estandarizaciÓn de mÉtodos de detecciÓn para

ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN PARA

PROMOTORES DE CRECIMIENTO VEGETAL (ÁCIDO INDOL ACÉTICO Y

GIBERELINAS) EN CULTIVOS MICROBIANOS

LINA XIMENA CELIS BAUTISTA

IVÁN RICARDO GALLARDO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA

BOGOTA

ENERO 2008






TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de

MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO




BOGOTA

ENERO DE 2008






TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de

MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO

Director: Maria Ximena Rodríguez




BOGOTA

ENERO 2008

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N. 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.






APROBADO: _________________________ Maria Ximena Rodríguez DIRECTORA ________________________ ________________________ José Salvador Montaña Pedro Jiménez JURADO 1 JURADO 2






APROBADO:

_________________________ ________________________ ANGELA UMAÑA Mphil . JANETH ARIAS PALACIOS Decana Académica Director de Carrera

Do you hear the message in the music now I hear it too

You know, you got your history in the making now Slowing down won't get you through, no no

Time Won´t Wait

Jamiroquai

AGRADECIMIENTOS

A nuestros padres y familia, por ofrecernos la oportunidad de desarrollar este largo proceso, por brindarnos su constante apoyo y colaboración.

A María Ximena Rodríguez, por todas las enseñanzas brindadas por su apoyo, paciencia, exigencia, confianza, esmero y en especial por todos los conocimientos que nos otorgo.

A María Mercedes Martínez, por brindarnos este proyecto, por los conocimientos que nos otorgo y por el apoyo igualmente recibido.

A la Federación Internacional de Universidades Católicas (FIUC) por el apoyo financiero brindado.

A Claudia Ramírez y Gisela Castrillon, por su asesoría.

A el personal de monitoria y material (Inesita, Vanessa, Paola) por los favores y facilidades que nos brindaron.

A Maritza López por su apoyo y favores brindados.

A tesistas del laboratorio 131 (Angélica, Pablito, Daniel, William, Caro Bello, Ruth) que ya casi lo logramos todos.

Y a todos los que se queden por fuera de esta lista, pero que igualmente saben que nos apoyaron y nos ayudaron y que les agradecemos.

Agradecimientos especiales Iván:

A Giya, Mi chinito, Enri, Pipe, Flaka y el resto que siempre estuvieron ahí al menos para ver la madrugadera y trasnochadera que toco y que apoyaron de alguna forma.

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………4

2. MARCO TEORICO………………………………………………………………7

1.1 REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL………………….7

1.1.1 ETILENO……………………………………………………….10

1.1.2 ACIDO ABSCÍSICO…………………………………………...11

1.1.3 CITOQUININAS……………………………………………….12

1.1.4 BRASINOESTEROIDES……………………………………..12

1.1.5 ACIDO JASMÓNICO..........................................................13

2.2 AUXINAS………………………………………………………………13 2.2.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES…………………………13

2.2.2 REGULACIÓN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA……14

2.2.3 BIOSÍNTESIS DE AUXINAS EN PLANTAS……….............18

2.3 GIBERELINAS……………………………………………………….19 2.3.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES…………………………20

2.3.2 REGULACIÓN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA……22

2.3.3 BIOSÍNTESIS DE GIBERELINAS EN PLANTAS…………..22

2.4 RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL……………………………………………………………….24 2.4.1 MECANISMOS DE ACCIÓN DE PGPRs…………………….24

2.4.1.1 Mecanismos de acción directa …………………..…….25

2.4.1.2 Mecanismos de acción indirecta………………….. …...29

2.4.2 BIOSÍNTESIS DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO

VEGETAL………………………………………………………...30

2.4.2.1 Biosíntesis de auxinas por bacterias...........................30

2.4.2.1.1 Ruta Indol 3 acetamida (IAM)…………………….. 30

2.4.2.1.2 Ruta Indol 3-Piruvato (IPvA)………………………..31

I

2.4.2.2 Biosíntesis de giberelinas por bacterias…………….32

2.5 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL…………………………………………34

2.5.1 MÉTODOS DE DETECCIÓN COLORIMÉTRICA DE

REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL………36

2.5.1.1 Detección colorimétrica de auxinas……………………36

2.5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky 36

2.5.1.2 Detección colorimétrica de giberelinas………………..36

2.5.1.2.1 Reactivo de Folling-Wu (ácido fosfomolíbdico)….36

2.5.1.2.2 Reactivo 2,4-ácido dinitrofenilhidrazina…………..37

2.5.2 DETECCIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE REGULADORES DE

CRECIMIENTO VEGETAL……………………………………….37

2.5.2.1 Cromatografía de capa fina (TLC)……………………..37

2.5.2.2 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)…….38

2.5.2.3 Cromatografía de gases acoplada a espectroscopía de

masas (GCMS)…………………………………………..38

2.5.2.4 Espectrofluorometría…………………………………….39

3. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………….41 4. OBJETIVOS……………………………………………………………………44

4.1 OBJETIVO GENERAL………………………………………………44 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………..44

5. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………45 5.1 ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE

AUXINAS (ÁCIDO INDOL ACÉTICO, AIA)……………………...45 5.1.1 DETECCIÓN COLORIMÉTRICA……………………………..45

5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky…………………………………..45

5.1.1.2 Evaluación del espectro de absorbancia (400-700nm)

para las reacciones con diferentes formulaciones del

reactivo de Salkowsky…………………………………... 47

II

5.1.2 DETECCIÓN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO

VEGETAL POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

(TLC)…………………………………………………………47

5.2 ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE GIBERELINAS………………………………………………………50

5.2.1 DETECCIÓN COLORIMÉTRICA……………………………..50

5.2.1.1 Reactivo Folling-Wu – ácido Fosfomolibdico………….50

5.2.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina……………………….51

5.2.2 DETECCIÓN FLUOROMÉTRICA…………………………….52

5.3 BIOENSAYO PARA LA DETECCIÓN DE AUXINAS Y GIBERELINAS………………………………………………………53

5.3.1 ÍNDICES DE GERMINACIÓN………………………………...54

5.4 MICROORGANISMOS……………………………………………….55 5.4.1 MEDIOS DE CULTIVO………………………………………...56

5.4.2 RECUPERACION Y RECONSTITUCIÓN DE CEPAS…….56

5.5 PRODUCCION DEL INOCULO PARA LA FERMENTACIÓN….56 5.5.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO Azotobacter vinelandii y

Azospirillum brasilense………………………………………..56

5.5.2 PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LAS CEPAS DEL

BIOINOCULANTE (14 Cepas)……………………………..57

5.5.3 FERMENTACIÓN DISCONTINUA…………………………...57

5.5.3.1 Fermentación discontinua de cepas de referencia y

estandarización de medio de cultivo……....................57

5.5.3.2 Fermentación discontinua de las cepas del

bioinoculante……………………………………………..58

5.6 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL A PARTIR DE CULTIVOS MICROBIANOS........................................................................58

5.6.1 DETECCION DE AUXINAS MICROBIANAS………………..58

5.6.1.1 Detección colorimétrica (Reactivo de Salkowsky)…...58

III

5.6.1.1.1 Curva patrón de ácido indol acético (AIA)………. 58

5.6.1.1.2 Determinación de producción de ácido indol acético

(AIA) en cultivos microbianos………………………..59

5.6.1.2 Detección de auxinas y giberelinas por cromatografía

de capa fina (TLC)………………………………………..59

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………….61 6.1 ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE

AUXINAS…………………………………………………………….61 6.1.1 DETECCIÓN COLORIMÉTRICA (REACTIVO DE

SALKOWSKY)…………………………………………………61

6.2 DETECCIÓN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC)…71

6.2.1 ESTANDARIZACIÓN DE FASE MÓVIL PARA TLC……….71

6.2.2 DETECCIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN

TLC……………………………………………………………...73

6.2.3 LIMITES DE DETECCION DE REGULADORES DE

CRECIMIENTO VEGETAL EN TLC (AIA, IBA, GA3)………75

6.3 ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE GIBERELINAS………………………………………………………76

6.3.1 DETECCIÓN COLORIMÉTRICA………………………………76

6.3.1.1 Reactivo Folling-Wu (ácido fosfomolíbdico).................76

6.3.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina………………………..77

6.3.2 DETECCIÓN FLUOROMÉTRICA……………………………..79

6.4 DETECCION DE ÁCIDO INDOL ACÉTICO EN CULTIVOS MICROBIANOS POR REACCIÓN DE SALKOWSKY………….81

6.4.1 CURVA PATRÓN DE ÁCIDO INDOL ACÉTICO (AIA)……..81

6.4.2 PRODUCCIÓN DE ÁCIDO INDOL ACÉTICO (AIA)………..82

6.4.2.1 Azotobacter vinelandii…………………………………..82

6.4.2.2 Azospirillum brasilense…………………………………87

6.4.2.3 Cepas bioinoculante……………………………………...89

IV

6.5. DETECCIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN CULTIVOS MICROBIANOS POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC)…………………………………………………………..93

6.5.1 Azotobacter vinelandii……………………………………….93

6.5.2 Azospirillum brasilense………………………………………95

6.5.3 CEPAS BIOINOCULANTE…………………………………..97

6.6 BIOENSAYO PARA DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL……………..105

6.6.1 ANÁLISIS ESTADÍSTICO……………………………………107

6. 7 ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN GENERAL……116

7. CONCLUSIONES……………………………………………………………122

8. RECOMENDACIONES………………………………………………………124 9. REFERENCIAS………………………………………………………………126

V

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 5.1 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de mezclas de

ácido perclórico y cloruro férrico y ácido sulfúrico y cloruro férrico…………..46

Tabla 5.2 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de ácido sulfúrico

con diferentes modificaciones en cuanto a concentraciones de H2SO4 y FeCl3

y diferentes volúmenes de reacción……………………………………………..46

Tabla 5.3. Descripción de fases móviles utilizadas en la estandarización de

TLC para detección de reguladores de crecimiento vegetal………………….48

Tabla 5.4 Índices de germinación……………………………………………….55

Tabla 6.1 Datos de pendiente, R2 y color obtenidos a partir de la reacción de

HClO4, R1, R2 y R3 con AIA……………………………………………………..63

Tabla 6.2 Datos de pendiente y R2 obtenidos a partir de la reacción de R1m,

R1m1, R1m2 y R2m con AIA………………………………………...................66

Tabla 6.3 Valores de máxima absorción en el espectro absorbancia de 400

– 700nm de las reacciones con las diferentes formulaciones del reactivo de

Salkowsky…………………………………………………………………………..68

Tabla 6.4 Movilidad cromatográfica (Rf) de reguladores de crecimiento (GA3,

AIA, IBA) en las fases móviles evaluadas………………………………………72

Tabla 6.5 Mejores valores de movilidad cromatográfica (Rf) Rf de las fases

móviles para la detección de AIA, IBA y GA3…………………………………..73

Tabla 6.6 Cuadro de comparación de día de mayor producción de AIA por

Azotobacter vinelandii en medios TSB y BT…………………………………...86


Azospirillum brasilense en medios TSB y BT…………………………………..89

Tabla 6.8 Valores de máxima producción de AIA cepas bioinoculante…… 91


las cepas del bioinoculante evaluado y Azospirillum brasilense……………..92

VI

Tabla 6.10 Valores de movilidad cromatográfica (Rf) de reguladores de

crecimiento en cultivos de Azotobacter vinelandii……………………………..93


crecimiento en cultivos de Azospirillum brasiliense……………………………94


crecimiento en cultivos de cepas del bioinoculante……………………………98

Tabla 6.13 Análisis multivariado MANOVA para la variable réplica en la

interacción tratamiento*réplica en pruebas de bioensayos………………….108

Tabla 6.14 Valores de P (ANOVA) para la detección de actividad de

reguladores de crecimiento en bioensayos……………………………………108

Tabla 6.15 Tablas de comparación Duncan para estadio 1………………..113



Tabla 6.18 Resultados de los mejores tratamientos para los montajes 1 y 2

de evaluación de lo reguladores, y montaje 3 de evaluación de

microorganismos…………………………………………………………………116

VII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1 Movimientos de los reguladores de crecimiento en la planta…….8

Figura 2.2 Estructura química del Etileno……………………………………..10

Figura 2.3 Estructura química del Ácido Abscísico…………………………..11

Figura 2.4 Estructura química de citoquinina…………………………………12

Figura 2.5 Estructura química del Ácido 3-Indol Acético…………………….14

Figura 2.6 Auxinas naturales……………………………………………………15

Figura 2.7 Auxinas sintéticas……………………………………………………16

Figura 2.8 Biosíntesis de AIA en plantas………………………………………18

Figura 2.9 Estructura química de las giberelinas……………………………..21

Figura 2.10 Rutas de biosíntesis de las giberelinas en plantas…………….23

Figura 2.11 Biosíntesis de AIA en bacterias…………………………………..32

Figura 2.12 Ruta de síntesis de giberelinas Acido Mevalonico……………..33

Figura 5.1 Revelado por inmersión……………………………………………49

Figura 5.2 Revelado por aspersión……………………………………………49

Figura 5.3 Cámaras de TLC y placas de silica gel…………………………..49

Figura 5.4 Cámara húmeda bioensayo………………………………………..53

Figura 5.5 Estadios de desarrollo germinación de semillas de lechuga….54

Figura 5.6 Cámara de TLC…………………………………………………….60

Figura 6.1 Curvas de detección AIA con el reactivo de Salkowsky a base a

de ácido perclórico y ácido sulfúrico……………………………………………61

Figura 6.2 Muestras de reacción de diferentes concentraciones de AIA con

los diferentes reactivos de Salkowsky………………………………………….62

Figura 6.3 Curvas de detección de AIA con el reactivo de Salkowsky a base

a de ácido perclórico y ácido sulfúrico………………………………………….64

Figura 6.4 Muestras de reacción de diferentes concentraciones de AIA con

los diferentes reactivos de Salkowsky…………………………………………..65

VIII

Figura 6.5 Espectro de absorción de reacciones con diferentes

formulaciones de reactivo de Salkowsky (AIA 30ug/m)……………………….69

Figura 6.6 Espectro de absorción de reacciones con formulaciones de

reactivo de Salkowsky modificadas (AIA 30ug/m)……………………………..70

Figura 6.7 Cromatogramas luz visible y UV S13, S5, S2.............................74

Figura 6.8 Límite de detección de reguladores de crecimiento vegetal (AIA,

IBA y GA3) en TLC………………………………………………………………...75

Figura 6.9 Reacción con ácido fosfomolíbdico a diferentes concentraciones

de GA3……………………………………………………………………………….76

Figura 6.10 Reacción de ácido fosfomolíbdico con una mezcla de AIA y GA3.

(1:1)…………………………………………………………………………………77

Figura 6.11 Reacción del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferente

concentraciones de GA3………………………………………………………….78

Figura 6.12 Reacción del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferentes

concentraciones de AIA………………………………………………………….78

Figura 6.13 Curva patrón de concentraciones AIA con reactivo Salkowsky

(R1m)………………………………………………………………………………81

Figura 6.14 Curvas de producción de AIA por Azotobacter vinelandii en

diferentes medios…………………………………………………………………82

Figura 6.15 Producción AIA por A. vinelandii ATCC12518 en medio BT…83

Figura 6.16 Curvas crecimiento(Abs540) y producción de AIA (ug/ml) de

Azotobacter vinelandii en diferentes medios de cultivo………………………85

Figura 6.17 Curvas de producción de AIA por Azospirillum brasilense en

diferentes medios…………………………………………………………………86

Figura 6.18 Curvas crecimiento (Abs540nm) y producción de AIA (ug/ml) de

Azospirillum brasilense en diferentes medios………………………………….87

Figura 6.19 Producción de AIA por las cepas del bioinoculante evaluado, y

curva de producción de AIA por Azotobacter vinelandii ……………………...90 Figura 6.20 Cromatógramas A. vinelandii. ..................................................94

Figura 6.21 Cromatógramas A. brasilense...................................................96

IX

Figura 6.22 Cromatógramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante99

Figura 6.23 Estadíos de desarrollo Lactuca sativa L……………………….108

X

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1

MEDIOS DE CULTIVO…………………………………………………………..132

ANEXO 2

GRÁFICAS DE PRODUCCIÓN AIA……………………………………………133

ANEXO 3

ESTADÍSTICA BIOENSAYO……………………………………………………139

XI

1

Resumen

Se evaluaron diferentes técnicas para la detección de reguladores de

crecimiento vegetal específicamente, Acido Indol Acético y Giberelinas,

dentro de las cuales se realizó una estandarización para el reactivo de

Salkowsky a base de acido sulfúrico como técnica cuantitativa para AIA y

cromatografia de capa fina como técnica cualitativa, tanto para AIA como

para GA3, buscando los solventes de mejor resolución y reactivos de mayor

espectro de detección. Igualmente se buscó la estandarización de un

bioensayo que permitiera determinar los efectos específicos de diferentes

tratamientos con reguladores grado reactivo y presentaciones comerciales,

para así poder precisar el efecto de la inoculación de semillas con caldos

microbianos y establecer la acción de los reguladores de crecimiento vegetal.

Se escogió el reactivo de Salkowsky R1m (H2SO4 7,9M – FeCl3 40mM,

proporción muestra reactivo 1:2), el cual mostró características muy similares

a las observadas con Salkowsky-HClO4 para la determinación de AIA.

Para la técnica de cromatografía de capa fina se logró la estandarización de

la fase móvil cloroformo: etilacetato : acido acético (50:30:20) con la cual se

obtuvo buena resolución de AIA, IBA y GA3, ya que no se reportan solventes

que determinen los tres tipos de reguladores al mismo tiempo. El revelador

(H2SO4 60% - FeCl3 28mM) también permitió la detección de los tres

reguladores.

Igualmente a partir de cultivos microbianos montados para evaluar su

capacidad como promotores de crecimiento vegetal por producción de

reguladores con las técnicas previamente estandarizadas, se logró la

implementación de un medio de cultivo sencillo y económico (BT) que

2

promoviera la producción de los reguladores y así mismo el desarrollo

microbiano.

Finalmente se montó un bioensayo en el cual se logró determinar el efecto

de diferentes reguladores de crecimiento vegetal en tres estadíos de

desarrollo en plántulas de lechuga, y así al inocular las semillas con las

cepas evaluadas como promotoras, asociar la producción de promotores a

su efecto en el desarrollo de las plántulas.

3

Abstract Different techniques for plant growth regulators detection, specifically indol

acetic acid and gibberellins, were evaluated. A standardization for AIA

quantitative colorimetric detection was performed, using a new Salkowsky

reagent formulation with sulfuric acid. As qualitative technique for AIA and

GA3 detection, TLC was evaluated, looking for solvent systems with better

resolution and spray reagens with a wider detection spectrum. A bioassay

was proved, to determine the specific effects of different plant growth

regulators (reactive and commercial grade), in order to set microbial broths

treatment effects and to establish the plant growth regulators effect.

Salkowsky R1m reactive (H2SO4 7,9M – FeCl3 40mM, sample reactive

proportion 1:2) was chosen, it showed the most similar activity compared with

Salkowsky-HClO4 for AIA determination.

For TLC standardization, the solvent system chloroform : ethyl acetate :

acetic acid (50:30:20) proved a proper AIA, IBA y GA3 resolution, knowing

that there are not reports for solvent systems which enable the detection of

the three regulators at the same run. The spray reagent (H2SO4 60% - FeCl3

28mM) allowed the three regulator detection as well.

The microbial cultures evaluated for plant growth promoters detection,

permitted the implementation of a simple and economic culture media (BT),

which induce both growth promoters production and good microbial

development

Finally, a bioassay was performed. This assay let to determine the effect of

different plant growth regulators at three development stages in lettuce

seedlings. Following that, it was possible to associate plant growth regulator

production and effects on seedlings development to lettuce seeds treated

with microbial broths.

4

1. INTRODUCCIÓN

Con la llegada de la segunda revolución verde se han establecido nuevas

tecnologías, las cuales buscan la optimización de los sistemas agrícolas. De

esta forma se ha abierto campo a la investigación y, a la producción de

bioformulados comerciales. Estos se basan en microorganismos con

reconocida actividad como promotores de crecimiento vegetal. Actividad que

es fundamentada básicamente en la producción de reguladores de

crecimiento vegetal capaces de incrementar la velocidad de germinación en

las semillas, fortalecimiento de los mecanismos naturales de defensa de la

planta y estimulación del sistema radicular, entre otros que le proveen

ventajas beneficios a la planta.

Al grupo de reguladores de crecimiento vegetal pertenecen las auxinas, un

grupo ampliamente reconocido y estudiado, en donde la más conocida es el

ácido indol acético (AIA). Aunque muchos compuestos químicos de

estructura similar pueden reeemplazarlo para promover los fenómenos

típicos del AIA, otro compuesto ampliamente utilizado es el ácido indol

butírico (IBA), siendo estos los más relevantes. Estos compuestos, pueden

ser sintetizados artificialmente, así como también otra auxina, el ácido

naftalen acético (NAA), los cuales son comercializados y utilizados

ampliamente en varios campos.

La acción de las auxinas como reguladores del crecimiento vegetal está

asociada al desarrollo y regulación de la planta, entre los cuales se

encuentra la elongación celular, tropismos, división celular y enraizamiento,

entre otras.

5

Las giberelinas (GAs), funcionan como reguladores de crecimiento vegetal al

estar estrechamente asociadas a la promoción de la germinación de las

semillas, crecimiento del tallo, inducir la brotación de yemas y el desarrollo de

los frutos. Existen varios tipos de giberelinas, siendo las más comunes: GA1,

GA3, GA4, GA7 y GA9.

En la naturaleza dichos reguladores de crecimiento vegetal no solo son

producidos por las plantas, sino que también otros organismos, presentes en

el suelo, los cuales son capaces de sintetizar estos metabolitos, y que están

en contacto constante con las raíces de las plantas, lo que genera un mejor

desarrollo de estas y así una relación entre la planta y el microorganismo,

estos microorganismos, ya sean hongos o bacterias, son conocidos como

promotores de crecimiento vegetal o PGPMs (Plant Growth Promoting

Microorganisms) que no solo son capaces de sintetizar reguladores de

crecimiento vegetal sino que también ayudan a las plantas en otros

procesos, evidenciando su producción por medio de bioensayos, por su

especificidad y precisión.

Con el tiempo, se han establecido varios estudios de dichos reguladores de

crecimiento vegetal, aplicando técnicas de análisis químicos, las cuales

pueden identificar, caracterizar y cuantificar estos compuestos. Las técnicas

más utilizadas son las cromatográficas como cromatografía en capa fina,

cromatografía líquida de alta resolución, al igual que cromatografía de gases

combinada con espectrofotometría de masas. Estas técnicas se han aplicado

al estudio de estos y otros compuestos orgánicos para elucidar su

conformación estructural, detección y cuantificación de producción por

determinados organismos, ya sean plantas, hongos o bacterias.

El esatudio de estos reguladores de crecimiento vegetal producidos por

microorganismos, no es fácil puesto que se producen en bajas

6

concentraciones y pueden encontrarse mezclados con otros compuestos

debido a que se generan como metabolitos secundarios, lo que hace

necesaria la purificación eficiente del compuesto.

Generalmente se utilizan procesos de cromatografía con sorbentes como gel

de sílice, una vez purificado, su análisis se hace teniendo en cuenta las

características químicas del mismo, basado en la aparición de fluorescencia

(por ejemplo GA3).

Debido a las distintas funciones de los reguladores de crecimiento vegetal y

en este caso específico las auxinas y giberelinas, sobre las plantas, y así

mismo a la gran variedad de organismos capaces de sintetizar estos

metabolitos, es preciso un método estándar para evaluar la producción de

dichos compuestos por los microorganismos promotores del crecimiento

vegetal, sin importar que tipo de microorganismo sea y dar pie a la

generación de nuevas investigaciones para evaluación de calidad de

bioformulados y producción de biofertilizantes, entre otros.

Este trabajo hace parte del proyecto “Formación de técnicos para mejorar la

calidad de suelos en países en vía de desarrollo: empleo de compost

mejorado biotecnológicamente en cultivos orgánicos”, financiado por la

Fundación Internacional de Universidades Católicas (FIUC).

7

2. MARCO TEÓRICO

2.1 REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL

Los reguladores del crecimiento vegetal o fitohormonas, son compuestos

orgánicos de bajo peso molecular que actúan a muy bajas concentraciones

en sitios distantes de donde son producidos, interviniendo en muchos

procesos fisiológicos como el desarrollo de tejidos, crecimiento del tallo y la

caída de hojas, entre otros (Purves et al., 2002; Salisbury, 1994). Estos

reguladores están directamente involucrados en procesos metabólicos o en

el proceso de desarrollo tal es el caso de la producción de amilasa y la

inducción de la floración entre otros, pero al actuar en bajas concentraciones

modifican dichos procesos, donde sus efectos varían según su interacción

con otros reguladores de crecimiento vegetal, de esta forma regulan o

influyen en un rango de procesos celulares y fisiológicos entre los que se

cuentan la división celular, diferenciación celular, desarrollo de frutos,

tropismos, dormancia de semillas, germinación de semillas, senescencia,

abscisión de las hojas, entre otras.

Son usados ampliamente en la agricultura, horticultura y biotecnología para

modificar y controlar el desarrollo y crecimiento de las plantas.

El término utilizado para nombrarlas como hormonas vegetales todavía es

debatido por algunos autores, puesto que las plantas no poseen un sistema

circulatorio análogo al de los animales. Por su naturaleza química, no son

proteínas, y el hecho de que dichas hormonas estimulan o regulan el

crecimiento de la planta, es por lo que muchos botánicos y biólogos se

refieren a ellas como reguladores del crecimiento vegetal, término que será

adoptado en este trabajo.

