hovasse agnes 2010

THESE

prsente pour lobtention du grade de

DOCTEUR DE LUNIVERSITE DE STRASBOURG

par

Agns HOVASSE

Protomique : maitrise de l'instrumentation, applications et tude des glycosylations

Soutenue le 29 septembre 2010 devant la commission dexamen :

Dr. Alain VAN DORSSELAER Directeur de thse Dr. Bernard MONSARRAT Rapporteur externe Dr. Nicolas SOMMERER Rapporteur externe Prof. Jacques HAIECH Examinateur interne

"Le savant n'est pas l'homme qui fournit les vraies rponses; c'est celui qui pose les vraies questions." Claude Lvi-Strauss

Remerciements

Ce travail de thse a t ralis au sein du Laboratoire de Spectromtrie de Masse Bio-Organique de l'Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien de Strasbourg (UMR 7178, CNRS-UDS)

Je tiens tout d'abord remercier trs sincrement Alain Van Dorsselaer pour m'avoir permis d'effectuer cette thse dans des conditions exceptionnelles, de m'avoir encourag et fait confiance tout au long de ce priple, mais galement Christine Schaeffer-Reiss pour son encadrement quotidien, son coute et sa grande disponibilit.

Je remercie M. Jacques Haiech d'avoir bien voulu prsider ce jury de thse, ainsi que Messieurs Bernard Monsarrat et Nicolas Sommerer pour avoir accept d'valuer mon travail.

Je remercie galement l'ensemble des personnes avec qui j'ai eu l'occasion de collaborer : Stan Tomavo, Emmanuel Biss, Sandrine Jgou, Clara Cilindre et Andrea Mosca.

Un grand merci tous ceux avec qui j'ai travaill, discut, rigol... au sein du LSMBO :

Avec pour commencer, Sarah Cianferani-Sanglier (ma premire manucure!), Vronique Trimbour (bonne chance pour l'avenir), Vronique Delval, Hlne Diemer et Jennifer Jung (merci ces moments de complicit entre filles) , l'indispensable Fabrice Varrier (l'ambiance ne serait vraiment pas la mme sans toi, et nos ordi non plus d'ailleurs), la tout aussi indispensable Danile Thierse, Fabrice Bertile (les amricains pendant ce temps l...), Cyril Colas (souvent de bon conseil), Laurence Sabatier (un grand merci pour tes coups de pouces dcisifs), Christine Carapito (j'ai beaucoup appris grce toi), l'indescriptible Franois Delalande, Alexandre Burel (la bio-info nous a chang la vie), Dominique Roecklin (pour ta grande contribution l'aventure hmoglobine), Kvin Jeanpert, Jean-Michel Saliou et bien sur mon colloc' Jean-Marc Strub (merci pour ton support technique sans faille mais aussi pour toutes nos discussion "grutesques" et autres).

Merci aux anciens... qui sont ne le sont pas tant que a, Sbastien (toutes ces heures cogiter derrire les machines), Cdric (le prsident du club des clops), Guillaume (pour les pauses salon de th), Laetitia (pour nos nombreuses sances de craquage et de remotivassions), mais aussi Audrey, Laurent, Dimitri et Chrystel.

Merci ceux qui sont en train de finir, Daniel (c'est pas bien de fumer), Nicolas (dit le parisien), Thierry (tu verras, les trappes on finit par s'y attacher... aprs quelques annes) et Bertrand; c'est la dernire ligne droite ce n'est pas le moment de craquer; et merci la relve, Sarah, Magalie, Stphanie, Elie et Amandine

Enfin un grand merci tous ceux qui m'ont permis d'atteindre et de franchir cette tape. Merci Marion, Benjamin et mes parents pour m'avoir toujours soutenu et encourag

malgr mon parcours chaotique. Et pour finir, Richard, un simple merci n'est de loin pas suffisant pour exprimer tout ce que je te dois.

PLAN DETAILLE

INTRODUCTION GENERALE....................................................................................1

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE.........................................................................7 Chapitre 1 : L'analyse des protines N-glycosyles par spectromtrie de masse.................................9 Chapitre 2 : Outils et stratgies pour l'analyse protomique : application l'analyse des glycoprotines.......................................................................................................................................29

RESULTATS................................................................................................................................67

PARTIE 1 : Dveloppements Recherche de l'amlioration des mthodologies d'analyses LC-MS/MS pour l'identification et la caractrisation des protines et des glycoprotines.............69 Chapitre 1 : Dveloppements de nouvelles mthodes pour l'valuation des performances d'un couplage nanoLC-MS/MS......................................................................................................................71 Chapitre 2 : Dveloppements mthodologiques pour la dtection et la caractrisation des protines N-glycosyles......................................................................................................................................101

PARTIE 2 : Applications Application des dveloppements mthodologiques pour l'identification et la caractrisation des protines et des glycoprotines diffrentes thmatiques biologiques....................................................................................................................................133 Chapitre 3 : Identification et caractrisation de protines et de glycoprotines du parasite Toxoplasma gondii...................................................................................................................................................135 Chapitre 4 : Application de la mthodologie protomique dveloppe l'tude des protines des vins de Champagne....................................................................................................................................159 Chapitre 5 : Quantification de HbA2 et tude des mutations de l'hmoglobine humaine...................175

CONCLUSION GENERALE.............................................................................................211 PARTIE EXPERIMENTALE..............................................................................................217

INTRODUCTION GENERALE....1 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE...7 Chapitre 1 : L'analyse des protines N-glycosyles par spectromtrie de masse......9

1. La glycosylation une des modifications post-traductionnelles les plus courantes ............................................................................................................................................ 9

1.1. Les modifications post-traductionnelles ................................................................................. 9 1.2. Le cas des glycosylations ....................................................................................................... 11

1.2.1. Les glycosylations ................................................................................................................ 11 1.2.2. Les N-glycosylations ............................................................................................................ 12

2. Stratgies pour la caractrisation des protines N-glycosyles par spectromtrie de masse ............................................................................................................. 15

2.1. Analyse des glycoprotines entires ..................................................................................... 16 2.1.1. De l'chantillon biologique complexe aux glycoprotines : techniques de sparations et d'enrichissements........................................................................................................................... 16 2.1.2. Analyse de glycoprotines entires par spectromtrie de masse ....................................... 17

2.2. Des glycoprotines aux glycopeptides .................................................................................. 18 2.2.1. Utilisation de diffrentes endoprotases pour gnrer les glycopeptides ........................... 19 2.2.2. Mthodes de fractionnement et d'enrichissement des glycopeptides ................................. 19

2.3. Analyse des peptides dglycosyls ....................................................................................... 20 2.4. Analyse des glycopeptides intacts ......................................................................................... 22

2.4.1. Dtection des glycopeptides grce aux ions diagnostiques ................................................ 22 2.4.2. Lanalyse MSn des glycopeptides ........................................................................................ 24

3. Conclusion .................................................................................................................................. 28

Chapitre 2 : Outils et stratgies pour l'analyse protomique : application l'analyse des glycoprotines....29

1. La spectromtrie de masse : un outil central pour la caractrisation des protines. .......................................................................................................................................... 30

1.1. Les sources d'ionisation .......................................................................................................... 30 1.1.1. La source lectrospray (ESI)................................................................................................ 31

1.1.1.1. Processus d'ionisation-dsorption ESI .......................................................................... 31 1.1.1.2. La source nano-lectrospray......................................................................................... 31 1.1.1.3. L'ionisation des glycoprotines et des glycopeptides.................................................... 32

1.1.2. MALDI .................................................................................................................................. 33 1.2. Les analyseurs .......................................................................................................................... 34

1.2.1. Le quadriple........................................................................................................................ 34 1.2.2. La trappe ionique ................................................................................................................. 35 1.2.3. Le Q-TOF : un analyseur en tandem ................................................................................... 38

1.3. La fragmentation peptidique ................................................................................................... 39 1.3.1. Nomenclature des fragments peptidiques ........................................................................... 39 1.3.2. La fragmentation induite par collision (CID) : le modle du proton mobile .......................... 40 1.3.3. La dissociation par transfert d'lectron (ETD)...................................................................... 41

2. Les stratgies protomiques bases sur les techniques sparatives .............. 42 2.1. Sparation des protines ......................................................................................................... 43

2.1.1. L'lectrophorse sur gel bidimensionnel (Gel 2D) ............................................................... 43 2.1.2. L'lectrophorse sur gel monodimensionnel (Gel 1D ou SDS-PAGE) ................................ 43 2.1.3. Sparation des protines par chromatographie liquide (LC) ............................................... 44

2.2. Sparation des peptides .......................................................................................................... 44 2.2.1. La sparation des peptides par nano-chromatographie liquide (nanoLC)........................... 44 2.2.2. La chromatographie liquide multidimensionnelle : l'approche "shotgun"............................. 45

3. Les stratgies d'identification en analyse protomique par spectromtrie de masse ................................................................................................................................................. 47

3.1. Les stratgies d'identification de protines........................................................................... 47 3.1.1. L'empreinte peptidique massique (Peptide Mass Fingerprint (PMF)).................................. 47 3.1.2. Identification par LC-MS/MS ................................................................................................ 48

3.1.2.1. L'empreinte de fragmentation peptidique (Peptide Fragment Fingerprinting (PFF)) .... 49 3.1.2.2. Le squenage de novo ................................................................................................ 50

