TRABAJO PRÁCTICO N° 2•MEDIOS DE CULTIVO• SIEMBRA Y TRANSPLANTE

MEDIOS DE CULTIVO.

• Definición: es toda preparación artificial, sólida,semisólida o líquida que suministra al microorganismocada una de las sustancias fundamentales, una fuentede energía y condiciones ambientales adecuadas parael desarrollo y la supervivencia del microorganismo.

• CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo.

• Los cultivos pueden ser:

• a) puros o axénicos

• b) mixtos

Existe gran diversidad de condiciones químicas y físicas en las cuales puede ocurrir el crecimiento

microbiano, pero siempre se requieren una fuente de energía y una fuente de carbono

Un solo tipo de microorganismo

Varios tipos de microorganismo

Todos los organismos requieren una fuente de energía para obtener ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos:

- fotosíntesis

- respiración aerobia: aceptor final de electrones O2

- respiración anaerobia: aceptores finales de electrones: NO3, SO4, CO2, fumarato.

- fermentación: conjunto de reacciones donde compuestos orgánicos sirven como donadores y aceptores de electrones. Se produce ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

Clasificación de Microorganismo según su fuente de energía y fuente de carbono

Composición de los medios de cultivos

• 1. Elementos energéticos y constitutivos

a) Macro elementos

b) Micro elementos o trazas

c) Factores de crecimiento

• 2. Agua

• 3. Agentes solidificantés:

1. Elementos energéticos y constitutivosa) Macro elementos

Fuente de Carbono

Fuente de nitrógeno

CO2 para autótrofos,

azúcares para heterotrofos

“Se necesita el carbono para la construcción de muchas moléculas necesarias para la célula”

“El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared”

NO3-, NH3 ó N2. (autótrofos)

Aminoácidos y proteínas

1. Elementos energéticos y constitutivosa) Macro elementos

Azufre

calcio, magnesio y potasio

sodio

Producir aminoácidos (cisteína ymetionina) y diferentes coenzimas

SO42-, tiosulfatoo sulfuro

Fuente de: Se adiciona como: La célula lo utiliza para:

Fósforo Fosfatos de sódioo potasio

Funciona como BufferPara producción de ATP, fosfolipidos y Ac Nucleicos

sales inorgánicas Co factores de enzimas

Na ClEstabiliza la

presión osmótica

1. Elementos energéticos y constitutivosb) Micro elementos o trazas

Son metales que se requieren en muy pequeñas cantidades. Participan en la estructura delas enzimas, vitaminas, transportadores de electrones como citocromos. Soncontaminantes de los macroelementos y se incorporan junto a ellos en los medios decultivo.

Frecuentemente esenciales:

Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn

Inhibidores del crecimiento:

Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor

que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.

1. Elementos energéticos y constitutivosb) Factores de Crecimiento

Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas

concentraciones y que no pueden ser sintetizados por la célula

Si la secuencia de producción enzimática, de un determinado componente.

(Por ej: Histidina) esta interrumpida por alguna alteración, este componente no

podrá sintetizarse por la célula y se convertirá en un factor de crecimiento.

Ejemplos de factores de crecimiento : vitaminas, como las del

complejo B algunos aminoácidos ,purinas y pirimidinas

2. Agua

•El agua representa el 80-90% del peso

total de una célula

•Es fundamental para la realización de

todos los procesos metabólicos

•Funciones enzimáticas, solvatación

de materiales orgánicos e inorgánicos,

y donación de electrones para

organismos fotosintéticos

En los medios de cultivo se usa agua destilada,

libre de iones como Ca2+ y Mg2+

3. Agentes solidificantés

Cuando se agregan a un medio de cultivo permiten aislar

colonias bacterianas. El mas utilizado es el Agar. Su uso es opcional

Placa de petri

Se adiciona el

medio de cultivo

con agar fundido

El agar se enfría

y se solidifica

Permite aislar

Colonias bacterianas

El Agar es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato.

Se usa sin problemas en medios de cultivoporque las bacterias NO lo digieren.

Sus características:

-Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.

- Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la mayoría de las

bacterias patógenas del hombre.

-No es tóxico para las bacterias

-Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de

microorganismos derivadas de una única célula), lo que resulta imposible en

medios líquidos!!

-Para medios semisólidos (donde observo movilidad) empleo 0,2-0,3% de agar

- Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.

Condiciones Físicas de un medio de cultivo

Temperatura

Presencia

de oxígeno

a) aerobios estrictas: requieren oxígeno para crecer.

b) anaerobios obligados: el O2 les resulta tóxico.

c) anaerobios facultativos: pueden crecer tanto en

condiciones aerobias como en condiciones anaerobias.

d) microaerófilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una

atm enriquecida en CO2.

e) anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2

y si son expuestos al O2 no mueren.

mesófilos: 35-37°C

psicrófilos: 15-20°C

termófilos: 50-60°C

presión osmótica

Humedad:

luz:

pH:

la mayoría de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl

es importante para los microorganismos fotosintéticos

Los microorganismos necesitan un ambiente húmedo para su desarrollo

la mayoría de las bacterias crece en medio neutro o levemente alcalino

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su origen

químicamente definidos

o sintéticos

naturales o complejos

Su composición química se

conoce con exactitud, cada

componente es de alta pureza

analítica y realiza un aporte

específico ej: medios para

autotrofos

Se preparan a partir de sustancias

naturales de origen animal o vegetal

de composición química no

rigurosamente constante: leche,

suero, macerado de maíz,etc

Ej: medios para quimioheterotrofos

Ej. Medio Definido o sintético; (para

fototrofos):

