espectro clínico-mutacional y estudios de correlación...
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Espectro clínico-mutacional y estudios de correlación genotipo-fenotipo en la
población española afectada de lipofuscinosis neuronal ceroidea
María del Socorro Pérez Poyato
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ESPECTRO CLÍNICO - MUTACIONAL Y ESTUDIOS DE
CORRELACIÓN GENOTIPO - FENOTIPO EN LA
POBLACIÓN ESPAÑOLA AFECTADA DE
LIPOFUSCINOSIS NEURONAL CEROIDEA
María del Socorro Pérez Poyato
Progama de Doctorat Medicina
Facultat de Medicina
Universitat de Barcelona
Progama de Doctorat Medicina
ESPECTRO CLÍNICO - MUTACIONAL Y ESTUDIOS DE CORRELACIÓN
GENOTIPO - FENOTIPO EN LA POBLACION ESPAÑOLA AFECTADA DE
LIPOFUSCINOSIS NEURONAL CEROIDEA
Memoria presentada por
María del Socorro Pérez Poyato
para optar al grado de Doctora en Medicina y Cirugía por la Universidad de Barcelona
Realizada bajo la dirección de
Prof.a Dra. Mercé Pineda Marfa
Dra. Montserrat Milá Recasens
Barcelona, Julio de 2012
Programa de Doctorat Medicina
Facultat de Medicina
Universitat de Barcelona
Trabajo realizado en el Hospital Sant Joan de Déu y en el Hospital Clínic
Barcelona
España
La interesada
María del Socorro Pérez Poyato
A la memoria de mi padre y a mi madre, por su gran amor A Inés, el mejor regalo de mi vida A Regina, por compartir sus inquietudes y sueños conmigo A mi hermana, siempre a mi lado
Agradecimientos A todos los pacientes y sus familias por haber colaborado en este estudio. A la Asociación Española de Ceroidolipofuscinosis, especialmente a Elena López
Davadillo, por facilitarme la información y el contacto con las familias.
A los compañeros del Servicio de Neurología del Hospital Sant Joan de Déu de
Barcelona, quienes me han aportado la mejor formación profesional y con quienes he
compartido momentos inolvidables de mi vida personal.
A la Dra. Mª Josep Coll Rosell, por su colaboración en la realización de los estudios de
las enzimas PPT1 y TPP1 en el Instituto de Bioquímica Clínica de Barcelona.
A la Dra. Judith Armstrong Moron, por su desinteresada dedicación y participación en
los estudios de genética molecular.
Al Prof. Dr. Isidre Ferrer Abizanda, por sus siempre atentas y rápidas respuestas a las
diferentes inquietudes surgidas durante el desarrollo de esta memoria. Su amabilidad,
disponibilidad y generosidad han enriquecido el trabajo realizado.
A la Dra. Montserrat Milá Recasens, directora de esta tesis, por aportar a mi formación
los conocimientos en genética molecular, por su apoyo y confianza en la realización de
este trabajo.
A los Drs. Rafael Camino León y Eduardo López Laso, compañeros de la Unidad de
Neuropediatría del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba, por el ánimo y la
sincera amistad que siempre me han brindado.
De forma muy especial, agradezco a la Prof.a Dra. Mercé Pineda Marfa los años de
conocimiento y sabiduría empleados en mi formación asistencial e investigadora. Me ha
distinguido al dirigir esta tesis y me ha dado la oportunidad de trabajar a su lado.
Gracias por estimular vocaciones, por ser verdadera maestra.
ÍNDICE � INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….1
1. Las lipofuscinosis neuronal ceroidea………………………………………5
1.1. Concepto general 1.2. Perspectiva histórica 1.3. Clasificación y nomenclatura 1.4. Epidemiología 1.5. Anatomía patológica
2. Fenotipos clínicos en la edad pediátrica…………………………………….19 2.1. Forma infantil (CLN1) 2.2. Forma infantil tardía (CLN2) 2.3. Forma juvenil (CLN3) 2.4. Formas variantes infantil tardía 2.4.1. Variante finlandesa (CLN5) 2.4.2. Variante juvenil precoz (CLN6) 2.4.3. Variante turca (CLN7) 2.4.4. Epilepsia progresiva con retraso mental y variante (CLN8) 2.5. Forma congénita (CLN10) 3. Exámenes complementarios…………………………………………………31 3.1. Electroencefalograma 3.2. Potenciales evocados visuales y electrorretinograma 3.3. Resonancia nuclear magnética 3.3.1. Espectroscopía 4. Diagnóstico………………………………………………………………….37
5. Tratamiento…………………………………………………………………..43
5.1. Terapia de reemplazamiento enzimático 5.2. Terapia génica 5.3. Terapia farmacológica 5.3.1. Tratamiento antiepiléptico 5.3.2. Tratamiento de los síntomas extrapiramidales 5.3.3. Tratamiento nutricional
� JUSTIFICACIÓN DE LA UNIDAD TEMÁTICA E HIPÓTESIS……………….47 � OBJETIVOS……………………………………………………………………….51 � PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………..55
1. Pacientes y diseño del estudio …………………..…………………………..57 2. Métodos para el estudio neuropatológico………………..…………………..60 3. Métodos bioquímicos………………………………...……………………...60 4. Métodos para el estudio molecular……..………………….………………..61 5. Aspectos éticos………………………………………..……………………..62 6. Análisis estadístico……………………………………..……………………62
� RESULTADOS…………………………………………………………………….65
1. Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración
clínica de una serie de pacientes españoles………….………….…….……...67
2. Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional
del gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles…….…77
3. Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso
clínico y estudios genéticos en pacientes españoles…..………….…………91
4. Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y
turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea………………………….107
5. Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea……………119
� DISCUSIÓN CONJUNTA …………………………………………………...…..123 � CONCLUSIONES ……………………………………………………...………...131 � BIBLIOGRAFÍA……………………….................................................................135 � ANEXO…………………………………………………………………………...171
ÍNDICE DE TABLAS Y/O FIGURAS � Figura 1. Localización de las proteínas en las lipofuscinosis neuronal ceroidea…....6
� Tabla 1. Características moleculares, enzimáticas y ultraestructurales de las
diferentes formas clínicas de lipofuscinosis neuronal ceroidea………..…………...12
� Tabla 2. Resumen de la nueva y antigua nomenclatura de las lipofuscinosis
neuronal eroidea………………………………..…………..……………………....14
� Figura 2. Biopsia muscular de un paciente con la forma infantil tardía de
lipofuscinosis neuronal ceroidea………………………………………….………...17
� Figuras 3, 4, 5, 6 y 7. Algoritmos para el diagnóstico de las lipofuscinosis neuronal
ceroidea…………………………………………………...……………………..….39
� Tabla 3. Ítems de la base de datos clínica de las lipofuscinosis neuronal ceroidea...59
� Figura 8. Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea………...121
ABREVIATURAS ABC Actividad de base cerebral
ATP Adenosina trifosfato
BHE Barrera hemato encefálica
CBZ Carbamacepina
CTSD Catepsina D
CV Cuerpos curvilíneos
CZP Clonazepam
EEG Electroencefalograma
EPMR Forma epilepsia progresiva con retraso mental de lipofuscinosis neuronal ceroidea
ERG Electroretinograma
ERT Terapia de reemplazamiento enzimático
FAEs Fármacos antiepilépticos
FP Finger print o huella dactilar
GROD Depósitos granulares osmofílicos
IAF Idiocia amaurótica familiar
LNC Lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCs Lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCA Forma del adulto de lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCC Forma congénita de lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCI Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCIT Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCJ Forma juvenil de lipofucinosis neuronal ceroidea
LTG Lamotrigina
MFSD8 Superfamilia facilitadora principal de las proteínas de transporte lisosomal
NAA N-acetil aspartato
PAS Acido periódico de Schiff
PB Fenobarbital
PEG Gastrostomía endoscópica percutánea
PEV Potencial evocado visual
PHT Fenitoína
PPT1 Palmitoil protein tioesterasa 1
RL Inclusiones o cuerpos rectilíneos
RNM Resonancia nuclear magnética
RNMs Resonancia nuclear magnética con espectroscopía
SAPs
SB
Saposinas o proteínas activadoras de los esfingolípidos
Sustancia blanca cerebral
SCMAS Subunidad c de adenosina trifosfato sintasa mitocondrial
SNC Sistema nervioso central
TC Tomografía computarizada
TPP1 Tripeptidil peptidasa 1
vLNCIT Forma variante infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea (CLN8)
vLNCITFin Forma variante infantil tardía finlandesa de lipofuscinosis neuronal ceroidea
vLNCITJuv Forma variante infantil tardía juvenil precoz de lipofuscinosis neuronal ceroidea
vLNCITTur Forma variante infantil tardía turca de lipofuscinosis neuronal ceroidea
vLNCJ Forma variante juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea
VGB Vigabatrina
VPA Ácido valproico
1
INTRODUCCIÓN 1. Las lipofuscinosis neuronal ceroidea
1.1. Concepto general
1.2. Perspectiva histórica
1.3. Clasificación y nomenclatura
1.4. Epidemiología
1.5. Anatomía patológica
2. Fenotipos clínicos en la edad pediátrica
2.1. Forma infantil (CLN1) 2.2. Forma infantil tardía (CLN2) 2.3. Forma juvenil (CLN3) 2.4. Formas variantes infantil tardía 2.4.1. Variante finlandesa (CLN5) 2.4.2. Variante juvenil precoz (CLN6) 2.4.3. Variante turca (CLN7) 2.4.4. Epilepsia progresiva con retraso mental y variante (CLN8) 2.5. Forma congénita (CLN10)
3. Exámenes complementarios 3.1. Electroencefalograma 3.2. Potenciales evocados visuales y electrorretinograma 3.3. Resonancia nuclear magnética 3.3.1. Espectroscopía
4. Diagnóstico
2
5. Tratamiento 5.1. Terapia de reemplazamiento enzimático 5.2. Terapia génica 5.3. Terapia farmacológica 5.3.1. Tratamiento antiepiléptico 5.3.2. Tratamiento de los síntomas extrapiramidales 5.3.3. Tratamiento nutricional
3
Las enfermedades que se estudian en esta tesis doctoral constituyen uno de los
grupos de patologías neurodegenerativas de herencia autosómica recesiva más
frecuentes en la infancia. Presentan gran variabilidad en la edad de inicio y comparten
amplio espectro fenotípico: epilepsia, déficit visual, deterioro motor y cognitivo
progresivos con fallecimiento a edad precoz. Se caracterizan por ser
ultraestructuralmente y genéticamente heterogéneas.
