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ESTANDARIZACIÓN DE UNA METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN

MULTIRESIDUO DE PLAGUICIDAS EN CAFÉ VERDE

HUGO FERNANDO ARIAS LOAIZA

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA

PEREIRA

2013




TRABAJO DE GRADO

Requisito final para optar al título de Químico Industrial

DIRECTOR:

Qco. MSc. JUAN PABLO ARRUBLA VELEZ

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA

PEREIRA

2013

NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO



Presentado por:


Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez revisada la

versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar:

La nota de _______________________________________

Con la connotación _______________________________________

Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy:

Director:

Juan Pablo Arrubla Vélez _______________________________________

Jurado:

Firma: _______________________________________

Jurado:

Firma: _______________________________________

A Yenny y María.

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer al Doctor José Hipólito Isaza Martínez, gran amigo y maestro, de

quien he aprendido todo lo que se sobre cromatografía y química analítica, al

director de este trabajo Juan Pablo Arrubla Vélez docente de la escuela de

química de la Universidad Tecnológica de Pereira por sus acertadas orientaciones

y a Diana Patricia Peláez Manrique, analista del Laboratorio de Calidad de

Productos Naturales por su invaluable colaboración en la ejecución de este

trabajo.

TABLA DE CONTENIDO

INDICE DE TABLAS 15

INDICE DE FIGURAS 17

RESUMEN 19

INTRODUCCION 21

JUSTIFICACIÓN 23

OBJETIVOS 25

1. MARCO TEORICO 27

1.1. EL CAFÉ 27

1.1.1. Café de Colombia 29

1.1.2. La cadena del café 30

1.1.3. Principales enfermedades del café 31

1.1.4. Principales plagas del café 33

1.2. LOS PLAGUICIDAS 35

1.2.1. Generalidades e historia 35

1.2.2. Química de los plaguicidas. 37

1.3. LEGISLACIÓN PARA EL CONTROL DE PLAGUICIDAS 40

1.3.1. Legislación internacional 40

1.3.2. Legislación nacional 41

1.4. TECNICAS ANALÍTICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS.

45

1.4.1. Cromatografía de gases 45

1.4.1.1. Instrumentación para cromatografía de gases 47

1.4.1.2. Puerto de inyección 47

1.4.1.3. Horno y columna 48

1.4.1.4. Detector 53

1.4.2. Detector selectivo de masas 55

1.4.2.1. El análisis cuantitativo con espectrometría de masas 59

1.5. ESTANDARIZACIÓN DE TÉCNICAS ANALÍTICAS 59

1.5.1. Exactitud 60

1.5.2. Precisión 60

1.5.3. Incertidumbre de la medición 61

1.5.4. Límite de detección 65

1.5.5. Límite de cuantificación 65

2. PARTE EXPERIMENTAL 67

2.1. MUESTRAS DE ANÁLISIS 67

2.2. ANALITOS 67

2.3. ESTANDARES 68

2.3.1. Soluciones patrón individuales 68

2.3.2. Patrones de calibración 69

2.4. ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO 69

2.4.1. Análisis cualitativo 70

2.4.2. Calibración instrumental 71

2.5. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 71

2.5.1. Molienda 71

2.5.2. Extracción de los plaguicidas de la matriz de café. 71

2.5.3. Limpieza de los plaguicidas 72

2.6. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LOS PLAGUICIDAS 74

2.6.1. Evaluación de la matriz 74

2.6.2. Porcentaje de recuperación 75

3. DATOS Y RESULTADOS 77

3.1. RESULTADOS DEL ANÁLISIS CUALITATIVO 77

3.1.1. Determinación de los tiempos de retención 77

3.1.2. Obtención de los espectros de masas 78

3.2. CURVAS DE CALIBRACIÓN 79

3.3. LIMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN 82

3.3.1. Evaluación de matriz 83

3.4. PORCENTAJES DE RECUPERACIÓN 86

4. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIÓN 87

4.1.1. Definición del mensurando 87

4.1.2. Modelo físico y modelo matemático 87

4.1.3. Fuentes de incertidumbre 88

4.1.4. Cuantificación de las incertidumbres estándar 89

4.1.5. Coeficientes de sensibilidad 92

4.1.6. Incertidumbre combinada y expandida 93

5. CONCLUSIONES 97

BIBLIOGRAFÍA 99

ANEXOS 103

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Características químicas de algunos plaguicidas controlados en café en

grano por la resolución 2906 de 2007 del ministerio de la protección

social. 38

Tabla 2. Resoluciones vigentes para el control de plaguicidas en Colombia. 41

Tabla 3. Fases estacionarias liquidas más comunes en cromatografía de gases

capilar 50

Tabla 4. Detectores más comunes para cromatografía de gases . 53

Tabla 5. Tipos de analizadores de masas. 57

Tabla 6. Analitos en el método para determinación de plaguicidas en café verde.67

Tabla 7. Estándares de plaguicidas para la preparación de patrones de referencia.

Los números de catalogo corresponden a la marca ChemService. 68

Tabla 8. Solventes para la preparación de soluciones patrón de plaguicidas

individuales. 68

Tabla 9. Concentración de los patrones de referencia con que se construyeron las

curvas de calibración. 69

Tabla 10. Condiciones instrumentales en el análisis cualitativo de los plaguicidas.

70

Tabla 11. Iones de cuantificación y referencia de los plaguicidas. 71

Tabla 12. Tiempos de retención de los plaguicidas en la mezcla madre estándar.

77

Tabla 13. Similitud de los espectros experimentales con la base de datos. 79

Tabla 14. Tabla de resultados. Área bajo el pico obtenida por triplicado para

diferentes concentraciones de forato. 80

Tabla 15. Coeficientes de correlación de las graficas de calibrado de los

plaguicidas. 82

Tabla 16. Relación señal ruido de los picos de Forato. 82

Tabla 17. Limites de detección y de cuantificación de los plaguicidas. 83

Tabla 18. Relación señal ruido de los muestras de café verde en blanco para

evaluar el efecto de la matriz 84

Tabla 19. Límites de detección y cuantificación finales después de considerar el

efecto de matriz. 85

Tabla 20. Comparación de los límites de cuantificación. LC-1 es el límite de

cuantificación calculado de la grafica de calibración sin tener en cuenta el

efecto de la matriz en la señal. 85

Tabla 21. Porcentajes de recuperación en la extracción de plaguicidas a partir de

muestras de café verde en grano. 86

Tabla 22. Variabilidad en las áreas bajo el pico de forato 90

Tabla 23. Resultados de la cuantificación de plaguicidas en café verde. 94

Tabla 24. Error en el cálculo de concentración de plaguicidas en café verde. 94

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Esquema de un cromatógrafo de gases. 47

Figura 2. Tipos de insertos para cromatografía de gases. 48

Figura 3. Cromatograma tomado en un cromatógrafo de gases. 54

Figura 4. Esquema de un espectrómetro de masas . 56

Figura 5. Espectro de masas de la cafeína. 58

Figura 6. Diagrama para la estimación de la incertidumbre de la medición. 63

Figura 7. Esquema del procesamiento de café verde para la extracción de

plaguicidas. 73

Figura 8. Limpieza de los plaguicidas en el extracto de café. 74

Figura 9. Protocolo para la evaluación de los porcentajes de recuperación en la

extracción de plaguicidas en café verde. 75

Figura 10. Cromatograma de la mezcla madre de plaguicidas. 77

Figura 11. Comparación del espectro de masas del forato. 78

Figura 12. Grafica de calibrado del Forato. . 81

Figura 13. Diagrama del método de determinación de plaguicidas en café verde.

87

19

RESUMEN

En este documento se presenta la estandarización de una técnica para la

determinación de plaguicidas organofosforados y triazoles en café verde, los

plaguicidas se extrajeron con una mezcla de acetonitrilo agua (4:1) seguida de una

partición líquido-líquido y dos extracciones en fase solida con fase reversa RP18 y

con carbón activado-NH2. Se evaluaron los porcentajes de recuperación, los

cuales estuvieron por encima del 70%. La lectura instrumental se hizo por

cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con un GCMS QP

2010 de Shimadzu, se evaluó la precisión instrumental y la linealidad en un rango

de concentraciones inferior a los límites máximos de residualidad de cada

plaguicida. Al final se estimó la incertidumbre. Todas las incertidumbres

estuvieron por debajo del 15% al igual que los porcentajes de error en las

concentraciones medidas.

21

INTRODUCCION.

El café ha sido tradicionalmente un renglón importante de la economía colombiana

y constituye el producto más importante de la agricultura. Colombia se ha

posicionado como productor de unos de los cafés suaves más apetecidos del

mundo y el 63.4% de sus exportaciones se destinan a Estados Unidos, Alemania y

Japón [1].

Por otro lado, la producción agrícola mundial se ve afectada por pérdidas de hasta

el 45% debido al ataque de una variedad de plagas incluyendo insectos,

nematodos, virus y bacterias, las enfermedades asociadas y la competencia por

malezas lo que ha generado una dependencia de los agricultores a los plaguicidas

químicos sintéticos para la protección de cultivos contra la depredación de los

insectos, sin embargo estos plaguicidas son muy agresivos con el medio ambiente

y solo reducen las perdidas en un 7% [2].

La acumulación de residuos de plaguicidas en los organismos está altamente

influenciada por el contenido de grasa de dicho organismo y la naturaleza lipofílica

del plaguicida. A pesar de que el contenido de grasa en los tejidos de las plantas

no es tan significativo, algunas especies de plantas han demostrado que tienen

mayores factores de bioacumulación. Esta acumulación de plaguicidas en la

planta puede tener graves consecuencias a través de la cadena alimentaria lo que

representa un potencial de efectos nocivos para la vida silvestre y los seres

humanos [3, 4].

En general, la dieta es la vía de exposición predominante para los plaguicidas, el

consumo de principios activos a través de la ingestión de alimentos ha demostrado

ser hasta cinco órdenes de magnitud más alta que otras vías de exposición como

la inhalación de aire y la ingestión de agua potable [3].

22

El uso de plaguicidas en la agricultura es por tanto objeto de un seguimiento

permanente debido al riesgo potencial que suponen para la salud pública y los

ecosistemas. En el cultivo, almacenamiento y trasporte del café se usan

plaguicidas, como insecticidas, herbicidas, nematicidas, fungicidas, que de no

aplicarse de manera controlada podrían aportar residuos al producto final; estos

residuos tienen unos límites máximos permitidos de acuerdo con parámetros

internacionales, por encima de los cuales podrían afectar la salud humana [28].

En Colombia, el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y el Ministerio de la

Protección Social promulgaron en 2007 la resolución 2906 por la cual se

establecen los Límites Máximos de Residuos de Plaguicidas -LMR- en alimentos

para consumo humano entre los cuales se encuentra el café en grano [5].

Internacionalmente es la FAO (Food and Agriculture Organization of United

Nations) quien establece los LMR para alimentos [6]. Se hace necesario el apoyo

de laboratorios acreditados que cuenten con métodos de análisis confiables,

sensibles y robustos como la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría

de masas, con la capacidad de cuantificar plaguicidas a las concentraciones

exigidas por la legislación vigente y que sirvan de apoyo para los organismos de

control en la certificación de productos agrícolas de exportación.

23

JUSTIFICACIÓN

Colombia ha sido tradicionalmente uno de los mayores proveedores de café suave

en el mercado internacional y está sujeto a legislaciones cada vez más rigurosas

que controlan los residuos de contaminantes tipo plaguicidas en los productos

agrícolas de exportación. En Colombia el Ministerio de la Protección Social

establece los límites máximos de residuos de 14 plaguicidas organofosforados,

organoclorados, carbamatos, piretroides y triazoles en café en grano mediante la

resolución 2906 de 2007; la Federación Nacional de Cafeteros es la entidad

encargada de verificar el cumplimiento de la normatividad establecida, para lo cual

se apoya en el Laboratorio de Calidad de Productos Naturales (CPN) de la

Universidad Tecnológica de Pereira.

Aunque existen diversas metodologías analíticas para la determinación de

plaguicidas, que van desde volumétricas, espectrofotométricas y cromatográficas,

la técnica que brinda mayor selectividad y alta sensibilidad para una amplia gama

de analitos la constituye la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de

masas, además esta técnica permite el análisis simultaneo de plaguicidas de

diversa naturaleza química.

Para el CPN estandarizar la técnica multiresiduo para la determinación de

plaguicidas representa un gran aporte al sector agrícola ya que permite a los

caficultores certificar la calidad de sus productos de exportación, de igual forma

constituye un apoyo técnico a las entidades gubernamentales encargadas de

regular los plaguicidas en los alimentos de acuerdo con la legislación vigente.

La posibilidad de brindar este servicio representa además un fortalecimiento para

el Laboratorio CPN y para la Universidad Tecnológica de Pereira por la interacción

con la comunidad, solucionando problemas específicos y generando recursos para

financiar la investigación en el campo de la química analítica y los productos

naturales.

25

OBJETIVOS.

OBJETIVOGENERAL

Estandarizar una metodología para la determinación multiresiduo de plaguicidas

organofosforados y triazoles en café verde usando extracción en fase solida

(SPE) y cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC/MS).

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Establecer los atributos del método de cromatografía de gases acoplado a

espectrometría de masas para la determinación de plaguicidas en café

verde.

Evaluar la técnica de extracción en fase sólida por medio de los porcentajes

de recuperación de los analitos a partir de la matriz de café.

Evaluar los interferentes de la matriz del café en la lectura instrumental y

calcular los límites de detección y cuantificación del método.

Evaluar la precisión global del método mediante la estimación de la

incertidumbre de la medición.

27

1. MARCO TEÓRICO.

1.1. EL CAFÉ

Se conocen como café los granos obtenidos de unas plantas perennes tropicales

(cafetos), morfológicamente muy variables, los cuales, tostados y molidos, son

usados principalmente para preparar y tomar como una infusión [29].

El género pertenece a la familia de las Rubiáceas (Rubiaceae), que tiene

alrededor de 500 géneros y más de 6000 especies, la mayoría árboles y arbustos.

Son principalmente de origen tropical, y de una amplia distribución, a ella

pertenecen plantas medicinales como la ipecacuana (Psichoria ipecacuanha), o la

Cinchona spp., de la cual se extrae la quinina [29].

Taxonómicamente, todas estas plantas se clasifican como del género Coffea, y se

caracterizan por una hendidura en la parte central de la semilla. Se encuentran

desde pequeños arbustos hasta árboles de más de 10 m.; sus hojas, que son

simples, opuestas y con estípulas, varían tanto en tamaño como en textura; sus

flores son completas (en la misma flor se encuentran todos los órganos) blancas y

tubulares; y los frutos, son unas drupas de diferentes formas, colores y tamaños,

dentro de las cuales se encuentran la semillas, normalmente dos por fruto [29].

