By NA 1

Genetica del cancro

Lezione 12

By NA 2

Il tumore come network

Carcinoma del colon

Esempio di progressione a tappe da tumore benigno a tumore maligno

Iperplasia Le cellule conservano morfologia

Cancro in situ Le cellule perdono il contatto con il tessuto

Le cellule mutate iniziano a duplicarsi in modo incontrollato

Displasia. Le cellule perdono morfologia

Cancro invasivo Le cellule divengono invasive e metastatizzano

Processo di vascolarizzazione

By NA 3

Un punto di vista diversoLa selezione agisce attraverso la fitness di un gruppo di individui: chi si riproduce di piu’ per effetto di mutazioni favorevoli in quel momento e in quel luogo prendera’ il sopravvento

trasferiamo questo concetto ad un gruppo di cellule : una cellula muta, acquisisce un vantaggio proliferativo sfuggendo anche parzialmente al sistema di controllo, si riprodurra’ piu’ rapidamente

la cellula nell’organismo e’ sottoposta ad un controllo a molti livelli e difficilmente potra’ in breve tempo prendere il sopravvento…… almeno finche’ i sistemi di controllo sono efficienti

By NA 4

Due forze contrastantiUna spinge la cellula mutata a prendere il sopravvento e l’altra protegge l’organismo nel suo insieme (apoptosi, meccanismi di riparo)

questo fa si che almeno fino al momento in cui un organismo si riproduce il numero di mutazioni somatiche che si accumulano nella cellula non raggiungano il livello di guardia: si pensa 6-7 (con le dovute eccezioni), e soprattutto con la nuova generazione si rincomincia.con il tempo i meccanismi di controllo si attenuano e vengono meno………

By NA 5

e allora come mai il cancro?se la possibilita’ di accumulare in una cellula o in un suo clone e’ bassa come mai ci sono i tumori cosidetti maligni?

sostanzialmente ci sono due meccanismi che permettono la progessione: mutazioni che aumentano la capacita’ proliferativa incrementando il numero di “individui” in cui potrebee manifestarsi una seconda, terza …… mutazione

mutazioni che intaccano la stabilita’ del genoma aumentando il livello di mutazioni nel loro insieme

By NA 6

riarrangiamenti multipli

By NA 7

riarrangiamenti multipli

By NA 8

percorsi che portano alla cancerogenesipossiamo ridurre a due i percorsi che sviando, portano al

tumore: percorsi che controllano la nascita di nuove cellule (geni del ciclo cellulare) e percorsi che portano alla morte (geni che controllano l’apoptosi)

al primo percorso appartengono quei geni (protoncogeni) che nella forma wt promuovono la proliferazione. Quando l’effetto della mutazione provoca un ”gain of function” il risultato e’ un prodotto inappropriato nella sua attivita’ o nello spazio o nel tempo.Vista la loro funzione wt basta la mutazione di un allele

vi ricordo che non e’ la mutazione in se’, ma l’effetto che la mutazione ha sulla funzione. il cancro e’ un fenotipo come gli altri, viene meno una funzione dell’individuo cellula.

By NA 9

percorsi che portano alla cancerogenesial secondo appartengono quei geni che nella versione wt

impediscono la progressione del ciclo cellulare (definiti TS tumor suppressor), stimolano l’apoptosi , controllano la stabilita’ del genoma, garantiscono l’accuratezza della replicazione, del riparo e della segregazione. Il fenotipo mutante compare quando tutti e due gli alleli sono mutati nella stessa cellula.Il nostro organismo e’ come un auto in cui i protooncogeni sono l’accelleratore e i TS i freni.

By NA 10

OncogeniEra noto che alcuni tumori animali originassero da infezioni virali, questa informazione derivava da esperimenti in vivo ed in vitro. Nell’uomo sono pochi quelli dimostrati ad eziologia esogena

By NA 11

OncogeniQuello che ci interessa e’ che geni portati da virus possono trasformre le cellule ospite. lo studio di questi geni ha permesso di capire cosa sono gli oncogeni. Test in vitro come il NIH-3T3 hanno permesso di chiarire che in tumori di origine non virale sono presenti oncogeni endogeni attivati

By NA 12

OncogeniIl primo oncogene virale identificato (1983) e’ stato v-sis che corrisponde al gene PDGFB fattore di crescita delle piastrine. La sua espressione incontrollata e’ concordante con l’idea che l’eccesso di un grow factor porti ad un’iperproliferazione.L’analisi di altri oncogeni ha confermato che la loro funzione e’ indispensabile per la cellula e che la loro alterata espressione e’ all’origine dei tumori.Grossolanamente possiamo suddividere gli oncogeni in 5 classi: fattori di crescita secreti recettori di membrana componenti dei sistemi di trasduzione del segnale intracellulare proteine DNA-binding compresi i fattori di trascrizione componenti del network delle cicline, delle chinasi-ciclino dipendenti e degli inibitori delle kinasi. Tutti componenti che controllano il normale svolgimento del ciclo cellulare

