J. Embryol. exp. Morph. Vol. 22,1, pp. 127-43, August 1969 127Printed in Great Britain

Formation et role des nucleoles desovocytes de Triturus helveticus Raz — Etude

autoradiographique et ultramicroscopique

ParS IMONE SANCHEZ 1

La presence d'un tres grand nombre de nucleoles dans la vesicule germinativedes Amphibiens, et revolution de cette population nucleolaire au cours del'ovogenese est un phenomene particulier qui a deja suscite de nombreuxtravaux. MacGregor (1965) a resume les resultats obtenus par differents auteurset rapportes ses propres observations sur la formation des nucleoles chez lesAmphibiens de differentes especes. 11 ressort de l'analyse faite par cet auteurque deux mecanismes generaux determinent l'etat multinucleole des ovocytesd'Amphibiens, soit que les chromosomes plumeux elaborent des corps nucleo-laires qui viennent grossir la population des nucleoles d'origine, soit que lafragmentation des nucleoles d'origine conduise a une multiplication de cesderniers, sans qu'une elaboration nouvelle intervienne. Mais, quelle qu'en soitl'origine, les nucleoles neoformes apparaissent, aux yeux de cet auteur, parfaite-ment identiques aux nucleoles originels. Par contre, Gall (1968) montre quel'apparition des organisateurs nucleolaires et de l'ADN qui constitue cesorganisateurs, a lieu au cours du stade pachytene de la meiose, et la multiplica-tion nucleolaire qui suit, s'effectue en liaison avec ces organisateurs. Cesobservations suggerent que la population des nucleoles typiques est flxee desles premiers stades de la meiose. Cependant, de tres nombreux corps nucleo-laires apparaissent au stade diplotene suivant, dans les ovocytes d'Amphibiens.Chez Xenopus laevis, Van Gansen & Schram (1968) distingue, a la fin de cestade, trois types de nucleoles: des nucleoles typiques, des micronucleoles, et desnucleoles a protuberances a partir desquels se formeraient les seconds. Nucleolestypiques et micronucleoles se caracterisent differemment par les techniquescytochimiques. Des examens ultrastructuraux et cytochimiques pousses ontpermis d'etablir d'une maniere sure la constitution et la fonction metaboliquedes nucleoles (Miller, 1962, 1964, 1966; MacGregor, 1967; Lane, 1967; VanGansen & Schram, 1968). Deux zones distinctes composent tout nucleoletypique: l'une est fibreuse, l'autre granulaire. Les precurseurs trities de l'ARNapparaissent d'abord dans le materiel fibreux ou s'effectuerait la synthese d'unepartie de l'ARN au contact de l'ADN de l'organisateur nucleolaire. L'ARN

1 Adresse de I*auteur: Laboratoire d'Histologie et d'Embryologie, Faculte de Medecine2, rue Ecole de Medecine, 34 Montpellier, France.

128 S. SANCHEZ

synthetise serait ensuite transfere dans le cortex granulaire. Par contre, lesmicron ucleoles non basophiles decrits par Van Gansen & Schram (1968) sontconstitues d'un materiel compact fibrillo-granulaire dense.

En abordant Fetude de l'ovogenese de Triturus helveticus, nous avonsobserve que le metabolisme nucleaire etait fortement marque par l'activite d'unepopulation nucleolaire heterogene dans son ultrastructure, et dont la densiteest variable au cours de la maturation de l'ovocyte. D'etroites relations s'etablis-sent entre les nucleoles et les chromosomes plumeux au cours de la phaseterminale de l'ovogenese, qui sont le signe d'une activite biosynthetique intense:les observations autoradiographiques decrites ci-dessus en apportent lademonstration.

MATERIEL ET TECHNIQUES

La plupart des observations decoulent de l'examen d'autoradiogrammesexecutes selon la technique de Ficq (1962).

Des animaux femelles de Triturus helveticus Raz recoltes a differentes epoquesde l'annee dans la region des Causses, ont recu une injection intraperitonealede 100/tc de precurseur radioactif: acide orotique 5-T, act. spec. 750 mc/mM; L-lysine-4-5-T monohydrochlorure, act. spec. 302 mc/mM; L-phenylaline-T, act.spec. 750 mc/mM, provenant d'Amersham (Angleterre). Les ovaires ont etepreleves apres des temps variables et fixes dans l'alcool (9)-acetique (1).

L'ovaire d'un animal qui avait recu une injection de lysine pendant 24 h, aete conserve en chambre sterile, dans une solution froide, un jour entier, avantd'etre fixe. Des tests enzymatiques a la ribonuclease et a la desoxyribonuclease,ont ete pratiques sur lame, avant la pose de l'emulsion.

La technique de Bloch et Hew (1950), au bleu de bromophenol apres hydrolysedans l'acide picrique avec et sans acetylation, a permis une bonne visualisationdes proteines basiques.

