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NATURE NEUROSCIENCE | ARTICLE

K Jeffrey Huang, Andrew Jarjour A, Oumesmar Nait Brahim, Kerninon Christophe, Anna Williams, Krezel Wojciech, Kagechika Hiroyuki, Julien Bauer,Zhao Chao, Anne Baron-Van Evercooren, Pierre Chambon, Charles ffrench-Constant & Franklin JM Robin

Nature Neuroscience (2010) doi: 10.1038/nn.2702Reçu 09 Juillet 2010 Accepté 21 Octobre 2010 Publié en ligne 05 Décembre 2010

RésuméLa base moléculaire de la régénération de la myéline du système nerveux central (remyélinisation) est mal comprise. Nous avons généré une transcription profilcomplet de la phases distinctes de la remyélinisation spontanée qui suivent une démyélinisation focale dans le SNC de rat et a constaté que les transcriptions quicodent les récepteurs RXR rétinoïdes acide-γ ont été exprimés de manière différentielle au cours de la remyélinisation. Les cellules de la lignée des oligodendrocytesexprimé RXR-γ dans les tissus des rats qui étaient en cours de la remyélinisation et active et remyélinisés lésions de sclérose en plaques. Renversement de RXR-γpar interférence ARN ou antagonistes spécifiques RXR sévèrement inhibée différenciation des oligodendrocytes en culture. Chez les souris qui n'avaient pas RXR-γ,adultes cellules précurseurs d'oligodendrocytes efficacement repeuplée après lésions de démyélinisation, mais a montré une différenciation retardée enoligodendrocytes matures. L'administration de l'agoniste RXR 9 - cis-acide rétinoïque à démyélinisés cultures tranche cérébelleux et à des rats âgés, après unedémyélinisation a provoqué une augmentation dans les axones remyélinisés. Nos résultats indiquent que RXR-γ est un régulateur positif de la différenciation desprécurseurs des cellules endogènes des oligodendrocytes et la remyélinisation et pourrait être une cible pharmacologique pour le traitement de régénération dans leSNC.

IntroductionSuite à une démyélinisation aiguë dans le SNC, les cellules précurseurs des oligodendrocytes adultes (OPC) peuvent migrer vers le domaine de la blessure, sedifférencier en oligodendrocytes et de restaurer la gaine de myéline 1 , 2 , 3 . Toutefois, ce processus naturel de régénération, la remyélinisation spontanée ou, estlimitée dans les maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques 4 , 5 , en partie en raison de l'échec des OPC adultes à se différencier en oligodendrocytesmyélinisantes 6 , 7 , 8 . The failure to restore CNS myelin after injury compromises the integrity of axons and leaves them vulnerable to degeneration 9 . Although thegenes that regulate the proliferation and differentiation of OPCs during development have been intensively studied, relatively little is known about the molecular signalsthat regulate the function of adult OPCs after demyelination. The identification of key signaling networks associated with remyelination would improve ourunderstanding of how OPCs respond to injury, and help researchers to identify pharmacological targets for the development of regenerative therapeutics that couldencourage myelin regeneration 10 , 11 .

gamma récepteur de rétinoïde X signalisation accélère la remyélinisation du SNC: Nature Neuroscienc... http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=fr&ie=UTF-8&sl=en&tl=fr&u=http://www.natur...

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Nous avons utilisé un réseau bien établi et hautement traitable toxine induit une démyélinisation méthode chez des rats 12 , combiné avec microdissection par capturelaser (LCM) et l'analyse des microréseaux de lésions isolées de manière sélective, pour générer un transcriptome complet des étapes distinctes de la remyélinisationspontanée CNS. Nous avons constaté que la transcription qui code RXR-γ a été sensiblement régulés à la hausse au cours de la phase de régénération de laremyélinisation et nous avons détecté-γ expression RXR en cellules de la lignée des oligodendrocytes dans remyélinisantes lésions dans le SNC de rat et de tissusprovenant de personnes avec la sclérose en plaques. En utilisant des méthodes de manipulation pharmacologique et génétique, nous avons constaté que l'activationde RXR stimule la différenciation des oligodendrocytes pour améliorer la remyélinisation. RXR de signalisation représente donc une cible thérapeutique derégénération pour promouvoir la remyélinisation du système nerveux central dans le cerveau démyélinisés.

RésultatsAugmentation de transcriptions RXRG dans le SNC remyélinisantes lésionsNous induite demyelinations focal dans la région caudale de rats (inférieure) pédoncule cérébelleux (CCP) 12 et isolées des tissus lésés à 5, 14 et 28 jourspost-lésion (DPL) LCM aide. Pour l'analyse par microréseau, nous avons utilisé trois rats lésés par point de façon indépendante le temps de fournir trois répétitionsbiologiques. Nous hybride ARN marqué sur la puce Illumina Rat RefSeq, qui contient plus de 22.000 gènes, et les a analysées en utilisant les BeadStudio Illumina etd'outils statistiques R (luminaires, limma et forfaits fspma). Nous avons identifié 8.754 gènes qui ont été exprimés de manière différentielle (3197 gènes avec P<0,05) au cours des trois points de lésion temps-post ( Fig. 1a et supplémentaire Tableau 1 ). Les gènes qui ont été les plus fortement exprimées à 5 dplcomparativement à 14 ou 28 dpl ont été associées à l'inflammation, y compris MMP7, CXCL13 et Arg1, alors que les gènes qui ont été le plus fortement exprimé à14 dpl contre 5 dpl ont été associés à la myélinisation, y compris Tspan2 , Mal, lpar1 (également appelé EDG2), MOBP et Mog (P <0,05; figure 1b. ). En effet, uneanalyse des gènes connus impliqués dans la myélinisation révélé que la plupart ont montré une expression accrue de 14 ou 28 dpl contre 5 dpl ( Fig. 1c ). Nous avonségalement constaté que les gènes qui sont spécifiques à la lignée OPC, comme Nkx2-2 et Myt1, ont montré une diminution d'expression de 14 dpl contre 5 dpl, cequi suggère que la population OPC se sont différenciées en oligodendrocytes de 14 dpl.

Figure 1: Expression différentielle des RXRG dans transcriptome remyélinisation du SNC.


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(A) Une classification hiérarchique et de l'analyse graphique des gènes exprimés différentiellement à 5, 14 et 28 dpl (P <0,05). (B) Dix régulés à la hausse la plupart des gènes àchaque instant par rapport aux points un autre moment. (C) Analyse graphique montrant les expressions différentielle des gènes connus associés à la myélinisation (P <0,05). (D)


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Les cinq ensemble des fonctions physiologiques dans les lésions à 5, 14 et 28 dpl en utilisant l'analyse des voies d'Ingenuity gènes surexprimés partir de chaque point du temps.(E) graphique Volcano (axe des x = log FC à 14 dpl comparativement à 5 dpl; axe y = log P) montrant très gènes différentiellement exprimés associées à des gènesmyélinisation RXRG. (Triangle vert; x, y = 3,3752, 2,7084) est présenté comme une transcription fortement exprimée à 14 dpl comparativement à 5 dpl. (F) en temps réel dedétection de qPCR Rxra, RXRB et d'expression RXRG de laser des lésions capturés au cours de la remyélinisation (n = 3). RXRG est à peine détectable dans les CCP non-léséset à 5 dpl, et fortement exprimé à 14 et 28 dpl . (G) L'hybridation in situ montre une augmentation significative de RXRG + cellules au sein du PCC à 14 et 28 dpl dpl par rapportaux non-lésés et 5 dpl CCP. La barre d'échelle, 50 um. (H) Quantification des RXRG + cellules lésées CCP à 5, 14 et 28 dpl (n = 3 par unité de temps). Moyenne ± SEM sontprésentés. * P <0,05, * * * P <0,001, ANOVA à un facteur.