3.2. Les banques de donnes ......................................................................................................... 51 3.3. Evaluation des rsultats........................................................................................................... 52

4. Conclusion .................................................................................................................................. 54

RESULTATS..67

PARTIE 1 : Dveloppements Recherche de l'amlioration des mthodologies d'analyses LC-MS/MS pour l'identification et la caractrisation des protines et des glycoprotines....69

Chapitre 1 : Dveloppement de nouvelles mthodes pour l'valuation des performances d'un couplage nanoLC-MS/MS.....71

1. Description du systme nanoLC-Chip/HCT Ultra ....................................................... 73 2. Optimisation des conditions chromatographiques ................................................... 75

2.1. Optimisation des mthodes chromatographiques................................................................ 75 2.2. Choix du modifieur organique : Optimisation d'une mthode nanoLC-MS utilisant le mthanol comme modifieur organique de la phase mobile ........................................................ 76

2.2.1. Conditions exprimentales................................................................................................... 77 2.2.2. La contrepression................................................................................................................. 77 2.2.3. La sensibilit......................................................................................................................... 78 2.2.4. Pouvoir lutif......................................................................................................................... 79 2.2.5. Rsolution chromatographique ............................................................................................ 81

2.3. Discussion et conclusion ........................................................................................................ 82 3. Optimisation des paramtres de la trappe ionique.................................................... 84

3.1. Optimisation de l'interface ....................................................................................................... 84 3.1.1. La source.............................................................................................................................. 84 3.1.2. La transmission .................................................................................................................... 84

3.2. Optimisation des paramtres d'acquisition en mode MS/MS automatique........................ 84 3.2.1. Les cycles d'acquisition en mode MS/MS automatique....................................................... 84 3.2.2. Conditions exprimentales................................................................................................... 85 3.2.3. Le nombre de spectres moyenns....................................................................................... 86 3.2.4. Nombre de parents slectionns pour tre fragments en MS/MS..................................... 87 3.2.5. Exclusion temporaire des ions parents aprs slection....................................................... 88

3.3. Discussion et conclusion ........................................................................................................ 88 4. Dveloppement de tests permettant d'valuer les performances du couplage nanoLC-Chip/HCT Ultra .............................................................................................................. 90

4.1. Intensit des pics chromatographiques................................................................................. 91 4.2. Largeur des pics chromatographiques mi-hauteur ........................................................... 92 4.3. Diffrence entre les temps de rtention des deux ions de rfrence ................................. 92 4.4. Rsolution spectrale................................................................................................................. 93 4.5. Identification de la protine ..................................................................................................... 93 4.6. Discussion et conclusion ........................................................................................................ 94

5. Nouveaut instrumentale : la trappe amaZon .............................................................. 95 5.1. Gomtrie de l'instrument ....................................................................................................... 95

5.2. Vitesse de balayage.................................................................................................................. 95 5.3. Rsolution spectrale................................................................................................................. 96 5.4. Sensibilit .................................................................................................................................. 98 5.5. Conclusion ................................................................................................................................ 98

6. Discussion et conclusion...................................................................................................... 99

Chapitre 2 : Dveloppements mthodologiques pour la dtection et la caractrisation des protines N-glycosyles....101

1. Introduction............................................................................................................................... 102 1.1. Une glycoprotine modle : lalpha-1 glycoprotine acide humaine (AGP) ............................. 102 1.2. Les ions diagnostiques ............................................................................................................. 103

2. Comparaison de diffrentes gomtries d'instruments pour la gnration d'ions diagnostiques.................................................................................................................. 106

2.1. Gnration d'ions diagnostiques par CID en source .......................................................... 106 2.1.1. Interface comprenant un capillaire de transmission et un skimmer................................... 106 2.1.2. Interface comprenant un capillaire de transmission et des funnels ................................... 108 2.1.3. Interface de type Z-spray ................................................................................................... 110 2.1.4. Discussion et conclusion.................................................................................................... 112

2.2. La gnration d'ions diagnostiques par CID dans la cellule de collision......................... 113 2.2.1. Les trappes ioniques .......................................................................................................... 113 2.2.2. Les Q-TOF ......................................................................................................................... 114 2.2.3. Discussion et conclusion.................................................................................................... 116

2.3. CID en source vs CID dans la cellule de collision pour un Q-TOF .................................... 117 2.3.1. Intensit des ions diagnostiques en fonction du mode de fragmentation.......................... 117 2.3.2. Type d'ion diagnostique gnr en fonction du mode de fragmentation ........................... 118 2.3.3. Discussion et conclusion.................................................................................................... 118

2.4. Discussion et conclusion ...................................................................................................... 119 3. Stratgie dveloppe pour la caractrisation des protines N-glycosyles 121

3.1. Digestion enzymatique : obtention de glycopeptides ........................................................ 121 3.2. Analyse LC-MS : gnration d'ions diagnostiques ............................................................. 122 3.3. Analyse LC-MS/MS : caractrisation des glycopeptides.................................................... 122

4. Conclusion ................................................................................................................................ 125

PARTIE 2 : Applications Application des dveloppements mthodologiques pour l'identification et la caractrisation des protines et des glycoprotines diffrentes thmatiques biologiques...133

Chapitre 3 : Identification et caractrisation de protines et de glycoprotines du parasite Toxoplasma gondii......135

1. Contexte gnral de l'tude ............................................................................................... 135 1.1. Introduction ............................................................................................................................. 135 1.2. Le parasite Toxoplasma gondii ............................................................................................. 136

1.2.1. Cycle d'infection et de reproduction de T. gondii ............................................................... 136 1.2.2. Reconnaissance et invasion de la cellule hte .................................................................. 137

2. Etude des glycoprotines impliques dans le mcanisme de reconnaissance et d'infection de la cellule hte par le parasite T. gondii............................................ 139

2.1. Contexte de l'tude ................................................................................................................. 139 2.2. Mthodologie........................................................................................................................... 139

2.2.1. Prparation d'chantillon et analyse protomique ............................................................. 139

2.2.2. Identification des glycoprotines par analyse nanoLC-MS/MS et recherche dans le gnome complet non annot de T. gondii.................................................................................................. 140 2.2.3. Caractrisation de protines N-glycosyles....................................................................... 142

2.3. Rsultats publis .................................................................................................................... 142 2.4. Conclusion et perspectives ................................................................................................... 143

3. Caractrisation des glycosylations de la protine GAP50 ................................... 147 3.1. Contexte de l'tude ................................................................................................................. 147 3.2. Mthodologie........................................................................................................................... 147

3.2.1. Prparation d'chantillon.................................................................................................... 147 3.2.2. Caractrisation des glycosylations de GAP 50 .................................................................. 147

3.3. Rsultats .................................................................................................................................. 148 3.3.1. Digestion enzymatique....................................................................................................... 148 3.3.2. Analyse nanoLC-MS : dtection des ions diagnostiques................................................... 148 3.3.3. Analyse nanoLC-MS/MS : caractrisation des glycopeptides ........................................... 149 3.3.4. Rsultats ............................................................................................................................ 150

3.4. Conclusion et perspectives ................................................................................................... 152 4. Etude des facteurs nuclaires impliqus dans la rgulation de l'expression des gnes de T. gondii .............................................................................................................. 153

4.1. Contexte de l'tude ................................................................................................................. 153 4.2. Mthodologie........................................................................................................................... 153

4.2.1. Prparation d'chantillon.................................................................................................... 154 4.2.2. Analyse protomique ......................................................................................................... 154

4.3. Rsultats .................................................................................................................................. 154 4.4. Discussion et conclusion ...................................................................................................... 155

Chapitre 4 : Application de la mthodologie protomique dveloppe l'tude des protines des vins de Champagne159

1. Analyse protomique diffrentielle des vins de Champagne contamins par Botrytis cinerea ............................................................................................................................ 160

1.1. Contexte de l'tude. ................................................................................................................ 160 1.2. Stratgie protomique............................................................................................................ 160

1.2.1. Prparation d'chantillon.................................................................................................... 160 1.2.2. Analyse protomique ......................................................................................................... 160

1.3. Rsultats publis .................................................................................................................... 161 1.4. Conclusion et perspectives ................................................................................................... 161

2. Caractrisation des glycosylations de l'invertase vacuolaire de raisin.......... 165 2.1. Contexte de l'tude ................................................................................................................. 165 2.2. Mthodologie........................................................................................................................... 166

2.2.1. Purification de l'invertase vacuolaire de raisin ................................................................... 166 2.2.2. Caractrisation des glycosylations de l'invertase vacuolaire de raisin .............................. 166

2.2.2.1. Analyse des glycopeptides intacts .............................................................................. 166 2.2.2.2. Analyse de la protine dglycosyle ........................................................................... 166

2.3. Rsultats .................................................................................................................................. 166 2.3.1. Purification de l'invertase vacuolaire de raisin ................................................................... 166 2.3.2. Caractrisation des glycosylations de l'invertase vacuolaire de raisin .............................. 167

2.3.2.1. Analyse des glycopeptides intacts .............................................................................. 167 2.3.2.2. Analyse de la protine dglycosyle ........................................................................... 169

2.4. Conclusion et perspectives ................................................................................................... 171

Chapitre 5 : Quantification de HbA2 et tude des mutations de l'hmoglobine humaine175

1. Introduction............................................................................................................................... 175 2. Quantification de HbA2 ........................................................................................................ 177

