il laboratorio di analisi: esperienze, criticità e ... · metodi immunometrici metodi...

29/11/2010

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Il Laboratorio di Analisi:Esperienze, criticità e

affidabilità dei tests diagnostici

Giorgio Bellomo, Marco Bagnati, Matteo VidaliLaboratorio Ricerche Chimico-Cliniche

Azienda Ospedaliero-Universitaria “Maggiore della Carità” - Novara

Ruolo del Laboratorio

Affidabilità ed Utilità del dato analitico

Schema generale�Identificazione univoca campione/paziente�Controllo della fase preanalitica�Analisi�Conferma

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Provvedimento del 18 settembre 2008

Tale provvedimento prevede due macrofasi :

I Livello di accertamenti da parte del Medico competente o di altro Operatore sanitario

II Livello di approfondimento diagnostico-accertativo a carico di Strutture sanitarie competenti (SERT)

Accertamenti di 1° livello

Accertamenti di SCREENING

� Procedure accertative da parte del Medico competente :

� visita medica “orientata all’identificazione di segni e sintomi suggestivi diassunzione…”

� prelievo del campione di urina “sotto controllo… introducendo misure atte adevitare la possibilità di manomissione del campione… ”

� possibilità di eseguire in sede di visita i test tossicologico-analitici con tecnicheimmunochimiche rapide

� Procedure di laboratorio presso idonee strutture autorizz atedalla regione :

� accertamenti analitici basati su metodi automatizzati di screening immunochimico

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Accertamenti di 1° livello

Nel caso in cui risultino positivi gli accertamenti di screening:

Accertamenti di CONFERMA

�Procedure diagnostico-accertative a carico delle Struttu reSanitarie competenti :

� mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa(valore medico-legale).

Accertamenti di REVISIONE

�Possibilità di una revisione del risultato :� il Lavoratore può richiedere la ripetizione dell’analisi sullo stesso campione

precedentemente prelevato in sua presenza o in presenza di un proprio consulentetecnico.

Il campione di urina

ESITO

POSITIVO

LABORATORIO

ANALISI

ESITO

NEGATIVO

TEST DI

CONFERMA

TEST DI

CONFERMA

TEST

ON SITE

ESITO

NEGATIVO

ESITO

POSITIVO

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Come va utilizzato il campione di urina

ALIQUOTA A20 ml

Test di SCREENING

ALIQUOTA B20 ml

Test di CONFERMA

Metodi immunochimiciautomatizzati

Cromatografia-spettrometria di

massa

Cromatografia-spettrometria di

massa

ALIQUOTA C20 ml

Test di REVISIONE

Contenitore monouso da 60 ml. “Si richiede una quantità di urina

non inferiore a 60 ml”

Qualora la quantità sia insufficiente, il campione incompleto viene sigil-lato e riaperto solo alla presenza del soggetto per la successiva inte-

grazione.

Cosa dice la legislazione vigente?

L’Art. 8, comma 2 dell’Accordo Stato/Regioni del 18 settembre 2008 dice che:

•è necessario garantire la tracciabilità di tutte le fasi assicurando l’archiviazione

e le ricerche in automatico,

•i trasgressori incorrono nella sospensione dalla mansione o nel licenziamento.

Ciò espone il lavoratore ad elevati rischi legali,

•tale prassi ha lo scopo di ridurre la documentazione cartacea da compilare,

•occorre tutelare tutti i soggetti coinvolti:

– Lavoratore,

– Azienda,

– Medico competente,

– Laboratorio per gli esami di primo livello,

– Laboratorio per gli esami di conferma.

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DROGHE D’ABUSO E METABOLITI

• DROGHE NATURALI:– Tetraidrocannabinolo (Cannabis Indica) � Ac.(L)11-NOR-D-9-THC-9-COOH– Morfina, Codeina (Papaver Somniferum)– Cocaina (Erythroxylon Coca) � Benzoilecgonina

• DROGHE SINTETICHE:– Eroina � 6-monoacetilmorfina � Morfina– Metadone � EDDP– Buprenorfina � Norbuprenorfina– Amfetamina– Metamfetamina– MDA (Love pill o Speed for lovers)– MDE (Eva)– MDMA (Ecstasy)

MATRICI• Urina

– Concentrazioni alte, non invasiva, semplice da trattare , facile da conservare

• Saliva– Prelievo ed analisi in strada– Le concentrazioni salivari correlano con quelle ematiche, bassa concentrazione, I campioni

di saliva devono essere analizzati rapidamente in quanto batteri eventualmente presentied enzimi potrebbero decomporre le sostanze contenute.