Nous avons ensuite effectué l'analyse des voies d'ingéniosité (IPA) en présentant la liste des gènes différentiellement exprimés ont été compris entre 5 et 14 dpl etentre 14 et 28 dpl à élucider la physiologie générale de la remyélinisation et active les voies de signalisation associées à chaque point le temps de régénération. Letop physiologiques réseaux des systèmes à 5 dpl, à base de gènes qui a montré une expression plus élevée de 5 à 14 dpl que dpl, portait sur la réponse immunitaire,ce qui indique la présence d'une inflammation active ( Fig. 1d et supplémentaire Tableau 2 ). En outre, les réseaux haut à 14 et à 28 dpl, à base de gènes ont étéactivés à 14 dpl contre 5 dpl et à 28 contre 14 dpl dpl, participent au développement du système nerveux et la fonction, avec une diminution de la réponseimmunitaire, ce qui indique que l'activité a augmenté la remyélinisation. Les voies les plus importantes (P <0,001) qui ont été détectés à 5 dpl ont été associées àl'inflammation et les activités des macrophages, comme le Fc γ-médiation phagocytose des récepteurs dans les macrophages ou des monocytes et l'interleukine designalisation, tandis que les voies de signalisation les plus importantes (P <0,001) à 14 dpl étaient liés au métabolisme cellulaire et la prolifération ou ladifférenciation; ces incluse inositol phosphate dans le métabolisme et la signalisation Notch voies ( supplémentaire Tableau 3 ). Ces résultats montrent que lasignature moléculaire globale de la remyélinisation du système nerveux central implique distinctes et dans le temps réglementées les voies de signalisation qui sontcaractérisées par une inflammation active à 5 dpl et par l'ouverture de la remyélinisation à 14 dpl.

Pour identifier les gènes qui sont potentiellement impliqués dans la remyélinisation du SNC, nous avons effectué une analyse du tracé de volcan en traçant l'évolutionde pliage (log FC) des gènes qui ont été exprimés de manière différentielle entre 5 et 14 dpl contre leur signification (log P). Nous faisons l'hypothèse, sur la basede notre analyse du transcriptome, que les voies de gènes qui sont régulés à la hausse ou enrichi à 14 dpl stimuler la remyélinisation (qui est, la différenciation OPC).Nous avons trouvé que le récepteur gamma X rétinoïde (RXRG) a été l'un des gènes régulés à la hausse de manière significative d'au plus 14 dpl (log = 3,375 FC;log P = 2,708) et en cluster avec de nombreux gènes qui sont impliqués dans la myélinisation ( figure 1e. et le tableau supplémentaire 4 ). RXR-γ et les membresd'autres RXR, RXR-RXR α et β-, sont des récepteurs nucléaires qui fonctionnent grâce à l'association hétérodimères avec d'autres récepteurs nucléaires, tels queles récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR), récepteurs des hormones thyroïdiennes, récepteurs de la vitamine D (VDR), peroxisome proliferator activateur desrécepteurs (PPAR) et le foie récepteurs X (LXR) pour réguler la prolifération cellulaire, la différenciation et l'apoptose 13 . Rxra et RXRB ont également été exprimésde manière différentielle au cours des trois temps lésion points-poste dans notre transcriptome remyélinisation, bien que la différence dans l'expression a été plusfaible que pour RXRG. Nous avons également détecté l'expression différentielle de gènes qui s'hétérodimériser avec RXR 14 , y compris Thra, THRB, Nr1h3 (LXRα), Nr2f1 (COUP-TFI) et NR4A2 (Nurr1), qui soutient l'idée que RXR de signalisation est impliqué dans la remyélinisation ( supplémentaire Tableau 5 ). Par ailleurs,l'IAP sur la liste complète des gènes différentiellement exprimés par les trois points de lésion temps-post a montré que les voies de signalisation associées à RXRont été enrichies ( Tableau 1 , Fig supplémentaire. 1 et supplémentaire Tableau 6 ), ce qui suggère que RXR de signalisation est très actif dans les lésions et pourrait

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contribuer à la remyélinisation.

Tableau 1: Les gènes associés à RXR de signalisation au cours de la remyélinisation

Pour valider RXR expression dans la remyélinisation, nous avons effectué en temps réel en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) en ARNm transcrit inverseisolé de non-lésés CCP et les contreparties centrales lésées à 5 dpl, 14 et 28 dpl dpl par LCM ( Fig. 1f ). L'expression de Rxra, RXRB et RXRG était compatibleavec leur expression différentielle in silico. En particulier, RXRG était à peine exprimée à 5 dpl, mais a montré une expression accrue de façon marquée (de près dehuit fois) à 14 dpl et est resté fortement exprimée à 28 dpl. En outre, dans l'analyse d'hybridation in situ des cerveaux de rat démyélinisés focalement a montré quela densité de RXRG cellules exprimant des lésions a été au moins 3 fois supérieure à 14 et 28 dpl qu'à 5 dpl ( Fig. 1g, h ), soutenant l'idée qu'il a été activementexprimé au début de la remyélinisation.

-Γ expression RXR en cellules de la lignée des oligodendrocytesL'environnement est composé de la remyélinisation des axones démyélinisés, OPC adultes activé, oligodendrocytes régénéré, la microglie et les macrophages et lesastrocytes réactifs 15 . Pour déterminer les cellules exprimé RXR-γ, nous avons effectué des analyses sur le rat immunfluorescence cerveaux démyélinisésfocalement. RXR-γ a été détecté principalement dans le cytosol des macrophages exprimant le marqueur ED1 + ( Fig. 2a ) et rarement dans les astrocytes réactifs (Fig. 2b ). Nous avons également constaté RXR-γ dans le cytosol des Nkx2.2 + OPC ( Fig. 2c ) et dans les noyaux des oligodendrocytes + CC1 ( Fig. 2d ), ce quisuggère qu'il pourrait être transporté d'influencer la différenciation OPC. Dans la substance blanche lésée-non, RXR-γ a été faiblement détectable dans CC1 +

oligodendrocytes ( Fig. 2e ). En lésé matière grise non, RXR-γ a été le plus fortement exprimé dans les neurones, comme dans le striatum ( Fig. 2f ). Ces résultatsconfirment que RXR-γ est fortement exprimé dans l'environnement blessés. Pour déterminer quel pourcentage de RXR-γ + cellules dans les lésions sont des cellulesde lignée oligodendrocytes, nous avons réalisé l'hybridation in situ contre RXRG suivie par la coloration immunoperoxydase utilisant des anticorps à la lignée Olig2marqueur des oligodendrocytes ( supplémentaire Fig. 2 ). cellules de la lignée Oligodendrocyte (Olig2 + RXR-γ +) ont représenté environ 8,7% du RXR-γ + cellules à5 dpl, 21,5% à 14 dpl et 25,5% à 28 dpl ( Fig. 2g ), ce qui suggère que la plupart des RXR-γ + cellules pourraient être des macrophages. Lorsque nous avonsquantifié RXR-γ + oligodendrocytes dans les lésions, nous avons constaté que le nombre de RXR-γ + + CC1 cellules augmenté de façon significative de 5 à 14 dpl dplet 28 dpl (P = 0,0022), ce qui suggère que la différenciation des OPC a augmenté dans les lésions plus temps ( Fig. 2h ).

Figure 2:-γ expression RXR par cellules de la lignée des oligodendrocytes.


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(A - d) Co-immunomarquage de RXR-γ (rouge) et (en vert) ED1 (a), GFAP (b), Nkx2.2 (c) ou CC1 (d) dans les lésions à 14 dpl. (E) Faint, la détection cytosolique de RXR-γ + +


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CC1 oligodendrocytes dans lésé substance blanche non-. (F) RXR-γ + neurones du striatum. Les noyaux ont été visualisées avec Hoechst (bleu). La barre d'échelle, 25 um. (G)Quantification des Olig2 total + γ + oligodendrocytes lignée des cellules-RXR par rapport au nombre total de RXR-γ + dans les lésions des cellules du PCC à 5, 14 et 28 dpl. (H)Quantification des RXR-γ + + CC1 oligodendrocytes dans les lésions CCP à 5, 14 et 28 dpl. (I - k) de détection de RXR-γ (vert) en cellules de la lignée des oligodendrocytes àpartir OPC / co-cultures de neurones DRG à 2, 6 et 7 j en co-culture. cellules de la lignée Oligodendrocyte ont été immunomarquées avec O4 (rouge), les axones avecanti-neurofilaments (NF, bleu) et des noyaux visualisées avec Hoechst (violet). La barre d'échelle, 60 um. Moyenne ± SEM sont indiqués;. * P <0,05, * P <0,01 *, * * P <0,001ANOVA à un facteur.