La primera descripción de una planta de café fue hecha en 1592 por Prospero

Alpini y, un siglo después, Antoine de Jussieu (1713) la denominó Jasminum

arabicanum (la consideró un jazmín). Fue Linneo (1737) quien la clasificó en un

nuevo género, el género Coffea, con una sola especie conocida: C. arabica. Hoy,

se reconocen 103 especies, sin embargo, sólo dos son responsables del 99% del

comercio mundial: Coffea arabica y Coffea canephora. Son originarias de África, o

de Madagascar (incluido los Comores) [29].

28

Los granos de café son las semillas de un fruto llamado popularmente cereza.

Estas cerezas están compuestas por una cubierta exterior, el exocarpio, el cual

determina el color del fruto; en el interior hay diferentes capas: el mesocarpio, es

una goma rica en azúcares adherida a las semillas que se conoce como mucílago;

el endocarpio es una capa amarillenta que cubre cada grano, llamada pergamino;

la epidermis, una capa muy delgada conocida como la película plateada; y los

granos o semillas, el endosperma, conocidos como el café verde, que son los que

tuestan para preparar los diferentes tipos de café [29].

El café es el principal producto agrícola de exportación, representa el 52% de las

exportaciones de todo el sector agropecuario con un valor de cosecha cercano a 5

billones de pesos anuales, ingresos que llegan a más de dos millones de personas

en la zona rural por lo que se considera el principal dinamizador de la economía

rural en Colombia [7].

Las especies del café más importantes comercialmente en el mundo son Arábica

(Coffea arabica L) y Robusta o Canephora (Coffea canephora). Coffea canephora

tiene una amplia distribución geográfica y se encuentra silvestre en el África,

como en Congo, Sudán, Uganda, y el Noroeste de Tanzania y Angola.

Aproximadamente, el 35% del café que se comercializa en el mundo es de esta

especie, conocida como Robusta. Las zonas bajas tropicales de África,

permitieron que esta especie desarrollara con el paso de los siglos resistencia a

numerosas plagas y enfermedades. Es en consecuencia más resistente a muchas

de las enfermedades del café, especialmente a la roya (Hemileia vastatrix), y esta

característica determinó su cultivo en el mundo a comienzos del siglo pasado. Se

cultiva generalmente en altitudes por debajo de 1000 m. Es de polinización

cruzada, por lo que para su cultivo se deben sembrar varios genotipos

compatibles. No se cultiva en Colombia. Su contenido de cafeína es mayor al 2%;

su taza es más amarga y con sabor a cereal. Investigaciones más recientes han

podido determinar que la especie Robusta es una de las más antiguas al

29

originarse hace más de 5 millones de años; incluso hay quienes consideran que

puede tener cerca de 25 millones de años [29].

Coffea arabica L. es actualmente la principal especie del género, y constituye más

del 60% del café que se comercializa en el mercado internacional. Es una especie

autógama, es decir, se autopoliniza o autofertiliza. Su centro de origen se

encuentra en el Sudeste de Etiopía, el Sur del Sudán y el Norte de Kenya. Es una

especie tetraploide (tiene 44 cromosomas), que proviene de formas antiguas de

dos especies diploides Coffea eugenioides (22 cromosomas), probablemente

como madre, y C. canephora (22 cromosomas), como padre. Estudios científicos

la catalogan como una especie relativamente "joven", que hizo su aparición hace

menos de 1 millón de años. Se considera un café de altura, que se cultiva bien en

temperatura de 18 a 23 0C. En Colombia las plantaciones están concentradas en

altitudes que oscilan entre los 1200 y los 1800 m.s.n.m. el contenido de cafeína de

los granos está entre 1,0 y 1,4% en base a materia seca, y es menos amargo que

la otra especie cultivada. Es el café de mejor calidad en taza [29].

Las variedades de café arábigo que se siembran en Colombia son:

Típica también llamada arábigo, pajarito o nacional.

Borbón.

Tabi que es una variedad de grano grande, tiene una excelente calidad y es

ideal para obtención de cafés especiales.

Caturra.

Variedad Colombia.

1.1.1. Café de Colombia.

CAFE DE COLOMBIA es la denominación que se le otorga al café 100% arábico

producido en las regiones cafeteras de Colombia, delimitadas entre la latitud

Norte 1° a 11°15, Longitud Oeste 72° a 78° y rangos específicos de altitud que

pueden superar los 2.000 metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.). Surge de la

particular combinación de diversos factores correspondientes a la latitud y altitud

30

de la tierra del café en Colombia, sus suelos, el origen botánico de la especie y

variedades de café producidas, el clima caracterizado por el doble paso de la Zona

de Convergencia Intertropical, la cambiante topografía, la luminosidad, rango

favorable de temperaturas, una adecuada cantidad y distribución de las lluvias

durante el año y unas prácticas culturales comunes que incluyen procesos de

recolección selectiva y de transformación del fruto mediante su beneficio, lavado y

secado. Estos factores, de manera conjunta, conducen a la producción de un café

sobresaliente, suave, de taza limpia con acidez relativamente alta, cuerpo

balanceado, aroma pronunciado y un perfil sensorial de excelente calidad [30].

1.1.2. La cadena del café.

Cuando se hace referencia al café se trata de sus formas o estadios: pergamino,

verde, tostado, e incluye el café molido, descafeinado, liofilizado, líquido y soluble.

En su proceso al mercado el café recorre diferentes fases, en primer lugar la

cadena comprende las actividades agrícolas que se realizan en finca, tales como

siembra, recolección, beneficio y secado, en el proceso de secado el café pasa de

pergamino mojado a pergamino húmedo y pergamino seco. El pergamino seco se

transporta a la trilladora donde se le extrae la película que lo cubre denominada

endocarpio. Aquí el café se convierte en café verde el cual es clasificado según el

tamaño y la calidad del grano. Posteriormente el café es tostado y el grano

adquiere su color café característico [1].

El componente agrícola de la cadena productiva de café (siembra, cosecha,

recolección y secado) es altamente generador de empleo con una ocupación

aproximada de 500.000 empleos directos [1].

En Colombia, el café verde se destina directamente a exportación mientras que la

producción orientada al consumo interno llega hasta la etapa final del proceso:

tostión, molienda y empacado [1].

Durante el primer mes del año cafetero que arrancó en octubre de 2012 y va hasta

septiembre de 2013, las exportaciones mundiales de café sumaron 8,88 millones

31

de sacos de 60 kilos mientras que en el mismo mes del año 2011 fue de 7,57

millones, no obstante las exportaciones cafeteras colombianas presentaron una

leve caída de 602.693 a 582.104 sacos [8].

En cuanto a la producción durante el año cafetero que terminó, Colombia ocupó el

cuarto lugar con 7,8 millones de sacos de 60 kilos, el primer lugar lo ocupa Brasil,

con 43,4 millones de sacos; seguido de Vietnam, con 20 millones, e Indonesia,

con 8,2 millones de sacos de café. El total mundial producido fue de 131,2

millones de sacos [8].

Aunque la participación en el volumen de producción mundial ha descendido

frente a Brasil y Vietnam, la participación en valor de las exportaciones mundiales

se ha mantenido superior al 15%, lo que refleja el posicionamiento del café de

Colombia en los mercados externos [7].

1.1.3. Principales enfermedades del café

El control de las principales enfermedades de los cafetales en los Andes de

Colombia es otra fuente de constante trabajo y esfuerzo para las familias

cafeteras. Las enfermedades son causadas por hongos, bacterias, virus y

nemátodos. Las de mayor importancia económica son: la roya, Hemileia vastratix;

las llagas del tallo y de las raíces, Ceratocystis fimbriata y Rosellinia bunodes; la

mancha de hierro, Cercospora coffeicola; el mal rosado, Corticium salmonicolor; el

volcamiento, Rhizocytonia solani; la muerte descendente, Phoma sp. y nemátodos

del género Meloidogyne [31].

1.1.3.1. La roya

Es un hongo conocido como Hemileia vastratix, que se distingue fácilmente por la

presencia de un polvillo amarillo en el envés de las hojas enfermas. Es una

enfermedad cíclica que afecta principalmente el follaje, produce defoliación y el

daño conocido como "paloteo". Está ligado a los años de alta producción con

epidemias severas. En cultivos susceptibles, la enfermedad ha causado pérdidas

32

hasta del 23% de la producción acumulada de cuatro cosechas. La relación de

café cereza a café pergamino seco puede llegar a valores de 8 a 1 [31].

El principal método de manejo es sembrar material resistente a la roya, como la

Variedad Castillo. En los materiales susceptibles como: Borbón, Típica

Maragogipe y Caturra, se requiere del uso de fungicidas protectores como el

Oxicloruro de Cobre, y sistémicos como el Cyproconazol o Triadimefon [31].

1.1.3.2. Las llagas del cafeto

Se conocen dos tipos de llagas en el cafeto: la llaga macana, Ceratocystis

fimbriata, y las llagas radicales, Rosellinia bunodes y R. pepo. Son hongos

habitantes del suelo que desde hace más de 30 años se vienen incrementando en

el país por las prácticas de renovación por zoqueo, podas de ramas bajeras,

deschuponadas, descopes o pisoteo en la base de los tallos, cuando no se

protegen las heridas y principalmente en época húmeda [31].

Causa la muerte de los árboles. En ataques severos puede reducir entre el 20% y

el 40% la densidad de plantas. Se recomienda la desinfección de las herramientas

con hipoclorito al 5% o formol al 10% y la protección de las heridas con fungicidas

como benomil y carbendazim, en dosis de 4 gramos por litro de agua [31].

El control es básicamente preventivo. Una vez que ataca la enfermedad, no se

conocen productos curativos. Los árboles enfermos se deben eliminar con todo y

raíz y exponer a los rayos del sol mínimo durante 3 meses [31].

1.1.3.3. La mancha de hierro

Es la enfermedad más generalizada en Colombia, causada por el hongo

Cercospora coffeicola. Afecta el cafeto durante todos sus estados de desarrollo,

desde las hojas cotiledonares hasta los frutos. Se caracteriza porque son

pequeñas manchas circulares de color pardo claro o marrón rojizo [31].

Permanentemente, causa la caída de las hojas e incrementa la producción de café

33

pasilla, mediacara y guayaba que afectan la calidad. Los cafetales a plena

exposición y mal fertilizados son los más susceptibles [31].

1.1.4. Principales plagas del café

Hay reconocidas más de 100 especies de insectos que viven en armonía en los

cultivo del café. Sólo tres de ellos representan un impacto económico: la broca,

Hypothenemus hampei, el minador de la hoja, Leucoptera coffeellum, y la

palomilla de las raíces, Dysmicoccus spp [31].

1.1.4.1. La broca del café, Hypothenemus hampei

Es la plaga más dañina que ha afectado el cultivo del café en toda su historia.

Desde septiembre de 1988 se registró en el país y ha ocasionado grandes

pérdidas en todos los departamentos cafeteros; incluso, marginó el cultivo de las

zonas bajas. Ataca directamente los frutos de café, es decir, afecta principalmente

la producción y la calidad [31].

Es un insecto de difícil manejo con los métodos tradicionales de control como los

insecticidas, porque permanece protegido la mayor parte de su vida en el interior

de los frutos. Algunos de los adultos son susceptibles a las aspersiones de estos

productos, que tienen efecto únicamente por contacto con la plaga [31].

La broca es un gorgojo de color negro, del tamaño de la cabeza de un alfiler. Es

muy perjudicial porque cuando ataca, perfora y daña los granos, para alimentarse

de las almendras del café. Es una plaga que inicia su ataque en los frutos verdes

del cafeto, entre los 3 y 4 meses después de la florescencia [31].

Para su control hay diferentes métodos, de los cuales el más utilizado es el

conocido como manejo integrado de la broca. Éste consiste en un control

cultural, que incluye el manejo en el beneficio, la recolección oportuna de los frutos

en el momento de su maduración y el control biológico con la utilización de

avispas y de hongos. Las avispas se crían y luego se liberan en los cafetales para

que se establezcan y se coman parte de la población de broca, buscándola dentro

34

de los frutos. El hongo es un moho blanco que se espolvorea en los cafetales para

que mate parte de la población de la broca [31].

La broca se expande a otras plantaciones por varias vías: en las semillas y frutos

atacados; cuando el hombre los lleva de un lugar a otro; en la ropa, sombrero o

calzado de las personas que transitan por las plantaciones; en herramientas y

equipos, tales como machetes, costales y canastos; en los vehículos; y en el agua

que se usa durante el lavado del café, etc [31].

1.1.4.2. El minador de la hoja, Leucoptera coffeellum

Es una plaga muy dañina que afecta principalmente el área fotosintética y causa la

defoliación de los árboles, y ha obligado a los agricultores de las zonas bajas al

uso de insecticidas [31].

Es conocida como una especie monófaga porque sólo ataca el género Coffea. Se

ha encontrado resistencia en las especies diploides como Coffea stenophylla. Los

daños son causados durante su estado de larva, cuando consume entre 1,0 y 2,0

cm² de área foliar durante su proceso evolutivo. Si concurren varias larvas en una

sola hoja puede llegar a causar necrosamiento en el 90% de su estructura [31].

1.1.4.3. La palomilla de la raíz

Son varias especies: Dismicoccus alazon, D. brevipes y D. criptus que

generalmente están asociadas con el hongo Septobasidium y las hormigas del

género Solenopsis.

Las colonias se inician desde el almácigo, donde afectan el cuello de la raíz de las

plantas, y en el campo su población aumenta y es cuidada por las hormigas. Los

síntomas externos en el árbol son similares a los producidos por un ataque de

llagas, que ocasionan el marchitamiento generalizado de la planta [31].

Su control es preventivo. Una vez establecida en los lotes es muy costoso y

dispendioso manejarla, y en muchos casos es mejor sustituir los árboles atacados.

35

1.2. LOS PLAGUICIDAS

1.2.1. Generalidades e historia

Plaguicida: Sustancia o mezcla de sustancias químicas de origen organosintético,

de naturaleza tóxica y por consiguiente con un alto poder para alterar en forma

drástica la fisiología de los organismos. Se utilizan en la actividad agrícola como

medio de control para enfermedades, plagas y malezas. Normalmente, la acción

del plaguicida no es específica para la especie objetivo y en consecuencia se

producen efectos de diferentes magnitudes sobre otras especies y sobre los

ámbitos expuestos a su acción [9].

Existe evidencia histórica que la primera civilización en utilizar plaguicidas, fueron

los egipcios a orillas del río Nilo. Existen papiros que detallan el uso de soluciones

de cobre para el control de hongos en cebada y el uso de soluciones acuosas de

compuestos arsenicales para el control de la langosta. En Estados Unidos, para el

año 1922, ya se utilizaba a orillas del Delta del Mississippi compuestos arsenicales

espolvoreados para el control de insectos en algodón [10].

