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67AN. VET. (MURCIA) 17: 67-80 (2001). INFLUENCIA DE DIVERSAS CONDICIONES ANALÍTICAS EN LA

DETRMINACIÓN DE COLINESTERASA EN SANGRE ENTERA MEDIANTE EL MÉTODO DE ELLMAN. F.TECLES, S.MARTÍNEZ SUBIELA, J.J. CERÓN

INFLUENCIA DE DIVERSAS CONDICIONES ANALÍTICAS EN LADETERMINACIÓN DE COLINESTERASA EN SANGRE ENTERA ME-DIANTE EL MÉTODO DE ELLMAN

Influence of several analytical conditions on whole blood cholinesterase activity determinationby Ellman method

F. Tecles, S. Martínez Subiela, J.J. Cerón

[email protected] de Patología Animal, Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia, 30100Espinardo (Murcia), España

RESUMEN

En este trabajo se pretende estudiar y evaluar las principales fuentes de variación que pueden provocarvariabilidad en la determinación de colinesterasa en sangre entera. Para este fin se analizaron alícuotas desangre entera de perro bajo distintas condiciones analíticas. Se observó un aumento de la actividad colinesterasaconforme se incrementó la temperatura de reacción. La mayor actividad colinesterasa se encontró en un interva-lo de pH entre 8.0 y 8.5; sin embargo, una fuerte elevación de la hidrólisis no enzimática del sustrato tiene lugarcuando el pH excede de 7.5, lo que haría recomendable el empleo de pH 7.5. Aunque los valores más elevadosde actividad se alcanzaron con una concentración del sustrato acetiltiocolina iodada de 5x10-3 M y debutiriltiocolina iodada de 10x10-3 M, se describió un fuerte aumento de la hidrólisis no enzimática de los sustratosa estas concentraciones, por lo que se prefirió emplear una concentración de ambos sustratos de 1x10-3 M. Elcromóforo ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico, y los sustratos acetiltiocolina iodada y butiriltiocolina iodada,permanecieron estables al menos durante tres meses si eran conservados a una temperatura de –20ºC. Los datosaportados permitirán contribuir a un mejor conocimiento de las fuentes de variación que afectan a la determina-ción de colinesterasa en sangre entera, y a la estandarización de las condiciones analíticas utilizadas.

Palabras clave: colinesterasa, sangre, análisis, temperatura, pH, concentración, estabilidad

SUMMARY

The main sources of variation that can produce variability on whole blood cholinesterase determinationswere studied and evaluated. For this purpose, dog whole blood aliquots were analyzed under different analyticalconditions. An increase on cholinesterase activity was observed as reaction temperature was raised. The highestcholinesterase activity was obtained at pH range between 8.0 and 8.5; however, non-enzimatic substrate hydrolysis

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was also increased when pH exceeded 7.5, so the use of pH 7.5 would be recommended. Althoughacetylthiocholine iodide concentration of 5x10-3 M and butyrylthiocholine iodide concentration of 10x10-3 Myielded the highest cholinesterase activity, an increase of non-enzymatic substrate hydrolysis was also observedat these substrate concentrations, so the use of both substrates at 1x10-3 M concentration was preferred. 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid as chromophore, and acetylthiocholine iodide and butyrylthiocholine iodide assubstrates, were stable for at least three months if frozen. Based on these results, this work in contributing to abetter knowledge of the sources of variation affecting whole blood cholinesterase determination, and thestandardization of analytical conditions.

INTRODUCCIÓN

Los insecticidas organofosforados ycarbamatos son utilizados de forma rutinariacomo tratamiento contra los parásitos queafectan a la agricultura y a los animales do-mésticos. El principal efecto tóxico de estoscompuestos consiste en la inhibición de lasenzimas con actividad colinesterasa (ChE).Por este motivo, la determinación de esta ac-tividad enzimática se emplea, tanto en la prác-tica clínica como en los estudios debiomonitorización ambiental, como indicadorde la exposición de los ecosistemas naturales,de los animales y de los seres humanos a estetipo de insecticidas. Asimismo, también se hademostrado que otros contaminantes, comoalgunos detergentes y metales, pueden dismi-nuir la actividad de esta enzima en los orga-nismos vivos (Guilhermino et al., 1998).