En las dos últimas décadas, los importantes avances en la investigación
genético-molecular han logrado la identificación de ocho genes responsables de las
diferentes formas clínicas en la edad pediátrica (CLN10/CTSD, CLN1/PPT1,
CLN2/TPP1, CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8 y CLN8) y actualmente el análisis
mutacional proporciona el diagnóstico definitivo de cada una de estas entidades y
permite establecer correlaciones genotipo-fenotipo.
La baja prevalencia de este grupo de enfermedades junto con la heterogeneidad
clínico-genética que las caracteriza hace que su diagnóstico plantee gran dificultad y, en
ocasiones se realice en estadios avanzados de la enfermedad. El conocimiento detallado
de la historia natural de la enfermedad ayuda a predecir el curso clínico y a seleccionar
una estrategia diagnóstica adecuada para cada una de las formas clínicas. Estas
consideraciones son prioritarias para evitar un retraso en el diagnóstico, permitir una
intervención lo más precozmente posible, reducir la morbilidad, el grado de
discapacidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes y sus familias. Actualmente
al no existir tratamiento curativo para este grupo de enfermedades, el conocimiento de
la historia natural de la enfermedad será fundamental para desarrollar una intervención
terapeútica curativa en el futuro. Los estudios de correlación genotipo-fenotipo,
imprescindibles para una correcta caracterización de los pacientes, son la base de un
consejo genético adecuado.
5
1. Las lipofuscinosis neuronal ceroidea
1.1. Concepto general
Las lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCs), conocidas también como
enfermedad de Batten, constituyen uno de los grupos de enfermedades
neurodegenerativas de herencia autosómica recesiva más frecuentes en la infancia
(Goebel y Sharp, 1998).
Son enfermedades de depósito lisosomal, caracterizadas desde el punto de vista
anatomopatológico por un acúmulo de ceroidolipofuscina (material de depósito
autofluorescente) en diferentes células del organismo, principalmente del cerebro y la
retina. Comparten características histopatológicas: gránulos PAS y Sudán negro B
positivos, resistentes a los solventes lipídicos, acumulados en el citoplasma de las
células nerviosas, y en menor extensión en otros tipos celulares, resultando en
degeneración y pérdida neuronal selectiva (Haltia, 2006). Los síntomas comunes a los
diferentes tipos de LNCs son: déficit visual, deterioro cognitivo y motor progresivo
(ataxia, espasticidad), epilepsia y evolución a estado vegetativo con fallecimiento a edad
precoz (Haltia, 2003). El examen oftalmológico pone de manifiesto degeneración
macular, acúmulos de pigmentos en la retina periférica, estrechez del árbol vascular y
atrofia óptica (Spalton et al. 1980, Hainsworth et al. 2009).
Inicialmente, las LNCs fueron clasificadas en diferentes formas clínicas (infantil,
infantil tardía, juvenil y de adulto) según la edad de inicio de la sintomatología, el orden
de aparición de los síntomas y la morfología ultraestructural del material depositado en
los diferentes tejidos analizados (Elleder et al. 1999, Santavouri et al. 2000, Haltia
2003).
Posteriormente, a principios de los años 90, la descripción de las primeras
formas variantes infantil tardía junto con la investigación en los campos de la
6
bioquímica y la genética molecular, permitieron la identificación de cinco genes
asociados a cada forma clínica en la edad pediátrica (CLN1, infantil; CLN2, infantil
tardía; CLN3, juvenil; CLN5 y CLN8, variantes infantil tardía) y el descubrimiento de
las proteínas codificadas por los genes CLN1/PPT1 y CLN2/TPP1.
En la última década del siglo XX y la primera del XXI, el espectro genético-
molecular de este grupo de enfermedades se ha ampliado con la identificación de los
genes CLN6, CLN7 y CLN10 reconociéndose hasta el momento, ocho genes
responsables de los diferentes fenotipos clínicos en la infancia: CLN10/CTSD,
CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8 y CLN8 (Mole 2006,
Siintola et al. 2006a, Williams et al. 2006, Siintola et al. 2007) y la localización celular
de las proteínas alteradas en este grupo de enfermedades (Figura 1).
Figura 1. Localización de las proteínas en las LNCs. CLN1, CLN2, CLN3, CLN5, CLN7 y CLN10 están localizadas en los lisosomas, mientras que CLN6 y CLN8 se encuentran en el retículo endoplásmico. Dependiendo del nivel de expresión y el tipo celular, pequeñas cantidades de proteína pueden encontrarse en otros compartimentos como CLN8 en el complejo retículo endoplásmico-Golgi o CLN3 en los endosomas y membrana plasmática. e. E: endosoma precoz; I.E: endosoma tardío; Jalanko and Braulke 2009
7
Actualmente el estudio genético basado en el análisis molecular proporciona el
diagnóstico definitivo de las LNCs y ha permitido asociar el defecto genético a cada una
de las formas clínicas: congénita, LNCC (CLN10); infantil, LNCI (CLN1); infantil
tardía, LNCIT (CLN2); juvenil, LNCJ (CLN3); variante infantil tardía finlandesa,
vLNCITFin (CLN5); variante infantil tardía juvenil precoz, vLNCITJuv (CLN6); variante
infantil tardía turca, vLNCITTur (CLN7) y variante infantil tardía epilepsia del norte con
retraso mental, EPMR - variante infantil tardía (CLN8) (Kousi et al. 2012).