– Il principio attivo della cannabis (D9-tetraidrocannabinolo, D9-THC o THC) diffondedifficilmente dal sangue alla saliva a causa della sua scarsa idrosolubilità

• Sudore– Prelievo ed analisi in strada

• PLASMA/SIERO/SANGUE– La concentrazione plasmatica è direttamente correlabile al lo status psicofisico del

soggetto al momento del prelievo , invasivo, concentrazioni basse

• Matrice cheratinica (capelli/peli)– Concentrazioni basse, consumo cronico , trattamento necessario

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SCREENING

• Analisi di Screening:– Analisi preliminare che fornisce un risultato presuntivo, ovvero la

probabile negatività o positività di un campione rispetto ad unasostanza/classe di sostanze e in riferimento a un valore di cut-offprestabilito. Per definizione, un risultato positivo ottenuto conun'Analisi di screening non può assumere valenza forense[GTFI – 3°rev 2010]

• Risultato: qualitativo o semiquantitativo• Risultato semiquantitativo: non possiede caratteristiche

di precisione ed accuratezza in quanto proviene dacurve di tarature di tipo sigmoide, risente di interferenti ecross reattività (non tutti gli analiti rispondono nellostesso modo)

CUT-OFF

• Cut-off:– Limite di concentrazione definito, in maniera

convenzionale e arbitraria, per stabilire lanegatività ovvero la positività nel caso dianalisi di screening di un campione.

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SENSIBILITÀ vs SPECIFICITÀ

Sensibilità = Veri Positivi

Veri Positivi + Falsi Negativi

Specificità =Veri Negativi

Veri Negativi + Falsi Positivi

capacità di identificare correttamente gli assuntori

capacità di identificare correttamente i non assuntori

SCREENING

Veri Negativi Veri Positivi

FP FN

Concentrazione

Fre

quen

za

Cut-OffMassima sensibilità FN = 0Massima specificità FP = 0

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CUT-OFF PER L’ANALISI DI SCREENING

Classe Urina (ng/ml) Saliva (ng/ml) Capelli (ng/mg)

Oppiacei 300 40 0,2

Cocaina e metaboliti 300 20 0,5

Cannabinoidi e metaboliti

50 4 0,1

Amfetamine Metamfetamine MDMA e analoghi

500a/1000b 50 0,2

Metadone e metaboliti 300 0.2

Buprenorfina e metaboliti

5

a - Accordo Stato-Regioni per le mansioni a rischiob - Art. 187 C.d.S.

APPROCCIO METODOLOGICO

SCREENINGCONFERMA

Aspetto diagnostico Aspetto legale

Classe Sostanza

Esecuzione: 30 min - 1 h Esecuzione: 1-2 giorni

Nessuna preparazione Preparazione manuale

ImmunocromatograficiMetodi immunometrici

Metodi cromatografici (GC-MS, LC-MS)

(CEDIA, EMIT, FPIA, Biochip, KIMS)

STOP

+

-

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AUTENTICITÀ DEL CAMPIONE• CREATININURIA

– valori di riferimento 25 - 300 mg/dL– concentrazioni fra 20 e 40 mg/dL sono fortemente sospette di

adulterazione (diluizione), in vivo o in vitro– cut-off 20 mg/dL; per valori inferiori il campione è da

considerare inattendibile in quanto adulterato (diluito).

• PESO SPECIFICO– valori di riferimento 1.003 – 1.030– cut-off 1.003; per valori inferiori il campione è da considerare

inattendibile in quanto adulterato.

• pH– valori di riferimento 4.5 – 9– cut-off: 3-10; per valori inferiori a 3 e superiori a 10 il campione è

da considerare inattendibile in quanto sicuramente adulterato.

ADULTERAZIONE DEL CAMPIONE• NITRITI

– Sostanze riducenti che interferiscono nelle reazioni NAD-NADHe nel riconoscimento dell’anticorpo specifico per la sostanzaoriginale. Possono esser presenti nelle urine, in conseguenza dicrescita batterica (per infezione delle vie urinarie o percontaminazione esterna) ma a concentrazioni tali da noninterferire con i test diagnostici. Possono essere indice diadulterazione in vitro per aggiunta di sostanze attualmente incommercio.

