GENETICA BACTERIANA

Laura Betancor, Pilar Gadea, Karina Flores

INTRODUCCIÓNLas bacterias son microorganismos con unaextraordinaria capacidad de adaptación adiferentes condiciones ambientales. Paracomprender la esencia de esta capacidad esimportante conocer las bases de su genética, esdecir como esta organizada la informacióngenética, como realizan y regulan su expresión,que mecanismos de variación génica poseen.Entre otras, la capacidad infecciosa de lasbacterias patógenas, radica en que poseen lainformación génica necesaria para colonizar lostejidos de un huésped, invadirlos y/o producirsustancias tóxicas que en definitiva causarán laenfermedad.Por otro lado, el conocimiento del modo defuncionamiento genético de las bacterias,sumado al hecho de que estos microorganismosson de relativo fácil manejo en el laboratorio,que en general tienen un rápido crecimiento, hallevado a que podamos utilizarlos para sintetizarproductos útiles a la medicina, tanto para eldiagnóstico como para la prevención ytratamiento de varias enfermedades. Estasposibilidades se han visto incrementadas apartir del desarrollo de la ingeniería genética yla disponibilidad de técnicas de biologíamolecular.

EL GENOMA BACTERIANO: SUESTRUCTURAToda la información genética esencial para lavida de la célula bacteriana, está contenida enuna única molécula de ADN de doble cadena,circular y covalentemente cerrado, a la quepodemos referirnos como “cromosomabacteriano”. Muchas bacterias, poseen ademásADN extra cromosómico, también circularcerrado, denominado ADN plasmídico, por estarcontenido en estructuras llamadas “plásmidos”,que portan información génica para unavariedad de funciones no esenciales para lacélula en condiciones normales de crecimiento.En términos bioquímicos, la composición yestructura de los ácidos nucleicos bacterianos, esla misma que para cualquier célula.Brevemente, conviene recordar que los ácidosnucleicos son macromoléculas compuestas denucleótidos unidos en forma covalente pormedio de enlaces fosfodiester entre los carbonosde las posiciones 3´ y 5´ de dos residuos deazúcares adyacentes, que conforman unesqueleto de azúcares y fosfatos que esconstante a lo largo de toda la macromolécula.La variación entre los distintos nucleótidos que

conforman la cadena de ácido nucleico, estadada por sus bases nitrogenadas, que en el casodel ADN son Adenina (A), Timina (T), Citocina(C) y Guanina (G), y en el caso del ARN en vezde T se encuentra Uracilo (U). A y G sedenominan bases púricas o purinas, mientras queT, U, y C se denominan bases pirimidínicas opirimidinas. De esta manera, una cadena o hebrade ácido nucleico, tendrá una estructura primariadeterminada por la secuencia de las bases que lacomponen.El ADN como macromolécula, esta compuestopor 2 cadenas nucleotídicas o hebrasantiparalelas, que se enlazan entre siconformando una doble hélice. Los enlacesentre las dos hebras de ADN están dados porpuentes de hidrógeno entre las purinas de unacadena con las pirimidinas de la otra. De estaforma, la A forma dos puentes de hidrógeno conla T, mientras que la C forma 3 puentes dehidrógeno con la G. A esto se le llamacomplementariedad de bases, es decir que la Aes complementaria a la T y la C lo es a laG.(Fig. 1) Estos enlaces permiten mantenerestable la estructura de la doble hélice de ADNen la que pueden distinguirse pares denucleótidos o mejor dicho pares de bases (pb).Estos pb pueden utilizarse como unidad detamaño o longitud para las moléculas de ADN, y

Fig. 1. Apareamiento de dos cadenas deADN

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de esa manera podemos decir por ejemplo que elADN cromosómico de Escherichia coli tieneun tamaño de 4,2 millones de pb o lo que es lomismo 4.200 kilobases (Kb).Como sabemos, todas las células debenenfrentarse al problema de como lograr conteneren su estructura moléculas tan grandes como elADN. Volviendo al ejemplo de E. coli, los4.200 Kb de su genoma, implican una longitudde 1,3 mm, es decir unas 1.000 veces la longitudde la célula. Las bacterias, no poseen histonasasociadas a su genoma y por tanto no tienen laposibilidad de compactar su ADN en estructurastipo nucleosomas como las células eucariotas.Por lo tanto, deben solucionar el dilema decomo compactar su cromosoma de otra manera.Esto se logra, porque el ADN circular cerrado escapaz de adoptar una estructura terciariadenominada de “superenrollamiento”, queimplica el enrollamiento del eje de la doblehélice sobre si mismo. (Fig. 2)Este superenrollamiento se dice que tienesentido negativo, porque es en el sentidocontrario al del enrollamiento de una hebra deADN sobre la otra, y supone para la bacteria unafuente de almacenamiento de energía para serutilizada en una variedad de procesosfisiológicos que la requieren, como por ejemplola separación de las 2 hebras de ADN necesariapara la replicación y la transcripción.El cromosoma bacteriano, es suficientementelargo como para formar varios lazos circulares,que como tales pueden a su vez superenrollarse,formando de esta manera una serie de dominiostopológicos independientes. Esta organizaciónen dominios, colabora al estado decompactación general del genoma bacteriano, eimpide que con la ruptura de una hebra en unpunto cualquiera del cromosoma, se pierda eltotal del superenrollamiento, manteniendo deesta forma la energía almacenada.Las bacterias poseen enzimas capaces de alterarla estructura del ADN modificando susuperenrrollamiento. Estas enzimas que sedenominan genéricamente "topoisomerasas",actúan introduciendo o eliminando vueltas“superhelicoidales”, cumpliendo un importanterol en los procesos de replicación ytranscripción del ADN. Por otra parte, esinteresante mencionar que algunas de estastopoisomerasas, como la ADN girasa, sonblanco de acción para los antibióticos del grupode las quinolonas, como el ácido nalidíxico.

