IL TRASFERIMENTO GENICO

COME INSERIRE DNA IN

UNA CELLULA

VIENE ISOLATA LA SEQUENZA DI DNA CHE SI INTENDE INSERIRE NELLA CELLULA OSPITE

VIENE INDIVIDUATO UN VETTOREIDONEO, CIOÈ UNA SEQUENZA DI IDONEO, CIOÈ UNA SEQUENZA DI DNA IN GRADO DI PERMETTERE L’INSERIMENTO DEL DNA TRASPORTATO NEL GENOMA DELLA CELLULA OSPITE

VIENE COSTRUITA UNA MOLECOLA DI DNA RICOMBINANTE, CIOÈ FORMATA DAL DNA VETTORE E DAL DNA DEL GENE DA INSERIRE

PRODOTTO CARATTERISTICHE GENI INTRODOTTI OBIETTIVO

Pomodoro (Calgene)

Ritardo nella maturazione

Gene antisenso che blocca la biosintesi dell’etilene, ormone che promuove la maturazione

Riduzione delle spese di conservazione Maggior durata del prodotto.

Colza

(AgrEvo,

Resistenza ad erbicidi

Geni batterici che conferiscono

Controllo delle erbe infestanti.

I VEGETALI - OGM

(AgrEvo, Monsanto,

Plant Genetic System)

conferiscono resistenza a due diversi erbicidi

Patata (Monsanto)

Resistenza ad insetti parassiti

Gene batterico Resistenza a parassiti senza utilizzo di agenti chimici

Soia (Monsanto)

Resistanza all’erbicida Glifosato

Gene batterico Controllo delle erbe infestanti

Mais

(Monsanto,

Resistenza a parassiti

Gene batterico

Resistenza a parassiti senza utilizzo di agenti chimici

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

PARTICLE GUN

IL BACILLUS THURINGIENSIS È UN BATTERIO SPORIGENO CHE VIVE NEL TERRENO. QUANDO VIENE INGERITO MEDIANTE VEGETALI CONTAMINATI, IL BATTERIO SPORULA NELL'OSPITE LIBERANDO LE TOSSINE (INNOCUE PER GLI ESSERI UMANI) CHE DANNEGGIANO IL TRATTO DIGERENTE DELLE LARVE DI DITTERICOME LE ZANZARE O CAUSANDO NEI BRUCHI DI MOLTI LEPIDOTTERI UNA MALATTIA PARALITICA.

GENE GENE ANTISENSOANTISENSO

L’INATTIVAZIONE GENICA

����

����RNA ANTISENSOLEGA L’mRNA E

BLOCCA LA TRADUZIONE

LA TERAPIA GENICA

CON TERAPIA GENICA SI INTENDE L’INSIEME DI PROCEDIMENTI ATTI L’INSIEME DI PROCEDIMENTI ATTI A CURARE O ALLEVIARE UNA MALATTIA MODIFICANDO GENETICAMENTE LE CELLULE DEL PAZIENTE

OBIETTIVI DELLA TERAPIA GENICA

� CORREZIONE DI FENOTIPI PATOLOGICI RISULTANTI DA MUTAZIONIGENETICHE: “SOSTITUIRE E/O CORREGGERE UN GENE MANCANTEO DIFETTOSO”

� ESPRESSIONE DI PROTEINA CORRETTA E CORREZIONEPERMANENTE

� TRASFERIMENTO VELOCE ED EFFICIENTE DEL “FARMACO”RISPETTANDO IL CONTESTO GENICO E CELLULARERISPETTANDO IL CONTESTO GENICO E CELLULARE

� INTRODURRE NELLA CELLULA GENI DIRETTI ALL’ELIMINAZIONEDELLE CELLULE CANCEROSE

� TRASFERIRE GENI VIRALI O BATTERICI A SCOPO DI VACCINAZIONE

� TRASFERIRE GENI CHE STIMOLANO LA CRESCITA O LARIGENERAZIONE DI TESSUTI DANNEGGIATI

VANTAGGI TEORICI DELLA TERAPIA GENICA

• CORREZIONE RADICALE DEI DIFETTI

• POSSIBILITÀ DI AGIRE SU MECCANISMI MOLECOLARIPER I QUALI RISULTA ESTREMAMENTE DIFFICILEPER I QUALI RISULTA ESTREMAMENTE DIFFICILESVILUPPARE FARMACI SPECIFICI

• VANTAGGI ECONOMICI (SE FOSSE PERMANENTEEVITEREBBE LA NECESSITÀ DI TRATTAMENTI RIPETUTI)

IN VIVOIN VIVO EXEX--VIVOVIVO

STRATEGIE

QUALI MALATTIE POSSONO ESSERE TRATTATE CON LA TERAPIA GENICA?