Pour les observations en microscopie electronique, les ovocytes ont ete fixespendant 4 h a la glutaraldehyde tamponnee, en solution a 5 %, et post-osmiespendant 1 h. Us ont ete inclus dans de l'Araldite.

Les preparations ont ete examinees au microscope electronique PhilipsEM 200.

RESULTATS

I. Mecanisme de la formation des corps nucle'olaires

(a) Etude cytochimique

Parmi les nombreuses donnees que Ton possede sur l'ovogenese des Amphi-biens, rappelons, tout d'abord, celles qui permettent de situer les problemes quenous avons abordes.

Le developpement de l'ovocyte se deroule en deux temps: d'abord, I'elabora-tion du vitellus, ensuite la maturation cytoplasmique suivie, au moment de laponte, de la maturation nucleaire.

Nucleoles des ovocytes

Fig. 1. Evolution de l'appareil nucleolaire au cours du developpement de l'ovocytede Triturus helveticus (coloration: bleu de bromophenol, acide picrique pH = 2,3).A, B. Debut de la phase d'accroissement. x 3.000.C. Vitellogenese primaire. x 1.200.D-G. Vesicules germinatives d'ovocytes prematures montrant l'ascension desnucleoles au centre du noyau (D), la formation de tres nombreux micronucleoles(E), le retour des nucleoles a la peripherie (F), et disparition des ramifications deschromosomes plumeux (G). x 750.

9 J E E M 22

130 S. SANCHEZ

Chez Triturus, la vitellogenese se deroule egalement en deux temps. Lavitellogenese precoce, qui s'effectue dans la zone corticale, tandis que la vitello-genese tardive s'effectue dans la zone peri nucleaire. Brachet (1947) met enevidence dans Foeuf non feconde d'Amphibien, l'existence d'un cortex basophilecontenant des granules ribonucleiques. Dans le cytoplasme, ces granulesribonucleiques se repartissent selon un gradient animal-vegetatif. Par contre, lalocalisation de certains acides amines tels que 1'arginine affecte une dispositioninverse. Witteck (1952) confirme les observations precedentes en montrant quela vitellogenese etait marquee des le debut et tout au long de son deroulementpar une polarisation qui prepare les localisations biochimiques ulterieures.

Sur le plan nucleaire, la presence de chromosomes longs et ramifies, leschromosomes plumeux, ainsi que celle de nombreux nucleoles accusent l'origi-nalite marquee de la vesicule germinative d'Amphibien.

La coloration au bleu de bromophenol-acide picrique a bas pH, specifiquedes proteines basiques (fig. 1), souligne avec une particuliere nettete, la structuremorphologique des constituants nucleaires, chromosomes et nucleoles. Cettetechnique montre: chez les tres jeunes ovocytes dont le noyau atteint 5 a 6 /* dediametre, de nombreux nucleoles spheriques et de structure homogene, serepartissant a la peripherie du noyau. A ce stade, seuls les nucleoles sont colores.Les chromosomes et le nucleoplasme demeurent incolores. A un stade plusavance (diametre nucleaire 25 JLO), l'aspect de la vesicule germinative changetotalement. Nucleoles spheriques, chromosomes leptotenes et nucleoplasmessont intensement colores en bleu. L'apparition de cette coloration est, probable-ment, la manifestation d'une synthese nouvelle de proteines basiques. Certainsnucleoles se trouvant pris entre les mailles du reseau chromatique, recueillentdes fragments chromatiques qu'ils entrainent contre la membrane nucleaire,tandis que les chromosomes perdent leur colorabilite premiere. Et c'est ainsique jusqu'a la vitellogenese, nous voyons, appliques contre la membranenucleaire, des nucleoles qui s'entourent d'un materiel spumeux.

Au cours de la vitellogenese, de nombreuses extrusions nucleaires debarrassentles nucleoles de ce materiel spumeux; les nucleoles redeviennent alorsspheriques.

Fig. 2. Formation et ultrastructure des micronucleoles de l'ovocyte premature deTriturus helveticus.A. Fragment de chromosome. La zone indiquee par la fleche pourrait etre l'axedu chromosome, x 15.200.B, C. Corps micronucleolaires en formation sur les ramifications chromosomiques.x 21.600 et 11.600.D. Corps micronucleolaire (m.n.) accole a la zone granulaire du nucleole (N).E. Detail grossi 103.200 de C montrant Pintegration des particules de 500 A environdans le corps micronucleolaire.