Aunque la actividad colinesterasa pue-de medirse en gran cantidad de tejidos anima-les, su determinación en la sangre es uno delos procedimientos más extendidos. La san-gre posee dos enzimas con actividadcolinesterasa: acetilcolinesterasa (AChE) ocolinesterasa verdadera, presente en la mem-brana de los eritrocitos; y butirilcolinesterasa(BChE) o pseudocolinesterasa, que se encuen-tra en el plasma. Tradicionalmente, loseritrocitos y el plasma han sido muy utiliza-dos para la determinación de colinesterasa. Sin

embargo, el uso de sangre entera proporcionauna serie de ventajas (Tecles et al., 2000): (1)no es necesario separar eritrocitos y plasma;(2) se necesita de un volumen de muestra re-ducido; (3) aumenta la precisión yrepetibilidad frente a la obtenida en el análi-sis de eritrocitos; (4) no se ve afectada por losprocesos hemolíticos.

El método de Ellman (Ellman et al.,1961) es uno de los métodos más utilizadospara la determinación de colinesterasa en san-gre entera. Este método detecta la apariciónde tiocolina tras la hidrólisis del sustratoacetiltiocolina (ATCh) por la colinesterasa. Latiocolina reacciona con el cromóforo, el áci-do 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB), paraproducir un compuesto de color amarillo, elácido 5-tio-2-nitrobenzoico, que puede sermedido espectrofotométricamente a una lon-gitud de onda de 412 nm. Recientemente seha recomendado el empleo de dos sustratos,acetiltiocolina y butiriltiocolina (BTCh), paraanalizar una misma muestra de sangre entera,ya que permite la monitorización tanto deAChE como de BChE, y por tanto una detec-ción más precisa de la exposición a agentesinhibidores de la colinesterasa (Tecles y Ce-rón, 2001).

Los resultados de las determinacionesenzimáticas obtenidos por diferentes labora-torios pueden presentar modificaciones debi-do principalmente a dos tipos de fuentes de



variación (Marden et al., 1994): preanalíticas(incluyen la variabilidad debida a factores bio-lógicos del individuo y al manejo de las mues-tras) y analíticas (engloban a aquellos facto-res relacionados con el método analítico). Lainfluencia de algunas de estas fuentes de va-riación, como la concentración ideal decromóforo (Cerón et al., 1996), efecto de losdiluyentes (Cerón et al., 1999) y el empleo dediferentes sustratos (Tecles y Cerón, 2001),ha sido ya estudiada en los análisis decolinesterasa realizados en sangre entera. Sinembargo, todavía existe un desconocimientosobre los efectos que las modificaciones en latemperatura de reacción, pH, concentraciónde los sustratos, o las condiciones de almace-namiento de los reactivos pueden provocarsobre este tipo de determinaciones.

La falta de estandarización en los análi-sis de colinesterasa en sangre entera provocauna gran variabilidad en los procedimientosanalíticos empleados por diferentes laborato-rios, incluso cuando el mismo método es uti-lizado como base. Este es uno de los proble-mas principales que afectan a la determina-ción de la actividad colinesterasa (Wilson yHenderson, 1992). El propósito de este traba-jo consiste en estudiar la influencia de algu-nos parámetros técnicos (temperatura de re-acción, estabilidad de reactivos, pH y concen-tración de sustratos) sobre los análisis decolinesterasa en sangre entera, y de este modocontribuir a resolver los problemas derivadosde la falta de un método estándar.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de las muestras

Se procedió a la obtención de sangre en-tera de la especie canina, por punción de la

vena cefálica de 10 perros adultos de la razaBraco alemán. Todos los animales estabansanos, y no habían sido expuestos a ningúninsecticida organofosforado o carbamato enlos últimos dos meses. Las muestras fueronheparinizadas, y con ellas se constituyó unamezcla que se utilizó para la realización delos diferentes ensayos. Posteriormente, lamezcla fue diluida al 1:50 con agua destilada,siguiendo las recomendaciones de Cerón et al.(1999), y separada en alícuotas que fueronalmacenadas en congelación hasta el momen-to de su utilización.