8

Existen siete clases de reguladores de crecimiento vegetal entre los cuales

se encuentran auxinas, giberelinas, citoquininas, brasinosteroides, ácido

abscísico, etileno y ácido jasmónico,, las cuales participan en la regulación

del crecimiento y desarrollo de la planta (Kende & Zeevaart, 1997; Tanimoto,

2005).

Figura 2.1 Movimientos de los reguladores de crecimiento

en la planta. Tomado de Tanimoto, 2005.

Dentro de los reguladores que promueven una respuesta fisiológica, existen

cuatro grupos principales de compuestos que ocurren en forma natural, cada

uno de los cuales exhibe propiedades de regulación del crecimiento en

plantas. Se incluyen auxinas, giberelinas, citoquininas y etileno, mientras que

los que inhiben el crecimiento o lo retardan se encuentran el ácido abscísico

con una estructura particular y actuando a muy bajas concentraciones dentro

de la planta (Kende & Zeevaart, 1997; Tanimoto, 2005).

La actividad de estos

reguladores sigue una

dinámica de regulación

intrínseca y un movimiento

dentro de la planta (Figura

2.1), establecido en base a

estudios clásicos desde el

sitio de producción y

transporte de cada

regulador (Tanimoto, 2005).

Algunos de estos

reguladores son adquiridos

del suelo afectando el

desarrollo de la planta.

9

Los reguladores de crecimiento vegetal, actúan de uno u otro modo en

todos los procesos de desarrollo, estos fenómenos de regulación pueden

clasificarse de acuerdo con Rojas& Ramírez, 1993 en:

1. De correlación, como multiplicación y alargamiento celular,

dominancia apical, actividad de las yemas, letargo y absición de

órganos.

2. De sensibilidad o movimiento como los tropismos y nastias.

3. De reproducción como floración, polinización y desarrollo del fruto.

También se ven implicados regulando el transporte de nutrientes, en sitios

donde los nutrientes se elaboran en mayor cantidad de la requerida como las

hojas a puntos donde se utilizan intensamente sin que elaboren la cantidad

suficiente, como las raíces flores y frutos en desarrollo (Rojas& Ramírez,

1993).

El concepto de hormonas vegetales o reguladores de crecimiento vegetal es

derivado de experimentos sobre tropismo realizados por Charles Darwin en

coleóptilos en donde se evidenció la respuesta de un regulador endógeno,

llevandolo al descubrimiento de las auxinas en 1928, y el consecuente

descubrimiento del ácido indol acético (Rojas & Ramírez, 1993).

El descubrimiento de este regulador generó como consecuencia varias líneas

de investigación encaminadas al descubrimiento de otros reguladores.

10

La caracterización química de éstos, fue establecida a partir de tejidos de

plantas superiores, y su descubrimiento fue a través de ensayos a partir de

extracto de tejidos y la acción de cada regulador, auxinas a partir de orina,

giberelina de cultivos filtrados de Gibberella fujikoroi, entre otros. Hoy en día

se utilizan métodos de extracción y purificación como HPLC, TLC y GC-MS,

entre otros (Davies, 1988).

2.1.1 ETILENO

Figura 2.2 Estructura química del Etileno.

Tomado de www.plant-hormone info.

promueve la senecencia, se produce en todas las partes de la planta y está

involucrado en la maduración de los frutos al promover la senescencia lo que

acelera la maduración, interviene en el mantenimiento del gancho apical en

plántulas, en la diferenciación de la raíz y hojas, en la formación de raíces

adventicias y estimula la maduración de los frutos. Es sintetizado a partir del

aminoácido metionina en todos los tejidos de la planta, aunque está más

asociada a los frutos y su producción depende del tipo de tejido, al igual que

de la especie vegetal y del estado de desarrollo de la planta (Purves et al.,

2002; Salisbury, 1994).

En 1935, Crocker propuso al etileno

como regulador del crecimiento

vegetal tras varios años de

observación como regulador y como

producto sintetizado por la planta

(Davies, 1988). Hoy en día es

reconocido como un regulador del

crecimiento vegetal de tipo

gaseoso (Figura 2.2), que

11

2.1.2 ÁCIDO ABSCÍSICO

Figura 2.3 Estructura química del Ácido

Abscísico.


Suele estar presente en altas concentraciones en los brotes latentes y en

algunas semillas latentes, y es el inhibidor más común de la germinación de

las semillas. También inhibe el alargamiento del tallo, regula el intercambio

de gas (CO2) y vapor de agua entre las hojas y la atmósfera mediante sus

efectos sobre los estomas, ya que estimula la oclusión de los estomas,

generalmente inhibe la función de otras enzimas como sucede con las

giberelinas. Es un compuesto de naturaleza sesquiterpenoide, producido en

la ruta del ácido mevalónico en los cloroplastos en donde es sintetizado

parcialmente ya que es biosintetizado inicialmente en las hojas. Su

producción es estimulada por el estrés y por las bajas temperaturas (Purves

et al., 2002; Salisbury, 1994).

En 1963 fue identificado y

caracterizado por Frederick Adicto,

mientras estudiaba el compuesto

responsable de la abscisión de la los

frutos en el algodón. El ácido abscísico

(Figura 2.3), promueve la acumulación

de las proteínas de almacenamiento en

las semillas (Davies, 1988).

12

2.1.3 CITOQUININAS

Figura 2.4 Estructura química de citoquinina


Las citoquininas (Figura 2.4), estimulan la formación de brotes, promueven la

división celular, ayudan a la germinación, inhiben el alargamiento del tallo,

estimulan el crecimiento de los brotes laterales y retardan el envejecimiento

de las hojas. Se encuentra en altas concentraciones en los meristemos y los

tejidos en crecimiento hasta donde es traslocado por el xilema desde las

raíces, desde donde probablemente es sintetizado por la ruta bioquímica de

la adenina (Purves et al., 2002; Salisbury, 1994).

2.1.3 BRASINOESTEROIDES

Siendo estos reguladores de crecimiento vegetal recientemente

determinados, los brasinoesteroides son conocidos como reguladores

“nuevos“ con múltiples efectos. Estimulan el alargamiento celular, el

alargamiento del tubo polínico y la diferenciación del tejido vascular, e inhiben

el alargamiento de la raíz (Taiz & Zeiger, 2006).

Son polihidroxiesteroides de 27, 28 o 29 átomos de carbono. Están

presentes en todos los tejidos vegetales. Biosintéticamente provienen del

cicloartenol, obtenido desde el escualeno (triterpeno). Se catabolizan por, la

conjugación con ácidos grasos, glicosilacion y oxidaciones (Soberón et al.,

En 1913 Gottlieb Haberlandt descubrió

un compuesto en el floema con la

capacidad de estimular la división

celular, trabajo que fue extendido en

1954 por Jablonski y Skoog. Fue solo

hasta 1955 cuando Millar, aisló el

compuesto y tomó su nombre por

estimular la división celular y el proceso

de citoquinesis (Davies, 1988).

13

2006). El tratamiento con nanogramos de brasinoesteroides por planta es

suficiente para promover el crecimiento, por lo que serán de importancia en

la agricultura, al aumentar los rendimientos de cultivos (Purves et al, 2002).

2.1.4 ÁCIDO JASMONICO

El ácido jasmónico y el jasmonato de metilo tienen un papel dentro de las

respuestas al estrés y de defensa. También se ha comprobado que estos

compuestos pueden modular procesos como la viabilidad del polen, la

maduración de frutos y el crecimiento de la raíz (Purves et al, 2002).

2.2 AUXINAS

Charles Darwin, en su libro el Poder de Movimiento en las Plantas, pone de

manifiesto la actividad de una sustancia con capacidad para inducir el

movimiento frente a una fuente de luz en coleoptilos de Phalaris canariensis

(alpiste), la cual posteriormente fue identificada como auxina (Arteca, 1996).

Desde ese entonces han sido ampliamente estudiadas y juegan un papel

central en la regulación del crecimiento de las raíces, promueven la

elongación del tallo e inhiben el crecimiento de brotes laterales manteniendo

la dominancia apical (Salisbury, 1994).

2.2.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES

El nombre auxina se deriva del griego auxein, que significa aumento o

incremento, designando cualquier compuesto constituido por el grupo

auxínico, y a menudo se usa como sinónimo al ácido indolacético (AIA).

Químicamente son llamadas ácido 3 -indol – acético (Figura 2.5), y son

derivados del triptofano.

14

Figura 2.5 Estructura química del Ácido 3-Indol Acético.


Su estructura química básica, se compone de un grupo indol, por lo que es

fácil encontrar en las plantas otros compuestos con estructura similar (Figura

2.6). Hoy en día se encuentran compuesto de similar acción sintetizados

artificialmente (Figura 2.7).

Para que una sustancia exhiba acción auxínica debe tener un radical ácido o

ser fácilmente convertible a él, un anillo aromático y de uno a cuatro

carbonos entre el carboxilo y el anillo(Rojas & Ramirez, 1987).. Todas las

auxinas sintéticas causan efectos parecidos pero cada producto individual

tiene una aplicación particular dentro de la regulación o acción auxínica (Taiz

& Zeiger, 2006)

Existen tres grupos auxínicos (Rojas & Ramirez, 1987):

• Derivados del indol como ácido indol propiónico (IPA), ácido indol

butírico (IBA) (Figura 2.6) y el áido 3-indol acético (AIA) (Figura 2.5).

• Derivados del naftaleno, como ácido naftalen acético (NAA) (Figura

2.6), ácido naftoxiacético (Noxa o BNOA), ácido naftilpropiónico

(NPA).

• Derivados fenoxi, usados como herbicidas selectivos y algunas veces

como reguladores del crecimiento vegetal.

15

Figura 2.6 Auxinas naturales. Tomado de www.biologie.uni-hamburg.de

Se encuentran en las células en concentraciones de 10-6 -10-8 M, y su

distribución dentro de los tejidos está sujeto a los principios del transporte

activo y polar. Si la concentración del compuesto en el tejido aumenta, el

efecto que tienen sobre la planta será la inhibición de la elongación de la

raíz, la razón es un estímulo en la producción de etileno, mientras que a

bajas concentraciones estimula la elongación de los brotes y las raíces

(Salisbury, 1994).

4-clorindol-3-acido acetico (4-Cl-IAA) Acido indol acético-aspartico

Acido fenilacetico (PAA)

Acido indol 3 -butírico

16

Acido 2,4,5-triclorofenoxiacético

Acido 2,4 - diclorofenoxiacético

2,4,5-Triclorofenoxiacético

Acido α – naftalinacético Figura 2.7 Auxinas sintéticas. Tomado de www.biologie.uni-hamburg.de

2.2.2 REGULACIÓN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA

Las funciones de las auxinas en los tejidos vegetales están estrechamente

ligadas a la elongación celular, fototropismo, geotropismo, dominancia apical,

iniciación de la raíz, producción de etileno y desarrollo de los frutos.

La elongación celular, está generada por la respuesta del tejido a las auxinas

las cuales son resumidas por Arteca, 1996 en:

• Baja resistencia de la pared celular, al romperse los enlaces

covalentes entre la celulosa y los xiloglucanos de la pared celular.

17

• Cambió en las relaciones hídricas de la célula, aunque el potencial

osmótico no cambia; el potencial de la célula se torna negativo.

• Al disminuir el potencial hídrico, el agua dentro de la célula se mueve

hacia la pared celular ejerciendo presión y ocasionando la elongación

celular.

• Una vez elongada la célula, los enlaces covalentes entre la celulosa y

los polisacáridos de la pared son establecidos nuevamente.

El fototropismo está influenciado por el transporte de las auxinas,

acumulándose a un lado del tallo, generando el movimiento en respuesta a

los estímulos de la luz (Arteca, 1996), el geotropismo responde de igual

forma a la acumulación de las auxinas en las hojas y el tallo en respuesta a

la fuerza de gravedad (Arteca, 1996).

La dominancia apical está relacionada con el transporte de auxinas por

medio de un mecanismo dependiente de energía, alejándose en forma

basipétala desde el punto apical de la planta hacia su base. Este flujo de

auxina reprime el desarrollo de brotes axilares laterales a lo largo del tallo,

manteniendo de esta forma la dominancia apical (Arteca, 1996).

Las auxinas promueven el desarrollo radicular al estimular la iniciación de

la raíz en esquejes y su diferenciación, lo cual es evidente con la aplicación

exógena de auxinas, donde la elongación de la raíz se ve disminuida

cuando su concentración es baja. Son reconocidas como estimulantes de

la producción de etileno en varios tejidos, incrementa el tamaño de los

frutos al estimular el crecimiento de las células, ya que actúan sobre la

elongación y la división celular jugando un papel fundamental en el

crecimiento de órganos y frutos (Salisbury et al, 1994).

18

2.2.3 BIOSÍNTESIS DE AUXINAS EN PLANTAS

Las auxinas son producidas en las plantas a partir del catabolismo del

triptófano lo cual se observó en ensayos en donde al colocar triptófano éste

era catabolizado por el tejido en AIA, aumentando su concentración en el

mismo (Salisbury et al., 1994; Taiz & Zeiger, 2006).

Figura 2.8 Biosíntesis de AIA en plantas. Tomado de Taiz & Zeiger, 2006

19

El triptófano está compuesto por un grupo indol y está universalmente

presente en los tejidos vegetales, ya sea en forma libre o incorporada. Hay

tres rutas principales de síntesis de auxinas dependientes del triptófano (Taiz

& Zeiger, 2006).

La ruta de tripatamina (TAM), está presente en numerosas especies de

plantas incluyendo Arabidopsis thaliana. La decarboxilación del triptófano a

triptamina, produce una serie de reacciones enzimáticas que originan indol 3-

acetaldehído (IAAId), el cual es oxidado por la IAA deshidrogenasa

convirtiéndolo en ácido 3-indol acético (Figura 2.8). La ruta de síntesis del

indol 3-piruvato (IPA), está estrechamente relacionada con la ruta TAM, ya

que su precursor es el TAM el cual es convertido a indol 3–piruvato por la

acción enzimática de la Trp aminotransferasa, el cual es decarboxilado para

formar IAAId, que es convertido en ácido 3–indol acético. A partir del indol 3–

acetonitrilo (IAN) se origina la ruta de IAN, en la cual el triptófano es

inicialmente convertido a inol 3 acetaldoina (IAOx) y posteriormente a IAN,

para finalmente ser convertido en Acido 3–Indol Acético (Figura 2.8) (Taiz &

Zeiger, 2006).

2.3 GIBERELINAS

Las giberelinas (GAs) son reguladores del creciemiento de las plantas

superiores que regulan numerosos aspectos del desarrollo vegetal.

Este grupo de hormonas fue descubierto al azar por fitopatólogos japoneses

que estudiaban en el arroz una enfermedad conocida como Bakane (planta

loca) causada por el hongo Gibberella fujikuroi en el año de 1809, en donde

se observaba un crecimiento excesivo en los tallos y brotes. Posteriormente

en 1955, se aisló a partir del filtrado segregado por el hongo, el compuesto

20

inductor del sobrecrecimiento del tallo que se denominó ácido giberélico.

Pocos años después, se comprobó que las plantas también poseen

compuestos con estructuras muy semejantes al ácido giberélico (Agrios,

2004).

Hoy en día muchos de los microorganismos promotores del crecimiento

vegetal son reconocidos como productores de giberelinas. Tal es el caso de

bacterias de los géneros Azospirillum, Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter,

algunos hongos como Gibberella fujikuroi, Fusarium moniliforme,

Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus flavus, F. oxysporium, Penicillium

corylophilum, P. cyclopium y Rhizopus stolonifer, entre otros, también han

reportado algas como productoras de giberelinas (Ergun et al, 2002; Hasan,

2002; Janzen et al, 1992; Sánchez- Marroquín, 1963; Srivastava & Ahmad,

2003; Unyayar & Unyayar., 1996).

Se han aislado y caracterizado 121 GAs, la mayoría de ellas a partir de

especies vegetales superiores. Al estudiar dichos compuestos se determinó

su estructura, revelando su capacidad como reguladores del crecimiento

vegetal, por lo que pueden afectar, regular o modular un amplio rango de

respuestas de crecimiento vegetal ya sea en la germinación de semillas, la

estimulación del crecimiento del tallo o raíces (Azcon & Bieto, 2000).

2.3.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES

Desde el punto de vista químico, las GAs (Figura 2.9) constituyen una familia

de diterpenos tetracíclicos ácidos cuyo esqueleto está constituido por un

anillo ent-giberelano de 20 o 19 átomos de carbono. Sin embargo, a nivel

fisiológico, en este grupo solamente se pueden distinguir unos pocos

miembros con capacidad para influir en el crecimiento vegetal o giberelinas

activas (Arteca, 1996).

21

Figura 2.9 Estructura química de las giberelinas. Tomado de Life the Science of Biology, 2001.

En cuanto a su actividad biológica, muy pocos compuestos pertenecientes a

la gran familia de giberelinas poseen la capacidad de regular el desarrollo

vegetal, el resto son precursores o productos inactivados laterales o finales,

también como reservas de las rutas que sintetizan las GAs activas.

La capacidad individual de cada giberelina para modificar el crecimiento se

determinó en la década de los sesenta mediante ensayos biológicos, en

éstos se determinó la respuesta de una determinada GA en un proceso

fisiológico dado. Las respuestas que producen o modulan las giberelinas

afectan tanto la regulación del crecimiento vegetativo como al desarrollo

reproductivo de la planta (Azcon & Bieto, 2000).

Las GAs son determinantes en el control de la elongación del tallo, también

modifican sustancialmente los procesos reproductivos de los vegetales,

participando en el control de la inducción de la floración la cual se ha

estudiado en Arabidopsis thaliana (Phillps, 1998), en la producción,

crecimiento, y desarrollo de los frutos. Así mismo sustituyen los

requerimientos de luz o frío que precisan muchas de las semillas para

germinar (Azcon & Bieto, 2000; Salisbury, 1994).

22

2.3.2 REGULACIÓN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA

Las giberelinas promueven el crecimiento celular debido a que incrementan

la hidrólisis de almidón, fructanos y sacarosa con lo que se originan

moléculas de fructosa y glucosa. Estas hexosas proporcionan energía vía

respiración contribuyendo a la formación de la pared celular, y a la

alimentanción de los embriones, acelera la germinación de las semillas,

también hacen momentáneamente más negativo el potencial hídrico de la

célula, lo que genera que el agua penetre con mayor rapidez provocando la

expansión celular y diluyendo los azúcares (Davies, 1988).

2.2.2 BIOSÍNTESIS DE GIBERELINAS EN PLANTAS

Para la síntesis de giberelinas se siguen los pasos comunes de síntesis de

terpenoides. Un terpenoide es una sustancia compuesta por bloques o

unidades de cinco átomos de carbono denominados isoprenos; según el

número de isoprenos, las giberelinas se denominan como diterpenos (Azcon

& Bieto, 2000).

La biosíntesis de giberelinas ha sido objeto de varias revisiones (Hedden,

1999; Hedden & Kamiya, 1997; Olzewski et al., 2002). Se divide en tres

etapas de acuerdo con su localización celular y las diferentes características

de las enzimas que participan en el proceso de síntesis, la primera etapa se

localiza en los plastidios y consiste en la conversión de geranilgeranil

difosfato (GGDP) a ent-kaureno, por acción de la enzima ent-kaureno

sintetasa (Figura 2.10), GGDP se sintetiza a través de la ruta del ácido

mevalónico (MVA) (Figura 2.10) en el citoplasma, la no dependiente de MVA

en el cloroplasto, la segunda etapa está localizada en el retículo

endoplasmático y consiste en la síntesis de GA12 a partir de ent-kaureno;

23

está catalizada por dos monooxigenasas de membrana dependiente de

NADPH; la ent-kaureno oxidasa (KO) y ácido ent-kaurenoico oxidasa (KAO),

cada uno de los cuales cataliza tres pasos metabólicos consecutivos. Estas

rutas son comunes a todos los organismos incluyendo microorganismos

(Arteca, 1996; Martinez & García, 2004). La tercera etapa de la biosíntesis de

GAs tiene lugar en el citoplasma y en ella intervienen dioxigenasas solubles

dependientes de 2-ceto-glutarato y Fe+2, esta es la etapa más compleja en la

que se han descrito dos rutas metabólicas importantes denominadas:

• No hidroxilación temprana en el carbono 13

• Hidroxilación temprana en el carbono 13

Figura 2.10 Rutas de biosíntesis de las giberelinas en plantas. Tomado de Martinez & García, 2004

24

2.4 BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPRs, Plant Growth

Promoting Rhizobacteria), son capaces de colonizar los sistemas radicales

de las plantas y promover el crecimiento de éstas. Tienen la capacidad de

alterar el crecimiento de los tejidos vegetales directa o indirectamente;

indirectamente las PGPR juegan un papel importante en la disminución o

prevención de otros fitopatógenos que puedan atacar las plantas; mientras

que directamente las PGPR promueven el crecimiento de la planta al

sintetizar compuestos (por ejemplo reguladores del crecimiento vegetal) que

le facilitan a la planta la toma de nutrientes del ambiente (Gray & Smith,

2004).

Las PGPRs sintetizan compuestos como auxinas y compuestos parecidos a

las giberelinas que aumentan la taSa de germinación de las semillas y el

desarrollo de pelos radiculares que ayudan a la planta a crece al aumentar la

capacidad de absorber (Hasan, 2002). La síntesis microbiana de sustancias

reguladores de crecimiento como las auxinas y giberelinas es un factor

importante en la fertilidad del suelo por lo que es necesaria su evaluación

para determinar la fertilidad del mismo.

2.4.1 MECANISMOS DE ACCIÓN DE PGPRs

Los mecanismos de acción de los PGPRs pueden clasificarse en directos y

indirectos, y cada uno de ellos puede actuar de manera independiente y

diferente (Solano, 2000).

25

2.4.1.1 Mecanismos de acción directa

A este grupo pertenecen aquellos metabolitos producidos por la bacteria

capaces de estimular el crecimiento vegetal (Kloepper, 1993). Totalmente

independientes de la población microbiana edáfica y del soporte edáfico. Tal

es que caso de:

• Fijación de nitrógeno de forma asociativa,

• Producción de reguladores de crecimiento vegetal como auxinas,

giberelinas y citoquininas, entre otras.

• Inhibición de síntesis de etileno.

• Aumento en la permeabilidad de la raíz.

El tipo de mecanismo de acción que utilice cada especie de bacteria

promotora del crecimiento vegetal, es difícil de estimar ya que cada bacteria

en particular puede afectar el crecimiento de la planta de diferentes maneras

y con diferentes mecanismos de acción (Kloepper, 1994; Solano, 2000).

El mecanismo de acción directo de las PGPRs por excelencia es la

producción de reguladores de crecimiento vegetal (Brown, 1974; Solano,

2000; Tien et al., 1979).

Aunque muchos de los microorganismos del suelo pueden producir

sustancias reguladores del crecimiento vegetal, el sistema radicular está

asociado a distintas comunidades microbianas capaces de sintetizar

reguladores de crecimiento vegetal.

Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir estos reguladores,

ya sea hongos como Dipodascopsis ininucleata, productor de auxinas y

zeatina, Cercospora rosicola productor de ácido abscísico, mientras que

Giberella fujikuroi produce giberelinas y citoquininas en su estado imperfecto

como Fusarium moniliforme (Unyayar & Unyayar, 1996). Entre las bacterias

26

con reconocida actividad como productoras de reguladores de crecimiento se

encuentran los géneros Azospirillum y Azotobacter los cuales al penetrar la

raíz producen giberelinas, auxinas, citoquininas, ácido abscísico y fijan

nitrógeno (Vargas et al, 2001), lo que las convierte en excelentes

biofertilizantes. Para el género Pseudomonas también se ha reportado la

capacidad de producción de auxinas y giberelinas (Vargas et al., 2001).

Es así como bacterias promotoras de crecimiento vegetal, han mostrado

efectos benéficos por la producción de reguladores del crecimiento vegetal,

como las giberelinas y auxinas, tal es el caso de Azospirillum sp.,

Pseudomonas sp. y Azotobacter sp., entre otros géneros reconocidas como

bacterias promotoras del crecimiento vegetal (Cassan et al., 2001).

Desde 1934 cuando Kögl, Haagen-Smit y Erxleben, obtuvieron AIA purificado

de orina, identificada como auxina, empezaron los estudios alrededor de su

actividad y biosíntesis (Baca & Elmerich, 2000), y con ellos la aparición de

trabajos en los que se reportaba a bacterias y hongos (Baca & Elmerich,

2000; Cassan et al., 2001) como productores de auxinas, los cuales son

asociados a la rizósfera de las plantas, reconociendo que el 80% de las

PGPRs o bacterias asociadas a la rizósfera son capaces de producir Acido

Indol Acético (AIA) (Zakharova et al, 1999). Las investigaciones que se han

producido no solo involucran la biosíntesis bacteriana de este regulador, o su

actividad fisiológica en las plantas, si no que establecen la relación que las

bacterias productoras de reguladores de crecimiento vegetal puede generar

con la planta y entender la dinámica de funcionamiento rizobacteria-planta

(Zakharova et al., 1999).

La producción bacteriana de giberelinas es menos común que la producción

de auxinas (Solano, 2000). Las giberelinas al igual que el ácido indol acético

son metabolitos secundarios los cuales tienen potencial comercial y son

importantes en el campo agrícola como en el desarrollo de la biotecnología

vegetal (Birkermeyer et al., 2003; Hasan, 2002).

