Espectroscopia 2DJ homonuclear - HOMO2DJEspectroscopia 2DJ homonuclear - HOMO2DJ

• Las secuencias 2D que vimos hasta ahora son utiles para determinar conectividad en sistemas de espines. Hay muchas cosas mas que podemos extraer con experimentos 2D en que tomamos ventaja de la dispersion de señales.

• Una de las peores cosas que nos puede pasar es tener una muestra llena de acoples con multiplicidad interesante pero donde todas las señales estan solapadas. Podemos solucio- nar este problema usando mas dimensiones.

• Esto es justamente para lo que usamos al HOMO2DJ. La idea es poner informacion sobre ’s en un eje y sobre J’s en el otro.

• La secuencia de pulsos es una variacion del eco de espin en la que el tiempo del eco aumenta progresivamente entre experimentos:

• Lo analizamos para un triplete y un doblete.

18090

t1 / 2 t1 / 2

HOMO2DJ - TripleteHOMO2DJ - Triplete

• Como la secuencia es un eco homonuclear, estamos re- enfocando corrimientos quimicos qualquiera sea el teimpo t1. Para un triplete en resonancia con un acople J tenemos:

• Para distintos t1’s, los diagramas al final van a ser distintos:

x

y

x

y

t1 / 2

x

y

x

y

t1 / 2

x

y

x

y

x

y

90

180

t1 ≈ 0 t1= 1 / 2J t1 > 1 / 2J

HOMO2DJ - Triplete (continuado)HOMO2DJ - Triplete (continuado)

• El pico central va a variar solo con la relajacion transversal (T2).

• Los componentes chicos del triplete van a variar periodicamente en funcion de t1 y el acople J:

A(t1) = Ao * cos( J * t1 )

• En este caso o = 0

porque estamos en resonancia.

• En la dimension t2 (f2), la que corresponde con la FID ‘real,’ todavia tenemos informacion de frecuencia (los corrimientos quimicos de los picos del multiplete). Si tratamos de armar una ‘ecuacion’ con esto:

A(t1, t2) cos( J * t1 ) * trig( o * t2 ) * trig( J * t2 )

o

o + J o - J

HOMO2DJ - Triplete (…)HOMO2DJ - Triplete (…)

• Esto es todo el proceso con datos reales para un triplete. Primero los datos en t1 y f2:

• FIDs que obtenemos a lo largo de - J, , y + J en t1 y sus respectivas TFs:

TF

TF

TF

HOMO2DJ - Triplete (mas…)HOMO2DJ - Triplete (mas…)

• Cosiderando ya sea el stack-plot o la seudo-ecuacion, una tranformada de Fourier en t2 y t1 nos da un espectro 2D con corrimientos quimicos en el eje f2 y acoples en el eje f1 Como reenfocamos los corrimientos quimicos en el periodo t1, todos los picos en el eje f1 estan centrados en 0 Hz:

• Nuevamente, como la informacion en las dimensiones f1 y f2 es distinta, el espectro 2D no es simetrico.

• Ahora es facil darse cuenta lo que le va a pasar a un doblete con un acople de J Hz en resonancia (o no)…

(f2)

J (f1)

o

o + J o - J

0 Hz

- J

+ J

HOMO2DJ - DobleteHOMO2DJ - Doblete

• Despues del pulso de 90 y un cierto tiempo t1, los dos vectores van a estar desfasados + J / 2 * t1 y - J / 2 * t1. Para t1 < 1 / 4J:

• Para distintos t1’s, vamos a ver una variacion en los dos picos en funcion del cos( J / 2 * t1 ).

• Despues de la TF en t1 y t2, el espectro 2D es el mismo, pero tenemos solo dos cross-peaks...

x

y

x

y

x

y

t1 / 2180

(f2)

J (f1)

o

o + J / 2 o - J / 2

0 Hz

- J / 2

+ J / 2

HOMO2DJ - ‘Tilting’HOMO2DJ - ‘Tilting’

• Si ponemos al triplete y al doblete juntos (ya sea que esten acoplados o no) obtenemos:

• Se ve claramente que hay informacion redundante en el eje f2. Como los cross-peaks estan torcidos exactamente 45 grados, podemos rotarlos en la computadora y alinearlos con los corrimientos quimicos. Esto se llama ‘tilting’.

