Expresión de Proteínas

Gran Escala

�  En 2000 NIH (National Institute of Health) �  Protein Structure Initiative ( Proteínas humanas)

�  Base de datos tiene mas de 33.000 secuencias proteícas (5%)

�  Principal Objetivo: Modelar estructuras proteícas desconocidas basándose en comparaciones estructurales.

Proteínas como productos biológicos

�  Fabricación de cerveza y vino (fermentación) �  Depende de enzimas producidas por la levadura

�  Producción de quesos �  Gracias a la bioingeniería, la fuente de proteínas usada

actualmente procede de bacterias manipuladas

�  Aunque se conocía desde la antigüedad no fue hasta 1970 que fue posible producir proteínas concretas a demandas.

�  Muchas de las aplicaciones hoy en día dependen de enzimas. �  Innumerables industrias se basan en la degradación de

grandes moléculas (despolimerización) �  Amilasas- hidrolizan CHO’s

�  Proteasas- descomponen proteínas

�  Lipasas- degradan grasas

�  Quimosinas son importante en la producción de alimentos y bebidas.

�  Hormonas- Mensajeros quimicos

�  Anticuerpos- Protegen a los organismos de enfermedades

Aplicaciones

�  Producción de un fármaco biotecnológico

�  Aplicaciones médicas

�  Procesamiento de alimentos

�  Textiles y artículos de cuero

�  Detergentes

�  Manufactura y reciclaje de papel

�  Adhesivos

�  Biosoluciones

Producción de un fármaco biotecnológico �  Anticuerpos monoclonales

�  Proteínas sanguíneas

�  No se producen por síntesis como es el caso de un producto químico donde se adicciona un componente cada vez.

�  Se producen mediante fermentación microbiana o cutivos de células

Estructuras de las proteínas �  Cadenas de aminoácidos (a.a.)

�  Peso molecular �  Carga de proteína �  Capacidad de interacción es clave para la actividad

biológica. �  Proteínas pueden tener cuatro niveles de organización

estructural (dependiendo de la secuencia química específica de sus subunidades de a.a.)

Estructura Primaria

�  Es la secuencia de una cadena de a.a.

Estructura Secundaria �  Es cuando la secuencia de a.a. se pliegan o giran en

puntos concretos, se une mediante enlaces de hidrógeno en una o dos formas estructurales.

�  Alfa hélice y láminas plegadas beta.

Estructura terciaria

�  Se produce cuando ciertas atracciones están presentes entre hélices alfa y láminas beta, obteniendo una estructura tridimensional única.

Estructura cuaternaria

�  Es una proteína compuesta por más de una cadena de a.a., cada una de las cuales participa en la forma tridimensional final.

Plegamiento de proteína

�  Todo lo que importa de una proteína (su estructura, función) depende del plegamiento. �  Ej. Anemia �  Alzheimer- Las placas que aparecen en la enfermedad se

acumulan por que la proteína mal plegada no puede ser degradada por las enzimas de las células cerebrales.

�  Fibrosis quística �  Enfermedad de las vacas locas �  Muchas formas de cáncer �  Infartos cardiácos

Glucosilación

�  Se añaden hidratos de carbono en lugares específicos de las proteínas.

�  Puede afectar la actividad, la solubilidad y la orientación, inclusive puede alargar la vida activa

Ingeniería de proteínas

�  Inducción de mutaciones aleatorias en genes y selección de organismos con el producto proteíco con la máxima actividad.

�  Ej. Organismos seleccionados que toleran concentración de Cianuro superior a 1.0 M.

�  La evolución molecular dirigida precisa la introducción de cambios específicos en las secuencias de nucleótidos de un gen concreto.

Producción de Proteínas

�  Proceso largo y laborioso

�  Cada fase tiene muchos métodos de producción para elegir.

�  Upstream processing- Incluye la expresión de la proteína en la célula

�  Downstream processing- La proteína primero se separa luego se comprueba pureza y capacidad funcional y por último se desarrolla un medio estable para preservar la proteína.

