estructura proteica e interacciones proteína-ligando

A.J.F.A. Estructura proteica e interacciones proteína-ligando.

ESTRUCTURA PROTEICA E INTERACCIONES PROTEÍNA-LIGANDO Se define como proteína a toda estructura que surge de la polimerización de aminoácidos. Cuando la cadena se compone de menos de 100 aminoácidos, se denomina polipéptido; una cadena compuesta por 101 o más aminoácidos recibirá el nombre de proteína. Un aminoácido se enlaza a otro mediante un enlace peptídico. Los enlaces peptídicos surgen de la unión del grupo α carboxilo de un aminoácido con el grupo α amino de otro aminoácido. El enlace peptídico puede ser considerado como una amida. A pesar de que es un enlace covalente simple, la existencia del doble enlace entre el carbono carboxilo y el oxígeno permiten una estructura de resonancia que confiere al enlace peptídico una energía de enlace mayor que la de los enlaces covalentes simples, cercana a la energía de enlace de un enlace covalente doble.

Asimismo, este carácter de doble enlace impide la rotación de los grupos funcionales alrededor del mismo. Los enlaces peptídicos ocurren en conformación trans. Niveles Estructurales La estructura proteica se organiza en cuatro niveles jerárquicos. La estructura primaria comprende la secuencia de aminoácidos que compone la proteína, escrita en sentido amino-terminal → carboxilo-terminal. La estructura primaria no se pierde, a menos que se someta la cadena peptídica a proteólisis. La estructura primaria permite, además, deducir algunas de las propiedades químicas de la proteína. Las propiedades químicas de una cadena peptídica se fundamentan en los aminoácidos que lo componen: Un péptido rico en aminoácidos ácidos tendrá carácter ácido; un péptido rico en aminoácidos hidrófobos tendrá propiedades hidrofóbicas. De manera similar a los aminoácidos, las proteínas poseerán carga neta dependiendo del pH del medio, según sea su estado de protonación. Asimismo, tienen un punto isoeléctrico (pI), definido según sea la composición de la cadena. A la hora de definir el valor de pI, hay que tener en cuenta que primero se disocia el extremo carboxilo-terminal, seguido de los grupos funcionales ácidos, luego el extremo amino-terminal, seguido de los

grupos funcionales básicos. El valor de las constantes de disociación de los grupos funcionales se altera debido a cambios electrostáticos a lo largo de la estructura entera, sin embargo esta variación es ligera. La estructura secundaria comprende el plegamiento del péptido a nivel local. Así como la estructura primaria indica la secuencia de los aminoácidos en el péptido, los niveles estructurales superiores indican la ubicación espacial de éstos. A pesar de que el enlace peptídico es un enlace rígido, los enlaces simples entre el carbono α y sus respectivos grupos amino (ángulo φ) y carboxilo (ángulo ψ) si permiten la rotación. Existen ángulos de rotación que dan lugar a estructuras más estables. En el diagrama de Ramachandran (Figura 1) se tabulan los ángulos de rotación con respecto a la estabilidad de la estructura.

Una configuración de ángulos específica da lugar a una conformación específica, y son más estables aquellas con menor interferencia estérica. Se han caracterizado tres estructuras que dan lugar a los niveles de organización superiores: Las hélices α, las hojas β y los giros β. Las hélices α son estructuras parecidas a resortes, en la que los aminoácidos se enlazan rodeando un eje central, teniendo los grupos R hacia afuera. Una hélice α puede ser dextrógira o levógira, dependiendo de la dirección del giro. Una manera de visualizar la dirección del giro puede ser usando una mano como referencia: El pulgar indica la posición del extremo amino-terminal y los otros dedos la dirección de giro. Será dextrógira si sigue el patrón de la mano derecha y levógira si sigue el patrón de la mano

Figura 1. Diagrama de Ramachandran indicando los

ángulos permitidos para las diferentes estructuras

secundarias.