(f2)

J (f1)

ot od

0 Hz

(f2)

J (f1)

ot od

0 Hz

HOMO2DJ - Muchas señalesHOMO2DJ - Muchas señales

• Si tenemos un espectro complicado vemos la ventaja. Para un 1H-1D que tiene esta apariencia:

• Tenemos toda la informacion sobre corrimientos quimicos () en el eje f2, y toda la informacion sobre acoples (J) en el eje f1.

• Obtenemos un espectro HOMO2DJ que tiene todo resuelto en ’s y en J’s:

(f2)

J (f1)

0 Hz

HOMO2DJ - ConclusionHOMO2DJ - Conclusion

• Otra ventaja es que si proyectamos al espectro sobre el eje , obtenemos un espectro 1D 1H ‘desacoplado’ de 1H:

• Ademas, como tomamos entre 128 a 256 experimentos en t1

tenemos esa cantidad (mas zero-filling) de puntos definiendo a las constantes J, cuyos valores andan entre 1 y 20 Hz.

• Para 50 Hz y 256 (+256) experimentos en t1, nos da 0.09 Hz / punto. Podemos medir Js con mucha precision en f1...

J

0 Hz

HOMO2DJ - Datos reales (II)HOMO2DJ - Datos reales (II)

• Estos son resultados para el etilcrotonato a 400 MHz...

• Notar la resolucion que tenemos en el multiplete a 5.7 ppm...

1D

2DJ

Con tilting...

Sin tilting...

O

OH

Espectroscopia 2DJ heteronuclearEspectroscopia 2DJ heteronuclear

• ¿Podemos hacer una variacion de la secuencia de eco de espin para obtener el mismo tipo de informacion en un sistema heteronuclear?

• En el caso homonuclear vimos que para lograr esto lo unico que hay que hacer es modificar el periodo en el eco de espines entre experimentos.

• Haciendo algo similar podemos separar corrimientos quimicos de 13C y constantes de acoplamiento hetero- nuclear (JCH). El experimento se llama HETRO2DJ, y la secuencia de pulsos involucra 1H y 13C:

• Baicamente la version 2D del APT...

180y90x

t1 / 2 t1 / 2

180y

{1H}1H:

13C:

Espectroscopia 2DJ heteronuclear (mas...)Espectroscopia 2DJ heteronuclear (mas...)

• Como para el HOMO2DJ, analizamos lo que le pasa a un doblete y a un triplete (i.e., a un CH y a un CH2…). Para un CH2:

• El primer pulso de 90 grados pone todo en el plano <xy> donde los vectores se empiezan a mover en direccion opuesta (aca tambien lo hacemos en resonancia para simplificar el analisis…).

• Despues de la mitad del eco de espin, aplicamos el pulso de 90 grados a los carbonos, que los invierte, y el pulso de 180 a los protones, que como vimos ya varias veces, invierte las marcas de los vectores de magnetizacion de 13C.

x

y

x

y

t1 / 2

x

y

90

180 (13C)

x

y

180 (1H)

Espectroscopia 2DJ heteronuclear (y mas…)Espectroscopia 2DJ heteronuclear (y mas…)

• Durante la segunda mitad del periodo del eco de espin, los vectores continuan desfasandose porque invertimos las marcas de los protones.

• Ahora, cuando prendamos el desacoplador todo se torna estatico, y las componentes de la magnetizacion que quedaron en el eje y se cancelan. Las componentes en el eje x no estan afectadas, y su intensidad va a variar periodicamente con el acople JCH. Para distintos t1’s:

x

y

x

y

x

y

t1 ≈ 0 t1= 1 / 2J t1 = 1 / J

x

y

t1 / 2

x

y

{1H}

Espectroscopia 2DJ heteronuclear (...y mas)Espectroscopia 2DJ heteronuclear (...y mas)

• Vemos que la señal central del triplete no esta afectada. En cambio, los otros dos picos van a tener una variacion periodica con el tiempo que depende de JCH.

• Si hacemos los numeros, vemos que la intensidad de lo que obtenemos en el dominio t1 tiene una componente constante (el pico del medio, Alm) mas una componente variable (las componentes de afuera del triplete, Ala):

• Acrodarse que Alm = 2 * Ala

• En la dimension t2 (f2), la que corresponde con la FID real, todavia tenemos informacion de corrimientos quimicos (los de los carbonos desacoplados). Si tratamos de armar una seudo-ecuacion:

A(t1) = Alm + 2 * Ala * cos( J * t1 )

o

A(t1, t2) cos( J * t1 ) * trig( o * t2 )

t1 = n / J

t1 = n / 2J

HETERO2DJ - TripleteHETERO2DJ - Triplete

• Si consideramos el stack-plot o la seudo-equation, una transformada de Fourier en t2 y t1 nos da un espectro 2D con corrimientos quimicos en el eje f2 y acoples en el eje f1. Como reenfocamos corrimientos quimicos durante t1, todos los picos en el eje f1 estan centrados en 0 Hz:

• Si pensamos en las distintas componentes que tenemos en la seudo-ecuacion, tambien vemos que va a haber una componente constante (el pico central) que nos va a dar una frecuencia de 0 en f1 (el pico del medio), mas una señal que varia con cos( JCH * t1 ), que despues de la TF nos da cross-peaks a +JCH y -JCH.