2.1. Contexte de l'tude ................................................................................................................. 177

2.2. Stratgie................................................................................................................................... 178 2.3. Dveloppement mthodologique .......................................................................................... 179

2.3.1. Choix de l'endoprotase..................................................................................................... 179 2.3.2. Protocole de digestion........................................................................................................ 180 2.3.3. Choix des peptides spcifiques pour la quantification ....................................................... 181 2.3.4. Sparation chromatographique.......................................................................................... 182 2.3.5. Limite de quantification ...................................................................................................... 183 2.3.6. Etalonnage par LC-MS....................................................................................................... 184

2.4. Rsultats et discussion.......................................................................................................... 184 2.5. Conclusion et perspectives ................................................................................................... 187

3. Caractrisation de mutations de l'hmoglobine ....................................................... 191 3.1. Contexte de l'tude ................................................................................................................. 191 3.2. Rsultats .................................................................................................................................. 193

3.2.1. Caractrisation de la mutation "Noah Mehmet Oeztuerk" ................................................. 193 3.2.2. Caractrisation d'une nouvelle mutation sur la chaine beta 93CysSer.......................... 194

3.3. Conclusion et perspectives ................................................................................................... 196 4. Quantification de HbA2 et dtection des mutations les plus courantes tels que Hb C, E, S et A2 par une approche protomique ................................................. 199

4.1. Contexte de l'tude ................................................................................................................. 199 4.2. Rsultats .................................................................................................................................. 200 4.3. Conclusion et perspectives ................................................................................................... 202

5. Conclusion ................................................................................................................................ 203

CONCLUSION GENERALE..211 PARTIE EXPERIMENTALE..217

Liste des principales abrviationsListe des principales abrviationsListe des principales abrviationsListe des principales abrviations

ACN : Actonitrile ADN : Acide dsoxyribonuclique BPC : Base Peak Chromatogram BLAST : Basic Local alignment Search Tool BSA : Bovin Serum Albumin CID : Collision-Induced Dissociation Da : Dalton DDA : Data Dependent Analysis ECD : Electron Capture Dissociation EIC : Extracted Ion Chromatogram ESI : Electrospray Ionisation ETD : Electron Transfer Dissociation eV : electron Volt Gel 1D : Gel d'lectrophorse monodimensionnel Gel 2D : Gel d'lectrophorse bidimensionnel Hb : Hmoglobine HPLC : High Performance Liquid Chromatography ISCID : Ion Source Collision Induced Dissociation IT : Ion Trap LC : Liquid Chromatography LOD : Limit Of Detection LOQ : Limit Of Quantification MALDI : Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation MS : Spectromtrie de Masse MS/MS : Spectromtrie de masse en tandem m/z : mass to charge ratio NanoLC-MS/MS : Nano liquid chromatography tandem mass spectrometry PFF : Peptide Fragment Figerprint PMF : Peptide Mass Fingerprint ppm : parties par million PTM : Post-translational Modification Q : Quadriple RP : Reverse Phase SCX : Strong Cation Exchange SDS-PAGE : Sodium DodecylSulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis TOF : Time of Flight UHPLC : Ultra High Pressure Liquid Chromatography

Liste des acides amins les plus courantsListe des acides amins les plus courantsListe des acides amins les plus courantsListe des acides amins les plus courants

Burlingame A.L. and Carr S. A., Mass Spectrometry in the biological sciences, Humana Press, 1996,

p. 542-545.

Codes Acides amins

Trois lettres Une lettre

Masse monoisotopique

du rsidu a (Da)

Glycine Gly G 57,022 Alanine Ala A 71,037 Srine Ser S 87,032 Proline Pro P 97,053 Valine Val V 99,068 Thronine Thr T 101,048 Cystine Cys C 103,009 Isoleucine Ile I 113,084 Leucine Leu L 113,084 Asparagine Asn N 114,043 Acide aspartique Asp D 115,027 Glutamine Gln Q 128,059 Lysine Lys K 128,095 Acide glutamique Glu E 129,043 Mthionine Met M 131,041 Histidine His H 137,059 Phnylalanine Phe F 147,068 Arginine Arg R 156,101 Tyrosine Tyr Y 163,063 Tryptophane Trp W 186,079

Liste des monosaccharides les plus Liste des monosaccharides les plus Liste des monosaccharides les plus Liste des monosaccharides les plus

couramment observscouramment observscouramment observscouramment observs

Burlingame A.L. and Carr S. A., Mass Spectrometry in the biological sciences, Humana Press, 1996, p. 542-545.

Famille Monosaccharides Abrviations Masses monoisotopiques des rsidus non drivs

(Da) a Pentoses (Pent) Xylose Xyl 132,04 Deoxyhexoses (DeoxyHex) Fucose Fuc 146,06

Galactose Gal 162,05 Glucose Glc 162,05 Hexoses (Hex) Mannose Man 162,05 N-actylglucosamine GlcNAc 203,08 N-actylhexosamines

(HexNAc) N-actylgalactosamine GalNAc 203,08 Acides sialiques (SA) Acide N-

actylneuraminique NeuAc 291,10

a Masse dun rsidu + Masse des groupements terminaux non drivs (R+OR ; 18,01 Da) = Masse dun monosaccharide. Addition des masses de plusieurs rsidus + 18,01 = masse dun polysaccharide.

O O R O ORM M M

M: reprsentation schmatique dun monosaccharide quelconque

R et OR : groupements terminaux dun polysaccharide.

R = H pour un monosaccharide non driv.

Masse

dun rsidu

O O R O ORM M M

M: reprsentation schmatique dun monosaccharide quelconque

R et OR : groupements terminaux dun polysaccharide.

R = H pour un monosaccharide non driv.

Masse

dun rsidu

INTRODUCTION GENERALEINTRODUCTION GENERALEINTRODUCTION GENERALEINTRODUCTION GENERALE

INTRODUCTION GENERALE

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IIIINTRODUCTION GENERALENTRODUCTION GENERALENTRODUCTION GENERALENTRODUCTION GENERALE

Aprs plus de 10 ans d'utilisation en biologie, la protomique est souvent considre comme

une mthodologie de routine. Ce point de vue est quotidiennement infirm puisque, bien souvent, lanalyse protomique ne permet pas dapporter toutes les donnes exprimentales ncessaires pour rpondre aux questions poses par les biologistes. Les limitations de lanalyse protomique concernent bien sr la sensibilit, la prcision dans les mesures de masse mais aussi la possibilit de raliser et dexploiter de grandes sries danalyses. A ces limitations, sajoute celle lie la caractrisation complte des modifications post-traductionnelles, avec leur htrognit, qui reste pour linstant difficilement ralisable.

Il est donc clair quil est encore ncessaire de dvelopper les mthodologies de lanalyse protomique, qui ne rpond pas, et de loin, tous les problmes poss en biologie. Cest dans ce cadre que se situe mon travail de thse.

Mon travail thse sest principalement focalis sur un aspect du dveloppement mthodologique en protomique : lamlioration de la mthodologie instrumentale en nanoLC-MS/MS et plus particulirement dans le cadre de la caractrisation des protines N-glycosyles et de la micro-htrognit des N-glycosylations. Ces dernires annes, il a t montr que, contrairement ce qui a longtemps t suppos, des diffrences apparemment minimes dans la structure des glycanes des N-glycosylations pouvaient entrainer des changements radicaux dans lactivit biologique des protines concernes. Jai donc tent de dvelopper des moyens nouveaux pour mieux caractriser la micro-htrognit des sites de glycosylations, c'est--dire de dcrire lensemble des structures glycaniques prsentes sur un mme site de N-glycosylation. Jai en particulier essay de comprendre pourquoi il tait difficile de dtecter les glycopeptides obtenus aprs digestion des protines et tent doptimiser cette dtection en utilisant lapproche des "ions diagnostiques" qui devait, selon la littrature, apporter plus de sensibilit. Enfin, nous avons orient nos dveloppements mthodologiques pour rpondre une demande trs frquente des biologistes : fournir des rsultats fiables sur des chantillons qui ne peuvent tre obtenus quune seule fois et disponibles en quantits trs faibles. Les stratgies analytiques dvelopper dans ces cas sont videmment trs diffrentes de celles couramment utilises lors de travaux o les chantillons biologiques sont disponibles en quantits suffisantes pour pouvoir rpter les expriences en optimisant les conditions danalyse. Les dveloppements mthodologiques obtenus pendant mon travail ont ensuite t appliqus dans le cadre de plusieurs collaborations avec des biologistes. Mon manuscrit de thse est prsent comme suit :


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L INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE de ce manuscrit de thse prsente dabord, dans un premier chapitre, les mthodes de caractrisation des N-glycosylations utilises lorsque jai commenc mon travail et, dans un second chapitre, linstrumentation et les stratgies protomiques utilises en gnral. Cette introduction tentera galement de mettre en vidence les axes pour lesquels des progrs mthodologiques sont faire en analyse protomique des glycoprotines.

Les RESULTATS obtenus pendant mon travail de thse sont ensuite exposs en deux parties : une partie "Dveloppements mthodologiques" suivie dune partie "Application des problmes biologiques".