Il ya plusieurs éléments de preuve que RXR-γ pourraient être impliquées dans la remyélinisation. Après contusions de la moelle épinière, les trois membres du RXRactivement exprimé dans le cytosol de la microglie réactive, les neurones, les astrocytes et des oligodendrocytes, ce qui suggère que RXR de signalisation estimpliqué dans la réponse des blessures de la CNS endommagé 16 . En outre, seuls RXR-γ a été trouvé à la translocation du cytosol vers le noyau desoligodendrocytes après une blessure 16 . Nous avons également effectué une recherche de base de données à travers l'analyse détaillée des dernières puces à ADNpurifié de cellules de la lignée des oligodendrocytes et constaté que RXR-γ est sensiblement enrichi en purifié OPC 17 . Pour confirmer que l'expression nucléaire deRXR-γ est en corrélation avec la différenciation OPC et la myélinisation, nous avons effectué des analyses sur immunocoloration purifié co-cultures de OPC et leganglion de la racine dorsale (DRG) neurones. Au bout de 2 j en co-culture, nous avons détecté RXR-γ se situe principalement dans le cytosol des cellulesprécurseurs des oligodendrocytes organismes et les processus ( Fig. 2i ). Toutefois, comme ces cellules différenciées et a commencé à myeliniser, RXR-γ n'est plusdétecté dans le processus et est devenu Réservé aux corps cellulaires et des noyaux ( Fig. 2j, k ), ce qui suggère que RXR-γ redistribue vers le noyau au cours de ladifférenciation OPC .

-Γ expression RXR dans les lésions de sclérose en plaquesPour examiner γ-expression de RXR dans les lésions de sclérose en plaques, nous avons effectué des analyses sur immunocoloration congélation rapide mortem ducerveau sections post de personnes choisies au hasard avec la sclérose en plaques, y compris progressive secondaire (deux cas) et forme rémittente-récurrente (uncas) et de trois non neurologique contrôles ( supplémentaires Tableau 7 ). Dans les frontières actives de lésions de sclérose en plaques, nous avons trouvéγ-expression de RXR dans le noyau ou le cytosol des cellules de la lignée des oligodendrocytes ( Fig. 3a-d ). Quantification des RXR-γ + cellules de ces lésions amontré que 84,5 ± 5,7% de ces cellules exprimaient Olig1 dans le noyau, ce qui indique que RXR-γ est exprimé par les OPC activés qui ont probablement migré versdes lésions en réponse à une démyélinisation dans la sclérose en plaques. Nous avons également constaté RXR-γ dans les microglies activées ou des macrophages( Fig. 3e ) et les astrocytes réactifs ( Fig. 3f ).

Figure 3: Expression de RXR-γ dans les lésions de sclérose en plaques.


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(A - f) Co-immunomarquage pour RXR-γ (vert) et (en rouge) MOG (a), SOX10 (b), Olig1 (c), NOG0-A (d), CMHII (e) ou GFAP (f ) dans de multiples domaines lésion activesclérose. Les noyaux ont été visualisées avec Hoechst (bleu). (G) Luxol rapide coloration au bleu puis-CMHII immunoperoxydase anti étiquetage montrant une lésion typiquechroniques multiples scléroses active avec la frontière active (A) et chroniques de base inactive (C), ainsi que la plaque-substance blanche péri (PPWM). (H) Quantification desRXR-γ nucléaire et cytoplasmique des cellules + dans les lésions de sclérose en plaques révèle nettement plus nucléaires RXR-γ + cellules de lésions actives, PPWM et plaquesombre remyélinisés (RM), comparativement à des lésions chroniques inactifs et blanc normal question figurant (WM ) à partir de cas non-neurologiques. barres d'échelle: a - f, 50pm; g, 2 mm. Moyenne ± SEM sont indiqués;. * P <0,05 *, * * P <0,001 ANOVA à un facteur.

Pour déterminer la densité des cellules qui ont exprimé RXR-γ dans les zones actives et inactives de dommages, nous avons utilisé Luxol fast blue (LFB) coloration


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des coupes de cerveau de personnes atteintes de sclérose en plaques suivie par la coloration immunoperoxydase avec les macrophages ou des monocytes CMHIImarqueur pour différencier les frontière active (LFB + CMHII +) de la base inactive chronique (LFB - CMH +) des lésions ( figure 3g. ). Nous avons également quantifiéle nombre de RXR-γ + cellules de la substance blanche-plaque péri (PPWM) autour de la lésion, dans une lésion plaque ombre remyélinisés, et dans le contrôled'apparence normale de la substance blanche du neurologiques cas non. Les lésions actives et PPWM contenait une plus grande densité de manière significative(lésions actives par rapport au contrôle: P <0,001; PPWM contrôle vs: P <0,05) de RXR-γ + cellules de la substance blanche ne contrôle ( Fig 3h. ). En revanche, leslésions chroniques de base inactive contenait significativement moins de RXR-γ + cellules (P <0,05) que n'a d'apparence normale de la substance blanche. Nousavons également détecté beaucoup plus que l'expression nucléaire RXR-γ cytoplasmique dans les lésions actives, PPWM et la plaque ombre remyélinisés (> 4 fois)que dans les chroniques cœurs inactifs. Contrairement aux lésions de sclérose en plaques, nous avons détecté plus que l'expression cytoplasmique RXR-γ nucléaires(> 2 fois) dans la substance blanche de contrôle, ce qui suggère que RXR-γ peut être séquestré dans le cytoplasme des cellules différenciées en phase terminaledans le SNC adulte normal . La détection de γ nucléaires RXR-dans les lésions actives, la plaque d'ombre et PPWM suggère que ces sont des zones de hauteactivité cellulaire qui pourraient être associés à la réparation. En outre, l'expression diminuée de RXR-γ dans les lésions chroniques inactives est bien corrélée avec ladépréciation de la remyélinisation dans les étapes progressives de sclérose en plaques, et soutient donc l'idée que RXR de signalisation est impliquée dans laréparation des axones du SNC démyélinisés.

RXR-γ-de-fonction altère la perte de la différenciation OPCPour déterminer si RXR-γ régule la différenciation des OPC, nous avons transfecté OPC culture avec les non-ciblage des petits ARN inhibiteurs (siRNA) et decontrôle ( Fig. 4a ), siRNA contre Rxra ( Fig. 4b ) ou siRNA contre RXRG ( . Fig 4c ). Après 72 h en milieu de différenciation, les oligodendrocytes qui ont ététransfectées avec RXR-γ siRNA étaient moins différenciés morphologiquement que les témoins. Nous immunocolorées cellules de la lignée des oligodendrocytes enutilisant l'anticorps monoclonal O4, qui reconnaît à la fois les oligodendrocytes immatures et différenciés, et un anticorps contre la protéine de myéline (MBP), quimarque seulement oligodendrocytes différenciés. Nous avons ensuite déterminé l'état de différenciation des cellules de la lignée des oligodendrocytes sur la base deleur morphologie telle que définie par une excroissance de processus multiples (simple), excroissance vaste processus et la ramification (complexes) et d'expansion àmembrane terminal (membrane; figure 4d. ). Contrôle non-ciblage des siRNA n'a pas d'influence sur la différenciation OPC, les pourcentages de O4 +

oligodendrocytes avec, complexe ou simple membrane morphologies semblent similaires à ceux de la maquette, non transfectées oligodendrocytes ( Fig. 4d ). Enrevanche, les cellules transfectées avec des siRNA-γ RXR montré une augmentation significative dans les oligodendrocytes affichage morphologies simple (P<0,001) et une diminution de ceux qui ont des morphologies membranaires (P <0,001), indiquant une incapacité à atteindre une différenciation efficace. Nous avonségalement constaté que moins de cellules transfectées de façon significative avec les α-siRNA RXR a + membrane feuilles MBP (P <0,05), mais pas aussi peu queles cellules transfectées avec des siRNA-γ RXR. En outre, le pourcentage de cellules MBP + a diminué de plus de 30% dans les cellules transfectées avec RXR-RXRα ou γ-siARN par rapport aux témoins ( supplémentaire Fig. 3 ). l'analyse a révélé que Immunostaining cellules de la lignée des oligodendrocytes exprimée à la foisRXR-RXR α et γ-mais guère de RXR-β dans la culture ( supplémentaire Fig. 3 ). analyse par Western blot a confirmé que les siRNA spécifiquement renverséexpression de RXR-RXR α et γ-, respectivement, et ne pas interférer avec l'expression des membres d'autres RXR ( Fig. 4e et complémentaire Fig. 4 ). Cesrésultats suggèrent que les RXR-RXR α et γ-sont impliquées dans la stimulation de la différenciation des oligodendrocytes.