En las LNCs el depósito de material proteico en los lisosomas de los diferentes
grupos celulares presenta un patrón característico que varía según la forma clínica. La
ultraestructura de dicho material observado al microscopio electrónico se corresponde
generalmente con depósitos granulares osmofílicos (GROD) en la LNCI y LNCC,
cuerpos curvilíneos (CV) en la LNCIT, e inclusiones celulares tipo huella dactilar o
“fingerprint” (FP) en la LNCJ (Goebel, 1996). Las inclusiones celulares suelen ser de
tipo mixto (GROD, CV, RL, FP) en las formas variantes infantil tardía (CLN5, CLN6,
CLN7, CLN8) (Mole et al. 2005).
Las LNCs son enfermedades que presentan amplia variabilidad clínica y se
caracterizan por ser genéticamente heterogéneas. Las mutaciones en un mismo gen
originan fenotipos diferentes: mutaciones comunes se asocian a un fenotipo clásico,
mientras que mutaciones menos frecuentes pueden originar un fenotipo variante.
Además, existen mutaciones asociadas a familias de un área geográfica determinada.
Por tanto, el espectro genético que caracteriza a este grupo de enfermedades comprende
heterogeneidad clínica con fenotipos más graves y benignos en función de cómo el
defecto genético afecte a la función de la proteína (Goebel y Wisniewski, 2004).
Los estudios de correlación genotipo-fenotipo permitirán profundizar en el
diagnóstico de este grupo de enfermedades mediante la identificación de las mutaciones
8
y la realización de una adecuada caracterización clínica de los pacientes. Existe un
registro internacional de pacientes para el estudio de dicha correlación
(http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml).
No existe tratamiento curativo en el momento actual, para este grupo de
enfermedades. El tratamiento farmacológico, la rehabilitación, la fisioterapia y la terapia
ocupacional pueden aliviar algunos síntomas de la enfermedad y son parte importante
de las medidas paliativas. Aunque el tratamiento farmacológico es necesario, es
primordial el soporte y la ayuda a las familias.
1.2. Perspectiva histórica
La primera descripción de las LNCs corresponde al Dr. Otto Christian Stengel
en 1826, médico noruego que identificó a cuatro hermanos (2 niños y 2 niñas) con
epilepsia, pérdida de visión y deterioro mental progresivos a los 6 años de edad.
En 1896 el Dr. Sachs, neurólogo americano, introdujo el término “idocia
amaurótica familiar” (IAF) para referirse a un grupo de enfermedades de inicio en la
infancia caracterizadas por ceguera, deterioro psicomotor y fallecimiento a edad precoz.
Las observaciones más concretas fueron realizadas por Batten (1903) al
identificar pacientes con “degeneración familiar cerebral y alteraciones maculares”, que
presentaban un inicio más tardío y clínicamente diferente de los descritos con IAF. En
1905 esta distinción fue confirmada por Spielmeyer, al describir detalladamente tres
hermanos con “una forma especial de IAF”, y por Vogt, que identificó pacientes con la
“forma juvenil de IAF” (Spielmeyer, Vogt, 1905).
A pesar de que los estudios emprendidos por Batten y Spielmeyer apuntaran a
una clara distinción entre las formas de IAF y la enfermedad de Tay-Sachs, fueron
consideradas como variantes de una misma entidad, apoyados por los estudios
anatomopatológicos de Schaffer (1905) en los que el material lipídico acumulado fue
9
encontrado en las células nerviosas. En 1914, Batten describió las alteraciones en el
sistema nervioso central de un niño afectado con IAF, correspondiéndose con una
entidad clínica diferente. En los estudios de Batten (1903, 1914), IAF de inicio infantil
tardío y juvenil aún no estaban diferenciadas.
En 1908 Jansky describió una forma diferente de IAF con atrofia cerebelosa. En
una publicación un año más tarde, Vogt observó que los hermanos con IAF de inicio
tardío manifestaban los síntomas de la enfermedad en el mismo orden cronológico, pero
existían diferencias en el curso clínico entre diferentes familias. Bielchowsky (1913)
describió tres hermanos con crisis epilépticas a los 3.5 años, rápido deterioro mental y
ceguera proponiendo que se trataba de un inicio infantil tardío de IAF, distinto de IAF
con inicio juvenil.
Los pacientes con IAF de inicio infantil fueron incluidos en el grupo de
pacientes con IAF juvenil, y no fue hasta 1931 que Sjögren diferenció en 115 pacientes,
según la clínica, el tipo infantil del juvenil. La distinción de IAF de inicio infantil de las
formas de inicio infantil tardío ocurrió gracias al aislamiento de gangliósidos de los
cerebros de pacientes con IAF de tipo infantil, conocido como enfermedad de Tay-
Sachs (Klenk, 1939). En 1962, Svennerholm identificó el gangliósido GM2 como la
principal sustancia acumulada en la forma infantil de IAF y verificó su ausencia en la
forma juvenil. Las investigaciones de Klenk y Svennerholm indicaban que el grupo de
IAF era bioquímicamente heterogéneo.