Determinación enzimática

Los análisis se realizaron mediante elmétodo de Ellman en un espectrofotómetro au-tomático (Coulter Profile Analyzer, CoulterScientific, Margency, Francia). Para evaluarel efecto de la temperatura de reacción, seempleó el fotocolorímetro automático CobasMira Plus (ABX Diagnostics, Montpellier,Francia), debido a que el Coulter ProfileAnalyzer únicamente permite utilizar 30º y37ºC.

El cromóforo empleado fue el ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB, SigmaChemical Co, St Louis, USA) a una concen-tración final de 0.08x10-3 M. La disolucióntampón-cromóforo se preparó con tampónfosfato 0.1 M y pH 7.5. Como sustratos de laenzima se utilizaron la acetiltiocolina iodada(ATCI, Sigma Chemical Co, St Louis, USA)y la butiriltiocolina iodada (BTCI, SigmaChemical Co, St Louis, USA), a una concen-tración final de 1x10-3 M. Esta concentraciónsufrió posteriores modificaciones (10x10-3 M,5x10-3 M, 1x10-3 M, 0.5x10-3 M y 0.1x10-3 M)con el fin de evaluar su efecto sobre la deter-minación de colinesterasa.



La actividad colinesterasa se expresócomo micromoles de sustrato hidrolizado/ml/min, y fue calculada de la siguiente manera:

Actividad final = incremento deabsorbancia a 405 nm de longitud de onda/min x 0.808 x dilución inicial.

0.808 es un factor de conversión iguala (1000/13600 x 1) x (275/25)

donde: 1000 es un factor de conversiónde mmol/ml a micromol/ml, 13600 M-1 cm-1

es el coeficiente de extinción molar del ácido5-tio-2-nitrobenzoico (producto de reacciónentre el DTNB y los ésteres de la colina) a405 nm de longitud de onda, 1 cm es la longi-tud de la cubeta de reacción, y 275/25 es ladilución en la cubeta.

Se calcularon dos patrones negativos:el primero constituido por sustrato ycromóforo, con el fin de monitorizar lahidrólisis no enzimática del sustrato, y el se-gundo por cromóforo y muestra, para evaluarla reacción entre el cromóforo y el glutatión(actividad no enzimática). La actividadcolinesterasa corregida se obtuvo tras la sus-tracción de ambos patrones negativos.

Efecto de la temperatura de reacción

Se separaron cinco alícuotas de una mez-cla de sangre entera, que fueron analizadas concuatro temperaturas de reacción diferentes:25º, 30º, 37º y 40ºC. El efecto de la tempera-tura en la hidrólisis no enzimática del sustratoy en la actividad no enzimática también fuemonitorizada.

Estabilidad de los reactivos

Se prepararon disoluciones de cada unode los reactivos: DTNB, ATCI y BTCI. Pos-

teriormente, las disoluciones se separaron enalícuotas y se almacenaron a temperatura am-biente, en refrigeración y en congelación. Des-pués de 1, 2, 7, 14, 30 y 90 días de conserva-ción, se analizaron cinco muestras de sangreentera utilizando reactivos almacenados(DTNB almacenado con sustratos frescos, ysustratos conservados con DTNB fresco), yposteriormente reactivos frescos (preparadosinmediatamente antes de la realización de losanálisis). Los resultados obtenidos con losreactivos frescos y conservados fueron com-parados después de cada análisis.

Efecto del pH.