Figure 4: Perte de la fonction γ-RXR altère la différenciation des oligodendrocytes.


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(A - c) les OPC purifiée transfectées avec les non-ciblage des siRNA (a), RXR α siRNA (b) et γ-siRNA RXR (c) et visualisées avec O4 (rouge) et des anticorps à la PBM (vert)après 72 h dans la différenciation moyennes. La barre d'échelle, 25 um. (D) les critères morphologiques pour l'état de maturation des oligodendrocytes différencier défini comme,complexe ou simple membrane morphologies. Les cellules transfectées avec des siRNA-γ RXR entraîné pourcentage a augmenté de + O4 oligodendrocytes avec desmorphologies simple et a diminué le pourcentage de morphologies membranaires complexes par rapport à la maquette traités et non-ciblage des cellules transfectées siARN. (E)par Western blot montre la spécificité de RXR-α ou γ-passes rabattues RXR. La position des étalons de poids moléculaire (en kilodaltons) est indiquée sur la gauche. Longueur


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blot complet présenté en supplémentaire Figure 4 . C, non transfectées de contrôle; M, maquette transfectées; NT, non-ciblage siRNA; RXR α, β, γ, RXR α, β ou γ siRNA. (F, g)ventrale lésions de la moelle épinière des RXRG + / - (f) et RXRG - / - (g) des souris colorées avec des anticorps de CC1 (vert) et Olig2 (rouge) 15 jours après la démyélinisation.Noyaux visualisées avec Hoechst (bleu). (H) Quantification des cellules de la lignée des oligodendrocytes à 15 et 30 dpl montre pas de différence dans la densité du total Olig2 +

cellules entre homozygotes et hétérozygotes souris mutantes, mais une réduction de CC1 + cellules et une augmentation Nkx2.2 + dans les lésions de cellules homozygotes parrapport hétérozygotes pour des souris mutantes. La barre d'échelle, 50 um. Moyenne ± SEM sont indiqués;. * P <0,05, * P <0,01 test t de Student.

Previous studies have shown that mice that lack RXR- γ show no gross abnormalities during development and are viable after birth 18 . However, as adults thesemutants show thyroid hormone resistance, changes in metabolic activity and depressive behaviors mediated by reduced dopaminergic signaling 19 , 20 , 21 , whichsuggests that RXR- γ regulates homeostatic functions in the adult CNS. To determine whether CNS remyelination requires RXR- γ , we performed focal demyelinationon Rxrg −/− mice by injecting lysolecithin into the spinal cord ventral funiculus of adult mice and analyzed spinal cord lesions at 15 and 30 dpl. At 15 dpl, the density ofED1 + macrophages or activated microglia, GFAP + reactive astrocytes and Olig2 + oligodendrocyte lineage cells were not substantially different in the lesions ofRxrg −/− mice compared with controls ( Fig. 4f–h and Supplementary Fig. 5 ), which suggested that RXR- γ was not required for the recruitment of these cells intolesions. Moreover, there was no obvious difference between the two groups regarding oligodendrocyte lineage cell survival in lesions ( Supplementary Fig. 5 ). Bycontrast, we found a significant reduction ( P = 0.0094) in the number of CC1 + oligodendrocytes in the lesions of Rxrg −/− mice compared with controls ( Fig. 4f–h ).However, this decrease appeared to be transient as by 30 dpl the number of CC1 + cells in lesions in Rxrg −/− mice had increased almost to the level seen in controlmice ( Fig. 4h ). We also detected more Nkx2.2 + OPCs in Rxrg −/− mice than in controls at 15 and 30 dpl, suggesting that OPCs were less efficient at differentiatinginto oligodendrocytes in the absence of RXR- γ . We next performed semi-thin resin section analysis and found no obvious difference in remyelination between Rxrg−/− and control mice at 30 dpl ( Supplementary Fig. 5 ). These results suggest that the loss of RXR- γ impairs OPC differentiation after demyelination, but also thatcompensatory mechanisms might eventually overcome the absence of RXR- γ signaling to regenerate myelinating oligodendrocytes.

RXR antagonists inhibit OPC differentiationTo abolish all RXR activity, we treated OPC cultures with a synthetic RXR-selective antagonist (HX531 or PA452) 22 ( Fig. 5 ). After 72 h, we immunostainedoligodendrocyte lineage cells with O4 antibody and antibody to MBP, and determined their differentiation states from their morphologies ( Fig. 5a ). Compared tountreated or control cultures ( Fig. 5b ), increasing concentrations of HX531 ( Fig. 5c ) or PA452 ( Fig. 5d ) resulted in oligodendrocyte lineage cells displaying moresimple morphologies and fewer membrane morphologies ( Fig. 5e ). Moreover, the percentage of total MBP + oligodendrocytes decreased in cells treated with eitherantagonist compared to controls ( Supplementary Fig. 6 ), suggesting that RXR antagonists inhibited oligodendrocyte differentiation. We did not find a substantialdifference in the number of oligodendrocyte lineage cells undergoing apoptosis between antagonist-treated and control cultures ( Supplementary Fig. 7 ), indicatingthat RXR antagonists do not influence the survival of these cells and were not toxic at the concentrations analyzed.

Figure 5: Rexinoids influence oligodendrocyte differentiation and myelination.


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( a – d ) OPC cultures immunolabeled with antibodies to O4 (red) and MBP (green) after RXR antagonist treatment for 72 h. Compared to non-treated cells ( b ), treatment withHX531 ( c ; 2 μM) or PA452 ( d ; 5 μM) resulted in fewer mature oligodendrocytes. La barre d'échelle, 25 um. ( e ) Increasing antagonist concentration resulted in decreasingnumber of membrane sheet-bearing oligodendrocytes. ( f – j ) Oligodendrocyte-DRG co-cultures maintained for 10 d after addition of OPCs immunolabeled with anti-MBP (green),anti-Caspr (red) and anti-NFH (blue). ( g ) Control co-culture; ( h ) HX531 (2 μM); ( i ) PA452 (5 μM); ( j ) 9cRA (50 nM). Scale bar, 100 μm. ( k , l ) Increasing antagonistconcentration resulted in decreased MBP + oligodendrocytes ( k ) and less myelination ( l ). ( m – p ) OPC cultures labeled with O4 (red) and anti-MBP (green). ( m ) Untreated; (n ) 9cRA alone; ( o ) 9cRA and HX531; ( p ) 9cRA and PA452. La barre d'échelle, 25 um. ( q ) Quantification showing that 50 nM 9cRA increased mature oligodendrocytemembranes, and low concentrations of HX531 and PA452 were sufficient to abrogate 9cRA-mediated differentiation. ( r ) Treatment of cultured OPCs with 9cRA, HX630 or PA024resulted in increased oligodendrocyte membrane sheets. Mean ± sem are shown. * P < 0.05 versus control, * * P < 0.005 versus control, † P < 0.05 versus 50 nM 9cRA, † † P <0.005 versus 50 nM 9cRA; Student's t test.

The observation that RXR signaling is required for the differentiation of oligodendrocyte lineage cells in purified OPC cultures raises the question of whether it alsopromotes myelin formation. We addressed this question by manipulating RXR signaling in co-cultures of OPCs and DRG neurons. We quantified myelination by MBP+ oligodendrocyte-axon contact (contacting), oligodendrocyte membrane extension on axons (extending) or myelin compaction based on elongated oligodendrocytemembranes over Caspr + paranodal clusters (wrapping; Fig. 5f ). Compared to control ( Fig. 5g ), administration of HX531 ( Fig. 5h ) or PA452 ( Fig. 5i ) to theco-cultures resulted in a concentration-dependent increase in the number of contacting oligodendrocytes and a marked reduction in the percentage of myelinatingoligodendrocytes ( Fig. 5k ). To determine whether decreased myelination was caused by failed oligodendrocyte differentiation or a potential decrease in the numberof axons, we calculated the percentage of neurofilament-labeled (NFH + ) axons that were myelinated. The percentage of myelinated axons with respect to total NFH+ axons in the culture decreased substantially when either antagonist was added to the culture medium ( Fig. 5l ), suggesting that oligodendrocytes were stalled at


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the premyelinating stage. These results indicate that RXR signaling in oligodendrocytes is necessary for efficient myelination.