En 1942, el químico Suizo Paul Hermann Müller (1925-1965), descubrió las

propiedades insecticidas de un compuesto orgánico clorado llamado

dicloro,difenil,tricloroetano, DDT. Paul Müller recibió en 1948 el premio Nobel de la

Medicina por este descubrimiento. Aunque la molécula ya había sido sintetizada

antes por el químico Othmar Zeidler, en 1874, fue el trabajo investigativo de Müller

quién hizo que esta molécula se convirtiera en el insecticida de mayor uso desde

1942 hasta 1970 [10].

El trabajo de investigación de Paul Müller ayudó al descubrimiento de otros

insecticidas organoclorados, entre ellos el aldrin, el cual fue introducido al mercado

en 1948, el clordano (1945), el dieldrin (1948), el endrin (1951), el heptacloro

(1948) y el toxafeno, que fue presentado al mercado de agroquímicos en 1948

[10].

36

Aunque el insecticida DDT de Müller empezó con mucho éxito a mediados del

siglo 20, al final cayó víctima de las mismas propiedades que lo habían logrado

llevar a la fama. Su extrema estabilidad química le confería una persistencia

inaceptable en el ambiente; y aunque su toxicidad aguda para los mamíferos era

relativamente baja, su alta solubilidad en lípidos le confería una alta toxicidad

crónica y una alta tendencia a la bioacumulación y la biomagnificación. Se estima

que para el año 1963, ya se habían fabricado y aplicado al ambiente un total de

453 millones de Kilogramos de DDT a nivel mundial [10].

El uso masivo de este insecticida empezó a mostrar un nuevo problema en la

protección de cultivos, la “resistencia” biológica de los insectos. En 1950, se

empezó a notar que las dosis “normales” de DDT en los cultivos de algodón de

Estados Unidos, no estaban controlando las plagas como lo hacían antes. Los

biólogos del USFDA reportaron que se estaban formando “razas” de insectos

resistentes al DDT. Además, el uso indiscriminado del insecticida había

disminuido las poblaciones de depredadores naturales de insectos que no se

consideraban plagas, pero con el tiempo, y sin la presencia de un control natural,

insectos que no eran plagas, lo eran ahora [10].

Durante la Segunda Guerra Mundial, se llevaron a cabo muchas investigaciones

en el desarrollo de gases tóxicos para ser empleados por el Tercer Reich como

armas de destrucción humana masiva. Estos trabajos llevaron al descubrimiento

de un grupo de insecticidas más efectivos que los organoclorados como el DDT,

este nuevo grupo se denominó organofosforados [10].

Los insecticidas organofosforados presentaron una nueva variante en el mundo de

los plaguicidas, ya que estos tenían propiedades sistémicas; lo cual significa que

aunque las sustancias podían eliminar las plagas a su contacto, también eran

absorbidas por la misma planta (sistémica), volviéndose ellas mismas tóxicas a los

insectos [10].

37

El primer insecticida sistémico de este tipo fue el dietilparanitrofenilmonotiofosfato,

llamado comúnmente parathion. Estos insecticidas resultaron muy efectivos para

el control de plagas, especialmente por sus propiedades sistémicas, eran bajos en

costo, pero presentaban riesgos para la salud humana. Estos insecticidas eran

altamente tóxicos para los mamíferos, podían ser absorbidos por la piel y a través

de las vías respiratorias de los operarios del equipo de aplicación. Además,

algunos de ellos presentaban propiedades teratogénicas [10].

Nuevas investigaciones dieron lugar a moléculas con estructuras más complejas,

actualmente existen cerca de 10 clasificaciones de plaguicidas en cuanto a su

estructura química [10]:

Organoclorados: presentan cloro en su molécula

Organofosforados: son fundamentalmente ésteres del ácido fosfórico

Carbamatos: derivados del ácido N-metil-carbámico

Piretrinas: productos naturales del Pyrethrum cinaerefolium

Piretroides: productos sintéticos

Derivados del ácido fenoxiacético

Bipiridilos: compuestos de amonio cuaternario

Derivados triazínicos

Fenoles halogenados

Organobromados

Fosfaminas

1.2.2. Química de los plaguicidas

En la tabla 1 se resumen las principales características químicas de los

plaguicidas mencionados en la resolución 2906 y que son objeto de este estudio

[32,33,34]

38

Tabla 1. Características químicas de algunos plaguicidas controlados en café en grano

por la resolución 2906 de 2007 del ministerio de la protección social.

OO

P

SS

S

Acido ditiofosforico O,O'-dietil S-etilsulfanilmetil ester

Forato

LD50: 2 mg/Kg

CAS: 298-02-2

PM : 260.39

FM: C7H17O2PS3

INSECTICIDA

Nombre comercial: Thimet

Clasificación: Organofosforado

Clase: 1A (extremadamente peligroso)

OO

P

SS

S

Acido ditiofosforico S-ter-butilsulfanilmetil O,O'-dietil ester

Terbufos

FM: C9H21O2PS3

INSECTICIDA



PM : 288.45LD50: 5 mg/Kg

CAS: 13071-79-9

Nombre comercial: Counter

O

O

P

S

S

S

Acido ditiofosforico O,O'-dietil S-(2-etilsulfanil-etil) ester

Disulfoton

LD50: 2 mg/Kg

CAS: 298-02-2

PM : 260.39

FM: C8H19O2PS3

INSECTICIDA

Nombre comercial: Thimet



N

Cl

Cl

Cl

OO

P

SO

Clorpirifos

Acido tiofosforico O,O'-dietil O''-(3,5,6-tricloro-2-piridinil) ester

LD50: 82 mg/Kg

CAS: 2921-88-2

PM : 350.59

INSECTICIDA

Nombre comercial: Dursban, Lorsban


Clase: II (moderadamente peligroso)

FM: C9H11Cl3NO3PS

39

Continuación Tabla 1. Características químicas de algunos plaguicidas controlados en

café en grano por la resolución 2906 de 2007 del ministerio de la protección social.

ClO

C

O

NN

N

1-(4-Cloro-fenoxi)-3,3-dimetil-1-[1,2,4]triazol-1-il-2-butanona

Triadimefon

FM: C14H16ClN3O2

LD50: 363 mg/Kg

CAS: 43121-43-3

PM : 293.78

FUNGICIDA

Nombre comercial: Amiral, Bayleton

Clasificación: Triazol

Clase: III (ligeramente peligroso)

ClO

OH

NN

NTriadimenol

1-(4-Cloro-fenoxi)-3,3-dimetil-1-[1,2,4]triazol-1-il-2-butanol

FM: C14H18ClN3O2

LD50: 700 mg/Kg

CAS: 55219-65-3

PM : 295.80

FUNGICIDA

Nombre comercial: Bayfidan, Baytan, Summit


Clase: III (ligeramente peligroso)

Cl

N

NN

PropiconazolO

O

Cl

1-[2-(2,4-Dicloro-fenil)-4-propil-[1,3]dioxolan-2-ilmetil]-1H-[1,2,4]triazol

LD50: 1517 mg/Kg

CAS: 60207-90-1

PM : 342.25

FUNGICIDA

Nombre comercial: Banner, Tilt


Clase: II (moderadamente peligroso)

FM: C15H17Cl2N3O2

40

1.3. LEGISLACIÓN PARA EL CONTROL DE PLAGUICIDAS

1.3.1. Legislación Internacional

Codex Alimentarius, es una colección reconocida internacionalmente de

estándares, códigos de prácticas, guías y otras recomendaciones relativas

a los alimentos, su producción y seguridad alimentaria bajo el objetivo de la

protección del consumidor. Oficialmente este código es mantenido al día

por la Comisión del Codex Alimentarius, un cuerpo conjunto con la Food

and Agriculture Organization (FAO) organismo perteneciente a las Naciones

Unidas y a la Organización Mundial de la Salud (WHO) cuyo objeto ya

desde 1963 es la protección de la salud de los consumidores y asegurar las

prácticas en el transporte internacional de alimentos. El Codex Alimentarius

enlista los alimentos que no deben contener una cantidad mayor de

residuos de plaguicidas (definidos, individualmente, en la definición del

residuo) que la que señala el límite máximo de residualidad (LMR) en mg/kg

en a) el punto de entrada en un país o b) el punto de entrada en los canales

comerciales de un país [6].

Convenio de Basilea para el control de los desplazamientos transfronterizos

de desechos peligrosos y su eliminación, es el tratado multilateral de medio

ambiente que se ocupa más exhaustivamente de los desechos peligrosos y

otros desechos. Cuenta con 170 países miembros (Partes) y su objetivo es

proteger el medio ambiente y la salud humana contra los efectos nocivos

derivados de la generación, el manejo, los movimientos trasfronterizos y la

eliminación de los desechos peligrosos y otros desechos, fue aprobado en

1989 y entró en vigor en 1992 [9].

Convenio de Estocolmo sobre contaminantes orgánicos persistentes

(COPs) es un acuerdo internacional que regula el tratamiento de las

sustancias tóxicas. Fue firmado en 2001 en Estocolmo y entró en vigor el

17 de mayo del 2004. Inicialmente el convenio regulaba doce productos

químicos incluyendo productos producidos intencionadamente, tales como:

41

plaguicidas, PCBs; dioxinas y furanos. Actualmente hay 172 países que han

ratificado el convenio [9].

Resolución 630 de 2002. Manual técnico andino para el registro y control de

plaguicidas químicos de uso agrícola [9].

Convenio de Rótterdam para la aplicación del procedimiento de

consentimiento fundamentado previo aplicable a ciertos plaguicidas y

productos químicos peligrosos objeto del comercio internacional entró en

vigor el 24 de febrero de 2004 [9].

1.3.2. Legislación Nacional

Ya sea por solicitud de los Ministerios de Salud o de Agricultura y mediante

Resolución de la Gerencia General del ICA, o del Ministerio de Agricultura, desde

1974 hasta la fecha, se han venido restringiendo o prohibiendo el uso en el país

de algunos plaguicidas señalados a continuación en la tabla 2 [5,11,12,13,14].

Tabla 2. Resoluciones vigentes para el control de plaguicidas en Colombia.

LEY, RESOLUCIÓN, DECRETO O ACUERDO #

AÑO DE EMISIÓN

ENTIDAD QUE EMITE OBJETO DE LA NORMA

R-447 1974 Ministerio de agricultura

Prohíbe el uso y venta de plaguicidas clorados para el cultivo de tabaco.

R-2189 1974 Instituto Colombiano Agriopecuario ICA

Cancela registro de fungicidas a base de compuestos de mercurio.


Cancela registro de plaguicidas a base de leptophos (Phosvel)

R-209 1978 Ministerio de agricultura

Prohíbe el uso de plaguicidas organoclorados en el cultivo del cafeto

Ley 9 1979 Congreso de la Republica

Establece las normas generales que sirven de base a las disposiciones y reglamentaciones emitidas para preservar, restaurar y mejorar las condiciones sanitarias en lo que se relaciona a la salud humana. Incluye normas generales sobre la producción, formulación, almacenamiento, distribución, movilización y aplicación aérea de los plaguicidas

42

Continuación Tabla 2. Resoluciones vigentes para control de plaguicidas en Colombia.


AÑO DE EMISIÓN


R-749 1979 Instituto Colombiano Agropecuario ICA

Cancela registro de venta de productos a base de 2,4,5-T y 2,4,5-TP


Prohíbe la producción, importación y venta de plaguicidas a base de Dibromocloropropano (DBCP)


Prohíbe la producción, importación y venta de plaguicidas a base de Dibromuro de etileno (EBD)


Prohíbe la producción, importación y venta de plaguicidas a base de Endrin

D-704 1986 Presidencia de la Republica

Prohíbe el uso de DDT, sus derivados y compuestos.


Prohíbe la producción, importación y venta de plaguicidas a base de Dinoseb

R-19408 1987 Ministerio de salud Prohíbe el uso y manejo de los plaguicidas a base de Clordimefon y sus sales

D-305 1988 Presidencia de la Republica

Prohíbe la importación, producción y formulación de plaguicidas a base de aldrin, heptacloro, dieldrin, clordano y canfecloro.


cancela la licencia de venta de plaguicidas que contienen clordimeform en su composición


prohíbe la aplicación por vía aérea en el territorio nacional de los herbicidas que contienen Paraquat


Cancela licencia de venta correspondiente al fungicida de uso agrícola denominado Dithane M-22 (Maneb)


Cancela licencias de venta a los plaguicidas de uso agrícola denominados Manzate D y Manzate.

43

Continuación Tabla 2. Resoluciones vigentes para control de plaguicidas en Colombia


AÑO DE EMISIÓN



Prohíbe la importación, producción y venta de plaguicidas que contengan en su composición el ingrediente activo Captafol


Prohíbe la importación, producción, venta y aplicación en el territorio nacional de los fungicidas que contengan Terbuconazol

D-1843 1991 Ministerio de Salud

Reglamenta parcialmente los títulos III, V, VI, VII y XI de la Ley 9 de 1979 sobre uso y manejo de plaguicidas con el objeto de evitar que afecten la salud de la comunidad, la sanidad animal y vegetal o causen deterioro al medio ambiente


Cancela las Licencias de Venta de los insecticidas a base de LINDANO


Restringe los usos de PARATHION, únicamente a plagas de algodón y pastos tecnificados y del METIL PARATHION únicamente a plagas del algodón y arroz tecnificado.


Prohíbe el uso de insecticidas para uso agrícola a base de Fonofos.

R-9913 1993 Ministerio de salud

Prohíbe la importación, producción y aplicación de los Fungicidas Maneb, Zineb y sus compuestos relacionados.


Prohíbe la importación, producción, formulación, comercialización, uso y manejo de los siguientes productos: DIELDRIN, CLORDANO, DODECACLORO o MIREX, PENTACLOROFENOL, DICOFOL, DDT, BHC HEPTACLORO, LINDANO y sus compuestos relacionados usados contra la broca del café.


Prohíbe la importación, fabricación, comercialización y uso de los plaguicidas con base en Bromuro de Metilo, solo o en combinación.

44

Continuación Tabla 2. Resoluciones vigentes para control de plaguicidas en Colombia


AÑO DE EMISIÓN



Por la cual se autoriza el uso de productos con base en ENDOSULFAN únicamente para el control de la broca del cafeto (Hipotenemus hampei).


Por la cual se cancela el registro de venta No. 0852 correspondiente al insecticida biológico denominado DIPEL WP.