– cut-off 5 mg/dL. Valori massimi riscontrati in condizioni naturalisono di 1,3 mg/dL.

• GLUTARALDEIDE– Sostanza polimerizzante che interferisce nel legame antigene-

anticorpo. Non è presente come componente normale nelleurine per cui il suo riscontro è indice di adulterazione.

– Cut-off zero (assente)

• OSSIDANTI E CANDEGGINA– Analizzando il valore di ossidanti/clorocromato di piridinio

(PCC) si ricerca la presenza di agenti ossidanti qualicandeggina e acqua ossigenata. Il clorocromato di piridinio(venduto con il marchio commerciale UrineLuck) è una sostanzaadulterante comunemente usata. Normalmente l’urina nondovrebbe contenere ossidanti o PCC.

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METODO IMMUNOCROMATOGRAFICO

Droga immobilizzata

Droga campione

Ab-pigmento

Test speditivo on site (qualitativo)

SCREENING DROGHE – TEST SPEDITIVO

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SCREENING: RISULTATI – TEST SPEDITIVO

SCREENING: SEMIQUANTITATIVA - I

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SCHEMA DELLA REAZIONE FPIA

SREENING: SEMIQUANTITATIVA - II

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SCHEMA DELLA REAZIONE EMIT

Screening: semiquantitativa - III

Drugs of Abuse Array PLUS(DoA PLUS)

AmfetamineMetamfetamineBarbituriciBenzodiazepine 1Benzodiazepine 2CannabinoidiCocaina (Benzoilecgonina)MetadoneOppiaceiFenciclidinaBuprenorfinaMDMACreatinina

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SCHEMA DELLA REAZIONE CON BIOCHIP

Cattura analita

E

Y Y

E

Anticorpi legaticovalentemente allasuperficie del biochip

Superficie Biochip con DTR

Generazione di luce che viene quantificataper determinare la quantità di analitapresente nel campione.

Anticorpo secondario

Cattura analita

E

Y Y

E





Cattura analita

E

Y Y

EE





DTR

ESEMPI DI FALSI POSITIVIAmfetamine e simili Selegilina,

Vicks Inhaler

Barbiturici FANS (ibuprofene, naproxen)

Benzodiazepine Oxaprozin

Cannabinoidi FANS (ibuprofene, naproxen)

OppiaceiFluoroquinolone (Ofloxacina, Levofloxacina)

Rifampin

Fenciclidina Venlafaxine

Dextrometorfano

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ANALISI DI CONFERMAo

II LIVELLO

CUT-OFF PER ANALISI DI CONFERMA

Classe Urina (ng/ml)Urina conferma

(ng/ml)Plasma conferma

(ng/ml)

Oppiacei 300 100 10

Cocaina e metaboliti 300 100 10

Cannabinoidi e metaboliti

50 15 2

Amfetamine Metamfetamine MDMA e analoghi

500a/1000b 250 20

Metadone e metaboliti 300 100 10

Buprenorfina e metaboliti

5 5 5

a - Accordo Stato-Regioni per le mansioni a rischiob - Art. 187 C.d.S.

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Preparazione del campione

ANALISI DI CONFERMA

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CROMATOGRAMMA DELLA MISCELA TEST

RICONOSCIMENTO ANALITA (cocaina)

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HPLC/MS MS

Pompa binariaAutocampionatore

Computer

Comparto portacolonna

Fasi mobiliSorgente

ESI

Q1

Q2

Q3

CROMATOGRAMMA-1

Codeina

6-MAMMorfina

Metadone

EDDP

Cocaina

Benzoilecgonina

Metadone

Morfina

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RANDOX1881

POS 30 (1,6%)

NEG1851 (98,4%)

EVIDENCE: SCREENING VS CONFERMA

5

18

2

11

30

5

10

15

20

25

cannabinoidi cocaina oppiacei amfetamine

num

ero

cam

pion

i

codeina>morfina

codeina

neg

pos

I test di conferma sono stati ottenuti mediante tec nica LC/MS/MS con strumentazione Agilent 1290Infinit y/TripleQuad6410

Axsym171

POS 56 (32,7%)

NEG115 (67,3%)