Con el fin de evaluar la influencia delpH en la determinación de acetil ybutirilcolinesterasa, cinco alícuotas de unamezcla de sangre entera de perro se analiza-ron con disoluciones tampón-cromóforo pre-paradas con tampón fosfato 0.1 M a cinco pHdiferentes: 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 y 9.0. Los sustratosempleados fueron ATCI y BTCI. El efecto delpH sobre la hidrólisis no enzimática de lossustratos y sobre la actividad no enzimáticase determinó de igual forma como en el ensa-yo de la temperatura.

Efecto de la concentración de sustratos

Se prepararon cinco disoluciones de cadauno de los sustratos, ATCI y BTCI, a las con-centraciones de 110x10-3 M, 55x10-3 M,11x10-3 M, 5.5x10-3 M y 1.1x10-3 M (las con-centraciones finales fueron: 10x10-3 M,5x10-3 M, 1x10-3 M, 0.5x10-3 M y 0.1x10-3 M,respectivamente). Las cinco concentracionesfueron utilizadas para la monitorización de laactividad colinesterasa en cinco alícuotas de



una mezcla de sangre entera de perro. Al igualque en el caso de la temperatura y el pH, lahidrólisis no enzimática del sustrato se deter-minó en función de la concentración utiliza-da.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los resultadosse realizó con un análisis de varianza de unfactor (ANOVA), utilizando un nivel de sig-nificación de 0.05. El análisis de rango múlti-ple se utilizó para realizar la comparación en-tre medias. Todos los cálculos se realizaroncon el programa informático Statgraphics(Statistical Graphics Corp, Rockville, MD,USA).

RESULTADOS

Efecto de la temperatura de reacción

El cuadro 1 muestra los valores de acti-vidad acetil y butirilcolinesterasa obtenidoscon diferentes temperaturas de reacción. Lamodificación de la temperatura de reacciónprovocó cambios significativos (p<0.001) enlos resultados. Los valores más elevados deactividad colinesterasa se obtuvieron a 40ºC,mientras que el descenso de la temperaturaprovocó una disminución. La hidrólisis noenzimática de los sustratos también se vioafectada por la temperatura de forma similar.Sin embargo, la actividad no enzimática nocambió en la misma medida.

El cuadro 2 muestra los factores de con-versión para diferentes temperaturas encon-trados en este trabajo con sangre entera deperro, y los compara con los calculados por

otros autores para el plasma humano y plas-ma canino, resultando ser muy similares.

Estabilidad de reactivos

Las figuras 1, 2 y 3 muestran los resulta-dos de la determinación de la actividadcolinesterasa corregida con reactivos frescosy conservados. No se encontraron diferenciassignificativas entre los resultados obtenidoscon cromóforo fresco y conservado durantetres meses a 25º, 4º o –20ºC. Los sustratosATCI y BTCI almacenados en congelación nomostraron pérdida de estabilidad después detres meses. A 4ºC, ambos permanecieron es-tables durante dos semanas, observándosecambios significativos (p<0.001) tras ese tiem-po. Hubo descenso significativo (p<0.001) alas 48 horas de almacenamiento de ATCI a25ºC, mientras que no se observaron hastadespués de dos semanas con BTCI.

Efecto del pH.

Los resultados obtenidos con la utiliza-ción de diferentes pH aparecen en el cuadro3. La actividad acetil y butirilcolinesterasa sevio significativamente afectada por el pH,incrementándose cuando aumenta el valor depH y disminuyendo cuando se reduce hastapH 7.0. La hidrólisis no enzimática de lossustratos se modificó en la misma forma, aun-que no hubo diferencias para el sustrato BTCIentre pH 7.0 y 7.5. La actividad no enzimáticaestá relacionada de forma inversa con el pH.De esta manera, los resultados de actividadesAChE y BChE corregidas variaron de la si-guiente manera: un valor de pH entre 8.0 y8.5 proporcionó la mayor actividad acetil ybutirilcolinesterasa; sin embargo, la hidrólisis



no enzimática de los sustratos experimentó unincremento significativo (p<0.001) si el pHera mayor de 7.5.

