Beatriz Larreina Manzanares

Jerome Bruno Grimplet y María Carmen Tenorio Rodríguez

Facultad de Ciencia y Tecnología

Grado en Enología

2015-2016

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Expresión del gen Uclacianina en diferentes variedadesde vid

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2016

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Expresión del gen Uclacianina en diferentes variedades de vid , trabajo fin degrado

de Beatriz Larreina Manzanares, dirigido por Jerome Bruno Grimplet y María CarmenTenorio Rodríguez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia

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GRADO EN ENOLOGÍA Trabajo de Fin de Grado | Beatriz Larreina Manzanares

Tutores: Jerome Grimplet Carmen Tenorio

EXPRESIÓN DEL GEN UCLACIANINA EN DIFERENTES

VARIEDADES DE VID

1

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido posible gracias al Grupo de Investigacion de Genetica y Genomica

de la Vid (Vitigen) del INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA VID Y EL VINO, al Dr. Jerome

Grimplet por guiarme, corregirme y formarme en este trabajo.

A la Dra. Carmen Tenorio por su papel como tutora y compañera en la Universidad de

La Rioja.

Quiero mostrar mi especial agradecimiento a Carol y Cris por su ayuda y la constante

aportación a mi quehacer diario en estos meses. Y por supuesto, a Javier Tello, por el

apoyo, motivación y amistad recibida estando a 300 km de distancia, GRACIAS.

2

RESUMEN

La compacidad del racimo es un rasgo fundamental de la vid (Vitis vinifera L.) que

puede afectar tanto a la calidad como al rendimiento. Los racimos compactos maduran

menos uniformemente, reduciendo la calidad y complicando la vendimia. Además son

más susceptibles a plagas y enfermedades, principalmente infecciones por hongos.

Por todo esto, hay un gran interés en el sector por conocer las bases genéticas y

fisiológicas que afectan a este carácter. En un proyecto anterior el grupo de genética y

genómica de la vid del ICVV estableció que, en un marco multivarietal, los caracteres

más determinantes de ese carácter son la longitud de los ejes principales del racimo y el

número total de bayas. En algunos genes candidatos se detectaron asociaciones

prometedoras entre polimorfismos concretos y la longitud de los ejes o el tamaño de

baya. Entre ellos, se destacó la asociación entre un polimorfismo detectado en el

promotor de un gen que codifica para una proteína tipo uclacianina (VviUCC1) y la

longitud de la primera ramificación.

Así, se analizó la expresión génica de la uclacianina en variedades con diferentes

genotipos (20 variedades en total de 3 genotipos, T:T, C:C, C:T), para la validación de la

asociación entre el polimorfismo y la expresión de gen.

A pesar de observarse que algunas de las variedades con el genotipo T:T presentan

mayores valores de expresión de la uclacianina, no se observó un resultado significativo

para el ANOVA, lo que indica que no hemos detectado diferencia significativa en la

expresión del gen VviUCC1 entre los tres genotipos estudiados.

3

ABSTRACT

Cluster compactness is a fundamental feature of the vine (Vitis vinifera L.) that can

affect both quality and yield. The compact clusters ripen less evenly, reducing the quality

and complicating the harvest. They are also more susceptible to pests and diseases,

especially fungal infections.

For all this, there is great interest in the industry to understand the genetic and

physiological bases that affect this character. In a previous project the group "Genética

y Genómica de la Vid" from the ICVV established that, in a multivarietal framework, the

determinants of that character are the length of the main axes of the cluster and the

total number of berries. In some candidate genes promising associations between

specific polymorphisms and length of the axes or berry size were detected.

Among them, the association between a polymorphism detected in the promoter

of a gene encoding a uclacianina protein (VviUCC1) and the length of the first branch.

Thus, the uclacianina gene expression was analyzed in 20 varieties with different

genotypes (T: T, C: C, C T 20 varieties in total 3 genotypes) for the validation of the

association between the polymorphism and expression of VviUCC1.

Despite that some varieties with genotype T:T show a higher expression of

uclacianina, no significant result for ANOVA was observed, indicating that we detected

no significant difference in the expression of VviUCC1 gene from the three genotypes.

4

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 6

1.1 Importancia de la vid y del vino en el mundo, España y La Rioja ................................. 6

1.2 Calidad de la uva ........................................................................................................... 6

1.3 Importancia de la compacidad en la calidad de la uva ................................................. 7

1.4 Aplicación de la PCR a tiempo real para los estudios de la expresión génica. ........... 10

1.5 Estudios previos .......................................................................................................... 12

2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 14

3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................ 15

3.1 Material vegetal .......................................................................................................... 15

3.2 Preparación de los RNA .............................................................................................. 16

3.2.1 Extracción de RNA de Inflorescencias de Vid. ..................................................... 16

3.2.2 Visualización de fragmentos de RNA en gel de agarosa. ..................................... 17

3.2.3 Precipitación de RNA con cloruro de litio (LiCl) ................................................... 18

3.3 PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR o RT-PCR)............................................ 19

3.3.1 Síntesis de DNA .................................................................................................... 19

3.3.2 Diseño de primers (o cebadores) para qPCR ....................................................... 20

3.3.3 Técnica qPCR o RT-PCR ........................................................................................ 20

3.3.4 Optimización de la concentración de primers ..................................................... 21

3.3.5 Determinación de la eficiencia ............................................................................ 22

3.4 Análisis de datos ......................................................................................................... 22

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 24

5

4.1 Concentración y pureza de los RNAs extraídos .......................................................... 24

4.1.1. Medida cuantitativa (NanoDrop). ....................................................................... 24

4.1.2 Medida cualitativa (gel de agarosa) ..................................................................... 26

4.2 Optimización de los primers utilizados ....................................................................... 27

4.3 Determinación de la eficiencia ................................................................................... 27

4.4 RT-PCR ......................................................................................................................... 29

5. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 33

6. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 34

6

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Importancia de la vid y del vino en el mundo, España y La Rioja

El cultivo de la vid (Vitis vinífera L.) y la producción de vino suponen una parte

importante del sector agroalimentario de numerosos países occidentales, además de

tener un papel destacable en su cultura y tradiciones. Desde el punto de vista

económico, la vid es el frutal más cultivado en el mundo. Según datos de la Organización

Internacional de la Viña y el Vino (O.I.V.) alrededor del 65% de la producción se destina

a la vinificación, cerca del 27% a su consumo en fresco y un 7% a la producción de uvas

pasas. Ante esto, España es el país con más superficie de viñedo cultivada (1.1 millones

de hectáreas), siendo el tercer país productor de vino y el noveno productor de uva de

mesa en el mundo.