LOS PLASMIDOS SON ADNEXTRACROMOSOMICOComo ya dijimos, muchas bacterias poseeninformación génica contenida en moléculas deADN distintas a las del cromosoma bacteriano,

denominadas plásmidos. Los plásmidos, sonmoléculas circulares de ADN de doble cadenaque constituyen una unidad de replicaciónindependiente del cromosoma. Por esto puedenencontrarse más de una copia del mismoplásmido dentro de la célula bacteriana. Engeneral los plásmidos de mayor tamaño, seencuentran en una o unas pocas copias, mientrasque los mas pequeños pueden estar en hasta 100copias por célula (plásmidos multicopia).Si bien el ADN plasmídico no porta informacióngenética esencial para la vida de la bacteria, síportan genes que le confieren nuevaspropiedades fenotípicas y que en algunos casosle son muy útiles para su adaptación alcrecimiento en ciertos ambientes.Muchas bacterias potencialmente patógenas parael hombre, solo son capaces de comportarsecomo tales, cuando portan un plásmido enparticular que contiene genes que le permitenexpresar moléculas de adhesión a los tejidos delhuésped o sintetizar sustancias tóxicas para éste.Como ejemplo, podemos mencionar el caso dela producción de la toxina tetánica, porClostridium tetani, agente causal del tétanos.En muchos casos, los plásmidos contienen genesque codifican para enzimas capaces de degradaralgunos antibióticos, permitiendo que la bacteriasobreviva a la acción de los mismos. Este es elcaso de la producción de beta lactamasas por

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cepas Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcusaureus o Haemophylus influenzae, que poseenun plásmido que les confiere resistencia aciertos antibióticos beta lactámicos comoPenicilina y Ampicilina.

Los plásmidos pueden clasificarse segúndistintos criterios, por ejemplo por su tamaño enpb, su número de copias en la bacteria o por eltipo de genes que porta (plásmidos devirulencia, plásmidos de resistencia aantibióticos, etc.) También pueden clasificarseen grupos de incompatibilidad. Se dice quedos plásmidos pertenecen al mismo grupo deincompatibilidad si son incapaces de coexistiren la misma célula bacteriana. Muchosplásmidos, en general los de mayor tamaño (quepueden portar hasta 50 o 100 genes), suelen sercapaces de transferirse de una bacteria a otramediante un proceso llamado conjugación(véase mas adelante). Estos plásmidos deconjugación codifican todos los factoresnecesarios para su transferencia. Algunosplásmidos mas pequeños, no conjugativos,pueden ser movilizados es decir que poseen lasecuencia necesaria para permitir sutransferencia, pero no codifican por ellosmismos las proteínas necesarias para sertransferidos. Por último, algunos plásmidos nose transfieren en absoluto. La adquisición deADN plasmídico por una cepa bacteriana,puede realizarse por medios distintos a laconjugación, como transformación, transducciónmediada por fagos o incorporación en elcromosoma, según veremos mas adelante.

LAS BACTERIAS PUEDEN TENERGENES “SALTARINES”Los elementos transponibles, son segmentos deADN capaces de moverse desde una posición aotra en el genoma, es decir “transponerse” o“saltar” desde un sitio determinado del genoma,escindiéndose del resto del ADN, hasta otrositio distinto, integrándose. Pueden saltar delcromosoma a un plásmido y visceversa o adistintos sitios dentro de la misma molécula deADN.Los elementos transponibles están ampliamentedistribuidos en la naturaleza, tanto en virus,células procariotas y eucariotas.Existen 2 variedades de elementostransponibles:

1) Las secuencias de inserción (elementos IS)2) Los transposones (Tn) Los elementos IS, son segmentos de ADNrelativamente pequeños, de aproximadamente 1a 2 Kb que contiene la información genéticamínima, necesaria para la transposición. Poseensecuencias específicas en ambos extremos delfragmento, que consisten en repeticionesinvertidas una respecto a la otra. Estassecuencias, son reconocidas específicamente porenzimas codificadas dentro del mismo elementoIS, denominadas transposasas responsables dela integración del elemento en su sitio blanco delgenoma. Los Tn son segmentos de ADN que además deportar la información necesaria para latransposición, contienen genes extra, quepueden codificar para muy distintas propiedadesfenotípicas, encontrándose entre las masimportantes desde el punto de vista clínico, laresistencia a antimicrobianos como ser el casode la resistencia de alto nivel a la gentamicinaencontrada en algunas cepas de Enterococcus sp. Algunos plásmidos, poseen uno o mas Tn queportan determinantes de resistencia aantibióticos, y la capacidad de estos elementospara saltar de un plásmido a otro, proporciona alas bacterias una gran flexibilidad paradesarrollar resistencia, debido a que estosplásmidos son en general conjugativos, por loque pueden transferirse entre distintas bacterias. La inserción de un elemento transponible, puedeproducir una variedad de efectos sobre laexpresión de la información génica, comoimpedir la funcionalidad de un gen, o activar laexpresión de otro. REPLICACION DEL ADN BACTERIANO El genoma completo de una célula, tanto seaprocariota como eucariota, debe replicarse conexactitud una vez por cada división celular. Portanto, la iniciación de la replicación comprometea la célula a una división posterior. Si se iniciala replicación, la división consiguiente no debeocurrir hasta que se haya completado lareplicación y de hecho, el final de la replicaciónpuede disparar la división celular.

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Las bacterias, a diferencia de las célulaseucariotas, son capaces de replicar su ADN a lolargo de todo su ciclo celular. Se denomina replicón a cada unidad dereplicación del ADN el cual contiene todos los

elementos requeridos para regular este proceso. El cromosoma bacteriano, se replica a partir deun único origen, que se mueve de forma linealhasta completar la duplicación total de lamolécula, por lo que constituye un replicón.Esto facilita su regulación, que está centrada enla etapa de iniciación, una vez que la replicacióndel cromosoma se inicia en el origen, todo elcromosoma será duplicado. Los plásmidos, constituyen repliconesindependientes del cromosoma, dando lugar auna replicación por ciclo celular coordinada conla replicación genómica (plásmidos unicopia) opuede permitir varias replicaciones por ciclo(plásmidos multicopia). El punto en el que el ADN se está duplicando,se llama horquilla de replicación. Lareplicación puede ser unidireccional obidireccional, según se formen una o doshorquillas en el origen. Generalmente, loscromosomas bacterianos tienen replicaciónbidireccional, mientras que algunos plásmidospueden replicarse unidireccionalmente. En lareplicación unidireccional, una horquilla sale delorigen y progresa a lo largo del ADN. En labidireccional se forman dos horquillas que sealejan del origen en direcciones opuestas hastaque se encuentran completando la duplicación.Esto permite a la bacteria duplicar su ADN masrápidamente, que si el proceso fueraunidireccional, pudiendo replicar mas de 1000pb por segundo. Es de destacar que a pesar de

Fig. 3. La replicación semiconservativadel ADN genera dos moleculas idénticas.