Expresión de Proteína : Primera fase

�  Selección de la célula que se usará como fuente de proteína �  Microorganismos- Los más atractivos �  Hongos �  Células animales �  Células vegetales

Los microorganismos

�  Son los más atractivos �  Procesos de fermentación son bien conocidos �  Pueden cultivarse en grandes escalas en poco tiempo �  Se pueden alterar genéticamente �  Se pueden usar varios métodos de tecnología de DNA

recombinante para aumentar la producción de una proteína microbiana.

�  Um método es introdcucir copias adicionales del gen en la célula huésped.

�  Otro método es introducción del gen en el organismo cuando es colocado un control de expresión

Hay limitaciones….

�  Las proteínas generadas se producen en forma de proteína de fusión, lo que significa que la proteína está unida a una proteína bacteriana.

�  La mayoría de ls proteínas sintetizadas naturalmente son intracelulares. La proteína se acumula en forma insoluble en cuerpos de inclusión.

�  Limitaciones en el uso de microorganimos: �  Procariotas son incapaces de llevar algunos procesos

(Glucosilación)

Hongos

�  Son fuentes de muchas proteínas usadas en productos como los alimentos (pan) y cerveza .

�  Las proteínas naturales de algunos hongos se utilizan como fuente de alimentos como la levadura.

�  Son eucariotas y pueden realizar algunas modificaciones transcripcionales y pueden plegar proteínas humanas correctamente.

Plantas

�  Células vegetales también pueden ser un lugar de expresión proteíca.

�  85% de los fármacos actuales se pueden encontrar en plantas. �  Ej papaína (enzima proteolítica)- agente ablandador de

carne. �  Limitación: No todas las proteínas pueden ser expresadas en

una planta. �  Pared celular dificulta proceso de extración de proteínas.

Sistema de células de mamíferos

�  Requisitos nutricionales son más complejos que otros organismos.

�  Células crecen más lentas y se necesitan más células para sembrar en bioreactores.

�  Problemas de Contaminación.

�  A pesar de todas estas dificultades en muchos casos las células animales siguen siendo la mejor opción y en ocasiones la única, para ciertos productos.

Sistemas de producción en animales

�  Las células en cultivo no son la única opción cuando se usan células animales, en algunos casos los productores son animlaes vivos. �  Ej anticuerpos monoclonales (ratones)

�  Se inyecta antígeno a ratón y este secreta anticuerpo deseado.

�  Ej leche o huevos de animales transgénicos- Estos productos de animales contienen las proteínas del gen recombinante introducido y puede purificarse de las proteínas de estos productos.

Sistema de Insectos

�  Se usan técnicas que usan larvas de insectos.

�  Baculovirus (virus que infectan insectos) se están usando como vehículos para insertar DNA que haga que las células del insecto produzcan proteínas deseadas.

Bioreactores �  Los sistemas de cultivo celulares de gran volumen se

realizan en un sistema cerrado y estéril hasta que se recogen los productos.

�  Dentro del sistema se mantienen condiciones de oxígenos (gases), temperatura y pH.

Una vez producida una proteína empieza el

Downstream Processing

Métodos de purificación de proteínas

�  Primer paso recoger proteína

�  Si la proteína es intracelular, se recoge toda la célula si es extracelular, la proteína se excreta al medio de cultivo, que se recoge.

Preparación de Extracto para purificación

�  Proteína es intracelular �  Lisis celular �  Métodos físicos y químicos

�  Variación en temperaturas

�  Uso de detergetes �  Uso de ultrasonidos

�  Molición con bolas de cristal

Separación de los componentes del extracto (Concentración Inicial del producto)

�  Concentración puede ser lograda induciendo la precipitación usando sales ( Sulfato de amonio) o solventes (etanol, acetona ó dietil éter). �  En industria problema con sulfato.

�  El precipitado es colectado (centrifugación, filtración) y redisuelto en un pequeño volumen de buffer.

Métodos de separación

�  Centrifugación -Separa las moléculas. Con esta técnica las proteínas pueden aislarse en una sola capa.

�  También se pueden usar filtros de distintos tipos y tamaños para separar proteínas

�  En la filtración por membrana se usan fibras de nylon o otro material sintético para eliminar todos los restos celulares de la solución.

�  La microfiltración elimina los precipitados y las bacterias.