R-.1312 2001 Instituto Colombiano Agriopecuario ICA

Cancela registro de venta del producto Thionex 35 EC, formulado a base de endosulfan


suspender el registro de venta de los productos TESS 50 EW (deltametrin) y LARVIN 375 SC (tiodicarb)


Por la cual se cancela registro de venta al fungicida Benlate WP a base de Benomyl.


Por el cual se adopta el manual de procedimientos de regulación y control de plaguicidas químicos de uso agrícola.

R-2906 2007 Ministerio de la protección social

Establece los Límites Máximos de Residuos de Plaguicidas -LMR- en alimentos para consumo humano y en piensos o forrajes


Por el cual se establecen obligaciones sobre la desnaturalización, almacenamiento y disposición final de desechos peligrosos e insumos agrícolas.


Por la cual se establecen requisitos para ampliación de uso de plaguicidas químicos de uso agrícola en cultivos menores.


Por el cual se establecen los requisitos para otorgar el registro de importador de plaguicidas de uso agrícola para uso directo.

45

1.4. TECNICAS ANALÍTICAS PARA LA DETERMINACION DE PLAGUICIDAS

Las primeras etapas en el control de plaguicidas se hizo con técnicas

gravimétricas y volumétricas que permitían la cuantificación de contaminantes

pero no la identificación individual de los mismos, posteriormente se introdujeron

técnicas de laboratorio que permitían la separación identificación y cuantificación

de los plaguicidas:

1.4.1. Cromatografía de gases

La cromatografía de gases es una de las técnicas más utilizadas en la química

analítica moderna, la posibilidad de analizar simultáneamente cientos de analitos

en unos pocos minutos, de trabajar con cantidades de muestra extremadamente

pequeñas y de poder detectar cantidades también muy pequeñas de analito, del

orden de picogramos en muchos casos; así como su aplicabilidad en una gran

variedad de disciplinas como la bioquímica, agronomía, química forense,

fitoquímica entre otras, ha hecho de la cromatografía de gases una herramienta

indispensable en casi cualquier laboratorio químico tanto de control de calidad

como de investigación [15].

La cromatografía de gases ha mostrado ser una técnica sensible, selectiva y

reproducible, por lo que es ampliamente utilizada para el análisis de sustancias

controladas por las autoridades como los plaguicidas entre otras [16,17,18].

Para ser analizadas por cromatografía de gases las moléculas deben ser

relativamente volátiles o debe ser posible convertirlas en un derivado que lo sea.

Con pocas excepciones, casi todos los plaguicidas se analizan por cromatografía

de gases.

El proceso comprende varios pasos: extracción de los plaguicidas de la matriz con

un solvente orgánico; los más usados son acetona, acetato de etilo y acetonitrilo.

Limpieza del extracto, para minimizar las interferencias de la matriz; puede

hacerse con extracción liquido-liquido (LLE), en fase solida (SPE) o

46

microextracción en fase solida (SPME). Finalmente la separación cromatográfica

y la cuantificación. Del extracto conteniendo los plaguicidas se toma una alícuota

y se introduce al cromatógrafo a través del puerto de inyección donde los analitos

se vaporizan y se mezclan con el gas de arrastre, generalmente helio (también se

usa en ocasiones nitrógeno o argón), cuya función es la de introducir y transportar

los analitos de la columna para que sean separados por la fase estacionaria. A la

salida de la columna se instala un sistema de detección que entrega alguna señal

en función de la cantidad de masa de cada componente y del tiempo [15,19].

La cromatografía de gases se puede clasificar en dos tipos, cromatografía gas

sólido y cromatografía gas líquido, en la cromatografía gas sólido, como su

nombre lo indica, la fase estacionaria es un sólido que retiene los analitos por

medio de la adsorción física, con el inconveniente de que se presenta adsorción

semipermanente de muchas moléculas activas o polares, por esta razón,

actualmente encuentra poca aplicación, su uso se limita al análisis de muestras

gaseosas principalmente [15].

La cromatografía gas líquido por el contrario, tiene gran aplicación en todos los

campos de la ciencia, aquí la separación se produce por la distribución de los

analitos entre la fase móvil gaseosa y una fase liquida inmovilizada sobre la

superficie de un sólido inerte. La cromatografía gas líquido fue desarrollada por

Martin y Synge en 1941 y en 1952 recibieron el premio nobel por la invención de

esta técnica. En 1955 apareció en el mercado el primer aparato comercial de

cromatografía gas líquido [15].

47

1.4.1.1. Instrumentación para cromatografía de gases

En la figura 1 se muestra un esquema de un cromatógrafo de gases

Figura 1. Esquema de un cromatógrafo de gases

1.4.1.2. Puerto de inyección

La puerta de entrada de la muestra al sistema es el puerto de inyección, consiste

en una cámara cilíndrica de pared metálica que al momento de introducción de la

muestra está por encima de los 200°C, su función es vaporizar la mezcla [15,19].

Para evitar el contacto de las moléculas con la pared metálica caliente, lo que

puede causar descomposición y perdida de analito, se usa un pequeño dispositivo

cilíndrico construido en vidrio denominado inserto, al interior del inserto se produce

la vaporización de la muestra y es donde esta se mezcla con el gas de arrastre,

existen insertos con diferentes geometrías internas para diversas aplicaciones o

modos de inyección. Los más comunes se muestran en la figura 2.

48

(a) (b)

Figura 2. Tipos de insertos para cromatografía de gases. (a) Split (b) splitless

El modo Split (con división de muestra) se usa para el análisis de muestras a altas

concentraciones (del orden del 1%), en este modo, después de la vaporización de

la muestra, parte de ella se dirige a la columna para el análisis y otra parte (la

mayoría) se desecha por la salida Split. Cuando se trabajan muestras que se

encuentran en el nivel de trazas como en el caso de los plaguicidas, se usa el

modo de inyección splitless, aquí toda la muestra que se inyecta se lleva a la

columna para su separación y posterior determinación [15,19].

1.4.1.3. Horno y columna

A la salida del puerto de inyección se conecta la columna que se encuentra al

interior del horno, existen columnas empaquetadas con diámetros internos de 3 a

5 mm con longitudes que van de los 3 a los 15 metros, se construyen en vidrio,

acero inoxidable, cobre o teflón y normalmente se configuran como helicoides de

10 a 15 cm a fin de poder ser introducidas en el horno, están rellenas con un

soporte solido finamente dividido y homogéneo sobre el cual se inmoviliza la fase

49

estacionaria liquida. Las columnas capilares, de mayor uso, tienen diámetros

internos de 0,25 0,32 y 0,53 mm y longitudes desde 15 hasta 120 metros, las

columnas capilares son de más amplio uso pues son más eficientes y reducen el

tamaño de muestra, el tiempo de análisis y el consumo de gas de arrastre,

mientras con columnas empaquetadas se manejan flujos del orden de los 15

mL/min con columnas capilares el consumo está alrededor de 1 mL/min [15,19].

Las columnas capilares fueron introducidas en 1959, pero no entraron en pleno

uso sino hacia 1980, a partir de entonces han ganado gran popularidad; se estima

que hoy en día mas del 90% de las aplicación en CG se hacen con columnas

capilares [19].

La columna capilar original inventada y patentada por el Doctor Marcel Golay,

consistió en un tubo capilar con una capa delgada de fase liquida recubriendo la

pared interna del tubo, razón por la cual se le llamo columna tubular abierta con

pared recubierta, o WCOT por sus siglas en ingles [19].

Otros dos tipos de columnas capilares se encuentran disponibles comercialmente,

la columna tubular abierta con soporte recubierto (o SCOT, support-coated open

tubular) y la columna tubular abierta de capa porosa (o PLOT, porous layer open

tubular). Las columnas SCOT tienen una delgada capa de un soporte solido

absorbente recubierto de fase liquida, estas columnas tienen mayor cantidad de

fase móvil y por ende mayor capacidad de carga que una columna común WCOT

[19].

Las columnas PLOT contienen una capa porosa de un sólido absorbente como

alúmina o tamiz molecular. Las columnas PLOT son adecuadas para el análisis de

gases livianos, por ejemplo la separación de neón, argón, oxigeno, nitrógeno y

xenón se hace con una columna PLOT de tamiz molecular [19].

50

En la tabla 3 se muestran las fases liquidas más comunes. Existen básicamente

dos tipos de fases estacionarias liquidas: los polímeros de siloxanos y las de

polietilenglicol.

Tabla 3. Fases estacionarias liquidas más comunes en cromatografía de gases capilar

Código

USP

Características (nombre, estructura,

Polaridad y usos)

Algunas referencias comerciales

G1

CH3

Si

CH3

O

100%

Polaridad: no polarUsos: solventes, productos de petroleo, muestras farmaceuticas.

dimetilpolisiloxano 100 %

Rtx/MXT – 1 (Restek)

DB/HP – 1 (AGILENT)

SPB – 1 (Supelco)

G27

CH3

Si

CH3

O

95%

Polaridad: no polarUsos: saborizantes, muestras ambientales hidrocarburos aromaticos.

Si O

5%

difenil 5%dimetilpolisiloxano 95%



SPB – 5 (Supelco)

NO

APLICA

CH3

Si

CH3

O Si

CH3

CH3

Si

CH3

CH3

Ox y

Polaridad: no polarUsos: saborizantes, muestras ambientales, pesticidas, PCBs, hidrocarburos aromaticos.

polisilfenileno 5%dimetilpolisiloxano 95%

Rtx - 5sil MS

Rtx – 5Sil MS (Restek)

DB – 5 MS (AGILENT)

SLB – 5 MS (Supelco)

51

Continuación Tabla 3. Fases estacionarias liquidas más comunes en cromatografía de

gases capilar

G43

CH3

Si

CH3

O

94%

cianopropilfenil 6%dimetilpolisiloxano 94%

Polaridad: lijeramente polarUsos: compuestos volatiles, insecticidas, residuos de solventes en productos farmaceuticos.

Si O

6%

(CH2)3

CN

Rtx/MXT - 1301, Rtx/MXT - 624

(Restek)

HP – 1301, HP – 624 (AGILENT)

SPB – 624 (Supelco)

G32

CH3

Si

CH3

O

80%


Polaridad: lijeramente polarUsos: compuesos volatiles, alcoholes.

Si O

20%



G42

CH3

Si

CH3

O

65%

Polaridad: medianamente polarUsos: pesticidas, PCB, aminas.

Si O

35%





G46

CH3

Si

CH3

O

86%

Polaridad: medianamente polarUsos: pesticidas, PCB, alcoholes oxigenados.

Si O

14%

(CH2)3

CN

cianopropilfenil 14%dimetilpolisiloxano 86%




52

Continuación Tabla 3. Fases estacionarias liquidas más comunes en cromatografía de

gases capilar

G3

CH3

Si

CH3

O

50%

Polaridad: medianamente polarUsos: triglicéridos, ésteres de ftalato, esteroides, fenoles.

Si O

50%





G6

Si

CH3

O

100%Polaridad: selectivo para pares de electrones libresUsos: muestras ambientales, solventes, gases drogas, cetonas, alcoholes

C2H4

CF3

trifluoropropilmetilpolisiloxano 100%



G7

Si O

50%

(CH2)3

CN

Si

CH3

O

50%

Polaridad: polarUsos: FAMEs, carbohidratos.

CH3

cianopropilmetil 50%fenilmetilpolisiloxano 50%

Rtx – 225 (Restek)


G16

H

C

H

OC

Polaridad: polarUsos: FAMEs, acidos, aminas, solventes, isomeros del xileno.

H

H

polietilenglicol

Stabilwax / Carbowax 20M (ResteK)

DB – WAX (AGILENT)

Supelcowax10 (Supelco)

53

1.4.1.4. Detector

Al final de la columna se encuentra el detector, existen gran variedad de

detectores que se basan en diversidad de fenómenos físicos.

Con pocas excepciones, la mayoría de detectores para cromatografía de gases

fueron inventados específicamente para esta técnica. Las mayores excepciones

son el detector de conductividad térmica, que ya existía como un analizador de

gases cuando comenzó la CG; y el espectrómetro de masas (o detector selectivo

de masas), que fue adaptado para las altas velocidades de escaneo necesaria

para los picos cromatográficos [19].

En total, hay probablemente más de 60 detectores que han sido usados en CG.

Muchos de ellos se basan en la formación de iones por uno u otro medio; y de

estos, el detector de ionización de llama es el más popular. En la tabla 4 se

enlistan los detectores más comunes para CG [19].

Tabla 4. Detectores más comunes para cromatografía de gases

Nombre selectivo para

Detector de ionización de llama (FID) NO

Detector de conductividad térmica (TCD) NO

Detector de captura electrónica (ECD) X*

Detector de nitrógeno/fosforo (NPD) N,P,X

Detector de fotoionización (PID) Aromáticos

Detector de ionización de Helio (HID) NO

Detector fotométrico de llama (FPD) S,P

Detector de emisión atómica de plasma (AED) Metales, X,C,O

Quimioluminiscencia S

Detector de densidad de gas (GADE) NO

Detector de radioactividad 3H, 14C

Espectrómetro de masas (MSD) SI

Infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR) SI *X = halógeno

Con la mayoría de detectores la identificación de un componente se hace

comparando el tiempo de retención del pico cromatográfico con el de un patrón

54

corrido a las mismas condiciones, esto implica que se debe tener información

previa sobre la identidad de los analitos, es decir, la comparación de los tiempos

de retención se hace solo con fines de verificación y el uso de los detectores se

limita principalmente al análisis cuantitativo. El detector selectivo de masas tiene

la ventaja de que a la vez que genera una señal cromatográfica puede obtener y

registrar el espectro de masas de cada uno de los analitos facilitando su

identificación ya sea por medio de la interpretación de su espectro de masas o con

la simple comparación en una base de datos. Esto lo hace idóneo para el análisis

cualitativo en los diversos campos de la investigación [20].

En los sistemas modernos el detector está comunicado con un ordenador el cual a

través de un software interpreta la señal y la registra en una gráfica llamada

cromatograma. La figura 3 muestra un cromatograma típico.

Figura 3.Cromatograma tomado en un cromatógrafo de gases.

En el cromatograma, cada pico corresponde a un compuesto de la mezcla, en el

eje de las abscisas se registra el tiempo de retención, esto es, el tiempo que tarda

55

un analito desde la inyección para efluir de la columna y llegar al detector. La

altura de cada pico depende de la cantidad de analito que llega al detector

1.4.2. Detector selectivo de masas.

Como se dijo anteriormente, la cromatografía de gases es la principal técnica

analítica para la separación de compuestos volátiles. Esta técnica combina

velocidad de análisis, alta resolución, fácil operación, excelentes resultados

cuantitativos y bajo costo, sin embargo, desafortunadamente la CG no puede

confirmar la identidad o estructura de ningún pico. Los tiempos de retención están

relacionados con los coeficientes de partición, y aunque esta es una característica

para definir un buen sistema, los datos obtenidos por si solos no pueden ser

usados para identificar un pico [19].