En 1963, Zeman y Alpert publicaron la existencia de lipopigmentos
autofluorescentes en pacientes con IAF de inicio infantil tardío, lo que definitivamente
diferenció a los pacientes con IAF de los pacientes con otras enfermedades de depósito,
incluyendo la enfermedad de Tay-Sachs. Zeman y Dyken (1969) acuñaron el término de
“neuronal ceroido lipofuscinosis”, basándose en las características histoquímicas y
10
ultraestructurales del material depositado. Demostraron que este material, parecido al
ceroide y a la lipofuscina, era resistente a los solventes lipídicos y mostraba un patrón
característico curvilíneo (infantil tardío) o “firnger print” / huella dactilar (juvenil). Así
se diferenciaron definitivamente este grupo de enfermedades de las gangliosidosis.
Después de la descripción por Haltia y Santavuori en 1973 de un nuevo tipo
infantil de LNC, caracterizado por la presencia de material de depósito granular
osmofílico (GRODs), las LNCs fueron clasificadas en diferentes formas clínicas
basadas en la edad de inicio y en la ultraestructura de los depósitos: forma infantil,
infantil tardía y juvenil. Esta clasificación no tuvo en cuenta los escasos pacientes
afectos de la forma congénita, descrita en 1941 por Norman y Wood.
En los últimos años se han descrito nuevas formas “atípicas” o “variantes”
ampliándose el espectro clínico de de las LNCs. Actualmente el término “lipofuscinosis
neuronal ceroidea” es ampliamente utilizado aunque el término genérico “enfermedad
de Batten” es común en USA.
1.3. Clasificación y nomenclatura
Inicialmente las LNCs, al ser reconocidas como grupo de enfermedades, se
clasificaron en tres formas clínicas principales, según la edad de inicio, el orden de
aparición de los síntomas y el material depositado en diferentes tejidos celulares:
infantil, infantil tardía y juvenil. En algunos países eran conocidas por sus epónimos:
Haltia-Santavuori (LNCI), Jansky-Bielschowsky (LNCIT), Spielmeyer-Vogt o
enfermedad de Batten (LNCJ).
Al principio de la década de los 90, la identificación de los genes CLN1, CLN2,
CLN3, CLN5 y CLN8 permitió su asociación con cada una de las tres formas clínicas
principales (LNCI, LNCIT y LNCJ) y con las primeras formas variantes infantil tardía
(vLNCITFin y EPMR) respectivamente.
11
El uso de epónimos está siendo abandonado y la existencia de las formas
variantes infantil tardía ha llegado a ser ampliamente reconocida, ya que la correlación
entre el defecto genético y la edad de inicio no es absoluta. En los últimos años del siglo
XX y primeros del XXI, la identificación de los genes CLN6, CLN7 y CLN10 ha
permitido clasificar las LNCs en ocho enfermedades diferentes (Tabla 1).
12
Fenotipo clínico E
pónimo
Nº
OM
IM
Gen
Loci
Referencia
Mutación com
ún /
Localización
Enzim
a L
ocalización Fenotipo
ultraestructural
Material
proteico
INFA
NTIL (LN
CI)
Haltia -
Santavuori
Infantil Tardía (LNC
IT)
Juvenil (vLNC
J)
Adulto (LN
CA
)
256730
CLN
1 1p32
Järvelä et al
(1991)
Arg122Trp
Exón 4
Arg151STO
P
Exón 5
PPT1 Interior del
lisosoma
GR
OD
SA
Ps
Clásica
(LNC
IT)
Jansky –
Bielschow
sky 204500
CLN
2
11p15 Sharp et al
(1997)
IVS5-1G
>C
Intrón 5
Arg208STO
P
Exón 6
TPP1 Interior del
lisosoma
CV
SC
MA
S
(vLNC
ITFin)
Variante
Finlandesa 256731
CLN
5 13q21.1-q32
Savukoski et al
(1994)
Tyr392STOP
Exón 4 C
LN5
Sistema lisosom
al G
RO
D,R
L, CV
, FP SC
MA
S
(vLNC
ITJuv)
Lake-
Cavanagh
601780 C
LN6
15q21-23 Sharp et al
(1997)
E72X
Exón 3 C
LN6
Retículo
endoplásmico
GR
OD
,RL, C
V, FP
SCM
AS
(vLNC
ITTur)
Variante Turca
610951 C
LN7
4q28.1-28.2 Siintöla et al
(2007)
Thr294Lys
Exón 10 M
FSD8
Mem
brana
lisosomal
GR
OD
,RL, C
V, FP
SCM
AS
(EPMR
)
Epilepsia
Progresiva con
retraso mental
Tahvanainen
(1994)
Arg24G
ly
Exón 2 G
RO
D, C
V
INFA
NTIL
TAR
DIA
(vLNC
IT) V
ariante
Infantil Tardía
600143 C
LN8
8p23
Topcu et al.
