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IL SECRETO DI LUMACA: ANALISI MICROBIOLOGICHE A COMPLEMENTO
DELL’INDAGINE CHIMICA
Cherasco 26 Settembre 2014Dr. Claudio Trapella; Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche
Università degli Studi di Ferrara
“La lumaca nel piatto:chi va piano va sano e va lontano
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ESTRAZIONE
L’estrazione meccanica della bava di lumaca è stata effettuata grazie alla collaborazione con l’azienda agricola COLOGNESI di Gualdo in provincia di Ferrara che detiene il brevetto della macchina per l’estrazione.
L’estrazione avviene attraverso uno stimolo chimico (NaCl) e grazie alla temperatura dell’acqua, le lumache non subiscono quindi nessun maltrattamento (% soppravvivenza 98%) .
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STORIA E SCOPERTA
STUDIO CONDOTTO NEL 2010
EFFETTO ANTIRUGHE
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CARATTERIZZAZIONE
La caratterizzazione dell’estratto di lumaca per la vendita alle industrie cosmetiche o alimentari viene effettuata su 3 livelli per garantire un prodotto di elevata qualità:
1.Caratterizzazione dell’estratto secco quindi % di sostanza secca all’interno del secreto. L’analisi di spettrofotometria infrarossa permette quindi di valutare la presenza di proteine all’interno dell’estratto.
2.Analisi dei metalli pesanti attraverso spettrofotometria di Assorbimento Atomico per valutare i metalli “buoni” (Na, K, Ca, Mg, Cu, Zn) e quelli “cattivi” (Cr, Pb, Ni).
3.Analisi Microbiologica del campione appena estratto per valutare la carica batterica totale
Sull’estratto di bava di lumaca, quali sofisticazioni possibili?
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CARATTERIZZAZIONE CHIMICA
ALLANTOINA
ACIDO GLICOLICO
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PRIMA EVIDENZA IN LETTERATURA DELL’USO DELLA SPETTROFOTOMETRIA INFRAROSSA
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CARATTERIZZAZIONE CHIMICA
SPETTROFOTOMETRO ALL ’INFRAROSSO
IL MUCO DI LUMACA ESSENDO UN COMPOSTO NATURALE PRESENTA UN’ELEVATA COMPLESSITA’. LE SUE PROPRIETA’ FARMACOLOGICHE NON SONO RICONDUCIBILI ESCLUSIVAMENTE ALLA SUA COMPOSIZIONE CHIMICA E AMMINOACIDICA.
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CARATTERIZZAZIONE CHIMICA
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DIFFERENZE TRA SPECIE
HELIX ASPERSA MULLER%SS= 6.7%
HELIX ASPERSA MAXIMA%SS= 6.0%
HELIX POMATIA%SS= 4.8%
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ANALISI INFRAROSSA DEL MUCO TOTALE DI HELIX ASPERSA
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ANALISI DEI METALLI PESANTI
A. HELIX ASPERSA MULLER B. HELIX ASPERSA MAXIMAC.HELIX POMATIA
Prof. Bracchi, Prof Novelli. Università di Parma
Metallo Concentrazione Valore
minimo Valore massimo Valore medio
Calcio mg/100 297 957 499
Fosforo ““ 155 216 186
Magnesio ““ 42 95 62
Potassio ““ 101 201 164
Sodio ““ 47 201 109
Rame ““ 5 173 48
Ferro ““ 18 55 35
Manganese ““ 2 4 3
Zinco ““ 12 22 15
Conc. Metalli nella carne
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AZOTO TOTALE E PROTEINE TOTALI CON IL METODO DEL KJELDHAL
Summarize Results
Date : 1/23/2013 15:55:41
Method Name : default
Method Filename : Default.mth
Group No : 1 Element %
Sample Name Nitrogen Carbon Hydrogen Sulphur
SNAIL1 0,488440126 2,296150923 0,321308196 0,244194999
SNAIL2 0,480161518 2,264023066 0,374696225 0,247604698
SNAIL3 0,457833827 2,175116062 0,385799468 0,243340284