La producción mundial del vino se estima aproximadamente entre 275 y 300

millones de hectolitros. España cuenta con unas 1.100.000 ha, suponiendo un 15% de la

superficie mundial del viñedo, con una tendencia reductiva en los últimos años. La

mayor parte de esta superficie se dedica a la producción de uva para elaboración de

vino, ocupando el viñedo destinado a la producción de uva de mesa poco más de 21.000

ha. Del total de la superficie dedicada a uva de vinificación, alrededor de 618.000 ha

están protegidas por Denominaciones de Origen (DO), cuya producción se destina a la

elaboración de vinos de calidad (Barco, 2008).

El modelo en que sustenta la D.O. Calificada (D.O.Ca) Rioja la determinación de su

calidad no es otro que una reglamentación con los siguientes principios básicos: no hay

libertad de plantación, limitación de rendimientos, existencia de mecanismos de control

y sanción del nivel de rendimiento fijado en cada campaña, limitación varietal,

diversidad agroclimática, nivel tecnológico y conocimiento suficiente para la producción

y elaboración con calidad, inversión en I + D, todo esto en un territorio limitado (por la

DOC) y pequeño que impide estrategias de expansión ilimitada (Barco, 2008).

1.2 Calidad de la uva

Una de las claves del éxito de la calidad de los vinos españoles durante los últimos

años es, sin duda, la especial atención que desde la bodega se le está prestando a las

condiciones de cultivo y producción de uva para su vinificación (Hidalgo Togores, 2006).

El concepto de uva de calidad va relacionado con varios aspectos:

7

1. El tipo de vino a elaborar: los parámetros de calidad no son los mismos para la

elaboración un vino blanco que para uno rosado o tinto.

2. Uva madura (maduración tecnológica o de la pulpa): la uva debe tener un nivel

adecuado de azúcares y acidez en el momento de la vendimia, para asegurar

fermentación, calidad aromática, calidad sensorial.

3. Maduración fenólica: La maduración fenólica es la más complicada de alcanzar

y difícil de evaluar mediante técnicas sencillas y rápidas. En este sentido se han

propuesto metodologías para su valoración a través de diversas características

vegetativas del viñedo, como la relación SFE (superficie foliar

expuesta)/producción, el vigor y el estado/exposición de los racimos, relaciones

que han mostrado tener una alta correlación con la maduración fenólica (Martínez

de Toda, 2007).

4. Peculiaridades de la variedad de uva: relacionado con la presencia de variedades

más demandadas y valoradas que otras, algo que depende directamente de las

tendencias de consumo.

5. Uva sana: la calidad de la uva vendrá determinada directamente con el estado

sanitario de los racimos, el cual vendrá dado por la presencia/ausencia de

enfermedades del viñedo como mildiu, oídio, botrytis. Así, si los racimos presentan

una alta presencia de estos organismos deberán ser rechazados para la

elaboración de productos de calidad (Martínez de Toda, 2008).

1.3 Importancia de la compacidad en la calidad de la uva

La compacidad del racimo de vid y los factores individuales que definen este

carácter repercuten en la calidad de la uva de vino y de mesa, siendo un atributo que

determina en gran manera el estado sanitario del fruto y la homogeneidad de la

maduración del racimo (Laguna-Ullan, N., 2011). Una elevada compacidad en el racimo

conlleva la aparición de un mayor número de bayas interiores, las cuales no recibirán la

radiación solar necesaria para la correcta y homogénea maduración del racimo (Bayo-

Canha et al., 2012). Una adecuada radiación sobre los frutos se ha relacionado con un

mayor contenido de sólidos solubles, antocianos, y compuestos fenólicos, así como con

una menor acidez titulable, menor contenido en acido málico, menor pH y peso de baya

(Bergqvist, J. et al., 2002), parámetros altamente valorados en uva para vinificación

(Méndez Sánchez, JV., 2005). Así, de manera general, los racimos muy compactos

presentarán peor calidad que los racimos sueltos.

Igualmente, el alto número de bayas en racimos compactos genera un microclima

de alta humedad y temperatura, así como una pobre aireación del racimo, lo que

8

favorece la aparición de diversas plagas y enfermedades del racimo (Martins Marques

Costa, T., 2013). Como se ha comentado anteriormente, si los racimos son severamente

atacados por estos organismos plaga serán rechazados en bodega, lo que puede

producir importantes pérdidas económicas para el viticultor (Labrador-Silva, A. 2002).

Por otro lado, la compacidad del racimo (figura 1) es uno de los parámetros que

evalúa el consumidor de uva de mesa a la hora de adquirir este producto, junto a

atributos como el sabor y el color de las bayas, el tamaño y la forma del racimo y la

firmeza y el color del raquis (Dragincic et al., 2015). En este sentido, el consumidor

rechazará aquellos racimos que sean excesivamente sueltos o excesivamente

compactos, por considerarlos de peor calidad.

Figura 1. Racimos de uva que muestran diferentes grados de compacidad de acuerdo al descriptor número 204 propuesto por la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV). 1: Racimo muy suelto ("Moscatel de Hamburgo"); 3: Racimo suelto ("Beba roja"); 5: Racimo Medio ("Pardillo") ; 7: racimo denso ("Cabernet Sauvignon"); 9: Racimo muy denso (" Sylvaner Gruen ")

Dada su importancia, se han probado numerosas técnicas vitícolas para modificar

la compacidad del racimo y producir racimos más sueltos (figura 2). Entre ellas cabe

destacar la utilización de giberelinas (Vartholomaiou et al. 2008), y el deshojado precoz

(Tardáguila et al. 2010).

No obstante, estas estrategias suelen afectar el número de bayas por racimo, lo

que genera una pérdida en el rendimiento en el cultivo, lo que se traduce en pérdidas

económicas para el viticultor. En este sentido, el uso de alternativas genéticas se plantea

como una posibilidad viable para abordar este problema a largo plazo. No obstante, y a

pesar de su importancia agronómica, se desconocen los procesos moleculares y

genéticos que determinan este carácter, probablemente a su elevada complejidad, lo

que dificulta su estudio (Tello et al., 2015).

9

Figura 2. Ejemplo de un racimo de vid (Vitis vinifera L.) suelto con ramificaciones largas (variedad Italia) y un racimo compacto con ramificaciones cortas (variedad Cinsaut). La cuadrícula del fondo tiene un tamaño de 1 cm2.