El espectrómetro de masas por otro lado, es uno de los detectores más ricos en

información. Esta técnica requiere unos pocos microgramos de muestra para el

análisis pero provee información tanto para la identificación cualitativa de

compuestos desconocidos como para su cuantificación. Además es fácilmente

acoplado a sistemas de cromatografía de gases [19].

La figura 4 es un esquema de un espectrómetro de masas de baja resolución

usado comúnmente en CG. Debido a su pequeño tamaño, a menudo es referido

como espectrómetro de masas de mesa [19].

56

ENTRADA DE LA MUESTRA

FUENTE DE IONIZACIÓN

ANALIZADORDE MASAS

DETECTOR

VACIO

SISTEMADE DATOS

ESPECTRO DE MASAS

m/z

Figura 4. Esquema de un espectrómetro de masas

Para uso con cromatografía de gases una interface comunica la salida de la

columna cromatográfica con la fuente de iones, en general el CG y el EM son muy

compatibles ya que ambos sistemas trabajan a alta temperatura, ambos trabajan

con compuestos en estado vapor y ambos trabajan con pequeñas cantidades de

muestra, sin embrago, el único problema que presenta este acoplamiento es que

la presión atmosférica a la salida de la columna cromatográfica debe reducirse

hasta unos 10-5 a 10-6 torr en la entrada del EM [19].

Después de separadas por el cromatógrafo, las moléculas de analito deben ser

ionizadas y fragmentadas para su análisis, esto se consigue en la fuente de iones.

Existen diversas formas de ionización, pero el impacto electrónico es el tipo de

ionización más utilizado, casi la totalidad de las bibliotecas o bases de datos de

espectros comerciales son construidas con este método. Se consigue

bombardeando las moléculas del compuesto con electrones de alta energía (70

57

eV), con el fin de remover un electrón de su estructura. Las moléculas, por la

pérdida del electrón y por el exceso de energía ganado en la colisión, se rompen

generando tanto especies neutras como especies cargadas (iones). El impacto

electrónico es el tipo de ionización más energético, por ende, con el que se

obtiene mayores rompimientos. Las demás técnicas de ionización se denominan

técnicas blandas, producen ionizaciones menos energéticas y menor

fragmentación de la molécula. El impacto electrónico es el modo de ionización

más usado en el análisis de plaguicidas aunque en algunos casos se usa también

la ionización química negativa [16].

Después de la ionización los iones producidos se aceleran a través de campos

eléctricos conduciéndolos hacia el analizador. En el analizador los iones son

desviados de su trayectoria por la aplicación de campos eléctricos o magnéticos,

que dependiendo de la masa del ion le suministran diferentes velocidades; la

magnitud de la desviación depende de la masa y velocidad de cada ion. Existen

también diversos tipos de analizadores. Ver tabla 5 [20].

Tabla 5. Tipos de analizadores de masas

Magnéticos

de enfoque simple

de doble enfoque

Cuadrupolares

De tiempo de vuelo

Trampa de iones

La mayoría de los CG-EM de mesa usan analizadores de masas de cuadrupolo,

trampa de iones o tiempo de vuelo. Los de tipo cuadrupolo representan cerca del

80% de los equipos comercializados en el mundo. Sistemas con analizadores de

masas magnéticos de doble enfoque también están disponibles en el mercado, sin

embargo son más costosos y no pueden considerarse de mesa por su tamaño

[19].

58

Por último los iones formados a partir de las moléculas de la muestra y separados

por el analizador, son colectados en el detector produciendo una señal eléctrica

que convenientemente amplificada, se registra y representa gráficamente en el

espectro de masas. Figura 5.

Figura 5. Espectro de masas de la cafeína

En el eje horizontal (abscisas) del espectro de masas se registra la relación entre

la masa y la carga de cada ion (m/z, donde m es la masa del ion y z su carga

eléctrica), por lo general la carga producida por el impacto de los electrones es

igual a la unidad por lo tanto puede leerse la masa de cada ion directamente en la

escala de las abscisas. En el eje vertical se lee la cantidad de los iones que se

expresa como abundancia relativa.

Los dos iones más característicos de un espectro de masas son: el denominado

pico base, que es el más alto de todos los picos y representa el ion en mayor

cantidad, y el pico de ion molecular que no representa exactamente un fragmento,

sino la molécula entera, cargada por la pérdida de su electrón y justo antes de su

primera fragmentación; el pico de ion molecular es, por tanto, el de mayor valor de

m/z en el espectro. Al pico base se le asigna una abundancia relativa del 100% y

con respecto a él se miden las abundancias del resto de los fragmentos [20].

59

Así, cada barra o pico en el espectro de masas representa un ion cuya posición en

el grafico depende de su masa y su altura de su abundancia. En condiciones de

reproducibilidad las moléculas de un mismo compuesto siempre se fragmentaran

produciendo los mismos iones en iguales cantidades. El espectro de masas se

considera por esta razón la huella digital de un compuesto [20].

1.4.2.1. El análisis cuantitativo con espectrometría de masas.

Los espectrómetros de masas cuadrupolares tienen la ventaja de poderse

configurar tanto para análisis cualitativo como para análisis cuantitativo.

El analizador cuadrupolar puede ajustarse para que separe y registre la totalidad

de los iones generados en la fragmentación, así se obtiene el espectro de masas

completo con el que se hace la identificación del compuesto. Este modo de trabajo

del espectrómetro se conoce como full scan y se usa para el análisis cualitativo.

Para el análisis cuantitativo, el cuadrupolo se configura de manera que solo

permita el paso hacia el detector de los fragmentos más representativos de cada

analito. Este procedimiento se conoce como monitoreo de iones seleccionados

(SIM) y tiene la ventaja de que se evita la llegada al detector de fragmentos de

moléculas diferentes a los analitos, que pueden estar presentes en la matriz y que

generan interferencia. Además la respuesta por unidad de masa es mayor por SIM

[20].

1.5. ESTANDARIZACIÓN DE TÉCNICAS ANALÍTICAS

Estandarizar o validar una técnica de análisis es verificar y documentar que esta

conduce con un alto grado de confiabilidad a datos altamente precisos y exactos

dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidas

[21].

60

Los atributos de calidad pueden ser de tipo estadístico o de tipo

operativo/económico. Entre los primeros figuran los parámetros fundamentales de

exactitud (relacionado con la trazabilidad) y precisión (relacionado con la

incertidumbre) y los secundarios de selectividad, sensibilidad, límites de detección

y cuantificación o robustez. Entre los criterios de tipo operativo/económico se

encuentran la facilidad de comprensión del método y manejo de la

instrumentación, la rapidez del análisis, su costo, la inversión, el mantenimiento,

etc. [22].

1.5.1. Exactitud

La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que

es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y

el valor experimentalmente encontrado [21].

La exactitud se expresa como porcentaje de recuperación en la valoración de una

cantidad conocida de analito añadida sobre la muestra. La recuperación esperada

depende del tipo de matriz, del procedimiento de preparación de la muestra y de la

concentración del analito en la misma. Aunque es deseable alcanzar valores de

recuperación cercanos al 100%, esto no es posible debido a los errores

sistemáticos inherentes a todo método de ensayo, por ejemplo, las pérdidas de

analito en las extracciones liquido-liquido o liquido-solido durante el procesamiento

de la muestra [21].

1.5.2. Precisión

Para que un dato obtenido mediante una medición sea de utilidad se debe tener

una idea de la precisión del método con que se realizó dicha medición.

La precisión determina el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una

serie de medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea

en las condiciones prescritas. Usualmente se expresa en términos de desviación

estándar (SD) o de desviación estándar relativa (RSD). La dispersión de los datos

61

obtenidos es debida a errores aleatorios presentes en todo proceso de medición.

Como consecuencia de la existencia de estos errores, los análisis realizados sobre

muestras idénticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a

resultados idénticos [21,23].

En un método de ensayo se involucran más de una medición: el pesaje de la

muestra, la medición del volumen final de extracto, la medición instrumental. Cada

una de estas mediciones está sujeta a errores aleatorios que afectan la precisión

del método

Una forma de evaluar la precisión del método es mediante la estimación de la

incertidumbre de la medición.

1.5.3. Incertidumbre de la medición:

El propósito de una medición es determinar el valor de una magnitud, llamada el

mensurando, que de acuerdo al Vocabulario Internacional de Términos Básicos y

Generales de Metrología (VIM), es el atributo sujeto a medición de un fenómeno,

cuerpo o sustancia que puede ser distinguido cualitativamente y determinado

cuantitativamente [24].

La imperfección natural de la realización de las mediciones, hace imposible

conocer con certeza absoluta el valor verdadero del mensurando. Toda medición

lleva implícita una incertidumbre. La incertidumbre es el parámetro asociado con

el resultado de la medición, que caracteriza la dispersión de los valores que

razonablemente podría ser atribuido al mensurando. Este parámetro podría ser

una desviación estándar u otra parte de un intervalo que indica un cierto intervalo

de confianza o de distribución más probable de los valores repetitivos de una

medición [24,25].

Este parámetro de la medición refleja la calidad de todo el proceso usado para la

medición y permite identificar los puntos clave del proceso o las etapas

susceptibles de mejora, existen diversas normas internacionales que sirven de

62

guía para el cálculo de la incertidumbre y específicamente para los ensayos

químicos se pueden mencionar las guías desarrolladas por IUPAC, EURACHEM,

CITAC y NIST, en ellas se plantean metodologías específicas para estimar la

incertidumbre en este tipo de mediciones [24].

El diagrama de la figura 6 describe los pasos para la estimación de la

incertidumbre [24].

La definición del mensurando es vital para obtener buenos resultados de la

medición. En no pocas ocasiones se mide algo distinto al propósito original [24].

Un modelo físico de la medición consiste en el conjunto de suposiciones sobre el

propio mensurando y las variables físicas o químicas relevantes para la medición

[24].

En la literatura se distinguen dos métodos principales para cuantificar las fuentes

de incertidumbre: El Método de Evaluación Tipo A está basado en un análisis

estadístico de una serie de mediciones, mientras el Método de Evaluación Tipo B

comprende todas las demás maneras de estimar la incertidumbre [24].

63

Definir el mensurando Y

Establecer el modelo físico

Identificar las magnitudes de entrada Xi

Establecer el modelo matemático

Identificar las fuentes de incertidumbre

Cuantificar la variabilidad de cada fuentey asociarle una distribución

Reducir. Obtener la incertidumbre estándar u(xi)

Estimar correlaciones

Calcular la incertidumbre estándar combinada uc

Elegir el nivel de confianza p

¿Cuantificarel número de

grados?

SI NO

Estimar los grados de libertad vi

Calcular el número efectivo

de grados de libertad vef

Determinar tp(vef)Determinar el

factor decobertura k

Calcular la incertidumbre expandida U

FIN

Figura 6. Diagrama para la estimación de la incertidumbre de la medición

64

Cabe mencionar que esta clasificación no significa que exista alguna diferencia en

la naturaleza de los componentes que resultan de cada uno de los dos tipos de

evaluación, puesto que ambos tipos están basados en distribuciones de

probabilidad. La única diferencia es que en las evaluaciones tipo A se estima esta

distribución basándose en mediciones repetidas obtenidas del mismo proceso de

medición mientras en el caso de tipo B se supone una distribución con base en

experiencia o información externa al metrólogo [24].

En la práctica esta clasificación no tiene consecuencia alguna en las etapas para

obtener una estimación de la incertidumbre combinada.

En este trabajo las incertidumbres de tipo A son las debidas a:

El volumen final del extracto

La inyección

La recuperación

La dispersión de los datos se expresa mediante la desviación estándar y para

convertir la dispersión en incertidumbre estándar se divide la desviación estándar

entre √n donde n es el número de mediciones.

Las incertidumbres de tipo B son las que se obtienen de información externa como

certificados de calibración, manuales o especificaciones de los instrumentos,

valores de mediciones anteriores, entre otros:

Masa de muestra

Error en la interpolación.

Cuando la incertidumbre se obtiene de un certificado, como el caso de la

incertidumbre en la masa de muestra, el dato leído debe dividirse por el factor de

cobertura, este dependerá de las distribuciones de probabilidad. Esto se debe a

que la incertidumbre estándar representa un intervalo de valores que contiene el

valor verdadero con una probabilidad de 68% asumiendo una distribución normal

65

de los datos, cuando se desea un nivel de confianza o de probabilidad mayor se

debe expandir el intervalo multiplicándolo por el factor de cobertura y la

incertidumbre así obtenida se llama incertidumbre expandida. El factor de

cobertura k, como ya se mencionó, depende del nivel de confianza requerido, en

una distribución normal k = 1 para una probabilidad de 68,27% y con k = 2, la

probabilidad es 95,45%. En un certificado de calibración las incertidumbres

reportadas son incertidumbres expandidas y quien emite el reporte debe

especificar el factor de cobertura (es decir, el nivel de confianza) [27]

1.5.4. Límite de Detección

Se puede describir el límite de detección de un analito como aquella concentración

que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de la

señal de una muestra en blanco o señal de fondo [26].

Esta descripción brinda al analista un amplio margen de libertad para decidir la

definición exacta del límite de detección basada en una adecuada interpretación

de la frase “significativamente diferente”. En la práctica existe muy poco acuerdo

entre los profesionales y los organismos oficiales sobre este punto. Una definición

que se usa comúnmente en la química analítica es que el límite de detección es la

concentración de analito que proporciona una señal igual a tres veces la señal de

fondo [26].

1.5.5. Límite de cuantificación.

El límite de cuantificación de un método es la mínima cantidad de analito que se

puede cuantificar con suficiente precisión y exactitud.

Entre los límites de detección y cuantificación hay un rango de concentraciones

del analito en que si bien no puede cuantificarse con precisión, si puede ser

detectado sin incurrir en falsos positivos [21].

67

2. PARTE EXPERIMENTAL.

2.1. MUESTRAS DE ANÁLISIS.

Se analizaron muestras de café verde en grano calidad excelso tipo exportación

suministradas por la Federación Nacional de Cafeteros, se conservaron en bolsas

de polietileno a temperatura ambiente.

Para la evaluación de los porcentajes de recuperación y de los interferentes de

matriz se usaron muestras de café verde en grano, libres de plaguicidas evaluadas

previamente.

2.2. ANALITOS.

Los plaguicidas objeto de análisis se enlistan en la tabla 6 con su respectivos

números CAS y límites máximos de residuos (LMR), según resolución 2906 de

2007 del Ministerio de la Protección Social.