Figura 4. Esquematización de las hélices α mediante

resortes (izquierda) o cilindros (derecha)

izquierda (Figura 2). En la Figura 3a se observa la configuración de una hélice α dextrógira. En la hélice α, hay 3.6 aminoácidos por cada giro. Esta estructura mantiene su estabilidad por: (a) Puentes de hidrógeno intracatenarios, formados entre el oxígeno de un grupo carboxilo α de un aminoácido y el hidrógeno del grupo amino α del aminoácido 3 espacios adelante del primero; (b) Puentes salinos intracatenarios, cuando la cadena R de un aminoácido ácido se enlaza con la cadena R de un aminoácido básico cercano; (c) aminoácidos poco voluminosos; (d) bajo contenido de glicina y prolina. Además, se favorece la formación de hélices α cuando aminoácidos de cadenas R de igual carga están separados

entre sí, de manera que se evite la interferencia electrostática entre estos.

Las hélices α se representan con hélices o cilindros, similar a la representación que se observa en la Figura 4. Las hojas β son estructuras secundarias igualmente caracterizadas. En las hojas β, los aminoácidos se disponen en una línea en forma de zigzag, con puentes de hidrógeno intracatenarios estabilizadores entre las líneas paralelas. Los grupos R se disponen en un patrón alternado hacia abajo y hacia arriba. Las hojas β pueden ser paralelas, todas las cadenas contiguas tienen igual dirección amino a carboxilo, o antiparalelas, cuando las cadenas contiguas poseen una dirección amino a carboxilo opuesta. Este patrón se observa en la Figura 5. Las hojas β se representan con flechas, en donde la punta indica el extremo carboxilo del último aminoácido en la hoja β. (Figura 6)

Figura 2. Determinación de la dirección de giro de las

hélices α.

Figura 3. Estructura de una hélice α dextrógira. (a) La estructura se estabiliza por puentes de hidrógeno intracatenarios. Cada giro

de la hélice hace un recorrido longitudinal de 0,54 nm o 5,4 Å. Asimismo, cada giro contiene 3.6 aminoácidos. (b) Vista superior de

una hélice α. (c) Modelo de esferas de una hélice α. (d) Vista superior de la hélice α en la que se enumeran los aminoácidos.


Las cadenas contiguas en las hojas β se comunican a través de giros β. Lo giros β son vueltas en 180°; los aminoácidos prolina y glicina aparecen con alta frecuencia en estos giros. El primer aminoácido del giro forma un puente de hidrógeno con el cuarto aminoácido. Cuando el

tercer aminoácido del giro es glicina, se clasifica como giro β tipo II. En todos los otros casos, se denominan giro β tipo I. (Ver Figura 7)

A pesar de que existen estructuras secundarias bien caracterizadas, aquellas regiones de la proteína que adquieren una distribución espacial diferente a las estructuras anteriores, entran en la clasificación de “plegamiento al azar”. Son regiones de plegamiento aleatorio, no caracterizadas.

La estructura terciaria comprende el plegamiento global de la cadena peptídica. Las diferentes estructuras secundarias interaccionan dando origen a diferentes dominios funcionales. Por dominio funcional se concibe una región plegada de una manera específica que da lugar a una función particular del péptido. El plegamiento global de una misma cadena puede dar origen a diferentes dominios funcionales. Por ejemplo, el plegamiento de la cadena de Actina-G da lugar a un dominio de ATPasa, un dominio de interacción con otras proteínas, un dominio para enlace de los cationes Mg+2 y Ca+2, entre otros. Es importante recalcar que cada dominio funcional suele tener una estructura conservada filogenéticamente. Proteínas de diferentes sistemas fisiológicos con una función común (p. ej. enlazar Ca+2) poseen dominios funcionales homólogos para dicha función. El cambio de un solo aminoácido en un dominio funcional puede dar lugar a la pérdida de la función, lo cual puede conducir a un estado fisiopatológico. La estructura terciaria se estabiliza mediante enlaces no covalentes, enlaces iónicos y puentes disulfuro. Los puentes disulfuro se dan entre residuos de cisteína. Si se tiene una cadena peptídica de 90 aminoácidos, el aminoácido número 7 puede interactuar con el aminoácido 80 para estabilizar el péptido. Se cumple que las regiones hidrofóbicas interaccionen entre sí; lo mismo ocurre para las regiones hidrofílicas. Otro factor importante en la estabilización de la estructura terciaria es la formación de capas de solvatación alrededor del péptido.

Figura 5. Hojas β. Se observa el patrón explicado en el

texto. (a) Hoja β paralela. (b) Hoja β antiparalela.