Efecto de la concentración del sustrato

La figura 4 muestra la evolución de laactividad acetil y butirilcolinesterasa corregi-da con el empleo de diferentes concentracio-nes de sustrato. La actividad

acetilcolinesterasa alcanzó su máxima activi-dad con una concentración de ATCI de5x10-3 M, descendiendo al utilizar mayoresconcentraciones. Sin embargo, la actividadbutirilcolinesterasa no decayó con una con-centración de BTCI de 10x10-3 M. Lahidrólisis no enzimática de ambos sustratosmostró un incremento significativo (p<0.001)cuando la concentración de sustrato fue ma-yor de 1x10-3 M.

Cuadro 1. Efecto de diferentes temperaturas en la determinación de colinesterasaen sangre entera. Actividad colinesterasa, expresada en µmol de sustrato hidrolizado/ml/min,y desviación estándar. Los resultados obtenidos a 37ºC fueron considerados como grupo con-trol en el análisis estadístico. *** (p<0.001); AChE (acetilcolinesterasa); BChE(butirilcolinesterasa); N.E. ATCI (hidrólisis no enzimática de acetiltiocolina); N.E. BTCI(hidrólisis no enzimática de butiriltiocolina); Act. No enzimática (actividad no enzimática).Los valores corregidos se obtuvieron tras la sustracción de ambos blancos.

Cuadro 2. Comparación entre diferentes factores de conversión a 25ºC para acetil ybutirilcolinesterasa. ATCI (acetiltiocolina); BTCI (butiriltiocolina).

Plasma humano

(Kit de Boehringer Mannheim

basado en Knedel y Bottger, 1967)

Plasma canino

(Carakostas y Landis1991)

Sangre entera

canina

(este trabajo)

BTCI ATCI ATCI BTCI

25ºC 1 1 1 1

30ºC 0.78 0.85 0.72 0.84

37ºC 0.60 0.7 0.55 0.53



Cuadro 3. Efecto de diferentes pHs en la determinación de colinesterasa en sangreentera. Actividad colinesterasa, expresada en µmol de sustrato hidrolizado/ml/min, y desvia-ción estándar. Los resultados obtenidos a pH 7.5 fueron considerados como grupo control en elanálisis estadístico. *** (p<0.001); AChE (acetilcolinesterasa); BChE (butirilcolinesterasa);N.E. ATCI (hidrólisis no enzimática de acetiltiocolina); N.E. BTCI (hidrólisis no enzimáticade butiriltiocolina); Act. No enzimática (actividad no enzimática). Los valores corregidos seobtuvieron tras la sustracción de ambos blancos.

Figura 1. Actividad colinesterasa con DTNB fresco y conservado. La actividad seexpresa como mmol de sustrato hidrolizado/ml/min, y corresponde a los valores corregidos trasla sustracción de la actividad no enzimática y la hidrólisis no enzimática de los sustratos.



Figura 2. Actividad colinesterasa con ATCI fresco y conservado. La actividad se ex-presa como mmol de sustrato hidrolizado/ml/min, y corresponde a los valores corregidos tras lasustratación de la actividad no enzimática y la hidrólisis no enzimática de los sustratos.

Figura 3. Actividad colinesterasa con BTCI fresco y conservado. La actividad se ex-presa como µmol de sustrato hidrolizado/ml/min, y corresponde a los valores corregidos tras lasustratación de la actividad no enzimática y la hidrólisis no enzimática de los sustratos.



DISCUSIÓN

Todos los análisis desarrollados duranteeste trabajo utilizaron los sustratos ATCI yBTCI ya que, al contrario que con otros ani-males como rumiantes o cerdo que sólo nece-sitan ATCI, ambos sustratos son necesariospara una caracterización completa de lacolinesterasa de la sangre (Tecles y Cerón,2001).