9- cis -retinoic acid improves CNS remyelination9- cis -retinoic acid (9cRA), an isomer of the vitamin A-derived all- trans retinoic acid, is a known ligand for RXR activation 23 . It has been shown to activatetranscription of the gene that encodes MBP 24 , which suggests that RXR signaling may promote OPC differentiation. To assess the role of 9cRA in OPCdifferentiation, we treated OPC cultures with 50 nM 9cRA for 48 h ( Fig. 5 ). As thyroid hormone can influence RXR signaling, we omitted triidothyronine and thyroxinefrom the culture medium. Compared to control or untreated cultures ( Fig. 5m ), cultures treated with 9cRA had a higher percentage of MBP + membrane sheets (Fig. 5n,q ), which suggests that 9cRA promotes OPC differentiation. However, 9cRA can activate both RXRs and retinoic acid receptors (RARs) 23 . To confirm that9cRA promoted OPC differentiation through RXRs, we administered 9cRA with the RXR antagonists HX531 ( Fig. 5o ) or PA452 ( Fig. 5p ) to OPC cultures. A lowconcentration of antagonist (0.1 μm HX531 or 0.1 μm PA452) was sufficient to abrogate 9cRA-induced OPC differentiation, and increasing concentrations of eitherantagonist in the presence of 9cRA further decreased the percentage of mature oligodendrocyte membranes ( Fig. 5q ), consistent with the idea that 9cRA stimulatesOPC differentiation through RXR signaling. To confirm that RXR activation stimulates OPC differentiation, we treated OPC cultures with the selective RXR agonistsHX630 or PA024 (refs. 25 , 26 ). Both agonists increased the elaboration of membrane sheets by cultured oligodendrocytes, consistent with the response of thesecells to 9cRA treatment ( Fig. 5r ). We also examined the effect of 9cRA on myelinating co-cultures but did not observe a significant increase in myelination ( P > 0.2;Fig. 5j,l ), which indicates that either endogenous activation of RXR signaling was sufficient to achieve maximal oligodendrocyte differentiation by 10 d in co-culture, or50 nM 9cRA was insufficient to increase differentiation from OPCs.

To find out whether activation of RXR signaling would promote CNS remyelination, we tested the effects of 9cRA on ex vivo demyelinated cerebellar slice cultures (Fig. 6 ). Mouse cerebellar slice cultures were treated overnight with lysolecithin after 14 d in vitro as described in rats to induce demyelination 27 . Cultures were thenmaintained in medium alone ( Fig. 6a ), 9cRA ( Fig. 6b ), the antagonists HX531 ( Fig. 6c ) or PA452 ( Fig. 6d ). We found that 9cRA treatment for 48 h or 14 d didnot result in an increase in the number of NG2 + OPCs or MBP + oligodendrocytes, whereas HX531 or PA452 resulted in a significant reduction ( P < 0.05) in MBP +

oligodendrocytes at both time points. However, an analysis of the percentage of myelin ensheathment revealed that 9cRA significantly increased ( P < 0.05) thepercentage of MBP + membranes on NFH + axons relative to control slices ( Fig. 6a–d,g ). Moreover, cell proliferation analysis using BrdU labeling revealed nodifference in the density of BrdU + cells between 9cRA–treated and control cultures ( Supplementary Fig. 7 ); therefore, 9cRA does not seem to affect cellproliferation.

Figure 6: CNS remyelination is enhanced by 9 cis -retinoic acid.


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( a ) Control cerebellar slices fixed 10 d after demyelination with lysolecithin and immunolabeled with antibodies to NFH (red) and MBP (green). ( b – d ) Remyelination wasincreased by 9cRA ( b ), and decreased by HX531 ( c ) or PA452 ( d ). La barre d'échelle, 20 um. ( e , f ) Quantification of NG2 + and MBP + cells, 48 h ( e ) or 14 d ( f ) aftertreatment. * P < 0.05; Student's t test. ( g ) Quantification of remyelination after addition of 9cRA, or HX531 or PA452 at high (H, 2 or 5 μM, respectively) or low (L, 0.2 or 0.5 μM)concentrations. * P < 0.05, * * P < 0.001; one-way ANOVA. ( h ) Treatment with 9cRA increased CC1 + cells in lesions in rats. Student's t test. ( i ) Real-time qPCR analysis showsincreased Mbp expression in 9cRA-treated mice. Student's t test. ( j ) Semi-thin section of a lesioned CCP 27 dpl after 9cRA treatment. Upper left corner shows normal myelinatedaxons. To the right is a large area of lesion showing axons outlined by thinly remyelinating membranes and dark macrophages. La barre d'échelle, 50 um. ( k ) Ultrastructuralmicroscopy (1,500×) shows many remyelinated axons (pink) compared to axons that remained demyelinated. ( l , m ) Control animal (images as in j and k , respectively) showsfew visible remyelinated axons. ( n ) Ranking analysis. Highest rank represents most remyelination. Mann-Whitney U test. ( o ) G -ratio is lower in 9cRA-treated mice compared tocontrol mice. Student's t test. ( p ) Representative images of myelinated, demyelinated, control remyelinated and 9cRA remyelinated axons. Mean ± sem are shown. * * * P <0.001.

Nous avons ensuite demandé si 9cRA exogène pourrait de même d'améliorer la remyélinisation in vivo. Que les rétinoïdes peuvent influencer la réponse immunitaireadaptative 28 , il serait difficile de distinguer les effets directs de 9cRA sur la remyélinisation de ceux qui ont été principalement immunomodulateurs. Nous avons doncutilisé la toxine focal modèle induit de démyélinisation pour notre expérience plutôt que d'une variante de l'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), qui est unmodèle largement utilisé pour étudier les aspects immunologiques de la sclérose en plaques. Le modèle de la toxine fournit également une distinction claire entre unedémyélinisation aiguë, dont l'induction est indépendante du système immunitaire adaptative, et la remyélinisation ultérieures, ce qui permet des effets de 9cRA sur laremyélinisation à être traitée spécifiquement. En outre, nous avons effectué nos études chez des rats adultes âgés, dans lequel la remyélinisation survient moinsefficace que chez des rats adultes jeunes et qui, par conséquent fournir un contexte plus cliniquement pertinente 29 . Suite à une démyélinisation focale, nous avons


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injecté 10 mg par kg par jour de 9cRA ou une solution saline par voie intrapéritonéale pendant 14 jours de 7 à 21 dpl, puis analysé la portée de la remyélinisation à27 dpl. La densité des oligodendrocytes lignée cellules + Olig2 et Nkx2.2 + OPC à des lésions dans le groupe traité 9cRA étaient semblables à ceux dans le groupetraité à une solution saline ( Fig. 6h ). Toutefois, nous avons détecté une augmentation de + différenciés oligodendrocytes CC1 dans le groupe traité 9cRA parrapport au groupe contrôle. , En temps réel sur qPCR laser capture microdissection-lésions plus à 27 dpl a montré une augmentation de 30% environ dansl'expression Mbp, ce qui indique régénération de la myéline, en ont traité des souris 9cRA par rapport aux souris de contrôle ( Fig. 6i ). Nous n'avons pas observé dedifférence significative entre les groupes traités et témoins 9cRA dans l'expression de PDGFRA (P = 0,1513) ou SCARB1 (P = 0,0864), ce qui correspond avec oumacrophages activités du CPVP, respectivement. Nous avons utilisé une résine semi-minces et les analyses ultrastructurales des lésions CCP à 27 dpl, et constatéque le groupe traité 9cRA ( Fig. 6j, k ) avait plus d'axones remyélinisés que le groupe contrôle ( Fig. 6l, m ). L'amélioration de la remyélinisation du SNC après 9cRAtraitement a été confirmée par l'analyse classement des sections minces de résine semi-( Fig. 6n ). Nous avons également évalué l'efficacité de la remyélinisation eneffectuant une analyse de ratio-G, qui décrit le rapport du diamètre des axones myélinisés à l'axone. Nous avons trouvé que le groupe traité étaient moins 9cRA unG-ratio à la saline-groupe traité en raison de la présence d'épaisses gaines remyélinisés autour des axones ( Fig. 6o, p ), compatible avec une accélération de laremyélinisation du SNC.