27

Se han identificado cerca de 130 clases de giberelinas, provenientes de

plantas, bacterias y hongos de las cuales las más comunes y biológicamente

activas son GA1, GA3 y GA4 (Cassan et al., 2001). En recientes artículos se

han reportado al rededor de 89 tipos de giberelinas producidas por

diazotróficos (microorganismos fijadores de nitrógeno). Gracias a distintos

experimentos se ha observado la producción de giberelinas por Azotobacter

sp., Pseudomonas sp., Rhizobium leguminosarium bv phaseoli, Azospirillum

brasilense, Azospirillum lipoferum, Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum

seropedicae, Bacillus pumilus y Bacillus licheniformes (Dobbelaere et al.,

2003).

Las bacterias del género Azospirillum y Azotobacter son rizobacterias gram

negativas, fijadoras de nitrógeno de vida libre, y que se han encontrado en

relación estrecha con las raíces de las plantas; además son capaces de

promover el crecimiento de las plantas a través del mejoramiento del

desarrollo de las raíces (Bahat-Samet et al., 2004). Se han detectado tres

tipos de sustancias promotoras de crecimiento producidas por bacterias del

género Azospirillum; auxinas, citoquininas y giberelinas. Se asume que los

reguladores de crecimiento vegetal producidos por bacterias causan cambios

detectados en la morfología de las raíces luego de ser inoculadas con

Azospirillum sp, que pueden generar un aumento en la absorción de

minerales (Bahat-Samet et al., 2004).

Es muy probable que esas auxinas y giberelinas producidas, no jueguen un

papel muy importante en la fisiología del organismo productor y sean

generadas como metabolitos secundarios. Sin embargo en varias

observaciones, entre estas de inoculaciones con Azotobacter chroococcum

en plantas de tomate, se ha sugerido que las GAs producidas por

microorganismos pueden inducir o promover el crecimiento de la planta

hospedera (Dobbelaere et al., 2003). Se ha observado también que GA3

28

tiene un efecto similar a inoculaciones con Azospirillum lipoferum al promover

el desarrollo de las raíces a las 48 horas de la inoculación en plántulas de

maíz especialmente incrementando la densidad de los pelos radicales en

áreas fisiológicamente activas para la absorción de nutrientes y agua

(Dobbelaere et al., 2003; Garcia de Salomone & Dobereiner, 1996). En un

estudio comparativo, aplicaciones de GA3 e inoculaciones con Azospirillum

sp., fue comparado su efecto en altura y peso fresco sobre plantas de maíz

sometidas a un tratamiento inhibidor de la síntesis de giberelinas. Se

observaron niveles parecidos en el incremento de la altura de las plantas

inoculadas con Azospirillum brasilense y Azospirillum lipoferum con relación

a las que se les adicionó la GA3, concluyendo que las GAs producidas por

Azospirillum sp. juegan un papel importante en el desarrollo de gramíneas

(Dobbelaere et al., 2003). Los miembros de este género ofrecen un

excelente modelo para establecer la producción de auxinas y su biosíntesis,

al igual que investigar las asociaciones planta–bacteria. Investigaciones

enfocadas a la biosíntesis de AIA en Azospirillum brasilense ponen de

manifiesto varias rutas de biosíntesis dependientes de triptófano, y

utilizándolo como modelo en el estudio de biosíntesis de AIA en bacterias

(Zakharova et al, 1999).

Por otro lado la aplicación de PGPRs en plantas cultivadas, es uno de los

más prometedores métodos para aumentar la producción agrícola (Strigul &

Kravchenko, 2005), aunque existen problemas para la introducción de estos

microorganismos al suelo ya que en varios casos éstos no sobreviven allí, o

no realizan la función esperada al incorporarlos. Es conocido que

organismos benéficos, introducidos a la rizosfera, son afectados por distintos

factores tanto bióticos como abióticos. Dentro de los factores abióticos se

encuentran la temperatura del suelo, el pH de este mismo, la disponibilidad

de oxígeno, la disponibilidad de nutrientes, el contenido de agua, el tipo de

29

suelo, la textura y estructura del suelo. Gracias a la gran abundancia de

microorganismos en la rizósfera inducidos por la liberación de compuestos

orgánicos por las plantas, se incluyen una serie de factores bióticos que

afectan la supervivencia de las PGPR en el suelo, dentro de éstas se incluye

predación por nemátodos y protozoos, actividad de bacteriófagos,

competencia microbiana por recursos e interacciones directas como

inhibición de la actividad microbiana por producción de antibióticos y

sinergismo o incremento de nutrientes disponibles (Strigul & Kravchenko

2005).

2.4.1.2 Mecanismos de acción indirecta

Los mecanismos indirectos son aquellos en donde la estimulación del

crecimiento aunque de manera indirecta, y la bacteria libera sus metabolitos

al medio edáfico afectando otros factores rizosféricos, los cuales se revierten

en una mejora o estimulación del crecimiento de la planta por ejemplo

(Kloepper, 1993; Solano, 2000):

• Producción de sustancias capaces de movilizar nutrientes de tipo

aminoácido, sideróforos o ácidos orgánicos que liberaran fósforo,

hierro y/o aluminio (Cattelan et al., 1999; Jones et al., 1994).

• Influyen en la producción de fitoalexinas, compuestos utilizados para

la defensa de la planta, respuesta inducida por lipopolisacáridos

producidos por bacterias en el rizoplano (Agrios, 2005; Cattelan et al.,

1999, Loon, 2007).

• Algunas bacterias pueden hidrolizar moléculas producidas por

patógenos como Pseudomonas cepacia y P. solanacearum, son

capaces de hidrolizar el ácido fusárico, liberar β 1,3–glucanasa

inhibiendo el desarrollo de la pared fúngica de hongos fitopatógenos

como Phytium ultimun y Rhizoctonia solani (Cattelan et al., 1999;

Loon, 2007; Schnider et a.l, 1994; Solano, 2000).

30

2.4.2 BIOSÍNTESIS DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL La habilidad que muestran los microorganismos para sintetizar reguladores

de crecimiento vegetal es muy conocida, las cuales se producen en

asociación con las plantas, estableciendo relaciones de tipo benéfico, o de

parasitismo en donde las bacterias u hongos sintetizan estos reguladores o

compuestos similares con estructuras químicas de acción similar, para

estimular los tejidos hospederos. A la lista de microorganismos productores

de reguladores se suman bacterias, actinomycetes, algas y hongos los

cuales pueden producir diferentes tipos de regulador y en diferentes

concentraciones (Baca & Elmerich, 2000; Tsavkelova et al., 2005).

2.4.2.1 Biosíntesis de auxinas en bacterias

Las auxinas son derivadas del triptófano (Trp), por múltiples rutas

metabólicas, pero solo puede ser sintetizado funcionalmente por rutas

dependientes de Trp.

2.4.2.1.1 Ruta Indol 3 acetamida (IAM)

La ruta IAM es la ruta para síntesis de auxinas mejor estudiada en bacterias,

consta de dos etapas. En la primera etapa, el triptófano es convertido a IAM

por la enzima triptófano 2–monooxigenasa (IaaM), mientras que en la

segunda etapa el IAM es convertido a AIA por una IAM hidrolasa (IaaH).

Esta ruta fue descrita inicialmente como una ruta de síntesis específica para

bacterias, ya que no habia evidencia de su existencia en plantas, hasta el

uso de técnicas de alta sensibilidad para la detección de IAM en tejidos de

Arabidopsis thaliana, en donde se encontró que también hace parte de las

rutas de síntesis utilizadas por las plantas (Piotrowski et al., 2001; Pollmann

31

et al., 2002).

2.4.2.1.2 Ruta indol 3-Piruvato (IPvA)

La ruta de biosíntesis de IAA en bacterias sigue la vía del indol 3–piruvato

(IPvA), siendo la más conocida en bacterias, como Bradyrhizobium,

Azospirillum, Rhizobium, Azotobacter, Enterobacter cloacae, y

Cyanobacteria. El primer paso en esta vía es la conversión del triptófano a

IPvA por la aminotransferasa (Pollmann et al., 2002; Taiz & Zeiger, 2006).

Posteriormente IPvA es decarboxilado a indol 3 acetaldehido (IAAId) por la

indol 3 piruvato decarboxilasa (IPDC). En el último paso IAAId es oxidada y

convertida en ácido 3–indol acético. Esta ruta ha sido descrita y

caracterizada en Azospirillum brasilense, en donde se ha descrito el gen que

codifica para la enzima IPDC (Zakharova et al, 1999) (Figura 2.8 y 2.11).

32

Figura 2.11 Biosíntesis de AIA en bacterias. Tomado de Piotrowski et al. 2001

2.4.2.2 Biosíntesis de giberelinas en bacterias

La biosíntesis de giberelinas en microorganismos es similar a la ruta

biosintética que realizan las plantas superiores, aunque no juegan un papel

vital en la fisiología de estos microorganismos, las giberelinas son producidas

como metabolitos secundarios.

La ruta biosintética de las giberelinas en PGPRs aún no ha sido reportada,

pero gracias a que las giberelinas son compuestos isoterpenoides, tanto los

producidos por las plantas como las producidas por las bacterias, se podría

asumir que la vía de biosíntesis en este tipo de bacterias, es la que se ha

reportado en animales, plantas, hongos, archeas y algunas enterobacterias

(Rohmer, 2003), es decir por la ruta del ácido mevalónico (Figura 2.10 y 2.12)

33

donde el acetato y el mevalonato son considerados como precursores

importantes de la síntesis de los isoterpenoides (Rohmer, 2003).

Figura 2.12 Ruta de síntesis de giberelinas siguiendo del Acido Mevalónico. Tomado de Davies, 1988

AcetilCoA

Acido Mevalónico

Acido Mevalónico Pirofosfato

Isopentenil Pirofosfato

Dimetilalil Pirofosfato

Geranio Pirofosfato

Farnesil Pirofosfato

Copil Pirofosfato

Ent- Kaurenol

Ent- Kaurenal

Ent- Ácido Kaurenoico

GA12 aldehído

GIBERELINAS GA3

Geranilgeranil Pirofosfato

7–Acido Kaurenoico Hidroxilado

34

2.5 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL

Las hormonas vegetales se encuentran en las plantas en bajas

concentraciones si se comparan con otros metabolitos secundarios como

alcaloides y terpenos, entre otros, por lo que la identificación química de las

mismas puede verse limitada por las técnicas usadas para su extracción y

purificación, ya sea por la baja concentración en que se presentan o por la

sensibilidad de las técnicas espectroscópicas requeridas para su

identificación química. La cuantificación de giberelinas producidas por

PGPRs se ha realizado bajo técnicas cromatográfícas como cromatografía

de capa fina (TLC), y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC),

mientras que la identificación de las mismas se ha logrado mediante la

espectrofotometría de masas (Birkemeyer et al., 2003; Chiwocha et al., 2003;

Don et al., 2005).

Desde 1980 (Taiz & Zeiger, 2002), con la aplicación de la cromatografía

líquida de alta resolución combinada con los bioensayos se han realizado

diversas investigaciones a cerca de la naturaleza y estructuras químicas de

las giberelinas. Desde entonces, con la cromatografía puede lograrse la

separación de estas sustancias para posteriormente ser pasada por un

espectrofotómetro, de donde se obtiene su configuración estructural,

obteniendo casi una huella digital del mismo.

Los reguladores de crecimiento vegetal pueden ser producidos

industrialmente usando procesos de fermentación, y se han obtenido

diferentes métodos, para su obtención y purificación de dichos medios, es así

como la cromatografía líquida de alta presión (HPLC), es un procedimiento

35

de rutina, el cual se emplea para la purificación y separación de giberelinas.

Mientras que para su detección se han desarrollado diferentes métodos,

como la cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de gases (GC),

cromatografía de gases y espectrofotometría de masas (GCMS) (Castillos,

1997). De esta forma la producción in vitro de giberelinas por Azospirillum

sp., y el efecto de las mismas han sido estudiados por espectrofotometría de

masas (MS), por medio de esta técnica se ha logrado establecer al

microorganismo como productor de auxinas y giberelinas exógenos de la

clase, GA1 y GA3 (Cassan, 2001).

Con el avance de la tecnología se han desarrollado técnicas

espectroscópicas más sensibles para la determinación química, que pueden

ser utilizadas en estudios de este tipo, al igual que el avance en las técnicas

cromatografícas que permiten la identificación, purificación y cuantificación

de las sustancias de interés (Davies, 1988).

Conocer el fundamento de dichas técnicas es de suma importancia para

entender y conocer las limitaciones de las mismas y de esta forma lograr

establecer la más sensible y la más adecuada al estudio.

Los métodos más usados hoy en día para el estudio de reguladores de

crecimiento vegetal son HPLC y GC. Debido a la aparición de columnas de

alta resolución comúnmente se utiliza GC, mientras que HPLC sólo es

utilizada con detectores altamente selectivos o con muestras altamente

purificadas (Arteca, 1996).

36

2.5.1 MÉTODOS DE DETECCIÓN COLORIMÉTRICA DE REGULADORES

DEL CRECIMIENTO VEGETAL

Los métodos más usados para la detección de reguladores de crecimiento

vegetal, especialmente giberelinas incluye el uso de costosos equipos, lo que

genera un sesgo en la investigación al estar ligada a altos costos. Es por

esto que se buscan técnicas que involucren procedimientos más sencillos y

al alcance de cualquier laboratorio, como es el caso de la detección

colorimétrica que involucra un reactivo específico y un espectroscopio.

2.5.1.1 Detección colorimétrica de auxinas

2.5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky

El reactivo de Salkowsky, ha sido ampliamente utilizado para establecer la

presencia de grupos indol, en solución a partir de tejidos vegetales y

extractos de cultivos microbianos, entre otros. Es un método netamente

colorimétrico basado en la oxidación que produce el ácido perclórico a las

moléculas de indol, generando una coloración que va de la gama de los

rosados a fucsia, evidenciando la presencia de moléculas con grupo indol

presumibles como compuestos auxínicos (Glickmann & Desaux, 1995,

Salkowsky, 1889).

2.5.1.2 Detección colorimétrica de giberelinas

2.5.1.2.1 Reactivo de Folling-Wu (ácido fosfomolíbdico)

La reacción colorimétrica a base del reactivo Folling-Wu (ácido

fosfomolíbdico), es un método utilizado en la detección de giberelinas, como

un método sencillo y práctico de detección, basado en la reacción de

reducción que presenta el ácido molíbdico frente a soluciones de ácido

giberélico a diferentes pH. La reacción de reducción ocasiona un cambio de

37

color del reactivo a azul mostrando la reducción ocasionada por la presencia

de giberelina en la solución (Graham & Henderson, 1960).

2.5.1.2.2 Reactivo 2,4-ácido dinitrofenilhidrazina

El acido giberélico sufre hidrólisis a 100°C lo que produce compuestos

cetónicos y ácido giberico, éstos compuestos cetónicos son los detectados

por el reactivo 2,4–dinitrofenilhidrazina, lo que permite la detección, y en

menor escala la cuantificación, de GA3 a partir de la reacción que se

obtiene entre el reactivo 2,4–dinitrofenilhidrazina y los compuestos

cetónicos derivados de la hidrólisis del ácido giberélico (Graham &

Thomas, 1960).

2.5.2 DETECCIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE REGULADORES DE

CRECIMIENTO VEGETAL

2.5.2.1 Cromatografía de capa fina (TLC)

La cromatografía de capa fina se ha utilizado en la separación y el análisis de

muchos compuestos y es de acuerdo a éstos que se utilizan solventes

específicos, siendo particularmente útil cuando se trata de sustancias no

volátiles.

En esta técnica las separaciones se producen con base en distintos

procesos, adsorción, reparto, intercambio iónico y diferencia en el tamaño de

las moléculas, lo que le confiere ventaja frente a otras técnicas ya que es

más rápida y sensible debido a que la muestra se difunde menos, por lo cual

pueden separarse cantidades menores y por que el revelado puede llevarse

a cabo con reactivos muy sensibles como ácidos sulfúricos y clorosulfónico

(Jork, 1991).

38

La técnica permite por tanto separaciones eficientes de mezclas complejas,

identificación preliminar de sus constituyentes como detección de

compuestos indeseables.

Los materiales y equipos que utiliza son similares a los utilizados en

cromatografía en papel, pero utiliza sorbentes (fase estacionaria) en donde

se agrupan adsorbentes, intercambiadores de iones y geles de filtración,

entre ellos se encuentra el gel de sílice o ácido sílico, siendo este el más

utilizado, el hidróxido de aluminio comúnmente llamado alúmina, Kieselgur o

Tierra de Diatomáceas se utiliza en separaciones por reparto de

oligosacáridos, celulosa fibrosa o celulosa microcristalina y poliamida entre

otros (Skoog & Leary, 1993).

2.5.2.2 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Es utilizada por su alta eficiencia, resolución y velocidad de separación, es

utilizada para separar reguladores vegetales de crecimiento de otros

compuestos presentes en el extracto, al igual que por su capacidad para

separar compuestos o impurezas, en donde puede observarse la alta

resolución de la técnica. Puede ser utilizada en bioensayos, aunque hay que

tener en cuenta que aunque puede haber separación no hay la purificación

necesaria del compuesto para que pueda ser utilizado directamente en

espectroscopía (Davies, 1988).

2.5.2.3 Cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas

(GCMS)

Este método es considerado como el mejor para el análisis de sustancias

asociadas al crecimiento vegetal, debido a su eficacia y a la simplicidad de la

técnica. A diferencia de otras técnicas, como HPLC, donde se usan

detectores los cuales son destruidos y no permiten recobrar los niveles de

radioactividad, mientras que este método mide diluciones isotópicas que no

39

presentan inconvenientes de este tipo por lo que es comúnmente usada en la

identificación y cuantificación en este tipo de sustancias (Arteca, 1996).

Este método fue el primero en ser usado para el análisis de reguladores de

crecimiento vegetal por McMillan y sus colaboradores quienes trabajaron en

la identificación de giberelinas. Aunque se conocen varias giberelinas, y son

de estructura química similar, se diferencian por la sustitución de átomos los

cuales pueden ser reflejados en el espectro de masas lo que permite una

identificación exacta no solo del grupo (giberelinas) sino de la molécula en si,

con lo cual se determina si es biológicamente activa o no, al igual que se

observan diferencias en los derivados que producen (Davies, 1988).

2.5.2.4 Espectrofluorométria

Bajo ciertas condiciones, los átomos absorben fotones de una longitud de

onda determinada, emiten algunas porciones de energía como fotones de

longitud de onda más larga (energía más baja), produciendo fenómenos

conocidos como fluorescencia y fosforescencia (Ramírez et al, 1996).

Estos fenómenos se distinguen entre sí por la velocidad que caracteriza los

actos de absorción y de reemisión, los cuales suceden en forma simultánea

para el fenómeno de fluorescencia, el cual solo se produce después de la

absorción de radiación ultravioleta (Ramírez et al, 1996).

Los métodos analíticos utilizan el fenómeno de absorción, en donde la

muestra absorbe parte de los fotones de energía lumínica incidente y se

detectan los fotones no absorbidos. El equipo utilizado en esta técnica

cuenta con una fuente de radiación, una lámpara ultravioleta, que incidirá

sobre la muestra (Skoog & Leary, 1993).

La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presenta los compuestos

que contienen grupos funcionales aromáticos, lo que permite la identificación

de compuestos de este tipo.

40

La eficacia cuantitativa de la técnica disminuye con el aumento de la

temperatura, y el fenómeno de fluorescencia se ve afectado por tetrabromuro

de carbono y/o yoduro de etilo al igual que la concentración de oxígeno que

ocasiona atenuación (quenching) (Skoog & Leary, 1993).

La espectrofluorometría ha tomado un papel importante en el análisis y

particularmente en la determinación de contaminantes, compuestos a niveles

traza y giberelinas (Don et al., 2005, Jiang et al., 1997).

41

3. JUSTIFICACIÓN

Las plantas para su desarrollo, no solo realizan procesos fotosintéticos o

toman sustancias minerales del suelo, también llevan a cabo en su interior

una serie de procesos fisiológicos que ayudan a dicho desarrollo. De la

misma forma, las plantas también se ven afectadas y de cierta manera

reguladas por algunos de los procesos que ocurren en el suelo, la mayoría

de los cuales son llevados a cabo por microorganismos, entre los que se

encuentran fijadores de nitrógeno, solubilizadores de fósforo, productores de

hormonas y otros, los cuales son conocidos como PGPRs (rizobacterias

promotoras de crecimiento vegetal).

Para que las plantas puedan llegar a desarrollarse satisfactoriamente, es

necesaria la coordinación de procesos fisiológicos como la absorción de

nutrientes, procesos fotosintéticos y procesos externos del suelo y del

ambiente, de los cuales depende su correcto funcionamiento.

Dentro de los procesos fisiológicos se encuentra incluida la síntesis de

distintas sustancias como reguladores de crecimiento (auxinas, giberelinas,

citocinas, etc.) los cuales son compuestos que actúan como reguladores

endógenos del crecimiento y desarrollo en las plantas superiores.

Las auxinas son conocidas como el primer regulador de crecimiento vegetal

estudiado en plantas. Se les identifican como compuestos químico de alto

potencial en la agricultura. Su acción no solo se limita al fototropismo, es

conocida por su participación en elongación celular, dominancia apical,

aparición de raíces adventicias, diferenciación vascular, formación de frutos y

flores.

42

Las giberelinas, cumplen varios procesos importantes dentro de las plantas

entre los que se encuentran: inducción de síntesis enzimática, promoción de

la germinación de semillas, rompimiento de estados de dormancia o latencia

de estructuras vegetativas o semillas, activación de la elongación de tallos y

raíces, desarrollo de frutos.

Las auxinas y giberelinas son, por tanto, reguladores de crecimiento vegetal,

nativas en las plantas, que afectan, regulan o modulan un amplio abanico de

respuestas de crecimiento y que en su ausencia generaría un gran retraso o

hasta inhibición del crecimiento vegetal.

En la naturaleza, la producción de auxinas y giberelinas no solo se lleva a

cabo por las plantas en su desarrollo normal, si no también por

microorganismos, que generan un impulso en el crecimiento de las plantas y

así un mejor desarrollo de estas.

El uso de las bacterias promotoras de crecimiento vegetal, se han convertido

en una excelente propuesta para optimizar la producción de cultivos y su

calidad. Pues segregan a la rizósfera diversas sustancias involucradas

directamente en la respuesta fisiológica de la planta. En la literatura se

encuentran reportes de la producción de diversos reguladores de crecimiento

vegetal como ácido indol acético y giberelinas por estas bacterias, lo que las

convierte en una fuente reguladores de crecimiento y un aporte extra de las

mismas para las plantas optimizando el rendimiento y la producción en un

cultivo dado.

Debido a la importancia del papel desarrollado por las auxinas y giberelinas

en las plantas es importante lograr estandarizar un método sencillo de

detección, puesto que si bien es cierto que la detección puede lograrse con

métodos analíticos químicos, es indispensable establecer una manera

43

eficiente y segura que permita obtener la máxima efectividad de cada método

en la detección de auxinas y giberelinas producidas, lo que se logrará

estableciendo el tiempo exacto de producción de los reguladores de

crecimiento vegetal por parte de los microorganismos, logrando de esta

forma una curva de producto que puede ser aplicable a varios tipos de

microorganismos. Gracias a esto, se podría llegar a evaluar la viabilidad y

efectividad de distintos productos, desarrollar investigaciones y generar un

avance biotecnológico, todo esto con el fin de aprovechar los beneficios que

pueden llegar a generar el uso de auxinas y giberelinas para el desarrollo de

una mejor agricultura.

44

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Implementar y estandarizar métodos sencillos de detección de auxinas y

giberelinas a partir de cultivos microbianos.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Estandarizar un método de detección de auxinas y giberelinas por

cromatografía de capa fina.

• Estandarizar un método de detección colorimétrica de auxinas y

giberelinas.

• Detectar la producción de auxinas y giberelinas en cepas de un

bioinoculante acelerador del proceso de compostaje.

• Establecer parámetros para estudiar la acción de reguladores de

crecimiento vegetal AIA, IBA GA3 en bioensayos.

45

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE AUXINAS (ÁCIDO INDOL ACÉTICO, AIA)

5.1.1 DETECCIÓN COLORIMÉTRICA

5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky

Para establecer la intensidad y sensibilidad de la reacción del reactivo de

Salkowsky, reportado más comúnmente en literatura, se realizó una curva de

calibración con el reactivo de Salkowsky preparado a base de ácido

perclórico (HClO4 3.48 M y FeCl3 10 mM ).

Se preparó un patrón de diferentes concentraciones (0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30

ug/ml) de ácido indol acético (AIA) comercial (Sigma) y se sometió a reacción

en proporción de 2 mL de reactivo de Salkowsky por 1 mL del patrón de AIA,

luego se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se leyó la

absorbancia con un espectrofotómetro (Genesis 20) a 530nm, las mediciones

se realizaron por triplicado. Obteniendose la curva de calibración.

Una vez establecida la sensibilidad del reactivo, la intensidad de la reacción y

la gama de colores característicos de la reacción, se realizaron diferentes

pruebas con reactivo Salkowsky preparado a base de ácido sulfúrico (Bric et

al, 1990; Glickmann & Dessaux, 1994), probando distintas concentraciones

tanto de FeCl3 como de H2SO4 y diferentes volúmenes de reacción (Tabla

5.1), con las mismas concentraciones del patrón de AIA (0, 5, 10, 15, 20, 25

y 30 ug/ml), incubando cada reacción por 30 minutos a temperatura

ambiente, para determinar la sensibilidad, la intensidad de reacción y la

46

escala de colores más cercana a los obtenidos con el reactivo a base de

ácido perclórico..

Se trabajó el reactivo de Salkowsky (Glickmann & Dessaux, 1994) con ácido

sulfúrico porque no fue posible comprar ácido perclórico, debido a

restricciones para su importación.

Tabla 5.1 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de mezclas de ácido perclórico y cloruro

férrico y ácido sulfúrico y cloruro férrico.