F. Structure particulaire d'une ramification chromosomique. x 44.800.

Nucleoles des ovocytes 131

9-2

132 S. SANCHEZ

Vers la fin de la vitellogenese, des phenomenes analogues aux premiers sederoulent a nouveau dans la vesicule germinative. La selectivite de la colorationau bleu de bromophenol a permis de les suivre avec beaucoup de nettete, aucours des differents stades prophasiques. Les 'lampbrush chromosomes' occu-pent, durant la vitellogenese, toute la vesicule germinative; les nucleoles sontlocalises dans les cryptes de la membrane nucleaire. Ensuite, les uns et les autresse groupent au centre de la vesicule germinative, et une multitude de granula-tions apparaissent au contact des chromosomes. Ces granulations deviennentcoalescentes et donnent naissance a un nombre tres important de micronucleoles.Certains d'entre eux vont se greffer sur les macronucleoles qui se trouvent aproximite. Les macronucleoles piques de micronucleoles, et les micronucleoleslibres retournent a la peripherie du noyau, laissant au centre les chromosomesdepouilles de leurs boucles.

Ces observations cytochimiques preliminaries suggerent l'existence de rela-tions directes entre les 'lampbrush chromosomes' et certains nucleoles ou partiesde nucleoles. L'etude ultrastructurale viendra confirmer cette hypothese.

(b) Etude ultrastructurale

Nous avons effectue des examens ultramicroscopiques dans la region deschromosomes d'ovocytes ages. A ces stades avances de la vitellogenese, lesvesicules germinatives contiennent, effectivement, trois types de corps nucleo-laires comme l'observent Van Gansen & Schram (1968) chez Xenopus laevis.

(1) Des nucleoles typiques, composes d'une region fibrillaire plus ou moinsentierement enfermee dans une cape de materiel granulaire. Ces nucleolestypiques prennent des formes diverses, spheriques ou en ruban.

(2) Des micronucleoles d'un type different des premiers et (3) des nucleolesa protuberances, formes par la juxtaposition de nucleoles typiques et de micro-nucleoles. C'est preferentiellement au contact de la region fibreuse que viennents'accoler les micronucleoles.

Si sur le plan cytochimique, les reactions des uns et des autres sont identiquesou presque, par contre, leur structure est differente.

Les micronucleoles ont une constitution homogene, ou apparaissent, essen-tiellement, des elements granulaires plus denses aux electrons que ceux desnucleoles typiques et d'un diametre plus grand (120 A). Mais c'est leur modede formation qui permet de les caracteriser surement. Dans les ovocytes ages,ou ils sont les plus nombreux, certains d'entre eux sont rattaches aux chromo-somes, ou, plus precisement, aux boucles chromosomiques qui leur donnentnaissance. Parmi le materiel heterogene que constitue ces boucles, se trouve untres grand nombre de particules de l'ordre de 500 A qui se groupent et formentdes amas de 2 a 3 /t de diametre. Dans cette masse, qui constitue le micronucleoleen formation, les particules de 500 A sont heterogenes. Elles paraissent formeesd'une chaine de particules plus fines de 120 A environ, enroulee sur elle meme.Elles se deroulent ensuite, rendant plus nette la structure finement particulaire.

Nucleoles des ovocytes 133

La population nucleolaire des ovocytes agee, est done composee de corpsnucleolaires different essentiellement par leur constitution ultrastructurale. Lesuns sont composites, les elements fibrillaires et les elements finement granulairesetant localises dans deux regions distinctes. Les autres sont de constitutionhomogene et formes de particules de l'ordre de 120 A derivant de particules plusgrosses de 500 A environ. La presence de fibrilles melees aux particules de 120 An'est pas exclue. Ces derniers nucleoles se greffent momentanement sur lespremiers et donnent naissance aux nucleoles a protuberance; mais ils s'endetachent ensuite en emportant souvent des fragments du nucleole hote. Lanature des echanges entre les deux types de nucleoles nous echappe encore.11 semble, cependant, que ces processus soient lies au transfert de ribonucleo-proteines elaborees par les chromosomes. En effet, a cote des micronucleoles,le nucleoplasme transporte des fragments, de tailles variables, d'un materiel quileur ressemble. Ces fragments, comme les micronucleoles, entrent en contactavec les nucleoles typiques.

II. Metabolisme de Vovocyte au cours de son developpement:syntheses de FARN et des proteines

(1) Cinetique d'incorporation de Vacide orotique-H3

Ce precurseur a ete injecte dans la cavite generale des animaux et les ovairesont ete preleves 3 h et 24 h apres l'injection.

L'incorporation de l'acide orotique dans l'ARN synthetise s'effectue des lespremieres heures, a un taux eleve (fig. 3 A, B).

D'une maniere generale, le marquage est essentiellement chromosomique.Les nucleoles n'apparaissent que legerement marques. Un transfert du materielradioactif dans le cytoplasme intervient au cours des 24 h qui suivent l'injectiondu traceur. Le marquage cytoplasmique est localise aux regions basophiles(fig. 3D).