AXSYM-AG: SCREENING VS CONFERMA

29

18

6 1

11

0

5

10

15

20

25

30

35


num

ero

cam

pion

i

codeina>morfina

codeina

neg

pos

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20

Axsym474

POS 71 (15,0%)

NEG403 (85,0%)

AXSYM: SCREENING

amfetamine 5

oppiacei7cocaina

22

cannabinoidi 37

ESTERNI: SCREENING VS CONFERMA

41

8 5 1

8

7 31

4

0

10

20

30

40

50

60


num

ero

cam

pion

i

codeina>morfina

codeina

neg

pos

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PREPARAZIONE DEL CAMPIONEUrina

PREPARAZIONE DEL CAMPIONEPlasma

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Screening (urina) vs Conferma (plasma)Oppiacei

092>10005

0.4313>10004

010>10003

75277>10002

0832>10001

[6-MAM] 2 ° L[Codeina] 2 ° L[Morfina] 2 ° LOppiaceiPaziente

092>10005

0.4313>10004

010>10003

75277>10002

0832>10001

[6-MAM] 2 ° L[Codeina] 2 ° L[Morfina] 2 ° LOppiaceiPaziente

In verde sono evidenziati i valori inferiori al Cut-Off

Screening (urina) vs Conferma (plasma)Cocaina

4598541>500014

3269197>500013

4828205612

91068>500011

252.685010

6010529

1620>50008

69416>50007

7491>50006

504595

173227>50004

50245>50003

5269342

28423>50001

[BEG] 2 ° L[Cocaina] 2 ° LCocainaPaziente

4598541>500014

3269197>500013

4828205612

91068>500011

252.685010

6010529

1620>50008

69416>50007

7491>50006

504595

173227>50004

50245>50003

5269342

28423>50001

[BEG] 2 ° L[Cocaina] 2 ° LCocainaPaziente


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Screening (urina) vs Conferma (plasma)Cannabinoidi

112>13519

212>13518

40.6>13517

255>13516

73>13515

406>13514

761.2>13513

162.2>13512

1857.9>13511

905.2>13510

80.7>1359

163>1358

641>1357

102>1356

282>1355

24936>1354

81>1353

505>1352

523>1351

[THC-COOH] 2° L[THC] 2° LCannabinoidiPaziente

112>13519

212>13518

40.6>13517

255>13516

73>13515

406>13514

761.2>13513

162.2>13512

1857.9>13511

905.2>13510

80.7>1359

163>1358

641>1357

102>1356

282>1355

24936>1354

81>1353

505>1352

523>1351

[THC-COOH] 2° L[THC] 2° LCannabinoidiPaziente


Screening (urina) vs Conferma (plasma)Amfetamine

0000018303

0000012702

070300>80001

[MDE]2° L

[MDMA]2° L

[MDA]2° L

[Metamfetamine]2° L

[Amfetamine]2° L

AmfetaminePaziente

0000018303

0000012702

070300>80001

[MDE]2° L

[MDMA]2° L

[MDA]2° L

[Metamfetamine]2° L

[Amfetamine]2° L

AmfetaminePaziente


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CONFERME: URINE vs SANGUE

THCTHC-COOH

2 21

THC-COOH312 >135 cannabinoidiPz 10

MDAMDMA

370

MDAMDMA

914 17600

>8000 amfetaminePz 9

MORFINACODEINA6-MAM

13 30.4

MORFINACODEINA6-MAM

34500 990 222

>1000 oppiaceiPz 8

COCAINABEG

68 910

COCAINABEG

3229 74900

>5000 cocainaPz 7

THCTHC-COOH

164


CODEINA

THCTHC-COOH

1

2 10

CODEINAMORFINATHC-COOH

354 203 374

>1000 oppiacei

>135 cannabinoidi

Pz 5

BEG162 BEG11465 >5000 cocainaPz 4

COCAINABEG

1749

COCAINABEG

140160980

>5000 cocainaPz 3

COCAINABEG

45 502

COCAINABEG

17607550

>5000 cocainaPz 2

THCTHC-COOH

5 50

THC-COOH146>135 cannabinoidiPz 1

2° livello plasma(ng/ml)

2° livello urina(ng/ml)