En un estudio previo realizado en el laboratorio de Genética y Genómica de la Vid

(Vitigen) del Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV) se llevó a cabo la disección

genética de este carácter a nivel inter-varietal, estudiando más de 100 variedades de

uva de vino y mesa durante tres años consecutivos (Tello et al., 2015) La aplicación

progresiva de distintos análisis multivariantes permitió señalar la longitud de las

primeras ramas del raquis, el número de bayas del racimo y, en menor medida, el

tamaño medio de la baya como los factores más determinantes en la distinta

compacidad del racimo, por lo que se indicaron como las vías más interesantes para el

estudio genético del carácter. Mientras que el número de bayas y su tamaño determinan

principalmente el volumen real del racimo, su volumen morfológico vendrá dado

además por su distribución tridimensional, determinado por las longitudes mayores del

raquis: la relación entre ambos volúmenes determinará entonces la compacidad del

racimo (figura 3).

.

Ital

ia

Cin

sau

t

10

Figura 3. Principales secciones del escobajo

1.4 Aplicación de la PCR a tiempo real para los estudios de la expresión génica.

Para la validación de los polimorfismos asociados localizados en el promotor, que

pueden afectar la expresión del gen, se harán estudios de expresión génica alelo-

específicas mediante la técnica de PCR a tiempo real.

Los polimorfismos se distinguen terminológicamente de las mutaciones por su

frecuencia. Las diferentes formas de los polimorfismos (llamados “alelos”) son más

frecuentes que las mutaciones, esto es, en una frecuencia mayor al 1%. La gran mayoría

de los SNP’s (Polimorfismo de nucleótido simple) tienen dos alelos los cuales están

representados por una sustitución de una base por otra. En las poblaciones, este tipo de

alelos se clasifican en alelo principal o “silvestre” y alelo raro o mutante, clasificación

basada en la frecuencia observada en las poblaciones (Checa Caratachea, M.A.,2007).

La gran diferencia de la técnica de PCR a tiempo real con respecto a la PCR

convencional radica en que la detección de la amplificación no se realiza al final de la

reacción, sino que se realiza durante el transcurso de la misma, al comienzo de la fase

exponencial, y sin necesidad de un paso posterior de migración electroforética del

producto de PCR (Sánchez-Díaz, A., 2012).

Tal y como se muestra en la Figura 4, en una PCR a tiempo real (RT-PCR o qPCR) se

pueden diferenciar varias fases. La primera de ellas es una fase exponencial, en esta fase

la reacción es muy específica y precisa. A continuación tiene lugar la fase lineal, en la

que alguno de los reactivos puede ser limitante (p.ej.: la Taq polimerasa pierde actividad

1. Pedúnculo

2. Eje central del raquis

3. Raquis

4. Ramificaciones

5. Pedicelo

11

o bien alguno de los productos comienza a degradarse). La reacción es más lenta y por

lo tanto aumenta la variabilidad en la cantidad del producto final. Finalmente se produce

una fase de meseta, en la que existe inhibición por producto y la reacción de síntesis se

detiene (Kainz P., 2000).

Figura 4. Representación gráfica de las fases de la PCR.

En una RT-PCR se produce una monitorización continua de todo el proceso, por

lo que es posible la comparación de las muestras en fase exponencial, cuando la

eficiencia es máxima, en vez de a punto final (como hace la PCR convencional). Al inicio

de la fase exponencial las distintas muestras amplificarán de una manera muy precisa y

similar. Sin embargo, según va transcurriendo el proceso, variará la eficiencia entre

muestras. Por este motivo, el parámetro que se utiliza para comparar las distintas

reacciones ha de tomarse en la fase exponencial donde la sensibilidad al error

experimental es menor (Sánchez-Díaz, A., 2012).

El fundamento de la RT-PCR es la relación directa entre la señal de fluorescencia

emitida durante el proceso de la PCR y la cantidad de DNA molde que transforman esa

señal en datos de cuantificación absoluta o relativa del fragmento de DNA amplificado,

el cual puede variar dependiendo de la muestra. La mayor parte de los métodos

existentes dentro de la cuantificación relativa se han desarrollado para ser utilizados en

trabajos de expresión genética, mediante la cuantificación indirecta del RNAm que se

12

expresa en un determinado tejido. Esta cuantificación implica la utilización de un gen de

referencia que debe cumplir:

1- El número de copias genéticas no debe variar entre tejidos ni tampoco entre

muestras.

2- La expresión del gen debe ser constante en los diversos tejidos y muestras

(Ginzinger, 2002).

En el caso de los estudios de la vid, se suele trabajar con el gen de la Ubiquitina,

EF1 α, GPDH como gen de referencia (Gu C et al., 2011).

1.5 Estudios previos

En otro estudio realizado en el mismo laboratorio se llevó a cabo un análisis

transcriptómico comparativo entre clones sueltos y compactos de las variedades

Tempranillo tinto y Garnacha tinta, que permitió la selección de genes candidatos

potencialmente involucrados en la compacidad del racimo o en caracteres relacionados

(Grimplet et al., en preparación).

El análisis de las secuencias génicas de más de 100 variedades de vid permitió

identificar un conjunto de polimorfismos que sirvieron de base para llevar a cabo un

estudio de asociación con la compacidad del racimo y los dos factores que más

determinan su variación (número de bayas y longitud de la primera ramificación del

racimo) (Tello et al., 2016). Esta aproximación permitió identificar un conjunto de

polimorfismos asociados con la compacidad del racimo o con los atributos que lo

determinan, localizados en genes no relacionados previamente con estos caracteres.

Entre los genes secuenciados, los genes con las asociaciones más prometedores han sido

pre-seleccionados y clasificados, para determinar cuáles serán estudiados para evaluar

y validar la asociación. La clasificación se ha basado en la calidad de la secuencia, la

robustez y la importancia de las asociaciones encontradas, la varianza de la

característica explicada por el modelo, la distribución genotípica del polimorfismo

asociado en la colección de variedades utilizado, el tipo y localización del polimorfismo

y la anotación funcional del gen.

Entre ellos, los autores destacaron la asociación entre un polimorfismo (llamado

K-88) detectado en el promotor de un gen que codifica para una proteína tipo

uclacianina (VIT_12s0059g02640) y la longitud de la primera ramificación y la

13

compacidad del racimo (Tello et al., 2016). De hecho, resultados transcriptómicos

previos indicaron una expresión específica de este gen en etapas clave para el

establecimiento y desarrollo del raquis en diferentes cultivares (Díaz - Riquelme et al.