(2004)
CLN
8
Retículo
endoplásmico
Golgi
FP, CV
SCM
AS
JUV
ENIL (LN
CJ)
Spielmyer-
Vogt- Sjögren
204200 C
LN3
16p12 Eiberg et al
(1989)
1.02kb delección
Intrón 6-8 C
LN3
Mem
brana
lisosomal
FP SC
MA
S
CO
NG
ENITA
(LNC
C)
Congénita
610127 C
LN10
11p15.5 Siintöla et al.
(2006)
CTSD
Interior del
lisosoma
GR
OD
SA
Ps
Tabla 1. Características m
oleculares, enzimáticas y ultraestructurales de las diferentes form
as clínicas de lipofuscinosis neuronal ceroidea
13
Este grupo de enfermedades presenta heterogeneidad genética (mutaciones en
diferentes genes pueden originar similares fenotipos clínicos: mutaciones en los genes
CLN1 y CLN3 causan LNCJ), heterogeneidad alélica (diferentes mutaciones en el
mismo gen pueden originar diferentes fenotipos clínicos: mutaciones en el gen CLN1
originan LNC con edad de inicio desde la infancia a la edad adulta) y, por último,
pueden ser fenotípicamente heterogéneas incluso dentro de la misma familia (la misma
mutación en el mismo gen puede originar diferentes síntomas y progresión de la
enfermedad).
Estos progresos y avances en el conocimiento de las LNCs han requerido una
revisión del tradicional sistema de clasificación y en el año 2009 surge un cambio en la
nomenclatura y una nueva clasificación de las LNCs. La nueva nomenclatura está
basada en el genotipo y considera las características clínico-patológicas de la
enfermedad (Tabla 2).
La nueva clasificación utiliza un sistema axial en la que el gen mutado denota el
subtipo de enfermedad, seguido de la presentación clínica y características
ultraestructurales, como sigue: Eje 1: gen afectado (CLN1, CLN2..), Eje 2: análisis
mutacional, Eje 3: fenotipo bioquímico, Eje 4: fenotipo clínico, Eje 5: estudio
ultraestructural, Eje 6: capacidad funcional del paciente, Eje 7: otras consideraciones
(factores genéticos o ambientales que pueden afectar al inicio o evolución de la
enfermedad) http://www.ucl.ac.uk/ncl/newnomenclature.shtml
14
Kousi et al. 2012
GEN OMIM EPONIMO ENFERMEDAD NOMBRE ABREVIADO
PPT1/CLN1 256730 Haltia-Santavuori CLN1, infantil LNCI
CLN1, infantil tardía CLN1, juvenil LNCJ / GROD CLN1, adulto
TPP1/CLN2 204500 Jansky-Bielschowsky CLN2, infantil tardía LNCIT
CLN2, juvenil CLN2, infantil
CLN3 204200 Spielmeyer-Sjögren CLN3, juvenil LNCJ
CLN3, prolongada CLN3, infantil
CLN5 256731 Variante infantil tardía Finlandesa CLN5, variante infantil tardía vLNCIT
CLN5, juvenil CLN5, adulto CLN5, infantil CLN6, variante infantil tardía vLNCIT CLN6 601780 Lake-Cavanagh variante juvenil precoz
o variante infantil tardía india CLN6, adulto Kufs tipo A CLN7, variante infantil tardía vLNCIT
MFSD8/CLN7 610951 Variante infantil tardía turca CLN7, juvenil
Variante infantil tardía CLN8, variante infantil tardía vLNCIT CLN8 600143
Epilepsia del Norte con retraso mental CLN8, EPMR EPMR CLN10, congénita LNCC
CTSD/ CLN10 610127 Congénita CLN10, juvenil
???? 609055 Variante juvenil CLN9, variante juvenil vLNCJ
Tabla 2. Resumen de la nueva y antigua nomenclatura de las lipofuscinosis neuronal ceroidea
15
1.4. Epidemiología
Las lipofuscinosis neuronal ceroidea son enfermedades que presentan una
distribución mundial y una incidencia de 1/12 500 nacimientos (Rider y Rider, 1988).
En Newfoundland (Canadá), la incidencia es de 13.6/100 000 nacimientos, similar a la
de Finlandia: 13/100 000 nacimientos vivos (Moore et al. 2008). En la República Checa
la incidencia es de 1.3 / 100 000 (Elleder et al. 1997). La prevalencia puede variar
dependiendo de la etnia o el país de procedencia siendo muy alta en Finlandia y en
países del norte de Europa (Uvebrant y Hagberg, 1997).
La LNCI predomina en Finlandia con una incidencia de 1/20 000 nacimientos
vivos y una frecuencia de portadores 1/70 (Santavuori et al. 1993).
La incidencia de la LNCIT ha sido calculada en diferentes poblaciones siendo la
más alta la encontrada en Newfounland: 9/100 000 nacimientos vivos (Moore et al.
2008) mientras que en el Oeste de Alemania es de 0.46/100 000 nacimientos (Claussen
et al. 1992). En países del norte de Europa como Suecia, se ha descrito una prevalencia
es de 0.43/millón de habitantes (Uvebrant y Hagberg, 1997).