Fig. 4. Para la replicación del ADN hacen falta varias enzimas.La ADN polimerasa III necesita para iniciar lasíntesis un cebador o primer que es sintetizado por una ARN polimerasa especial. Algunas proteinas desenrrollanla hélice de ADN y otras se unen a los fragmentos de ADN unicatenario para estabilizarlo. Como la polimerasasolo sintetiza ADN en dirección 5’ a 3’, una de las cadenas se sintetiza en forma discontinua, dejando una seriede fragmentos de ADN y de huecos sin replicar. La ADN polimerasa I rellena los huecos y una enzima ligasasella los fragmentos entre si.

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tal velocidad de replicación, la fidelidad de lamisma es muy grande, siendo la frecuencia demutaciones espontáneas del orden de 1 cada 107

a 1011 pb replicados. La replicación es semiconservativa porquecada molécula de ADN posee una cadena delADN original y una "nueva" lo cual resalta laimportancia de la complementariedad de basesen la estructura del ADN (Fig. 3). Las enzimas encargadas de catalizar el procesode replicación, se denominan ADNpolimerasas. En E. coli se conocen 3 ADNpolimerasas distintas. La responsable de lamayor parte de los procesos de replicación es lallamada polimerasa III, mientras que laspolimerasas I y II cumplen fundamentalmenteroles en la reparación de rupturas o de errores enlas moléculas de ADN. También participan otras enzimas, como son lasllamadas helicasas, responsables de“desenrollar” el ADN en el origen o cerca de él,paso que resulta indispensable para iniciar lareplicación. Esquemáticamente, podemos decir que lareplicación consta de 3 fases: iniciación,elongación y terminación. La iniciación, se da a partir del origen delreplicón donde se forma la o las horquillas de replicación, por la acción de helicasas que“desenrollan” la estructura del ADN,

formándose así una porción monocatenaria queestará en condiciones de formar un complejocon ciertas proteínas de unión al ADNencargadas de estabilizar la cadena sencilla,evitando la formación de puentes de hidrógeno.Se sintetiza un corto oligonucleótido de ARNcon un grupo 3´ oxidrilo libre, que actuará comocebador o “primer”, sobre el que la ADNpolimerasa agrega los nucleótidos. La elongación, consiste en el avance de lahorquilla de replicación, conforme se vanagregando nucleótidos a la cadenaneosintetizada, en un orden establecido por lasreglas de complementariedad de bases (A con Ty C con G) entre la cadena “molde” y la nuevacadena en síntesis. En esta etapa participafundamentalmente la ADN polimerasa III.Todas las polimerasas conocidas, agregannucleótidos en dirección 5´- 3´ para elcrecimiento de la cadena, y requieren de unacadena de ADN molde, un cebador y porsupuesto los nucleótidos. (Fig. 4) La terminación se da luego de que ambashorquillas de replicación han atravesado lamitad del cromosoma en direcciones opuestas, yse encuentran en la región terminal del genoma.En esta región hay secuencias de ADN queactúan como bloqueadores para el avance del lashorquillas, por lo que se asegura que todareplicación termine en esa pequeña porción del

Fig. 5. Comparación entre la expresión de los genes eucariotas y procariotas. Los ARNm procariotasson a menudo poligénicos, es decir que contienen información para mas de una proteína. El etremo 5’se traduce cuando todavía se está transcribiendo el extremo 3’. Los ARNm eucariotas sonmonogenicos y requieren de modificaciones postranscripcionales antes de atravezar la membrananuclear y llegar al citoplasma donde es traducido.

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genoma. LA EXPRESIÓN DE LOS GENESPROCARIOTAS: TRANSCIPCION YTRADUCCION. La expresión genética de todas las célulasdepende de los procesos secuenciales de latranscripción y la traducción que en conjunto,transfieren la información contenida en lasecuencia de nucleótidos de un gen a lasecuencia de aminoácidos de una proteína. Estoimplica que, a partir de la dotación génicaportada por la célula, o genotipo, se expresaránun conjunto de características evidenciables queconstituirán el fenotipo celular. Durante la transcripción, las reglas delapareamiento de bases son usadas por la ARNpolimerasa para sintetizar un productocomplementario a una cadena del ADN usadocomo molde, que constituye el ARN. Una de lasclases mas importantes de ARN es el llamadomensajero, que lleva la información para lasíntesis de proteínas. La ARN polimerasabacteriana, es distinta de la de las célulaseucariotas, y de hecho, ciertos antibióticos quetienen como blanco la ARN polimerasa (comola rifampicina) son efectivos exclusivamentefrente a células procariotas. La ARN polimerasa, reconoce un sitioespecífico en el ADN, llamado promotor, alcual se une, iniciando el proceso transcripcional.Un mismo transcripto, ARNm, puede contenerla información correspondiente a más de un gen,por lo que se traducirá luego en mas de unpolipéptido. El conjunto de genes que sontranscriptos en un único ARNm, y que por tantose expresan en conjunto, se denomina operón(ver mas adelante). Los genes procariotas, no poseen intrones comolos eucariotas, es decir que una vez transcriptoel ARNm, éste será traducido directamente enuna secuencia polipeptídica, sin necesidad derealizar un procesamiento post-transcipcional. Otra importante diferencia con la expresión delos genes eucariotas, es que por no poseer lasbacterias un compartimento nuclear definido, losprocesos de transcripción y traducción, seencuentran acoplados. Es decir que mientras seestá sintetizando una molécula de ARNm, elARN naciente puede tomar contacto con losribosomas e iniciar la síntesis proteica. (Fig. 5)Esto implica una ventaja para la célulabacteriana, y constituye una importante causade su gran capacidad de adaptación a diferentesambientes, ya que le permite responderrápidamente a los estímulos sintetizando losproductos proteicos necesarios en el momentoadecuado.