DiscussionNous avons généré une base de données de la transcription de gènes qui sont exprimés de manière différentielle en liaison avec la remyélinisation spontanée aprèsCNS focal, la toxine démyélinisation induite dans la matière blanche chez le rat. Le transcriptome remyélinisation sera une ressource utile qui devrait permettre à laneuroscience et des communautés médecine régénérative afin de mieux comprendre les réseaux de signalisation et de facteurs qui sont nécessaires lorsque lescellules précurseur endogène réparer le cerveau blessé, ainsi que la façon dont les gènes exprimés normalement et voies de signalisation dans le blanc questionpourrait être affectée dans les pathologies de démyélinisation du système nerveux central ou régénération de la myéline a échoué.

L'importance de RXR voies de signalisation dans le transcriptome a montré que la remyélinisation RXR de signalisation a été associée à la CNS réponserégénérative, et ouvre un nouveau domaine de recherche sur le rôle des RXRs en médecine régénérative. Dans le mammifère CNS indemnes, RXR-γ estgénéralement exprimée à de faibles niveaux dans toutes les cellules gliales 30 , mais il devient activement exprimé par les microglies activées ou les macrophages,les astrocytes et des oligodendrocytes réactive après lésion du SNC 16 . Nous avons constaté que RXR-γ a également été exprimée après une démyélinisationfocale et des lésions actives de sclérose en plaques, ce qui suggère que RXR-γ est un signal physiologique de blessure dans la lésion cérébrale aiguë. Les analysesfonctionnelles dans les POs cultivées en utilisant des siRNA contre RXR-γ-ou des antagonistes spécifiques de RXR, et γ-souris null RXR, a montré une différenciationdes oligodendrocytes inefficaces, ce qui indique que RXR-γ est un régulateur important de la remyélinisation. En purifié OPC humain adulte, profilage microarray n'apas détecter des transcrits RXRG 31 . Nous avons constaté que les OPC de apparence normale de la substance blanche du cerveau la sclérose en plaques aexprimé plus RXR-γ dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui suggère que RXRG peut-être pas activement transcrit en 'repos' OPC adultes. Par conséquent,comme chez les rongeurs, RXR-γ est probablement exprimée et activée, en réponse à une lésion du système nerveux central chez l'homme.

La possibilité pour les RXR à s'hétérodimériser avec un certain nombre de récepteurs nucléaires suggère que RXR peut moduler l'expression des gènes différents,selon le moment et avec qui il s'hétérodimérise récepteur. RXR peuvent se former ou non permissifs hétérodimères permissive avec d'autres récepteurs nucléaires 32

. Comme 9cRA stimulé la différenciation et amélioré la remyélinisation du SNC, RXR-γ agit probablement permissive hétérodimérisation bien. permissive


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hétérodimères candidats, y compris LXR et PPAR, ont été décrites dans des cellules de lignée oligodendrocytes 33 , 34 , 35 . Dans nos données microarray, nousn'avons pas de détecter l'expression différentielle de tous les membres de la famille PPAR, mais nous avons détecté RXR-α, β-RXR, LXR α, COUP-TFI et Nurr1comme partenaires possibles dans permissive-γ hétérodimères RXR. Cependant, il reste à déterminer qui des récepteurs nucléaires (s) s'hétérodimériser avecRXR-γ dans les cellules de la lignée des oligodendrocytes après démyélinisation, et quels gènes sont transcrits en réponse à-γ activation RXR pour promouvoir ladifférenciation des OPC.

agonistes RXR ou réxinoïdes sont largement disponibles et montrent promesses thérapeutiques pour la différenciation de thérapie cellulaire du cancer, ainsi que pourle traitement des maladies métaboliques 32 . Dans l'EAE, 9cRA peut moduler l'inflammation 36 , ce qui suggère que réxinoïdes pourrait être utile pour le traitementdes maladies inflammatoires du système nerveux tels que sclérose en plaques. Nous avons montré ici que réxinoïdes peut aussi stimuler la différenciation desoligodendrocytes et la remyélinisation du SNC blessés, illustrant ainsi un rôle supplémentaire de réxinoïdes comme médicaments potentiels pour la thérapierégénérative en troubles de démyélinisation.

Méthodesdémyélinisation focale.Homme-Dawley rats Sprague âgés de 3 mois (180-210 g) ont été utilisés pour LCM, hybridation in situ et immunomarquage. Les rats âgés de 9 mois à un an(250-300 g) ont été utilisés pour les 9 - l'acide rétinoïque expérience-cis. Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la réglementation duRoyaume-Uni du Home Office (Licence du projet: 80/8718) démyélinisation focale a été induite de manière bilatérale par injection stéréotaxique 4,0 pi de 0,01%(bromure d'éthidium (vol / vol) dans une solution saline dans caudale pédoncules cérébelleux (CCP). Pour l'analyse de RXRG + / - et RXRG - / - mutants, des sourisadultes (~ 6 mois) a reçu 1 pi de lysolécithine% 1,0 (vol / vol) d'injection dans le cordon ventral, et les souris ont été tués à 15 et 30 dpl dpl pour l'analyse.

microdissections capture laser et les microarrays.Souris (n = 4 par groupe) ont été tués à 5, 14 et 28 dpl, et le cerveau isolé et congelés instantanément. Cryosections (15 um) ont été recueillies sur des lames dePEN-membrane (Cat PALM. N ° 1400-1000), fixés dans l'éthanol 70% (vol / vol), colorées au bleu de toluidine à 1% (poids / volume), puis avec de l'éthanoldéshydraté et le xylène. LCM a été réalisée sur PALM MicroBeam. L'ARN total a été isolé à l'aide RNAqueous-Micro (Cat Ambion.. No. AM1931) et utilisés pourl'analyse des microréseaux et PCR en temps réel. Pour puces à ADN, l'ARN total à partir de cerveaux (n = 3) isolés les uns des lésions post-point de temps ont étéamplifiés une fois et la quantité vérifiée. ARN ont été hybridés sur Illumina Rat RefSeq diapositive, donnant trois répétitions biologiques par unité de temps, et gènesdifférentiellement exprimés ont été détectés en même temps que la BeadStation Illumina. Les puces à ADN a été réalisée à Cambridge génomique Services(Université de Cambridge).

Microarray et la bioinformatique.Le BeadChip Ratref expression-12 a été utilisé pour l'étude de microarray. La qualité de l'essai a été évaluée à l'aide du panneau de commande BeadStudio. Lesdonnées brutes ont été chargés dans R en utilisant Lumi 37 , et ont été filtrés en utilisant la valeur de détection Illumina. Cette valeur est une valeur P qui résulte d'untest statistique entre les billes représentant les sondes et les contrôles négatifs sur le réseau, le défaut lumi filtre compte toutes les sondes avec une valeur Pinférieure à 0,01 comme présent. Le filtrage a été effectuée selon les critères suivants: une sonde donnée doit être présent sur au moins l'une des répliques à l'un


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des points dans le temps. Une fois les données ont été filtrées, elles ont été transformées à l'aide de stabilisation de la variance et ensuite normalisées en utilisant lanormalisation quantile à Lumi. Les données ont ensuite été analysées en utilisant le paquet fspma R. Cet algorithme est conçu pour effectuer modèle mixte analysede variance. Le modèle choisi a eu deux effets principaux, les points dans le temps et les échantillons. Ce dernier a été défini comme un effet aléatoire et leclassement a été effectué sur les points de temps. D'autres comparaisons ont été effectuées en utilisant le paquet limma R. Ce package utilise des modèles linéairespour comparer les groupes, et a été utilisé pour effectuer des comparaisons par paires de comparer les différents moments entre eux. Pour les deux séries derésultats, l'analyse de la variance et les comparaisons par paires, les valeurs P ont été corrigées à l'aide de faux positifs. Le coupé utilisés pour l'analyse a été P<0,05. Les gènes qui ont été exprimés de manière différentielle sur trois points lésion temps-post de l'analyse ANOVA (P <0,05) ont été soumis au Cluster 3.0 pourl'analyse de classification hiérarchique (distance euclidienne, le regroupement de liaison centroïde) et visualisées en utilisant Java TreeView. IPA a été réalisée enutilisant le logiciel Ingenuity Pathways Analysis.

