FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE.MICROBIOLOGIA SI DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL ESCHERICHIOZELOR I AL DIZENTERIEI BACTERIENE

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAEPeste 50 de genuri cu peste 250 speciiHabitat: intestinul gros al omului, animalelor. Pot fi intalnite pe sol, plante, in apa, etc Martori de contaminare fecal a mediuluiMajoritatea fac parte din microflora normal (comensal) intestinal

CLASIFICAREAN FUNCIE DE PATOGENITATE:Enterobacterii patogene: genurile Shigella, Salmonella, Yersinia pestis, Klebsiella pneumoniae, unele variante ale speciei Escherichia coli;Enterobacterii condiionat patogene: genurile Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Edwardsiella, etc.

TESTE-CHEIE ALE FAMILIEI ENTEROBACTERIACEAE Bacterii (bastonae) gramnegativeNesporogeneMobile-peritriche sau imobileFacultativ-anaerobeFermenteaz glucoza pn la acid (A) sau acid i gaz (AG)Catalazo-pozitiveOxidazo-negativeReduc nitraii n nitrii

TESTE PRIMARE (identificarea genurilor)Utilizarea citratului de Na (mediul Simmons)Utilizarea malonatului de NaHidroliza ureei (testul Preus)Decarboxilarea lizinei (LDC)Dezaminarea fenilalaninei (FAD)Producere de H2S n mediul multitest (ex.: Kligler)Fermentarea glucozei pn la acizi (testul MR)Fermentarea glucozei pn la acetoin (testul VP)Mobilitatea (n geloz semilichid)

TESTE SECUNDARE (identificarea speciilor/variantelor)Teste biochimice (fermentarea glucidelor, decarboxilarea aminoacizilor (arginin, ornitin), producerea indolului, etc)Fagoidentificarea i lizotipiaColicinogenotipiaSeroidentificarea Antibiograma

CARACTERE MORFOBIOLOGICECaractere morfologice: bastonae G-, 1 - 6 m x 0,3 - 1 m, mobile peritriche (Shigella, Klebsiella, Yersinia pestis imobile), nesporogene, formeaz microcapsule (Klebsiella capsulat), posed fimbrii.

Caractere de cultur: Anaerobe facultativTemperatura optim 37 grade C (limite 18 45 grade) Nepretenioase nutritivColonii S, apar dup 18-24 h de incubare, 2 - 3 mm (dup repicri pot apare colonii R), Klebsiella colonii M (mucoide), Proteus invadeaz suprafaa mediului

MEDII DE CULTURDe transport: glicerin 30%, soluie salin 3%, soluie tampon-fosfatDe mbogire a bacteriilor patogene: Kauffmann, Muller, bulion selenit, etcDiferenial-diagnostice:De izolare a culturii pure- ENDO, LEVIN, PLOSKIREVComponena: baz nutritiv, lactoz, indicatorColoniile L+ : colorate; Coloniile L- : incolore (frecvent flora patogen)- Mediul Wilson-Blair cu sulfit de Bi (Salmonella reduce sulfitul n sulfur de Bi colonii negre pe mediul verde)

II. De acumulare i identificare preliminar (medii multitest)Russel, Kligler (glucoz, lactoz, sruri de Fe, indicator)Olkeniki (glucoz, lactoz, zaharoz, uree, sruri de Fe, indicator)III. De identificare final (medii cu citrat, malonat, irul Hiss, medii cu aminoacizi, gelatina, etc)

CARACTERE ANTIGENICEAg O, de perete, LPZ, termostabil i rezistent la alcool, sensibil la formol, specificitate de gen, specie, grup. Stimuleaza producerea Ig M.Ag H, flagelar, proteic, termolabil i inactivat de alcool, rezistent la formol, specificitate de tip (variant). Stimuleaza producerea Ig G. Ag K, superficial, capsular, termovariabil, specificitate de specie, tip. Mascheaz Ag O, inaglutinabilitate cu seruri anti-O. Variante L, A, B la E.coli, Vi la Salmonella i CitrobacterAg F, fimbrial, termolabil, nespecific ECA (Enterobacterial Common Antigen) - antigen polizaharidic din peretele celular, comun fam. Enterobacteriaceae (interes taxonomic) Ag Kunin

