FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

Fundamento: determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar (degradar) un hidrato de carbono específico incorporado a un medio base, produciendo ácido, o ácido con gas visible.

Se emplea caldo nutritivo (medio base) adicionado del hidrato de carbono a probar. Cuando el indicador utilizado es azul de bromo timol, se considera:

Producción de gas en la campana de Durham: (+) gas: El desalojo de aproximadamente 1/3 de líquido en la campana de Durham basta para registrar la producción de gas. Microorganismo aerogénico. (-) gas: el microorganismo es anaerogénico (no se observan burbujas de gas).

HUGH-LEIFSON

Fundamento: permite determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un microorganismo (generalmente se utiliza glucosa como sustrato)

Algunas bacterias pueden:

-oxidarla completamente convirténdola en CO2 y H2O (generalmente aerobios

estrictos),

-fermentar anaeróbicamente la glucosa (anaerobios obligados),

-metabolizarla por ambas vías (anaerobios facultativos), o

-ser incapaces de utilizar la glucosa.

Oxidación Fermentación Ni fermentación ni oxidación Aerobio Anaerobio facultativo Anaerobio Obligado

También se puede determinar: -producción de gas -movilidad

Indicador: Azul de bromo timol

PRUEBA AGAR TRIPLE AZÚCAR HIERRO (TRIPLE SUGAR IRON; TSI)

Fundamento: el principio de esta prueba es determinar la capacidad de un microorganismo para utilizar 1 a 3 hidratos de carbono, generar gas y, producir H2S. Las fermentaciones de azúcares son características de los grupos, géneros o especies bacterianas, sobre todo entre la familia Enterobacteriaceae, ayudan a determinar género.

•Si utiliza solamente glucosa: •pico de flauta (superficie): reacción alcalina (color rojo)

(metabolismo oxidativo y uso de NH3)

•profundidad: reacción ácida (amarillo) (metabolismo fermentativo)

•Fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa: •pico de flauta: amarillo •profundidad: amarillo.

•No fermenta glucosa, sacarosa ni lactosa (para organismos no entéricos):

•superficie alcalina: color rojo •profundidad: color rojo.

Hay precipitación del FeS de color

negro

Si el microorganismo es aerogénico: hay producción de

CO2 e H2

Indicador: Rojo de fenol

PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER (VP) Y ROJO DE METILO (RM)

Se utiliza el medio de Clark y Lubs que es una solución buffer de peptona glucosada.

VOGES-PROSKAUER (VP) Fundamento: algunos microorganismos producen acetil metil carbinol (acetoína), intermediario en la producción de 2,3-butanodiol a partir de la fermentación de glucosa por vía butilenglicólica.

acetoína y 2,3-butanodiol diacetilo Oxidados O2, álcali

Guanidina (peptona) alfa-naftol creatinina

(+): color rojizo oscuro: acetoína. (-): color amarillo.

ROJO DE METILO (RM) Fundamento: capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa (vía ácido-mixta) y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. En Clark y Lubs se agregan 2-3 gotas de la solución de rojo de metilo.

(+): color rojo definido (pH 4.4) (-): color amarillo (pH 6)

Fundamento: esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Este medio contiene azul de bromotimol como indicador de pH.

citrato oxalacetato + 2 formato oxalacetato piruvato + CO2

PRUEBA DE UTILIZACIÓN DEL CITRATO

(+): crecimiento con viraje al azul intenso en el pico de flauta (a veces todo el medio). (-): crecimiento ni cambio de color del medio (permanece verde).

PRUEBAS A REALIZAR EN MEDIO SIM (SULFURO DE HIDRÓGENO, INDOL, MOVILIDAD)

SH2 Fundamento: determinar si un microorganismo es capaz de liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática sobre los aminoácidos que contienen azufre (metionina, cistina, y cisteína).Se emplea un medio con peptona, sulfato de hierro y amonio.

(+):coloración negro-parduzca en la línea de punción (con difusión cuando el microorganismo es móvil) (-): no hay cambio de color

INDOL Fundamento: determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el triptofano produciendo indol. Para la realización de la prueba se utilizan medios a base de peptona, dentro de cuyos aminoácidos se encuentra el triptófano.

(+): anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohólica

(-): toma el color del reactivo (amarillo)

S2O3= red H2S

H2S + Fe3+ SFe (negro)

Peptonas triptofanasas Indol

(triptofano) Indol + p-dimetilaminobenzaldehído (Rvo de Kovacs)

MOVILIDAD Fundamento: muchos microorganismos poseen flagelos, que son responsables de su movilidad, la que se puede poner de manifiesto por observación en fresco, o bien, sembrando en agar blando y observando el crecimiento.

(+):crecimiento por debajo de la línea de punción. En caso de microorganismos muy móviles el medio queda

totalmente turbio (-): el crecimiento se circunscribe a la línea de punción

Fundamento: determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitritos, amoníaco o nitrógeno libre. Esta reducción tiene lugar generalmente en condiciones anaerobias ya que la enzima que interviene, la nitratasa, es sensible al oxígeno. En estas condiciones el microorganismo obtiene el oxígeno del nitrato, siendo este proceso de oxidación una “respiración anaerobia”

REDUCCIÓN DE NITRATO

Medio: Caldo nutritivo + KNO3

Campanita de Durham

Nitrógeno: se evidencia por la presencia de gas en

la campanita.

Nitrito: reactivo de Islova van Islovay (ácido sulfanílico y

alfa-naftilamina) reacciona con el grupo nitrito

compuesto diazoico para-

sulfobenceno-azo-alfa-naftilamina

(+): rosado o rojo intenso

Amoníaco: reactivo de Nessler a la alícuota restante del cultivo.