La partie "Dveloppements mthodologiques" est focalise sur la LC-MS/MS et comprend 2 chapitres :

Le chapitre 1 porte sur l'optimisation d'un couplage nanoLC-MS/MS et sur le dveloppement de mthodes permettant de vrifier les performances de ce systme. Les optimisations ont port la fois sur la partie chromatographique et sur le paramtrage du spectromtre de masse. Ce travail m'a permis de dvelopper un ensemble de tests permettant de vrifier les performances de chacun des modules du couplage et dtablir des diagnostiques en cas de panne.

Le chapitre 2 est consacr au dveloppement d'une mthodologie pour la caractrisation des protines N-glycosyles. Notre stratgie est base sur l'utilisation de techniques protomiques classiques (digestion enzymatique, LC-MS et LC-MS/MS) et sur la gnration d'ions dits "diagnostiques" qui sont spcifiques de la fragmentation des glycopeptides. Plusieurs mthodes d'obtention des ions diagnostiques ont t exprimentes (CID en source ou CID dans la cellule de collision) sur diffrents spectromtres de masse disponibles au laboratoire, chacun ayant des gomtries de source et d'analyseur diffrentes.

La partie "Application des problmes biologiques" dcrit les rsultats obtenus lors de 3 collaborations avec des biologistes o nous avons appliqu les mthodes danalyse protomique que nous avons mises au point et dcrites dans la partie "Dveloppements mthodologiques".

Le chapitre 3 prsente lutilisation squentielle de plusieurs stratgies appliques l'tude du parasite Toxoplasma gondii et se divise en trois points :

o Nous avons tudi les glycoprotines impliques dans le mcanisme d'invasion (le glideosome) de la cellule hte par le parasite et nous avons caractris un site de glycosylation de l'une d'entre elles, GAP50; o Dans un deuxime temps, une stratgie plus adapte, nous a permis de caractriser plus

finement la protine GAP50 en dcrivant la micro-htrognit pour chacun des 3 sites de glycosylation; o Enfin, grce une augmentation de sensibilit obtenue par une srie doptimisations,

nous avons pu identifier une srie de facteurs de transcription impliqus dans le mcanisme


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d'interconversion entre la forme virulente tachyzote et la forme dormante bradyzote du parasite. Ce travail a permis d'identifier un facteur nuclaire qui a t nomm TgNF3 et dont le rle a pu tre tudi de manire plus approfondie par nos collaborateurs. Le chapitre 4 prsente la premire tude protomique ralise sur des vins de Champagne

ainsi qu'une caractrisation des glycosylations dune protine importante pour la moussabilit du vin, linvertase vacuolaire :

o Une premire partie est consacre une analyse diffrentielle par gel d'lectrophorse bidimensionnel entre un vin vinifi partir de raisins contamins par le champignon Botrytis cinerea et un vin sain; o La seconde partie de cette tude a port sur la caractrisation de l'invertase vacuolaire de

raisin qui constitue une des protines majeures du vin et qui possde 12 sites potentiels de N-glycosylation. Enfin, le chapitre 5 porte sur la mise au point de stratgies de quantification dune forme

dhmoglobine (HbA2) et sur la caractrisation de formes mutes des hmoglobines : o Une mthode de quantification fine de l'hmoglobine humaine HbA2 a ainsi t

dveloppe dans le but d'obtenir une mthode de rfrence pour certifier des chantillons standards pour talonner les instruments couramment utiliss pour quantifier l'hmoglobine HbA2 dans les laboratoires d'hmatologie; o Nous avons galement dvelopp une stratgie permettant de caractriser de nouvelles

mutations de l'hmoglobine lorsque les mthodes danalyse classiques sont inefficaces; o Enfin, nous avons largi la mthode de quantification la dtection des mutations les plus

courantes.

INTRODUCTION INTRODUCTION INTRODUCTION INTRODUCTION

BIBLIOGRAPHIQUEBIBLIOGRAPHIQUEBIBLIOGRAPHIQUEBIBLIOGRAPHIQUE

L'analyse des protines N-glycosyles par spectromtrie de masse

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Chapitre 1Chapitre 1Chapitre 1Chapitre 1


1. La glycosylation une des modifications post-traductionnelles les plus courantes

1.1. Les modifications post-traductionnelles

Une modification post-traductionnelle d'une protine se dfinit comme une modification chimique covalente catalyse par des enzymes, qui se produit aprs que l'ADN ait t transcrit en ARN, elle-mme traduite en protines.

Les modifications post-traductionnelles (Post-Translational Modifications PTMs) modulent souvent profondment les proprits biologiques d'une protine. Ces PTMs peuvent prendre plusieurs formes. Elles peuvent consister en :

Une modification de la structure primaire de la protine par addition ou clivage d'un ou plusieurs acides amins;

Une modification des extrmits N- ou C-terminales par fixation dun groupement; Une modification de la chaine latrale dun acide amin par fixation covalente dun

groupement; Un clivage protolytique.

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE : Chapitre 1

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Le Tableau 1 prsente les PTMs les plus courantes. Plusieurs PTMs, diffrentes ou non,

peuvent affecter la mme protine. Environ 80% des cellules de mammifre contiennent des PTMs. Elles vont dterminer lactivit dune protine et donc son rle au sein de la cellule. Elles sont impliques dans tous les processus biologiques tels que la division cellulaire, la diffrenciation ou les interactions htes-pathognes [M. Mann et Jensen 2003]. C'est pourquoi leur caractrisation est un enjeu fondamental pour l'tude du fonctionnement cellulaire.

Les PTMs les plus rpandues correspondent des additions covalentes parmi lesquels on trouve la phosphorylation, la glycosylation, lubiquitination, la mthylation et lactylation [Jensen 2006]. Chacune de ces PTMs aux fonctions biologiques variables se produit sur des acides amins donns et entrane des diffrences de masse par rapport lacide amin non-modifi. Ces diffrences de masse sont dtectables par spectromtrie de masse [Jensen 2006].

Modifications post-traductionnelles

(acides amins modifis)

Diffrence de masse

(Da)Exemples de leurs

fonctions biologiques

Phosphorylation(Ser, Thr, Tyr)

Sulfatation(Tyr)

Glycosylation(Asn, Ser, Thr)

Ubiquitination(Lys)

Mthylation(Lys mono-, di- et trimthylation)(Arg mono- et dimthylation)(His monomthylation)

Actylation(Lys N-terminal)

Oxydation(Met)(Trp)

Ponts disulfures(Cys)

80

80

203 > 1000

> 1000

14, 28, 4214, 2814

42

164, 16, 32

- 2

Transduction du signal, rgulation de lactivit enzymatique, interactions protines-protines ou protines-ligands

Signalisation et localisation des protines, interactions protines-protines

Stabilit, solubilit, scrtion du signal, rgulation des interactions, reconnaissance et interaction extracellulaire

Signal pour dgradation des protines, interactions protines-protines

Rgulation de lactivit des protines, interaction protines-protines et protines-acides nucliques, activit des gnes (histones)

Stabilit et activit des protines, rgule interactions protines-protines et protines-ligands

Peut rguler lactivit des protines mais il sagit souvent dun artfact chimique

Stabilise lactivit et la structure des protines, impliqu dans des processus rdox

Modifications post-traductionnelles

(acides amins modifis)

Diffrence de masse

(Da)Exemples de leurs

fonctions biologiques

Phosphorylation(Ser, Thr, Tyr)

Sulfatation(Tyr)

Glycosylation(Asn, Ser, Thr)

Ubiquitination(Lys)

Mthylation(Lys mono-, di- et trimthylation)(Arg mono- et dimthylation)(His monomthylation)

Actylation(Lys N-terminal)

Oxydation(Met)(Trp)

Ponts disulfures(Cys)

80

80

203 > 1000

> 1000

14, 28, 4214, 2814

42

164, 16, 32

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Transduction du signal, rgulation de lactivit enzymatique, interactions protines-protines ou protines-ligands

Signalisation et localisation des protines, interactions protines-protines

Stabilit, solubilit, scrtion du signal, rgulation des interactions, reconnaissance et interaction extracellulaire

Signal pour dgradation des protines, interactions protines-protines

Rgulation de lactivit des protines, interaction protines-protines et protines-acides nucliques, activit des gnes (histones)

Stabilit et activit des protines, rgule interactions protines-protines et protines-ligands

Peut rguler lactivit des protines mais il sagit souvent dun artfact chimique

Stabilise lactivit et la structure des protines, impliqu dans des processus rdox

Tableau 1. PTMs les plus couramment observes, diffrences de masse gnres et exemples de leurs fonctions biologiques [Jensen 2006]

Cependant, comme illustr dans le Tableau 1, plusieurs acides amins peuvent subir la mme

modification (cas par exemple de la phosphorylation). De mme, des modifications de nature diffrente peuvent engendrer des diffrences de masses trs proches (par exemple la phosphorylation et la sulfatation ou la trimthylation et lactylation). Cela peut rendre lidentification et la localisation de la modification difficile et leur tude par analyse protomique peut rapidement savrer complique.


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De plus, il est courant de constater que les protines sont partiellement modifies, ainsi les protines et les peptides portant des PTMs sont souvent prsents en faible quantit dans les extraits rendant leur dtection difficile.

Cest pourquoi, de nombreuses mthodologies ont t dveloppes qui incluent les optimisations instrumentales, mais galement des mthodes denrichissements, de marquages chimiques spcifiques ou des combinaisons denzymes de digestions notamment [Hoffman et al. 2008].