La LNCJ es a nivel mundial la forma clínica más frecuente (Goebel y
Wisniewski, 2004). La incidencia en el Oeste de Alemania es de 0.71/100 000
nacimientos (Claussen et al. 1992), en Italia es de 0.20/100 000 (Cardona y Rossati,
1995) y en países del norte de Europa como Suecia es de 2.2/100 000 nacimientos vivos
(Uvebrant y Hagberg, 1997). La LNCJ es más frecuente que LNCIT en España (Pérez-
Poyato et al. 2011) y Portugal (42,3% y 3.8% respectivamente) (Texeira et al. 2003a) y
menos frecuente en la República Checa (Elleder et al. 1997).
La vLNCITFin fue inicialmente descrita en Finlandia, identificándose
posteriormente en familias procedentes de otros países como Colombia, Portugal, Italia
o España (Pérez-Poyato et al. 2012b). La vLNCITJuv presenta una alta incidencia en
16
familias procedentes de la República Checa de origen Romano (Elleder et al. 1997) y en
familias de Costa Rica de descendencia española (Gao et al. 2002).
1.5. Anatomía patológica
Las LNCs se caracterizan por un acúmulo intralisosomal de lipopigmentos
autofluorescentes en el sistema nervioso central y en tejidos no neuronales,
principalmente la retina. A nivel celular existe una activación de los astrocitos con
pérdida neuronal en el sistema nervioso central (Cooper et al. 2006) y de las células de
la retina lo que origina progresiva atrofia cerebral, cerebelosa y degeneración retiniana.
El material acumulado corresponde a proteínas y otros compuestos como fosfolípidos,
oligosacáridos dolicol y ubiquinona. El principal material de depósito está formado por
proteínas activadoras de los esfingolípidos o saposinas (SAPs) (Tynelä et al. 1993) y
por la subunidad c de ATP sintasa mitocondrial (SCMAS) (Hall et al. 1991, Palmer et
al. 1992). Las SAPs se observan en la forma congénita e infantil, mientras que SCMAS
se encuentran en las restantes formas clínicas de LNCs.
El material depositado presenta una morfología característica a nivel
ultraestructural: granular, curvilínea, rectilínea o de huella dactilar (Elleder et al.. 1999)
que predomina en cada forma clínica pero no es específica, ya que pueden observarse
diferentes inclusiones en una misma entidad. Para la visualización de dichas inclusiones
mediante el estudio de microscopía electrónica es necesario realizar biopsia de tejidos
como piel, conjuntiva, músculo esquelético, mucosa rectal o apendicular (Rapola y
Haltia 1973, Rapola et al. 1984) (Figura 2).
17
Muscular biopsy: curvilinear bodies (clb) englobed by a lysosomal membrane (arrows) in muscle fibres (A and C) and endothelial cells (B).mb: basal membrane
A
B
C
CLN2: late infantile NCL: Jansky-Bielchowsky disease
Figura 2. Biopsia muscular de un paciente con la forma infantil tardía de
lipofuscinosis neuronal ceroidea (cortesía del Prof. Dr. I. Ferrer Abizanda).
El examen ultraestructural permite la visualización de las inclusiones en los
linfocitos de sangre periférica, pero al estar presentes sólo en una minoría de los
linfocitos, es aconsejable confirmar el diagnóstico mediante la realización de una
biopsia (piel, conjuntiva, apéndice, músculo, etc). La piel es el tejido más adecuado ya
que es accesible y contiene la glándula sudorípara ecrina, cuyo tipo celular es el ideal
para el diagnóstico anatomopatológico. La biopsia debe realizarse con una profundidad
de 3 mm en un lugar donde abunden las glándulas sudoríparas como por ejemplo el
antebrazo o la parte interna del brazo, excluyendo la región axilar
http://www.ucl.ac.uk/ncl/diagnostic_approach.shtml .
19
2. Fenotipos clínicos en la edad pediátrica
El espectro clínico-molecular de las LNCs, constituido inicialmente por las tres
formas clínicas principales: LNCI (CLN1), LNCIT (CLN2) y LNCJ (CLN3), se ha ido
ampliando en las dos últimas décadas con la descripción de las formas variantes infantil
tardía: finlandesa, vLNCITFin (CLN5); juvenil precoz, vLNCITJuv (CLN6); turca
vLNCITTur (CLN7); epilepsia del norte con retraso mental, EPMR, variante infantil
tardía, (CLN8) y de la forma congénita, LNCC (CLN10).
2.1. Forma infantil (CLN1)
La forma infantil (LNCI; enfermedad de Haltia-Santavuori) es frecuente en
Finlandia donde presenta una incidencia de 1/20 000 nacimientos (Santavuori et al.
1993). Se inicia entre los 8-18 meses de edad (Santavuori et al. 1973, 1974) con retraso
psicomotor y progresa con déficit visual y crisis epilépticas hacia el final del segundo
año de vida. En la exploración neurológica los pacientes presentan irritabilidad,
hipotonía generalizada, desaceleración del perímetro cefálico y en ocasiones,
estereotipias manuales similares al Síndrome de Rett. El deterioro clínico es muy rápido
y a los tres años de edad los niños están ciegos, espásticos y en estado vegetativo. El
fallecimiento normalmente ocurre entre los 8-13 años de edad (Santavuori, 1988).