Malattie Ereditarie:

•Distrofia muscolare•Atrofia muscolare•Fibrosi cistica •Emofilia •Emofilia •Immuno deficienze (ADA – X-linked) •Fenilchetonuria (malattie metaboliche)•Anomalie fisiologiche (mucopolisaccaridosi, sindrome di Gaucher etc.)

QUALI MALATTIE POSSONO ESSERE TRATTATE CON LA TERAPIA GENICA?

Malattie non Ereditarie:

•Cancro •Malattie cardiovascolari •Malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson etc.)

Infine la terapia genica può trattare anche malattie acquisite quali:•Traumi di vario tipo (fratture ossee, ferite, ustioni) •Ischemie (necrosi dei tessuti causate da un'interruzione dell'apporto sanguigno) •Infezioni

METODI DI TRASFERIMENTO DEL MATERIALE GENETICO

Metodi Biologici: Metodi Fisici:Metodi Chimici:

� Adenovirus ricombinante

Virus Adenoassociati

� Liposomi Cationici

Complessi di Polilisina

� Elettroporazione

Nucleofezione �Virus Adenoassociati

�Retrovirus

�Lentivirus

�Complessi di Polilisina �Nucleofezione

�Microiniezione

Sistema ViraleSistema Non Virale

VETTORI VIRALI: I RETROVIRUS

• Genoma: RNA singolo filamento.

• Integrazione casuale nel genoma (mutagenesi inserzionale).

• Difficile produrli in grandi quantità (titolo elevato).

• Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle cellule

staminali.staminali.

• Poco immunogeni.

• L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la

persistenza del virus nel genoma.

• In assoluto sono i vettori più utilizzati per la terapia genica.

• Possono infettare solo cellule proliferanti

• Genoma a RNA.

• A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.

• Scarsissime reazioni immunologiche.

VETTORI VIRALI: I LENTIVIRUS

• Scarsissime reazioni immunologiche.

• Elevata efficienza di trasduzione e persistenza dell’espressione.

• Ottime prospettive per la terapia genica in vivo.

• Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale).

• Genoma a DNA doppio filamento.

• Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche.

• Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica.

VETTORI VIRALI: ADENOVIRUS

• Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti.

• Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato).

• Forti reazioni immunologiche.

VETTORI VIRALI: SPECIFICITÀ

LA LIPOFEZIONE

LA TRASFEZIONE

CELLULA PACKAGING

VANTAGGI (TEORICI) DELLA TERAPIA GENICA

• Correzione radicale dei difetti

• Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici

• Vantaggi economici (se fosse permanente eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti)

SOSTITUZIONE GENICA

STRATEGIE TERAPEUTICHE

Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzionetotale o parziale di un gene.

INIBIZIONE MIRATA DELL’ESPRESSIONE GENICA

STRATEGIE TERAPEUTICHE

Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.

siRNA

UCCISIONE DIRETTA DI CELLULE PATOLOGICHE

STRATEGIE TERAPEUTICHE

TERAPIA GENICA “IN SITU”

STRATEGIE TERAPEUTICHE

UCCISIONE DI CELLULE PATOLOGICHE MEDIATA DAL SISTEMA IMMUNITARIO (TUMORI)

STRATEGIE TERAPEUTICHE

TERAPIA GENICA DEL CANCRO: POTENZIAMENTO DELLA RISPOSTA IMMUNE

STRATEGIE TERAPEUTICHE

LO STATO DELL’ARTE

LO STATO DELL’ARTE

LO STATO DELL’ARTE

LO STATO DELL’ARTE

STATO DELLA

SPERIMENTAZIONE

1. OLTRE IL 70% DEI PROTOCOLLI SONO IN FASE 1 O

2 (VALUTAZIONE DELLA SICUREZZA)

2. 75% DEI PROTOCOLLI IN FASE 1 NEL 1995 NON

HANNO SUPERATO QUELLA FASE

3.NESSUN PROTOCOLLO HA AL MOMENTO PRODOTTO

RISULTATI DURATURI E RADICALI NELL’UOMO AD

ECCEZIONE DEGLI INTERVENTI RIGUARDANTI LA

S.C.I.D.