(+): color rojo ladrillo

(H2N2)C=O + H2O ureasa CO2 + 2NH3

PRUEBA DE FENILALANINA

desaminación oxidativa

Fundamento:

FENILALANINA FENILPIRUVICO

(+): produce un color verde por formación de compuestos coloreados debido a la presencia de ácido fenilpirúvico. (-): no se observa cambio de color.

+ FeCl3 al 10%

PRUEBA DE LA UREASA

Fundamento: permite determinar la capacidad de un microorganismo para hidrolizar la urea, por acción de la enzima ureasa. El pH óptimo para la actividad de la enzima es 7.

(+): viraje del indicador del amarillo (rojo fenol) al rojo violáceo o púrpura. (-): amarillo pálido

2 H2O2 catalasa 2 H2O + O2

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios

Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

Citocromo H2O2 o H2O citocromooxidasa

PRUEBA OXIDASA

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-

p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs).

PRUEBA DE LA CATALASA

La actividad de la enzima se pone de manifiesto adicionando unas gotas de agua oxigenada sobre una colonia en medio sólido o un cultivo en caldo. (+): desprendimiento de gas con formación de burbujas.

(-): no se observan burbujas.

Fundamento: la mayoría de los microorganismos tienen la propiedad de producir la enzima catalasa, la que desdobla el agua oxigenada liberando O2.

Lipasa

triglicéridos glicerol + ác. grasos libres opacidad con brillo iridiscente sobre las colonias

Lecitinasa

lecitina diglicérido + fosforilcolina opacidad visible alrededor de la colonia

A diferencia de lecitinasa, la lipasa no es difusible y la reacción ocurre sólo en la vecindad de las colonias.

PRUEBA DEL FACTOR CAMP-REVERSO

Pone en evidencia el efecto sinérgico entre las hemolisinas de C. perfringens y S. agalactiae (group B).

En un agar sangre sembrar una cepa de Streptococcus agalactiae como una estría recta central. Perpendicularmente, sembrar una estría recta de C. perfringens. Incubar en anaerobiosis.

AGAR YEMA DE HUEVO (EYA)

Un resultado positivo se observa por una zona de

hemólisis en punta de flecha en la unión de las

2 estrías.

Lecitinasa

LIPASA Y LECITINASA: DÓNDE CORTAN?

TG glicerol + ác. grasos libres ( producto no difusible)

Lecitina diglicérido + fosforilcolina (difusible)

Prueba de lipasa

Agar yema de huevo (EYA)

Positivo: (Halo iridiscente o perlado alrededor de las estrías)

Negativo

Soria J. M.Trab. Final Biol. Mol. 2013

Reacción de NAGLER = neutralización de lecitinasa

Prueba de lecitinasa

Lecitinasa = fosfolipasa C = alfa toxina (disuelve lípidos de membrana)

Agar yema de huevo (EYA)

Prueba de

lecitinasa

en agar EYA

Clostridium perfringens

Microorganismo no productor de lecitinasa

Reacción de NAGLER positiva

DIGESTION DE LA CARNE

Fundamento C. perfringens sintetiza proteasas, colagenasas, hialuronidasas y otras enzimas que pueden producir la degradación del tejido muscular. Esto se pone en evidencia cuando se cultiva en medio carne cocida. (+): Partículas de carne desintegradas o en forma de polvo. Se observa producción de gas evidente por elevación del émbolo de vaselina.

Fundamento Algunos microorganismos anaerobios se caracterizan por producir la enzima amilasa que hidroliza almidón. Se emplea Agar infusión de corazón + Almidón soluble. Para saber si el almidón ha sido hidrolizado o no, se utiliza el reactivo iodo/ioduro (lugol) que en presencia de almidón forma un complejo de color oscuro (azul o marrón).

(+): una zona incolora alrededor del desarrollo indica hidrólisis del almidón (-): una zona oscura a púrpura, indica que no hubo hidrólisis

HIDRÓLISIS ALMIDON

DIGESTIÓN DE LA CARNE

-Medio carne cocida -VasPar -Incubación 21 días -Resultado positivo: -pulverización de la carne -producción de gas

SISTEMA API DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram -. Básicamente consta de 21 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta.

A partir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensión en 5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de

agua estéril.

Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada pocillo tiene

un tubo y una cúpula, parte aerobia), de todos los

pocillos.

Poner la tira en su propia cámara húmeda de

incubación.

Incubar a 37 °C durante 18-24 h.

La lectura de los resultados se lleva a cabo por

comparación de los colores de cada pocillo con los de

las tablas de lectura, y anotando el resultado como

positivo o negativo.

Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata, para realizar esta operación hay programas informáticos.

Son un conjunto de reacciones empleadas comúnmente en la identificación de miembros de la familia enterobacteriaceae.

I = Prueba del Indol; M = Prueba de Rojo de Metilo V = Prueba de Voges-Proskauer C = Prueba de utilización de Citrato

El principal objetivo del Manual es asistir a la identificación de bacterias e indicar las relaciones que existen entre los distintos grupos.

Publicado en 1982, corresponde a la 9° edición y consta de 4 subvolúmenes. Estos son: Gram negativos de importancia general, médica o industrial Gram positivos (excluyendo actinomycetes) Archaebacteria, cyanobacteria y el resto de gram negativos Actinomycetes Las claves para ingresar correctamente al Manual Bergey son: •Tipo de metabolismo •Forma y disposición celular •Coloración de Gram

Esto conducirá a la acertada elección de 1 de los 4 subvolúmenes.

La sigla IMViC incluye cuatro pruebas:

E. coli (++--)

MANUAL BERGEY