La traducción es un proceso por el cual el ARNribosómico, el ARN de transferencia (ARNt) ynumerosas proteínas ribosomales y otras,participan en la "lectura" del código genéticodado por los tripletes de nucleótidos o codonesportados por el ARNm, y en la "escritura" de lasecuencia correspondiente de aminoácidos en elproducto polipeptídico. El ribosoma desempeñaun papel fundamental, reuniendo al ARNm y alos ARNt cargados de aminoácidos. La estructura y composición en ARN y proteínasde los ribosomas procariotas, difiere en ciertamedida de la de los ribosomas eucariotas.Tienen una menor masa y por tanto uncoeficiente de sedimentación menor (50 S lasubunidad mayor y 30 S la menor, haciendo enconjunto 70 S) Estas diferencias entre losribosomas procariotas y eucariotas, del mismomodo que otras diferencias en la expresión delmaterial genético (polimerasas, topoisomerasas,proteínas y mecanismos regulatorios, factores deelongación) tienen una serie de implicancias.Una de éstas es la sensibilidad diferencial deprocariotas y eucariotas a sustancias comotoxinas y antibióticos. Por ejemplo macrólidos,aminoglucósidos, cloramfenicol y otros sonantimicrobianos que actúan sobre el ribosomabacteriano o el proceso de síntesis proteica,mientras que ciertas toxinas bacterianas como ladiftérica, actúan selectivamente a nivel de lasíntesis proteica eucariota. Existen 2 sitios en el ribosoma, el aceptor (sitioA) donde los ARNt cargados se asocian enprimer lugar, y el sitio peptídico (sitio P), dondese sujeta la cadena polipeptídica en crecimiento.Durante cada paso de adición de aminoácidos, elARNm avanza 1 codón y el nuevo aminoácidose traslada del sitio A al sitio P, incorporándosea la proteína en formación. Como el código genético es universal, elsignificado de los codones es muy similar al delos eucariotas, aunque cabe mencionar que seencuentran algunas diferencias en los codonesque determinan la iniciación y la terminación dela traducción, así como en la preferencia de usode ciertos codones. Como en los procesos de replicación ytranscripción, el paso inicial de la traducción esun importante punto de regulación. LA REGULACION DE LA EXPRESIONGENICA EN BACTERIAS Las bacterias tienen una gran variedad demecanismos para controlar la expresión de susmiles de genes, con cual logran que el productode un gen determinado, solo se sintetice cuandoes necesario y en lo posible, en la cantidadóptima. Esto les permite una sorprendentecapacidad de adaptación a cualquier cambio en

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la concentración de nutrientes del medio en quehabitan, activando solo cuando es necesario,determinadas vías metabólicas. Así, las bacteriasevitan sintetizar enzimas cuando falta el sustratocorrespondiente, pero siempre están preparadaspara fabricarlas cuando aparece el sustrato en elentorno. Un importante mecanismo regulatoriodesarrollado por las bacterias se basa en laactivación o desactivación de la transcripción deun grupo de genes cuyos productos tienenfunciones relacionadas, que se encuentranorganizados en una región del genoma de formade regular su expresión en conjunto. Esta formade organización genética, se denomina operón yle permite a la célula administrar en formaóptima sus reservas energéticas. Un operón consiste en: un promotor que es elblanco de la regulación; genes adyacentes quecodifican cada una de las enzimas de una víametabólica y una secuencia de terminación de latranscripción. De esta manera, todos los genes constituyentesde un operón, son transcriptos de maneracoordinada, como ARNm policistrónico, esdecir, multigénico, que es traducidosecuencialmente en proteínas por los ribosomas. La iniciación de la transcripción puede regularsede forma positiva o negativa. Los genes bajocontrol negativo se expresan constantemente amenos que sean "desconectados" por unaproteína represora que evitará la expresión delgen mediante su unión a una secuenciaespecífica del ADN denominada operador,impidiendo que la ARN polimerasa inicie latranscripción en el promotor. Aquellos genes cuya expresión se encuentrabajo control positivo, no serán transcriptos amenos que esté presente una proteínaactivadora la cual se une a una secuenciaespecífica del ADN y ayuda a la ARNpolimerasa en los pasos iniciales de latranscripción. Los operones pueden ser inducibles oreprimibles. Se considera que los operones soninducibles cuando la introducción de un sustratoen el medio aumenta la expresión de las enzimasnecesarias para su metabolismo. Esos operonesinducibles sólo funcionan en presencia de unapequeña molécula llamada inductor. Por otro lado, un mecanismo regulatorio porrepresión, es el caso de algunas enzimas cuyasíntesis disminuye cuando se encuentrancantidades suficientes de los productosterminales de la vía metabólica correspondiente.Esto se denomina "represión por producto final"y en este caso los metabolitos terminales sonmoléculas conocidas como correpresores.

Un ejemplo clásico es el del operón lactosa(lac), descrito en E. coli. (Fig. ) Este operón,contiene un conjunto de genes cuyos productosson las enzimas responsables de la degradacióndel azúcar lactosa. En ausencia de lactosa en elmedio, el operón es reprimido por la unión deuna proteína represora a la secuencia deloperador, lo que impide la función de la ARNpolimerasa. La adición de lactosa anula estarepresión, ya que el propio azúcar actúa comoinductor, uniéndose a la proteína represora,impidiendo que ésta continúe asociada aloperador. Este mecanismo de control negativo,asegura que el operón lac se transcriba solocuando se encuentra lactosa en el medio. Por otra parte, existe un mecanismo paraaumentar al máximo la expresión del operónlac, basada en un mecanismo de controlpositivo, mediado por proteínas activadoras. Enel caso de E. coli, una proteína llamada proteínaactivadora del gen por el catabolito (PAC),forma un complejo con AMPc y adquiere lacapacidad de unirse a una secuencia específicadel ADN presente en el promotor. La unión delcomplejo PAC-AMPc al ADN, potencia launión de la ARN polimerasa al promotor,permitiendo así un aumento en la frecuencia deiniciación de la transcripción. De esta manera,se regula no solo la síntesis sino también lacantidad que se sintetiza, según losrequerimientos, de las enzimas responsables dela degradación de la lactosa. Este mismo tipo de mecanismos reguladores dela transcripción, se encuentran en muchasbacterias para una gran variedad de víasmetabólicas. Por otra parte, también existen operones que sonregulados a nivel de la terminación de latranscripción, por un mecanismo especialllamado atenuación, que es característico de lasvías biosintéticas de aminoácidos y está basadaen la característica de acoplamiento entretranscripción y traducción. Este es el caso deloperón triptofano, en el que el promotor codificapara un pequeño péptido que contiene 2 Trp enuna posición crítica. Cuando hay suficientecantidad del aminoácido en el medio, el péptidose sintetiza rápidamente a partir del promotorque es transcripto y luego traducido. Estoconduce a un cambio conformacional en el ADNcorrespondiente al operón, que permite que sereconozca una señal de terminación de latranscripción, entre el promotor y los genesestructurales, en donde la ARN polimerasa sesepara del ADN y termina la transcripción. Porel contrario, cuando no se encuentra suficienteTrp, el péptido no podrá sintetizarse y la ARNpolimerasa continuará transcribiendo el