Les anticorps et les réactifs.Les anticorps primaires pour les expériences sur les rongeurs ont été anticorps de souris à A2B5 (Millipore), un anticorps de lapin à CaspR (Abcam), anticorps desouris à ED1 (Serotec), anticorps de souris à GFAP (DAKO), anticorps de rat à la MBP (Serotec), anticorps de souris à Nkx2.2 (DHSB, Université de l'Iowa), lasouris O4 (Millipore), un anticorps de lapin à Olig2 (Millipore), un anticorps de poulet à NFH (Biotechnologies Encor) et anticorps de lapin à RXR-γ (Abcam). Pour lestissus sclérose en plaques, ils ont été anticorps de lapin à RXR-γ (Abcam), un anticorps de lapin à RXR α (Santa Cruz Biotechnology), un anticorps de lapin à RXRβ(Santa Cruz Biotechnology), anticorps monoclonal de souris à Olig1 (R & D Systems), anticorps polyclonal pour SOX10 (R & D Systems), anticorps polyclonal dirigécontre Nogo-A (Santa Cruz Biotechnology), anticorps anti-CMH de classe II (IgG1 de souris, DAKO) et les anticorps GFAP (IgG1 de souris, Millipore).

Immunohistochimie.Les rats ont été anesthésiés et perfusés avec du paraformaldéhyde 4% à 5 dpl, 14 et 28 dpl dpl avant cerveaux ont été isolés, et postfixé cryosectioned. sections12-pin contenant des lésions ont été détectées par l'examen rapide de toluidine bleue microscopique de coloration et de lumière avant de collecte et de stockage à-80 ° C. La coloration immunoperoxydase a été réalisée en utilisant le Kit Vectastain ABC (Vector Laboratories). Non radioactifs hybridation in situ pour RXR-γ a étéréalisée comme décrit 29 . Pour la génération de la sonde RXRG, un pb de rat 669 RXRG fragment d'ADNc a été isolé comme décrit 38 à partir de culture cellulaireextraits OPC et sous-cloné dans le vecteur + CS2. Antisens RXRG a été généré avec T7 polymerase après BamH1 linéarisation. Images cellules ont étéphotographiés et étiquetés, ont été évalués à l'aide Axiovision 4.7.1 logiciel (Zeiss). L'analyse statistique a été réalisée en utilisant Excel et Prism Graph Pad.

Rat, purifiée cultures OPC.cultures OPC ont été préparés à partir de rats Sprague-Dawley néonatale comme décrit 39 . Les OPC ont été ensemencées sur PDL-13-mm revêtu des lamelles deverre, et maintenus dans un milieu sans SATO thyroxine et thiiodothyronine à 37 ° C dans 7,5% de CO Pour les expériences de différenciation, les OPC ont étécultivées en présence de DMSO 1:1000, RXR agonistes HX630 ou PA024 (à 100 nm ou 1 uM), 5 ou 50 nM 9 - cis-acide rétinoïque et / ou des antagonistes desynthèse RXR HX531 (à 0,1 pM, 1 uM, 2 uM ou 4 uM) ou PA452 (à 0,1 uM, 1 uM, 5 uM ou 10 uM). Les cultures ont été fixés pour l'analyse parimmunofluorescence. Confocale z-piles ont été acquises en utilisant Leica SPE microscope confocal, et analysées en utilisant le logiciel Image Pro Plus (MediaCybernetics). La différenciation a été analysée en marquant les cellules comme «simple» (bref, les processus non-interdigitées), «complexe» (plus, interdigitéesprocessus, mais pas les feuilles de membrane) ou «membrane» morphologie (processus contenant des feuilles de membrane MBP-positifs). Trois × 20 champs de

2.


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chacune des quatre lamelles ont été analysés par l'état.

Myélinisantes rat OPC-DRG co-cultures de neurones.Rat OPC et co-DRG OPC-cultures ont été préparés comme décrit 40 , avec les modifications suivantes: cultures de neurones DRG ont été préparés à partir de jourembryonnaire 15-Dawley rats E15) Sprague (et en culture à une densité de 2 × 10 5 cellules par 22 - mm lamelle. DRG ont été maintenues dans du DMEM avecsérum de veau foetal à 10% (FCS, vol / vol) et 100 ng ml -1 NGF (Serotec). cultures DRG ont été traités avec fluorodésoxyuridine pour éliminer les cellulescontaminantes. Après 21 jours, 2 × 10 5 OPC ont été ajoutés par la lamelle de GHM, et co-cultures ont été maintenues pendant 10 j en moyenne myélinisation (BMEavec SES et je Glutamax suppléments, pg 36 ml -1 de glucose et 0,5% de FCS ( tous les Invitrogen)). Dans les expériences de la myélinisation, 1:1000 DMSO, 50nM 9 - cis-acide rétinoïque, HX531 (0,2 ou 2 uM) ou PA452 (0,5 ou 5 uM) ont été ajoutés. Les cultures ont été fixés pour l'immunocytochimie. Oligodendrocytes ontété notés pour leur morphologie que «contact» (processus de toucher mais pas l'alignement sur les axones), «l'extension» (aligné sur les processus, mais pas lesaxones environs) ou «conditionnement» (MBP et nœuds caspr-positifs sont clairement visibles). Le pourcentage de la superficie des axones myélinisés été quantifiéeen utilisant Image Pro Plus. Pour chaque domaine analysé, pourcentage de surface myélinisées a été mesurée par l'extraction d'une image de masque représentantcolocalisation MBP-NFH de chaque couche d'une pile confocale et la réalisation d'une «profondeur de champ étendue 'de projection de ces images masque pourformer une seule image qui représente le total zone myélinisées tout au long de la pile, dont la valeur a été obtenue en utilisant le logiciel. La superficie totalemyélinisées a ensuite été divisée par la superficie NFH-immunopositives mesurée dans ce domaine, multiplié par 100. Trois × 20 champs de chacune des quatrelamelles ont été analysés par l'état.

cultures Mouse tranche cérébelleux.Remyélinisantes cultures souris tranche du cervelet ont été préparés sur la base des méthodes utilisées précédemment publiés pour les rats. Les coupes ont étéexposées à la moyenne, 50 nM 9cRA, ou faible (0,2 ou 0,5 uM) ou de fortes doses (2 ou 5 uM) des antagonistes RXR HX531 et PA452, maintenue pendant unepériode de 14 j, puis traitées pour immunomarquage. L'imagerie a été réalisée comme décrit ci-dessus pour des cultures d'oligodendrocytes et la myélinisation desco-cultures. La myéline a été quantifiée en utilisant Image Pro Plus comme décrit pour le co-cultures. Deux expériences ont été analysés en double.

transfections de siRNA.Après shake-off, les OPC ont été maintenues dans un milieu SATO avec un stylo-streptomycine (Invitrogen), 0,5% de sérum de veau fœtal (SVF, vol / vol) et 10 nMPDGF et FGF nuit. Le milieu a été enlevé et remplacé par SATO avec FBS 0,5%, et les cellules ont été transfectées avec 20 uM siRNA (ou une maquettetransfectées) en utilisant 1% réactif de transfection lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) dans OPTI-MEM. séquences de siRNA utilisés ont été obtenus à partir deDharmacon Thermo Scientific / (RXR α: L-089934-01; RXR-γ: L-083061-08; non-ciblage: D-001810-10). Le milieu a été remplacé par SATO (sans T3 ou T4) avec0,5% de FBS et le stylo-strep après 6 h. Les cellules ont été maintenues en culture pendant 72 h, puis fixée à 4% PFA pendant 20 min à 4 ° C ou lysées pendant 10minutes sur la glace avec du tampon TEN avec 1% de Triton X-100 (vol / vol) et 1 × protéase et cocktails inhibiteur de phosphatase (Calbiochem). Les lysats ont étésoumis à SDS-PAGE et Western blot.

9 - cis rétinoïque sur l'analyse des acides démyélinisation focale.les rats âgés (n = 10 par groupe) avec des lésions focales démyélinisante ont été injectés par voie intrapéritonéale avec 10 mg par kg 9 - cis-acide rétinoïque


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(BIOMOL international) ou une solution saline par 7 à 21 dpl et tué à 27 dpl pour l'analyse par microscopie et la remyélinisation PCR. Pour les sections de résinesemithin et la microscopie électronique, les souris (n = 6 par groupe) ont été perfusés avec glutaraldéhyde à 4% et leur cerveau enlevé. Nous avons obtenu 1-mmtransversale cervelet / sections du tronc cérébral, les traités par le tétroxyde d'osmium, les déshydratés dans l'éthanol, et les noyés dans la résine (TaabLaboratories). Nous avons recueilli des sections de résine 1-um sur lames de verre et les colorées avec toluidine 1% de bleu. L'ampleur de la remyélinisation aensuite été évaluée par microscopie optique. Pour l'analyse ultrastructurale, résine intégré tissus ont été coupés et examinés avec un microscope Hitachi H-600électrons. l'analyse du classement (n = 4 par groupe) a été effectuée en utilisant un 2-tailed test de Mann Whitney et analysées en utilisant Excel et Prism GraphPad. ratio analyse G a été réalisée en utilisant NIH ImageJ. Les souris restantes (n = 4 par groupe) ont été tués et leurs cerveaux enlevés pour LCM et l'analyseqPCR.