• A diferencia del HOMO2DJ enque teniamos informacion de JHH en las dos dimensiones, en este caso desacoplamos 1H durante la adquisicion, osea que removemos acoples JCH del eje f1.

(f2)

J (f1)

0 Hz

- J

+ J

HETERO2DJ - DobleteHETERO2DJ - Doblete

• Podemos hacer el mismo analisis para un doblete (o un cuarteto, que daria casi lo mismo…).

• Despues del pulso de 90 y el periodo t1 / 2, los dos vectores se van a desfasar como hemos visto n-veces...

• Como vimos con el triplete, los dos pulsos de 180 van a invertir los vectores (el pulso en 13C) y las marcas (el pulso en 1H). Esto significa que los dos vectores se van a seguir desfasando durante el segundo periodo del eco (t1 / 2).

x

y

x

y

t1 / 2

x

y

90

180 (13C)

x

y

180 (1H)

HETERO2DJ - Doblete (continuado)HETERO2DJ - Doblete (continuado)

• Cuando prendemos el desacoplador de 1H, las cosas quedan estaticas con respecto a los acoples. Esto es analogo a lo que vimos para el triplete…

• Si mirasemos a la señal que vamos a tener para distintos valores de t1, obtenemos:

• Hay que notar que en este caso el ‘cero’ es a 1 / J porque los vectores se estan moviendo mas ‘lento’ que para el triplete (i.e., se mueven a J / 2 * t en vez de a J * t...).

x

y

x

y

x

y

t1 ≈ 0 t1= 1 / J t1 > 1 / J

x

y

t1 / 2

x

y

{1H}

HETERO2DJ - Doblete (mas...)HETERO2DJ - Doblete (mas...)

• Mirando a las distintas rebanadas que nos dan despues de la TF en f2, vemos algo asi:

• En este caso la señal va a alternar de positiva a negativa en todos los multiplos de 1 / J…

• Luego de la segunda TF (en f1), el 2D quedaria asi:

o

t1 = n / J

t1 = n / 2J

(f2)

J (f

1)

o

0 Hz

- J / 2

+ J / 2

• Como para el triplete, no tenemos acoples en f2 (13C) porque desacoplamos durante la adquisicion en t2.

H3C

H3C CH3

O

H

HETERO2DJ - ConclusionHETERO2DJ - Conclusion

• Los problemas de este experimento son la relajacion, y que con un DEPT obtenemos la misma informacion en mucho menos tiempo. Es mas ‘didactico’ que otra cosa...

• Este espectro fue tomado con un Eft-90 a 22 MHz...

CH

CH2

Separando la paja del trigo:* Una brevisimaSeparando la paja del trigo:* Una brevisimaintroduccion al ciclado de fasesintroduccion al ciclado de fases

• Generalmente, hasta la secuancia de pulsos mas simple (90-FID) genera mas informacion de la que queremos.

• A pesar de que hasta ahora solo lidiamos con sistemas de espines ideales que dan señales ‘buenas,’ en el mundo real hay muchas cosas que pueden aparecer en un espectro que en realidad no queriamos. Algunos ejemplos son:

• Imperfecciones en los tiempos de pulso. Muchas veces un pulso no es exactamente 90, y no toda la magnetization en z termina en el plano <xy>:

*Esto no es idea mia. Es una sugerencia de Ray Freeman...

z

x

y

z

y

x

z

y

x

‘90’y

< 90

Ciclado de fases (continuado)Ciclado de fases (continuado)

• Fases incorrectas en los pulsos. En vez de estar exactamente en <x> o <y>, el pulso va a tener un pequeño desfasaje :

• Imperfecciones en los periodos de tiempo. Artefactos de este tipo resultan en cancelacion (o maximizacion) incompleta de señales en experimentos de pulsos multiples como ser el eco de espin. • Artefactos de ‘ruido-blanco’. Ruido de frecuencia continua, que genera un ‘spike’ a la misma frecuencia todo el tiempo. • Vibraciones. Si el iman vibra (frecuencias), la sonda (‘probe’) vibra, y eso lo vemos en el espectro...