Figura 6. Representación

esquemática de las Hojas

β

Figura 7. Representación de palos y esferas de los giros β

tipo I y tipo II.


La interacción de las diferentes estructuras secundarias da lugar a motivos estructurales conservados. Es común que estos motivos estructurales sirvan de punto de partida para la caracterización de los dominios funcionales. En la figura 8 se pueden apreciar dos motivos estructurales caracterizados.

La estructura cuaternaria consiste en la interacción de múltiples cadenas peptídicas. Se mantiene por enlaces no covalentes, iónicos y puentes disulfuro extracatenarios. La ruptura de los enlaces estabilizadores produce el despliegue de la proteína. Este fenómeno se denomina desnaturalización. La desnaturalización puede darse con aumentos de la temperatura, variaciones del pH, cambios extremos en la osmolaridad, entre otros factores. Los puentes disulfuro son altamente estables, con energías de enlace elevadas. La ruptura de este tipo de enlaces generalmente se logra mediante catálisis enzimática. Luego de desnaturalizada, una proteína puede volver a adquirir su conformación nativa. Esto evidencia que la secuencia de aminoácidos define la estructura del péptido. Es decir, la estructura primaria precisa los niveles estructurales superiores. En la desnaturalización se pierden la estructura cuaternaria, terciaria y secundaria, pero no la primaria. Algunas proteínas, sin embargo, no pueden recuperar su conformación nativa luego de la desnaturalización. Esto se debe a que en su proceso de síntesis, algunas proteínas requieren la ayuda de enzimas que catalizan el plegamiento de la proteína. Estas enzimas reciben el nombre de proteínas chaperonas. La estructura primaria se compromete únicamente cuando se somete la proteína a degradación enzimática. Las proteínas pueden tener una porción compuesta por moléculas diferentes a aminoácidos. Estas porciones no aminoacídicas reciben el nombre de grupos prostéticos. Las proteínas que poseen grupos prostéticos se denominan proteínas conjugadas. El grupo prostético puede consistir en una estructura lipídica, en un glúcido,

una estructura metálica, entre otros. Asimismo, dependiendo del grupo prostético, la proteína puede recibir diferentes denominaciones, p. ej. lipoproteínas aquellas que poseen lípidos, metaloproteínas aquellas que poseen iones metálicos, entre otros. Interacciones proteína-ligando. Mioglobina (Mb) y Hemoglobina (Hb). Mioglobina (Mb) La mioglobina (Mb) es una proteína de 153 aminoácidos, formada por 8 hélices α, a cada una de las cuales se le designa una letra de la A a la H (figura 9). Es una proteína globular. La estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas globulares es densa, de manera que todos los átomos se aglomeran en una especie de esfera o globo (de allí el nombre “globulina”). Las proteínas fibrilares poseen una estructura terciaria y cuaternaria extendida, a manera de hilos. La Mb posee un grupo prostético, el grupo heme, que constituye el sitio de enlace a oxígeno. El grupo heme es un anillo de protoporfirina IX, que posee un ión Fe+2 en el centro del anillo (figura 9). El ión Fe+2 puede formar 6 enlaces coordinados en esa posición, 4 de los cuales son para la unión al anillo de protoporfirina, 1 para la histidina

93 (el aminoácido número 93 de la secuencia) o histidina proximal y otro para enlazar el O2. Debido a que este grupo prostético alberga un ión metálico, la Mb es una metaloproteína. El grupo heme se encuentra en un “bolsillo” formado principalmente por las hélices E y F.

Figura 8. Los motivos estructurales surgen de la combinación

de las diferentes estructuras secundarias. Izquierda, Barril β;

derecha, sándwich α-β.

Figura 9. Estructura terciaria de la Mb. Cerca del 70% de los

153 aminoácidos se disponen en 8 hélices α, nombradas de

la A a la H. El grupo prostético se estabiliza en un bolsillo

formado por las hélices F y E.