Tabla 6. Analitos en el método para determinación de plaguicidas en café verde

ITEM Nombre

Formula

Química

Cas #

MRL

(mg/kg)

1 Forato C7H17O2PS3 298-02-2 0,02

2 Terbufos C9H21O2PS3 13071-79-9 0,05

3 Disulfoton C8H19O2PS3 298-04-4 0,2

4 Clorpirifos C9H11Cl3NO3PS 2921-88-2 0,05

5 Triadimefon C14H16ClN3O2 43121-43-3 0,05

6 Triadimenol C14H18ClN3O2 55219-65-3 0,1

7 Propiconazol I & II C15H17Cl2N3O2 60207-90-1 0,1

68

2.3. ESTÁNDARES.

Se usaron estándares de alta pureza de cada pesticida de marca ChemService,

en la tabla 7 se relacionan los números de catálogo y grado de pureza. El anexo 1

contiene las fichas técnicas de cada estándar emitidas por el fabricante.

Tabla 7. Estándares de plaguicidas para la preparación de patrones de referencia. Los

números de catalogo corresponden a la marca ChemService

ITEM

Nombre

Numero de

catalogo

% Pureza

1 Forato PS-654 97,5

2 Terbufos PS-680 99,1

3 Disulfoton PS-652 98,2

4 Clorpirifos PS-674 99,5

5 Triadimefon PS-1013 99,2

6 Triadimenol PS-1064 99,5

7 Propiconazol I & II PS-1075 98,2*

*Mezcla de isómeros

2.3.1. Soluciones patrón individuales.

A partir de los estándares se preparó una solución patrón de aproximadamente

5.000 partes por millón (mg/L) por cada plaguicida. En la tabla 8 se relacionan los

solventes que se utilizaron para cada plaguicida.

Tabla 8. Solventes para la preparación de soluciones patrón de plaguicidas individuales

ITEM Nombre Solvente

1 Forato Tolueno

2 Terbufos Metanol

3 Disulfoton Metanol

4 Clorpirifos Acetona-Hexano (1:1)

5 Triadimefon Acetona-Hexano (1:1)

6 Triadimenol Tolueno-Acetonitrilo (1:1)

7 Propiconazol I & II Acetona-Hexano (1:1)

69

2.3.2. Niveles de Calibración.

Se preparó una mezcla de los plaguicidas denominada mezcla madre agregando

los volúmenes necesarios de solución patrón para que cada componente quedara

a una concentración igual a 200 veces su límite máximo de residualidad (LMR) en

acetona hexano (1:1). Para el disulfoton su concentración en la mezcla madre es

igual a 100 veces su LMR. A partir de esta mezcla se hicieron las diluciones para

los niveles de calibración en acetona-hexano (1:1) usando el método de diluciones

sucesivas, en la tabla 9 se registran las concentraciones de los diferentes

plaguicidas en cada nivel de calibración.

Tabla 9. Concentración de los patrones de referencia con que se construyeron las curvas

de calibración.

Nombre

LMR*

mg/Kg

Nivel 1

mg/L

Nivel 2

mg/L

Nivel 3

mg/L

Nivel 4

mg/L

Nivel 5

mg/L

Nivel 6

mg/L

Madre

mg/L

Forato 0,0200 0,0050 0,0100 0,0200 0,0400 0,0800 0,1600 4,0

Terbufos 0,0500 0,0125 0,0250 0,0500 0,1000 0,2000 0,4000 10

Disulfoton 0,2000 0,0250 0,0500 0,1000 0,2000 0,4000 0,8000 20

Clorpirifos 0,0500 0,0125 0,0250 0,0500 0,1000 0,2000 0,4000 10

Triadimefon 0,0500 0,0125 0,0250 0,0500 0,1000 0,2000 0,4000 10

Triadimenol 0,1000 0,0250 0,0500 0,1000 0,2000 0,4000 0,8000 20

Propiconazol I & II 0,1000 0,0250 0,0500 0,1000 0,2000 0,4000 0,8000 20

*Límite Máximo de Residualidad

2.4. ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

La mediciones se realizaron en un cromatógrafo de gases acoplado a

espectrometría de masas marca SHIMADZU, referencia QP 2010, equipado con

inyector automático referencia AOC 20i+s y se usó para el análisis de los

cromatogramas el software GCMSsolution versión 2.5. Se utilizó una columna

capilar marca RESTEK, referencia RTX 5Sil MS (30m x 0,25mm I.D.; 0,25µm fd).

70

2.4.1. Análisis cualitativo.

Se inyectaron 2 µL de la mezcla madre en el cromatógrafo para medir los tiempos

de retención y tomar los espectros de masas de cada pesticida. En la tabla 10 se

relacionan las condiciones de corrida.

Tabla 10. Condiciones instrumentales en el análisis cualitativo de los plaguicidas

puerto de inyección

Temperatura de inyección 250°C

Modo de inyección Split

relación Split 10

Gas de arrastre Helio

flujo por columna 1 mL/min

flujo de purga 3 mL/min

Horno

Temperatura 1 120°C

tiempo 1 2 minutos

Rampa 1 10°C/min

Temperatura 2 270°C

tiempo 2 0 minutos

Rampa 2 25°C/min

Temperatura final 320°C

tiempo final 2 minutos

Detector

Temperatura de interface 280°C

Temperatura fuente de iones 260°C

Modo de ionización impacto electrónico (70eV)

modo de lectura Scan

Rango de masas 40 a 350 uma

Para evitar la contaminación cruzada se programó el autoinyector para realizar

tres lavados previos a la inyección con acetona, metanol y hexano (1 con cada

solvente) y seis lavados posteriores (2 con cada solvente). El volumen de lavado

fue 6 µL. Adicionalmente se programaron tres purgas con la muestra.

Se integraron los picos cromatográficos y los plaguicidas se identificaron por

comparación de sus espectros de masas con la base de datos WileyAccessPak

7th Edition. John Wiley&Sons, Inc.

71

2.4.2. Calibración instrumental

Los patrones de calibración se inyectaron con las mismas condiciones

cromatográficas que la mezcla madre pero se configuró el espectrómetro de

masas en el modo de adquisición SIM (monitoreo selectivo de iones). Los iones

que se monitorearon para cada pesticida se relacionan en la tabla 11.

Tabla 11. Iones de cuantificación y referencia de los plaguicidas

PLAGUICIDA ion de

cuantificación

Ion de referencia

1

Ion de referencia

2

Ion de referencia

3

Forato 75 121 260 231

Terbufos 231 288 153

Disulfoton 88 186 153

Clorpirifos 314 197 286

Triadimefon 208 181

Triadimenol 168 112 128

Propiconazol I & II 173 259

Se realizaron tres inyecciones de 2 µL por cada concentración y se usaron 6

concentraciones, se integraron los picos cromatográficos y se graficó el promedio

de las áreas bajo el pico contra la concentración correspondiente.

2.5. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS.

2.5.1. Molienda

Se tomaron 15 gramos de café verde y se molieron en un molino marca IKA

referencia MF 10 Basic equipado con un cabezal de martillos a 5500 revoluciones

por minuto.

2.5.2. Extracción de los plaguicidas de la matriz de café.

Se pesaron con la mayor exactitud posible 10 gramos (g) de muestra molida en un

erlenmeyer de 250 mililitros (mL), se adicionaron 30 mL de Acetonitrilo-Agua (5:2)

y se puso la mezcla en el baño ultrasónico durante 15 minutos, luego se filtró y el

filtrado se colectó en un embudo de separación de 250 mL, al residuo sólido en el

72

erlenmeyer se adicionaron 20 mL de acetonitrilo y se agitó durante 15 minutos en

el agitador orbital, se filtró nuevamente en el embudo de separación. Se hizo una

extracción liquido-liquido al filtrado con 30 mL de solución salina en buffer fosfato

pH 7.

Se desechó la fase acuosa y la fase en acetonitrilo se pasó a través de un

cartucho para extracción en fase solida RP18 (1000 mg, 6 mL). (El cartucho fue

previamente acondicionado con 10 mL de acetonitrilo). El efluente conteniendo

los plaguicidas se recogió en un matraz volumétrico (clase A) de 50 mL, luego se

adicionaron al matraz 12.5 mL de tolueno y se aforó el volumen con acetonitrilo.

Se vertió la mezcla resultante a un erlenmeyer de 100 mL y se secó con 5 g

sulfato de sodio anhidro.

2.5.3. Limpieza de los plaguicidas.

La mezcla de acetonitrilo-tolueno seca, conteniendo los plaguicidas, se pasó a

través de un cartucho para extracción en fase sólida Envicarb-NH2 (500 mg/500

mg, 6 mL). (El cartucho fue acondicionado previamente con 10 mL de acetonitrilo-

tolueno (3:1)). El efluente se recogió en un balón para rotaevaporador de 100 mL.

Se rotaevaporó el efluente hasta un mL (sin llevar a sequedad). Luego se

adicionaron 10 mL de acetona al balón y se rotaevaporó de nuevo sin llevar a

sequedad, se adicionaron 5 mL más de acetona y se rotaevaporó hasta sequedad.

Luego se adicionaron 1,5 mL de una mezcla de acetona-hexano (1:1), con la cual

se lavó bien el balón haciéndola pasar por las paredes y se dejó reposar por unos

pocos minutos, finalmente se transfirió el lavado a un vial de inyección ajustando

el volumen a 1 mL. En la figura 7 se observa el diagrama de flujo correspondiente

a la extracción de los plaguicidas y en la figura 8 se presenta el diagrama de flujo

para el proceso de limpieza.

73

Pesar aprox. 15 g de Café verde

Moler a 5500 rpm

Pesar 10 g muestra molida

Acetonitrilo-Agua (5:2) 30 mL

homogenizar 15 min. en ultrasonido

2. Aforar a 50 mL con ACN

NaCl 20% en Buffer Fosfato 0.5M, pH 7 - 30 mL

Fase Acuosa

Fase Acetonitrilo

Columna cromatografica ODS (RP-18) Acondicionada con 10 mL de acetonitrilo

Secar con Na2SO4 anhidro

A. EXTRACCION DE LOS PLAGUICIDAS

Filtrar Residuo

Filtrar

ResiduoCombinar los filtrados

Acetonitrilo 20 mL

Homogenizar 15 min en agitador

Desechar

1. adicionar 12.5 ml de Tolueno

Desechar

Extracto enAcetonitrilo-Tolueno

Figura 7. Esquema del procesamiento de café verde para la extracción de plaguicidas.

74

Columna cromatografica ENVI-carb/LC-NH2 500mg/500mg Acondicionada con 10 mL de tolueno acetonitrilo 1:3

Concentrar a 1 mL

Adicionar 10 mL de acetona y concentrar a 1 mL

Adicionar 5 mL de acetona y llevar a sequedad

Disolver el residuo en 1.5 mL de acetona hexano (1:1)

Agitar y reposar

Ajustar el volumen a 1 mL exactamente

GC/MS

Extracto enAcetonitrilo-Tolueno

B. LIMPIEZA DE LOS PLAGUICIDAS

Figura 8. Limpieza de los plaguicidas en el extracto de café.

2.6. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LOS PLAGUICIDAS

2.6.1. Evaluación de la matriz

Muestras de café verde en grano libre de plaguicidas se sometieron a extracción,

se inyectaron 2 µL de los extractos en modo SIM y bajo las mismas condiciones

que los patrones de calibración.

75

2.6.2. Porcentaje de recuperación

Se prepararon 5 mililitros de una solución en la que cada plaguicida se encontraba

a una concentración igual a 5 veces su límite máximo de residualidad (LMR). Se

molieron tres muestras de café verde en grano, libres de plaguicidas. Se pesaron

10 gramos de cada muestra molida y se doparon con 1 mL de la solución medido

volumétricamente. Cada muestra contaminada se procesó según la metodología

propuesta en este trabajo. Se inyectó en el cromatógrafo 2 µL del extracto final

obtenido usando las mismas condiciones instrumentales con que se inyectaron los

niveles de calibración, se inyectó además 2 µL de la solución de dopaje restante

para usarse como referencia. El porcentaje de recuperación se calculó como el

porcentaje de área en la muestra relativo al área en la referencia bajo el pico

correspondiente a cada plaguicida. En la figura 9 se resume el protocolo seguido

para medir los porcentajes de recuperación.

muestra 1cafe verde10 gramos



PROCESAMIENTO PARA EXTRACCION Y LIMPIEZA DE LOS PLAGUICIDAS

Adicionar1 mL de

solucion dopaje

Adicionar1 mL de

solucion dopaje

Adicionar1 mL de

solucion dopaje

Referencia1 mL de

solucion dopaje

LECTURA INSTRUMENTAL

Figura 9. Protocolo para la evaluación de los porcentajes de recuperación en la

extracción de plaguicidas en café verde.

77

3. DATOS Y RESULTADOS

3.1. RESULTADOS DEL ANÁLISIS CUALITATIVO.

3.1.1. Determinación de los tiempos de retención

En la figura 10 se muestra el cromatograma de la mezcla madre de los plaguicidas

y en la tabla 12 se registran los tiempos de retención.

Figura 10. Cromatograma de la mezcla madre de plaguicidas.

Tabla 12. Tiempos de retención de los plaguicidas en la mezcla madre estándar

PLAGUICIDA TIEMPO DE RETENCIÓN

(minutos)

Forato 9,333

Terbufos 10,221

Disulfoton 10,588

Clorpirifos 12,306

Triadimefon 12,519

Triadimenol 13,356

Propiconazol I 15,648

Propiconazol II 15,760

78

3.1.2. Obtención de los espectros de masas.

Para verificar la identidad de los plaguicidas y asignar los nombres a los picos

cromatográficos correspondientes, se tomaron sus espectros de masas en full

scan y se compararon con los de la base de datos verificando que los índices de

similitud fueran superiores al 80%. En figura 11 se muestra la comparación entre

el espectro del forato tomado experimentalmente y el de la base de datos. En el

anexo 2 están los espectros de todos los plaguicidas.

A

B

Figura 11. Comparación del espectro de masas del forato. A) Espectro de masas tomado experimentalmente. B) Espectro de masas del forato en la base de datos.

79

Puesto que se trata de estándares certificados esta comparación se hace con

fines de verificación únicamente. El índice de similitud es el dato con base en el

cual el software asigna los nombres a los picos cromatográficos para la creación

de la tabla de compuestos. No se realizó el análisis de fragmentogramas puesto

que esta fuera del propósito de este trabajo, además se trata de estándares

certificados cuya identidad se conoce plenamente. En la tabla 13 se presentan los

índices de similitud encontrados para cada plaguicida.

Tabla 13. Similitud de los espectros experimentales con la base de datos.

Plaguicida Índice de similitud

Forato 94%

Terbufos 95%

Disulfoton 96%

Clorpirifos 90%

Triadimefon 94%

Triadimenol 93%

Propiconazol I & II 81%

3.2. CURVAS DE CALIBRACIÓN.

Con la información obtenida en la construcción de las curvas de calibración se

evaluaron las características instrumentales.