Ultrafiltración �  El método más común actualmente para lograr

concentrar el producto inicial.

�  Las membranas para estos procesos son lo suficientemente pequeños para retener proteínas de bajo peso molecular.

�  Las membranas de ultrafiltración con una masa molecular de retención de 1 a 300 kDa están disponibles comercialmente.

Ultrafiltración

�  Ultrafiltros son de acetato de celulosa o nitrato de celulosa.

�  Requisito para la manufactura de estos filtros es que el material utilizado tenga bajas propiedades de absorción por proteínas.

Ultrafiltración �  Este método se ha convertido en uno prominete para

la concentración de proteínas por varias razones: �  Tiene pocos efectos adversos sobre la bioactividad

de las moléculas de proteína. �  Tasas altas de recuperación con más de 99 %. �  Tiempos de procesamiento rápidos, en comparación

con otros métodos de concentración. �  Se requiere poco equipo auxiliar .

Pasos iniciales en todo proceso de purificación (liberan la proteína de

la célula)

Purificación Cromatográfica

Purificacion cromatografica �  Una vez la proteína es recobrada de su fuente y

concentrada debe ser purificada.

�  La purificación es lograda por cromatografías por columna.

�  Se refiere a la separación de diferentes tipos de proteínas : �  Se compone de dos fases: �  Una fase sólida estacionaria �  Una fase móbil �  La mayoría de las cromatografías son de

naturaleza de absorción. �  Retención selectiva

Cromatografía de Columna �  Se refiere a la separación de diferentes tipos de

proteínas de acuerdo a diferencias en fases. Una fase sólida y una fase movil.

Características de proteínas �  Tamaño

�  Forma

�  Carga

�  La presencia de grupos hidrofóbicos

�  Habilidad para unirse a varios ligandos

�  La combinación de dos a cuatro técnicas diferentes es empleada en un proceso típico de downstream. Flitración en gel y cromatografía de intercambio iónico son las más comunes.

�  Estos procesos son usualmente controlados por computadoras. Las columnas cromatográficas son de acero inoxidable.

�  Separación de procesos cromatográficos es efectuado generalmente a presiones bajas.

Técnica Base de separación

Intercambio iónico Diferencias en la carga de la superficie de la proteína a un pH.

Filtración de gel Diferencia en masa y forma de diferentes proteínas

Afinidad Basada en la interación entre una proteína y un ligando apropiado.

Interación hidrofóbica Diferencias en la hidrofobicidad de la superficie de la proteína.

“Chromatofocusing” Separa proteínas en base a su punto isoeléctrico.

Cromatografía por exclusión de tamaño (gel filtration)

Cromatografía por exclusión de tamaño (gel filtration)

�  Separa en base a formas y tamaño.

�  Se logra la separación percolando la solución de la proteína através de una columna empacada con una matriz porosa en gel en forma de cuentas (beads).

�  Proteínas grandes son eludidas. Las proteínas más pequeñas no son retenidas por tiempo igual. Mientras más pequeñas más tiempo son retenidas en la columna.

�  Estas geles tienden a usarse para separar proteínas de otras moléculas en orden de magnitud de su tamaño pequeño, y son a menudo usadas para remover componentes de amortiguadores de bajo peso y sales de soluciones proteícas.

�  A menudo son utilizado en etapas finales de procesos de purificación.

�  Pequeños volumenes deben sera aplicados a la columna para lograr resolución efectiva.

�  Requiere tiempo de procesamiento más largo.

Cromatografía de Intercambio Iónico

Cromatografía de Intercambio Iónico

�  Ácido aspártico y ácido glutámico tienen carga negativa mientras lisina, arginina y histidina tienen cargas positivas.

�  La carga neta que exhibe una proteína depende de la cantidad de los a.a. cargados en la proteína y en el pH de la solución de la proteína.

�  Un valor de pH sobre punto isoeléctrico (proteína exhibe carga negativa)

�  Esta cromatografía está basada en el principio de atracción electroestática reversible de una molécula cargada a una matriz sólida que contiene atada covalentemente grupos de cargas opuestas.

�  Las proteínas pueden ser eludidas alterando el pH o incrementando la concentración de sales en el amortiguador.