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conjunto de los genes del operón. De estamanera, la célula solo sintetizará el aminoácido,cuando no haya suficiente cantidad en el mediocomo para utilizarlo para sus necesidadesbiosintéticas. No solo a nivel de la transcripción existeregulación, sino que también existenmecanismos reguladores que actúan a nivel de latraducción y aún luego de la misma. Lavelocidad de la traducción de las diferentessecuencias de ARN transcriptos, puede variarmas de 1000 veces, según el sitio de unión delribosoma con el mensajero. En general, elcontrol de la traducción, se basa en laobstrucción del sitio de unión del ribosoma, yasea por la unión de una proteína al ARN

ribosómico en ese sitio, o por el apareamientode bases del mismo con otro fragmento de ARN.Este es el mecanismo utilizado para laregulación de la síntesis de las proteínasribosomales, cuyos genes también se encuentranorganizados en operones. Por último, existe también una regulaciónpostraduccional, que le es útil a la célulabacteriana para inactivar enzimas innecesarias,ya que hay que considerar que si bien tienenmecanismos para dejar de producir enzimascuando no las requieren, éstas tienen una vidamedia relativamente larga, y en ciertas ocasionesle es más redituable desde el punto de vistaenergético inactivar las enzimas de una rutabiosintética, que asumir el gasto de ATPcorrespondiente al funcionamiento de la ruta,cuando el producto se encuentra disponible en elmedio. VARIACION GENOTIPICA:MUTACIONES Y TRANSFERENCIA DEGENES Como vimos, las bacterias tienen mecanismosque les permiten variar su expresión génicafavoreciendo la síntesis de los productos deciertos genes y reprimiendo las de otros. Estosmecanismos pueden llamarse de variaciónfenotípica, ya que implican una serie decambios en el fenotipo celular o de la poblaciónbacteriana. A su vez, también tienenmecanismos de variación genotípica, que seránigualmente traducidos en cambios fenotípicos,pero que se basan en una modificación de lainformación genética contenida en la célula. Básicamente, existen 2 formas de variacióngenotípica en bacterias. Por un lado, el genomaestá sujeto a sufrir cambios debidos amutaciones y por otro lado, las célulasbacterianas pueden intercambiar materialgenético y de esa forma sufrir recombinación. Una mutación es un cambio heredable en lasecuencia de bases de los ácidos nucleicos queconstituyen el genoma de un organismo, queocurren en condiciones naturales con una muybaja frecuencia y se deben fundamentalmente aerrores en los procesos de replicación del ADN.Además de las mutaciones espontáneas, puedenocurrir también mutaciones inducidas,provocadas por agentes mutagénicos que puedenser químicos, físicos o biológicos los cualesproporcionan una herramienta para introducircambios en el genoma bacteriano en ellaboratorio. La mayoría de estos errores oalteraciones introducidos en el genoma, soncorregidos por los mecanismos de reparacióndel ADN, pero algunos escapan a la correccióny pueden dar lugar a cambios heredables queproporcionan una diversidad genética. Dada la

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baja frecuencia de mutaciones, solo losmicroorganismos, con su alta tasa decrecimiento, pueden alcanzar las cifrassuficientemente altas como para que seandetectables. Las mutaciones en bacterias,frecuentemente afectan propiedades fácilmente

reconocibles como requerimientosnutricionales, morfología o resistencia aantibióticos. Algunas mutaciones, pueden conferir al mutanteuna ventaja frente a la cepa que le dio origen,bajo ciertas condiciones ambientales, de maneraque la progenie de dicha célula mutante es capazde superar el crecimiento de la cepa natural ysustituirla. Este es el caso de las mutaciones queconfieren resistencia a los antibióticos, en lasque el mutante resistente se seleccionará en unambiente en el que las bacterias estén expuestasal antibiótico en cuestión. Este tipo demutaciones se denominan selectivas. Encambio, frente a una mutación no selectiva labacteria no adquiere beneficios en relación a suprogenitor, como por ej. la pérdida de pigmentode las colonias de Serratia marcescens que seobserva al ser cultivadas en agar.Las mutaciones puntuales, son aquellas queimplican un cambio en una única base, y puedenprovocar que se cambie un aminoácido por otroen el producto proteico (mutación por cambiode sentido). Otras veces no se traducen enningún cambio (mutación silenciosa), ya quecomo sabemos existe mas de un codón para cadaaminoácido. También puede suceder que elcodón se convierta en una señal de terminación(mutación sin sentido) y en ese caso se traduciráuna proteína incompleta no funcional.Las deleciones y las inserciones dan lugar acambios más notorios en el ADN, provocando lapérdida o la incorporación de cualquier númerode pares de bases, por lo que siempre que esteno sea un múltiplo de 3 se produciránmutaciones por desplazamiento del marco delectura que suelen provocar la pérdida total delfenotipo.Muchas mutaciones que originan un productoproteico defectuoso, pueden ser suprimidas porun segundo evento de mutación en otro sitio delgenoma (mutaciones supresoras) restaurándoseel fenotipo original. La recombinación genética es el procesomediante el cual elementos genéticoscontenidos en genomas de diferentesindividuos se combinan, lo que permite que elindividuo lleve a cabo alguna nueva función yque puede dar como resultado una adaptación alos cambios en el medio ambiente.Este es un evento evolutivo importante y lascélulas tienen mecanismos específicos queaseguran que dicha recombinación se efectúe. Adiferencia de los eucariotas donde larecombinación genética ocurre en asociación ala reproducción sexual, en los procariotascomprende una serie de mecanismosindependientes del evento de reproducción

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celular. Estos mecanismos son llamadostransformación, transducción y conjugación.La transformación es el proceso por el cualciertas bacterias llamadas competentes soncapaces de incorporar ADN exógeno o extraño,proveniente de otras bacterias, que se encuentralibre en el medio.La virulencia del Streptococcus pneumoniaeguarda relación con la presencia de cápsulapolisacarídica a su alrededor. Las bacterias concápsula tienen un aspecto liso (S) cuando secultivan en placas de agar y son capaces dematar a los ratones que son inyectadosexperimentalmente con una suspensiónbacteriana. Las colonias con bordes rugosos (R)de S. pneumoniae, carecen de cápsula y no sonletales al infectar ratones. Frederick Griffith en1928 observó por primera vez la transformacióncuando mezcló bacterias S muertas conbacterias R vivas y encontró que al inyectar lamezcla en ratones resultaba letal. De estoconcluyó que las R habían sido sustituídas o"transformadas" en bacterias S, ahora capacesde fabricar el polisacárido capsular virulento.La capacidad de captar el ADN exógeno,conservarlo en forma estable e interaccionar conél se denomina competencia. La competencia