1.2. Le cas des glycosylations

1.2.1. Les glycosylations

Une glycosylation correspond la liaison covalente dun glycane sur la chaine latrale d'un acide amin d'une protine. Ces glycanes sont constitus d'une succession de monosaccharides qui forment une structure polysaccharidique. Les rsidus les plus frquemment observs sont dcrits

dans le Tableau 2.

Monosaccharides

Xylose Fucose

Galactose Glucose Mannose

N-actylglucosamineN-actylgalactosamine

Acide N-actylneuraminique

Masses monoisotopiquesdes rsidus (Da)

132,04146,06162,05162,05162,05203,08203,08291,10

Abrviations

XylFucGalGlcMan

GlcNAcGalNAcNeuAc

SymbolesMonosaccharides

Xylose Fucose

Galactose Glucose Mannose

N-actylglucosamineN-actylgalactosamine

Acide N-actylneuraminique

Masses monoisotopiquesdes rsidus (Da)

132,04146,06162,05162,05162,05203,08203,08291,10

Abrviations

XylFucGalGlcMan

GlcNAcGalNAcNeuAc

Symboles

Tableau 2. Noms, abrviations, symboles et masses des monosaccharides les plus couramment observs dans les structures des glycanes. La nomenclature des symboles a t tablie par le Consortium for functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)

La glycosylation est prsente aussi bien chez les eucaryotes que chez les procaryotes [Upreti et al. 2003], et reprsente une des PTMs les plus courantes. En effet, d'aprs une tude ralise par Apweiler partir de la banque protique SWISS-PROT, plus de la moiti des protines existantes seraient glycosyles [R. Apweiler et al. 1999]. Elles reprsentent la majorit des marqueurs de surface cellulaires ainsi que des protines scrtes. Elles ont une influence fondamentale sur les proprits physicochimiques de la protine telles que sa stabilit, sa conformation ou sa capacit tre dgrade par une protase par exemple [Rudd et al. 2001]. De plus, elles jouent un rle clef dans un grand nombre de processus biologiques comme le dveloppement embryonnaire ou la communication cellulaire [Dwek 1996]. De nombreuses tudes ont permis d'observer des corrlations entre des glycosylations anormales et des cas de cancer, de maladies inflammatoires ou du foie


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[Dube et Bertozzi 2005, Blomme et al. 2009]. La caractrisation des glycoprotines peut ainsi tre utilise pour dvelopper des vaccins, des mdicaments ou des mthodes de diagnostiques pour ces maladies [Dube et Bertozzi 2005].

Il existe deux principaux types de liaisons sucre-protine qui dpendent de la nature de la

liaison covalente entre le glycane et l'acide amins ( Figure 1) : les O-glycosylations et les N-glycosylations.

O-glycosylation N-glycosylation

OO

R

O

NH

NHAc

HOHO

OH

Srine ou Thronine

O

OH

OHO

NHAc

HN O

O

NH

AsparagineN-Actyle GlucosamineN-Actyle Glucosamine

Figure 1. Structures chimiques des liaisons sucre-protine pour les O et N-glycosylations

Les O-glycosylations : le rsidu monosaccharide se lie la protine par le groupement hydroxyl des rsidus srine (Ser), thronine (Thr), hydroxyproline (Hyp) ou hydroxylysine. La plus rpandue est la O-glycosylation de type mucine o le rsidu N-acetylglucosamine (GlcNAc) du glycane se lie la srine ou la thronine.

Les N-glycosylations : le glycane est attach la protine par le groupement amide dune asparagine (Asn) via le rsidu N-actylglucosamine (GlcNAc). Lasparagine doit se situer dans un motif Asn-X-Ser/Thr (X pouvant tre nimporte quel acide amin sauf une proline) qui est appel squence consensus. Dans de rares cas l'acide amin Ser/Thr est remplac par une cystine [Satomi et al. 2004]. Leur chemin de biosynthse tant commun, tous les N-glycanes ont un squelette pentasaccharide identique qui est constitu de 3 mannoses et de 2 N-actylglucosamines (Man3GlcNAc2) [Helenius et Aebi 2001].

Dans la suite de ce chapitre nous nous intresserons plus particulirement au cas des N-glycosylations.

1.2.2. Les N-glycosylations

Les N-glycosylations sont constitues d'un tronc commun dont la squence est : Man3GlcNAc2

(entoure en rouge sur la Figure 2). Le GlcNAc proximal est fix sur lasparagine de la squence consensus.


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Chemin de synthse des N-glycoprotines

Rticulum Endoplasmique Appareil de Golgi

Ma

mm

ifre

sPl

an

tes

Type high mannose Type hybride Type complexe

Type high mannose Type hybride Type Le

Avec: N-actylglucosamine (GlcNAc)Mannose (Man)Galactose (Gal)Acide N-actylneuraminique (NeuAc)Fucose (Fuc)Xylose (Xyl)

Asn Asn Asn

Asn Asn Asn



Ma

mm

ifre

sPl

an

tes




Asn Asn Asn

Asn Asn Asn



Ma

mm

ifre

sPl

an

tes





AsnAsn AsnAsnAsn AsnAsn

AsnAsn AsnAsnAsn AsnAsn

Figure 2. Exemple de structures de N-glycanes couramment trouvs dans les plantes et les mammifres aux diffrents stades de leur biosynthse [Bednarczyk 2008]

Les N-glycanes peuvent tre classs en 3 types en fonction de la nature et de la localisation des ramifications, appeles antennes [Dalpathado et Desaire 2008] :

Les high-mannoses quand les ramifications sont constitues uniquement de mannoses; Les N-glycanes complexes quand les antennes contiennent des N-acetylglucosamines, des

galactoses, des fucoses et/ou des acides sialiques. Ils constituent la classe la plus abondante des oligosaccharides prsents chez les mammifres et leur structure est caractrise par un nombre variable dantennes;

Les N-glycanes hybrides, comportent une antenne de type high-mannose alors que la ou les autres sont de type complexe.

Il existe donc de nombreux types de N-glycosylations chez les eucaryotes dont la structure varie considrablement selon quelles soient biosynthtises dans les cellules de mammifres ou de

plantes [Gomord et Faye 2004] ( Figure 2). De plus, les structures glycaniques ne sont pas statiques et varient de manire qualitative et quantitative en fonction de l'avancement dun processus biologique


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[Dwek 1996]. En effet, ce quon appelle une glycoprotine est en fait un mlange de trs nombreuses molcules qui peuvent avoir des fonctions biologiques trs diffrentes, bien quelles aient toutes exactement la mme squence en acides amins. Cette htrognit est donc uniquement lie des diffrences de glycosylations.

On distingue deux types dhtrognit : la macro- et la micro-htrognit [Morelle et al. 2006]. Une N-glycosylation se situe obligatoirement sur une asparagine comprise dans une squence consensus (Asn-X-Ser/Thr) que l'on nomme site de glycosylation. Pourtant ce site peut ne pas tre occup par une glycosylation. Cest ce quon appelle la macro-htrognit dune glycoprotine. Ensuite, chaque site consensus glycosyl peut porter plusieurs glycanes diffrents (longueur des antennes, ramification, etc). Ceci correspond la micro-htrognit. Par exemple, pour une glycoprotine contenant 3 sites de glycosylations pouvant chacun porter 10 glycanes, il est possible d'observer jusqu' 1000 glycoformes diffrentes de cette protine.

Figure 3. (a) Structures de glycopeptides de lovalbumine (b) Abondance relative de chaque glycoforme sur 292 NLT, d'aprs [An et al. 2003]

La Figure 3 illustre la grande micro-htrognit qui peut affecter un seul site de glycosylation.

Toutes les structures glycaniques reprsentes ( Figure 3a) sont fixes sur lasparagine en position 292 de lovalbumine dans les proportions indiques sur le diagramme ( Figure 3b).


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2. Stratgies pour la caractrisation des protines N-glycosyles par spectromtrie de masse

Pour caractriser une glycoprotine, il est ncessaire didentifier la squence primaire de la protine, mais aussi de dterminer les sites de glycosylations et dtablir la structure des glycanes et leur htrognit [Temporini et al. 2008]. Ceci pose un certains nombre de difficults car :

Une glycoprotine peut possder plusieurs squences consensus glycosyles ou non; Chaque site peut porter diffrents glycanes possdant des antennes de taille, de nature ou

en nombre diffrent; c'est ce qu'on appelle l'antnarit; Les glycosylations ne sont pas statiques; elles varient de manire qualitative et quantitative

en fonction de l'avancement d'un processus biologique.

La prsence de plusieurs sites de glycosylation, la grande htrognit de structure glycanique, et le nombre lev de stroisomres et de rgioisomres possibles rendent l'analyse des glycoprotines plus complexe que celle des protines non glycosyles. C'est pourquoi, pour les tudes protomiques, les glycoprotines sont souvent dglycosyles avant leur analyse [Brooks 2009]. Ceci est en train de changer grce de nombreux dveloppements instrumentaux [Wuhrer et al. 2007, Dalpathado et Desaire 2008].

La Figure 4 prsente les techniques les plus couramment utilises pour l'analyse de

glycoprotines par spectromtrie de masse. Ces mthodologies comportent plusieurs tapes qui peuvent tre rsumes de la manire suivante :

Purification des glycoprotines partir de l'chantillon biologique (facultatif); Analyse des glycoprotines entires par spectromtrie de masse afin d'obtenir des

informations sur son htrognit; Digestion des glycoprotines par une endoprotase afin d'obtenir un ensemble de peptides

et de glycopeptides; o Analyse des glycopeptides entiers (purifis ou non) par spectromtrie de masse; o Dglycosylation des glycopeptides afin d'obtenir un ensemble de peptides "nus" et de

glycanes "libres" qui sont ensuite analyss par spectromtrie de masse; Interprtation des rsultats permettant l'identification de la protine, la dtermination des

sites de glycosylation et la structure de glycanes.