By NA 13

Oncogeni

By NA 14

Attivazione protoncogeniUn protoncogene diventa oncogene quando la mutazione provoca un aumento di funzione che puo’ essere : quantitativo di un prodotto normale qualitativo: prodotto leggermente mutato che non puo’ rispondere al suo controllore, prodotto chimerico originato da un riarrangiamento genomicoLe mutazioni sono sempre somatiche, ci sono alcune eccezioni, ma la predisposizione alla comparsa di tumori e’ un aspetto di sindromi polimalformative a trasmissione auosomica dominante (RAS)

Anche il protoncogene RET e’ particolare: le sue mutazioni con attivazione provocano la MEN2A neoplasia delle ghiandole endocrine che si puo’ presentare come familiare. Si ritiene che questo comportamento derivi dalla ristrettezza dell’espressione del prodotto mutato di RET nello spazio e nel tempo. Da notare che mutazioni con perdita di funzione di questo gene provocano una sindrome neonatale:Morbo di Hirschprung.Anche il protoncogene KIT mutato con perdita di funzione provoca una sindrome familiare con depigmentazione il piebaldismo.

By NA 15

Attivazione protoncogeni Amplificazione genica

conseguenza di errori casuali nella replicazione del DNAEsempio: cromosomi double minutes e homogeneously staining regions (HSR)

double minutes

By NA 16

Attivazione protoncogeni Mutazione puntiforme

Esempio: nel carcinoma della vescica, il gene ras presenta una mutazione nella sostituzione di una

singola base che, a sua volta, provoca la sostituzione di un amminoacido. Tali cambiamenti

avvengono in punti caratteristici del gene che conducono a trasformazione cellulare

By NA 17

Attivazione protoncogeni Riarrangiamento cromosomico:linfoma di Burkitt t(8;14)

c-myc gene catena pesante Ig

c-myc si viene a trovare sotto il controllo del promotore del Igche e’ un promotore forte e nella serie bianca funziona ad un ritmo elevato: il proto-oncogene perde la propria regolazione e assume quella del Ig. La cellula perde il controllo

QUESTO AVVIENE SOLO SE LA TRASLOCAZIONE SI VERIFICA NEI LINFOCITI!

traslocazione

By NA 18

Attivazione protoncogeni

cromosoma non normale

chr Philadelphia (1961)

Nel 95% dei casi di CML

Indagini FISH E MOLECOLARI

SI FORMANO DUE GENI DI FUSIONE:- ABL-BCR su DER9 (nessuna proteina prodotta)- BCR-ABL su Ph (proteina di fusione coinvolta nella proliferazone cellulare)

ABL

BCR

ABL/BCR

BCR/ABL

CML, Leucemia Mieloide Cronica

Traslocazione reciproca braccio lungo chr.9 e il braccio lungo chr.22: t(9;22)(q34;q11).

By NA 19

Attivazione protoncogeni

By NA 20

Attivazione protoncogeni

By NA 21

Modalita’ di espressioneGli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche?

Perche’ per manifestare il fenotipo e’ necessario che entrambi gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse)

Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e’ sensibile alla quantita’ di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non nepregiudica la funzione.

Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e’ quello della cellula non dell’individuo!

Il tumore va considerato come un “individuo” : all’interno dell’organismoci sono cloni (“individui”) che non manifestano il fenotipo perche’ hanno un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l’allelewild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore

By NA 22

Questi oncosoppressori vengono definiti “gatekeepers”: (guardiani) perche’ regolano funzioni cellulari fondamentali come l’innesco della proliferazione, del differenziamento e dell’apoptosi. La conoscenza del loro meccanismo di azione ha introdotto il concetto di APLOINSUFFICENZA.

Oncosoppressori gatekeepers

APLOINSUFFICENZA: condizione in cui la mancata funzionalita’ di un allele non provoca la comparsa del fenotipo, ma mette la cellula in condizioni di “debolezza”. La cellula e’ eterozigote e il gene puo’ ancora svolgere la funzione, ma e’ una funzione non completamente efficace

By NA 23

La perdita del prodotto del gene NF1, mutato nella neurofibromatosi di tipo 1, conduce ad una incontrollata attivita’ di ras.