Concentración Volumen de reacciónReactivo FeCl3 H2SO4 HClO4 AIA Salkowsky Referencias Perclórico 10 mM - 3,5 M 1 mL 2mL Bric et al, 1990

R1 40 mM 7,9 M - 1 mL 1 mL Glickmann & Dessaux, 1994

R2 16 mM 10,8 M - 1 mL 1 mL Glickmann & Dessaux, 1994

R3 9,2 mM 6,9 M - 1 mL 1 mL Glickmann & Dessaux, 1994 Dentro de los reactivos preliminarmente evaluados se determinó los de mejor

sensibilidad de reacción y color, comparados con la reacción sometida con

ácido perclórico y a éstos se les realizaron algunas modificaciones en cuanto

a proporción de reacción (AIA: Reactivo) y concentración de sus compuestos

(Tabla 5.2) buscando obtener la reacción más cercana a la presentada con el

reactivo de Salkowsky a base de acido perclórico.

Tabla 5.2 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de ácido sulfúrico con diferentes

modificaciones en cuanto a concentraciones de H2SO4 y FeCl3 y diferentes volúmenes de reacción.

FeCl3 H2SO4 AIA SalkowskyR1m 40 mM 7,9 M 1 mL 2mLR1m1 40 mM 10,8 M 1 mL 1 mLR1m2 40 mM 10,8 M 1 mL 2mLR2m 16 mM 10,8 M 1 mL 2mL

ReactivoConcentración Volumen de reacción

47

5.1.1.2 Evaluación del espectro de absorbancia (400-700nm) para las

reacciones con diferentes formulaciones del reactivo de Salkowsky.

Para establecer la longitud de onda a la cual se debe leer cada reactivo, se

realizó un espectro de absorbancia para establecer el valor máximo de

absorbancia de cada reacción con las diferentes formulaciones del reactivo

de Salkowsky.

Los espectros de absorción se realizaron en un espectrofotómetro Shimadzu,

en longitud de onda de 400 – 700 nm, evaluando cada reactivo con 10 y 30

ug/ml de AIA (Sigma), por duplicado.

5.1.2 DETECCIÓN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL

POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC)

La detección de reguladores de crecimiento por TLC, fue llevada a cabo en

placas de silica gel con indicador de fluorescencia (Merck), probando 15

fases móviles (Tabla 5.3), buscando buena separación entre las bandas de

corrida y la movilidad de todos los reguladores.

Para la estandarización se utilizaron patrones de reguladores (AIA, IBA, GA3)

comerciales (Sigma–Aldrich), preparando soluciones stock de diferente

concentración para evaluar la sensibilidad y la capacidad de detección de la

técnica. También se realizaron ensayos para determinar, el revelador, la

distancia entre puntos de siembra y el volumen de siembra. la forma de

revelar con calor en horno a 100°C durante 10 minutos.

Las soluciones stock de los reguladores vegetales (AIA, IBA, GA3) se

disolvieron en agua, con una concentración final de 10 mg/ml, a partir de ella

se realizaron diluciones para alcanzar concentraciones de 10, 5, 1, 0.5, 0.1,

0.05 y 0.01ug/ml para la siembra en las placas de TLC, y de este modo

establecer la mínima concentración detectada.

48

Tabla 5.3. Descripción de fases móviles utilizadas en la estandarización de TLC para detección de

reguladores de crecimiento vegetal.

Fase Móvil Solvente Proporciones Referencias

S1 CHCl3 : CH3COOC2H5 :CH3COOH 90:5:10 Zeevart, 1965

S2 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 50:30:20 Metzger & Zeevart, 1980

S3 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 60:40:5 Torres et al, 2000

S4 CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH 50:40:10 Tien et al, 1979

S5 CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH 30:55:10 Barazani & Friedman, 1999

S6 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 50:30:5 Modificado de Torres et al, 2000

S7 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 50:30:10 Modificado de Torres et al, 2000

S8 CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH 50:30:10 Ahmad & Ahmad, 2004

S9 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 15:5:1 Ross & Bradbeer, 1968

S10 CHCl3 : CH3COOH 95:5 Sweet & Lewis, 1971

S11 (CH3)2CHOH : NH4OH 25% : H2O 8:1:1 Sweet & Lewis, 1971

S12 (CH3)2CHOH : NH4OH 25% : H2O 10:1:1 Strzelczyk et al, 1983

S13 (CH3)2CHCH2OH : CH3COOH : H2O 12:3:5 Tien et al, 1979

S14 ETER PETROLEO:CH3COOC2H5 60:40 Contreras et al, 2001

S15 CH2Cl2:CH3COOC2H5 : CH3COOH 90:10:1 Contreras et al, 2001

S16 ETER PETROLEO:CH3COOC2H5 30:70 Contreras et al, 2001

El revelador utilizado fue H2SO4 60% y FeCl3 28mM, con una composición

similar al reactivo de Salkowsky, garantizando la detección de auxinas (AIA),

y citado en literatura como revelador para giberelinas (Merck, 1980).

La aplicación del revelador para la estandarización se realizó por medio de

inmersión (Figura 5.1) y no por aspersión (Figura 5.2), por la facilidad de

manejo de las placas de tamaño (3.5cm x 10cm) y para garantizar el

cubrimiento total del revelador sobre la placa.

49

Figura 5.1. Revelado por inmersión

Figura 5.2. Revelado por aspersión

El cromatograma se realizó en placas de silica gel de 3.5 x 10cm, las cuales

fueron marcadas y limpiadas en el solvente correspondiente antes de ser

utilizadas, marcando cada punto de siembra a 0.5 cm del borde de la placa

(Figura 5.3).

Figura 5.3. Cámaras de TLC y placas de silica gel

El volumen de muestra para siembra fue

de 1ul, se colocó en cada placa una

mezcla (mix) de reguladores preparado

con proporciones iguales de AIA, IBA y

GA3, y con muestra de cada regulador

por separado.

MIX GA3 AIA IBA

50

5.2 ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE GIBERELINAS

5.2.1 DETECCIÓN COLORIMÉTRICA

5.2.1.1 Reactivo Folling-Wu – ácido fosfomolíbdico

La determinación de ácido giberélico con el reactivo Folling-Wu - ácido

fosfomolíbdico, se realizó a partir de soluciones stock de giberelinas a

diferentes concentraciones, buscando establecer una curva de calibración

para la detección de GA3 en base al reactivo.

Se prepararon 200 ml del reactivo Folling-Wu - ácido fosfomolíbdico, a partir

de ácido molíbdico al 85%, una solución de tungstanato de sodio al 10%,

hidróxido de sodio al 10% y ácido fosfórico. El reactivo fue preparado en dos

fases, en la primera fase se adicionaron 7 g/l de ácido molíbdico, 1g/l de

tungstanato de sodio, posteriormente se adicionaron 40 ml de hidróxido de

sodio al 10% y se adicionaron 40 ml de agua destilada. La solución fue

llevada a ebullición durante 40 minutos para remover los rastros de amonio

presentes en el ácido molíbdico. En la segunda fase se dejó enfriar la

solución y se añadieron 70 ml de agua destilada y 25 ml de ácido fosfórico al

85%. Finalmente la solución fue aforada con agua destilada a 200 ml

(Graham & Henderson, 1960).

Las soluciones concentradas de giberelina fueron preparadas a partir de

GA3 comercial (Sigma-Aldrich), se obtuvieron soluciones de 100µg/l,

500µg/l y 1000µg/l.

Se realizaron ensayos para determinar la sensibilidad del reactivo con el

ácido giberélico, y especificidad del reactivo con una mezcla de GA3 con

51

AIA (Sigma-Aldrich) (1:1), y solo AIA comercial a una concentración de

100µg/l.

Una vez preparadas las soluciones de reguladores de crecimiento se

realizó la evaluación del reactivo, a una proporción de 1 ml de muestra y 3

ml de reactivo de ácido fosfomolíbdico, el tiempo de reacción fue de 60

minutos, a baño maría en ebullición. El tiempo cero fue estimado luego de

dos minutos de sumergidos los tubos de ensayo baño de agua a

ebullición, pasados los 60 minutos, los tubos fueron retirados del baño y

la temperatura fue bajada con ayuda de baño de hielo. Una vez a

temperatura ambiente, la intensidad del color fue observada y la densidad

óptica fue medida a 780 nm en un espectrofotómetro (Genesis) (Graham

& Henderson, 1960).

5.2.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina

La determinación de ácido giberélico se realizó a partir de patrones

conocidos de giberelina comercial (Sigma-Aldrich), preparando soluciones

de 1 mg/ml, 500 ug/ml y 100 ug/ml. Para comprobar la efectividad del

reactivo se probó frente a concentraciones de ácido indol acético,

preparando soluciones de 1 mg/ml, 500 ug/ml y 100 ug/ml a partir de acido

indol acético comercial (Sigma).

El reactivo se preparó a partir de hidróxido de potasio al 10%, 2-4

dinitrofenilhidrazina preparada previamente con HCl, 2-4

dintrofenilhidrazina y alcohol (Graham & Thomas, 1960).

Una vez preparado el reactivo y las soluciones stock de GA3 y AIA, se

colocó 1ml de reactivo por 1ml de muestra, la cual se llevó a ebullición

durante 5 minutos. El tiempo cero fue tomado 40 segundos después de la

inmersión del último tratamiento. Al final de este periodo, se llevaron los

52

tubos a un baño de hielo durante 5 minutos, posteriormente se añadieron

2 gotas de KOH al 10% en alcohol etílico al 80%, se homogenizó y se dejó

reaccionar durante 5 minutos. El desarrollo de color rojo vino mostró una

reacción positiva, y se midió la intensidad del color a 430 nm en un

espectrofotómetro (Genesis 20) (Graham & Thomas, 1960).

5.2.2 DETECCIÓN FLUOROMÉTRICA

La detección fluorométrica fue realizada a partir de una solución stock de

GA3 (Sigma–Aldrich) 100ug/ml. Se tomaron 0.2ml de esta solución y se

adicionaron 0.2ml de mezcla ácido sulfúrico:etanol (50:50) (Reyes et al.,

1991), posteriormente se llevó a incubación a 48°C durante 30 minutos. La

lectura se realizó a 464 nm en emisión y 406nm en excitación.

Siguiendo el procedimiento descrito por Jiang et al. (1997) se tomó 1ml de

solución stock de GA3 y se le adicionó 9ml de ácido perclórico 7M,

posteriormente se llevó a baño de agua a ebullición durante 6 minutos y se

realizó la lectura a 457nm en emisión y 416 nm en excitación.

Para realizar una curva de detección se prepararon soluciones de GA3 a

partir de la solución stock de diferente concentración 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5,

0.8, 1, 2, 3, 5, 8, 10, 15 y 20ug/ml, para determinara la capacidad de

deteccion del reactivo y la eficacia en la cuantificación.

53

5.3 BIOENSAYO PARA LA DETECCIÓN DE AUXINAS Y GIBERELINAS

Se evaluó la capacidad de productos comerciales de reconocida acción

como reguladores de crecimiento como Gibgro (GA3) (Arysta LifeScience),

Hormonagro (ácido naftalen acético) (Colinagro S.A), reguladores

comerciales grado reactivo GA3, AIA, IBA (Sigma-Aldrich) y agua como

control sobre plántulas de lechuga, Lactuca sativa L., para posteriormente

evaluar la producción de las cepas de referencia y las cepas del

bioinoculante como productoras de auxinas y giberelinas. Fue realizado en

cajas sello pack de tapa alta transparente, en la cual se colocó un acordeón

de papel absorbente (papel para secado de manos, Familia) para originar

una cámara húmeda apta para germinación y el desarrollo de las plántulas.

Inicialmente se realizaron ensayos de estandarización del volumen de agua

para las cajas el cual fue determinado como 2ml por surco (Figura 5.4).

Figura 5.4. Cámara húmeda bioensayo

Las cámaras húmedas fueron montadas con 20 semillas por caja, colocando

5 por cada surco, y acordeones de 4 surcos, con 4 repeticiones por

tratamiento, para un total de 80 semillas por tratamiento (ISTA, 2006). La

inoculación con el caldo del ultimo dia del cultivo microbiano, los patrones

comerciales de reguladores y los productos comerciales de las semillas fue

realizada previa imbibición en la solución de cada tratamiento, GA3

54

(100ug/mL), AIA (100ug/mL), IBA (100ug/mL), Gibgro GA3 10% (200ppm),

Hormonagro (ANA 17,2g/L, 500ppm) y agua, durante 10 minutos y

posteriormente colocadas en cámara húmeda. La evaluación de las cepas de

referencia y de las cepas del bioinoculante fue realizada imbibiendo las

semillas durante 10 minutos en los caldos de cultivo (sobrenadante) de la

fermentación discontinua de cada cepa.

La lectura del ensayo fue realizada cada 12 horas determiando el estadio de

desarrollo de la planta (Celis et al, 2006) comprendidos en emergencia de la

radícula (Estadío1), emergencia del hipocolito (Estadío 2), emergencia de los

cotiledones (Estadío 3) y emergencia de las hojas primarias (Estadío 4)

(Figura 5.5)

FIGURA 5.5. Estadios de desarrollo en germinación de semillas de lechuga.

Tomado de Celis et al., 2006

5.3.1 ÍNDICES DE GERMINACIÓN

Con los datos de los estadios de desarrollo de las plántulas obtenidos a partir

del montaje en las cámaras húmedas, se establecieron índices o parámetros

de evaluación de crecimiento (Tabla 5.4), los cuales se evaluaron para el

55

resto de estadios para establecer diferencias significativas entre cada

tratamiento, en el cambio de estadio a estadio y su posible efecto sobre las

plántulas.

Tabla 5.4 Índices de germinación. Tomado de Czabator, 1964;Thomson & Elkassaby., 1993

5.4 MICROORGANISMOS

Los microorganismos empleados en el estudio fueron Azospirillum brasilense

cepa ATCC 29145 (control de producción de GAs) y Azotobacter vinelandii

cepa ATCC 12518 (control de producción de AIA). El primero obtenido del

laboratorio Asociación Suelo Planta Microorganismo, de la Pontificia

Universidad Javeriana (PUJ), cepa obtenida del proyecto ”La silvicultura

como alternativa viable para el aprovechamiento sostenible y la conservación

de las plantas medicinales de la flora nativa de Colombia” financiado por el

convenio Andrés Bello y la PUJ; mientras la cepa de Azotobacter vinelandii

se obtuvo del Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la PUJ.

También se trabajó con 14 cepas las cuales no fueron identificadas, que

hacen parte de un bioinoculante utilizado como acelerador de compostaje, ,

desarrollado en el Laboratorio de Biotecnología del Departamento de

Microbiología de la PUJ, del trabajo: Aislamiento de bacterias termófilas y

Indice Definición

GC Capacidad de germinación máxima (% Semillas germinadas al final de la prueba)

GRI# de semillas germinadas en un periodo de tiempo determinado (# Sem germinadas /Hrs lectura actual-Hrs lectura anterior)

R50 Tiempo (#Hrs) en que germinó el 50% de lo sembradoR50́ Tiempo(#Hrs) en que germinó el 50% de lo germinado

PV Valor máximo cociente del día de semillas germinadas en el total de días de siembra (#Sem germinada/Hrs lectura)

MDG # Semillas total germinadas/Hrs total de montajeVG Valor de germinación MDG*PV

56

hongos mesófilos a partir de la fracción orgánica de residuos sólidos urbanos

(Rodríguez & Ruiz, 2006).

5.4.1 MEDIOS DE CULTIVO

Se evaluó la capacidad del caldo tripticasa soya (TSB), medio B (Strzelczyk

et al, 1984) y medio B suplementado con triptona (BT) (Anexo 1) para inducir

la producción de auxinas y giberelinas, y como soporte para la producción de

biomasa en la fermentación discontinua realizada para cada una de las

cepas.

5.4.2 RECUPERACIÓN Y RECONSTITUCIÓN DE CEPAS

Las cepas fueron recuperadas a partir de viales de conservación en glicerol,

haciendo repiques en Agar Tripticasa Soya (TSA) (Anexo1), por triplicado; las

cajas fueron incubadas a 28 ºC por 2 días para luego realizar una prueba de

pureza con coloración de Gram, finalmente fueron repicadas en TSA por

duplicado e incubadas a 28ºC.

5.5 PRODUCCIÓN DEL INÓCULO PARA LA FERMENTACIÓN

5.5.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO Azotobacter vinelandii y Azospirillum

brasilense

A partir de cultivos axénicos de A. vinelandii y A brasilense en TSA se

preparó una suspensión de células en solución salina al 0,85% estéril,

leyendo absorbancia en un espectrofotómetro Genesis 20 a 540 nm,

buscando un absorbancia de 0,2 nm equivalente a una concentración de 108

células/ml, una vez se alcanzada dicha concentración se realizó una dilución

1/10 obteniendo una concentración de 107 cel/ml en el inóculo.

57

5.5.2 PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LAS CEPAS DEL

BIOINOCULANTE (14 Cepas)

El inóculo de las 11 cepas bacterianas fue obtenido a partir de cultivos

axénicos de cada cepa realizando suspensiones celulares de concentración

108 cel/ml, siguiendo el procedimiento descrito en el numeral 5.5.1. El inóculo

de las 3 cepas de actinomycetes (cepas 6, 10 y 8) se realizó a partir de

cultivos axénicos realizando una suspensión celular de concentración

107células/ml a partir de conteo en cámara de Neubauer.

5.5.3 FERMENTACIÓN DISCONTINUA

5.5.3.1 Fermentación discontinua de cepas de referencia y estandarización

de medio de cultivo

La fermentación discontinua para las cepas de referencia A. vinelandii y A.

brasilense, se realizó a partir de inóculos axénicos de concentración 107

cel/ml, en Caldo Tripticasa Soya (TSB), Caldo B, Caldo BT (Anexo 1)

evaluando los tres medios de cultivo por triplicado.

La fermentación fue realizada en erlenmeyer de 250 ml con un volumen

efectivo de trabajo de 90 ml, al cual se le adicionó el inóculo, correspondiente

al 10% del volumen efectivo de trabajo, obteniendo una concentración final

de 106 cel/ml. Posteriormente, las fiolas fueron llevadas a agitación continua

en un agitador orbital a 100 rpm, a temperatura ambiente durante 7 días.

Cada 24 horas, se tomaron 4 ml de caldo de cultivo, durante los 7 días de la

fermentación. La muestra de cultivo fue centrifugada a 5000 rpm por 10

minutos, se tomó el sobrenadante y almacenó en tubos eppendorf, para

posterior congelación hasta la evaluación de los reguladores de crecimiento.

58

5.5.3.2 Fermentación discontinua de las cepas del bioinoculante

La fermentación discontinua para las cepas del bioinoculante se realizó

siguiendo el mismo procedimiento descrito en el numeral 5.5.3.1, pero

solamente se llevó a cabo en Caldo B y Caldo BT.

5.6 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL A PARTIR DE CULTIVOS MICROBIANOS

5.6.1 DETECCIÓN DE AUXINAS MICROBIANAS

5.6.1.1 Detección colorimétrica (Reactivo de Salkowsky)

Se determino que el reactivo de Salkowsky a base de ácido sulfúrico, fue

más sensible y efectivo, se realizó la determinación de la producción de

ácido indol acético a partir de los muestreos obtenidos de la fermentación

para todas las cepas (A. vinelandii, A. brasilense y las 14 cepas del

bioinoculante). La formulación del reactivo de Salkowsky utilizada fue R1m

(H2SO4 7,9M y FeCl3 40mM)

5.6.1.1.1 Curva patrón de ácido indol acético (AIA)

Para la determinación de la concentración (ug/ml) de ácido indol acético

(AIA) producidos por cada cepa diariamente, se realizó una curva patrón con

el reactivo Salkowsky a base de ácido sulfúrico (R1m).

Se preparó un patrón de diferentes concentraciones (0, 2, 4, 8, 10, 15, 20 y

30 ug/ml) de AIA comercial (Sigma) y se sometió a reacción a una proporción

de 2 mL de reactivo de Salkowsky R1m por 1 mL de las diferentes

concentraciones del patrón de AIA, luego se incubó durante 30 minutos a

temperatura ambiente, y finalmente se leyó absorbancia con un

59

espectrofotómetro (Genesis 20) a 530nm. Las mediciones se realizaron por

triplicado y se determinó la curva de calibración y la ecuación de la recta.

5.6.1.1.2 Determinación de producción de ácido indol acético (AIA) en

cultivos microbianos

Las muestra de caldo de cultivo (sobrenadante) que se encontraban

almacenadas en congelación, se sometieron nuevamente a centrifugación,

en una microcentrífuga Jouan a 10.000 rpm por 5 min. Se tomó 1ml del

sobrenadante y se llevó a reacción con 2ml del reactivo de Salkowsky R1m,

dejándolo en incubación a temperatura ambiente por 30 minutos, para luego

leer en el espectrofotómetro (Genesis 20) a 530 nm determinando el valor de

absorbancia. Una vez obtenidos estos valores, se sustituyeron en la

ecuación de la recta obtenida a partir de la curva patrón de AIA,

determinando la concentración de AIA (ug/ml) producidos en cada día de la

fermentación.

5.6.1.2 Detección de auxinas y giberelinas por cromatografía de capa fina

(TLC)

La detección de auxinas y giberelinas fue realizada a partir de muestras

previamente tratadas (microcentrifugación a 10.000rpm por 10min) haciendo

una extracción líquido-líquido. Una alícuota de 1.5ml del sobrenadante se

mezcló con 1.5ml de acetato de etilo, homogenizando con vortex 20 veces,

posteriormente la mezcla fue centrifugada, por 10 min a 5000rpm (centrífuga

Sorvall), para facilitar la separación de las dos fracciones. A partir de la

fracción orgánica se tomó 1ml y se transfirió a un tubo eppendorf tapa rosca.

Posteriormente la fase orgánica se concentró (evaporación) por

centrifugación al vacío en un “speedvac” Jouan, en el Laboratorio de

Micología y Fitopatología de la Universidad de Los Andes (LAMFU).

60

Finalmente la fracción orgánica concentrada se reconstituyó en 50ul de

metanol, sonicando las muestras durante 45 minutos.

Los cromatógramas fueron realizados en placas de silica gel para detección

de fluorescencia (Merck) de 10 x 10 cm, las cuales fueron limpiadas

previamente en la fase móvil de cloroformo: acetato de etilo: acido acético

(50:30:20).

Figura 5.6 Cámara de TLC

Listos los cromatógramas se colocaron en la fase móvil dejando un frente de

corrida de 6.5 cm, posteriormente fueron retirados de la cámara de TLC

(Figura 5.6), se dejaron secar para posteriormente ser asperjados con el

revelador uniformemente (H2SO4 60%, FeCl3 28mM). Luego de la aspersión,

las placas se secaron a temperatura ambiente en la cabina de extracción y

posteriormente las placas se sometieron a calentamiento en horno a 100°C

durante 2 minutos. La lectura se realizó para GA3 en UV de onda larga,

mientras que AIA e IBA, fueron observados en luz visible, registrando en

ambos casos la movilidad cromatográfica (Rf).

Se sembró en las placas 10ul de muestra,

sirviendo inicialmente 2ul y dejando secar, y

repitiendo la siembra 5 veces.

Las placas fueron marcadas con 7 puntos

para siembra, sembrando en el último carril

1ul de la mezcla de reguladores (AIA, IBA,

GA3), como control del cromatograma.

61

6. RESULTADOS Y DISCUCION

6.1 ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE AUXINAS

6.1.1 DETECCIÓN COLORIMÉTRICA (REACTIVO DE SALKOWSKY)

Al evaluar las reacciones de los diferentes tipos de reactivos de Salkowsky a

base de ácido sulfúrico, se observó un comportamiento diferente de los datos

entre los tres reactivos inicialmente evaluados R1, R2 y R3 (Glickmann &

Dessaux, 1995), encontrándose variaciones tanto en sus valores de

pendiente (Figura 6.1), como en el color que presentaron en el momento de

la reacción (Figura 6.2).

a

b

c

d

Figura 6.1 Curvas de detección AIA con el reactivo de Salkowsky a base a de ácido perclórico y ácido

sulfúrico: a Salkowsky HClO4 (HClO4 3,5 M – FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1 (H2SO4 7,9 M –

FeCl3 40 mM, 1:1), c Salkowsky R2 (H2SO4 10,8 M – FeCl3 16 mM, 1:1), d Salkowsky R3 (H2SO4 6,9

M – FeCl3 9,2 mM, 1:4); se observan los datos de pendiente y R2 para cada una de las reacciones.

62

Figura 6.2 Muestras de reacción de diferentes concentraciones de AIA con los diferentes reactivos de

Salkowsky. a Salkowsky HClO4 (HClO4 3,5 M – FeCl3 10mM, 1:2), b Salkowsky R1 (H2SO4 7,9 M –

FeCl3 40 mM, 1:1), c Salkowsky R2 (H2SO4 10,8 M – FeCl3 16 mM, 1:1), d Salkowsky R3 (H2SO4 6,9

M – FeCl3 9,2 mM, 1:4); se observa la escala de color según las diferentes concentraciones de AIA.