La actividad de la enzima colinesterasaes, al igual que muchas otras enzimas, depen-diente de la temperatura (Fairbrother et al.,1991). De este modo, se observó un aumentode la actividad colinesterasa conforme seincrementó la temperatura de reacción. Lahidrólisis no enzimática del sustrato tambiénresultó más elevada con la temperatura, porlo que debió ser sustraída del resultado final.Estos resultados indican que las modificacio-

nes en la temperatura de reacción provocan laaparición de diferencias significativas en laactividad colinesterasa. En nuestro trabajorecomendamos la realización de los análisis a37ºC, temperatura que ha sido utilizada pornumerosos autores (Humiston y Wright, 1967;Wilson et al., 1996; Dass et al., 1997; Winterset al., 1997), y a la que la colinesterasa denumerosos mamíferos alcanza su actividadóptima. Sin embargo, muchos kits comercia-les realizan sus determinaciones a temperatu-ra ambiente, ya que evita la necesidad de dis-poner de sistemas de control de temperatura.Por otra parte, Nostrandt et al. (1993) reco-mendaron que los análisis deberían ser reali-zados a 25ºC en caso de sospecha de exposi-ción a carbamatos, ya que la colinesterasainhibida por este tipo de compuestos puedeser reactivada si es sometida a temperaturaselevadas.

Figura 4. Actividad AChE y BChE obtenida con diferentes concentraciones desustrato. La actividad se expresa como mmol de sustrato hidrolizado/ml/min, y corresponde alos valores corregidos tras la sustratación de la actividad no enzimática y la hidrólisis noenzimática de los sustratos.



Los factores de conversión para diferen-tes temperaturas, que han sido anteriormentecalculados para el plasma humano (kit deBoehringer Mannheim basado en Knedel yBottger, 1967) y plasma canino (Carakostas yLandis, 1991), son muy similares a los encon-trados en este trabajo con sangre entera deperro. Sin embargo, en términos generales, losfactores de conversión siempre deben ser uti-lizados para una misma enzima, condicionesde preparación de las muestras y método ana-lítico, con el fin de evitar errores (Hill yFleming, 1982). De este modo, los factoresde conversión calculados para plasma no sonaplicables a la sangre entera.

Ambos sustratos, acetil y butiriltiocolina,resultaron estables al menos durante tres me-ses en congelación, tiempo superior al descri-to por Tor et al. (1994) para la acetiltiocolina.El DTNB permaneció estable al menos tresmeses en cualquiera de las temperaturas utili-zadas. Estos resultados permitirían un uso mássimple y económico de los reactivos.

La capacidad del sitio activo de lacolinesterasa para llevar a cabo el ataquenucleofílico sobre el sustrato está influenciadadirectamente por el pH existente en el mediode reacción. De este modo, la actividadcolinesterasa es dependiente del pH(Fairbrother et al., 1991). En nuestro estudio,las actividades acetil y butirilcolinesterasacorregidas alcanzaron su valor máximo en unintervalo de pH entre 8.0 y 8.5. El valor de lahidrólisis no enzimática de los sustratos tam-bién se vio incrementado a partir de la utiliza-ción de pH 8.0, lo que reduce la sensibilidadde los ensayos y obliga a su cálculo y sustrac-ción como ya sugirieron Matthed y Chapin(1990). Los diferentes autores no se ponen deacuerdo a la hora de realizar sus análisis y hanempleado una gran variedad de pHs: pH 8.0(Harlin y Ross, 1990; Halbrook et al., 1992),

pH 7.6 (Schmidt et al., 1992), pH 7.5 (Cerónet al., 1996), pH 7.4 (Ward y Hess, 1971), pH7.2 (kits de Boehringer Mannheim y Sigma)o pH 7.0 (Lewis et al., 1981; Tor et al., 1994).Incluso Ellman et al. (1961) utilizó pH 8.0 parala dilución de las muestras, y pH 7.0 para eltampón-cromóforo al encontrar mayor esta-bilidad del DTNB a este pH. Según los resul-tados obtenidos, la elección de un pH ideal noresulta fácil. En nuestro laboratorio optamospor utilizar pH 7.5, que se encuentra dentrode los valores de referencia para la especiecanina (7.37-7.51) (Russell et al., 1996), y enel que la hidrólisis no enzimática de lossustratos es reducida, por lo que se evitan in-crementos no reales de actividad.