Primo prodotto di terapia genica disponibile in commercio:

Adenovirus esprimente p53 contro carcinomi squamo-cellulari di testa e collo, licenziato in Cina dall’Industria cinese Shenzen SiBiono (2003)

LO STATO DELL'ARTE

Prodotto simile che sta per essere registrato negli USA (ora in fase III della sperimentazione clinica contro carcinomi sqamo-cellulari di testa e collo, tumori del polmone e della mammella):

Adenovirus per p53, AdvexinSi ritiene che l’Advexin sara’ il primo farmaco di terapia genica registrato in USA..

ADA (ADENOSINE DEAMINASE)

• Catalizza la deaminazione di adenosina edesossiadenosina in inosina e desossiinosina

• Mutazioni nel gene dell’ADA causanoimmunodeficienza (SCID, Severe Combinedimmunodeficienza (SCID, Severe CombinedImmunodeficiency): virtualmente assente attivita’ dilinfociti B e T

• Cure possibili: trapianto di midollo, somministrazionedi PEG-ADA bovina

TRIAL CLINICO PER DEFICIT ADA

L’espressione di ADA persiste a 12 anni dalla prima infusione di cellule modificate in una delle 2 pazienti trattate:20% dei linfociti esprimono ancora ADA

TRIAL CLINICO PER DEFICIT ADA

La 2a paziente ha invece sviluppato anticorpi contro componenti del sistema di infezione (FCS) e ha perso i linfociti trasdotti e l’espressione di ADA

Gene therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency(SCID)-XI Disease:

• Trial successivi hanno dimostrato successo nel correggere il difettoimmunitario in 9 pazienti su 10 trattati

TRIAL CLINICO PER SCID

• Tuttavia, dopo 3 anni i due pazienti piu’ giovani (1 e 3 mesi al tempodel trattamento) hanno improvvisamente sviluppato proliferazioneclonale di linfociti T maturi (Science 2003).

• In entrambi i casi, i linfociti aberranti mostravano inserzione del vettoreretrovirale in prossimita’ del promotore del proto-oncogene LMO2:

MUTAGENESI INSERZIONALE!

ATTUALI PROBLEMI TECNICI DELLA TERAPIA GENICA

• Efficienza di trasferimento genico

• Selettività del sistema di trasferimento

• Espressione instabile nel tempo• Espressione instabile nel tempo

• Espressione non regolata

• Reazioni del sistema immunitario

• Possibili interferenze con il genoma

(mutagenesi inserzionale)

LIMITI DELLA TERAPIA GENICA

• Rischio troppo elevato in presenza di terapie alternative

• Mancanza di efficacia dovuta a problemi tecnici (inefficiente trasferimento genico, inattivazione del gene terapeutico)terapeutico)

• Costi elevati

• Alto rischio di effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)

OBIETTIVI FUTURI

• IDENTIFICARE PROTOCOLLI DI TRASFERIMENTO PÙ EFFICACI CHE PERMETTANO UNA ESPRESSIONE DEL DNA DI LUNGA DURATA

• SVILUPPARE VETTORI CHE RISULTINO ANCORA PIÙ SPECIFICI PER IL TARGET CELLULARE DESIDERATO SPECIFICI PER IL TARGET CELLULARE DESIDERATO

• VERIFICARE LA CORRETTA INSERZIONE DEI GENI TRASFETTATI NEL LOCUS GENICO (NO RANDOM)

• VERIFICARE CHE I GENI UNA VOLTA INSERITI NEL GENOMA DELLA CELLULA TARGET SIANO CORRETTAMENTE CONTROLLATI

• COMPRENDERE I MECCANISMI DI BASE DELLA RICOMBINAZIONE OMOLOGA: GENE TARGETING