Luego de obtener los datos preliminares de las diferentes mezclas de ácido

sulfúrico y cloruro férrico de los reactivos básicos R1, R2 y R3, en base a las

pendientes de las gráficas obtenidas (Glickmann & Dessaux, 1995) (Tabla

Curva detección AIA - Salkowsky

(HClO4 3.5M - FeCl3 10mM, 1:2)

a

Curva detección AIA - R1

(H2SO4 7.9M - FeCl3 40mM, 1:1)

b


(H2SO4 10.8M - FeCl3 16mM, 1:1)

c


(H2SO4 6.9M - FeCl3 9.2mM, 1:4)

d

63

6.1) y el color de la reacción, se realizaron unas modificaciones a los

reactivos R1 y R2 (Glickmann & Dessaux, 1995) debido a que estos

presentaron datos más altos de pendiente y R2 que los datos obtenidos con

el reactivo R3, comparados con los datos obtenidos a partir de la curva de

calibración realizada con Salkowsky a base de HClO4. El color de la reacción

fue similar en los cuatro para las cuatro formulaciones del reactivo. Teniendo

en cuente estas observaciones, se decidió variar la proporción de reacción

entre AIA y el reactivo, así como las concentraciones de H2SO4 y FeCl3

(Tabla 5.2). Nuevamente se comparó la sensibilidad de cada reactivo (Figura

6.3) y el color de reacción, buscando una coloración similar a la gama de

colores observada en reacción con Salkowsky a base de HClO4 (Figura 6.4).

Tabla 6.1 Datos de pendiente, R2 y color obtenidos a partir de la reacción de HClO4, R1, R2 y R3 con

AIA, los asteriscos pertenecen a la gama de color del reactivo a base de acido perclorico el cual cuenta

con 4 asteriscos, buscando una comparación entre la gama de color con los reactivos evaluados.

Reactivo Pendiente R2 ColorHClO4 0,034 0,999 ****R1 0,018 0,994 ****R2 0,014 0,992 **R3 0,007 0,986 *

64

a

b

c

d

e

Figura 6.3 Curvas de detección de AIA con el reactivo de Salkowsky a base a de ácido perclórico y

ácido sulfúrico: a Salkowsky a base de HClO4 (HClO4 3,5 M – FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1m

(H2SO4 7,9 M – FeCl3 40 mM, 1:2), c Salkowsky R1m1 (H2SO4 10,8 M – FeCl3 40 mM, 1:1), d

65

Salkowsky R1m2 (H2SO4 10,8 M – FeCl3 40 mM, 1:2), e Salkowsky R2m (H2SO4 10,8 M – FeCl3 16

mM, 1:2); se observan los datos de pendiente y R2 para cada una de las reacciones.

Figura 6.4 Muestras de reacción de diferentes concentraciones de AIA con los diferentes reactivos de

Salkowsky. a Salkowsky a base de HClO4 (HClO4 3,5 M – FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1m (H2SO4 7,9 M

– FeCl3 40 mM, 1:2), c Salkowsky R1m1(H2SO4 10,8 M – FeCl3 40 mM, 1:1), d Salkowsky R1m2 (H2SO4

10,8 M – FeCl3 40 mM, 1:2), e Salkowsky R2m (H2SO4 10,8 M – FeCl3 16 mM, 1:2); se observa la escala de

color según las diferentes concentraciones de AIA.

Curva detección AIA - Salkowsky (HClO4 3.5M - FeCl3 10mM, 1:1)

a

Curva detección AIA - R1m (H2SO4 7.9M - FeCl3 40mM, 1:2)

b

Curva detección AIA - R1m1 (H2SO4 10.8M - FeCl3 40mM, 1:1)

c

Curva detección AIA - R1m2 (H2SO4 10.8M - FeCl3 40mM, 1:2)

d

Curva detección AIA – R2m (H2SO4 10.8M - FeCl3 16mM, 1:2)

e

66

Al obtener los datos de las reacciones del patrón de AIA con los reactivos R1m,

R1m1, R1m2 y R2m (Tabla 6.2) y los diferentes patrones de color (Figura 6.4)

observados en el momento de la reacción, en comparación con los datos iniciales

de la reacción de AIA con Salkowsky preparado con HClO4 y de acuerdo a las

pendientes de las gráficas y la escala de color que presento la reacción se decidió

trabajar con el reactivo R1m, el cual presenta mayor sensibilidad y color de

reacción con el reactivo a base de ácido perclórico. El reactivo R1m1 presenta

mayor sensibilidad que el R1m, pero la reacción muestra una tonalidad diferente a

la reacción con Salkowsky-HClO4.

Tabla 6.2 Datos de pendiente y R2 obtenidos a partir de la reacción de R1m, R1m1, R1m2 y R2m con AIA.

los asteriscos pertenecen a la gama de color del reactivo a base de acido perclorico el cual cuenta con 4

asteriscos, buscando una comparación entre la gama de color con los reactivos evaluados.

Reactivo Pendiente R2 ColorHClO4 0,034 0,999 ****R1m 0,024 0,973 ****R1m1 0,032 0,964 ***R1m2 0,01 0,963 *R2m 0,009 0,994 **

El color de reacción con el reactivo de Salkowsky puede variar según el

compuesto detectado, caracterizándose AIA por generar un color fucsia en

reacción con dicho reactivo. La tonalidad de la coloración de la reacción es

directamente proporcional a la cantidad de AIA (Bric et al, 1991). De esta forma,

cuando se torna de un color fucsia a púrpura intenso es un indicativo de la

presencia de altas cantidades de AIA en la muestra; mientras que si se torna de

un color fucsia a rosa pálido se asume la presencia de una baja concentración de

AIA. La aparición de color fucsia en la reacción, es debida a una reacción oxidativa

causada por el ácido, y una transaminación que lleva a la sustitución del grupo

amino por el Cl del FeCl3, presente en el reactivo de Salkowsky (Gordon & Webert,

67

1950) la reacción de oxidación producida por el ácido es más intensa según el

poder oxidativo del ácido utilizado, siendo el ácido perclórico uno de los ácidos con

mayor poder oxidativo (Bric et al,1991, Glickmann & Dessaux 1995). Lo que se

buscó en este trabajo fue sustituir el ácido perclórico por ácido sulfúrico,

igualmente un ácido con un alto poder oxidativo (Merck, 2001).

La reacción de Salkowsky es altamente específica para grupos indol, pero no para

AIA como tal. Cuando se pone en reacción una muestra y se torna de color

amarillo a amarillo café se podría especular la detección de otros compuestos con

grupos indol como ácido indol butírico, ácido indol pirúvico o ácido indol propiónico

(Bric et al, 1991). Por esto, se busca al estandarizar el uso de nuevas

formulaciones de Salkowsky que el color de reacción sea similar al color de

reacción de Salkowsky a base de ácido perclórico, ya que por color se podría

presumir la detección específica de AIA y no de otros compuestos con grupos

indol. Debido a esto, no se escogió el reactivo R1m1 ya que aunque presentó un

valor de pendiente cercano al valor obtenido en la reacción con ácido perclórico,

no presentó una tonalidad tan similar a la que se presenta con ácido perclórico,

por lo que se podría estar detectando otro tipo de compuestos con grupos indol. El

reactivo R1m2, cuya modificación fue el aumento de la concentración del ácido

sulfúrico con lo que se esperaría que la reacción de oxidación fuese mayor,

presentó un color café el cual no está acorde a la gama de color que se presenta

con el reactivo de Salkowsky a base de ácido perclórico, lo cual posiblemente fue

causado a que la oxidación pudo haber generado una detección de precursores de

AIA (Bric et al, 1991).

El cambio de coloración de reacción con algunas de las formulaciones del reactivo

de Salkowsky puede también estar relacionado con un cambio en la longitud de

onda de máxima absorbancia. Para verificar si se dieron cambios en la longitud de

máxima absorbancia, se evaluó el espectro de absorbancia de las reacciones de

todos los reactivos de Salkowsky-H2S04 comparando con el espectro de

absorbancia de Salkowsky-HClO4. Para determinar los espectros de absorbancia

68

para cada reactivo, se corrió una reacción con solución de AIA en dos

concentraciones (10ug/ml y 30ug/ml), y el espectro se determinó en rango de luz

visible (400nm – 700nm) (Figura 6.5 y 6.6). Los picos de máxima absorción están

entre 528nm y 534 nm. La longitud de absorbancia máxima de la reacción con

Salkowsky-HClO4 fue de 528 nm, lo cual se ajusta a la literatura donde se

recomienda la lectura a 530 nm (Salkowsky, 1889); de la misma forma ocurre con

el reactivo R1m donde la diferencia no excede los 0.5 nm, con lo que se puede

determinar la lectura a 530 nm (Tabla 6.3) (Bric et al, 1991; Glickmann & Dessaux,

1995). En caso de que la longitud de onda de máxima absorción tenga un cambio

mayor de 10nm, se podría modificar la lectura de la prueba a la longitud del onda

de pico de absorción para aumentar la sensibilidad de la prueba. En el caso del

reactivo R1m no es necesario hacer esta modificación.

Tabla 6.3 Valores de máxima absorción en el espectro absorbancia de 400 – 700nm de las reacciones con

las diferentes formulaciones del reactivo de Salkowsky.

λ (nm)

REACTIVO10

ug/ml 30

ug/ml Perclórico 528,50 528,50

R1 529,50 529,50 R2 531,00 530,50 R3 532,00 532,00

R1m 532,50 532,50 R1m1 531,00 531,50 R1m2 532,50 533,50 R2m 533,50 535,00

69

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIÓN SALKOWSKY-HClO4 (AIA 30ug/ml)

a.

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIÓN SALKOWSKY-H2SO4 R1 (AIA 30ug/ml)

b.


c.


d.

Figura 6.5 Espectro de absorción de reacciones con diferentes formulaciones de reactivo de Salkowsky (AIA

30ug/m). a. HClO4, b. H2SO4 R1, c. H2SO4 R2 d. H2SO4 R3.

70

Figura 6.6 Espectro de absorción de reacciones con formulaciones de reactivo de Salkowsky modificadas

(AIA 30ug/m). a. HClO4, b. H2SO4 R1m, c. H2SO4 R1m1, d. H2SO4 R1m2, e. H2SO4 R1m2

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIÓN SALKOWSKY-HClO4 (AIA 30ug/ml)

a.

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIÓN SALKOWSKY-H2SO4 R1m(AIA 30ug/ml)

b.

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIÓN SALKOWSKY-H2SO4 R1m1 (AIA 30ug/ml)

c.


d.


e.

71

6.2 DETECCIÓN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC)

6.2.1 ESTANDARIZACIÓN DE FASE MÓVIL PARA TLC

La estandarización de detección de reguladores de crecimiento por TLC, fue

establecida probando 15 fases móviles (Tabla 5.3), buscando principalmente

buena resolución entre las bandas de corrida y la movilidad de todos los

reguladores. Para la estandarización se utilizaron patrones de reguladores

(AIA, IBA, GA3) comerciales (Sigma–Aldrich), preparando soluciones stock

de diferente concentración para evaluar el límite de detección de la técnica.

La resolución entre las bandas y el valor de Rf, movilidad cromatográfica

(Tabla 6.4), fueron los criterios básicos para la escogencia de la fase móvil a

utilizar en la evaluación de producción de AIA, IBA, GA3 en las cepas de

referencia y las cepas del bioinoculante.

Los Rf de GA3 obtenidos a partir de las fases móviles S1, S3, S4, S5, S8, S9,

S10, S12, S14, S15, S16 (Tabla 6.4) con un frente de corrida de 4.5 cm,

demuestran la falta de afinidad entre el solvente y la muestra. Aumentando el

frente de corrida de 4.5 cm a 6 cm se observó movilidad de la muestra en los

solventes S3, S4, S5 (Tabla 6.4), mientras que con las mismas fases móviles

se observó la movilidad de AIA e IBA, la cual se ve sesgada por la falta de

movilidad de GA3.

La determinación de la fase móvil fue realizada a partir de S2, S5 y S13,

siendo estos los solventes que mostraron mejor resolución entre las bandas

de AIA e IBA y movilidad de GA3 (Tabla 6.4).

72

Tabla 6.4 Movilidad cromatográfica (Rf) de reguladores de crecimiento (GA3, AIA, IBA) en las fases

móviles evaluadas (los reguladores con prefijo m indican el carril del cromatograma en el que se sirvió

la mezcla de los tres reguladores, mix).

FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 4,5 cm) FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 6 cm)

mGA3 mAIA mIBA GA3 AIA IBA mGA3 mAIA mIBA GA3 AIA IBA

S1 0,00 0,56 0,63 0,00 0,60 0,68 0,00 0,60 0,68 0,00 0,59 0,67

S2 0,31 0,75 0,88 0,28 0,83 0,88 0,28 0,83 0,88 0,28 0,83 0,91

S3 0,00 0,63 0,75 0,00 0,65 0,78 0,06 0,68 0,78 0,07 0,68 0,78

S4 0,00 0,67 0,77 0,00 0,65 0,76 0,05 0,72 0,82 0,05 0,71 0,81

S5 0,00 0,85 0,90 0,36 0,86 0,90 0,39 0,89 0,93 0,39 0,89 0,93

S6 0,03 0,71 0,81 0,04 0,72 0,83 0,00 0,70 0,81 0,00 0,71 0,80

S7 0,07 0,78 0,87 0,07 0,78 0,87 0,00 0,76 0,84 0,00 0,76 0,84

S8 0,00 0,67 0,82 0,03 0,67 0,83 0,06 0,68 0,77 0,06 0,66 0,80

S9 0,00 0,53 0,64 0,00 0,53 0,60 0,00 0,54 0,64 0,00 0,54 0,54

S10 0,00 0,33 0,53 0,00 0,36 0,53 0,00 0,38 0,60 0,00 0,33 0,58

S11 0,04 0,37 0,50 0,04 0,42 0,59 0,09 0,50 0,61 0,09 0,44 0,59

S12 0,00 0,29 0,40 0,00 0,29 0,41 0,00 0,29 0,42 0,00 0,29 0,40

S13 0,76 0,00 0,93 0,73 0,90 0,91 0,78 0,86 0,92 0,78 0,90 0,92

S14 0,00 0,10 0,19 0,00 0,14 0,25 0,00 0,17 0,25 0,04 0,17 0,34

S15 0,00 0,31 0,44 0,00 0,31 0,50 0,00 0,35 0,48 0,00 0,35 0,40

S16 0,00 0,50 0,63 0,04 0,54 0,65 0,00 0,46 0,63 0,00 0,46 0,65

La fase móvil S13 fue el mejor sistema de solvente para la movilidad de GA3

evidenciado por el mayor Rf de GA3 de las 16 fases móviles (Tabla 6.5), con

una fluorescencia clara. Sin embargo las bandas de AIA e IBA no presentan

buena resolución, presentándose como manchas; mientras que en el carril

del Mix se observa un enmascaramiento AIA por IBA, observándose solo una

mancha amarilla con un borde fucsia característico del AIA (Figura 6.8 a). El

sistema de solvente S5 presenta el segundo Rf de GA3 más alto de las 16

fases móviles evaluadas, lo que lo hace un excelente solvente para GA3

(Tabla 6.5); sin embargo, aunque AIA e IBA se observan con buena

resolución, este sistema también resuelve otras bandas en el cromatógramas

(Figura 6.8 b).

La fase móvil S2, compuesta por cloroformo: acetato de etilo: ácido acético

(50:30:20), presentó un Rf para GA3 de 0.28, el cual es menor comparado

73

con S5 y S13 (Tabla 6.5), y excelente resolución entre las bandas de AIA e

IBA, en los dos frentes de corrida evaluados (Figura 6.8 c y d).

Los valores de Rf y la resolución entre las bandas de AIA e IBA (Figura 6.9)

obtenidos a partir de los cromatógramas sugieren a la fase móvil S2, como el

solvente adecuado para la detección de los tres reguladores de crecimiento

vegetal (AIA, IBA y GA3).

Tabla 6.5 Mejores valores de movilidad cromatográfica (Rf) Rf de las fases móviles para la detección

de AIA, IBA y GA3 (los reguladores con prefijo m indican el carril del cromatograma en el que se sirvió

la mezcla de los tres reguladores, mix).

FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 4,5 cm) FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 6 cm)

mGA3 mAIA mIBA GA3 AIA IBA mGA3 mAIA mIBA GA3 AIA IBA

S2 0,31 0,75 0,88 0,28 0,83 0,88 0,28 0,83 0,88 0,28 0,83 0,91

S5 0,00 0,85 0,90 0,36 0,86 0,90 0,39 0,89 0,93 0,39 0,89 0,93

S13 0,76 0,00 0,93 0,73 0,90 0,91 0,78 0,86 0,92 0,78 0,90 0,92

Al realizar una revisión bibliográfica no se encontraron referencias donde se

cite el uso de un mismo solvente para la detección de los tres reguladores de

crecimiento (AIA, IBA y GA3), por lo que los resultados obtenidos entonces

no se pueden comparar con resultados de estudios preliminares.

6.2.2 DETECCIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN TLC

La detección de auxinas se llevó a cabo con el patrón de AIA e IBA, los

cuales reaccionaron con el revelador, de composición similar a la del reactivo

Salkowsky, garantizando la detección de grupos indol. La reacción evidenció

el color fucsia característico de AIA con el reactivo Salkowsky (Bric et al.,

1990), mientras que para IBA se observó un color naranja oscuro en los

cromatógramas, tanto en los carriles donde se sirvieron individualmente los

patrones como en la mezcla de los tres (Figura 6.7).

74

FIGURA 6.7 a. Cromatograma fase móvil S13, luz visible y UV, frente de corrida 4cm, b.Cromatograma

fase móvil S5, luz visible y UV, frente de corrida 4cm, c. Cromatograma fase móvil S2, luz visible frente

de corrida 4cm y 6cm, d. Cromatograma fase móvil S2, luz UV, frente de corrida 4cm y 6cm.

a. Cromatograma S13 (Frente de corrida 4 cm)

b. Cromatograma S5 (Frente de corrida

4 cm)

c. Cromatograma S2 Frente de corrida 4 cm 6cm

d. Cromatograma S2 Frente de corrida 4 cm 6cm

MIX GA3 AIA IBA MIX GA3 AIA IBA

MIX GA3 AIA IBA

IBA

AIA

IBA

AIA

AIA

IBA

AI

IBA

MIX GA3 AIA IBA MIX GA3 AIA IBA MIX GA3 AIA IBA

GA3

GA3

GA3 GA3

MIX GA3 AIA IBA MIX GA3 AIA IBA

75

Las giberelinas fueron detectadas por la fluorescencia que resulta de la

reacción de oxidación entre el ácido giberélico y el ácido sulfúrico del

revelador (Reyes et al., 1991), lo cual fue observado bajo luz ultravioleta,

observándose una fluorescencia azul intensa en los cromatogramas (Figura

6.7), tanto en la mezcla de reguladores como en el patrón de GA3.

6.2.3 LIMITES DE DETECCIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO

VEGETAL EN TLC (AIA, IBA, GA3)

Para establecer el límite de detección de la técnica se realizó una curva de

detección de reguladores AIA, IBA, GA3 con el patrón de cada regulador a

diferente concentración (Figura 6.8) estableciendo el limiete de detecci´pon a

partir de el rango de producción de AIA, GA3 en microorganismos,

producción de AIA (0.05ug/ml), y GA3 (0.05 ug/ml). (Torres et al, 2000, Tien

et al, 1979). Se establecio el limiete de detección de la tenica como de 0.5ug/

ml para AIA, IBA y GA3.

Figura 6.8 Límite de detección de reguladores de crecimiento vegetal (AIA, IBA y GA3) en TLC. Panel

superior cromatograma luz visible y panel inferior cromatoigrama en UV.

0.01ug 0.05ug 0.1ug 0.5ug 1ug 5ug 10ug

0.01ug 0.05ug 0.1ug 0.5ug 1ug 5ug 10ug

GA3

AIA

IBA

IBA

AIA

GA3

76

6.3 ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE GIBERELINAS

6.3.1 DETECCION COLORIMETRICA

6.3.1.1 Reactivo Folling-Wu (ácido fosfomolíbdico)

La reacción de detección de giberelinas con el reactivo Folling-Wu (ácido

fosfomolíbdico) presentó un color azul en las soluciones de diferentes

concentraciones de GA3 (Figura 6.9). Las soluciones de AIA tratadas con el

mismo reactivo, también presentaron la misma coloración azul (Figura 6.10).

Estos resultados demuestran la inespecificidad del reactivo.

Figura 6.9. Reacción con ácido fosfomolíbdico a diferentes concentraciones de GA3.

La detección colorimetríca de giberelinas con el reactivo Follin Wu está

restringida a soluciones puras de giberelinas, ya que dicho reactivo puede

reaccionar con aminoácidos y azucares (Graham & Henderson 1960), como

en el caso de AIA donde el grupo indol reacciona reduciendo el ácido

fosfomolíbdico generando el color azul característico de la reacción positiva.

77

Figura 6.10. Reacción de ácido fosfomolíbdico con una mezcla de AIA y GA3. (1:1).

6.3.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina

La detección colorimetríca de giberelinas con el reactivo 2,4

dinitrofenilhidrazina presentó color rojo en los patrones de GA3,

correspondiente a la reacción positiva del reactivo (Figura 6.11), por la

detección de los compuestos cetónicos producidos por la hidrólisis de las

giberelinas (Graham & Thomas, 1960). Sin embargo la reacción de los

patrones de AIA generó el mismo color rojo, lo que evidenció la falta de

especificidad del reactivo (Figura 6.12). Probablemente debido a un

producto de la hidrólisis de AIA, lo que hace que la reacción solo se pueda

aplicar para la cuantificación de patrones de giberelinas o muestras puras.

GA3: AIA 100ug/ml

78

Figura 6.11 Reacción del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferente concentraciones de GA3

Figura 6.12 Reacción del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferentes concentraciones de AIA.

79

6.3.2 DETECCIÓN FLUOROMÉTRICA

La detección fluorométrica de GA3 es realizada en longitudes de onda del

espectro visible, en donde la fluorescencia esta reportada en emisión 457 y

excitación 416nm (Jiang et al., 1997), mientras que Reyes y colaboradores

(1991), la reportan en emisión 464 nm y excitación 406 nm. La detección se

basa en la oxidación del ácido giberélico por reacción con ácido sulfúrico o

ácido perclórico en alcohol. El producto de la oxidación del ácido giberélico

emite fluorescencia (Jiang et al, 1997).

La estandarización de la prueba no pudo ser llevada a cabo por problemas

con los fluorómetros disponibles. El espectroflurómetro del Departamento de

Química de la PUJ no tiene monocromador en la fuente de excitación, por lo

cual las lecturas de las reacciones con diferentes concentraciones de patrón

de GA3 no diferían. Tampoco se lograba una lectura estable, el indicador de

unidades de lectura oscilaba constantemente.

También se trabajó con el fluorómetro del Instituto de Errores Innatos del

Metabolismo. El fluorómetro contaba con filtros de longitudes de onda muy

cercanas a las requeridas, pero no se detectó señal en la reacciones, incluso

en las reacciones con los patrones de mayor concentración. Siendo este

flourómetro, un equipo que trabaja con filtros y un poco antiguo, la

sensibilidad no es tan alta como la de un espectrofluorómetro. El equipo

funciona muy bien con compuestos como umbeliferonas o cumarinas que

presentan autofluorescencia. Al parecer la fluorescencia emitida por la

oxidación del ácido giberélico no es lo suficientemente fuerte para ser

detectada por este equipo.

Se tuvo acceso a otro fluorómetro de filtros, de mayor sensibilidad, que

trabaja en formato de lector de placa de Elisa (Universidad Nacional), pero

80

desafortunadamente este equipo no contaba con un juego de filtros de

longitudes de onda cercanas a las requeridas.

Teniendo en cuenta que los fluorómetros de filtros no se podían utilizar por

diferencias en las longitudes de onda de detección, se buscó un detector de

fluorescencia utilizado para HPLC. Estos detectores se pueden separar del

cromatógrafo y acoplar a una pantalla para lectura. El detector permite

ajustar cualquier longitud de onda en excitación y emisión, y además tiene

alta sensibilidad. El inconveniente en el uso de estos lectores se da porque

que solo tienen celdas de flujo. La reacción para detección de giberelinas

tiene un porcentaje de ácido sulfúrico o perclórico alto (alrededor del 50%), lo

que causaría daño irreparable al sistema de flujo acoplado la celda del

detector.

81

6.4 DETECCIÓN DE ÁCIDO INDOL ACÉTICO EN CULTIVOS MICROBIANOS POR REACCIÓN DE SALKOWSKY

6.4.1 CURVA PATRÓN DE ÁCIDO INDOL ACÉTICO (AIA)

Para la detección y cuantificación de ácido indol acético (AIA) producido por

cada una de las cepas evaluadas, se realizó una curva patrón con el reactivo

de Salkowsky R1m, a diferentes concentraciones de patrón de AIA comercial

(Sigma - Aldrich) (2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30 y 40 ug/ml) (Figura 6.14), para

determinar la ecuación de la recta y el valor de R2, confirmando que los

valores de pendiente y R2 coincidieran con los obtenidos inicialmente con el

reactivo R1m, estandarizado previamente para la detección óptima de AIA.

y = 0,023x + 0,019R² = 0,994

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Unid

adee

s de

Abs 5

30nm

Concentración AIA ug/ ml

CURVA DE CALIBRACION SALKOWSKY (AIA)

Figura 6.13 Curva patrón de concentraciones AIA con reactivo Salkowsky (R1m)

Una vez confirmada la coincidencia de los datos se utilizó dicha ecuación

para cuantificar AIA producido por cada cepa, a partir de los datos obtenidos

por absorbancia de las muestras en reacción con Salkowsky.