La perdita di p53 genera la sindrome di Li-Fraumeni, sottraendo le cellule al processo di apoptosi

APC, coinvolto nella FAP, regola la trasmissione di un segnale dalla superficie cellulare al nucleo, che porta all’espressione di c-MYC

Oncosoppressori gatekeepers esempi

By NA 24

Altri oncosoppressori

By NA 25

famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell’esterasi D

Perdita di eterozigosita’ LOH

Cellule tumorali

omozigote eterozigote eterozigote LOH

By NA 26

Meccanismi di acquisizione della seconda mutazione

+ + Rb --

+ Rb

Rb Rb

Rb+

Rb+Rb Rb x Rb

C.O mitotico Non disgiunzione

e duplicazione

Conversione genica

delezione

mutazionepuntiforme

Rb+Rb

By NA 27

Perdita di eterozigosi per identifiare un TS

By NA 28

Perdita di eterozigosi / instabilita’

By NA 29

come funzionano i TS

By NA 30

controllo dell’integrita’ del genoma

By NA 31

19 anni, lieve ritardo mentale, difficolta’ di apprendimento, iperpigmentazione, mixomi al seno e all’ipofisi

Diagnosi clinica:

Carney Complex (CNC) de novo

By NA 32

Carney Complex (CNC) disease:autosomico dominante, suscettibilita’ al cancro

Mixoma: tumore benigno connettivale quando localizzato nel cuore puo’ provocare alterazioni cardiache

By NA 33

Carney Complex (CNC) disease:autosomico dominante, suscettibilita’ al cancro

PRKAR1A(17q24): gene codificante l’unita’ regolatoria della proteinchinasi A.L’80% degli affetti ha mutazioni in questa sequenza

La paziente non ha mutazioni nel gene

By NA 34A 10 anni era stato eseguito il cariotipo per il ritardo mentale: presenza di un piccolo marcatore de novo non identificato nel 70% delle metafasi

Cariotipo

By NA 35

2009: array-CGH

chr1:83061240-846630251.6 Mb Log2ratio 1.08 (triplicatione)

last norm 82999282first trip 83061240last trip 84663025

first norm 84713307

alla comparsa del fenotipo del Carney Complex e’ stata eseguita un array-CGH perchiarire se ci fosse relazione con il piccolo marcatore

By NA 36

FISH with probe(s) of the unbalanced region confirmed that the triplicated material is located on the marker chromosome

FISH

La FISH con i BAC della regione triplicata conferma l’origine del piccolo marcatore sovrannumerario e lo sbilanciamento genomico

By NA 37

DomandaIl materiale genomico presente nel marker e’ reponsabile del fenotipo (ritardo mentale

e Carney Complex disease della proposita?

By NA 38

Domanda

From OMIM: urate oxidase is presumably a nonessential enzyme in humans. Lack of this enzyme might contribute to the development of hyperuricemia and gout in adult life No information for increased dosage of the geneAccording to bioinformatic tools, the marker was not associated with the patient’s phenotype since the only disease-gene is not involved in the development of the Carney complex disease

Is the genetic material contained within the de novo marker chromosome responsible for the phenotype of the proband(mental retardation, Carney complex disease)??

Il materiale genomico presente nel marker e’ reponsabile del fenotipo (ritardo mentale e Carney Complex disease della proposita?

By NA 39

Tubulin tyrosin ligase-like highly expressed in the nervous system

Sterile alpha motif domain???

cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit

The genes in the triplication portion not known as disease-gene

From OMIM: urate oxidase is presumably a nonessential enzyme in humans. Lack of this enzyme might contribute to the development of hyperuricemia and gout in adult life No information for increased dosage of the geneAccording to bioinformatic tools, the marker was not associated with the patient’s phenotype since the only disease-gene is not involved in the development of the Carney complex disease

urate oxidase urate oxidase

By NA 40

Triplication of the

PRKACB cAMP-dependent protein

kinase catalytic subunit

Same effect of PRKAR1A mutation?

By NA 41

… The net effect of all these changes in CNC cells is an increase in DNA transcription and/or activation of other pathways leading to abnormal growth and proliferation.

By NA 42

Normalized to actin

Normalized to gapdh

PKA Activity Real Time PCR on lymphocytes

and fibroblastsfrom the patient and two controls

We know now that the Carney phenotype of our patient is linked

to the triplication of the catalytic subunit of the protein kinase A gene

By NA 43

Array analysis must be done having in mind the phenotype

and not in a blind wayGenome-wide array analysis requires noteworthy abilityin using public genomic databases

a similar case in a prenatal diagnostic setting could have been interpreted as without any clinical consequences since none of the triplicated genes was known to be pathogenic when amplified