Para ejecutar su función, muchas proteínas requieren enlazar otras moléculas. Toda aquella molécula que puede ser enlazada por una proteína se denomina ligando. El O2 es el principal ligando de la Mb en cuanto a la ejecución de su papel fisiológico Una proteína puede tener dominios de

enlace diferentes para distintos ligandos. La unión entre una proteína y su ligando puede representarse cuantitativamente a través de la siguiente expresión:

Ecuación 1.1 En donde P es la proteína libre, L es el ligando libre y PL es la proteína enlazada a ligando. Por ser un proceso reversible, es posible establecer una constante que describa la relación entre la cantidad de productos y la cantidad de reactivos:

Ecuación 1.2

Ka representa la constante de asociación del complejo proteína-ligando. Puede ser tomada como una medida de la afinidad de la proteína por el ligando en cuestión, en donde mientras más elevado es Ka, más afín es la proteína por el ligando. Arreglando la ecuación 1.2 se puede obtener la siguiente expresión:

Ecuación 1.3

La ecuación 1.3 indica un comportamiento fundamental de la interacción proteína-ligando: La relación proteína-ligando/proteína libre ([PL]/[P]) es proporcional a la concentración de ligando. A mayor cantidad de ligando, mayor será la cantidad de proteína asociada a éste. Cuando [L] es muy elevada, la cantidad de proteína libre es despreciable y con aumentos sucesivos de [L], el valor de [PL] no varía. Este estado puede denominarse saturación. Se puede establecer una relación entre la cantidad de sitios de unión a ligando ocupados y la cantidad de sitios de enlace a ligando totales (θ):

Ecuación 1.4

Si se sustituye [PL] por Ka[L][P] (ecuación 1.3), se obtiene:

Ecuación 1.5

Debido a que es más intuitivo referirse a la interacción proteína-ligando en términos de la disociación más que de la asociación de P con L, la ecuación 1.5 puede quedar expresada con la constante de disociación, Kd, de la siguiente manera:

Ecuación 1.6

Si se gráfica la ecuación 1.6, se obtiene una curva hiperbólica, en la que el eje x indica la concentración de ligando y el eje y la relación proteína-ligando/proteína total:

El valor de la constante de disociación, Kd, puede interpretarse como la concentración de ligando necesaria para ocupar la mitad de los sitios de enlace a ligando disponibles, tal como se observa en la figura 11. Mientras

Figura 10. Estructura del grupo heme. Se compone de un

anillo de protoporfirina IX que enlaza un ión Fe+2

en el

centro.

Figura 11. Gráfica de θ vs [L] (Ecuación 1.6).


más afín es una proteína a un ligando, menor cantidad de ligando requiere para ocupar el 50% de sitios de unión a ligando. Como el oxígeno molecular, a temperatura atmosférica, es un gas, la ecuación 1.6 puede expresarse en relación a la presión parcial de oxígeno, pO2*:

Ecuación 1.7

Una curva en la que se expresa la cantidad de proteína saturada en relación a la presión parcial de un gas se denomina curva de saturación del gas. En este caso, en la figura 11 se observa la curva de saturación de oxígeno para la Mb. Kd también se expresa en términos de presiones parciales, por lo que pasa a denominarse P50, y es la presión parcial del gas a la cual el 50% de los sitios de enlace a ligando disponibles están saturados.

El grupo heme es cerca de 20.000 veces más afín por el CO que por el O2. Sin embargo, cuando el grupo heme esta enlazado a la Mb, la afinidad por CO pasa a ser alrededor de 100 veces mayor que la afinidad por O2. Esto se logra en parte por interferencias estéricas que sufre el CO al momento de enlazarse al Fe+2 del grupo heme. Cuando enlaza oxígeno, una histidina, denominada histidina distal (aminoácido 64 de la secuencia), estabiliza el oxígeno en el bolsillo que alberga también grupo heme. Se ha

identificado que la rotación de la cadena lateral de la histidina distal permite la entrada del oxígeno al bolsillo EF. Este movimiento se da en el orden de los nanosegundos. La interacción entre una proteína y un ligando por lo general requieren movimientos moleculares transitorios de la estructura proteica, fenómeno que recibe el nombre de encaje inducido. Hemoglobina (Hb) Mientras que la función de la Mb es almacenar O2, la Hb es la proteína encargada de su transporte. La Hb es una proteína multimérica, compuesta por subunidades α y β, en una estequiometría de 2:2. Se sintetizan a partir de genes distintos. La subunidad α posee 141 aa y la subunidad β 146 aa. A pesar que las secuencias de ambas cadenas tienen poca homología con la secuencia de la Mb, la estructura terciaria de las tres cadenas es muy similar (figura 13).