82

6.4.2 PRODUCCIÓN DE ACIDO INDOL ACÉTICO (AIA)

6.4.2.1 Azotobacter vinelandii

Se realizaron tres montajes de cultivo de Azotobacter vinelandii ATCC12518,

para determinar la producción de AIA, debido a que los datos obtenidos a

partir de estos tuvieron alta variabilidad. En el primer montaje se observó un

comportamiento lineal ascendente, pero con una producción de AIA baja

(Anexo 2). Para el segundo montaje los datos mostraron un comportamiento

lineal ascendente para la producción de AIA, pero con concentraciones de

AIA mucho mayores en comparación al primer montaje, adicionalmente esta

presento mejor definición de color y un mejor comportamiento entre réplicas

(Figura 6.14), obteniendo concentraciones de AIA aproximadamente de

60ug/ml en el medio BT y 72 ug/ml en medio TSB, en el sexto día de cultivo,

lo cual concuerda con lo reportado por Torres y colaboradores (2000), en

donde la producción de AIA por A. vinelandii alcanzaba concentraciones de

32.22 ppm – 34.25 ppm. El tercer montaje presentó una curva de producción

de AIA con un pico de producción en el día 4, buen comportamiento entre

réplicas y buena definición de color (Anexo 2).

01020304050607080

0 1 2 3 4 5 6 7

Conc

entr

ació

n A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Producción de AIA Azotobacter vinelandii en medio BT

a. b. Figura 6.14 Curvas de producción de AIA por Azotobacter vinelandii a. Producción de AIA en medio BT, b.

Producción de AIA en medio TSB (Montaje 2).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6 7

Conc

entr

ació

n A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Producción de AIA Azotobacter vinelandii en medio TSB

83

A. vinelandii fue establecido como el control positivo para la producción de AIA por

la buena producción de AIA detectada en el segundo montaje y su tendencia de

producción en aumento lineal. Al comparar su producción en los medios de cultivo

TSB y BT se observó un comportamiento similar en cuanto a la producción de AIA

(Figura 6.14). Esta cepa de A. vinelandii también fue utilizada como control

positivo de producción de AIA en medio BT por Duque & Quintana (2008). La cepa

presentó un comportamiento lineal tendiente al aumento en la producción de AIA

hasta el día 8 de cultivo (Figura 6.15). En cuanto a concentración de AIA por día

de cultivo, los valores fueron similares a los obtenidos en el segundo y tercer

montaje. Los resultados de Duque & Quintana (2008) corroboran el

comportamiento de la cepa en procesos de producción de AIA.

Los resultados de este estudio también concuerdan con los resultados reportados

por Zakharova y colaboradores (1999), quienes observarón una tendencia lineal

ascendente para las curvas de producción de AIA en A. vinelandii y A. brasilense

habitantes de rizósfera.

-40,00

-20,00

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16Conc

entr

ació

n de

AIA

ug/

ml

Tiempo (días)

Producción AIA Azotobacter vinelandii en medio BT (Duque; Quintana, 2008)

Figura 6.15 Producción AIA por A. vinelandii ATCC12518 en medio BT (Duque & Quintana, 2008)

Aunque se observaron diferencias entre los tres montajes, el comportamiento de la

cepa en los medios de cultivo evaluados TSB y BT fue muy parecido, ya que en

los dos medios de cultivo se observó una producción de AIA parecida llegando a

concentraciones de 60ug/ml en medio BT y 70 ug/ml de TSB para el montaje 2; lo

84

que asegura al medio BT como un medio apropiado para la producción de

biomasa y para la producción de AIA (Figura 6.15 y 6.17). El medio B no presentó

dicho comportamiento, ya que no se observó producción de AIA, este resultado se

puede explicar por que tanto el medio TSB como el medio BT (Anexo 1) estimulan

la producción de AIA por proporcionar una fuente de triptófano (Trp), el cual es

considerado como el principal precursor en la vía de síntesis de AIA. En cultivos

con presencia triptófano se incrementa la producción de AIA por diferentes vías

metabólicas (Bric et al., 1991; Zakharova et al., 1999), mientras que el medio B al

no tener una fuente de triptófano no promueve la producción de AIA por dichas

vías. Esta observación sugiere que en esta cepa de A. vinelandii solo actúan las

rutas dependiente de triptófano para la biosíntesis de AIA. En el medio B tampoco

se evidenció buena producción de biomasa, probablemente por ser un medio

mineral carente de fuentes de nitrógeno orgánico, aunque este medio se

recomienda para el crecimiento de microoganismos nativos de suelo (Strzelczyk et

al., 1984).

El crecimiento de A. vinelandii en los medios de cultivo presentó la misma

tendencia que la producción de AIA, ya que según valores de turbidez del cultivo

(Abs540) se observó que tanto para TSB como para BT los valores fueron muy

similares, y al presentarse buen crecimiento de la cepa en el medio se promueve

la producción de AIA, al llegar a la fase estacionaria en la cinética de crecimiento

(Torres et al, 2000) (Figura 6.16 a y b). Por el contrario, en el medio B se

observaron valores de turbidez muy bajos, lo que indica poco crecimiento en el

medio, lo cual concuerda con la falta de producción de AIA (Figura 6.16 c).

El comportamiento, en producción de biomasa, de la cepa en los medios de cultivo

evaluados se debe a que tanto TSB como BT son medios de cultivos ricos en

nutrientes, TSB es un medio compuesto por peptona como fuente de nitrógeno y

carbono y dextrosa como fuente de carbono, los cuales son nutrientes esenciales

para el desarrollo y reproducción bacteriana (Brock et al, 2001), también cuenta

con reguladores de osmolaridad, como cloruro de sodio y fosfato dipotásico, los

85

cuales regulan la toma de nutrientes en las células (Brock et al, 2001), la tripticasa

es una fuente de triptófano, que estimula la producción de AIA lo que determinaría

su comportamiento (Asghar et al., 2002; Karadeniz et al., 2006). Así mismo, el

medio BT es un medio apropiado para la producción de biomasa, aunque es un

medio sencillo de sales básicas y glucosa (Anexo1). Entre sus componentes se

encuentra NH4NO3 y triptona (digerido pancreático de caseína) que además de ser

fuente de triptófano sirve de fuente de nitrógeno orgánico y Ca, promoviendo un

mejor crecimiento (Brock et al, 2001). La glucosa, fuente de carbono, es

metabolizada rápidamente por A. vinelandii (Moreno & Garcia, 1995).

0

2

4

6

8

10

01020304050607080

0 1 2 3 4 5 6 7

Crec

imie

nto

en u

nida

des

de A

bs

Conc

entr

ació

n AI

A ug

/ml

Tiempo (Dias)

Azotobacter vinelandii en medio TSBCrecimiento (Abs) VsProducción de AIA ug/ ml

AIA ug/ml Crecimiento en unidades de Abs

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6 7

Crec

imie

nto

en u

nida

des

de A

bs

Conc

entr

ació

n A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Azotobacter vinelandii en medio BTCrecimiento (Abs) VsProducción AIA ug/ ml


a. b.

c. Figura 6.16 Curvas crecimiento (Abs540) y producción de AIA (ug/ml) de Azotobacter vinelandii. a. Cultivo en

medio TSB, b. Cultivo en medio BT, c. Cultivo en medio B.

El día de muestreo óptimo para la determinación de AIA en cultivos en agitación,

fue establecido por una diferencia entre los datos obtenidos día a día en la

0

1

2

3

4

5

6

7

8

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 1 2 3 4 5 6 7

Crec

imie

tno e

n un

idad

es d

e A

bs

Con

cent

raci

ón A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Azotobacter vinelandii en medio BCrecimiento (Abs) vs Produción AIA ug/ ml


86

producción de AIA (Tabla 6.6), ya que no se observó un pico de producción

constante entre los montajes. Al calcular la diferencia en producción de AIA entre

los días de cultivo, se logró establecer el día de mayor producción de AIA para

tomar este como el día de muestreo óptimo para determinar cuanto puede llegar a

producir una cepa día a día en este tipo de cultivos.

Tabla 6.6 Cuadro de comparación de día de mayor producción de AIA por Azotobacter vinelandii en medios

TSB y BT (los valores indican la diferencia de producción de AIA día a día)

TSB BT

Dia Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3 Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3

0 0,152 0,000 2,513 0,042 0,000 0,000

1 0,181 3,078 3,212 0,647 0,000 10,659

2 2,745 4,570 8,495 0,944 10,363 8,091

3 0,233 17,070 7,890 1,446 17,527 14,570

4 0,343 15,067 9,503 0,527 24,933 17,715

5 1,887 14,113 3,481 2,463 6,371 -4,449

6 2,218 11,882 -6,089 -0,012 11,210 -3,938

Teniendo en cuenta los resultados presentados en la tabla 6.6, el día de mayor

producción de AIA para A. vinelandii, realizando un promedio entre los valores

obtenidos, sería el día cuatro; prestando mayor atención a los resultados de los

mentajes 2 y 3 en medio BT. Además, aunque no es el comportamiento típico de

la cepa, en el montaje 3 se presentó un pico de producción de AIA en el día cuatro

(Anexo2), lo que indicaría también que es un día importante en la producción de

AIA.

Como se reporta en literatura, la fase estacionaria en la cinética de crecimiento

microbiano es aquella en donde se inician algunos procesos biosinteticos de

metabolismo secundario, entre los cuales se cuenta la producción de AIA

(Karadeniz et al, 2006), ajustándose al día de producción máxima, el cual se

ubicaría en la fase estacionaria de la cinética de crecimiento de la bacteria (Figura

6.17).

87

6.4.2.2 Azospirillum brasilense

Para A. brasilense se realizaron dos montajes de cultivo, en medio TSB, BT y B,

para determinar la producción de AIA. El primer montaje presentó una producción

lineal en aumento con baja producción de AIA en comparación a lo obtenido con

A. vinelandii, con buena definición de color y comportamiento entre réplicas

(Anexo 2). El segundo montaje presentó la misma tendencia que el primero, con

una producción de AIA no mayor a 10 ug/ml, buen comportamiento entre réplicas y

definición de color (Figura 6.17).

Al obtener entonces los datos de producción de AIA por A. brasilense se observó

el mismo comportamiento que en los datos de A. vinelandii, con un

comportamiento lineal con producción en aumento característica de A. brasilense

(Zakharova et al., 1999), el cual al igual que la mayoría de los miembros del

género Azospirillum son productores de AIA dependientes de triptófano como

precursor de AIA. El triptófano se puede metabolizar por dos vías principales, vía

Indol-3- acetamida (IAM) y vía Indol-3-piruvato (IPyA) (Zakharova et al., 1999; Taiz

& Zeiger, 2006).

Figura 6.17 Curvas de producción de AIA por Azospirillum brasilense a. Producción de AIA en medio BT, b.

Producción de AIA en medio TSB (Montaje 2)

0123456789

0 1 2 3 4 5 6 7

Co

ncan

tració

n A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Producción de AIA por Azospirillum brasilense en medio BT

a.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7Co

ncen

tració

n A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Producción de AIA por Azopirillum brasilense en medio TSB

b.

88

El crecimiento de A. brasilense en los medios de cultivo mostró la misma

tendencia de A. vinelandii con un crecimiento similar en el medio TSB

donde la producción de AIA no fue muy alta (7ug/ml), pero el crecimiento y

desarrollo de la cepa determinado por la turbidez del cultivo (Figura 6.18),

gracias a que este medio (TSB) es una buena fuente de nutrientes para

este tipo de microorganismos favoreciendo así su desarrollo y crecimiento

con fuentes de C, N y demás elementos esenciales para su crecimiento

(Brock et al, 2001). Por otro lado, el crecimiento en medio BT no se

comparara con el crecimiento en TSB, ya que los datos de turbidez

obtenidos fueron muy, esto se vió reflejado en la producción de AIA, la cual

fue de 5 ug/ml. Para el medio B no se observó ni producción de AIA ni

crecimiento de la cepa, debido a que esta puede que sea una cepa un

poco más exigente en cuanto a requerimientos para producción de

biomasa.

Figura 6.18 Curvas crecimiento (Abs540) y producción de AIA (ug/ml) de Azospirillum brasilense.

a. Cultivo en medio TSB, b. Cultivo en medio BT.

Para establecer el día de muestreo óptimo para determinar la producción de

AIA por A. brasilense, se realizó un análisis por diferencia de valores entre

los días de producción de AIA (Tabla 6.7) ya que tampoco se observó un pico

de producción constante entre los montajes realizados.

0

1

2

3

4

5

6

7

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5 6 7

Cre

cim

iento

en u

nid

ades

de A

bs

Conce

ntr

ació

n A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Azospirillum brasilense en medio TSB Crecimiento (Abs) vsProducción AIA ug/ ml


a.

01234567

010203040506070

0 1 2 3 4 5 6 7

Conc

entr

ació

n A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Azospirillum brasilense en medio BTCrecimiento (Abs) vsProducción de AIA ug/ ml


b.

89

Tabla 6.7 Cuadro de comparación de día de mayor producción de AIA por Azospirillum brasilense en

medios TSB y BT (los valores indican la diferencia de producción de AIA día a día).

TSB BT

Dia Montaje 1 Montaje 2 Montaje 1 Montaje 2

0 0,000 0,000 0,000 0,000

1 0,211 2,339 0,153 0,000

2 0,600 0,108 0,342 0,000

3 0,441 1,142 0,792 2,298

4 0,429 -0,188 1,355 0,927

5 1,238 0,995 0,239 2,500

6 0,453 2,608 -1,060 0,699

Según los resultados observados en la tabla 6.7, el día óptimo de muestreo

determinado por la diferencia de valores de producción día a día, fue el día 5

ya que al hacer un promedio entre lo valores obtenidos se determina este

día, el cual también se ajusta a los valores obtenidos por el crecimiento como

fase estacionaria en su cinética de crecimiento, en la que se ha reportado

producción de AIA (Janzen et al., 1992; Karadeniz et al., 2006) (Figura 6.19).

6.4.2.3 Cepas bioinoculante

La determinación de la producción de AIA realizada con el reactivo de

Salkowsky R1m para las cepas del bioinoculante (Figura 6.20), se analizó por

diferencia entre los valores producción para determinar el día de mayor

producción de AIA por cada una de las cepas, y se compararon con los

valores obtenidos con la cepa de A. vinelandii determinada como control

positivo para la producción de AIA (Tabla 6.8).

90

Figura 6.19 Producción de AIA por las 14 cepas del bioinoculante evaluado, y curva de producción de

AIA por Azotobacter vinelandii control positivo.

La producción de AIA por parte de las cepas (Tabla 6.8), no sobrepasó los

47ug/ml. La producción de AIA fue buena en el medio de cultivo BT al igual

que la producción de biomasa, lo que no se observó en medio B, por la

carencia de triptona en el medio, con lo que se puede concluir las rutas de

biosíntesis de AIA, tanto en las bacterias y los actinomicetos del

bioinoculante, es dependiente triptófano (Strzeclczyk et al, 1984).

Las cepas 1, 2, 3 y 9 fueron las cepas con mayor productividad de AIA,

mientras que las cepas 5, 6, 7, 10, 11, 12 y 14 fueron las de menor

producción de AIA, al no superar los 4ug/ml de producción de AIA (Figura

6.19 y Tabla 6.8).

-1,00

9,00

19,00

29,00

39,00

49,00

59,00

69,00

79,00

0 1 2 3 4 5 6

Conce

ntr

ació

n A

IA u

g/m

l

Tiempo (Dias)

Producción AIA (Cepas Bioinoculante)+ Control positivo (Azotobacter vinelandii)

Azotobacter vinelandii Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4Cepa 5 Cepa 6 Cepa 7 Cepa 8 Cepa 9Cepa 10 Cepa 11 Cepa 12 Cepa 13 Cepa 14

91

Tabla 6.8 Valores de máxima producción de AIA por las cepas bioinoculante

MÁXIMA

CEPA

PRODUCCIÓN

DE AIA (ug/ml)

DIA MÁXIMA

PRODUCCIÓN

DE AIA (ug/ml)

1 30 3

2 47 2

3 41 2

4 25 4

5 4 3

6 2 1

7 0,25 4

8 20 3

9 40 2

10 4 3

11 2 1

12 3 2

13 16 3

14 0,89 4

A partir de los datos de la Tabla 6.9, al hacer un promedio de la diferencia de

producción de AIA día a día, se podría decir que el día de mejor producción o

de mayor producción para las cepas tiende a ser el día 3, observándose un

aumento en lo valores de AIA detectados e inclusive picos de producción

cercanos a este día, lo que lo señala como un día óptimo para la producción

de AIA, día que probablemente se encuentra en la fase estacionaria en la

cinética de crecimiento de los microorganismo corroborando la producción de

AIA como un metabolito secundario tanto de bacterias como actinomicetos

(Karadeniz et al., 2006; Strzeclczyk et al., 1984).

92

Tabl

a 6.

9C

uadr

o de

com

para

ción

de

día

de m

ayor

pro

ducc

ión

de A

IA p

or la

s 14

cep

as d

el b

ioin

ocul

ante

eva

luad

o y

A. v

inel

andi

i

Día de

cult

ivoAzo

tobact

er vin

elandi

i Cep

a 1Cep

a 2Cep

a 3Cep

a 4Cep

a 5Cep

a 6Cep

a 7Cep

a 8Cep

a 9Cep

a 10

Cepa 1

1Cepa

12Cep

a 13

Cepa 1

4

00,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

000,0

001

0,000

0,986

15,486

7,542

0,431

1,058

0,768

0,000

1,694

5,181

2,722

2,029

0,542

2,667

0,778

210,

3631,3

0632,

22233,

6811,8

610,3

910,6

810,0

002,2

2234,

9170,7

920,5

651,2

925,9

170,5

283

17,527

16,028

-23,08

3-18,

0289,8

611,5

940,5

800,0

077,6

81-16

,500

4,361

0,116

1,250

16,569

0,389

424,

93311,

4317,2

6410,

27813,

0280,8

55-0,0

720,1

352,9

86-14

,097

0,750

1,087

-1,181

4,736

0,889

56,3

710,7

92-27

,833-

30,333

-0,194

0,768

0,101

0,036

2,556

-7,556

2,403

0,420

-0,278

-25,41

7-0,7

926

11,210

-2,194

-2,472

-1,861

-1,778

-0,159

0,377

0,071

3,153

-0,194

-1,236

1,246

-0,472

-2,153

-0,597

93

6.5. DETECCIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN CULTIVOS MICROBIANOS POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC)

6.5.1 Azotobacter vinelandii

Los cromatógramas obtenidos a partir de las muestras de A. vinelandii,

muestran la producción de AIA por la cepa desde el día 1 hasta el día 6 con

un Rf de 0.75 el cual concuerda con el control (mix) con un Rf de 0.75 (Tabla

6.10). El aumento en concentración de AIA en el tiempo se evidenció por el

aumento de la intensidad del color de la banda (fucsia), en función del día de

cultivo (Torres et al., 2004) (Figura 6.21 a). Se observó un color fucsia

característico de AIA debido a reacción con el revelador, compuesto por

H2SO4 y FeCl3, por oxidación del grupo indol seguida de transaminación con

Cl (Salkowsky, 1889; Torres et al., 2004).

No se observa producción de IBA, y tampoco de giberelinas por parte de A.

vinelandii (figura 6.20 a, b), pues no se detectó la banda de color naranja

característica de IBA, como se observa en el carril del mix (Rf 0.75). De igual

manera detecta fluorescencia típica de GA3 en los carriles de las muestras de

cada día de cultivo, mientras que en control (mix de reguladores) se observó

una banda fluorescente azul intenso con un Rf de 0.37 (Tien et al., 1979).

Tabla 6.10 Valores de movilidad cromatográfica (Rf) de reguladores de crecimiento en cultivos de

Azotobacter vinelandii

AZOTOBACTER VINELANDII Día de R1 R2 R3 cultivo AIA IBA GA3 AIA IBA GA3 AIA IBA GA3

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,001 0,75 0,00 0,00 0,74 0,00 0,00 0,92 0,00 0,002 0,75 0,00 0,00 0,75 0,00 0,00 0,92 0,00 0,003 0,77 0,00 0,00 0,75 0,00 0,00 0,92 0,00 0,004 0,75 0,00 0,00 0,75 0,00 0,00 0,92 0,00 0,005 0,75 0,00 0,00 0,75 0,00 0,00 0,92 0,00 0,006 0,77 0,00 0,00 0,75 0,00 0,00 0,92 0,00 0,00

MIX 0,77 0,86 0,25 0,75 0,82 0,26 0,92 0,95 0,37

94

a b

c d

e f Figura 6.20 Cromatógramas A. vinelandii. R1 a luz visible b fluorescencia, R2 c luz visible

d fluorescencia, R3 e luz visible f fluorescencia 6.5.2 Azospirillum brasilense

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

95

Los cromatógramas de A. brasilense mostraron la producción de AIA por

parte de la cepa desde el día 1 hasta el día 6, lo cual se vió reflejado con la

presencia de una banda fucsia con un valor de Rf 0.82, igual al Rf del control

(Tabla 6.11) (Torres et al., 2004). Se observó aumento en la intensidad del

color de la banda (rosado tenue a fucsia intenso), lo que refleja el aumento

de concentración de AIA en el curso de tiempo de la fermentación. No se

observó la presencia de IBA (banda amarillo naranja), ni de GA3 (banda de

fluorescencia azul en luz UV de longitud de onda laga). Esta cepa mostró un

comportamiento similar a A. vinelandii. Se observó la similitud entre réplicas y

la presencia de IBA y GA3 en el control (mix de reguladores) con un Rf de

0.89 para IBA y 0.37 para GA3 (Figura 6.21).


Azospirillum brasiliense

AZOSPIRILLUM BRASILENSE Día de R1 R2 R3 cultivo AIA IBA GA3 AIA IBA GA3 AIA IBA GA3

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,88 0,00 0,00 2 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 3 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 4 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 5 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 6 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00

MIX 0,82 0,89 0,28 0,89 0,95 0,37 0,89 0,92 0,37

96

a b

c d

e f Figura 6.21 Cromatógramas A. brasilense. R1 a luz visible b fluorescencia, R2 c luz visible

d fluorescencia, R3 e luz visible fluorescencia

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

97

6.5.3 CEPAS DEL BIOINOCULANTE

Los cromatógramas de las cepas del bioinoculante se realizaron a partir de

un pool (mezcla de réplicas) de los días evaluados. Se detectó producción de

de AIA en cuatro cepas. La cepa 2 presentó banda de AIA del día 2 al 6 con

un Rf de 0.82, el mismo que el control (mix de reguladores). Al igual que en

las cepas control, el color de la banda fue intensificándose a lo largo del

tiempo de incubación. La cepa 4 también presentó banda con un Rf igual al

del control (0.69) y aumento de la intensidad del color de la banda respecto al

tiempo. La cepa 5 presentó banda característica con un Rf de 0.77, igual al

control, pero solo desde el día 5 al día 6. La cepa 9 presentó banda desde el

día 4 al día 6, con un Rf de 0.92, tal como el control. Los resultados de

movilidad cromatográfica y fotografías de los cromatogramas de las 14 cepas

del bioinoculante se pueden observar en la Tabla 6.12 y la Figura 6.22,

respectivamente.

La fluorescencia característica de las giberelinas (Tien et al, 1979) se

observó en cinco cepas. La cepa 4 presentó banda con un Rf de 0.31, desde

el día 4 al día 6. La cepa 5 presentó banda con un Rf de 0.32, desde el día 1

al día 6. La cepa 10 presentó banda con un Rf de 0.37, con producción entre

los días 1 a 3. La cepa 11 presentó banda con Rf de 0.43, los días 2 y 3. La

cepa 12 presentó banda con un Rf 0.40, desde el día 3 al día 6.

Ninguna de las cepas evaluadas mostró producción de IBA (Tabla 6.12 y

Figura 6.22), presentándose entonces para todas las fases estacionarias

únicamente la banda de color naranja en el carril de siembra del mix.

98


cepas del bioinoculante

Día de CEPA 1 CEPA 2 CEPA 3 cultivo AIA IBA GA3 AIA IBA GA3 AIA IBA GA3

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

MIX 0,92 0,95 0,37 0,82 0,86 0,31 0,92 0,94 0,38 CEPA 4 CEPA 5 CEPA 6

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00 2 0,69 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00 3 0,69 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00 4 0,69 0,00 0,31 0,00 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00 5 0,69 0,00 0,31 0,77 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00 6 0,69 0,00 0,31 0,77 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00


0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,92 0,00 0,00 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,92 0,00 0,00 6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,92 0,00 0,00


0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,00 0,00 0,37 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,37 0,00 0,00 0,43 0,00 0,00 0,00 3 0,00 0,00 0,37 0,00 0,00 0,43 0,00 0,00 0,40 4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,40 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,40 6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,40

MIX 0,83 0,88 0,37 0,85 0,89 0,43 0,83 0,40 0,40 CEPA 13 CEPA 14

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

MIX 0,85 0,38 0,38 0,82 0,31 0,31

99

Figura 6.22 Cromatógramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante A. Cepa 1, B. Cepa 2, C,

cepa 3.

A. CEPA 1 CEPA 1

B. CEPA 2 CEPA 2

C. CEPA 3 CEPA 3

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX0 1 2 3 4 5 6 MIX

100

Figura 6.22 Cromatógramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante D Cepa 4, E Cepa 5, F Cepa 6

D. CEPA 4 CEPA 4

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

F. CEPA 6

CEPA 5 E. CEPA 5

CEPA 6

101

CEPA 7

H. CEPA 8

CEPA 9

CEPA 8

I. CEPA 9

G. CEPA 7

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

102

CEPA 10

L. CEPA 12

CEPA 11 K. CEPA 11

CEPA 12

J. CEPA 10

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

103

.Figura 6.22 Cromatógramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante G. Cepa 7, H. Cepa 8, I. Cepa 9, J Cepa 10, K Cepa 11, L Cepa 12, M Cepa 13, N Cepa 14

La vía de síntesis de giberelinas en microorganismos es similar a la ruta de

síntesis que realizan las plantas superiores, aunque no juegan un papel vital

en la fisiología como tal de los microorganismos. Esta ruta para las PGPRs

no ha sido reportada pero se describe la ruta de biosíntesis de isoterpenoides

(es decir la ruta del ácido mevalónico) como la ruta utilizada para la síntesis

de giberelinas; en donde el acetato y el mevalonato son considerados como

los precursores de la ruta (Rohmer, 2003). Posiblemente no todas las cepas

produjeron giberelinas debido a que no todas cuentan con la capacidad de

N .CEPA 14 CEPA 14

M. CEPA 13 CEPA 13

0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX

0 1 2 3 4 5 6 MIX

104

sintetizar dicho metabolito por la carencia de la maquinaria enzimática

necesaria para el desarrollo de esta vía de síntesis o inhibición en la

expresión de estas rutas metabólicas. Igualmente es posible que tampoco se

encontraran disponibles en el medio los precursores referenciados para la

ruta de síntesis.