Dans ce chapitre, aprs avoir dcrit les techniques de purification et d'analyse des glycoprotines entires, nous ferons le parallle entre les deux stratgies utilisant ou non la deglycosylation des glycopeptides.

Et / ou


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Glycoprotines

Endoprotase

LC-MS, LC-MS/MS, MS et/ou MS/MS,

Identification de la protine, dtermination du site de glycosylation et de la structure du glycane

Mlange de glycopeptides et de peptides

chantillon biologique

MS glycoprotine entire

* Enrichissement et/ou fractionnement

Peptides dglycosyls et glycanes

Dglycosylation



* : tapes facultatives en fonction de la nature de lchantillon

Glycoprotines

Endoprotase

LC-MS, LC-MS/MS, MS et/ou MS/MS,

Identification de la protine, dtermination du site de glycosylation et de la structure du glycane

Mlange de glycopeptides et de peptides

chantillon biologique

MS glycoprotine entire


Peptides dglycosyls et glycanes

Dglycosylation



* : tapes facultatives en fonction de la nature de lchantillon

Figure 4. Les stratgies les plus utilises pour l'analyse de protines N-glycosyles par spectromtrie de masse

2.1. Analyse des glycoprotines entires

2.1.1. De l'chantillon biologique complexe aux glycoprotines : techniques de sparations et d'enrichissements

Les glycoprotines sont trs htrognes et chaque glycoforme est gnralement prsente dans de faibles proportions dans un chantillon biologique. Il est donc trs souvent ncessaire d'utiliser une ou plusieurs tapes de fractionnement afin de faciliter leur caractrisation.

La chromatographie daffinit est une technique couramment utilise qui permet d'enrichir l'chantillon en glycoprotines et ainsi de les analyser plus facilement. Une des phases stationnaires les plus communes est constitue de lectine fixe sur de la spharose ou de lagarose. Les lectines sont des protines qui interagissent de manire slective avec un type de glycoforme sans le modifier.

Diffrentes lectines peuvent tre utilise pour isoler des glycoprotines ayant des glycoformes diffrentes [Nawarak et al. 2004]. Il existe par exemple la ConA (concanavaline A) qui est spcifique des glycanes contenant des mannoses ou des glucoses, ou la WGA (wheat germ agglutinin) qui


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reconnait les N-acetylglucosamines et les acides sialiques. Il existe galement des approches utilisant une combinaison de diffrentes lectines permettant de capturer plusieurs types de glycoformes [Yang et Hancock 2004].

2.1.2. Analyse de glycoprotines entires par spectromtrie de masse

La caractrisation des glycoprotines intactes par spectromtrie de masse pose un certain nombre de difficults qui sont lies leur htrognit. Comme il a t mentionn prcdemment, une glycoprotine est un mlange d'espces molculaires avec la mme squence en acides amins mais des glycosylations diffrentes. Par consquent, lorsqu'on analyse une glycoprotine par spectromtrie de masse, on obtient un spectre trs htrogne. De plus, l'intensit des ions est divise par le nombre de glycoformes. Ces contraintes sont d'autant plus grandes que le nombre de glycoformes est important.

Les glycoprotines intactes peuvent tre analyses par MALDI-TOF-MS. Ce type d'instrument ne permet d'obtenir la rsolution sur les glycoformes que pour des protines de petite taille (20 40 kDa) et ne comportant que peu de glycoformes. Pour les glycoprotines trs htrognes, l'analyse MALDI-TOF ne permet d'obtenir qu'un spectre complexe difficilement interprtable. Cependant, en optimisant le type de matrice et la prparation du dpt MALDI, il est possible d'obtenir des rsultats intressants [Gimenez et al. 2007].

D'autres tudes utilisent l'ESI-MS pour l'analyse de glycoprotines intactes [Wagner-Rousset et al. 2008]. L'ionisation lectrospray gnre des ions multichargs (Chapitre 2, 1.1.1.). Avec ce type de source, il est donc ncessaire d'utiliser un analyseur possdant une rsolution suffisante pour sparer des glycoformes de masse trs proche. L'ESI-MS permet d'valuer l'htrognit glycanique pour des glycoprotines ne comportant qu'un site de glycosylation, et est gnralement utilis pour

l'analyse de protines recombinantes ( Figure 5).

De manire gnrale, l'analyse des glycoprotines intactes ne permet pas d'obtenir d'informations significatives ds lors que la glycoprotine comporte plus d'un site de glycosylation. Cest pourquoi il est ncessaire d'utiliser une approche qui passe par la digestion de la glycoprotine laide dune endoprotase de faon gnrer des glycopeptides portant chacun un seul site de glycosylation pour permettre la caractrisation de la micro-htrognit.


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Figure 5. Spectres correspondent l'analyse par lectrospray positif d'un anticorps monoclonal. A1 : protine intacte; A2 : protine aprs traitement la PNGase F. En haut les ions multichargs et en bas les spectres dconvolus qui reprsentent la masse molculaire de l'anticorps et de ses diffrentes glycoformes, d'aprs [Wagner-Rousset et al. 2008]

2.2. Des glycoprotines aux glycopeptides

La caractrisation des glycoprotines passe par la dtermination de la squence primaire de la protine, des sites de glycosylations et enfin des glycoformes avec les micro-htrognits. Comme il a t montr dans le paragraphe prcdent il est ncessaire d'effectuer une digestion enzymatique avec une endoprotase pour avoir accs ces informations. L'ensemble des peptides et glycopeptides obtenus forme un mlange complexe qui pose un certain nombre de difficults pour leur analyse en LC-MS :

Les glycopeptides sont plus faiblement ionisables que les peptides non glycosyls et gnrent donc des ions moins intenses;

La micro-htrognit provoque une division de l'intensit des ions entre les diffrentes glycoformes;

Les glycopeptides ont souvent des poids molculaires plus levs que les peptides non glycosyls. Les paramtres de transmission du spectromtre de masse doivent donc tre spcifiquement adapts pour les peptides glycosyls;

Les glycosylations augmentent souvent le caractre hydrophile des glycopeptides qui sont donc insuffisamment retenus et mal spars sur les colonnes de phase C18 utiliss gnralement en protomique;

Chaque glycoforme ayant un tant de rtention lgrement diffrent, la micro-htrognit des glycopeptides provoque un largissement des pics chromatographiques.


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Deux mthodologies complmentaires prsentes dans ce chapitre permettent de surmonter ces difficults:

La dglycosylation permet danalyser les glycanes et les peptides sparment [Geyer et Geyer 2006]. Il ainsi possible dobtenir des informations de squence la fois pour le peptide et le glycane. En revanche, cette mthodologie ne permet pas d'obtenir d'information sur la micro-htrognit s'il y a plusieurs sites de glycosylation.

L'analyse des glycopeptides intacts [Dalpathado et Desaire 2008], permet de dterminer la fois le site de glycosylation mais galement la micro-htrognit. Nanmoins la squence en acides amins du glycopeptide nest que rarement dtermine dans sa totalit.

Ces deux mthodes ncessitent lutilisation dune endoprotase afin de digrer la glycoprotine en peptides et glycopeptides. De plus, une tape denrichissement du digestat en glycopeptides peut tre ncessaire.

2.2.1. Utilisation de diffrentes endoprotases pour gnrer les glycopeptides

La protolyse des glycoprotines peut s'effectuer avec une grande varit d'enzymes. La plus couramment utilise est la trypsine qui a l'avantage d'tre trs spcifique. La squence peptidique des glycopeptides gnrs est donc prvisible. Cependant certains sites de coupure peuvent ne pas tre atteints cause de l'encombrement strique gnr par les glycosylations. De plus certains glycopeptides peuvent contenir plusieurs sites de glycosylations. C'est pourquoi il est galement possible d'utiliser d'autres enzymes spcifiques (Glu C, Asp N, Chymotrypsine) ou aspcifiques (Pronase, Protiniase K) afin d'obtenir les glycopeptides les mieux adapts l'analyse MS. Enfin, la combinaison de plusieurs enzymes est parfois ncessaire pour parvenir localiser tous les sites de glycosylation de la protine [Larsen et al. 2005].

2.2.2. Mthodes de fractionnement et d'enrichissement des glycopeptides

Une fois la glycoprotine digre avec une ou des protases, on obtient un mlange complexe de glycopeptides et de peptides non glycosyls.

Les glycopeptides sont moins facilement ionisables que les peptides non glycosyls, cela peut donc gnrer une suppression de signal lors de l'analyse MS. De plus, la micro-htrognit fait que l'intensit des ions des glycopeptides est divise par le nombre de glycoformes. C'est pourquoi il peut tre ncessaire d'enrichir le mlange en glycopeptides afin d'en faciliter l'analyse.