Genul Escherichia. Diagnosticul de laborator al escherichiozelorGenul Escherichia Spp.: E.coli, E.blattae, E.fergusonii, E.vulneris, E.hermaniiE.coli descoperita in 1885 de Teodor Escherich, pediatru si bacteriologHabitat: intestinul gros al omului i animalelor (80% din flora aerob intestinal), 107-109 bacterii/gram fecale. Contamineaz solul i apele de suprafa. Prezena E.coli - indicator de contaminare fecal

Rolul E.coli n fiziologia uman1. Manifest activitate antagonist fa de alte bacterii, inclusiv cele patogene (probiotic tulpina Nissle 1917 - Mutaflor)2. Stimuleaz dezvoltarea esutului limfoid prin intermediul Ag sale3. Particip la procesele de digestie, inclusiv n metabolismul colesterolului i acizilor biliari4. Asigur organismul cu vitamine, sintetiznd vitamine B, K, acid nicotinic, acid folic, etc.Rolul E.coli in biotehnologie, microbiologie industriala, model in studii microbiologice

CARACTERE MORFOBIOLOGICEE.coli enterobacterie tipic, mobil, lactoza+ (colonii colorate pe medii DD de izolare), fermenteaz glucoza cu formare de AG. Teste primare: MR +, mobilitate +, LDC+, celelalte teste sunt negativeStructura antigenicAg O 181 tipuri (O1, O2, O3,......O181)Ag H 60 tipuri (H1, H2, etc)Ag K 100 tipuriDin combinaii rezult serovariante: ex.: E. coli O55:H2:K1

FACTORI DE PATOGENITATECapsula (antifagocitar, Ag K1 camuflaj imunologic datorit epitopilor comuni cu polisialozil-glicopeptide cerebrale la nou-nscui)Proteine din ME i LPZ (anti-complement, protecie de factorii bactericizi ai sngelui, adeziune, invazie)Adezine: pili tipul I, se leaga de manoza de pe suprafata cel epiteliale, pili CFA, pili P (adeziune la uroepiteliu si hematii)Toxine: endotoxina, enterotoxine termostabile - ST i termolabile LT (codificate plasmidic), citotoxine Shiga-like toxine (SLT-1, SLT-2), codificate bacteriofagic -hemolizina (citolizina care formeaza pori in membrana diferitor celule)Siderofori (sisteme de captare a Fe)

ROLUL E. COLI N PATOLOGIA UMANFENOTIPURI DIAREIGENETulpini enteropatogene: EPEC (O26, O55, O111, O125, O142, etc). Responsabile de gastro-enterite infantile (infecii salmoneliforme).Aderarea EPEC la mucoasa intestinului subire prin intermediul pililor Bfp (bundle forming pili) si distrugerea microvilozitatilor (leziunea atasare si stergere)Insertia sistemului de secretie tipul III seringa in peretele enterocitului si injectarea unor proteine in citoplasma celulei, inclusiv a receptorilor pentru intimina.Atasarea stransa a EPEC printr-o protein din membrana extern (intimina)

Alte proteine secretate determina rearanjarea actinei in celule, cu formarea unui piedestal pentru bacterie, distrugerea mitocondriilor si induc apoptoza enterocitelor.Rezulta perturbarea proceselor de secretie si absorbtie intestinala (diaree, voma). Unele tulpini produc SLT si sunt moderat invazive.

Tulpini enteroinvazive: EIEC (O28, O124, O143, etc). Responsabile de sindrom dizenteric (infectie dizenteriforma) cu invazia mucoasei colonului, penetrare intracelular, ulceraii. Factori de patogenitate: adezine, invazine.