También se observó que no todos las cepas evaluadas produjeron AIA,

igualmente se podría decir que la causa es la falta del pool enzimático

necesario para su síntesis (Karadeniz, et al, 2006; Bric, et al 1991); hay que

tener en cuenta los resultados detección de AIA por la reacción de

Salkowsky. El no observar producción de AIA en los cromatogramas puede

ser a un problema de detección, la cantidad de AIA en la muestra no alcanza

el límite de detección de la técnica, 0.05ug de acuerdo a los resultados de

este trabajo.

Siguiendo con la comparación de los resultados de detección de AIA por

reacción de Salkowsky y TLC, tampoco se observa una concordancia clara

entre las concentraciones de AIA y la aparición de las bandas típicas de AIA

en los cromatógramas de las cepas del bioinoculante. Esto se podría

presentar porque se pierde AIA en la extracción líquido-líquido con acetato

de etilo, por ejemplo el proceso de agitación (vortex) en la extracción no es

homogéneo entre todas las muestras, lo que no permite que las dos fases

(acuosa y orgánica) tengan el mismo contacto. Para probar esta posible

causa, alícuotas de diferentes concentraciones de patrones de los

reguladores de crecimiento se mezclaron con medio BT y se sometieron a

proceso de extracción con acetato de etilo y posterior concentración. Los

resultados de los de los cromatógramas no pudieron ser utilizados para

probar el posible problema en la extracción porque se presentó un

sobrelapamiento entre las bandas de AIA e IBA. Las corridas se repitieron

varias veces pero, el resultado de movilidad de las bandas siempre fue el

105

mismo. Adicionalmente la banda correspondiente a GA3 no se detectó,

incluso en las concentraciones más altas de las mezclas de patrones

sometidas a extracción. En el control de corrida, la banda de GA3 siempre se

detectó, lo que indica que no hubo problemas con el revelador.

6.6 BIOENSAYO PARA DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL Se realizaron tres montajes de germinación de semillas de lechuga crespa

Lollo Rossa en cámara húmeda, el primero en octubre, el segundo en

noviembre y el tercero en diciembre. En el primer y segundo montaje se

evaluó el efecto de dos productos comerciales Gibgro (Arysta LifeScience) y

Hormonagro (Colinagro), el primero a base de ácido giberélico y el segundo a

base de auxinas (ANA); también se evaluaron patrones de AIA, IBA y GA3

(Sigma-Aldrich) y un control con agua destilada. El tercer montaje se realizó

con las 16 cepas evaluadas (A. vinelandii, A. brasilense y las 14 cepas del

bioinoculante), un control con el medio de cultivo (BT) y un control con agua

destilda. En el primer montaje cada tratamiento tuvo 3 réplicas, cada una con

20 semillas, para un total de 60 semillas por tratamiento, el segundo montaje

tuvo 5 réplicas, cada una con 20 semillas, para un total de 100 semillas por

tratamiento, y en el tercer montaje se tuvo 4 réplicas, cada una con 20

semillas, para un total de 80 semillas por tratamiento, que es el número

mínimo de semillas exigido por la ISTA (2006) para este tipo de

evaluaciones.

Una vez montadas las cámaras húmedas, y establecidos los estadíos de

desarrollo de las plántulas (Figura 6.24), se procedió a determinar los índices

de germinación para el estadío 1 (Czabator, 1962; Thomson & Elkassaby.,

1993). Adicionalmente se determinaron los índices de germinación para el

resto de los estadíos (Anexo 3), gracias a que los índices utilizados no son

106

específicos para germinación. Esto son índices que según la teoría se

pueden manejar para el resto de estadíos pues lo que marcan es el cambio

de un estado a otro, mas no características como tal de ese cambio, es decir

en este caso marca por número la cantidad de plántulas que pasan del

estadío uno al dos, del dos al tres y así; igualmente también se tiene en

cuenta el tiempo de cambio de estadío. Se decidió determinar los índices

para todos los estadíos porque las semillas con las que se trabajó son

semillas certificadas, lo que indica que su germinación es casi del 100%.

Este porcentaje de germinación dificulta el poder encontrar diferencias

significativas entre los tratamientos, ya que el total de las semillas germinaría

y no se evidenciaría fácilmente el efecto de los tratamientos.

Figura 6.24 Estadíos de desarrollo Lactuca sativa L.

0 1 1a 1b 2

3 3a 3b 3c 3d

107

6.6.1 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Una vez determinados los índices para cada estadío y para cada tratamiento,

se tomaron los datos obtenidos de los tres montajes y se analizaron

buscando determinar el mejor tratamiento para todos los índices y así

establecer cual regulador de crecimiento tenia el efecto más marcado en

cada estadío en general o en determinados índices. En los montajes 1 y 2,

ninguna de las plántulas, en los seis tratamientos, presentó desarrollo hasta

el estadío 4, en los 14 días de lectura. En el montaje 3, en algunos

tratamientos, se observaron plántulas con desarrollo hasta estadío 4, pero

estos datos no se analizaron porque no se contaba con valores asociar su

comportamiento a un regulador de crecimiento específico.

Dado que se midieron diferentes indicadores, se corrió inicialmente un

análisis multivariado (MANOVA) buscando identificar si el efecto de los

tratamientos y las réplicas afectan simultáneamente a todos lo indicadores.

De acuerdo a estos estadísticos, se observó que el efecto del tratamiento si

es importante en la interacción tratamiento po replica es decir que se probó

una hipótesis del siguiente estilo: ( ) ( ) 0:.0: 10 ≠= ijij HvsH γγ , donde

Ho propone que el efecto tratamiento no es significativo en el modelo de

estudio. Los resultados de los estadísticos Lambda de Wilks, Traza de Pillai,

Traza de Hotelling y la raíz de Roy mostraron valores P menores a 0.05 para

todos los montajes, lo que indica que si hay una diferencia significativa entre

los tratamientos, llevando así a rechazar la hipótesis nula.

Luego se probó si el efecto la réplica en la interacción tratamiento*réplica

debía ser incluida en el modelo final que describe el comportamiento de las

variables. De acuerdo a los p-valores (Tabla 6.13), vemos que estos son

mayores a 0.05 entonces no se rechazaría la hipótesis nula donde se

propone que el efecto de la réplica en la interacción tratamiento*replica no es

108

significativo o igual a 0, es decir que no se encuentra variabilidad entre las

réplicas para cada tratamiento en ninguno de los tres montajes realizados.

Tabla 6.13 Análisis multivariado MANOVA para la variable réplica en la interacción tratamiento*réplica

en pruebas de bioensayos.

Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3Wilks' Lambda 0.9988 0.4183 0.7462Pillai's Trace 0.9982 0.8604 0.7016Hotelling-Lawley Trace 0.9999 0.7539Roy's Greatest Root 0.1657 0.128 0.2275

Pr > FEstadístico

El paso siguiente fue identificar el efecto de cada tratamiento en cada uno de

los índices, para cada montaje. Para esto se realizó un análisis de varianza

ANOVA (Tabla 6.14) buscando diferencias significativas para los valores

obtenidos para cada índice, en cada estadío y en cada montaje.

Tabla 6.14 Valores de P (ANOVA) para la detección de actividad de reguladores de crecimiento en

bioensayos (se incluyen las variables montaje, estadío de germinación e índices germinación, en verde

valores de p>0,05)

Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3GC NDS NDS NDS 0.4935 0.1378 0.1378 0.7103 0.7103 0.5385

GRI NDS NDS NDS 0.4935 0.4244 0.2057 0.9096 0.7103 0.5006

R50 0.0091 0.0131 0.0302 0.0038 <.0001 0.0044 <.0001 <.0001 <.0001

R50́ 0.0091 0.0131 0.0302 0.0038 <.0001 0.0044 <.0001 <.0001 <.0001

PV 0.0007 0.0105 0.0336 0.4866 <.0001 <.0001 0.0040 <.0001 0.0031

MDG 0.0183 0.0864 0.0028 0.3419 0.0008 0.0246 0.0314 0.0035 0.0197

VG 0.0037 0.0729 0.0075 0.0530 0.0002 <.0001 0.0190 0.0010 0.0071

Indice

Pr > F

Montaje 3Montaje 2Montaje 1

Según los valores de ANOVA (Tabla 6.14) no se encontraron diferencias

significativas para los índices GC y GRI para ninguno de los estadíos en

ninguno de los montajes, ya que estos índices lo que determinan son

básicamente el porcentaje de germinación total y en un periodo de tiempo. Al

ser semillas certificadas se garantiza un porcentaje casi del 100% de

109

germinación, por esto no es posible encontrar diferencias significativas entre

tratamientos para estos índices.

Al observar diferencias significativas entre la mayoría de índices para cada

estadío, se continuó con la determinación del efecto de los tratamientos en

cada índice, para así poder establecer el tratamiento de mayor significancia

en cada estadío. Para esta determinación, se corrió un análisis de

agrupamiento de medias (Duncan y LSD de Fisher). Los dos análisis

arrojaron los mismos resultados, por lo cual se decidió reportar únicamente

los resultados del análisis de Duncan.

El primer montaje fue un ensayo preliminar, en el que se evaluaron

reguladores de crecimiento grado reactivo (AIA, IBA, GA3) y comerciales

(Gibgro y Hormonagro), para asociar su actividad biológica con la

determinación de los índices en los diferentes estadíos. Para este montaje

los tratamientos que mejores resultados presentaron para el estadío 1 fueron

Hormonagro, Gibgro y GA3 para los índices relacionados con velocidad de de

germinación (R50 y R50´) (Tabla 6.15a). Hormonagro, también presentó los

mejores resultados en VG (valor de la germinación) y PV (cantidad de

semillas a germinar por día), lo cual se correlaciona con los resultados de

R50 y R50´, pues al germinar mayor número de semillas por día se

disminuye el tiempo en que germinan el total de las semillas, siendo esto

favorable pues se disminuye el tiempo de germinación. Para el estadío 2, el

tratamiento con los mayores índices fue Hormonagro, excepto para MDG,

seguido en algunos índices por Gibgro (Tabla 6.16 a). Para el estadío 3, se

observo la misma tendencia, es decir Hormonagro presentó los mayores

valores en todos los índices, seguido de Gibgro (Tabla 6.17 a)

Luego de determinar los resultados para el primer montaje, se hizo un

segundo montaje con los mismos tratamientos pero con 5 réplicas para un

110

total de 100 semillas, pues el número total de semillas por tratamiento de la

primera prueba no es representativo para estos ensayos(ISTA, 2006). En

este segundo montaje, en el estadío 1, Hormonagro y GA3 presentaron los

mayores valores para los índices R50, R50´ y VG, AIA también presentó

valores en el rango de Hormanogro y GA3 para los índices de velocidad de

germinación (R50 y R50´) (Tabla 6.15 b). El estadío 2, se ve mayormente

influenciado por GA3 y Hormonagro para todos los índices (Tabla 6.16 b). El

estadío 3 presentó efecto de GA3 para para los índices de velocidad de

germinación (R50 y R50´), y los índices de cantidad de semillas a germinar

por día (PV) y valor de la germinación (VG) están influenciados por el control

(Tabla 6.17 b).

Al comparar los datos del montaje 1 y 2 se pudo evidenciar que los

tratamientos que tienen un efecto predominante sobre los índices en los

diferentes estadíos son GA3 y Hormonagro. Las giberelinas son un regulador

de crecimiento vegetal el cual tiene la capacidad de estimular la división

celular y elongación, igualmente tienen la capacidad de romper los estados

de dormancia de las semillas, debido a que se cree que tienen un efecto

sobre el calcio, ya que al adicionar GA3 al medio aumenta la concentración

de calcio en el citosol lo que promueve la producción de enzimas hidrolíticas

como la α-amilasa, la cual hidroliza el almidón presente en el endospermo

activando así la toma de nutrientes por parte de el embrión (Taiz & Zeiger,

2006). Se podría decir que este efecto de ruptura de dormancia se ve en el

montaje 2, escogido como tratamiento control ya que cumple con los

requerimientos mínimos exigidos por la ISTA(2006). Igualmente se podría

decir que la actividad de elongación y división celular en el estadío 2 está

influenciad por GA3, pues este tratamiento presentó los mayores valores en

todos los índices, pero también hay una influencia significativa de

Hormonagro. Las auxinas son reguladores de crecimiento vegetal que

influyen principalmente en procesos de elongación de raíces y tallos,

111

igualmente promueven la iniciación de la raíz generando el desarrollo y

elongación de la radícula, y a nivel celular promueven la división y

diferenciación celular por lo que influyen en el desarrollo de tejidos y

fototropismo de las plantas (Arteca 1996, Taiz & Zeiger, 2006). Así entonces,

se podría decir que el efecto de las auxinas (Hormonagro) se ve reflejado en

los resultados observados en el estadío 2 tanto del montaje 1 como del

montaje 2, donde este tratamiento se ve como uno de los mejores agrupado

con el tratamiento GA3, quien también se reporta como un promotor de la

división celular. En estadío 2 las plántulas están pasando de emergencia de

la radícula a emergencia de hipocotilo por lo que se presenta una gran

actividad de diferenciación celular y división celular, procesos en los que se

podría ver un efecto directo tanto de las auxinas como de GA3 (Taiz & Zeiger,

2006). Para el estadío 3, es difícil determinar cual tratamiento presentó la

mayor influencia, pues en el montaje 1 predominó el efecto de Hormonagro, y

en el montaje 2 GA3 tuvo mayor influencia en los índices de velocidad.

En el tercer montaje, donde se evaluó el efecto de las cepas, se vio un efecto

más marcado para el estadío 1 de las cepas 6 y 10 en tres de los índices

representativos (R50, R50´ y PV), aunque el análisis estadístico agrupó las

cepas 6, 5, 12, 7, 10 y 8 para los índices R50 y R50´, mientras que para los

índices MDG y VG se observó como mejor tratamiento la cepa 13 (Tabla

6.15c). Para el estadío 2, se observó para los índices R50 y R50´como

mejores tratamientos las cepas 9, 13 y 12, para PV la cepa 13 seguida de la

cepa 10, para MDG las cepas 5, 10, 12, 13, y A. vinelandii, para VG las

cepas 10 y 13 seguidas por la cepa 12 (Tabla 6.16 c). Para el estadío 3, en

R50 las cepas 7, 8 y 10, en R50´, igualmente las cepas 7, 8 y 10 más la cepa

11 y el A. vinelandii, en PV A. vinelandii, al igual que para MDG y VG,

seguido en los tres casos por la cepa 10 (Tabla 6.17 c).

112

Según los datos del montaje de las cepas y comparando con los datos

obtenidos a partir del análisis de los montajes 1 y 2, se podría decir que para

el estadío 1, las cepas 6, 10 y 13 (Tabla6.18) fueron los mejores

tratamientos, ya que presentaron los valores más altos para los datos

significativos de los índices; se podría atribuir a estas cepas un efecto de

GA3. En el estadío 2, los mejores tratamientos fueron la cepa 12 y 13,

posiblemente por la producción de auxinas y/o GA3. Finalmente para el

estadío 3, los mejores tratamientos agrupados en la mayoría de los índices

fueron las cepas 10, 7 y A. vinelandii, posiblemente por la producción de

auxinas y/o GA3.

Los microorganismos como de promotores de crecimiento vegetal tienen la

capacidad de sintetizar diferentes reguladores de crecimiento vegetal como

auxinas, giberelinas y citoquininas, entre otras. Estos metabolitos

secundarios liberados al medio contribuyen de forma directa a que las

plantas desarrollen más sus tejidos radiculares y liberen exudados ricos en

carbohidratos que benefician el crecimiento y adaptación del microorganismo

en la rizosfera (Dobbelaere et al., 2003), así entonces el efecto de los

microorganismos evaluados en el bioensayo se puede ver reflejado en el

desarrollo de las plántulas, gracias a que inocular las semillas con los caldos

microbianos promovió un mejor desarrollo en comparación a tratamientos

control (agua y medio de cultivo), donde el tiempo para pasar de un estadío a

otro fue más lento.

113

Trat

Med

ia Du

ncan

Tra

tM

edia

Dunc

an T

rat

Med

ia Du

ncan

Tra

tM

edia

Dunc

an T

rat

Med

ia Du

ncan

Tra

tM

edia

Dunc

an T

rat

Med

ia Du

ncan

Ag

ua10

0A

Agua

2,33

3A

Gibg

ro36

.000

BGi

bgro

36.0

00B

Horm

o0,

5509

AIB

A0,

7027

AHo

rmo

0,230

1A

Gibg

ro10

0A

Gibg

ro2,

333

AHo

rmo

36.0

00B

Horm

o36

.000

BGi

bgro

0,45

56

BHo

rmo

0,41

BIB

A0,2

244

B A

Horm

o10

0A

Horm

o2,

333

AGA

352

.000

B A

GA

352

.000

B A

Ag

ua0,

3954

B

CGA

30,

3889

BGi

bgro

0,169

4B

A

CAI

A10

0A

AIA

2,33

3A

IBA

60.0

00A

IBA

60.0

00A

GA3

0,39

49

B C

Gibg

ro0,

3704

BGA

30,1

536

B

C

IBA

100

AIB

A2,

333

AAI

A60

.000

AAI

A60

.000

AIB

A0,

3393

CAg

ua0,

3333

BAg

ua0,1

318

D C

GA3

100

AGA

32,

333

AAg

ua60

.000

AAg

ua60

.000

AAI

A0,

3324

CAI

A0,

2263

BAI

A0,0

753

D

VGG

CG

RIR5

0R5

0´PV

MDG

a.

Trat

Med

ia

Dunc

an T

rat

Med

ia D

unca

n Tr

atM

edia

Dun

can

Trat

Med

ia D

unca

n Tr

atM

edia

Du

ncan

Tr

atM

edia

Du

ncan

Tra

tM

edia

Du

ncan

Ag

ua10

0A

Agua

1,66

7A

GA3

43.2

00B

GA3

43.2

00B

Horm

o0,

2794

AAg

ua0,

275

AHo

rmo

0,07

69A

Gib

gro

100

AGi

bgro

1,66

7A

AIA

45.6

00B

AIA

45.6

00B

GA3

0,25

08A

Gibg

ro0,

2237

1A

GA3

0,06

97A

AIA

100

AAI

A1,

667

AHo

rmo

60.0

00AB

Horm

o60

.000

ABAg

ua0,

2256

AHo

rmo

0,22

222

AIB

A0,

0511

ABG

A310

0A

GA3

1,63

3A

IBA

67.2

00A

IBA

67.2

00A

IBA

0,22

49A

AIA

0,21

098

AAI

A0,

0507

ABHo

rmo

99AB

Horm

o1,

650

ABAg

ua72

.000

AAg

ua72

.000

AAI

A0,

2064

AIB

A0,

1944

4A

Agua

0,04

82AB

IBA

98B

IBA

1,66

7B

Gibg

ro79

.200

AGi

bgro

79.2

00A

Gib

gro

0,19

72A

GA3

0,18

148

AGi

bgro

0,03

58B

GR

IG

CV

GM

DG

PV

R50

´R

50

b.

Trat

Med

ia Du

ncan

Tra

tM

edia

Dunc

an T

rat

Med

ia Du

ncan

Tra

tM

edia

Dunc

an T

rat

Med

ia Du

ncan

Tr

atM

edia

Dunc

an

Trat

Med

ia Du

ncan

Ce

pa 13

100.0

00A

Cepa

131,6

67A

Cepa

648

.000

CCe

pa 6

48.00

0C

Cepa

60,3

031

ACe

pa 13

0,268

97A

Cepa

130,0

802

AA,

vine

landi

i10

0.000

AA,

vine

landi

i1,6

67A

Cepa

548

.000

C Ce

pa 5

48.00

0C

Cepa

100,3

021

ACe

pa 10

0,237

85B

A

Cepa

100,0

727

B

A

Cepa

910

0.000

ACe

pa 9

1,667

ACe

pa 12

48.00

0C

Cepa

1248

.000

CCe

pa 13

0,296

B

AA,

vine

landi

i0,2

3479

B A

Ce

pa 12

0,068

1B

A

C

Cepa

210

0.000

ACe

pa 2

1,667

ACe

pa 7

48.00

0C

Cepa

748

.000

CCe

pa 12

0,295

8B

A

Ce

pa 8

0,230

16B

A

C

Cep

a 80,0

675

B

A

C

Ce

pa 6

100.0

00A

Cepa

61,6

67A

Cepa

1048

.000

CCe

pa 10

48.00

0C

Cepa

80,2

917

B

A

C

Ce

pa 12

0,225

69B

A

CCe

pa 6

0,062

1B

D

A C

A, br

asile

nse

98.75

0A

A, br

asile

nse

1,646

ACe

pa 8

48.00

0C

Cepa

848

.000

C Ce

pa 5

0,283

3B

A

C

Cepa

30,2

2437

B A

C

C

epa 7

0,061

8B

D

A C

Cepa

398

.750

ACe

pa 3

1,646

ACe

pa 9

51.00

0C

BCe

pa 9

51.00

0C

BCe

pa 7

0,280

2B

D

A C

Cepa

90,2

2321

B A

C

C

epa 1

40,0

611

B D

A

C

BT

98.75

0A

BT1,6

46A

Cepa

1151

.000

C B

Cepa

1151

.000

C B

Cepa

140,2

75B

D

A C

Cepa

140,2

2109

B A

C

C

epa 5

0,059

7B

D

A C

Cepa

598

.750

ACe

pa 5

1,646

ACe

pa 13

51.00

0C

B

Ce

pa 13

51.00

0C

B

Ce

pa 1

0,260

4E

B

D A

C

C

epa 1

0,217

59B

A

C

Cep

a 10,0

596

B D

A

C

Ce

pa 8

98.75

0A

Cepa

141,6

46A

Cepa

151

.000

C B

Cepa

151

.000

C B

Cepa

110,2

576

E B

D

A

C

Cep

a 70,2

1693

B A

C

A

, vin

elan

dii

0,059

4B

D

A C

Agua

98.75

0A

Agua

1,646

ACe

pa 14

54.00

0C

B

Ce

pa 14

54.00

0C

B

Ce

pa 9

0,254

9E

B

D A

C

C

epa 5

0,211

81B

A

CCe

pa 9

0,057

2B

D

A C

Cepa

1498

.750

ACe

pa 8

1,646

ACe

pa 4

57.00

0C

BCe

pa 4

57.00

0C

BA,

vine

landi

i0,2

498

E B

D

A

C

A, b

rasil

ense

0,207

38B

C

Cepa

30,0

56B

D

A C

Cepa

797

.500

ACe

pa 1

1,625

ACe

pa 2

57.00

0C

B

Ce

pa 2

57.00

0C

B

Ce

pa 4

0,248

4E

B

D A

C

C

epa 6

0,204

2B

C

A, br

asile

nse

0,047

4B

D

C

Cepa

497

.500

ACe

pa 4

1,625

ACe

pa 3

57.00

0C

BCe

pa 3

57.00

0C

BCe

pa 3

0,246

5E

B

D A

C

A

gua

0,188

66B

C

Cepa

110,0

452

D

C

Cepa

197

.500

ACe

pa 10

1,625

AA,

vine

landi

i57

.000

C B

A, vi

nelan

dii

57.00

0C

BAg

ua0,2

396

E B

D

C

Ce

pa 2

0,185

19B

C

Agua

0,045

D

C

Cepa

1297

.500

ACe

pa 7

1,625

AAg

ua57

.000

C B

Agua

57.00

0C

BCe

pa 2

0,236

9E

D

C

BT

0,182

87B

C

Ce

pa 4

0,044

8D

CCe

pa 10

97.50

0A

Cepa

121,6

25A

BT60

.000

BBT

60.00

0B

A, br

asile

nse

0,226

3E

D

Ce

pa 4

0,180

56B

C

Cepa

20,0

439

D

C

Cepa

1195

.000

ACe

pa 11

1,583

AA,

bras

ilens

e72

.000

AA,

bras

ilens

e72

.000

ABT

0,217

3E

Cepa

110,1

7593

CBT

0,039

7D

VGM

DGPV

R50́

R50

GRI

GC

c.

Tabla

6.15

Tabl

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mpa

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n Du

ncan

par

a es

tadio

1; a

. Mon

taje

1, b

. Mon

taje

2 c.

Mon

taje

3

114

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ia

Dunc

an T

rat

Med

ia

Dunc

an T

rat

Med

ia

Dunc

an T

rat

Med

ia

Dunc

an T

rat

Med

ia

Dunc

an T

rat

Med

ia

Dunc

an T

rat

Med

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Dunc

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100

AAg

ua2,

333

AHo

rmo

48.0

00C

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o48

.000

CHo

rmo

0,39

12A

Agua

0,31

349

AHo

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0,12

207

AGi

bgro

100

AGi

bgro

2,33

3A

Gibg

ro56

.000

B C

Gi

bgro

56.0

00B

C

Agua

0,31

349

BHo

rmo

0,30

463

B A

Agua

0,09

906

B A

Horm

o10

0A

Horm

o2,

333

AAg

ua60

.000

B C

Agua

60.0

00B

CGi

bgro

0,29

96C

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30,

2754

6B

AGA

30,

0803

4B

AAI

A10

0A

AIA

2,33

3A

GA3

66.0

00B

A

GA

366

.000

B A

GA3

0,29

167

C B

Gibg

ro0,

2333

3B

AGi

bgro

0,06

991

B A

IBA

100

AIB

A2,

333

AAI

A72

.000

B A

AIA

72.0

00B

AAI

A0,

2646

6C

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A0,

2219

4B

AAI

A0,

0566

9B

GA3

100

AGA

32,

333

AIB

A80

.000

AIB

A80

.000

AIB

A0,

2322

5C

AIA

0,21

33B

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0,05

227

B

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0R5

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a.