Como cada concentración se inyectó por triplicado, se evaluó la precisión

instrumental en los diferentes puntos de las curvas de calibración con base en la

desviación estándar de las áreas bajo cada pico correspondiente, en general, las

desviaciones estándar relativas (%DER), se mantuvieron por debajo del 5% con la

excepción de forato y propiconazol para quienes en el primer nivel fue de 5,94 y

6,49% respectivamente, sin embargo, teniendo en cuenta que la variación en los

extremos de la curva es mayor que en el centro de gravedad de la misma [26],

cabria esperar mayor variabilidad en los primeros niveles, además porque los

datos se acercan al ruido instrumental. En conclusión los valores de %DER para

forato y propiconazol en el primer nivel son aceptables.

80

Por otro lado, en el nivel cuatro todos los plaguicidas presentaron en la primera

réplica un dato notoriamente distinto de los otros dos, lo que resultó en %DER

superiores al 25% para algunos de ellos en ese nivel de concentración, esto pudo

deberse a un error aleatorio en la inyección de esa replica, como por ejemplo una

burbuja en la jeringa de inyección.

Existen pruebas estadísticas que permiten determinar si el dato diferente o

anómalo se puede atribuir a un error aleatorio y en consecuencia desecharse, sin

embargo en este caso no fue posible aplicar dicha prueba, pues se requiere para

ello mínimo cuatro datos [26], luego, se conservaron los datos anómalos.

En la tabla 14 se muestran las concentraciones y las áreas medidas para el forato,

en el anexo 3 se presentan los datos para todos los plaguicidas.

Tabla 14. Tabla de resultados. Área bajo el pico obtenida por triplicado para diferentes

concentraciones de forato

Nivel Concentración

(mg/L) Área promedio

Desviación estándar de

Área

Desviación estándar

relativa de Área Área

1 0,0050 13098,33 778,51 5,94 13242

12258

13795

2 0,0100 17015,67 777,05 4,57 16383

17883

16781

3 0,0200 43941,00 507,99 1,16 43795

44506

43522

4 0,0400 68915,33 20503,01 29,75 45399

83042

78305

5 0,0800 176158,33 5607,74 3,18 170110

181185

177180

6 0,1600 345393,00 8242,78 2,39 339028

354704

342447

El rango de concentraciones en que se evaluó la linealidad fue bastante amplio, la

relación entre las concentraciones del nivel 1 y 6 fue de 1 a 32, una inspección

81

visual de la gráfica de calibrado permite observar la relación lineal entre la señal y

la concentración, en la figura 12 se muestra la gráfica de calibrado del forato.

Nombre: Forato f(x) = 2179914.24x – 3692.88

r=0,998240 r2=0,996484

Figura 12. Grafica de calibrado del Forato.

Se observa en la figura 12 que la gráfica de calibrado del forato corresponde a una

línea recta, pero los puntos no caen exactamente sobre la línea debido a las

desviaciones en la exactitud instrumental. Aunque es evidente que la respuesta

del instrumento es dependiente de la concentración, el cálculo del coeficiente de

correlación es más adecuado para cuantificar el grado de relación entre las dos

variables. En la tabla 15 se registran los coeficientes de correlación de cada

analito y en el anexo 3 se muestran las gráficas de calibrado de todos los analitos

con sus respectivas ecuaciones.

Se puede observar, que aunque se conservo el dato anómalo los coeficientes de

correlación son bastante buenos, todos están por encima de 0.997, esto

demuestra que la respuesta del detector es lineal y proporcional a la concentración

en el rango establecido.

82

Tabla 15. Coeficientes de correlación de las graficas de calibrado de los plaguicidas.

PLAGUICIDA R* R2

Forato 0,998240 0,996484

Terbufos 0,999078 0,998157

Disulfoton 0,999316 0,998633

Clorpirifos 0,999102 0,998204

Triadimefon 0,999571 0,999141

Triadimenol 0,997010 0,994029

Propiconazol I & II 0,998692 0,997385 *R: coeficiente de correlación

3.3. LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN.

Se calculó la relación señal ruido (S/R) de todos los picos cromatográficos en cada

uno de los niveles de calibración. De cada plaguicida se obtuvo tres datos de

relación señal ruido por cada concentración. Se tabuló la concentración contra el

promedio de relación señal ruido. En la tabla 16 se muestran los resultados para

el forato.

Tabla 16. Relación señal ruido de los picos de Forato

Forato

nivel Concentración.

(mg/L)

Promedio señal ruido

(S/R)

N1 0,0050 151,71

N2 0,0100 173,87

N3 0,0200 533,30

N4 0,0400 995,11

N5 0,0800 2228,45

N6 0,1600 5065,07

Con los datos de concentración y relación señal ruido promedio se hizo una

regresión lineal y con la ecuación resultante se calculó la concentración necesaria

para obtener las relaciones señal ruido de 3 y 10 correspondientes al límite de

detección y cuantificación respectivamente.

83

En la tabla 17 se muestran los resultados para todos los plaguicidas.

Tabla 17. Limites de detección y de cuantificación de los plaguicidas

Plaguicida Limite de detección

(mg/L)

Limite de cuantificación

(mg/L)

Forato 0,0048 0,0051

Terbufos 0,0078 0,0080

Disulfoton 0,0146 0,0147

Clorpirifos 0,0163 0,0167

Triadimefon 0,0131 0,0154

Triadimenol 0,0207 0,0211

Propiconazol I & II 0,0143 0,0148

Todos los límites de cuantificación estuvieron por debajo de la concentración

menor en la curva, menos clorpirifos y triadimefon, sin embargo, la precisión del

instrumento en los niveles menores de estos dos plaguicidas son inferiores a 5%

lo que significa que se puede cuantificar confiablemente en estas concentraciones

a pesar de que el límite de cuantificación calculado sea mayor. Los limites de

cuantificación y detección calculados a partir de las graficas de calibrado, están

bastante influenciados por la desviación de los puntos con respecto a la línea; el

error aleatorio que se presentó en el nivel cuatro desvió significativamente los

puntos, se puede asegurar que esta es la razón por la cual los limites de

cuantificación resulta mayor que el nivel uno de calibración en los casos en que

así sucedió.

3.3.1. Evaluación de Matriz

Los patrones con los que se construyó la curva de calibración fueron soluciones

en las que solo estuvieron presentes los analitos y el solvente, por tanto la relación

señal ruido calculada sobre estos patrones no refleja el efecto de la matriz sobre la

señal de fondo del instrumento. Si bien el procesamiento de la muestra busca,

además de extraer los analitos, retirar la mayor cantidad posible de constituyentes

de matriz, algo de estos constituyentes logran llegar al extracto final. Por tanto se

84

hizo necesario evaluar el efecto que estos interferentes tienen sobre el ruido y las

consecuencias sobre los límites de detección y cuantificación. Para esto se

procesaron 15 muestras de café verde libre de plaguicidas y se calculó la relación

señal ruido en los intervalos de tiempo en que aparecen los picos de los

plaguicidas. El promedio de estos datos se multiplicó por 3 y 10 para recalcular los

límites de detección y cuantificación. Los resultados se muestran en las tablas 18

y 19.

Tabla 18. Relación señal ruido de los muestras de café verde en blanco para evaluar el

efecto de la matriz

Replica Forato Terbufos Disulfoton Clorpirifos Triadimefon Triadimenol Propiconazol

S/R S/R S/R S/R S/R S/R S/R

1 2,47 18,84 0,29 5,47 4,52 1,10 0,77

2 2,11 20,39 0,15 16,12 3,12 0,03 0,64

3 2,69 11,71 0,47 8,64 2,95 1,48 2,43

4 2,51 24,07 0,37 11,30 6,10 1,56 1,24

5 0,98 18,84 2,81 15,09 1,14 0,16 2,01

6 1,53 4,61 1,11 2,68 2,39 2,08 0,43

7 1,33 13,65 1,28 24,14 5,08 0,92 0,98

8 1,39 7,91 0,96 13,79 4,24 1,50 0,79

9 0,87 17,14 1,91 17,68 1,69 1,13 1,68

10 2,70 26,43 0,12 5,67 0,97 3,67 0,56

11 1,70 21,56 0,21 19,39 1,65 1,31 2,46

12 1,21 11,45 2,01 11,76 4,95 0,42 1,55

13 2,57 14,87 1,57 21,40 2,79 2,63 1,96

14 1,47 9,89 1,68 9,32 0,52 0,57 0,59

15 0,79 10,54 3,51 14,87 2,48 1,08 1,47

Promedio 1,75 15,46 1,23 13,15 2,97 1,31 1,30

(S/R)*3 5,26 46,38 3,69 39,46 8,92 3.93 3,91

(S/R)*10 17,55 154,60 12,30 131,54 29,73 13,10 13,04

Nótese en la tabla 18 que el resultado de multiplicar la relación señal ruido por 3,

nunca supera ninguno de los datos individuales, lo que es conforme con la

definición y sobre todo con la justificación de limite de detección. La alta

variabilidad en los datos es de esperarse puesto que nos encontramos en el nivel

del ruido.

85

Tabla 19. Límites de detección y cuantificación finales después de considerar el efecto de

matriz.

Plaguicida Limite de detección

(mg/L)

Limite de cuantificación

(mg/L)

Forato 0,0049 0,0053

Terbufos 0,0094 0,0135

Disulfoton 0,0146 0,0147

Clorpirifos 0,0187 0,0247

Triadimefon 0,0151 0,0219

Triadimenol 0,0207 0,0213

Propiconazol I & II 0,0145 0,0156

La tabla 20 presenta la comparación entre el límite de cuantificación calculado a

partir de la curva de calibración (LC-1), el límite de cuantificación con el efecto de

matriz (LC-2) y el valor de concentración mínimo de la curva de calibración (N1).

Tabla 20. Comparación de los límites de cuantificación. LC-1 es el límite de cuantificación

calculado de la grafica de calibración sin tener en cuenta el efecto de la matriz en la señal.

LC-2 es el límite de cuantificación considerando el efecto de la matriz en la señal. N1 es el

nivel de menor concentración usado en la curva de calibración.

Pesticida LC-1

(mg/L) LC-2

(mg/L) N1

(mg/L)

Forato 0,0051 0,0053 0,0050

Terbufos 0,0080 0,0135 0,0130

Disulfoton 0,0147 0,0147 0,0250

Clorpirifos 0,0167 0,0247 0,0130

Triadimefon 0,0154 0,0219 0,0130

Triadimenol 0,0211 0,0213 0,0250

Propiconazol I & II 0,0148 0,0156 0,0250

Se observa en la tabla 18 que la mayor afectación por matriz la sufrieron terbufos,

clorpirifos y triadimefon, esto no representa un problema puesto que el límite de

cuantificación a pesar de todo se mantiene 20 veces por debajo del LMR.

86

3.4. PORCENTAJES DE RECUPERACIÓN.

Según el protocolo de la figura 7, los extractos finales contienen los plaguicidas a

una concentración igual a cinco veces sus LMR, lo que equivale a la mitad del

LMR en las muestras de café puesto que en el proceso de extracción y

purificación los analitos se concentran 10 veces, es decir, los analitos contenidos

en 10 gramos de café terminan en un mililitro de extracto. Los porcentajes de

recuperación se calcularon por la relación de áreas de cada muestra y la

referencia en vez de usar la curva de calibración para cuantificar, de esta manera

se evita el error por la interpolación.

En la tabla 21 se muestran los resultados de los porcentajes de recuperación para

cada plaguicida.

Tabla 21. Porcentajes de recuperación en la extracción de plaguicidas a partir de

muestras de café verde en grano

Plaguicida Replica

1 Replica

2 Replica

3 Promedio Desviación estándar %DER*

Forato 73,5 81,4 67,9 74,3 6,8 9,13

Terbufos 84,3 91,8 89,9 88,7 3,9 4,43

Disulfoton 87,6 96,0 98,0 93,9 5,5 5,88

Clorpirifos 92,7 85,4 78,5 85,5 7,1 8,30

Triadimefon 68,0 75,4 72,4 71,9 3,7 5,13

Triadimenol 81,0 86,2 93,2 86,8 6,1 7,04

Propiconazol I & II 88,0 97,9 93,7 93,2 5,0 5,35 *%DER: desviación estándar relativa

Todos los porcentajes de recuperación promedio estuvieron entre 70% y 95% con

una baja dispersión de los datos (%DER por debajo del 10%). Es importante que

las desviaciones estándar relativas (dispersiones) sean pequeñas ya que influyen

directamente en la incertidumbre de medición, es decir, en la precisión del método,

además da una idea de la reproducibilidad en la extracción.

87

4. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIÓN.

Se realizó la estimación de la incertidumbre para el forato a manera de ejemplo y

al final de esta sección se presentan los resultados para todos los analitos.

4.1.1. Definición del mensurando

Aquí el mensurando es la concentración de Forato expresada en miligramos de

Forato por cada kilogramo de café verde.

4.1.2. Modelo físico y modelo matemático.

En primer lugar se hizo un esquema del proceso identificando de manera

independiente sus etapas. Ver figura 13.

Figura 13. Diagrama del método de determinación de plaguicidas en café verde

Las moléculas de plaguicidas están contenidas en un medio solido que constituye

la matriz, en este caso el café. Para ser cuantificadas, se extrajeron con un

solvente adecuado para la medición instrumental, el porcentaje de recuperación

en la extracción y el volumen final de extracto, así como la masa inicial de matriz,

constituyen variables de entrada en el cálculo de la concentración que es la

variable de salida. La otra variable de entrada es la concentración de plaguicida

en el extracto determinada en la lectura instrumental. El modelo matemático se

describe a continuación:

88

Dónde:

Cm = concentración de plaguicida en la muestra (mg/kg)

Cext= concentración de plaguicida en el extracto (mg/L)

Vext = volumen de extracto (mL)

%R = porcentaje de recuperación (no tiene unidades)

mm = masa de la muestra (g)

4.1.3. Fuentes de incertidumbre

Con base en el modelo matemático se construyó el diagrama causa efecto que se

muestra en la figura 14.

Figura 14. Diagrama causa efecto en el cálculo de la concentración de Forato en café.