Un examen plus precis permet d'observer des variations dans le marquage,au cours du developpement de l'ovocyte. Lors de la phase preparatoire a lavitellogenese, les tres jeunes ovocytes, dont le cytoplasme montre le plus hautdegre de basophilie, presentent le marquage nucleaire le plus intense. Cetteintensite s'estompe aux stades suivants, ce qui rend vraisemblable une diminu-tion du taux des syntheses de l'ARN au cours de la vitellogenese proprementdite. La synthese reprend avec une nouvelle intensite au cours de l'ascensiondes nucleoles au centre de la vesicule germinative, stade qui marque la fin de lavitellogenese et annonce la maturation.

La localisation du marquage nucleaire au cours des premieres heures del'incorporation d'acide orotique-H3 se superpose avec le trace des chromo-somes. Les nucleoles peripheriques ne sont pas marques d'une maniere signi-ficative. Par contre, les nucleoles qui, en fin de developpement, se rassemblentau centre de la vesicule germinative presentent un marquage net. Lane (1967)

134 S. SANCHEZ

a montre qu'il s'agit d'une synthese d'ARN qui s'effectue au contact de l'ADNnucleolaire. Mais, la majeure partie de FARN synthetise Test, sans nu] doute,a partir des chromosomes.

Au cours des 24 h qui suivent, les ribonucleoproteines marquees se detachentdes chromosomes et sont transportees a la peripherie du noyau; elles passent,ensuite, dans le cytoplasme juxtanucleaire. II n'est pas exclu que les nucleolescontribuent au transfert des ribonucleoproteines vers la membrane nucleaire.

(2) Cinetique ̂ incorporation de la lysine-H3

La coloration massive des nucleoles et des micronucleoles par les techniquesprecedemment decrites, suggere la presence, dans ces organites nucleaires,d'une forte teneur en proteines basiques. C'est la raison pour laquelle nousavons utilise la lysine-H3 comme traceur radioactif, afin de preciser la significa-tion des phenomenes decrits dans le chapitre precedent. Mais la localisation dela coloration des proteines basiques ne se limite pas aux seules regions nucleaires.Une quantite importante de proteines basiques cytoplasmiques a ete trouvee, eneffet, dans l'ovocyte de Triton (Horn, 1962). Les colorations cytochimiques quenous avons employees permettent de les situer dans les ilots de vitellus enformation, en bordure des plaquettes vitellines.

La biosynthese de ces proteines basiques et leur comportement au cours dudeveloppement de l'ovocyte ont ete analyses par la technique autoradiographiqueapres incorporation de la lysine-H3 qui a ete injectee dans la cavite generale del'animal, a raison d'une injection de 100/tc. Les ovaires ont ete preleves 7,18,24 hapres l'injection. Dans ce dernier cas, un fragment de l'ovaire a ete conservependant 24 h apres Fablation, dans une solution physiologique contenant un excesde lysine non radioactive, avant d'etre introduit dans le fixateur.

La distribution du precurseur dans les ovocytes varie en fonction de la dureedu 'pulse', ce qui permet de suivre la migration des proteines qui ont incorporel'acide amine durant leur synthese. Elle varie egalement en fonction du stade dudeveloppement de l'ovocyte. Enfin, un marquage effectue a diverses periodesde l'annee permet de constater une variation saisonniere, comme l'a signaleGeuskens, chez Asterias rubens (1965). Le marquage est en effet plus intense auprintemps. D'une maniere generale, a la 7e h, les vesicules germinatives sontuniformement marquees, tandis que les cytoplasmes ne le sont qu'en certaines

Fig. 3. Incorporation d'acide orotique-H3 dans les ovocytes de Triturus heheticus.x 1.200.A. Marquage nucleaire des ovocytes au stade previtellogenetique (duree de l'in-corporation 3 h).B. Vesicule germinative d'un ovocyte premature apres 3 h d'incorporation duprecurseur.C. Meme stade apres 24 h d'incorporation.D. Ovocyte en fin de vitellogenese primaire ayant incorpore l'acide orotique-H3dans la zone basophile perinucleaire (24 h).

Nucleoles des ovocytes 135

• s< V

<» . * , ..•

A..'

. .**

£ • t

136 S. SANCHEZ

-p.a.

1 • * , . ' * • -

• • > . - * ' •

D

'K;

Nucleoles des ovocytes 137

regions privilegiees. En effet, la densite du marquage cytoplasmique presenteun gradient centripete qui suggere un deplacement des proteines de la peri-pherie vers le noyau. La synthese parait s'efTectuer surtout dans le cortex, ouTon observe des ilots de proteines marquees sur tout le pourtour de l'ovocyte.Par contre, la membrane folliculaire n'a pas retenu le precurseur d'une manieresignificative.

Lorsque les glandes sont prelevees un jour apres l'injection, des variations semanifestent dans la localisation et la densite du marquage, entre les differentescategories d'ovocytes. L'incorporation reste moderee dans les ovocytes tresjeunes ou tres ages; elle augmente considerablement durant la vitellogenesesecondaire.