Il existe un grand nombre de mthodes permettant de fractionner ou denrichir un chantillon en glycopeptides. Comme pour l'enrichissement des glycoprotines, lune des plus courantes consiste utiliser des colonnes daffinit avec de la lectine qui peut tre greffe sur diffrents support comme de la spharose [Alvarez-Manilla et al. 2009], de lagarose [Bunkenborg et al. 2004] ou de la silice [Xiong et al. 2003]. Cette technique a l'avantage d'tre spcifique d'un type de glycane donn [Alvarez-Manilla et al. 2009].


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Une autre approche est base sur l'utilisation des proprits physico-chimiques des glycopeptides. Ainsi, plusieurs mthodes ont t dveloppes en utilisant la chromatographie dinteraction hydrophile (HILIC) [Calvano et al. 2008]. Les glycopeptides tant plus hydrophiles que les peptides non glycosyls, ils vont tre lus plus tard que sur une phase inverse C18. Il est alors possible de rcuprer la fraction ou de coupler la chromatographie avec un spectromtre de masse quip dune source nano-ESI. Cela permet une analyse directe de lchantillon enrichi en glycopeptides.

Une autre approche consiste en lutilisation de micro-colonnes contenant de la poudre de carbone graphite [Larsen et al. 2005]. Cette technique permet de dessaler et de concentrer lchantillon en glycopeptides. Larsen et al [Larsen et al. 2007] utilisent le mme principe de micro-colonne mais avec une phase TiO2 qui retient spcifiquement les acides sialiques.

Il existe galement dautres matrices comme des billes magntiques fonctionnalises avec de lacide diboronique qui permettent un enrichissement en N- et O-glycopeptides [Sparbier et al. 2005], [Xu et al. 2010]. Les billes fonctionnalises avec de lhydrazyde ncessitent une tape doxydation des glycanes qui augmente la dure exprimentale et la complexit de lchantillon [H. Zhang et al. 2003, Tian et al. 2007].

Enfin les glycopeptides tant gnralement de taille plus importante que les peptides, cette proprit peut tre mise profit en utilisant une colonne dexclusion strique pour les collecter [Alvarez-Manilla et al. 2006].

L'analyse des glycopeptides peut donc se faire aprs une ou plusieurs tapes de purification. Pourtant en pratique, les glycopeptides sont souvent analyss directement partir du digestat total donc dans un mlange complexe de peptides et de glycopeptides.

2.3. Analyse des peptides dglycosyls

Cette stratgie utilisant la dglycosylation ncessite plusieurs tapes qui comprennent la dglycosylation, le marquage des glycanes et lanalyse par spectromtrie de masse [Mechref et Novotny 2002, Mechref et al. 2005, Geyer et Geyer 2006, Morelle et Michalski 2007, Brooks 2009].

La libration du glycane peut se faire chimiquement (-limination en milieu alcalin, hydrazynolise, acide trifluoro-methanesulfobique (TFMS)) ou avec une enzyme [Fryksdale et al. 2002, Morelle et Michalski 2007]. La mthode enzymatique a pour avantage de conserver la fois le glycane et le peptide intact. En revanche, chaque enzyme est spcifique dun type de glycosylation, il nen existe pas duniverselle [O'Neill 1996].

La PNGase F (peptide N-glycosydase F) est lenzyme la plus couramment utilise. Elle coupe une grande varit de glycanes lexception de ceux portant un fucose en 1-3 sur le GlcNAc de lextrmit rduite [Tretter et al. 1991]. Dans ce cas il est possible dutiliser la PNGase A. Ce type denzyme coupe la liaison entre le GlcNAc et lasparagine. L'asparagine (Asn) glycosyle est alors


- 21 -

damide pour de venir un acide aspartique (Asp) ( Figure 6A). La diffrence de masse entre ces deux acides amins est de 1 Da ce qui permet d'identifier le site de glycosylation en effectuant une analyse MS/MS du peptide dglycosyl.

Afin de ne pas confondre une asparagine oxyde en acide aspartique avec une damidation in vitro [Robinson et Robinson 2001], la dglycosylation peut tre effectue dans de l'eau lourde H218O [Gonzalez et al. 1992, Kster et Mann 1999, Kaji et al. 2003]. La diffrence de masse obtenue est alors de 3 Da ce qui permet de lever l'ambigut.

Il existe galement des endoglycosidases qui coupent la liaison glycosydique entre les deux rsidus GlcNAc du tronc commun. La plus couramment utilises est lendoglycosydase H (endo H) qui libre les high-mannoses et une grande partie des glycanes de type hybrides. Lavantage de ce type

denzyme est de laisser un rsidu GlcNAc sur lasparagine ( Figure 6B). Le site de glycosylation est ainsi trs clairement marqu.

PNGase F+ (m = + 0,984 Da)

Endo H(m= + 203,08 Da)

(A)

(B)

PNGase F

Endo H+

Asp

Asn

Asn

Asn

PNGase F+ (m = + 0,984 Da)

Endo H(m= + 203,08 Da)

(A)

(B)

PNGase F

Endo H+

AspAsp

AsnAsnAsn

AsnAsn

AsnAsnAsn

Figure 6. Schma des digestions enzymatiques des protines et des peptides glycosyls permettant de dcrocher les N-glycanes avec (A) la PNGase F et (B) lEndo H

Les glycanes libres peuvent ensuite tre marqus au niveau de leur extrmit rduite avec un groupement chromophore, fluorophore ou une fonction ionisable afin d'amliorer leur dtection [Geyer et Geyer 2006]. L'un des marquages les plus courants utilise la 2-amino-benzamide ou 2-AB [Bigge et al. 1995].

Une analyse par spectromtrie de masse permet alors d'obtenir une carte glycanique en caractrisant les glycanes et de squencer les peptides dglycosyls pour trouver les sites de glycosylation [Alvarez-Manilla et al. 2009]. Toutes ces tapes demandent du temps et surtout une quantit de matriel importante. De plus linformation sur la micro-htrognit est perdue.


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2.4. Analyse des glycopeptides intacts

Le squenage des peptides par MS/MS est aujourd'hui devenu une technique de routine. Il n'en est pas de mme pour les glycopeptides pour lesquels il s'agit d'obtenir des informations de squence sur deux types de structures oligomriques diffrentes : le squelette peptidique et le squelette oligosaccharidique, pour lesquels les rgles de fragmentation sont diffrentes. En thorie la MS/MS peut fournir la squence en acides amins du glycopeptide, les glycoformes et les sites de glycosylation. Mais en pratique, la MS/MS des glycopeptides prsente des difficults et n'est de loin pas encore une mthode compltement maitrise.

En effet, les glycopeptides sont plus difficiles ioniser par la technique dlectrospray habituellement utilise que les peptides non glycosyls. De plus, comme les structures glycaniques sont trs htrognes le signal en spectromtrie de masse est rparti sur de nombreux ions molculaires dont lintensit est bien plus faible que celle du peptide correspondant non glycosyl. Par consquent, ils sont en gnral, particulirement difficiles dtecter.

En rponse ce problme de dtection difficile, une approche a t dveloppe par lquipe de Carr [Huddleston et al. 1993]. Il sagit de dtecter les glycopeptides dans le spectre de masse laide dions spcifiques de la fragmentation des glycosylations. Ces ions sont gnralement nomms "ions diagnostiques" ou "ions marqueurs".

2.4.1. Dtection des glycopeptides grce aux ions diagnostiques

Les ions diagnostiques sont gnrs par fragmentation prfrentielle des liaisons osidiques qui sont plus faibles que les liaisons peptidiques. Il sagit dions oxoniums tels que m/z 204 (HexNAc+), 366 (HexHexNAc+), 163 (Hex+) ou 292 (Neu5Ac+) [Huddleston et al. 1993] ( Figure 7).

O+

OHHO

HO

O

NHHO

HO

HO

CH3

O

O

N-actylhexosamine + Hexose : 366 Da

O+HN COOH

CH3

O

HO

OH

HO

HO

Acide N-actyle neuraminique : 292 Da

O+

OHHO

HO

HO

Hexose : 163 Da

N-actylhexosamine : 204 Da

O+

HNHO

HO

HO

CH3

O

O+

OHHO

HO

O

NHHO

HO

HO

CH3

O

O


O+

OHHO

HO

O

NHHO

HO

HO

CH3

O

O



O+HN COOH

CH3

O

HO

OH

HO

HO


O+HN COOH

CH3

O

HO

OH

HO

HO



O+

OHHO

HO

HO

Hexose : 163 Da

O+

OHHO

HO

HO

Hexose : 163 DaHexose : 163 Da

N-actylhexosamine : 204 Da

O+

HNHO

HO

HO

CH3

O

N-actylhexosamine : 204 DaN-actylhexosamine : 204 Da

O+

HNHO

HO

HO

CH3

O

O+

HNHO

HO

HO

CH3

O

Figure 7. Structures chimiques des ions oxoniums servant d'ions diagnostiques


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Domon et Costello [Domon et Costello 1988] ont tabli une nomenclature pour la fragmentation des sucres dcrite dans la Figure 8. Les ions diagnostiques sont de type B et Y.