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Med

ia

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rat

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rat

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Dunc

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rat

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Dunc

an T

rat

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Dunc

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rat

Med

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Dunc

an T

rat

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Dunc

an

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100

AHo

rmo

1,66

7A

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76.8

00C

GA3

76.8

00C

GA3

0,19

775

AGA

30,

1840

1A

GA3

0,03

6661

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bgro

100

AGi

bgro

1,66

7A

Horm

o81

.600

CHo

rmo

81.6

00C

Horm

o0,

1898

5A

Horm

o0,

1803

2A

Horm

o0,

0343

58A

IBA

100

AAg

ua1,

667

AAI

A10

0.80

0B

AIA

100.

800

BAg

ua0,

1592

6B

AIA

0,15

291

BAg

ua0,

0244

44B

GA3

100

AAI

A1,

667

AIB

A10

0.80

0B

IBA

100.

800

BAI

A0,

155

BAg

ua0,

1525

3B

AIA

0,02

3928

BHo

rmo

99AB

GA3

1,66

7A

Agua

105.

600

BAg

ua10

5.60

0B

IBA

0,15

035

BIB

A0,

1494

7B

IBA

0,02

2617

BAI

A98

BIB

A1,

633

AGi

bgro

124.

800

AGi

bgro

124.

800

AGi

bgro

0,13

749

BGi

bgro

0,13

287

BGi

bgro

0,01

8366

B

GR

IG

CV

GM

DG

PV

R50

´R

50

b.

Trat

Med

ia

Dunc

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rat

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Dunc

an T

rat

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Dunc

an

Trat

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an

Trat

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Dunc

an

Trat

Med

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an

Trat

Med

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Dunc

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13

100.

000

ACe

pa 1

31,

667

ACe

pa 1

269

.000

HCe

pa 1

269

.000

G

Cepa

13

0.21

838

A

A. v

inel

andi

i0.

1921

3

ACe

pa 1

30.

0410

30

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vin

elan

dii

100.

000

AA.

vin

elan

dii

1,66

7A

Cepa

13

69.0

00H

Cepa

13

69.0

00G

Cepa

10

0.20

432

B

ACe

pa 1

00.

1907

7

ACe

pa 1

00.

0397

11

ACe

pa 9

100.

000

ACe

pa 9

1,66

7A

Cepa

969

.000

H

Ce

pa 9

69.0

00G

Cepa

12

0.20

255

B

A

C

Ce

pa 1

20.

1898

8

ACe

pa 1

20.

0392

00

B

A

Ce

pa 2

100.

000

ACe

pa 2

1,66

7A

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10

72.0

00H

GCe

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072

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F G

A. v

inel

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i0.

1965

9

B

D A

C

Cepa

13

0.18

619

A

A.

vin

elan

dii

0.03

8149

B

ACe

pa 6

100.

000

ACe

pa 6

1,66

7A

Cepa

772

.000

H

G

Cepa

772

.000

F G

Cepa

60.

1881

6

B

D A

C

Cepa

50.

1824

4

ACe

pa 5

0.03

4658

B

AA,

bra

sile

nse

98.7

50A

A. b

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lens

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646

ACe

pa 6

75.0

00 F

H

G

Cep

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75.0

00F

G

Ce

pa 9

0.18

571

B

D

C

Ce

pa 9

0.17

593

B

ACe

pa 9

0.03

2771

B

A

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pa 3

98.7

50A

Cepa

31,

646

ACe

pa 1

78.0

00F

H

E

G

Cep

a 1

78.0

00F

G

E

Ce

pa 5

0.18

452

B

D

C

Ce

pa 1

40.

1738

0

B

A

C

C

epa

60.

0322

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B D

A

C

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1,64

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inel

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F H

E

D

G

A.

vin

elan

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81.0

00F

G

E D

Cep

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0.18

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B

D

C

Ce

pa 1

0.17

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B

A

C

Cep

a 1

0.03

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B

D

A C

Ce

pa 5

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50A

Cepa

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646

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pa 8

84.0

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H

E D

G

Cepa

884

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F G

E

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pa 1

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4

B

D E

C

Cepa

60.

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B

A

C

C

epa

70.

0308

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B D

A

C

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F H

E

D

G

Ce

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D

C

epa

10.

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3

B

D E

C

Cepa

80.

1692

1

B

D A

C

Ce

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40.

0308

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B D

A

C

Agua

98.7

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587

.000

F H

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D

C G

Cepa

587

.000

F G

E

D

C C

epa

80.

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1

F

B D

E

C

Cepa

11

0.16

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B

D

A

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Cepa

11

0.03

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B

D

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Ce

pa 1

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ACe

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B

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C

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F B

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D

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epa

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F

B D

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C

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70.

1671

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B

D A

C

Ce

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0.03

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B

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pa 4

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B

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C

Cepa

14

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B

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C

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F

D

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B

D

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B D

C

Ce

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00B

E

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396

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C

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F

D

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B

D

A

C

Cepa

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B D

C

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B

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C

Ce

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Ce

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F

D

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B

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C

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12

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B

A

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B

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Cepa

12

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108.

000

B

A

Agua

108.

000

B

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1481

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F

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bra

sile

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3.00

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A. b

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lens

e12

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A. b

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lens

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1401

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3

115

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80.0

00B

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rmo

80.0

00B

Ho

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0,26

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ro10

0A

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333

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88.0

00B

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88.0

00B

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AAI

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0354

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108.

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AIB

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0A

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0,19

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GA3

0,16

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0319

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0A

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Agua

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AAg

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0A

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0,16

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IBA

0,16

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0282

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GM

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a.

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edia

Du

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4.80

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98.7

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108

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8D

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80,

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116

Tabla 6.18 Resultados de los mejores tratamientos para los montajes 1 y 2 de evaluación de

reguladores, y montaje 3 de evaluación de microorganismos.

Estadío Regulador (Montajes 1 y 2) Tratamiento (Montaje 3)1 Hormonagro y GA3 Cepas 6, 10 y 132 Hormonagro y GA3 Cepas 12 y 13

3 Hormonagro, GA3 y control (H2O)Cepas 10, 7 y Azotobacter vinelandii

6. 7 ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN GENERAL

Se evaluaron diferentes técnicas para la detección de reguladores de

crecimiento vegetal, específicamente ácido indol acético y giberelinas. Se

hizo una estandarización para detección colorimétrica de AIA con el reactivo

de Salkowsky preparado con ácido sulfúrico como técnica cuantitativa, y

cromatografía de capa fina como técnica cualitativa, tanto para AIA como

para GA3. También se buscó la estandarización de un bioensayo que nos

permitiera determinar los efectos específicos de diferentes reguladores de

crecimiento (grado reactivo y comerciales), para poder precisar el efecto de

la inoculación de semillas con caldos microbianos y así establecer la

actividad biológica de los diferentes microorganismos evaluados.

La técnica de Salkowsky fue evaluada con distintas mezclas de ácido

sulfúrico y cloruro férrico (Glickman & Dessaux, 1995), debido a que la

formula original del reactivo es a base de ácido perclórico, pero por

inconvenientes de importación y restricción de venta, se buscó un ácido que

pudiera brindar los mismos resultados o muy similares a los obtenidos con

Salkowsky preparado con ácido perclórico. Se buscó el reactivo (H2SO4-

FeCl3) y proporciones de reacción que mostraran la sensibilidad, precisión y

similitud de color a la reacción con Salkowsky-HClO4. Teniendo en cuenta

estas condiciones se escogió el reactivo R1m, descartando otros reactivos

117

que aunque en algunos casos mostraron sensibilidad mayor presentaban

gama de color diferente a la de la reacción por oxidación del grupo indol por

Salkowsky-HClO4. (Bric et al., 1991; Gordon & Weber, 1950)

Una vez estandarizada la técnica colorimétrica de Salkowsky con el reactivo

R1m, se montaron cultivos con cepas referenciadas como productoras de

AIA. Se utilizaron dos cepas, A. vinelandii y A. brasilense, en las cuales se

observo la producción de AIA con un comportamiento lineal en aumento en

función del tiempo, corroborando estudios realizados esta y otras cepas de A.

vinelandii (Duque & Quintana, 2008; Zakharova et al, 1999) y otras cepas de

A. brasilense (Zakharova et al., 1999). Se estableció como control positivo

para la producción de AIA a la cepa de A. vinelandii por buena producción de

AIA (80ug/ml) comparado con A. brasilense que produjo menos de 10 ug/ml.

La cepa de referencia A. vinelandii (ATCC12518) no está caracterizada como

una cepa productora de AIA en el catalogo de cepas de referencias de la

ATCC, mientras que A. brasilense (ATCC29145) si está caracterizada como

cepa productora de AIA, esto no concuerda con los resultados obtenidos en

el estudio.

También se buscó un medio de cultivo sencillo y económico que promoviera

la síntesis de los reguladores de crecimiento y que al mismo tiempo

permitiera una buena producción de biomasa. Se probaron tres medios de

cultivo, TSB como medio enriquecido y se comparó con el medio B (et al,

1984), que es un medio mineral para microorganismos del suelo, y el mismo

medio B con suplemento de triptona, como fuente de triptófano para

inducción de producción de AIA. El triptófano actúa como precursor principal

en la vía de síntesis del ácido indol acético, debido a que es el origen del

grupo indol presente en el AIA (Taiz & Zeiger, 2006; Vasanthakumar &

Mcmanus, 2004; Zakharova et al., 1999). En la mayoría de estudios se utiliza

L-triptófano para inducir la síntesis de AIA, pero al buscar estandarizar

118

técnicas sencillas y al mismo tiempo económicas, se decidió trabajar con

triptona, un suplemento económico y ampliamente utilizado en laboratorios

de microbiología convencionales. La triptona no solo es fuente de triptófano

sino también es fuente de carbono y nitrógeno orgánico fácilmente asimilable

por todos los microorganismos. Se determinó, al observar el comportamiento

en crecimiento de las cepas y la producción de AIA, que el medio B

suplementado con triptona (BT) es un medio óptimo tanto para el desarrollo

microbiano como para la promoción de producción de AIA. Se descartó el

medio B sin suplemento, ya que en este no se observó un buen desarrollo

microbiano y además no se detecto la presencia de AIA, pero permitió

comprobar que los microorganismos evaluados poseen rutas metabólicas

dependientes de triptófano para la biosíntesis de AIA.

La técnica de cromatografía de capa fina fue evaluada probando 16 sistemas

de solventes, buscando uno que lograra la separación y detección de

reguladores de crecimiento vegetal como AIA, IBA y GA3, y así lograr una

determinación de los tres reguladores en una misma corrida, pues no se

encontraron reportes de sistemas de solventes que permitieran la resolución

de auxinas y giberelinas. La fase móvil cloroformo : etilacetato : ácido acético

(50:30:20) permitió movilidad y separación de los tres reguladores, y el

reactivo de tinción también permitió la detección de los tres reguladores en

los cromatogramas. El reactivo es una modificación del reactivo de

Salkowsky con H2SO4 que permite detección de auxinas de grupo indol en

luz visible y detección de giberelinas en luz UV de onda larga (366nm).

Aunque este método de detección es cualitativo, tiene la ventaja de poder

diferenciar entre auxinas derivadas del indol, ácido indol acético y ácido indol

butírico.

Una vez estandarizada la técnica de detección de reguladores por TLC, fue

utilizada para evaluar la producción de reguladores AIA, IBA, GA3 para las

119

muestras obtenidas a partir de los cultivos microbianos, observándose una

producción de AIA y GA3 por las cepas 4 y 5 mientras que la producción de

AIA fue determinada en las cepas 2 y 9, y la producción de GA3 fue

observada en las cepas 10, 11 y 12. Las cepas de referencia mostraron

producción de AIA pero no de GA3. La cepa de A. vinelandii no está

caracterizada como productora de GA3, pero la de A. brasilense si lo está

(Díaz L.A., 2006, comunicación personal).

Los resultados del bioensayo mostraron que dentro de los 7 índices de

desarrollo evaluados no se presentó diferencia significativa para los índices

GCs y GRI, se determinó una tendencia general por estadío mostrando para

los montajes 1 y 2, que el estadío 1 está influenciado por GA3 y auxinas

(Hormonagro), el estadío 2 también está influenciado por GA3 y Hormonagro,

al igual que el estadío 3, aunque en este estadío es más difícil establecer la

relación por que los montajes 1 y 2 tienen comportamientos diferentes, en el

montaje 1 predomina el efecto de Hormonagro y en el montaje 2 GA3. En el

montaje 3, en el estadío 1 se observaron los índices más altos para las cepas

6 y 10, para el estadío 2 las cepas 12 y 13, y para el estadío 3 las cepas 7 ,

8, 10 y A. vinelandii.

La detección de reguladores a partir de TLC representa la técnica más

amplia, en el sentido de poder determinar tres reguladores de crecimiento en

un solo montaje, y también permite resolución entre auxinas de origen

indólico, pero no es una técnica altamente sensible. El límite de detección de

esta técnica para los tres reguladores (AIA, IBA y GA3) fue establecido a

0.05ug, pero al comparar los resultados de detección de AIA con TLC y los

del reactivo de Salkowsky no se presenta asociación para todas las muestras

evaluadas. La prueba se Salkowsky mostró resultados positivos para todas

los micrrorganismos, aunque algunos en bajas concentraciones, mientras

que en TLC solo se detectó AIA en las cepas de referencia y las cepas 2, 4, 5

120

y 9, siendo las cepas 2, 4 y 9 unas de las cepas con mayores

concentraciones de AIA en cultivo (determinado por Salkowsky-R1m). Lo

contradictorio de esta observación es que la cepa 5 presenta bajas

concentraciones de AIA en cultivo. En el caso de las cepas que presentan

resultados positivos con Salkowsky y no muestran detección en TLC, no se

puede hablar de inespecificidad del reactivo de Salkowsky, pues este detecta

anillos indol en general (Salkowsky, 1889). En el caso que de Salkowsky

estuviera detectando otros compuestos indólicos, se observarían bandas de

color rosado-fucsia con Rf diferentes a del AIA, y este no fue el caso para

dichas cepas; incluso no se observaron bandas con la coloración y Rf propios

de IBA. La razón de por qué se detecta AIA por Salkoswsky y no TLC está

más encaminada a un problema en el momento de la extracción líquido-

líquido con acetato de etilo, como ya se mencionó en el numeral 6.5.

La cepa de referencia A.vinelandi ATCC12518, presentó resultados acordes

en todas las técnicas estandarizadas en este trabajo, ya que se observó en

TLC, la producción de AIA con una escala de color acorde a la producción en

el tiempo entre los días 1 y 6, la determinación de auxinas por Salkowsky fue

positiva obteniéndose una de producción máxima de no menos de 80 ug/ml

los cuales, se confirmó por TLC corresponden a AIA, y finalmente en el

bioensayo se presentó como uno de los mejores tratamientos en el estadío 3,

que previa estandarización fue catalogado como un estadío altamente

influenciado por auxinas, lo cual confirma los resultados obtenidos con esta

cepa.

De acuerdo los resultados, la cepa 10 que se muestra como productora de

GA3 en TLC, exhibe la misma producción de GA3 en el bioensayo ya que se

vió como uno de los mejores tratamientos para el estadío 1 el cual, según los

montajes de bioensayo 1 y 2 fue el más influenciado por GA3, al igual que

para el estadío 3, influenciado por GA3 y auxinas, en donde se confirmaría la

121

acción de GA3 como único regulador producto del metabolismo de la cepa 1,

teniendo en cuenta que el valor máximo de producción de AIA según prueba

de Salkowsky fue de 4ug/mL.

Las cepas 11 y 12 también mostraron alta producción de GA3 en TLC, lo cual

concuerda con los datos obtenidos en el bioensayo donde se observa como

uno de los mejores tratamientos en el estadío 2, el cual está influenciado por

GA3 y auxinas, mientras que la cepa 11 se mostró como el mejor tratamiento

para el estadío 3.

La comparación entre los resultados del bioensayo y la producción de AIA en

reacción colorimétrica (mayores índices en estadío 2 y máximo de 16ug/ml

de AIA), propone a la cepa 13 como productora de auxinas, aunque no se

haya detectado producción en TLC. Lo mismo pasa con la cepa 8, que tiene

altos índices en el estadío 3.

Se confirmó que la síntesis de reguladores de crecimiento tiene un efecto

directo en la promoción del desarrollo de las plántulas de lechuga, pero

también los intermediarios de las rutas de biosíntesis de estos reguladores

puede tener un efecto indirecto de promoción de desarrollo sobre las

plántulas porque pueden inducir a la activación de la rutas de biosíntesis de

hormonas reguladoras de crecimiento en las plántulas (Bric et al., 1991;Taiz

& Zeiger, 2006).

122

7. CONCLUSIONES

• El reactivo Salkowsky a base de acido sulfúrico R1m, se estableció

como el reactivo de comportamiento similar al de ácido perclórico,

siendo el más indicado para ser utilizado en la técnica de detección

colorimetrica.

• Se estableció el medio BT como apto para la producción de biomasa

microbiana y AIA, al compararlo con TSB.

• La triptona utilizada en el medio BT es una buena fuente de triptófano,

y de otros nutrientes favoreciendo la producción de biomasa

microbiana y AIA.

• Se determinó a la cepa de Azotobacter vinelandii (ATCC12518) como

control positivo para producción de AIA, comparada con al cepa de

Azospirillum. brasilense (ATCC 291459) caracterizada como

productora de AIA.

• Se estableció como día óptimo de muestreo para cepas productoras

de AIA el día 4 en fermentación discontinua en medio BT.

• Las pruebas colorimétricas evaluadas para detección y cuantificación

GA3 no son específicas para giberelinas, solo se pueden utilizar para

cuantificar soluciones puras de giberelinas.

• Para la detección de AIA, IBA y GA3 por TLC, en una misma corrida

cromatográfica, se determinó como fase móvil cloroformo : etilacetato :

acido acético (50:30:20) y como revelador H2SO4 60% - FeCl3 28mM.

• En la estandarización del bioensayo de germinación de semillas de

lechuga, se determinarón auxinas (Hormonagro) y GA3 como los

reguladores de mayor influencia en los estadíos de desarrollo 1 y 2.

• Las cepas evaluadas son dependientes del triptófano para la

produccion de AIA.

123

• Se evaluó la producción de AIA y GA3 por parte de las cepas de

bioinoculante acelerador de compostaje, donde las cepas 4 y 5 fueron

las únicas productoras de los dos metabolitos, las cepas 2 y 9 se

definieron como productoras de AIA, y las cepas 10, 11 y 12 como

productoras de GA3, de acuerdo a la prueba de TLC.

• La prueba de Salkowsky determinó a las cepas 2, 3 y 9 como las de

producción más alta de AIA.

• El bioensayo en semillas de lechuga asoció a las cepas 6, 10, 12 y 13

como productoras de auxinas y AIA.

124

8. RECOMENDACIONES

• La prueba de TLC puede establecerse como cuantitativa, con ayuda

de programas de densitometría de libre acceso en Internet. Debe

establecerse una curva de calibración por intensidad de color en

función de concentración de patrones. Esta recomendación se hace

porque en los cromatogramas de las cepas de referencia se observó

claramente el aumento de intensidad de color en función de tiempo,

acorde a los resultados de cuantificación de AIA en el curso de tiempo

del cultivo. Para la cuantificación de auxinas con grupo indol, esta

estandarización no implica altos costos porque solo re requiere de un

scanner o una cámara digital convencional. La cuantificación de

giberelinas si implicaría mayores costos pues es indispensable contar

con una lámpara de UV onda larga de buena intensidad y de una

cámara digital de sistema óptico altamente sensible. Lo ideal es contar

con un densitómetro, pero este no es un equipo que fácilmente se

encuentre en un laboratorio de microbiología y adicionalmente es un

equipo de un costo elevado.

• Probar la eficacia de la extracción de reguladores de crecimiento,

específicamente AIA, por extracción líquido-líquido haciendo

cuantificación por reacción con Salkowsky.

• Evaluar la posibilidad de elevar el límite de detección de reguladores

de crecimiento por TLC, usando placas HPTLC, que aunque tienen un

costo elevado, permiten la detección de metabolitos en

concentraciones de ng/mL.

• Confirmar las concentraciones límite de detección de TLC por

cuantificación en HPLC.

125

• Hacer varias repeticiones, en tiempos diferentes, de los montajes de

los bioensayos, incluyendo otras formulaciones comerciales de

reguladores de crecimiento y ANA grado reactivo, para así confirmar la

asociación de los tratamientos a los índices calculados para los

diferentes estadíos de desarrollo.

• Montar los bioensayos con semillas de especie con germinacion y

desarrollo más lento, pero que sean fácilmente asequibles a un

laboratorio de microbiología, para poder encontrar más fácilmente

diferencias significativas entre los índices y los estadíos de desarrollo.

En este trabajo también se hicieron ensayos con semillas de fríjol,

montando curvas para determinar tiempo óptimo de imbibición, pero la

rápida contaminación de las semillas por hongos y bacterias no

permitió hacer la evaluación de todos los estadíos de desarrollo. Es

posible minimizar la contaminación con el uso productos como

Mancozeb.

• Continuar caracterizando las cepas del bioinoculante como PGPB,

evaluando por ejemplo fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos,

producción de sideróforos y capacidad antagónica, entre otras. El

interés en esta caracterización es muy particular, pues las 14 cepas de

este inoculante están definidas como cepas termófilas, pero en este

estidio probaron crecer bien en condiciones de mesofilia,

adicionalmente producen reguladores de crecimiento vegetal, y en el

bioensayo se confirmó que pueden promover el desarrollo de plántulas

de lechuga. Todo esto implica que su actividad no solo aplica a nivel

de aceleración del proceso de compostaje, si no también a nivel de

promoción de crecimiento vegetal. No se encuentran reportes de

bioinoculantes que tengan estas dos actividades.

126

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134

ANEXO 1 MEDIO TSB (Caldo tripticasa soya)

MEDIO B

MEDIO BT (B MODIFICADO)

COMPOSICION g/L Glucosa 2,5 Peptona de caseína 17 Peptona de soya 3 NaCl 5 K2HPO4 2,5

COMPOSICION g/L Glucosa 5 K2HPO4 1 NH4NO3 0,4 NaCl 0,2 MgSO4·7H2O 0,4

COMPOSICION g/L Glucosa 5 K2HPO4 1 NH4NO3 0,4 NaCl 0,2 MgSO4·7H2O 0,4 Triptona 20

135

ANEXO 2 GRAFICAS PRODUCCION DE AIA Azotobacter vinelandii 1. Montaje 1

PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. vinelandii en medio BT

012345678

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N AI

A (u

g/m

l)

PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. vinelandii EN MEDIO TSB

-5

0

5

10

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)CO

NCEN

TRAC

IO A

IA

(ug/

ml)

2. Montaje 3

PRODUCCION DE AIA A. Vinelandii EN MEDIO BT(Montaje 3)

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N AI

A (u

g/m

l)

Producción AIA Azotobacter vinelandii en medio TSB (Montaje 3)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo (Dias)

Conc

entr

ació

n AI

A (u

g/m

l)

136

Azospirillum brasilense 3. Montaje 1

PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. brasilense

00,5

11,5

22,5

33,5

4

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N A

IA

(ug/

ml)

PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) A. brasilense EN MEDIO TSB

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

DE

AIA

(ug/

ml)

Cepas bioinoculante PRODUCCION DE AIA EN MEDIO BT 4. CEPA 1

PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 1

0,005,00

10,0015,0020,0025,0030,0035,0040,0045,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N DE

AIA

(u

g/m

l)

5. CEPA 2

PRODUCCION DE AIA ug/ ml CEPA 2

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CON

CENT

RACI

ON D

E AI

A (u

g/m

l)

137

6. CEPA 3


0,005,00

10,0015,0020,0025,0030,0035,0040,0045,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CON

CEN

TRAC

ION

DE

AIA

(ug/

ml)

7. CEPA 4


0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Dïas)

CON

CEN

TRAC

IO D

E AI

A ug

/ml

8. CEPA 5

PRODUCCION AIA (ug/ ml) CEPA 5

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N DE

AIA

(u

g/m

l)

138

9. CEPA 6


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N DE

AIA

(u

g/m

l)

10. CEPA 7


-0,05

0

0,05

0,10,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N DE

AIA

(u

g/m

l)

11. CEPA 8


0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N DE

AIA

(u

g/m

l)

139

12. CEPA 9


0,005,00

10,0015,0020,0025,0030,0035,0040,0045,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N D

E AI

A (u

g/m

l)

13. CEPA 10


0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CON

CEN

TRAC

ION

DE

AIA

(ug/

ml)

14. CEPA 11


0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N DE

AIA

(u

g/m

l)

140

15. CEPA 12


0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,50

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CONC

ENTR

ACIO

N D

E AIA

(u

g/m

l)

16. CEPA 13


0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CON

CEN

TRAC

ION

DE A

IA

(ug/

ml)

17. CEPA 14


0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (Días)

CON

CEN

TRAC

ION

EN

AIA

(u

g/m

l)

estandarizaciÓn de mÉtodos de detecciÓn para

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