2014, Fasoli et al., 2012), lo que sugiere que este gen podría estar involucrado de una

manera u otra en la formación de la inflorescencia y la arquitectura final del raquis. Así,

los autores propusieron este gen (y este polimorfismo) como un interesante candidato

para realizar trabajos más profundos para confirmar dicha asociación, como sería

determinar la expresión de este gen en variedades de vid con distinto genotipo para K-

88 (Tello et al., 2016).

14

2. OBJETIVOS

Los objetivos planteados para este trabajo fueron los siguientes:

1. Analizar la expresión génica de la uclacianina en variedades con diferentes genotipos.

Para la validación de los polimorfismos asociados localizados en el promotor, que

pueden afectar a la expresión del gen, se harán estudios de expresión génica mediante

RT-qPCR.

2. Evaluar y validar las asociaciones encontradas en relación con la arquitectura del

racimo.

15

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1 Material vegetal

Para este trabajo se seleccionaron 20 variedades de vid (Vitis vinífera L.) de la

Colección de Variedades del Instituto de Ciencias de La Vid y del Vino (ICVV, Instituto

Código FAO: ESP-217) situada en la finca de "La Grajera" (Logroño, La Rioja, España)

(Tabla 1). Estas variedades se seleccionaron considerando su distinto genotipo para el

polimorfismo K-88, localizado en el promotor del gen VvUCC1 (VIT_12s0059g02640) y

asociado con la longitud de las ramificaciones del raquis y la compacidad del racimo

(Tello et al., 2016).

Para cada variedad se tomaron tres inflorescencias completas (cada una de una

cepa diferente) en el estadio fenológico E-L 14 (estado de inflorescencia, mayo 2015).

Se congelaron con nitrógeno líquido en el mismo momento que se muestreaban,

se trasladaron al laboratorio y se conservaron congeladas a -80 ⁰C para la posterior

extracción de RNA.

Tabla 1. Variedades de vid (V. vinífera) incluidas en este trabajo.

Número Variedad

Nombre variedad

Genotipo K-88 Uso principal de la variedad

1 Cinsaut C:C Vino

2 Italia C:T Mesa

3 Albillo Real C:T Vino

4 Alphonse Lavallee T:T Mesa

5 Pedro Ximenes T:T Vino

6 Trebbiano Toscano C:C Vino

7 Airén C:T Vino

8 Cabernet Franc C:C Vino

9 Barbera Nera C:C Vino

10 Tempranillo Tinto C:C Vino

11 Planta Nova C:T Mesa

12 Listán Prieto T:T Vino

16

13 Torrontés T:T Vino

14 Moristel C:T Vino

15 Paraíso C:T -

16 Delight C:C Mesa

17 Merlot C:C Vino

18 Tinto Velasco C:C Vino

19 Aramon Noir C:C Vino

20 Naparo T:T Mesa

3.2 Preparación de los RNA

3.2.1 Extracción de RNA de Inflorescencias de Vid.

La extracción de RNA se realizó a partir de las muestras de las inflorescencias

congeladas a -80 ⁰C (descritas en el apartado anterior), se machacaron en morteros de

cerámica estériles hasta conseguir un fino polvo uniforme, manteniendo siempre la

muestra congelada con nitrógeno líquido. El polvo extraído (aprox. 100 mg/muestra) se

conservó en un tubo eppendorff estéril debidamente etiquetado.

El RNA se extrajo con el Kit Plant Total RNA (Sigma-Aldrich), siguiendo el

protocolo suministrado por el fabricante con ciertas modificaciones, tal y como se indica

a continuación.

- En un eppendorff se pesaron 100mg de muestra, a la que se le añadieron

500µL de Lysis Solution y 5µL de 2-ME. Se vorteó durante 30 segundos y

seguidamente se introdujo en un baño a 56 ⁰C durante 5 minutos.

- Una vez transcurrido el tiempo, se realizó una centrifugación de a 13000 rpm

durante 3 minutos. El sobrenadante obtenido se pasó por un tubo de 2 mL

con la columna de filtración (azul) y se centrifugó a 13000 rpm durante 1

minuto.

- A continuación se retiró la columna de filtración y se añadieron 250 mL de la

solución Binding. Se mezcló bien con la misma punta de pipeta (aprox. unas

5 veces) y se pipeteo 500 µL de la mezcla que fueron transferidos a un nuevo

tubo de 2mL con la columna Binding (roja).

- Se centrifugó a 13000 rpm durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante

dejándose secar la columna.

17

A continuación, se realizó un tratamiento con DNasa para eliminar cualquier

resto de DNA que pudiera haber en las muestras. Para ello:

- Se añadieron 300 µL del Wash Solution 1, se centrifugó durante un 1 minuto

a 13000rpm, y se descartó el sobrenadante.

- Y para cada digestión se añadió 10 µL de DNase I más 70 µL de RDD. Se

pipetearon los 80µL de dicha digestión y se añadieron al centro del filtro de

la columna, se incubaron las muestras durante 15 minutos a temperatura

ambiente.

- Seguidamente, se realizó una limpieza de la columna añadiendo 500 µL del

Wash Solution 1 en el centro del filtro de la columna, se centrifugó a 13000

rpm durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante. Este paso se repitió

nuevamente ya que este tejido sale con bastantes impurezas.

- A continuación, añadimos 500 µL del Wash Solution 2 y se centrifugó a

1300rpm durante 30 segundos. Este paso se repite tantas veces como sea

necesario hasta que el sobrenadante salga sin color verde.

- Centrifugamos la columna vacía para secarla a 13000 rpm durante 1 minuto.

- Pasamos la columna a un nuevo tubo de 1,5 mL.

- Se añadió 60µL de Agua DEPC en el centro del filtro de la columna y pasado

1 minuto se centrifugó, 13000 rpm durante 1 minuto.

Una vez extraído en RNA, se procedió a evaluar la calidad y el rendimiento de

dicha extracción. Para ello, se realizó una electroforesis en un gel de agarosa teñido con

azul de bromofenol (1%) tal y como se indica en el apartado 3.2.2

Para ver el rendimiento obtenido de la extracción se efectuó la medida 260/280

y 260/230 por medio de un espectrofotómetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific ,

Wilmington , EEUU).

3.2.2 Visualización de fragmentos de RNA en gel de agarosa.

Para visualizar los fragmentos de RNA, se empleó la técnica de electroforesis

horizontal en gel de agarosa.Se preparó un gel con agarosa de alta pureza (Bio-Rad) a

una concentración del 1% en tampón de almacenamiento (TAE 1X)- 60 mM de Tris y 2

mM EDTA, pH 8.5 - con gel Red.