Dans le premier cas, on constate une accumulation renforcee de proteinesdans la vesicule germinative et les nucleoles (fig. 4A). Le second cas est carac-terise par une abondante accumulation dans les centres actifs de vitellosynthesequi entourent la vesicule germinative, et autour des plaquettes vitellines (fig. 4B).I l y a done une correspondance parfaite entre les localisations indiquees par lescolorations cytochimiques et par l'autoradiographie.

L'analyse du marquage est surtout significative apres une chasse du precurseurdurant 24 h.

Chez les jeunes ovocytes, le marquage est alors presque uniquement nucleaire.Dans les ovocytes en cours de vitellogenese, le marquage des regions basophilesdiminue au profit des centres actifs de vitellogenese. C'est dans les ovocytesles plus ages que la distribution des proteines oflfre le plus d'interet en raison dela polarisation qu'elle presente. Leur repartition cytoplasmique s'eflfectue selonun gradient qui prefigure le gradient animal-vegetatif; d'autre part, les proteinesbasiques paraissent suivre la polarite de la vitellogenese tardive et la symetrisa-tion de l'ovocyte de la meme maniere que les proteines sulfhydrilees suivant lesobservations de Brachet (1947), rapportees par Dalcq (1941). 11 faut preciser qu'ace stade du developpement de l'ovocyte, la vesicule germinative s'est rapprocheedu pole animal. Elle a une position laterale par rapport a l'axe de symetriepassant par le centre de la calotte pigmentee (Fig. 4C, D). Les proteines basiques,en majeure partie cytoplasmiques, coiffent exterieurement le pole animal de la

Fig. 4. Incorporation de lysine-H3 dans les ovocytes de Tritunts helveticus.A. Incorporation pendant 18 h dans un ovocyte en cours de vitellogenese primaire.x600.

B. Idem, dans un ovocyte en cours de vitellogenese secondaire. x 480.C. D. Ovocyte age ( x 300) et sa vesicule germinative fortement grossie, apres unechasse du precurseur durant 24 h (x 3.000). On note la polarisation du marquagedu cote du pole animal (p.a.).E. Incorporation de precurseur dans le nucleole et la membrane nucleaire. x 3.000.F. Marquage cortical au cours des 7 premieres heures dans un ovocyte age.x 3.000.

138 S. SANCHEZ

vesicule germinative. Le regroupement des nucleoles, dans cette meme regionde la vesicule germinative, suggere qu'ils sont l'un des agents de transfert desproteines basiques, de la vesicule germinative dans le cytoplasme. En effet, unexamen optique a fort grossissement revele de nombreux grains d'argent pre-cipites sur la face externe de certains nucleoles peripheriques. De meme, lesnucleoles groupes au centre des vesicules germinatives sont porteurs de pro-teines basiques, comme ils etaient porteurs d'acide ribonucleique marque parl'acide orotique.

Par ailleurs, un lisere cortical de proteines basiques radioactives ceint l'oeuf,tandis que le centre n'est pas marque.

La lysine-H 3 apparait done comme un precurseur signaletique de la syntheseet du comportement de certaines proteines basiques presentes dans l'ovocytede Triton.

Ces syntheses proteiques sont correlatives de la vitellosynthese, puisque lesproteines marquees apparaissent d'une maniere importante, dans les zonescorticales au niveau du cortex basophile decrit par Brachet (1947) et les zonesperinucleaires de proliferation de plaquettes vitellines. Mais, anterieurement ala formation du vitellus, elles sont liees aux regions les plus basophiles contenantune forte proportion d'ARN. L'apparition des plaquettes vitellines primairesa la peripherie de l'ovocyte repousse vers le noyau en le reduisant, ce cytoplasmebasophile ainsi que le marquage qui lui est associe. Le marquage nucleaire suitune evolution parallele: il diminue progressivement au cours de la vitellogeneseprimaire. Une incorporation accrue du precurseur dans les vesicules germinativeset, surtout, dans les nucleoles, precede l'amorce de la vitellogenese secondaire.

II apparait done que les proteines basiques dont la synthese est associee aF elaboration du vitellus, sont liees aux constituants cytoplasmiques riches enacide ribonucleique qui composent les noyaux vitellins. La chasse du precurseurpendant 24 h suggere une premiere migration des proteines basiques cytoplas-miques dans les vesicules germinatives. Ce premier transfert serait suivi d'unsecond transfert nucleocytoplasmique. Au cours de cette derniere phase, lesimages des nucleoles et des extrusions nucleaires, donnees par les autoradio-graphies apres incorporation de la lysine-H 3 (fig. 4) et de l'acide orotique-H3(fig. 3) sont identiques. Ces relations tout au moins apparentes, entre ARN etproteines basiques, conferent a ces dernieres une importance sur le plan em-bryonnaire, qu'accentue leur localisation tres particuliere dans les ovocytesatteignant leur maturite.