�  La mayoría de los proceso de purificación al menos emplean un paso de intercambio iónico (técnica cromatográfica más popular)

�  Menos costosa.

�  A pH fisiológico muchas proteínas exhiben una carga negativa.

�  Cromatografía de intercambio aniónico es la más usada.

Cromatografía de interación hidrofóbica

Cromatografía de interación hidrofóbica

�  Ocho de los veinte aminoácidos son hidrofóbicos por su naturaleza no polar de sus grupos (R).

�  La cromatografía de interacción hidrofóbica fracciona las proteínas por su diferencia en grado de hidrofobicidad. (Esto depende de la ocurrencia de interacciones hidrofóbicas entre los parchos hidrofóbicos de la superficie de las proteínas y los grupos hidrofóbicos covalentes atados a la matriz.

�  La separación de la proteína por interacciones hidrofóbicas depende de la interacción de la proteína, la matriz del gel y el solvente acuoso que rodea.

�  Incrementando la fortaleza iónica de una solución por la adicción de una sal neutral incrementa la hidropobicidad de las moléculas proteícas.

�  Columnas de interacción hidrofóbica son mejores si se aplican bajo condiciones de alta fortaleza iónica.

�  Mientras una proteína sea mas hidrofóbica más fuerte se enlaza.

Cromatografía de afinidad

�  Tiene una alta bioespecificidad, lo cual produce un alto grado de purificación.

�  Una gran variedad de ligandos pueden ser covalentemente enlazados a la matriz.

�  Elución de la proteína enlazada a una columna de afinidad es lograda por la alteración de la composición de los buffer de elución, de forma tal que la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado sea reducida grandemente.

�  Una gran variedad de interaciones no covalentes contribuyen a la interación proteína ligando. �  Cambios en el pH del buffer, fortaleza iónica, inclusión de

detergentes o agentes como el glicol de etileno pueden ser suficientes para eludir la proteína.

�  Cromatografía de afinidad ofrece muchas ventajas sobre métodos tradicionales.

�  La especificidad y selectividad no puede ser superada por otros procedimientos

�  Incrementa la pureza y tiene casi un 100% de producción

�  Incorporación de un paso de afinidad drásticamente reduce los pasos subsiguientes para lograr la purofocación del producto.

�  Reducción drástica de tiempo y dinero.

Limitaciones:

�  Ligando bioespecíficos son costosos y exhiben pobre estabilidad.

�  Técnicas son químicamente complejas, peligrosas , que consumen tiempo y dinero.

Enfoque isoeléctrico

�  Se usa a menudo en el control de calidad del proceso de purificación para identificar dos proteínas similares que son difíciles de separar por otros medios.

�  Cada proteína tiene un número específico de a.a. cargados en su superficie en lugares concretos. Cada proteína tiene una firma eléctrica única, conocida como su punto isoeléctrico (IEP).

�  Este IEP puede ser usado para separar proteínas cuyas demás características sean similares

Verificación

�  En cada paso del proceso de purificación es importante verificar la proteína.

�  Verificar que la proteína no se ha perdido y que los intentos de concentración han sido exitoso.

�  La SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) suele usarse para hacer estas comprobaciones. �  Se le añade SDS(detergente) a una muestra de mezcla de

proteinas y se calienta la mezcla. �  Las cargas del sulfato se distribuyen equitativamente en la

proteína desnaturalizada.

�  Se hace una separación dependiendo del tamaño (número de carga de las proteínas)

�  La muestra se carga en una matriz de gel especial (PAGE), donde forma una única banda en un lugar específico, según su tamaño y masa molecular.

�  Se añade un tinte azul (Tinción Azul de Coomasie) lo cual permite observar la banda coloreada que permite la comparación con un marcador de tamaño conocido.

�  Un método específico para la detección de proteínas es el Western Blotting

Conservación de la proteína

�  Liofilización (secado por congelación) �  En este proceso los cristales de hielo se subliman a vapor

de agua directamente sin pasar por el estado líquido. �  Se ha demostrado que la liofilización mantiene la

estructura proteíca y por esta razón es el método habitualmente elegido para conservar las proteínas biotecnológicas.