PCR quantitative.amorces de PCR pour le rat Mbp, PDGFRA, SCARB1, B2M, Rxra, RXRB, RXRG et actine ont été achetés chez Gene Globe (Qiagen). QPCR en temps réel a étéréalisée avec Quanti-Tect SYBR Green PCR Kit (Qiagen) et analysées par Rotor Gene analyseur PCR 6000 (Corbett Research). Les résultats ont été normaliséspar rapport à l'actine ou B2M et exprimés en moyenne ± sem analyse statistique a été réalisée en utilisant Prism Graph Pad.

Plusieurs échantillons de tissus sclérose en plaques et immunohistochimie.Snap-congelés post-mortem du cerveau de plusieurs échantillons ont été obtenus à partir de la sclérose de la banque française GIE cerveau NeuroCEB (D. Seilhean,Hôpital Pitié-Salpêtrière) et le Royaume-Uni multiples tissus sclérose Bank (R. Reynolds, Imperial College). échantillons de cerveaux de contrôle des personnes quiavaient succombé à des maladies non-neurologique ont également été obtenus à partir des mêmes sources. Les tissus ont été recueillis avec le consentement desdonateurs pleinement informés grâce à un système donneur potentiel après l'approbation éthique. Trois cas choisis au hasard, la sclérose en plaques (supplémentaire tableau 6 ) ont été étudiées, y compris progressive secondaire (deux cas) et forme rémittente-récurrente (un cas). Pour ces cas, la sclérose enplaques, l'âge moyen était de 66,3 ans (extrêmes: 65-74). La préservation de mort des tissus délai a varié entre 20 et 45 h. L'évaluation histologique des lésions aété réalisée en utilisant Luxol rapide bleu / violet de crésyl et d'huile rouge O (macrophages remplis de débris de myéline) coloration histologique. lésions de scléroseen plaques ont été classées selon leur activité inflammatoire (immunomarquage KP1) et sur la base de critères histologiques des lésions aiguës (démyélinisationactive, une vacuolisation de la myéline, une inflammation ou un œdème, une gliose mineurs et de la marge vague), des lésions chroniques (aucune vacuolisation de lamyéline, absence de l'inflammation, de la gliose, la perte axonale et la marge nette) et des plaques d'ombre (pâleur myélinique). L'expression de RXR-γ a été étudiéedans six des lésions de sclérose en plaques avec une bordure active (n = 3), chronique de base silencieuse (n = 5), et) remyélinisés ombre plaques (n = 1, en partie.

Snap-congelés multiples coupes de tissus ont été hydratés dans la sclérose en plaques et micro-ondes de PBS dans Vector démasquer solution, selon le protocoledu fabricant. En bref, les articles ont été pré-incubées dans un tampon de blocage (10% de sérum de chèvre normal (vol / vol), 0,1% Triton X-100 dans du PBS)pendant 1 h et incuber pendant une nuit avec des anticorps primaires à 4 ° C. Après une nuit d'incubation, les lames ont été lavées abondamment dans PBS / 0,1%Triton X-100 et incubées avec des anticorps appropriés secondaire. Quantification des RXR-γ + cellules a été réalisée sur le logiciel ImageJ d'au moins trois sectionsde série la sclérose en plaques (100 um d'intervalle) dans les frontières actifs, chroniques de base silencieux et PPWM de trois cas distincts et dans la substanceblanche d'apparence normale de non-neurologiques contrôles. Les données sont exprimées en moyenne ± sem non-paramétrique des tests statistiques ont étéréalisées (ANOVA à un facteur) et les résultats ont été considérées comme significatives à P <0,05.


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GSE24821

Omnibus l'expression des gènes

codes d'adhésion.Une liste complète des gènes a été déposé au NCBI GEO (code adhésion GSE24821 ).

codes d'adhésionRéférencé adhésions

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références Télécharger

RemerciementsWe thank D. Seilhean (Service d'Anatomopathologie Neurologique, GH Pitié-Salpêtrière, Paris) for classification of multiple sclerosis lesions, the French Brain BankGIE NeuroCEB (Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris, France) and the United Kingdom Multiple Sclerosis Society Brain Bank (R. Reynolds, Imperial College, London) for


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multiple sclerosis tissue. All tissues were collected with the approval of the French and London Multicentre Research Ethics committees. Animal procedures wereperformed under a UK Home Office Project License. This work was supported by grants from the United Kingdom Multiple Sclerosis Society (RJMF, C.ff.-C.), theWellcome Trust (C.ff.-C.), the French Multiple Sclerosis foundation ARSEP (BNO), the Biotechnology and Biological Sciences Research Council of the UnitedKingdom (C.ff.-C., JB), National Multiple Sclerosis Society (C.ff.-C., RJMF, AB-VE, BNO), AP-HP Hôpital Pitié-Salpêtrière, Service d'AnatomopathologieNeurologique (BNO) et des Maladies du Système Nerveux (AB-VE). AW holds a Wellcome Trust Intermediate Fellowship. AAJ holds a Fellowship from MultipleSclerosis Society of Canada.

Informations sur l'auteurCes auteurs ont contribué également à ce travail.Jeffrey K Huang & Andrew A Jarjour

AffiliationsMRC Centre for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine and Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge, Cambridge, UK.Jeffrey K Huang, Chao Zhao & Robin JM Franklin

MRC Centre for Regenerative Medicine and Multiple Sclerosis Society/University of Edinburgh Centre for Translational Research, Centre for InflammationResearch, The Queen's Medical Research Institute, Edinburgh, UK.Andrew A Jarjour, Anna Williams & Charles ffrench-Constant

Centre de Recherche de l'Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière, Inserm U.975; Université Pierre et Marie Curie-Paris 6 UMR-S975; Cnrs UMR 7225;and AP-HP Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Fédération de Neurologie, Paris cedex 13, France.Brahim Nait Oumesmar, Christophe Kerninon & Anne Baron-Van Evercooren

Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Department of Cell Biology and Development, Illkirch, France.Wojciech Krezel & Pierre Chambon

Graduate School of Biomedical Science, Institute of Biomaterials and Bioengineering, Tokyo Medical and Dental University, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan.Hiroyuki Kagechika

Department of Pathology, University of Cambridge, Cambridge, UK.Julien Bauer

ContributionsJKH performed in vivo experiments and laser capture microdissections. AAJ performed in vitro experiments. CZ contributed to in vivo experiments. AW performed


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ex vivo experiments. BNO, CK and AB-VE performed multiple sclerosis tissue analysis. HK generated RXR antagonists and agonists. WK and PC generated theRXR- γ mouse mutants. JB and JKH performed bioinformatics. C.ff.-C. and RJMF equally oversaw the project.

Conflit d'intérêts financiersLes auteurs déclarent pas des intérêts financiers concurrents.

Correspondant auteurs

Correspondance à: Charles ffrench-Constant or Robin JM Franklin

Des renseignements supplémentaires

Fichiers Excel

Supplementary Table 1 (5M)Total genes differentially expressed between 5, 14 and 28 days post CCP demyelination.

1.

Supplementary Table 2 (100K)Gene list used for IPA analysis.

2.

Supplementary Table 3 (68K)Active signaling networks found between 5 and 14 dpl.

3.

Supplementary Table 4 (716K)Total genes differentially expressed between 5 and 14 dpl (P < 0.05) used for volcano plot.

4.

Supplementary Table 6 (196K)IPA identified RXR associated pathways from the remyelination transcriptome.

5.

Les fichiers PDF

Supplementary Text and Figures (11M)Supplementary Figures 1–7 and Supplementary Tables 5, 7

1.


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1097-6256 1546-1726

© 2010 Nature Publishing Group, une division de Macmillan Publishers Limited.

Tous droits réservés. partenaire de AGORA, HINARI, OARE, INASP, CrossRef et COUNTER


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résumé - g-stationsep.g-station.com/pdf/retinoid_x_receptor_gamma_s_fr.pdf · la base...

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