(3) Cinetique d'incorporation de la phenylalanine-H3

Merriam (1966) a cite de nombreux travaux rapportant des observations surles deux types de syntheses proteiques qui interviennent au cours de l'ovogenesed'Amphibiens. Certaines proteines seraient synthetisees dans l'ovocyte;d'autres, de source extraovocytaire, seraient transferees dans l'ovocyte. Lemarquage intense de la membrane folliculaire (Ficq, 1962) parait en temoigner.

Nucleoles des ovocytes 139

Les proteines marquees par la phenylalanine-H 3 doivent se rapporter acette deuxieme categoric L'incorporation du precurseur est rapide. Le marquagede l'ovaire est aussitot general et uniforme, tant en ce qui concerne les noyauxque les cytoplasmes. Certes, l'incorporation du precurseur est accentuee dansles regions basophiles. Mais on ne note pas une accumulation aussi dense, dansdes regions privilegiees comme avec la lysine. D'autre part, les membranesfolliculaires presentent toujours une radioactivite remarquable.

On est d'autant plus frappe de voir, au milieu d'un marquage general etintense de l'ovocyte, les aires restreintes des centres actifs de vitellosynthesedemeurer depourvues de grains d'argent. Pourtant, c'est dans ces ilots devitellus naissant que la lysine-H3 s'incorpore, temoignant d'une synthese pro-teique quantitativement tres importante. La phenylalanine ne s'y incorpore pas,ofFrant un contraste frappant avec les autres regions cytoplasmiques.

Les differences extremement nettes qui se manifestent dans la repartition desdeux precurseurs, incitent a penser qu'il s'agit bien des syntheses de deux classesdistinctes de proteines qui s'opposent sur plusieurs points.

D'abord par leur origine vraisemblablement exogene pour les proteines richesen phenylalanine, endogene pour les autres. Ensuite, par les modalites de leursynthese qui s'effectue concurremment dans le noyau et le cytoplasme pour lespremieres alors que le transfert cyto-nucleoplasmique des secondes est probable.Mais le trait le plus caracteristique est sans doute la tres forte accumulation desproteines riches en lysine dans les noyaux vitellins qui sont depourvus de pro-teines de la seconde categoric

Et jamais nous n'avons observe une repartition privilegiee des proteinesmarquees par la phenylalanine, selon un gradient de polarite, ce qui renforce lecaractere singulier des proteines basiques a cet egard.

DISCUSSION

Ces observations permettent d'etablir le mode de formation, au cours dustade chromosome plumeux (et a partir de ceux-ci), de nucleoles d'un typedifferent des nucleoles d'origine. L'existence, dans les vesicules germinativesd'Amphibiens, de differents types nucleolaires a ete meconnue par la plupartdes auteurs. MacGregor (1965) admet la poursuite de l'activite de l'organisateurnucleolaire au stade diplotene, chez Thturus cristatus seulement, sans modifica-tion apparente de la structure des nucleoles nouvellement formes. Les observa-tions de Gall (1968) chez Xenopus suggerent egalement que la multiplicationnucleolaire correlative de l'apparition des organisateurs nucleolaires s'effectuedurant le stade pachytene seulement. Comment expliquer la presence dans lesovocytes murs de Xenopus des trois types de nucleoles que nous observonsegalement chez Triturus helveticus, a savoir, les nucleoles classiques decrits partousles auteurs (Brown&Ris, 1959; Miller, 1966; MacGregor, 1967; Lane, 1967),les micronucleoles et des nucleoles composites ou se trouvent associes les deux

140 S. SANCHEZ

types precedents. Van Gansen & Schram (1968), qui n'ont suivi qu'une partiedu processus de la formation des micronucleoles, n'envisagent qu'une filliationpossible avec les nucleoles d'origine. Chez Triturus helveticus, les micronucleolesderivent d'un materiel forme au contact des chromosomes diplotenes; leurtexture est identique a celle qui compose les boucles chromosomiques dont ilssont issus. Elle est faite de grains de 500 A qui rappellent les grains perichroma-tiniens decrits par Degekel & Govaerts (1968). La conversion de ces grains enparticules plus petites de l'ordre de 120 A, a l'interieur des micronucleoles,rapprochent egalement, ces organites des 'puffs' des chromosomes polytenesde Dipteres. Quoiqu'il en soit de ces analogies, ces nucleoles sont structurale-ment differents des nucleoles classiques definis par leur materiel fibrillaireassocie a une masse finement granulaire. C'est secondairement que les micro-nucleoles vont se greffer sur les nucleoles d'origine pour permettre des echangesde materiel avec ces derniers; il s'en detachent ensuite. Ils constituent ainsi, lesagents de transfert nucleocytoplasmiques du materiel chromosomique dontl'elaboration est particulierement active au cours de la prophase meiotiqueprecedant la maturation. La nature des echanges qui interviennent entre lesdeux types nucleolaires nous echappe. Elle peut etre partiellement expliquee parles observations concernant l'analyse du metabolisme des acides ribonucleiqueset des proteines basiques.

