Etude histologique, cellulaire et moléculaire de la régénération

colonnes

1 2 3 4

Correction

Elucidation du protocole

cellule normale

cellules C2C12 (avec ou sans Flag)

protéine Msx1cellulemusculairedifférenciée

gène Msx1

Ac anti-Msx1

gène FlagAc anti-FlagFlag-Msx1

avant IP : colonne 1 (cellules exprimant seulement Msx1) : protéines présentes dans le noyau = histone H1, histone H3, Pol II, Msx1

colonne 2 (cellules exprimant Flag-Msx1) : mêmes protéines + Flag

après IP :colonne 3 : aucun spot car immunoprécipitation des seules protéines Flag-Msx1

colonne 4 :Anti-H1 : présence d’un spot = détection de H1 par les Ac anti-H1

Flag-Msx1 Ac anti-H1

H1

Anti-H3 : absence de spot = absence de détection de H3 par les Ac anti-H3 (marquage de H3 seulement si liaison à Msx1)

Anti-Pol II : absence de spot = absence de détection de Pol II par les Ac anti-Pol II

Anti-Flag et Anti-Msx1 : présence de spots = détection normale de Flag-Msx1 par les Ac anti-Flag et les Ac anti-Msx1

Msx1 se lie seulement à la protéine histone H1 mais ni à la protéine histone H3 ni à la Pol II : la liaison entre Msx1 et H1 semble

H3 libre Flag-Msx1 Ac anti-H3 (mis en présence de Flag-Msx1 exclusivement)

spécifique

suivant :

Correction

Msx1 entière (contrôle) ou avec délétions 1-42, 1-73 ou 1-104 : résultats identiques = pas d’effets des délétions situées en amont de l’acide aminé 105 sur la liaison de Msx1 sur l’ADN

délétion 1-138 : suppression de la répression transcriptionnelle de MyoD, de l’inhibition de la différenciation, de l’interaction avec H1 et de la liaison au CER région 105-139 nécessaire au rôle de Msx1 et à tous ses effets cellulaires = nécessité de l’intégrité de la région 105-139

délétion de l’homéodomaine et la partie en aval de celui-ci : effets identiques à la délétion 1-138 malgré le maintien de la région essentielle 105-139 la région 105-139 est nécessaire mais pas suffisante pour permettre à Msx1 d’assurer son rôle

Msx1-A (séquence des acides aminés de l’homéodomaine modifiée) : suppression de la répression transcriptionnelle de MyoD, de l’inhibition de la différenciation et de la liaison au CER mais maintien de l’interaction avec H1 interaction entre Msx1 et H1 nécessaire mais pas suffisante pour la liaison au CER, la répression transcriptionnelle de MyoD et l’inhibition de la différenciation

2 domaines de Msx1 sont nécessaires à la liaison de Msx1 à l’ADN :

- la région 105-139 qui permet la liaison au CER

- l’homéodomaine qui lie l’ADN grâce à l’histone H1

colonnes 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7

Correction

document A, pré-requis : l’histone H1 est nécessaire à l’inhibition de la différenciation des cellules musculaires

colonnes 3 et 6 : l’ARNi H1 inhibe l’expression de H1 de 50% ; la diminution de la quantité de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation des cellules musculaires

colonne 6 : la coexpression de Msx1 et de l’ARNi H1 entraîne une réduction de la production de H1 et donc une réduction de l’inhibition de la différenciation des cellules musculaires alors que…

colonne 5 : … la coexpression de Msx1 et de l’ARNi contrôle ne conduit à aucune diminution de la production de H1, ce qui permet la normale différenciation des cellules musculaires…

… ainsi, l’ARNi contrôle n’interfère en rien dans les mécanismes de contrôle de la différenciation des cellules musculaires

Msx1 nécessite la présence de l’histone H1 pour inhiber la différenciation des cellules musculaires

document B, pré-requis : MHC, chaîne lourde de la myosine, est un marqueur de la différenciation

colonne 3, construction Flag-Msx1 : absence de MHC = absence de différenciation (vérification du rôle inhibiteur de Msx1 sur la différenciation des cellules musculaires)

colonne 5, construction ARNi H1 : présence de MHC = différenciation cellulaire l’absence (ou la diminution de quantité) de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation cellulaire

colonne 6, construction Flag-Msx1 + ARNi contrôle : absence de MHC = absence de différenciation cellulaire Msx inhibe la différenciation car…

colonne 4, … construction ARNi contrôle : présence de MHC = différenciation cellulaire pas d’effet propre de l’ARNi

colonne 7, construction Flag-Msx1 + ARNi H1 : présence de MHC = différenciation cellulaire la suppression (ou la diminution de la quantité) de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation des cellules musculaires

Msx1 nécessite la présence de l’histone H1 pour inhiber la différenciation des cellules musculaires