depende de la presencia de un sistema decaptación de ADN específico asociado amembrana (Fig. 6).Ejemplos de bacterias con competencia naturalson Haemóphilus influenzae, Neisseria sp.,Streptococcus pneumoniae y ciertas especies deBacillus. Si bien la mayoría de las bacterias nopresentan capacidad natural para captar ADN,es posible inducir en el laboratorio lacompetencia, generando por distintos mediosdistorsiones en la membrana celular, porejemplo mediante pulsos eléctricos(electroporación) o mediante cambios osmóticosy térmicos. Estos procedimientos son muyutilizados para introducir experimentalmenteADN extraño, por ejemplo un plásmido, en unabacteria y así “transformarla” para que adquieraun fenotipo de interés. Las bacterias también pueden ser transformadascon ADN viral, en cuyo caso el proceso sellama transfección.La transducción es la transferencia de ADN deuna bacteria a otra por intermedio de unbacteriófago. Existen dos formas detransducción la especializada y la generalizada.La primera ocurre cuando un fago temperadoporta genes bacterianos adquiridos durante unciclo infeccioso anterior, y al infectar una nuevabacteria e integrar su genoma al cromosomabacteriano, incorporará a éste la informacióngenética correspondiente a la bacteria infectadapreviamente. La transducción generalizada esllevada a cabo por partículas viralesdefectuosas, que se originan como cápsidesvacías durante la replicación viral y que luegoincorporan ADN de una bacteria, así al infectaruna nueva bacteria podrá introducir en elladicho material genético.

La conjugación se basa en el intercambiounidireccional de información genética desdeuna bacteria donante a otra receptora medianteun contacto real (Fig. 8). La conjugación seproduce en la mayoría de las eucariotas, entremiembros de la misma especie, pero se hademostrado también entre procariotas y célulasvegetales, animales y hongos.Los plásmidos son los elementos genéticos quecon mayor frecuencia se transmiten de estaforma. La capacidad de conjugación depende dela presencia en la bacteria de plásmidosconjugativos que contienen los genes necesariospara tal proceso.Un ejemplo muy conocido de plásmidoconjugativo lo constituye el plásmido F de E.coli que codifica diversas proteínas necesariaspara la conjugación, incluyendo el pili sexual.Esta es una estructura especializada esencialpara el contacto entra la bacteria donadora y la

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receptora. En general, los plásmidosconjugadores solamente causan la transferenciade su propio material genético pero en ocasionesel plásmido puede integrarse al cromosomabacteriano y por tanto al momento de conjugar,se transferirá no solo a sí mismo sino también alos genes cromosómicos que se encuentran trasél. Teóricamente todo el cromosoma podría sertransferido, lo que requeriría más de 2 hs, perola unión entre las bacterias por medio del pilipersiste menos tiempo.Las cepas bacterianas con el plásmido F tienenuna gran capacidad de recombinación por lo quese denominan cepas hfr (high frecuency ofrecombination). Debemos recordar que este esun mecanismo muy efectivo para latransferencia de genes de resistenciaantibióticos.

APORTES DE LA BIOLOGIAMOLECULAR Y LA GENETICABACTERIANA A LA MEDICINAUna de las contribuciones mas grandes de laingeniería genética de bacterias, es su uso parael desarrollo de vectores o vehículos quepermiten el clonado de cualquier secuencia deADN. Los vectores mas ampliamente utilizadoscon este fin, son los plásmidos bacterianos.Clonar implica introducir un fragmento de ADNen un vector. Los vectores de clonación, debenpermitir la inserción de un fragmento de ADNextraño y ser capaces de replicarse normalmentedentro de la bacteria. Como vimos, losplásmidos tienen la capacidad de autoreplicarsey son elementos génicos factibles de sertransferidos entre bacterias e introducidos en

una cepa deseada, por lo que constituyen buenosvectores de clonación. Actualmente existenvarios tipos de vectores, algunos plasmídicos

(como el pBR322 o el pUC) y también vectoresvirales (como el bacteriófago lambda) o los masmodernos llamados cósmidos que combinanalgunas de las ventajas de los plámidos con lasde los fagos.Para clonar un gen cualquiera en un plásmido,es necesario en primer lugar cortar el ADNplasmídico y el ADN del cual procede el gen aclonar, para luego ligarlos de la manera deseada.Para esto, existen unas valiosas herramientas dela ingeniería genética, que son las enzimas derestricción. Muchas bacterias, sintetizan estetipo de enzimas, que son capaces de cortarhebras de ADN extrañas a la propia bacteria, ensecuencias nucleotídicas específicas. Porejemplo, una cepa determinada de E. coli,produce una enzima denominada EcoRI. Quereconoce la secuencia GAATTC y la corta (VerFig.)Así, luego que EcoRI ha cortado, quedaránbases sin aparear, que estarán disponibles paraaparearse con otro fragmento de ADN que posealas bases complementarias. Si cortamos 2fragmentos de ADN con esta enzima, ymezclamos los productos de esa reacción, seobtendrá un producto recombinante,combinación de los 2 ADN originales.Estas enzimas, que han sido hace tiempopurificadas y hoy se producen comercialmente,son utilizadas para clonar genes en por ejemploun plásmido bacteriano.De esta manera, es posible por estos métodosincorporar en un plásmido bacteriano un geneucariota que codifique para una proteínadeterminada que nos interese producir engrandes cantidades, siempre que se conozca susecuencia nucleotídica y se disponga deenzimas de restricción que sean capaces decortar específicamente el fragmento de ADNque contiene el gen. Una vez obtenido elfragmento de ADN de interés y cortado elplásmido a ser utilizado como vector con lasmismas enzimas de restricción, estaremos encondiciones de ligar ambos fragmentos de ADN,valiéndonos de las propiedades decomplementariedad de bases del ADN,construyendo lo que se llama un plásmidorecombinante. Este plásmido, podrá serintroducido por transformación en una cepabacteriana apropiada y se podrá producir laproteína de interés en un cultivo bacteriano deE. coli, purificándola luego a partir del cultivo.(Fig. 9)Utilizando estos procedimientos de clonado yexpresión de genes, actualmente se producenmuchas proteínas que son utilizadas para eltratamiento de diversas enfermedades humanas,como por ejemplo la diabetes, al producir lahormona humana insulina u otras como la

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hormona de crecimiento o el interferón, enbacterias recombinantes obteniendo cantidadessuficientes como para su aislamiento y usoterapéutico.Por otra parte, la disponibilidad de antibióticosnaturales para el tratamiento de las infeccionesbacterianas, no es infinita, por lo que otraimportante área de investigación, se centra en laaplicación de la ingeniería genética a la creaciónde nuevos fármacos antimicrobianos. Pormanipulación genética, se intenta producirmutaciones específicas en los genes encargadosde la codificación de proteínas con efectoantibiótico o producir moléculas de antibióticoshíbridos, logrados por técnicas de ADNrecombinante.