• Todo esto va a dejar señales espureas en nuestro espectro 1D: ‘Spikes,’ lineas de base onduladas, ‘side-bands,’ etc.

• A medida que vamos a dimensiones mas altas, las cosas se tornan cada vez peor, y de acuerdo con la Ley de Murphy, lo que queremos ver decae o se cancela y lo que no queremos crece y crece...

z

x

y

z

y

xB1

90 ‘y’

Ciclado de fases (mas...)Ciclado de fases (mas...)

• Digamos que tenems un artefacto a cierta frecuencia que esta alli aun sin un tubo en el iman (el pico verde...). Puede originarse por una perdida de un circuito al receptor, a los amplificadores, al convertidor AD, etc.

• La mayoria de las veces, la frecuencia va a ser la de la portadora (B1). Vamos a analizar una secuencia 90-FID simple en la que pasa esto (la linea roja es el receptor…):

• Si repetimos y tomamos otra FID, el artefacto va a seguir estando alli. Tambien va a sumar como todas las señales, y como no es aleatorio, va a crecer a medida que tomeos mas FID’s igual que una señal real.

• Hay algo bien facil que podemos hacer para eliminar este tipo de ruido del espectro. Esta basado en que podemos cambiar nuestro ‘punto de vista’ de experimento a experimento, pero el artefacto no puede.

o B1

FT

y

x

o

90y

t1 (FID)x

Ciclado de fases (y mas...)Ciclado de fases (y mas...)

• A cambiar el ‘punto de vista’ le llamamos ciclado de fase, e involucra avanzar la fase de los pulsos y/o del receptor por una cantidad controlada entre los experimentos.

• Para eliminar el artefacto, hacemos lo siguiente. Primero tomamos una FID con un pulso de 90y y el receptor en el eje x como en el caso anterior. Despues avanzamos la fase del pulso de 90 por 180 grados (90-y), y movemos el receptor

tambien por 180 grados al eje -x (la linea roja…):

• Si ahora sumamos los dos espectros (o las FID’s), el signo de la señal a B1 va a alternar entre escanes sucesivos y se cancela despues de la suma:

o

B1

FT90-y

t1 (FID)-x

y

x

o

o

B1

o B1 o B1

+ =

Ciclado de fases (...y mas)Ciclado de fases (...y mas)

• En vez de dibujar todos los vectores y ejes cada vez que nos referimos a un ciclo de fases, usamos notacion reducida. Al ciclo de fases anterior lo podemos escribir asi:

• En este caso tenemos solo un pulso y el receptor. En una secuencia de pulsos multiple o un 2D extendemos esto a todos los pulsos que sea necesario.

• A la secuencia anterior la podemos extender y obtenemos el protocolo de ciclado de fase mas comun, llamado CYCLOPS, que es usado en deteccion por cuadratura, e involucra 4 ciclos en vez de 2 (tenemos dos receptores…):

1

2

90 (y, 1)

270 (-y, 3)

0 (x, 0)

180 (-x, 2)

Pulso 90 ReceptorCiclo

Pulso 90 Rcptr-1Ciclo Rcptr-2

1

2

0 (x, 0)

90 (y, 1)

0 (x, 0)

90 (y, 1)

3

4

180 (-x, 2)

270 (-y, 3)

180 (-x, 2)

270 (-y, 3)

90 (y, 1)

180 (-x, 2)

270 (-y, 3)

0 (x, 0)

Ciclado de fases (...y mas)Ciclado de fases (...y mas)

• Aca vemos el CYCLOPS en un experimento de eco de espin (T2) en 13C. Lo extendemos a todos los pulsos:

;avance-version (GMB - 10/2004) ;T2 measurement using Hahn spin-echo ;with power gated decoupling

#include <Avance.incl>

"p2=p1*2" "d11=30m" "d12=20u"

1 ze 2 d12 pl13:f2 d1 cpd2:f2 d12 pl12:f2 p1 ph1 vd*0.5 p2 ph2 vd*0.5 go=2 ph31 d11 wr #0 if #0 ivd lo to 1 times td1 d11 do:f2 exit

ph1=0 1 2 3 ph2=0 3 2 1 ph31=2 3 0 1

... ...

Escrito como ‘columnas’ en vezde ‘filas’…