THCTHC-COOH

2 21


MDAMDMA

370

MDAMDMA

914 17600

>8000 amfetaminePz 9

MORFINACODEINA6-MAM

13 30.4

MORFINACODEINA6-MAM

34500 990 222

>1000 oppiaceiPz 8

COCAINABEG

68 910

COCAINABEG

3229 74900

>5000 cocainaPz 7

THCTHC-COOH

164


CODEINA

THCTHC-COOH

1

2 10

CODEINAMORFINATHC-COOH

354 203 374

>1000 oppiacei

>135 cannabinoidi

Pz 5

BEG162 BEG11465 >5000 cocainaPz 4

COCAINABEG

1749

COCAINABEG

140160980

>5000 cocainaPz 3

COCAINABEG

45 502

COCAINABEG

17607550

>5000 cocainaPz 2

THCTHC-COOH

5 50

THC-COOH146>135 cannabinoidiPz 1

2° livello plasma(ng/ml)



Etanolo (primo livello): chimica-clinica

Reazione: Enzimatica (Alcol Deidrogenasi)

Rivelazione: Spettrofotometrica UV (NADH a 340nm)

Tempi di disponibilità del risultato: 18 min

CVa: 3.2 %

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Attività annuale

Attivià annuale (2010): 1204

Valenza sanitaria: 771

Valenza giudiziaria: 431

Positivi perValenza sanitaria: 330 42.8 %Positivi perValenza giudiziaria: 51 11.8 %

Spettri di massa

m/z

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160m/z0

100

%

31

30

32

334440 45 59

577166

747884 9485

96113

102 117123

alcoli1 10 (1.683) Cm (10:11-57:63)1.29e5

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160m/z0

100

%

45

32

314341

39 465958 60 69 1311007078 84 119117

123133144

147150

159

alcoli1 22 (1.904) Cm (21:23-47:64)1.66e5

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160m/z0

100

%

59

4131

29

3932

38

43565545

6069

72131100

779179

94119

114106

123150141

154

alcoli1 28 (2.013) Cm (28:30-49:61)2.30e5

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150m/z0

100

%

31

30 424132 5943 5755 60 69 13111996 109114

128133 148147 149

alcoli1 38 (2.197) Cm (37:39-51:62)7.68e4

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130m/z0

100

%

31

30

41

39

3338

5643

5544

535057

7369 13174 100 119114

alcoli1 99 (3.315) Cm (98:100-49:87)1.82e4

0 20 40 60 80 100 120 1400

100

%

31

30

4532

4346

47 6959 13110070 119114

150 153

alcoli1 16 (1.793) Cm (15:17-46:74)1.45e5

CH3 OH CH3 CH2 OH

CH3 CH2 CH2 OH CH3 CH2 CH2 CH2 OH

CH3 CH

CH3OH CH3 C

CH3

CH3

OH

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Miscela di alcoli ed isomeri

n-Pr

opan

olo

Met

anol

o ETA

NO

LOIs

opro

pano

lo

n-B

utan

olo

t-B

utan

olo

1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50Time1

100

%

Scan EI+TIC

1.69e62.01

1.901.79

1.68

2.203.32

Correlazioni primo livello/conferma

050

100150200250300350400450500

0 100 200 300 400 500

Etanolo, mg/dL (I° livello)

Eta

nolo

, mg/

dL (c

onfe

rma)

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Transferrina carboidrato-carente

Helena Stibler et al, Abnormal microheterogeneity

of transferrin in serum and

cerebrospinal fluid in alcoholism, Acta Med.

Scand, 1978; 204:49-56

Studio condotto sul liquido cerebrospinale di pazienti affetti da degenerazione cerebellare alcolica. Identificazione mediante isoelectrofocusing di isoforme particolari della transferrina caratterizzate da un punto isoelettrico piu elevato (pI >5.7) rispetto aquello dell’isoforma maggiore.


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28

H. Stibler, S. Borg. Glycoprotein glycosyltransferase activities in serum in alcohol-abusing patients and healthy controls. Scand J Clin Lab Invest.

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Ridotta attività degli enzimi galattosiltransferasi e Nacetylglucosaminyltransferasi

Xin Y, Lasker JM, Lieber CS.

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Ridotta attività degli enzimi sialil, galattosil eNacetilglucosaminiltransferasi e aumentata attività della sialidasi.


100% ×=natransferritotaleArea

DSTAreaDST


29/11/2010

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Variante C 2C3


29/11/2010

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Variante BC


CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE

Il “come” non può essere disgiunto dal “che cosa”La massima qualità ed affidabilità di un dato di

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