SNAIL4 0,475547046 2,259398937 0,361756295 0,245468855
SNAIL5 0,486850172 2,337282658 0,377795458 0,249659687
Analisi elementare
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Sample 1 1.09gr azoto 6.81gr proteine
Sample 2 1.56gr azoto 9.77gr proteine
sample 3 1.49gr azoto 9.30gr proteine
Kjeldahl come metodo di analisi Proteine= N totX 6.25
TRE CAMPIONI DI BAVA DI LUMACA PURA
Sample A: 800mg bava 200mg BSA 2.64gr N tot 16.5gr Proteine
Sample B: 800mg bava 200mg NH4Cl 5.42gr N tot 33.8gr Proteine
Sample C: 1000mg bava 1.56gr azoto 9.77gr proteine
TRE CAMPIONI DI BAVA DI LUMACA ADULTERATI
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Spettro infrarosso di bava di lumaca con aggiunta di BSA
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Spettro infrarosso di bava di lumaca con aggiunta di NH4Cl
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ANALISI MICROBIOLOGICHE
VALUTAZIONE CARICA BATTERICA
Semina di 100ul a conc 100ug\ul ( 1mg in tot) su:
TSA (carica batterica tot)
Mannitol Salt Agar ( Stafiloccocchi)
McConkey ( Coliformi)
Sabouraud + Cloramfenicolo ( Miceti)
RISULTATI:
Carica batterica totale pari a 4 x 10^-2 CFU\mg con presenza di soli Bacilli gram
positivi
GRAM SU TSA GRAM MANNITOL SALT AGAR
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CURVA DI CRESCITA BATTERICA
E.Coli
0 20 40 60 800
1
2
3NTBAVA
MIN
Fo
ld in
crea
se
S.Aureus
0 20 40 60 800.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5NTBAVA
MIN
Fo
ld in
crea
se
S.Mutants
0 20 40 60 800
1
2
3
4NTBAVA
MIN
Fo
ld in
crea
se
P.Aeruginosa
0 20 40 60 800.85
0.90
0.95
1.00
1.05
1.10
1.15NTBAVA
MIN
Fo
ld in
crea
se
C.Albicans
0 20 40 60 800.6
0.8
1.0
1.2
1.4NTBAVA
MINF
old
incr
ease
100ul BAVA (10mg) in un ml finale
RALLENTAMENTO
CRESCITA DEI
GRAM NEGATIVI
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50ug/u
l
25ug/u
l12
,5ug/u
l6,2
5ug/u
l3,1
25ug/u
l
0
20
40
60
80
100E.ColiS.AureusP.AeruginosaC.Albicans
% in
hib
itio
nDETERMINAZIONE MIC (minima concentrazione inibente)
Coltura per 24h in 100ul totali (1x10^4 batteri) con diluizioni seriali di bava
Alla concentrazione di 50ug/ul tutti e 4 i microrganismi vengono inibiti nella crescita, in
particolare i gram negativi. Questi ultimi sono leggermente inibiti anche alla concentrazione
di 25ug\ul.
P.Aeruginosa, E. Coli: Garm –
Staphylococcus. Aureus Gram +
C albicans Fungo
E.coli
S.Aureus
C.Albicans
P.Aeruginosa
50u
g/u
l25u
g/u
l12.
5u
g/u
l6.2
5u
g/u
l3.1
25u
g/u
l
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ANALISI MICROBIOLOGICHE
CONCLUSIONI:
1. LA BAVA LIOFILIZZATA NON CONTIENE UNA CARICA BATTERICA POTENZIALMENTE NOCIVA
2. IL PREPARATO MOSTRA ATTIVITA’ BATTERIOSTATICA SOPRATTUTTO SUI GRAM NEGATIVI
E.COLI E P.AERUGINOSA SONO INIBITE GIA’ ALLA CONCENTRAZIONE DI 25ug/ul
IL PROCESSO DI LIOFILIZZAZIONE GARANTISCE UNA BUONA PUREZZA MICROBIOLOGICA
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PROSPETTIVE
1. Analisi più dettagliata (Proteomica) dei componenti di Helix Aspersa Muller per identificare le proprietà biologiche associate ai vari componenti.
3. Collaborazione con l’Azienda ospedaliera di Ferrara, il Tecnopolo per le Scienze della Vita e aziende biomedicali della RER per un progetto di messa a punto di garze e teli medicati per le ustioni e le piaghe da decubito (POR-FESR 2014-2020).
2. Valutazione delle possibili frodi sul prodotto attraverso l’analisi infrarossa associata all’analisi dell’azoto totale e dell’acido glicolico e dell’allantoina via HPLC.
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