Cada muestra se preparó mezclando 200ng de RNA (aprox. 0,5 µl), 2 µL de azul y

hasta un volumen final de 12 µL con agua DEPC.

18

Una vez cargadas las muestras en el gel (12 µL en cada pocillo), este se sumergió

completamente en TAE 1X (40 mL de TAE 50X - 1960 mL Agua MQ) en la cubeta de

electroforesis. El RNA migró a 75-80 voltios desde el polo negativo hasta el positivo,

durante el tiempo necesario para la separación adecuada de los fragmentos de interés.

La electroforesis se dio por finalizada cuando el frente de la carrera alcanzo el 75% de la

longitud del gel. Posteriormente, la imagen fue captada con el sistema de

fotodocumentación (GELdoc de Bio-RAD Molecular Imager ChemiDoc XRS).

Aquellas muestras cuyo rendimiento fue inferior a 2, se procedió a realizar una

purificación con cloruro de litio, dado que el RNA precipita en presencia de dicho

compuesto pero no así DNA, proteínas, azúcares y fenoles, que quedan disueltos en el

sobrenadante, de modo que se puede obtener el RNA purificado a partir del pellet. Se

recomienda hacer la precipitación con volúmenes bajos, para favorecer la precipitación

del RNA al evitar diluirlo demasiado.

3.2.3 Precipitación de RNA con cloruro de litio (LiCl)

1. Añadir al RNA resuspendido en agua DPEC 0.333 volúmenes de LiCl 10M para una

concentración de 2.5M de LiCl. En este caso se añadió 20 µL de LiCl por cada 60 µL de

RNA en agua DPEC.

2. Incubar la mezcla con LiCl overnight a 4 ⁰C (tubos en hielo).

3. Centrifugar 30 min a 4 ⁰C a 13000 rpm.

4. Eliminar sobrenadante (con pipeta cuidadosamente para no arrastrar el pellet).

5. Lavar el pellet con 500 µL de etanol al 70% previamente enfriado a -20 ⁰C. Centrifugar

10 minutos a 4 ⁰C a 13000 rpm.

6. Eliminar el etanol con pipeta cuidadosamente. Terminar de secar el etanol al aire o

en speed vac.

7. Resuspender el pellet en el volumen de 60 µL de agua DEPC durante 1-2 horas

(mantener los tubos en hielo).

19

3.3 PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR o RT-PCR)

3.3.1 Síntesis de DNA

A partir de los RNAs obtenidos, se procedió a la síntesis de cDNA, utilizando para

ello el kit de retrotranscripción Takara (TAKARA, Tokio, JAPON). Según indicaciones del

fabricante, se preparó la mix de reacción indicada en el protocolo, en hielo. Se

dispensaron 3.5 µL del mix en microtubos estériles y libres de RNAsas, añadiendo

entonces 1 µg de los RNAs anteriormente extraídos y completando con agua DEPC hasta

los 10µL de volumen final. Los tubos se etiquetaron debidamente.

Las muestras preparadas se incubaron en el termociclador para la síntesis de

cDNA, usando las siguientes condiciones:

I. 37⁰C, 15 minutos (etapa de transcripción reversa).

II. 85⁰C, 5 segundos (etapa de inactivación de la transcripción).

III. 4⁰C (para su conservación).

Se preparó la siguiente mezcla de reacción en hielo. Se recomienda preparar un

poco más de la mezcla maestra para compensar las pérdidas de pipeteo. Después de

dispensar las alícuotas de esta mezcla en los microtubos, se añadió la muestra de RNA.

Para 1 reacción:

5X PrimerScript Buffer 2 µL

RT Enzyme Mix I 0.5 µL

Oligo dT Primer 0.5 µL

Random 6 mers 0.5 µL

RNA (1µg) x µL

Agua DPEC x µL

vol.final 10 µL

Dependiendo de la cantidad de RNA que se tenga que echar para tener 1µg hasta

los 10µL de volumen final, lo ajustaremos con Agua DPEC.

Los cDNA obtenidos se diluyeron 1/50 en Agua MQ y se comprobó por medio de

un espectrofotómetro que tuvieran una concentración similar.

20

3.3.2 Diseño de primers (o cebadores) para qPCR

Se diseñaron una pareja de primers para el gen VviUCC1 (VIT_12s0059g02640)

usando la secuencia de la versión V1 de la notación del genoma de la vid

(http://genomes.cribi.unipd.it/grape/) mediante el programa informático Oligo

Explorer 1.2. Para su diseño se tuvieron en cuenta parámetros generales como:

(I) Tm (temperatura media).

(II) El contenido de G/C.

(III) La longitud de los primers.

(IV) El tamaño del amplicón.

(V) Y la formación de estructuras secundarias.

Dichos parámetros se optimizaron para obtener la máxima eficiencia bajo las

condiciones estándar de amplificación en un termociclador de tiempo real ABI PRISM

7500 (Applied Biosystems, EEUU). En el diseño también se tuvo en cuenta la

recomendación de no incluir en las 5 últimas bases del extremo 3´más de 2 Cs/Gs .

Las secuencias de la pareja de primers diseñada para el gen VviUCC1 fueron las

siguientes:

Forward: AAGTTTCAAAAGCAGACTATG Reverse: CTGGAGATGAGAGAGGTATGAC

Estas secuencias se enviaron a SIGMA-ALDRICH para su síntesis, y así poder usarlos

en el proceso de qPCR.

3.3.3 Técnica qPCR o RT-PCR

La expresión del gen VviUCC1 en las inflorescencias de las variedades de vid

estudiadas se realizó mediante qPCR, comparando nuestros resultados con los

obtenidos por un gen de referencia (gen ubiquitina). Cada muestra se colocó por

triplicado en la placa, ya que es una técnica bastante sensible. Para ello se siguió el

protocolo de Takara Bio Inc.

Para cada muestra se realizó un mix según el protocolo que se indica a

continuación. Las condiciones que se establecieron en el equipo de PCR a tiempo real

fueron las estándar para el kit comercial utilizado, usando el termociclador ABI PRISM

7500. Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos MicroAmpTM

fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems, EEUU) cubiertas con el film

21

MicroAmpTM optical adhesive film (Applied Biosystems, EEUU). Así, se programó una

desnaturalización inicial de 95 ⁰C durante 10 segundos, seguido de 40 ciclos de dos

pasos: (I) 95 ⁰C/5 segundos y (II) 60⁰C/34 segundos (etapa de la reacción de PCR). Por

último se llevó a cabo una etapa de disociación de tres pasos: (I) 95⁰C/15 segundos, (II)

60⁰C/1 minuto y (III) 95⁰C/15 segundos.