CO2 ……………………….. (fuente de C)

NaNO3 …………………… (fuente de N)

Na2SO4 ……………………. (fuente de S y Na)

KH2PO4 ……………………. (fuente de P y K)

Trazas ……………………… varias

H2O ………………………… (indispensable para

toda función celular)

Conjunto de sales,

Especificas Para un

determinado

tipo de

microorganismo

Ej- agar nutritivo, medio natural o

complejo; (para bacterias

quimioorganotrofas):

Peptona de carne ………….. 0.5 g

Extracto de carne ………….. 0.3 g

NaCl ………………………… 0.5 g

Agar ……………………… 1.5 – 2 g

Agua destilada ……………. 100 ml

Aditivos que no tienen una

Composición nutritiva definida

PEPTONAS: son producto de la hidrólisis ácida o

enzimática de proteínas de origen animal o

vegetal (ej. peptona de carne, peptona de soja,

peptona de caseína).

EXTRACTO DE CARNE: su función es ser

complemento vitamínico de las peptonas. Pero también

aporta: Sustancias nitrogenadas como: aminoácidos,

bases púricas y pirimídicas, ácidos orgánicos, creatina,

xantina, hipoxantina, ácido úrico, urea. Sustancias no

nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de hexosas,

ácido láctico, sales inorgánicas.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su Consistencia

Líquidos sólidos semisólidos o blandos

No contienen

solidificante

y no permiten

el aislamiento

de colonias

incluye agar

al 0.3%

Incluyen agar en

concentraciones

de 1.5 a 2%

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su Composición

Comunes Enriquecidos

incluyen una fórmula

nutritiva básica que

permite el crecimiento

de microorganismos

poco exigentes.

Tienen una alta calidad

nutritiva por el agregado

de componentes muy

ricos como leche, sangre,

huevo líquido, etc. Se

utilizan en el cultivo de

bacterias exigentes

Ej.

- comunes: AGAR NUTRITIVO

-peptona de carne

-extracto de carne

-NaCl

-agar 2%

-agua destilada

- enriquecidos: AGAR SANGRE

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su función:

Medios de

enriquecimiento:

Medios Líqudos sembrados

con poblaciones mixtas de

microorganismos, favorecen

la multiplicación de ciertos

grupos e inhiben el

desarrollo de las especies

restantes.

Medios selectivos Medios diferenciales

son medios sólidos

que favorecen

la multiplicación

de un determinado

microorganismo e inhibe el

desarrollo de otrosSe logran agregando comp qcos

(Ab) o alterando las condiciones

fcas (pH).

permiten discriminar entre

diferentes tipos de bacterias

basándose en características

metabólicas particulares

de cada uno.Se logran agregando determinados

sustratos (Ej glucosa) y un sistema

indicador (Ej Rojo fenol)

Ej.

- de enriquecimiento (líq.) - selectivos (sólidos)

Caldo Mac Conkey(inhibidor + lactosa +

púrpura de bromocresol Agar Mac Conkey(inhibidor + lactosa + rojo

neutro)

Ej.

-diferencial

Agar triple azúcar hierro (TSI)

Enterobacter

Shigella

Proteus

Pseudomonas

Fermentación de: -glucosa ?; -sacarosa ?; -lactosa ?

Producción de H2S ?

El medio incluye los 3 azúcares, sal de Fe2+ y un indicador

de pH (rojo neutro)

Ej.

De transporte: medio de Stuart

medio de Cary Blair

Contiene buffer + sustancias criopresevantes (glicerol)

Control pH. Ajuste con NaOH o HCL-Cintas de pH

-Azul de bromotimol

-pHmetro

Esterilización de los medios de cultivo-Autoclave

Control de Esterilidad-Se toma una parte representativa de los medios y se incuban en estufa de cultivo a 37ºC

Medios de Transporte -Ej Medio de Stuart

Conservación de los medios de cultivo-4-10º C en refrigerador

PARTE B: SIEMBRAS Y REPIQUES

Siembra: se entiende por siembra al acto de transferir o colocar un

microorganismo en un medio de cultivo adecuado. La transferencia se

efectúa desde el hábitat natural (nicho ecológico) al medio de cultivo.

Medio de cultivoMuestras

Trasplante o repique: es la transferencia de gérmenes desde un

medio de cultivo a otro.

¿Con qué se siembra?

Ansas en anillo

y un ansa recta

Siembra en placa

con medio solido

Crecimiento de

Colonias bacterianas

Espátula de

Drigalski

¿Con qué se siembra?

Siembra

Crecimiento de

Colonias bacterianas

Micropipeta o

Pipeta pasteur

Micropipeta Pipeta pasteur

Técnica aséptica para siembras y repiques

A- se esteriliza el ansa a la llama

B- se sostiene el ansa con el índice

. Luego con el meñique .

se destapa el tubo de muestra .

La "Técnica aséptica" tiene un doble objetivo:

a) evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes

de las muestras o cultivos y

b) evitar la contaminación de las muestras y cultivos con microorganismos

procedentes del ambiente o del propio operador

E- se flamea el tubo, para

Evitar su contaminación

F- se tapa con el dedo meñique

C. Se flamea la boca para evitar

Contaminación

D- se sumerge el ansa para tomar

Un inoculo del tubo