O

OH

O

OH

OH

HO O

OH

CH2O H CH2OH CH2OHO R

O O OH

OH

Z2

0,2A1

2,4A2

1,5X1

Y2

B1 C1

Y1 Z1 Y0 Z0

B3 C3B2 C22,5A3

123

45

0O

OH

O

OH

OH

HO O

OH

CH2O H CH2OH CH2OHO R

O O OH

OH

Z2

0,2A1

2,4A2

1,5X1

Y2

B1 C1

Y1 Z1 Y0 Z0

B3 C3B2 C22,5A3

123

45

0

Figure 8. Nomenclature de fragmentation des polysaccharides (Domon et Costello, 1988). Pour les fragments de type Ai et Xi, les numros en exposants correspondent des fragmentations intracycliques. [Domon et Costello 1988]

Ces ions peuvent tre gnrs de deux manires : soit par fragmentation dans la cellule de collision [Carr et al. 1993, Huddleston et al. 1993], soit par fragmentation en source [Huddleston et al. 1993, Sullivan et al. 2004, Peterman et Mulholland 2006].

Ils sont issus de la fragmentation interne du glycane et ont donc des masses molculaires diffrentes en fonction du type de glycosylation. Par exemple dans le cas des high-mannoses, on observe l'ion m/z 366 (HexHexNAc+) dans des proportions moins importantes que dans les cas des glycosylations complexes [Huddleston et al. 1993]. En effet, comme le montre la Figure 9 la gnration de cet ion ncessite la coupure de 3 liaisons dans le cas des high-mannoses et seulement d'une ou deux liaisons dans les cas des glycanes complexes. De mme, la prsence ou non d'ions tels que l'ion m/z 292 (Neu5Ac+) ou m/z 657 (Neu5AcHexHexNAc+) indique si le glycane porte ou non des acides sialiques ( Figure 10) [Sullivan et al. 2004].

N-actyle hexosamine : 203 Da

Hexose : 162 Da


Asn

N-glycosylation complexe

Asn

N-glycosylation high-mannose

Figure 9. Liaisons devant tre fragmentes pour la gnration de l'ion m/z 366


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La recherche de ces ions dans un chromatogramme permet de dtecter la zone d'lution des

glycopeptides ( Figure 10) do leur nom de "marqueurs" ou "diagnostiques" [Conboy et Henion 1992, Carr et al. 1993, Medzihradszky et al. 1997]. Il est ainsi possible de localiser les spectres MS/MS correspondants des glycopeptides dans le chromatogramme [Peterman et Mulholland 2006].

Figure 10. (A) LC-MS d'un digestat trypsique d'un anticorps monoclonal dans des conditions optimises pour la dtection des ions diagnostiques. (B) (C) et (D) correspondent aux chromatogrammes dions extraits m/z 204, 292 et 366 qui indiquent l'lution de glycopeptides. L'absence de signal pour l'ion m/z 292 indique que ces glycopeptides ne portent pas d'acide sialique. D'aprs [Sullivan et al. 2004]

Ces ions diagnostiques vont donc permettre la fois de dtecter les glycopeptides dans le chromatogramme mais aussi d'obtenir une information sur le type de glycosylation.

La littrature montre, en fait, que les ions diagnostiques nont que peu t utiliss dans la stratgie de caractrisation des glycoprotines. Bien que de nombreux travaux dcrivent l'utilit des ions diagnostiques, trs peu de mthodes permettant de les gnrer partir de mlanges complexes et en trs petites quantits ont t publies. Nous pensons que les mthodes instrumentales pour former ces ions doivent encore tre optimises, surtout avec les progrs instrumentaux en termes de sensibilit, de prcision de mesure de masse et de rsolution. Le chapitre 2 des rsultats sera consacr ce point.

2.4.2. Lanalyse MSn des glycopeptides

La fragmentation des N-glycopeptides permet de dterminer la composition de chaque glycane sur chaque site de glycosylation mais galement de dterminer le site de glycosylation. En effet, de manire gnrale, les spectres de fragmentation CID des N-glycopeptides contiennent trois types dions fragments majoritaires :


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Des ions fragments correspondant des pertes de sucres successifs sur la chane peptidique : ces ions permettent de dterminer les enchanements de monosaccharides et ainsi de remonter la composition de chaque glycane;

Des ions oxoniums dits "diagnostiques" de type Bi et Yi qui sont issus de la fragmentation interne du glycane. Ces ions donnent des informations supplmentaires sur la composition du glycane mais permettent surtout didentifier rapidement si un spectre MS/MS correspond la fragmentation dun glycopeptide;

Lion correspondant au peptide non-glycosyl.

Dans certains cas, il est possible dobserver des ions correspondant la fragmentation du

peptide non glycosyl permettant didentifier la squence en acides amins du peptide ( Figure 11A). Nanmoins, la liaison glycosidique tant beaucoup plus labile que la liaison peptidique, les fragments les plus intenses correspondent des pertes successives de sucres sur le glycopeptide, et la prsence dions fragments correspondant au peptide sont peu intenses voire inexistants. De ce fait, il est difficile de pouvoir dterminer la squence du peptide partir du spectre MS/MS.

Plusieurs articles sur l'analyse de glycopeptides par MS [H. Jiang et al. 2004, Harvey 2005, Wuhrer et al. 2007], montrent que la fragmentation CID d'un glycopeptide a tendance varier selon le type de spectromtre de masse, les paramtres instrumentaux, la squence du glycopeptide, l'tat de charge, etc. Par exemple, sur les instruments de type Q-TOF, le type dions gnr est trs dpendant de lnergie de collision applique [Wuhrer et al. 2007]. La Figure 11 montre les spectres de fragmentation dun glycopeptide basse ( Figure 11A) et haute nergie ( Figure 11B). A basse nergie, les ions observs correspondent majoritairement la fragmentation du glycane. A haute nergie, les ions gnrs correspondent la fragmentation de la partie peptidique et permettent ainsi dobtenir la squence du peptide.

Une autre solution consiste effectuer de la MS3 en utilisant une trappe ionique [Demelbauer et al. 2004, Wuhrer et al. 2007, Segu et Mechref 2010]. En MS/MS, lion correspondant au peptide avec un GlcNAc li lasparagine est gnralement le plus intense. Il est alors possible de slectionner cet ion pour le fragmenter une seconde fois (MS3) et ainsi dterminer la squence du peptide [Wuhrer et al. 2005].

Bien que plusieurs logiciels existent pour identifier et caractriser des glycopeptides partir d'analyses MS/MS, l'automatisation de l'interprtation de leurs spectres de fragmentation reste complique. Tout d'abord, bien qu'il existe certaines banques de donnes pour les glycanes [Aoki-Kinoshita 2008] il n'y en a aucune pour les glycopeptides. De plus, tant donn que trs peu de fragments correspondant au peptide sont observs dans les spectres, il est difficile d'tablir la squence en acides amins du glycopeptide.


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Figure 11. Exemple de spectres MS/MS obtenus par CID de lion tricharg de m/z 1119 correspondant au glycopeptide trypsique Ser295-Arg313 de la peroxidase de raifort (horseradish peroxidase HRP) obtenu sur un Q-FT-ICR-MS/MS ; (A) Fragmentation basse nergie (15 V) ; (B) Fragmentation haute nergie (30 V). D'aprs [Wuhrer et al. 2007]

A

B


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C'est pourquoi, beaucoup de logiciel dvelopps ncessitent de connaitre la squence de la glycoprotine [Goldberg et al. 2007, Irungu et al. 2007, Deshpande et al. 2010]. De plus, afin de limiter le taux de faux positifs, il est souvent recommand d'utiliser un spectromtre de masse trs haute rsolution, type FTICR [Irungu et al. 2007, Wu et al. 2010]. Des problmes se posent galement en ce qui concerne la compatibilit avec les formats des listes de masses. Ainsi, certains logiciels ne sont utilisables qu'avec un certain type d'instruments [Ozohanics et al. 2008]. Enfin certains programmes semblent prometteurs mais ne sont pas utilisables sur des chantillons en trs petite quantit [Ozohanics et al. 2008, Wu et al. 2010].

Ainsi, jusqu' maintenant, il n'existe pas de logiciel permettant d'effectuer une interprtation de spectres MS/MS pour des glycopeptides totalement inconnus et prsents dans un mlange en petite quantit.

Plus rcemment avec le dveloppement de la source ETD [Syka et al. 2004], une mthode alternative sest ouverte pour la caractrisation de N-glycopeptides par MSn. En effet, la fragmentation par ETD tant non ergodique elle permet de prserver les liaisons osidiques tandis que le squelette

peptidique est fragment en gnrant principalement de ions c et z ( Figure 12).

Figure 12. Exemple dun spectre MS/MS obtenu par ETD de lion tricharg de m/z 1119 correspondant au glycopeptide trypsique Ser295-Arg313 de la peroxidase de raifort (horseradish peroxidase HRP) obtenu sur une trappe HCTultra (Bruker Daltonics) quipe avec une source ETD [Wuhrer et al. 2007]

De plus, en combinant la fragmentation alterne ETD /CID il est possible de remonter la structure du glycane et la squence du peptide [Catalina et al. 2007, Alley et al. 2009]. Cependant, l'interprtation des spectres de fragmentation ETD reste trs complexe et entirement manuelle.


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3. Conclusion

La glycosylation fait partie des modifications port-traductionnelles les plus courantes. Elle possde un rle majeur dans la fonction biologique des protines. Cependant, la caractrisation des glycoprotines reste complexe en grande partie cause de leur grande htrognit.

Afin de caractriser finement les protines N-glycosyles, plusieurs critres sont prendre en compte comme : la quantit de matriel, la taille de la glycoprotine, son htrognit et quelle est prcisment linformation recherche. Ainsi, la caractrisation de protines N-glycosyles ncessite la mise en place dune mthodologie combina

hovasse agnes 2010

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