Mix para el protocolo de Takara Bio Inc. para la PCR Real Time con el termociclador ABI

PRISM 7500 (Applied Biosystems, EEUU).

Para 1 reacción:

SYB R (2X) 25µL

Forward Primer (10µM) 1µL

Reverse Primer (10µM) 1µL

ROX Dye I (50X) 1µL

cDNA 4µL

dH2O 18µL

3.3.4 Optimización de la concentración de primers

Para la optimización de la concentración de los cebadores se realizaron nueve

ensayos resultantes de la combinación de 3 concentraciones de cebador directo (300,

600, 900 mMol) con otras 3 concentraciones de cebador reverso (300, 600, 900 mMol).

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µL, según indica

el protocolo de TAKARA, los 4µL de cDNA, fueron un mix preparado de todas las

muestras de cDNA que tenemos de todas las variedades del estudio.

Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo se llevaron a cabo tal y como se describe

en el apartado 3.3.3.

22

3.3.5 Determinación de la eficiencia

Para el ensayo de la eficiencia se realizaron diluciones seriadas 1:10 (8 puntos), se

realizó con el mix de los nueve ensayos descritos anteriormente, previamente a realizar

las diluciones seriadas se realizó una purificación de los productos de PCR mediante el

kit "QIAquick PCR Purificatión Kit".

Para el cálculo de la eficiencia (%) se empleó la ecuación:

E =100[ 10(-1/pendiente)-1]

3.4 Análisis de datos

Obtenidas las curvas de amplificación por la RT-PCR, a partir de estas curvas

específicas de cada muestra se obtuvieron nuestros valores Ct (threshold cycle) para el

gen control y el gen candidato. El valor Ct se determina en la intersección de la línea

umbral con la curva de amplificación incluida en el software del equipo RT-PCR como se

muestra en la figura 5.

Figura 5.Curvas de amplificación RT-PCR con su Ct.

La expresión del gen candidato será normalizada con la expresión del gen control.

Para la normalización de RT-PCR se utilizó el método ∆∆CT (Livak) (Kenneth J. y Thomas

D. Schmittgen, 2001). El método ∆∆CT hace una suposición importante acerca de la PCR,

y se basa en que las eficiencias de amplificación del gen control de referencia y del gen

candidato de interés, deben ser aproximadamente iguales. Específicamente ∆∆CT

asume que en cada ciclo de PCR se duplicará exactamente la cantidad de material en la

muestra (la eficiencia de amplificación = 100 %).

23

PASO 1

Primer diferencial (∆Ct)

∆Ct = Ct muestra, gen candidato - Ct muestra, gen control

PASO 2

Segundo diferencial (∆∆Ct)

∆∆Ct = ∆Ct muestra – ∆Ct referencia (muestra con menor expresión)

PASO 3

2^-(∆∆Ct)

(Kenneth J. Livak y Thomas D. Schmittgen, 2001)

Con este ratio 2^-(∆∆Ct) se realizó un ANOVA en Excell para ver si hay diferencias

significativas entre los diferentes genotipos estudiados.

24

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Concentración y pureza de los RNAs extraídos

4.1.1. Medida cuantitativa (NanoDrop).

Tras realizar la extracción de RNA de todas las inflorescencias se procedió a evaluar

su calidad y su pureza. La concentración (cuantificada con el NanoDrop) y los ratios

calculados entre las absorbancias determinadas a las longitudes de onda UV-VIS 260 nm

y 280 nm (ratio 260/280) y 260 nm y 230 nm (ratio 260/230) se muestran en la tabla 2.

Tal y como suele suceder en este tipo de estudios, se observó una gran variación

en los rendimientos obtenidos, con concentraciones de RNA que variaron entre 82.1

ng/µl (variedad Tempranillo tinto, cepa 3) y 6413.3 ng/µl (variedad Italia, cepa 1).

La relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la pureza de

DNA y RNA. Una proporción de ~ 1.8 está generalmente aceptada como "puro" para el

DNA; una proporción de ~ 2.0 está generalmente aceptada como "puro" para el RNA.

Si la relación es apreciablemente menor en cualquiera de los caso, esto puede

indicar la presencia de proteína, fenol u otros contaminantes que absorben fuertemente

cerca de 280 nm.

Tabla 2. Calidad y rendimiento de las extracciones de RNA realizadas a partir de inflorescencias de distintas variedades de vid.

Variedad Cepa Concentración (ng/µl)