Tulpini enterotoxigene: ETEC (O6, O8, O20, O25, O115, etc). Infecteaza doar oamenii. Responsabile de diareea cltorului, sindrom holeriform. Adeziunea la enterocitele intestinului subire este asigurat de pili (CFA colonization factor antigen sau CSF coli surface factors). Elaboreaz toxine enterotoxine LT i/sau ST (codificate plasmidic).Mecanismul: activeaz adenilat- respectiv guanilat ciclaza enterocitelor cu acumulare de cAMP sau cGMP intracelular, provocnd o secreie sporit a ionilor de Cl- i inhibiia absorbiei ionilor de Na+, antrennd astfel o pierdere hidric important.

Tulpini enterohemoragice: EHEC (O157:H7; O26, O111, O145). Responsabile de colite hemoragice cu sindrom uremic-hemolitic (anemie hemolitic + trombocitopenie + insuficien renal)Sursa - animale colonizate cu tulpini EHEC. Doza infectanta -

Tulpini enteroagregative: EAggEC (O104:H4, O111:H12). Cu ajutorul unor adezine (fimbrii) adera la suprafata intestinului subtire. Urmeaza stimularea secretiei mucusului, cu formarea unui biofilm, ce protejeaza bacteriile de antibiotice si fagocitoza. EAggEC produc 2 toxine toxina enteroagregativa termostabila si toxina codificata plasmidic. Ambele induc secretia lichidelor. Provoac diaree persistent (peste 14 zile) la copii si adulti cu imunosupresie (HIV/SIDA). Ader agregativ la suprafaa culturilor de celule.

Tulpini enteroadezive: EAEC. Ader difuz la celulele intestinale i culturile de celule. Provoac sindroame diareice.

FENOTIPURI UROPATOGENE (O1, O2, O4, O6) UPEC Posed afinitate pentru mucoasa uro-genital (fimbrii tipul 1 sau P (pyelonephritis-associated pili) , Ag O i K specifice, hemolizine, etc ). Responsabile pentru apr. 90% din ITU (inf. tractului urinar)

FENOTIPURI CE CAUZEAZA MENINGITE NEONATALE (tulpini K1)

Alte forme clinice provocate de E.coli:Sepsis, oc endotoxinicInfecii ale plgilor (frecvent de origine nosocomial)Colecistite, peritonite, salpingite, etc.Toxiinfecii alimentare

DIAGNOSTIC DE LABORATORPrelevate n funcie de forma clinic: materii fecale, urin, snge, LCR, puroi, etc

Metode de diagnosticExamenul microscopic de orientare (frotiu Gram n infecii extra-intestinale, RIF)Examenul bacteriologic (de baz, cantitativ) detalii in Ghid !!!!!Examenul serologic (retrospectiv, de confirmare) - RA cu autotulpini (titru diagnostic 1:200)

Tratamentul escherichiozelor

Antibiotice peniciline semisintetice, cefalosporine, aminoglicozide, carbepeneme, ciprofloxacina, trimetoprim, nitrofurane, aztreonam. N.B. Antibiograma obligatorie, rezistenta multipla!(ESBL rezist la peniciline si cefalosporine, NDM-1 rez si la carbapeneme i/v)Eubiotice (colibacterin, lactobacterin, bifidumbacterin, bificol, etc)Bacteriofagi

Profilaxia escherichiozelor - nespecific

GENUL SHIGELLA. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEIShigelele strict umane. Cauzeaz infecii intestinale - igeloze, cea mai grav formdizenteria bacterian.Clasificarea genului Shigella (biochimic i antigenic):A Shigella dysenteriae (12 s/v, 12 b/v) Manitol -B Shigella flexneri (6 s/v, 14 ss/v, 23 b/v)C Shigella boydii (23 s/v)D Shigella sonnei (1 s/v, 7 b/v)Serogrupele B, C, D manitol +Descoperite in 1898 de Kiyoshi Shiga

CARACTERE MORFOBIOLOGICE Enterobacteriaceea tipice, imobile, lactozo-negative (colonii incolore pe medii DD)Teste primare - scindeaz glucoza pana la acizi (testul MR+), celelalte teste primare sunt negative.