En effet, la majeure partie des syntheses de l'ARN nucleaire s'effectue aucontact des chromosomes plumeux et sans doute des boucles granuleuses deCallan. Ces observations conflrment les nombreuses donnees rapportees dans lalitterature de ces dernieres annees (Gall & Callan, 1962; lzawa, Allfrey &Mirsky, 1963a, b; Edstrom & Gall, 1963; Davidson, Allfrey & Mirsky, 1964).

Cet ARN est transports par des granulations nucleoplasmiques. 11 n'est pasexclu que les micronucleoles soient impliques, egalement, dans ce transfert, etceci en liaison avec les proteines basiques qui viennent s'accumuler dans lesvesicules germinatives. Les images autoradiographiques donnees par l'incorpora-tion des deux precurseurs utilises sont parfaitement superposables. Les nucleolesde type classique n'incorporent l'acide orotique-H3 que lorsqu'ils se trouvent aucontact des chromosomes. Les nucleoles peripheriques ne sont generalement pasmarques, ce qui incite a penser qu'il s'agit, pour la majeure partie, d'une accumu-lation d'ARN sur les nucleoles centraux plus que d'une synthese in situ. Etl'amalgame entre materiel nucleolaire normal et corps micronucleolaires ougranulations nucleoplasmiques pourraient justifier cette derniere hypothese.

Si la majeure partie de 1'ARN parait etre synthetisee au contact des chromo-somes, il est cependant indeniable, comme Ton montre MacGregor (1967) etLane (1967) qu'une fraction d'ARN est synthetisee dans les nucleoles centraux.Deux sortes d'ARN sont ainsi mis en evidence: un ARN chromosomique et unARN nucleolaire.

La formation des micronucleoles, le changement qui s'opere dans les struc-tures nucleolaires par le passage de formes spheriques a des formes en ruban ou

Nucleoles des ovocytes 141

protuberantes, joints a l'activite elaboratrice des chromosomes plumeux sontle signe d'un metabolisme nucleaire intense lie a la maturation de l'ovocyte.Ce metabolisme aux processus complexes, concerne particulierement la forma-tion d'un stock d'ARN destine a transmettre des informations d'origine mater-nelle au cours des premiers stades embryonnaires (Brown & Ris, 1959; Davidsonet al. 1964).

La participation des proteines basiques aux mecanismes de la transmissiongenetique est suggeree par le comportement particulier des proteines fortementmarquees par la lysine-H3. Dans l'ovocyte de Triton, ces proteines se repartis-sent dans le cytoplasme selon un gradient de polarite bien net surtout dans laderniere phase de maturation cytoplasmique. Dans le noyau, elles sont associeesaux nucleoles et aux nucleoplasmes riches en ARN et sont distinctes des histoneschromosomiques synthetisees, comme l'ADN, au cours de la phase post-ovogoniale; dans les stades plus jeunes, elles sont dans le cytoplasme et le noyau,localisees, preferentiellement, aux regions les plus basophiles. Shepherd &Nolan (1968) ont souligne le fait que les proteines basiques seraient liees auxstructures qui interviennent dans les mecanismes du transfert de 1'informationgenetique, dans les cellules de l'ovaire du Hamster, ce qui Concorde avec nospropres observations. 11 faudrait, cependant, completer ces observations parune analyse autoradiographique en microscopie electronique pour obtenir unelocalisation precise des traceurs sur les ultrastructures.

RESUME

Nos observations decoulent d'examens d'autoradiogrammes apres incorpora-tion d'acide orotique-H3 et de lysine-H3, dans l'ovocyte de Triturus helveticus.II y a ete joint des colorations cytochimiques au bleu de bromophenol-acidepicrique, et une etude ultrastructurale des vesicules germinatives.

Ces deux dernieres techniques revelent, avec une particuliere nettete, laformation de 'micronucleoles' a partir des 'lampbrush chromosomes'. L'ultra-structure des micronucleoles est differente de celle des nucleoles d'origine. 11ssont constitues de particules de 500 A qui se transforment lorsqu'elles s'agregentles unes aux autres.

La phase 'lampbrush chromosomes' se caracterise par une activite biosyn-thetique intense, dont temoignent l'incorporation de l'acide orotique et laformation des micronucleoles.

La lysine-H3 revele une synthese proteique, qui prend un caractere particulierpar la disposition qu'affecte ces proteines basiques dans l'ovocyte age, selon ungradient rappelant le gradient animal-vegetatif.

142 S. SANCHEZ

SUMMARY

The formation and role of nucleoli in the oocytes 0/Triturus helveticus:an autoradiographic and ultrastructural study

The data concern autoradiographic examination of the incorporation of[3H]orotic acid and [3H]lysine into oocytes of Triturus helveticus.

Cytochemical staining with bromophenol blue-picric acid, and ultrastructuralstudies have been done.