Ratio 260/280

Ratio 260/230

Método Extracción

Airén 1 1663,5 2,02 2,08 kit sigma

Airén 2 1980,1 2,01 1,77 kit sigma

Airén 3 2981,8 1,99 2,18 kit sigma

Albillo Real 1 1437 2,05 1,96 kit sigma

Albillo Real 2 1098 2,06 1,91 kit sigma

Albillo Real 3 2245,4 2,14 2,21 kit sigma-LICL

Alphonse Lavallee 1 1461,2 2,1 2,09 kit sigma

Alphonse Lavallee 2 1635,1 2,03 1,76 kit sigma

Alphonse Lavallee 3 372 1,91 1,45 kit sigma-LICL

Aramon Noir 1 2263,4 2,04 1,8 kit sigma

Aramon Noir 2 2958,1 1,97 1,9 kit sigma

Aramon Noir 3 208,4 2 1,78 kit sigma-LICL

Barbera Nera 1 521,8 2,11 2,39 kit sigma-LICL

Barbera Nera 2 554,8 2,08 2,2 kit sigma-LICL

Barbera Nera 3 1099,8 1,99 1,71 kit sigma

25

Cabernet Franc 1 864,2 2,06 2 kit sigma

Cabernet Franc 2 248,1 2 1,71 kit sigma-LICL

Cabernet Franc 3 310,9 2,06 1,92 kit sigma-LICL

Cinsaut 1 996,5 1,93 1,75 kit sigma-LICL

Cinsaut 2 437,7 2,03 1,81 kit sigma-LICL

Cinsaut 3 308,4 1,89 1,5 kit sigma-LICL

Delight 1 203,4 1,89 2,33 kit sigma-LICL

Delight 2 1538,2 1,95 1,73 kit sigma

Delight 3 1285,4 2,12 2,15 kit sigma

Italia 1 6413,3 2,06 2,28 kit sigma-LICL

Italia 2 1607,2 2,03 1,85 kit sigma

Italia 3 1179,7 2,02 1,72 kit sigma

Listán Prieto 1 155 1,96 1,59 kit sigma-LICL

Listán Prieto 2 198,8 1,94 1,67 kit sigma-LICL

Listán Prieto 3 195,7 1,96 1,67 kit sigma-LICL

Merlot 1 133,2 1,95 1,6 kit sigma

Merlot 2 1354,6 2,09 1,99 kit sigma

Merlot 3 912,8 2,04 1,97 kit sigma

Moristel 1 2122 1,96 2,01 kit sigma

Moristel 2 741,6 2,03 1,89 kit sigma

Moristel 3 256,4 2,07 2,03 kit sigma

Naparo 1 286,7 2,01 1,7 kit sigma-LICL

Naparo 2 239,8 1,97 2 kit sigma-LICL

Naparo 3 139,1 1,97 1,88 kit sigma-LICL

Paraíso 1 1660,4 2,05 1,81 kit sigma-LICL

Paraíso 2 2242,3 1,99 1,78 kit sigma

Paraíso 3 314,7 2,03 1,72 kit sigma-LICL

Pedro Ximenes 1 445,4 2,02 1,86 kit sigma

Pedro Ximenes 2 581,1 1,92 2,01 kit sigma

Pedro Ximenes 3 437,8 2,05 1,87 kit sigma-LICL

Planta Nova 1 342,5 1,91 1,38 kit sigma-LICL

Planta Nova 2 450,3 1,94 1,43 kit sigma-LICL

Planta Nova 3 301,4 1,97 1,82 kit sigma-LICL

Tempranillo Tinto 1 1420,9 1,98 1,71 kit sigma

Tempranillo Tinto 2 84 1,95 1,67 kit sigma-LICL

Tempranillo Tinto 3 82,1 2,01 1,55 kit sigma-LICL

Tinto Velasco 1 810,3 1,89 2,1 kit sigma-LICL

Tinto Velasco 2 610,6 1,95 1,72 kit sigma-LICL

Tinto Velasco 3 156,9 1,81 1,89 kit sigma-LICL

Torrontes 1 1482,6 2,09 2,06 kit sigma

Torrontes 2 3303,4 2,13 2,25 kit sigma-LICL

Torrontes 3 1303 2,06 1,96 kit sigma

Trebbiano Toscano 1 1868,7 1,94 2,01 kit sigma

Trebbiano Toscano 2 965,8 2,02 1,8 kit sigma

Trebbiano Toscano 3 1619,7 2,04 1,95 kit sigma

26

4.1.2 Medida cualitativa (gel de agarosa)

Igualmente, se procedió a evaluar la calidad y el rendimiento de dicha extracción

de manera cualitativa. Para ello, y tal y como se ha comentado en la sección de

materiales y métodos, se realizó una electroforesis en un gel de agarosa teñido con azul

de bromofenol. La imagen del gel con las muestras de RNA migradas se muestra en la

figura 6.

Figura 6. Gel de agarosa con las 60 muestras de RNA migradas. Las muestras se cargaron en los pocillos del gel según el siguiente orden ascendente: pocillos 1,2,3 Cinsaut; pocillos 4,5,6 Italia; pocillos 7,8,9 Albillo Real; pocillos 10,11,12 Alphonse Lavallee; pocillos 13,14,15 Pedro Ximenes; pocillos 16,17,18 Trebbiano Toscano; pocillos 19,20,21 Airén; pocillos 22,23,24 Cabernet Franc; pocillos 25,26,27 Barbera Nera; pocillos 28,29,30 Tempranillo Tinto; pocillos 31,32,33 Planta Nova; pocillos 34,35,36 Listán Prieto; pocillos 37,38,39 Torrontes; pocillos 40,41,42 Moristel; pocillos 43,44,45 Paraíso; pocillos 46,47,48 Delight; pocillos 49,50,51 Merlot; pocillos 52,53,54 Tinto Velasco; pocillos 55,56,57 Aramon Noir; pocillos 58,59,60 Naparo.

Como se puede apreciar en la Figura 6, no se observa degradación del RNA.

Asimismo, se observó que en 6 de las 60 muestras (pocillos 2, 11, 30, 31, 48 y 51) no se

produjo una correcta migración del RNA.

27

4.2 Optimización de los primers utilizados

Con el fin de identificar las concentraciones optimas de cebadores, se diseñó un

ensayo con nueve combinaciones de 3 concentraciones de primer directo (300, 600, 900

mMol) y 3 concentraciones de primer reverso (300, 600 y 900 mMol). En la tabla 3 se

recogen los resultados de estos ensayos.

Tabla 3. Resultados obtenidos del experimento de optimización del primer.

mMol CT Medio

300 28,9839±0,84

600 29,3377±1,39

900 28,6606±0,58

Por observarse resultados muy similares entre las concentraciones ensayadas, y

con el fin de reducir los costes asociados a la compra de reactivo, se consideró que la

opción más adecuada, era emplear la concentración de 600 mMol, siendo también la

opción que marca en el Protocolo RT-PCR (Takara).

4.3 Determinación de la eficiencia

Los ensayos de eficiencia consistieron en la realización de una recta patrón, a

partir de una serie de diluciones seriadas de los primers diseñados (tabla xxxx). Una vez

obtenidos los valores de Ct (el valor Ct se determina en la intersección de la línea umbral

con la curva de amplificación, dicha aplicación está incluida en el software del equipo

RT-PCR) para cada una de las diluciones ensayadas, mediante la amplificación en la RT-

PCR, se estableció una relación lineal entre dichos valores y la concentración de los

primers (figura 7). El valor de la pendiente se empleó para calcular la eficiencia (%) del

gen control y el gen candidato (uclacianina, VviUCC1).

28

Tabla 4: Ct medios de los primers diseñados para el gen de la uclacianina a distintas concentraciones.

Figura 7. Recta de regresión obtenida entre el valor Ct medio de los primers del gen de la uclacianina a distintas concentraciones.

Tal y como se indicó en materiales y métodos, con la pendiente de la recta se obtuvo

la eficiencia de los primers para el gen de la uclacianina (E= 105%) y para el gen de la

ubiquitina, usado como control (E= 95%). Considerando que la eficiencia de ambos

primers (control y candidato) fueron aproximadamente iguales se aplicó la

y = -3,19x + 29,376R² = 0,9685

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6

Ct

me

dio

Dilución

Ct PRIMERS DILUCIÓN

12,5032 10-5

17,2561 10-6

20,2509 10-7

23,8731 10-8

25,1446 10-9

29

normalización de RT-PCR utilizando el método ∆∆Ct (Livak)(Kenneth J. Livak y Thomas

D. Schmittgen, 2001)

4.4 RT-PCR

Las reacciones de PCR a tiempo real (RT-PCR) se llevaron a cabo en las 60 muestras

analizadas, con tres réplicas por muestra, tal y como se describe en material y métodos.