FACTORI DE PATOGENITATE:Factori de adeziune la mucoasa colonului (fimbrii, LPZ)Sistem de secretie tipul III (seringa)Microcapsula (antifagocitar)Factori de penetrare i multiplicare intracelularToxine:Toxina Shiga, de origine cromosomal. Inhiba sinteza proteinelor in celula gazda. Manifesta activitate neurotoxic, enterotoxic, citotoxic elaborat de S.dysenteriae 1. Citotoxine (Shiga-like toxine (SLT), verotoxine), codificate de bacteriofagi. Efect similar cu cel al toxinei Shiga.Endotoxina

Structura antigenic: Ag O i K cu specificitate de gen, specie, subspecie, variant

Rezistena n mediul extern:S.dysenteriae - foarte sensibil (1-2 ore)S.flexneri persist 1-3 sptmni n ap, 2 luni n lactateS.sonnei persist i se multiplic n lactate

PATOGENEZA DIZENTERIEI BACTERIENESursa de infecie: bolnav, reconvalescent, purttorTransmiterea fecal-oral: Contact direct (mini murdare)Alimentar (alimente, ap)

Doza infectant: 10-102 bacterii

Bacteriile afecteaza intestinul gros. Celulele epiteliale normale sunt rezistente la infectia cu Shigella spp.

In faza initiala Shigella este captata de celulele M din placile Peyer. Dupa transcitoza epiteliului intestinal bacteria este eliberata intr-o vacuola care ulterior este captata de macrofage. Shigella evita distrugerea prin initierea rapida a apoptozei macrofagelor, determinand eliminarea citokinelor proinflamatoare (IL1, IL18). Shigella eliberata din macrofage invadeaza celulele epiteliale prin membrana bazo-laterala (prin macropinocitoz dirijat, sistem de secretie III). Shigella produce liza membranei vacuolei si se multiplica in citoplasma.

Bacteriile se propag intra- i intercelular graie polimerizrii actinei la un pol al celulei (caracter determinat plasmidic). Citokinele eliberate de macrofage si celulele epiteliale determina o recrutare masiva a PMN un locul infectiei, ceea ce duce distrugerea integritatii epiteliului si facilita invazia directa a submusoasei, evitand celulele M. Astfel, moartea macrofagelor, distrugerea stratului epitelial, influxul masiv al PMN determina inflamaia fibrinoas intens a colonului, micro-abcese i ulceraii, cu apariia mucusului, puroiului i sngelui n materiile fecale.

Perioada de incubaie 2 - 4 zile

Semne clinice febr, dureri abdominale, tenesme (spasme rectale), scaune lichide mucopurulente-sanguinolente frecvente. Vindecarea n 2-5 zile (clinic, apoi microbiologic).Forme cronice sau portaj sunt posibile.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEIPrelevate: probe de scaun (elementele muco-sangvinolente, purulente), apa, alimente, lavaje de pe suprafeeMetode de diagnosticExamenul microscopic RIFExamenul bacteriologicI. Izolarea culturii pure pe medii DD (Endo, Levin, Ploskirev) sau mbogirea igelelor n bulion selenit

II. Coloniile L- sunt repicate pe mediile Olkeniki, Kligler pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar(lactoza/zaharoza -, glucoza A, ureea -, H2S -)III. Identificarea definitiv a culturii pure - Caractere morfotinctorialeCaractere de cultur Caractere biochimice (teste primare, secundare)Caractere antigenice (seroidentificarea prin RA pe lam cu seruri imune anti-Shigella poli- i monovalente)FagoidentificareaVirulena (testul Sereny la cobai)AntibiogramaIV. Analiza rezultatelor i formularea rspunsului

3. Diagnosticul serologic (din a 5-7 zi de boal)- RA, RHAI (aduli 1:400 (S.flexneri), 1:200 (S.sonnei) copii 1:100 coproanticorpi (Ig A 1:80) ELISARIFIImunitate: specific de tip, 1-2 ani, umoral (IgA)Profilaxie: vaccinuri ribosomale, inactivate, atenuate (imunitate de scurt durat) Tratament: antibiotice (trimetoprim, sulfamide, tetraciclin, ampicilina, etc), eubiotice, bacteriofagi, vaccin inactivat (dizenteria cronic)

********************************************