Otra importante aplicación de la biologíamolecular a la medicina, es la producción devacunas recombinantes contra infeccionesvíricas o parasitarias, en bacterias. Esteprocedimiento, se basa en la expresión enbacterias de genes de patógenos que codificanpor ejemplo antígenos de superficie del virus odel parásito contra el que se desea vacunar, quesean capaces de actuar como inmunógenosadecuados en la vacunación. Así, clonando losgenes apropiados en los microorganismosadecuados, podrán producirse grandescantidades del antígeno puro. Este método,proporciona la ventaja de que se evita trabajarcon microorganismos patógenos. El desarrollode la vacuna contra la hepatitis B representa elprimer éxito de las vacunas recombinantes. Estavacuna, es producida en una levadura, que hasido transformada previamente con un vectorrecombinante que contiene el gen del virusclonado, encargado de codificar para unaproteína de superficie inmunogénica.Estos métodos, pueden emplearse también parala producción de vacunas vivas, es decir vacunasa ser administradas con virus o bacterias vivas,que han sido manipuladas genéticamente paraperder su virulencia pero que mantienen intactassus propiedades inmunogénicas. A su vez, estosmicroorganismos, denominados atenuados,pueden utilizarse como vectores de genes deotros gérmenes patógenos, y lograr producir unavacuna que inmunice contra mas de unaenfermedad infecciosa a la vez. Estosprocedimientos, son motivo de investigación enlos laboratorios de desarrollo de vacunas entodo el mundo.

BIOTECNOLOGIA APLICADA ALDIAGNOSTICO CLINICOOtra utilidad de la producción de antígenos aescala industrial en bacterias, es para larealización de pruebas diagnósticas que detectenanticuerpos específicos contra antígenosmicrobianos en el suero de pacientes. En estoscasos, interesa clonar en una bacteria de rápidocrecimiento como E. coli, el gen que codificapara un antígeno determinado delmicroorganismo contra el cual se desea detectarla respuesta inmune montada por el paciente. Deesta manera se producirá el antígeno proteico encantidad suficiente, como para utilizarlo como"captura" de anticuerpos en la técnica elegidapara la prueba diagnóstica, ya sea esta ELISA,Inmunofluorescencia, aglutinación de partículasde látex u otras. Un ejemplo de esto, es elreciente desarrollo de una técnica de ELISApara la detección de anticuerpos dirigidos contrael antígeno del core del virus de hepatitis B,

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habiéndose este antígeno clonado y expresadoen E. coli.Las bacterias patógenas, se comportan comotales porque poseen ciertos genes, portadostanto por su cromosoma como en plásmidos, quele confieren la capacidad de expresardeterminadas características fenotípicasdenominadas factores de virulencia odeterminantes de patogenicidad. El estudiodetallado de la genética bacteriana, ha permitidoidentificar varios de estos genes y hoy día somoscapaces no solo de identificar a una bacteriacomo patógena cuando la aislamos produciendoenfermedad, sino también, cuando encontramosen ella los genes responsables de la expresión dedeterminantes de patogenicidad.Esto es especialmente importante, en los casosen que no alcanza con identificar a nivel deespecie una cepa bacteriana aislada de unamuestra patológica, para poder afirmar que esabacteria es el agente causal del procesoinfeccioso. Este es el caso de las enfermedadesdiarreicas causadas por ciertas cepas de E. coli.Como sabemos, E. coli forma parte de lamicroflora normal del tracto intestinal delhombre, y por supuesto esas bacterias no actúancomo patógenos en el intestino. Sin embargo,algunas cepas especiales de la misma especie,cuando alcanzan a colonizar el tractogastrointestinal, a través de la ingesta dealimentos o agua contaminados, son capaces demultiplicarse a ese nivel y causar un procesoinfeccioso que se manifiesta con un cuadrodiarreico. Estas cepas productoras de diarrea,difieren en su carga genética de laspertenecientes a la flora normal, en que poseengenes que codifican para factores de virulencia,por ejemplo pueden ser capaces de producirtoxinas cuyo blanco de acción es el enterocito, oproducir determinadas proteínas de membranaexterna, que la capacitan para adherirse a lamucosa intestinal. Entonces, a la hora deestablecer un diagnóstico clínico microbiológicoen un cuadro diarreico, por ejemplo en unlactante (rango etario donde E .coli es el primeragente causal de diarrea) no alcanzará conidentificar fenotípicamente como E. coli unacepa aislada del coprocultivo, sino que habráque determinar que esta cepa posee losdeterminantes de patogenicidad adecuados. Unaopción para esto, es hoy identificar la presenciade los genes que codifican para estosdeterminantes.Para esto, se han desarrollado técnicasdenominadas de hibridación por sondas, quese basan en las propiedades decomplementariedad de bases del ADN. Unasonda, es un fragmento de ADNcomplementario a una región de un gen que nos

interesa identificar, que ha sido marcada conalgún indicador que pueda ser detectado luegode la hibridación. El marcado puede realizarseincorporando nucleótidos radioactivos obiotinilados o marcados con digoxigenina. Si enun cultivo bacteriano interesa saber si ésta poseeel gen X cuya secuencia conozco, podremosconstruir una sonda específica para dicho gen,extraer el ADN del cultivo y mezclarlo connuestra sonda, en condiciones que permitandesnaturalizar la estructura de doble cadena delADN para permitir que la sonda logre hibridarcon su secuencia complementaria. De estaforma, podremos evidenciar si nuestro cultivoposee o no el gen buscado, ya que de estarpresente, encontraremos la marcacorrespondiente a la sonda incorporada en laestructura del ADN. Esta técnica puedeutilizarse aplicando la sonda directamente sobreuna muestra clínica, por ejemplo una seccióntisular, y en ese caso se denomina hibridaciónin situ.Hoy día se dispone de muchas sondasespecíficas de ADN empleadas para eldiagnóstico de muchas enfermedadesbacterianas. La hibridación por sondas, así comootros métodos que comentaremos para detectarun gen en particular, es especialmente útil pararealizar el diagnóstico etiológico de infeccionesproducidas por microorganismos cuyo cultivo esdificultoso, ya sea por un crecimiento muy lento,como puede ser el caso de Micobacterium sp., opor tener requerimientos especiales para sucultivo y aislamiento, como en Chlamidia sp. yRickettsia sp. o en los virus.El mayor problema en el diagnóstico utilizandohibridación por sondas, ha sido la bajasensibilidad de la técnica, ya que se requiere queen la muestra existan suficientes copias del genbuscado, como para que la marcacorrespondiente a la sonda sea detectada. Engeneral, las técnicas de hibridación in situ consondas no radioactivas, son capaces de detectarsolo mas de 200 copias del gen. Por esto,muchas veces la sensibilidad de la técnica no essuficiente como para descartar como muestrasnegativas a aquellas con las que se obtienenresultados negativos.Uno de los mas interesantes avances en el áreade diagnóstico clínico, ha sido el desarrollo deun método que permite amplificar el número decopias de un determinado fragmento de ADN deinterés. Esta técnica, llamada Reacción enCadena de la Polimerasa, mas conocida por susigla en inglés PCR, permite la generación demillones de copias exactas de un fragmento deADN, a partir de tan solo 1 copia original enapenas 2 o 3 horas. La PCR se basa en laspropiedades de la replicación del ADN, que