En cada placa de RT-PCR se añadió un control negativo (igualmente con tres réplicas).

En estas muestras el volumen de RNA se sustituyó por un volumen igual de agua estéril

y libre de RNA. En la Figura 8 se muestran las curvas de amplificación correspondientes

a la primera de las 5 placas realizadas. Las tres curvas finales (las situadas a la derecha

de la figura) se corresponden al control negativo, es fiable ya que surgen en un ciclo muy

tardío.

Figura 8. Curvas de amplificación de la RT-PCR.

30

A partir de estas curvas de amplificación específicas de cada muestra se

obtuvieron nuestros valores Ct para el gen control y el gen candidato. En la tabla XXXX

se muestra el valor ∆Ct para cada una de ellas, resultado de haber restado el valor de Ct

del gen control al Ct del gen candidato (VviUCC1).

Para utilizar el método de ∆∆Ct se necesita una condición de referencia (Kenneth

J. Livak y Thomas D. Schmittgen, 2001). En nuestro caso se seleccionó el valor obtenido

por la variedad Albillo real como condición de referencia, considerando que fue la

variedad con menor expresión media para el gen candidato (tabla 5).

Tabla 5. Valores ∆CT y ∆∆CT (vs Albillo real) obtenidos para cada variedad.

Genotipo Variedad ∆ct ∆∆ct vs albillo real Ratio vs albillo real 2^∆∆ct

C:T Airén 10,1722±0,65 -0,9062 1,8742 C:T Albillo Real 11,07844±0,78 0 1 T:T Alphonse Lavallee 9,534522±1,04 -1,5439 2,9159 C:C Aramon Noir 6,317198±5,39 -4,7612 27,1193 C:C Barbera Nera 8,413551±1,18 -2,6649 6,3418 C:C Cabernet Franc 10,58668±1,45 -0,4918 1,4062 C:C Cinsaut 9,2392±1,09 -1,8392 3,5782 C:C Delight 5,289107±1,58 -5,7893 55,3050 C:T Italia 9,068231±2,16 -2,0102 4,0284 T:T Listán Prieto 6,045905±2,63 -5,0325 32,7299 C:C Merlot 5,26173±1,45 -5,8167 56,3645 C:T Moristel 6,378335±2,71 -4,7001 25,9940 T:T Naparo 1,883537±2,11 -9,1949 586,0612 C:T Paraíso 3,643949±1,88 -7,4345 172,9840 T:T Pedro Ximenes 10,14291±1,68 -0,9355 1,9126 C:T Planta Nova 9,352413±1,29 -1,7260 3,3082 C:C Tempranillo Tinto 4,690108±3,39 -6,3883 83,7685 C:C Tinto Velasco 4,007908±1,38 -7,0705 134,4136 T:T Torrontés 6,269952±1,23 -4,8085 28,0221 C:C Trebbiano Toscano 9,18776±1,54 -1,8907 3,7081

El ratio 2^∆∆CT (tabla 5) nos permitió comparar la expresión del gen candidato

(VvUCC1) entre las 20 variedades analizadas (figura 9).

31

Figura 9. Expresión relativa del gen VviUCC1 en las 20 variedades de vid analizadas en este trabajo.

A partir de los resultados obtenidos se realizó un análisis de la varianza de una vía

(ANOVA) para determinar si existen diferencias significativas entre los tres genotipos

existentes para el SNP K-88 (C:T, T:T, C:C), usando para ello el ratio 2^∆∆CT.

Los resultados se muestran en la tabla 6. A pesar de observarse que algunas de las

variedades con el genotipo T:T presentan mayores valores de expresión para el gen

candidato (FIGURA 9), se observó un resultado no significativo (α= 0,42) para el ANOVA,

lo que indica que no existe diferencia significativa en la expresión del gen VvUCC1 entre

los tres genotipos detectados para K-88.

0

100

200

300

400

500

600

700

Air

én

Alb

illo

Rea

l

Alp

ho

nse

Lav

alle

e

Ara

mo

n N

oir

Bar

be

ra N

era

Cab

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et

Fran

c

Cin

sau

t

De

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t

Ital

ia

List

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t

Mo

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Par

aíso

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pra

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to V

elas

co

Torr

on

tés

Treb

bia

no

To

scan

o

Rat

io v

s al

bill

o r

eal (

2-d

dct

)

Variedades

Expresión Uclacianina

32

Tabla 6 .Análisis de la varianza (ANOVA)

Análisis de varianza de un factor RESU

MEN

Grupos Cuenta Suma Promedi

o Varianza

Columna 1 6

209,188818

34,864803

4667,5048

Columna 2 5

651,641637

130,328327

65102,2391

Columna 3 9

372,005197

41,3339107

2093,44539

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las

variaciones Suma de

cuadrados Grados

de libertad

Promedio de los

cuadrados F Probabilidad

Valor crítico para F

Entre grupos

31602,9339 2

15801,467

0,8939443

0,42741822

3,59153057

Dentro de los grupos

300494,043 17

17676,1202

Total 332096,

977 19

33

5. CONCLUSIONES

Se consiguió extraer satisfactoriamente el RNA de las inflorescencias de las 20

variedades distintas de vid y sintetizar sus correspondientes cDNAs.

Al estudiar los resultados obtenidos de la expresión génica del gen candidato

uclacianina (VvUCC1) mediante la técnica de RT-PCR, los valores más altos de

expresión se obtuvieron en algunas de las variedades que presentaban el genotipo

T:T.

De las 20 variedades de vid estudiadas con diferentes genotipos (C:C, C:T, T:T) para

el polimorfismo(K-88) detectado en el promotor del gen uclacianina (VvUCC1), se

obtuvo un resultado no significativo (α= 0,42) para el ANOVA, lo que indica que no

existe diferencia significativa en la expresión del gen VvUCC1 entre los tres genotipos

detectados para K-88 en el estadío estudiado.

La variedad con los valores más altos de expresión del gen uclacianina (VvUCC1) fue

la variedad Naparo. Esto es debido a que el gen control ubiquitina no se expresó.

Esto puede ser debido, a que esta variedad es femenina, motivo por el cual dio

problemas al extraer el RNA de las inflorescencias.

Estos resultados obtenidos nos indican que sería interesante realizar estudios

posteriores en los estadios anterior y posterior al realizado en este trabajo, así como

una optimización en el diseño de los primers.

34

6. BIBLIOGRAFÍA

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