Cada subunidad α y β alberga un respectivo grupo heme, dando lugar a 4 sitios de enlace a O2.

En la Hb, las subunidades α interaccionan con las subunidades β y entre sí mediante enlaces no covalentes y

*Se considera la presión parcial de los gases debido a que el sistema se encuentra a temperatura y volumen constantes. La ley de los gases establece que el producto de la presión por el volumen (P.V) es directamente proporcional a los moles del gas (n), la temperatura absoluta (T) y una constante, definida como la constante de los gases (R), es decir: PV=nRT. Si el volumen y la temperatura son valores constantes, se tiene que la variación de presión implicará necesariamente un aumento de la cantidad de moles del gas. A presiones mayores, mayor cantidad de gas.

Figura 12. Curva de saturación de oxígeno de la Mb. Se

evidencia que la Mb pose una afinidad elevada por el O2,

convirtiéndola en una proteína ideal para el almacenaje de

O2. Figura 13. Estructura de la cadena de Mb en comparación

con la subunidad β de la Hb..

Figura 14. Estructura

cuaternaria de la Hb.


enlaces iónicos. Es decir, la Hb tiene estructura cuaternaria (figura 14). Se han identificado dos estados conformacionales para la hemoglobina. Un estado R (relajado) en el que existe un menor número de enlaces iónicos entre las subunidades α y β. Coincide con el estado de saturación de oxígeno. El estado T (tenso) posee un mayor número de enlaces iónicos entre ambas subunidades (figura 15) y coincide con el estado de baja saturación, en el cual la Hb recibe el nombre de desoxihemoglobina.

El cambio conformacional R→T es esencial para la función de la Hb. En el estado R, la Hb presenta mayor afinidad por O2 que en el estado T; el estado R favorece el enlace de oxígeno (figura 16).

En el caso de la Hb se cumple que la unión de una molécula de O2 a una de las subunidades α o β modifica la afinidad de las otras unidades por el O2. Esta propiedad se denomina alosterismo: El enlace de un ligando altera la afinidad por el mismo u otro ligando en los sitios de enlace restantes. Tal ligando recibe el nombre de modulador alostérico. Un modulador alostérico será homótropo cuando el ligando funcional y el modulador alostérico sean

la misma molécula. Sera heterotropo cuando el ligando natural y el modulador alostérico son moléculas distintas. El modulador alostérico será positivo cuando induzca un cambio conformacional que eleve la afinidad por un ligando; será negativo cuando induzca un cambio conformacional que deprima la afinidad por un ligando. El O2 es un modulador alostérico homótropo positivo de la Hb. Este tipo de interacciones también reciben el nombre en conjunto de cooperativismo. El cooperativismo está descrito en términos matemáticos a través de la ecuación de Hill. En términos cualitativos, existen dos modelos que teorizan el comportamiento alostérico de la hemoglobina. El primero, el modelo concertado, sugiere que todas los sitios de unión a ligando de una proteína alostérica pueden estar, todos al mismo tiempo, en uno de dos estados de afinidad (alta y baja). El segundo, el modelo secuencial, establece también dos estados de diferente afinidad (alta y baja), pero en este caso, la proteína puede pasar por fases transitorias en las que algunos sitios de enlace están en conformación de alta afinidad y otros sitios de enlaces están en conformación de baja afinidad. La curva de saturación de oxígeno para la Hb tiene forma de una “S” inclinada (curva sigmoide). En la figura 16 se observa dicha curva, la señalada “transition from low- to high- affinity state”. El valor de pO2 en los capilares pulmonares es de alrededor 13kPa. En la curva de la figura 16 se observa a que a este valor de pO2, la Hb se encuentra en un estado de alta afinidad y está saturada de O2. A nivel de los capilares tisulares, la pO2 desciende a un valor aproximado de 4 kPa. A este valor de pO2, la Hb se encuentra en un estado de baja afinidad por O2, y la relación θ desciende a valores cercanos a 0.5. Este comportamiento hace de la Hb una proteína ideal para la captura de O2 en los pulmones y para el transporte del mismo a los tejidos periféricos. Si el comportamiento de la Hb fuera idéntico al de la Mb, seria excelente para tomar oxígeno en los pulmones, pero no lo liberaría a nivel tisular. Efecto Bohr. Transporte de H+ y CO2. Además de O2, la Hb posee sitio de enlace para protones y para CO2. Los protones se unen a las cadenas laterales R de los aminoácidos ácidos y básicos, siendo esta interacción dependiente de las variaciones de pH. El CO2 se une al extremo amino terminal de cada una de las cadenas α y β. La unión de protones y CO2 a la Hb favorecen la conformación T. Es decir, disminuyen la afinidad de la Hb

Figura 15. Enlaces iónicos formados entre las subunidades de

la Hb en la conformación T.