These techniques clearly show the formation of micronucleoli produced bythe lampbrush chromosomes. The ultrastructure of the micronucleoli differsfrom that of the original nucleoli.

The incorporation of [3H]orotic acid in the chromosomes and the formation ofmicronucleoli provide a morphological basis for the biochemical events takingplace during the lampbrush chromosome phase.

The incorporation of [3H]lysine follows a particular distribution in the olderoocytes, reflecting the gradient between animal and vegetative poles.

Mes remerciements s'adressent a Monsieur le Professeur Brachet pour les critiques etsuggestions qu'il a formulees au cours de la redaction de ce texte.

TRAVAUX CITES

BLOCH, D. P. & HEW, H. Y. C. (1950). Schedule of spermatogenesis in the Pulmonate Snail,Helix aspersa with special reference to histone transition. / . biophys. biochem. Cytol. 1,515-31.

BRACHET, J. (1947). Localisation de l'acide ribonucleique et des proteines dans l'ovaire degrenouille normal et centrifuge. Experientia 3, 329.

BROWN, C. A. & Ris, H. (1959). Amphibian oocyte nucleoli. / . Morph. 104, 377-414.DALCQ, A. (1941). UCEufet son dynamisme organisateur (ed. Albin Michel), pp. 1-582. Paris.DAVIDSON, E. H., ALLFREY, V. G. & MIRSKY, A. E. (1964). On the RNA synthesized during

the lampbrush phase of Amphibian oogenesis. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A. 52, 501—8.DEGEKEL, D. & GOVAERTS, A. (1968). Structure fine du materiel nucleaire et des chromosomes.

/ . Microscopie 7, 28 a.EDSTROM, E. & GALL, J. G. (1963). The composition of ribonucleic acid in lampbrush

chromosomes, nucleoli, nuclear sap, and cytoplasm of Triturus oocyte. /. Cell Biol. 19,279-84.

FICQ, A. (1962). Le metabolisme de l'oogenese etudie par autoradiographic Bull. Acad. r.Belg. Cl. Sci. 48, 335-43.

GALL, J. G. (1968). Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during Amphibianoogenesis. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A., 60, 553-60.

GALL, J. G. & CALLAN, H. G. (1962). H3-uridine incorporation in lampbrush chromosomes.Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A. 48, 562-70.

GEUSKENS, M. (1965). Etude par autoradiographie et cytophotometrie du metabolisme desproteines basiques au cours de l'oogenese et de l'ovocyte d'Asterie. Bull. Acad. r. Belg.Cl. Sci. 51, 116-23.

HORN, E. (1962). Extranuclear histone in the Amphibian oocyte. Biochemistry, N.Y. 48,257-265.

IZAWA, M., ALLFREY, V. G. & MIRSKY, A. E. (1963 a). The relationship between RNA syn-thesis and loop structure in lampbrush chromosomes. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A. 49,544-51.

Nucleoles des ovocytes 143IZAWA, M., ALLFREY, V. G. & MIRSKY, A. E. (1963 b). Composition of the nucleus and chromo-

somes in the lampbrush stage of the newt oocyte. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A., 50, 811-17.LANE, N. J. (1967). Spheroidal and ring nucleoli in Amphibian oocyte. J. Cell Biol. 35,

421-34.MACGREGOR, H. C. (1965). The role of lampbrush chromosomes in the formation of nucleoli

in Amphibian oocytes. Quart. J. microsc. Sci. 106, 215-28.MACGREGOR, H. C. (1967). Pattern of incorporation of (3H) uridine into RNA of Amphibian

oocyte nucleoli. / . Cell Sci. 2, 145-50.MERRIAM, R. W. (1966). Studies on the ultrastructure and metabolism of nucleoli in Am-

phibian oocyte. Vtli Int. Congr. Electron Microsc. vol. n.MILLER, O. L. (1962). Studies on the ultrastructure and metabolism of nucleoli in Amphibian

oocytes. Fifth int. Congress for electron microscopy, vol. 2, NN. 8MILLER, O. L. (1964). Extrachromosomal nuclear DNA in Amphibian oocytes. / . Cell Biol.

23, 60.MILLER, O. L. (1966). Structure and composition of peripheral nucleoli in Salamander

oocytes. Natn. Cancer Inst. Monogr. 23, 53-66.SHEPHERD, G. R. & NOLAN, B. J. (1968). The intracellular distribution of basic proteins in

the Chinese Hamster ovary cell. Expl Cell Res. 49, 238-50.VAN GANSEN, P. & SCHRAM, A. (1968). Ultrastructure et cytochimie ultrastructurale de la

vesicule germinative et du cytoplasme perinucleaire de l'ovocyte tnur de Xenopus laevis.J. Embryol. exp. Morph. 20, 375-90.

WITTECK, M. (1952). La vitellogenese chez les Amphibiens. Archs Biol., Paris 63, 133-97.

{Manuscrit regu le 24 decembre 1968)