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puede reproducirse in vitro si se coloca el ADNmolde, en una mezcla de reacción con unaenzima ADN polimerasa, nucleótidos ycebadores específicos para las regionesflanqueantes del fragmento que se deseaamplificar. Esta mezcla, se coloca encondiciones de ph y osmóticas tales quepermitan el funcionamiento adecuado de lapolimerasa, y en condiciones de temperaturadistintas. Primero, a altas temperaturas (94 o 95grados) para lograr que el ADN sedesnaturalice, es decir que se separen ambashebras; segundo, a temperaturas adecuadas paraque los cebadores hibriden con el ADN molde(entre 40 y 55 grados, según los cebadores); yen tercer lugar, a la temperatura adecuada paraque lapolimerasa de ADN lleve a cabo el proceso dereplicación. Las polimerasas que se utilizan paraesto, deben ser capaces de tolerar estas altastemperaturas de desnaturalización del ADN, porlo que la enzima utilizada, corresponde a unabacteria termófila, Thermus aquaticus, por locual se la llama Taq polimerasa, cuyatemperatura óptima es de 72 grados. Hoy día seutiliza ésta y también otras enzimas, producidasen forma recombinante en E. coli .Estos cambios de temperatura, se realizan en unequipo conocido como termociclador, que escapaz de variar entre rangos muy amplios detemperatura en tiempos muy cortos. Esteciclado de temperaturas, por ejemplo94º por 1 minuto, 45º por 1,5 minutos y 72 º por1, 5minutos

se repite unas 30 veces, con lo que se logra queen cada ciclo se duplique el número de copiasde cada una de las hebras del ADN molde, conlo que se logra un crecimiento exponencial. (verFig. 11 )Este procedimento, puede aplicarsedirectamente sobre una muestra clínica,buscando determinar la presencia o ausencia deun microorganismo en particular, a través de ladetección de una secuencia específica en suácido nucleico.Para revelar el resultado del ensayo, la mezclade reacción debe ser utilizada como muestra enuna corrida electroforética en gel de agarosa ode poliacril amida, en donde el ADN migradesde el polo negativo al positivo, en mayor omenor medida según su peso molecular, es decirsu tamaño en pares de bases. El fragmento aamplificar, es por supuesto de un tamañoconocido, por lo que podrá determinarse lapresencia del gen buscado en la muestra, porquehabrá amplificado en la reacción y presentaráuna banda del tamaño correspondiente en el gel.(Ver Fig. 12 )Los geles deberán ser revelados para quedesarrollen una reacción de color visible, quenos ayude a determinar la presencia o ausenciade la banda de interés. En el caso de los geles deagarosa, el revelado se hace generalmente conbromuro de etidio, que es un agente intercalantedel ADN, es decir que su molécula se intercalaentre las bases del ácido nucleico. Esteprocedimiento, resulta en un “teñido” del gel, yaque el bromuro de etidio tiene la propiedad de

Fig. 11. Reacción en cadena dela polimerasa (PCR)Se parte de primers específicospara la secuencia de interés. Sedesnaturaliza el ADN (94 °)ylos primers se unen en sussecuencias complementarias.(ala temp. adecuada según losprimers, aprox. 55°). Luego lapolimerasa sintetiza a partir decada primer copiando la cadenamolde ( a 72°). Asi se completaun ciclo, repitiendose elproceso unas 30 veces, luego delo cual se logra multiplicar lasecuencia de interés en formaexponencial.

fluorescer bajo luz ultravioleta, por lo que al serexpuesto el gel a UV, se evidenciará lapresencia o ausencia de la bandacorrespondiente. En el caso de los geles depoliacrilamida, el revelado puede realizarse portinción con nitrato de plata.El resultado de la PCR, también puede hacerseevidente, combinado la PCR con una técnica dehibridación por sondas. Esto se logratransfiriendo el ADN del gel a una membrana(por ejemplo de nitrocelulosa), y poner a ésta encontacto con una sonda específica. En este caso,el revelado lo brinda la marca de la sonda. Esteprocedimiento de transferencia de ADN a unamembrana combinado con hibridación porsondas, se denomina Southern Blott.

Si bien hemos centrado el interés de estastécnicas de detección de ácidos nucleicos para eldiagnóstico de las enfermedades infecciosas,también son muy utilizados hoy día paradiagnosticar una amplia gama de enfermedadescomo neoplásicas y hereditarias.La aplicación de la biotecnología molecular a lamedicina, representa un campo de intensainvestigación y vertiginoso desarrollo. Laprevención, el tratamiento y el diagnóstico demuchas enfermedades que hasta hace pocosaños resultaba imposible, hoy son una realidad,y cada vez más la biología molecular aportaconocimientos y tecnología aplicables a lamejora de la calidad de vida y la salud humana.

BIBLIOGRAFIA- "Microbiología. Mecanismos de las

enfermedades infecciosas". Schaechter,Medoff, Eisenstein. Ed. Panamenricana.

- "Zinsser. Microbiología médica". Joklik,Willett, Amos, Wilfert. Ed. Panamericana

- "Genes". B. Lewin. Ed. Reverté.- "Microbiología médica" Murray,

Kobayashi, Pfuller, Rosenthal. Ed. HarcourtBrace.

- "ADN recombinante. Introducción a laingeniería genética". Watson, Tooze, Kurtz.Ed. Labor.

Fig. 12. Corrida electroforética en gel deagarosa, para revelar una reacción de PCR.En el carril de la derecha se observa unmarcador de peso molecular y en los doscarriles anteriores el producto de laamplificación del tamaño esperado. En elprimer carril la muestra no contenía lasecuencia de interés.

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