La mayor actividad colinesterasa se ob-tuvo cuando la concentración de los sustratosATCI y BTCI fue de 5x10-3 M y 10x10-3 M,respectivamente. Una concentración de ATCIde 10x10-3 M provocó la inhibición de laacetilcolinesterasa; pero este efecto no se ob-servó en la butirilcolinesterasa, cuya activi-dad continuó incrementándose con una con-centración de BTCI de 10x10-3 M. Este dife-rente comportamiento de la AChE y BChE conexceso de sustrato ha sido también observadoen otros tipos de muestras: la AChE eneritrocitos puede ser inhibida por elevadasconcentraciones de ATCI, mientras que lasaltas concentraciones de BTCI no inhiben ala BChE en plasma. Por otro lado, los reduci-dos niveles de actividad ChE obtenidos a ba-jas concentraciones de sustrato (entre 0.1 y0.5x10-3 M) pueden ser debidos a que estasconcentraciones no fueron suficientes paraalcanzar una cinética de orden cero (Tor et al.,1994; Cerón et al., 1996). Este comportamien-to de la AChE y BChE caninas es similar alque se ha observado en sangre entera de laespecie humana (Wilson et al., 1996). Con res-pecto a la hidrólisis no enzimática de los



sustratos se vio significativamenteincrementada cuando la concentración exce-dió de 1x10-3 M. sobre la base de estos resul-tados, en nuestro trabajo preferimos la utili-zación de una concentración, tanto de ATCIcomo de BTCI, de 1x10-3 M para la determi-nación de acetil y butirilcolinesterasa en san-gre entera. De este modo, obtenemos una ma-yor actividad que con bajas concentraciones(0.1 y 0.5x10-3 M), y una menor hidrólisis noenzimática de los sustratos que con elevadasconcentraciones (5 y 10x10-3 M).

Muchos kits comerciales recomiendan elempleo de una concentración de sustrato de5x10-3 M o mayor, y en un estudio entre labo-ratorios el 77% de los participantes utilizaronATCI a una concentración mayor de4.68x10-3 M (Marden et al., 1994). En caso deutilizar estas concentraciones en muestras dela especie canina, sería necesario la determi-nación de la hidrólisis no enzimática de lossustratos y la corrección de la actividadcolinesterasa, con el fin de prevenir incremen-tos no reales de esta enzima. Se ha demostra-do que la falta de esta corrección provoca unasobreestimación de la actividad ChE en mues-tras de sangre entera inhibidas pororganofosforados (Wilson et al., 1996).

Por todo lo anteriormente expuesto, con-cluimos que las condiciones consideradascomo idóneas para la determinación de la ac-tividad colinesterasa en sangre entera son:temperatura de reacción 37ºC, pH 7.5, y con-centración de sustrato 1x10-3 M. Además, tan-to el cromóforo DTNB como los sustratosATCI y BTCI pueden ser almacenados a–20ºC por un tiempo mínimo de tres mesessin perder su capacidad para el análisis. Losresultados y conclusiones obtenidas en estetrabajo contribuirán a un mejor entendimien-to de los factores que pueden influir en la de-terminación de colinesterasa, y al estableci-

miento de unas condiciones ideales de análi-sis que pueden optimizar el método y reducirla variabilidad existente entre laboratorios di-ferentes. El conocimiento y control de estasfuentes de variación mejorará la sensibilidaddel ensayo, lo que puede ser especialmenteútil para detectar la exposición subclínica aorganofosforados y carbamatos, ya que el des-censo de actividad es menor en estos casos(Wilson et al., 1997). Debido a que este traba-jo se ha desarrollado en la especie canina, se-ría recomendable realizar estudios similaresen otras especies domésticas, aves y peces.

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