De acuerdo con el diagrama causa efecto se identificaron las siguientes fuentes de

incertidumbre:

En primer lugar está la pesada de la muestra cuya variabilidad se obtuvo del

certificado de calibración, luego la muestra se sometió al proceso de extracción y

limpieza de los plaguicidas, este proceso conllevó perdidas de analito que se

evaluaron procesando por triplicado muestras contaminadas con concentraciones

conocidas, todas las incertidumbres resultantes de las mediciones de volumen

durante el proceso, (es decir del uso de pipetas, probetas, etc.), quedaron

89

incluidas en el cálculo de incertidumbre por recuperación. Al final de la extracción

y limpieza, los analitos se transfirieron al vial de inyección y se ajustó el volumen

de extracto a 1 ml, estos viales fueron calibrados por pesada y la incertidumbre en

el volumen se calculó a partir de la dispersión de las masas resultantes. Después

de esto, el extracto se inyectó en el instrumento para la obtención de los

respectivos picos cromatográficos y sus áreas las cuales se interpolaron en la

gráfica de calibrado del instrumento para determinar la concentración de

plaguicida en el extracto. La medición del volumen de inyección, las pérdidas de

analito en el puerto de inyección, la eficiencia de la ionización en la fuente, la

perdida de iones en el cuadrupolo y la respuesta del detector suponen fuentes de

incertidumbre en el área medida bajo el pico, todas estas se cuantificaron de

manera global inyectando 6 repeticiones del patrón de referencia con el que se

doparon las muestras para evaluar el porcentaje de recuperación y determinando

la dispersión de las áreas resultantes. En cuanto a la interpolación, por ser la

gráfica de calibrado un instrumento de medida, tiene una incertidumbre asociada

que se cuantificó con cálculos matemáticos basados en los residuales (las

diferencias entre los valores de área medidos y los valores de área calculados a

partir de la ecuación resultante de la regresión lineal). De manera que el error en

la concentración del extracto se cuantificó combinando la incertidumbre en el área

con el error en la interpolación [24,26].

4.1.4. Cuantificación de las incertidumbres estándar.

Pesada de la muestra

De acuerdo con el certificado de calibración la incertidumbre expandida esta

expresada por:

U= (0,0001 + 0,0000013m)

90

Y el factor de cobertura es 2, entonces la incertidumbre estándar en la pesada es:

u(m) = (0,0001 + 0,0000013(10,0))/2 = 0,0000565 g

Recuperación

Para el Forato se obtuvo una recuperación promedio de 74,3% con una desviación

estándar de 6,8% para tres repeticiones, entonces:

u(%R) = 6,8/√3 = 3,9259818305

Volumen del extracto

Como se mencionó anteriormente el vial de inyección se sometió a calibración por

gravimetría, la desviación estándar de los valores medidos fue de 0,06006008 ml

con 80 mediciones:

u(vol.) = 0,06006008/√80 = 0,00671492108070378 ml

concentración en el extracto

La incertidumbre en la concentración del extracto se estimó por la combinación de

las incertidumbres en el área y en la interpolación. La desviación estándar de las

áreas en las 6 repeticiones fue 3953 unidades en la tabla 22 se muestran los

resultados.

Tabla 22. Variabilidad en las áreas bajo el pico de forato

Incertidumbre en la inyección

Replica Área

1 205.947

2 214.007

3 202.871

4 208.763

5 204.969

6 209.538

Promedio 207.683

Desviación estándar 3.953

%RSD 1,9

91

La incertidumbre estándar en la inyección es:

u(iny) = 3953/√6 = 1613,84876924698 unidades de área.

Para combinar la incertidumbre de las áreas con la incertidumbre en la

interpolación se multiplicó por su coeficiente de sensibilidad, para calcularlo se

derivó la concentración con respecto al área en la ecuación de la línea de

calibrado:

El cálculo de la incertidumbre en la interpolación es un poco más complejo, en

primer lugar se calcula el estadístico Sy/x según:

Donde yi es el área medida para cada concentración usada en la curva de

calibración (en este caso corresponde al promedio de tres repeticiones), ^yi es

el valor de área corregido o calculado con la ecuación de la gráfica resultante y n

es el número de puntos de calibración, 6 en este caso. Obtenido Sy/x el error en la

interpolación se calcula con:

Donde b es la pendiente de la gráfica de calibrado, m es el número de mediciones

del extracto (en este caso se hicieron 6 mediciones pero en el trabajo de rutina las

92

muestras se miden, por lo general, una sola vez), n nuevamente es el número de

puntos de calibrado, y0 es el área medida o promedio de áreas medidas para el

extracto y es el promedio de las áreas de los patrones de calibración [26].

Para el Forato se obtuvieron los siguientes valores:

Sy/x = 8586,14226584211 unidades de área

u(int) = Sx0 = 0,002847438 mg/L

Finalmente:

u(ext.) = 0,002942106 mg/L

4.1.5. Coeficientes de sensibilidad

El coeficiente de sensibilidad describe qué tan sensible es el mensurando con

respecto a variaciones de la magnitud de entrada correspondiente, se calcula

mediante la derivada parcial de la función que relaciona las variables de entrada

con respecto a la correspondiente variable de entrada [24].

Coeficiente de sensibilidad de la pesada

Coeficiente de sensibilidad de la recuperación

93

Coeficiente de sensibilidad de volumen de extracto

Coeficiente de sensibilidad de concentración del extracto

4.1.6. Incertidumbre combinada y expandida

Para obtener la incertidumbre combinada, que a la vez es la incertidumbre

estándar de la variable de salida (concentración de Forato en la muestra de café

verde), se estimó el peso que cada una de las incertidumbres estándar calculadas

anteriormente, tienen sobre el resultado final. Esto se consiguió calculando el

producto de cada incertidumbre estándar por el coeficiente de sensibilidad,

entonces la incertidumbre combinada se obtuvo mediante:

u(Cm) = 0,00065254 mg/Kg

Se utilizó el factor de cobertura k = 2 para calcular la incertidumbre expandida con

un nivel de confianza del 95,45%

U(Cm) = u(Cm) x 2 = 0,00130507 mg/Kg

94

El resultado final para la concentración de Forato en la muestra se calculó con la

ecuación planteada como modelo matemático, el resultado final fué:

Cm = 0,0097552 + 0,00130507 mg/kg.

En la tabla 23 se relacionan los resultados para todos los plaguicidas evaluados

Tabla 23. Resultados de la cuantificación de plaguicidas en café verde

Resultados

Pesticida Concentración U* U Relativa

Forato 0,0098 0,0013 13,4

Terbufos 0,0256 0,0020 7,7

Disulfoton 0,0511 0,0041 8,0

Clorpirifos 0,0253 0,0030 12,0

Triadimefon 0,0260 0,0020 7,6

Triadimenol 0,0471 0,0059 12,5

Propiconazol I & II 0,0481 0,0041 8,6 *U: Incertidumbre en cuantificación de plaguicidas en café verde

La última columna de la tabla 23 muestra las incertidumbres relativas, para el

forato, la concentración final es de 0,0098 mg por Kg de café verde con una

incertidumbre de 0,0013 mg/Kg que corresponde al 13,4% del valor de

concentración. Para evaluar la exactitud final del método se calculó el porcentaje

de error en la concentración, los resultados se muestran en la tabla 24

Tabla 24. Error en el cálculo de concentración de plaguicidas en café verde

Resultados

Pesticida Concentración

esperada Concentración

calculada % Error

Forato 0,0100 0,0098 2,0

Terbufos 0,0250 0,0256 2,4

Disulfoton 0,0500 0,0511 2,2

Clorpirifos 0,0250 0,0253 1,2

Triadimefon 0,0250 0,0260 4,0

Triadimenol 0,0500 0,0471 5,8

Propiconazol I & II 0,0500 0,0481 3,8

95

Se puede observar en las tablas 21 y 22 que el método es preciso y exacto, los

porcentajes de error en la concentración medida estuvieron por debajo del 6% con

incertidumbres inferiores al 13.5% a un grado de confiabilidad del 95%. En

consecuencia, la metodología propuesta en este trabajo es válida para cuantificar

los plaguicidas Forato, terbufos, disulfoton, clorpirifos, triadimefon, triadimenol y

Propiconazol en café verde tipo exportación.

97

5. COCLUSIONES

Se estandarizó la técnica multiresiduo para determinar plaguicidas en café verde

tipo exportación.

Se obtuvieron los atributos del método, la exactitud (% de error) en todos los

casos fue mayor al 94% y la precisión (%RSD) fue mayor al 94% para cinco

niveles de concentración. Las correlaciones de las curvas de calibración oscilaron

entre 0,996 y 0.999 para rangos lineales de trabajo entre 0,005 y 0,8000 ppm. Los

límites de detección fueron en todos los casos inferiores a 0.025 ppm cumpliendo

con las necesidades legislativas.

La técnica de extracción en fase solida arrojó porcentajes de recuperación

oscilaron entre el 71,9 y 93,9%, con dispersiones inferiores al 9.13%. El efecto de

matriz influyó sobre los plaguicidas terbufos, clorpirifos y triadimefon en donde sus

límites de detección se duplicaron.

Para el cálculo global de la incertidumbre se tuvo en cuenta las fuentes más

significativas del proceso y el resultado final fue, para todos, inferior al 13.5% de

incertidumbre cumpliendo con los criterios de aceptación en análisis de residuos

de plaguicidas.

99

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103

ANEXOS

Anexo 1. Fichas técnicas de los estándares de plaguicidas

109

+

110

Anexo 2. Espectros de masas

A

B

Comparación del espectro de masas del Forato. A) Espectro de masas tomado experimentalmente. B) Espectro de masas del Forato en la base de datos.

111

A

B

Comparación del espectro de masas del Terbufos. A) Espectro de masas tomado experimentalmente. B) Espectro de masas del Terbufos en la base de datos.

112

A

B

Comparación del espectro de masas del Disulfoton. A) Espectro de masas tomado experimentalmente. B) Espectro de masas del Disulfoton en la base de datos.

113

A

B

Comparación del espectro de masas del Clorpirifos. A) Espectro de masas tomado experimentalmente. B) Espectro de masas del Clorpirifos en la base de datos.

114

A

B

B

Comparación del espectro de masas del Triadimefon. A) Espectro de masas tomado experimentalmente. B) Espectro de masas del Triadimefon en la base de datos.

115

A

B

Comparación del espectro de masas del Triadimenol. A) Espectro de masas tomado experimentalmente. B) Espectro de masas del Triadimenol en la base de datos.

116

A

B

Comparación del espectro de masas del Propiconazol. A) Espectro de masas tomado experimentalmente. B) Espectro de masas del Propiconazol en la base de datos.

117

Anexo 3. Curvas de Calibración.

Nombre: Forato – M/Z: 75

f(x) = 2179914.24*x - 3691.88

r=0.998240 r2=0.996484


(mg/L) Área

promedio


Área


relativa de Área

Área

1 0,0050 13098,33 778,51 5,94 13242

12258

13795

2 0,0100 17015,67 777,05 4,57 16383

17883

16781

3 0,0200 43941,00 507,99 1,16 43795

44506

43522

4 0,0400 68915,33 20503,01 29,75 45399

83042

78305

5 0,0800 176158,33 5607,74 3,18 170110

181185

177180

6 0,1600 345393,00 8242,78 2,39 339028

354704

342447

118

Nombre: Terbufos – M/Z: 231

f(x) = 558827.81*x – 2181.10

r=0.999078 r2=0.998157


(mg/L) Área

promedio


Área


relativa de Área

Área

1 0,0130 6866,00 195,10 2,84 7038

6654

6906

2 0,0250 11951,67 151,19 1,26 11895

12123

11837

3 0,0500 27852,00 66,55 0,24 27904

27875

27777

4 0,1000 46736,67 12090,93 25,87 32871

55083

52256

5 0,2000 112073,00 4160,00 3,71 107746

117043

112430

6 0,4000 221511,00 6346,22 2,86 215579

228203

220751

119

Nombre: Disulfoton – M/Z: 88

f(x) = 1684304.23*x – 13601.59

r=0.999316 r2=0.998633


(mg/L) Área

promedio


Área


relativa de Área

Área

1 0,0250 40856,67 96,55 0,24 40806

40968

40796

2 0,0500 69621,67 1819,11 2,61 68596

71722

68547

3 0,1000 164294,67 497,52 0,3 163737

164454

164693

4 0,2000 287845,33 67626,52 23,49 210549

336101

316886

5 0,4000 674606,33 23427,34 3,47 648841

694627

680351

6 0,8000 1333945,00 31224,07 2,34 1304531

1366709

1330595

120

Nombre: Clorpirifos – M/Z: 314

f(x) = 167324.88*x – 1921.45

r=0.999102 r2=0.998204


(mg/L) Área

promedio


Área


relativa de Área

Área

1 0,0130 1215,00 58,39 4,81 1150

1232

1263

2 0,0250 2624 104,80 3,99 2511

2643

2718

3 0,0500 6554,67 79,06 1,1 6565

6621

6478

4 0,1000 12774,67 3024,50 23,68 9297

14791

14236

5 0,2000 31702,00 1270,51 4,01 30257

32644

32205

6 0,4000 65369,33 1065,90 1,63 64538

66571

64999

121

Nombre: Triadimefon – M/Z: 208

f(x) = 359967.85*x – 1170.89

r=0.999571 r2=0.999141


(mg/L) Área

promedio


Área


relativa de Área

Área

1 0,0130 3204,00 43,58 1,36 3201

3249

3162

2 0,0250 7075,33 274,05 3,87 6760

7210

7256

3 0,0500 17733,00 351,40 1,98 17339

17846

18014

4 0,1000 33110 4714,53 14,24 27743

36583

35004

5 0,2000 73465,33 1997,17 2,72 71243

75110

74043

6 0,4000 141861,67 1861,77 1,31 139982

143705

141898

122

Nombre: Triadimenol – M/Z: 168

f(x) = 305145.57*x – 9085.66

r=0.997010 r2=0.994029


(mg/L) Área

promedio


Área


relativa de Área

Área

1 0,0250 4111,67 100,73 2,45 4001

4198

4136

2 0,0500 11094,33 114,46 1,03 10994

11219

11070

3 0,1000 22788,33 633,33 2,78 22086

22963

23316

4 0,2000 42312,67 11620,78 27,46 28928

48180

49830

5 0,4000 105020,33 2973,74 2,83 101607

107051

106403

6 0,8000 240763,00 2109,93 0,88 242195

238340

241754

123

Nombre: Propiconazole I & II – M/Z: 173

f(x) = 542550.24*x – 8425.16

r=0.998692 r2=0.997385


(mg/L) Área

promedio


Área


relativa de Área

Área

1 0,0250 10852,67 805,17 7,42 11000

9984

11574

2 0,0500 23714 385,00 1,62 23716

24098

23328

3 0,1000 49596,00 765,40 1,54 49227

50476

49085

4 0,2000 87887,33 21363,30 24,31 63302

98406

101954

5 0,4000 199832,67 2724,08 1,36 199011

202873

197614

6 0,8000 432083,00 3171,37 0,73 431780

433395

429074

estandarizaciÓn de una metodologÍa para...

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