Figura 16. Curvas de saturación de oxígeno para los estados

conformacionales de Hb de alta y baja afinidad por oxígeno,

R y T, respectivamente.


por O2. Los iones H+ y el CO2 son moduladores alostéricos heterotropos negativos El pH en los capilares pulmonares se aproxima a 7,6. A nivel tisular, desciende a 7,4. El CO2, uno de los productos resultantes del metabolismo celular, no es soluble en la sangre. Cuando difunde fuera de los tejidos, es transformado en ácido carbónico, H2CO3, por la acción del enzima anhidrasa carbónica, ubicada en los eritrocitos. El H2CO3 es soluble en la sangre, y puede viajar hasta los capilares pulmonares, en donde se revierte la reacción de la anhidrasa carbónica, generando CO2 a partir de H2CO3, el cual será liberado del cuerpo durante la expiración. El ácido carbónico producido en la sangre se encuentra en equilibrio según la reacción:

La elevación en plasma de [H2CO3] conlleva un leve descenso del pH sanguíneo. En la figura 17 se observa, la variación de la afinidad de la Hb por O2 con respecto a los cambios de pH.

Cerca de un 20% del CO2 y un 40% de los protones generados a nivel tisular son transportados por la Hb. El efecto Bohr postula que la elevación de [CO2] y la disminución de pH favorecen la conformación T de la Hb, disminuyendo la afinidad de esta por O2. Esto asegura aún más la liberación de oxígeno a nivel tisular y su captura a nivel pulmonar. 2,3 BPG. El 2,3 bifosfoglicerato (2,3 BPG) es un modulador alostérico heterotropo negativo de la Hb. Deriva del

intermediario metabólico de la glicolisis, 1,3 BPG. En los eritrocitos, parte del 1,3 BPG es transformado en 2,3 BPG por la acción del enzima 2,3 BPG mutasa. El 2,3 BPG se enlaza a la Hb en la interface formada por las cuatro subunidades de la Hb, con una estequiometría de 1:1. Se une preferentemente a la conformación T de la Hb, estabilizándola. La producción de 2,3 BPG asegura una mayor liberación de O2 a nivel tisular cuando pO2 disminuye. Un ejemplo de ello es cuando se viaja a un lugar de mayor altitud con respecto al mar. La presión atmosférica es menor en este caso. En condiciones normales, el porcentaje de saturación de oxígeno de la Hb a nivel tisular luego de liberar el O2 desciende de entre 99% y 100% a un valor aproximado del 60%. Al disminuir pO2 en la atmósfera, no se alcanza el 100% de saturación de oxígeno cuando la sangre llega a los pulmones. Para suplir la disminución de la presión parcial de oxígeno, se genera mayor cantidad de 2,3 BPG, de manera que se libere más oxígeno del que se liberaba antes. Es decir, el porcentaje de saturación de O2 de la hemoglobina desciende ahora a un aproximado del 45%. El efecto del 2,3 BPG sobre la Hb se observa en la figura 18.

REFERENCIAS: 1. Nelson, D et al. Lehninger Principles of

Biochemistry. 5a edición. W.H Freeman Company. 2. Stryer, L et al. Principios de Bioquímica. 6a

edición. Editorial Reverté.

Figura 17. Curva de saturación de oxígeno para la Hb con

respecto a cambios de pH. Notese que la disminución del pH

causa un descenso de la afinidad de la Hb por O2.

Figura 18. Efecto del 2,3 BPG en la afinidad de la Hb por O2.

La elevación de [2,3 BPG] favorece el estado de baja afinidad

por O2. Los porcentajes indican la cantidad de oxígeno

liberado a nivel tisular.

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