La LNCI está causada por el déficit de la enzima lisosomal palmitoil-protein
tioesterasa 1 (PPT1) (Vesa et al. 1995), hidrolasa ácida lisosomal con capacidad de
hidrolizar las uniones covalentes entre los ácidos grasos (palmitato) y las proteínas S-
acetiladas (Camp y Hofmann, 1993). La enzima PPT1 es codificada por el gen CLN1
(MIM #256730) que se localiza en el cromosoma 1p32 (Järvela et al. 1991) y contiene
9 exones.
20
Las mutaciones en el gen CLN1/PPT1 están asociadas con un inicio de la
enfermedad desde la infancia hasta la edad adulta (Hofmann et al. 1999a, Wisniewski et
al. 2000, Mole et al. 2005), originando además de la forma infantil, los fenotipos
infantil tardío (Wisniewski et al. 1998c, Waliany et al. 2000, Bonsignore et al. 2006,
Simonati et al. 2009) y juvenil (Mitchinson et al. 1998).Todos los pacientes con
mutaciones en el gen CLN1 presentan déficit de la enzima PPT1 y depósitos granulares
osmofílicos (GROD) a nivel ultraestructural (Rapola y Haltia 1973, Hoffamn et al.
2002).
La mayoría de las mutaciones identificadas en el gen CLN1 causan LNCI y el
curso clínico de estos pacientes está relacionado con el tipo de mutación. Las
mutaciones que originan pérdida de proteína o proteína truncante resultan en un inicio
más precoz y más rápida progresión de la enfermedad (Das et al. 1998). Algunas
mutaciones en el gen CLN1 son más frecuentes según el país de procedencia. En
Finlandia, el 90% de los pacientes presentan la mutación missense c.364A>T p.R122W
en homocigosis dando lugar a inactividad del enzima (Vesa et al. 1995; Mole, Williams
y Goebel 2005) mientras que la mutación c.451C>T p.R151X es más frecuente en
pacientes de diferentes orígenes étnicos y está asociada con un fenotipo severo cuando
se presenta en estado homocigoto (Das et al. 1998, Munroe et al. 1998, Hofmann et al.
1999a).
2.2. Forma infantil tardía (CLN2)
La forma infantil tardía (LNCIT; enfermedad de Jansky-Bielchowsky) fue
descrita por Jansky (1908) y Bielchowsky (1913), es poco frecuente en Finlandia y
predomina en otras poblaciones del norte de Europa (Williams et al. 1999a). La
enfermedad se inicia entre los 2-4 años con cualquier tipo de crisis epilépticas (Lavrov
et al. 2002), siendo las crisis mioclónicas las más características y refractarias al
21
tratamiento. Algunas veces el retraso del lenguaje puede preceder a la epilepsia. La
regresión del desarrollo psicomotor con pérdida de deambulación autónoma y del
lenguaje ocurre a los 4-5 años junto con ataxia, disartria y deterioro cognitivo
(Williams et al. 1999a). El déficit visual conduce a la ceguera a los 5-6 años de edad y
los pacientes fallecen entre los 6-15 años (Wisniewski et al. 2001, Haltia 2003).
Existen escalas de discapacidad diseñadas específicamente para valorar el progresivo
deterioro clínico de estos enfermos (Steinfeld et al. 2002, Worgall et al. 2007).
La LNCIT está producida por el déficit de la enzima lisosomal tripeptidil
peptidasa 1 (TPP1) (Sleat et al. 1997), componente de una familia de serina-
carboxylproteinasas, cuya función es eliminar el aminoácido terminal de las proteínas
sometidas a degradación lysosomal (Vines y Warburton 1998) favoreciendo el acúmulo
de la subunidad c de ATP sintasa mitocondrial (Ezaki et al. 2000). La enzima TPP1 es
codificada por el gen CLN2 (MIM #204500) que se localiza en el cromosoma 11p15
(Sharp et al. 1997) y contiene 13 exones.
La mayoría de las mutaciones en el gen CLN2/TPP1 originan pérdida total de
actividad enzimática y están asociadas con el fenotipo clásico. Otros pacientes presentan
un fenotipo juvenil con curso clínico más benigno (Hartikainen et al. 1999, Wisnieski et
al. 1999, Bessa et al. 2008, Elleder et al. 2008, Kohan et al. 2009) y se han publicado
tres pacientes que iniciaron la enfermedad en el primer año de vida (Simonati et al.
2000, Ju et al. 2002), así la heterogeneidad clínico-genética de esta enfermedad ha
quedado demostrada (Zhong et al. 2000).
El principal marcador ultraestructural de la LNCIT asociada a mutaciones en el
gen CLN2 son los cuerpos curvilíneos (CV), aunque también se observan inclusiones de
tipo mixto con CV y FP en la biopsia de algunos pacientes con fenotipo juvenil
(Wisniewski et al. 1999).
22
El espectro mutacional del gen CLN2 incluye dos mutaciones particularmente
comunes a nivel mundial, la mutación que afecta al splicing c.509-1G>A y la mutación
sin sentido c.622C>T p.R208X; ambas acontecen en heterocigosis con otras mutaciones
en el 60-78% de los pacientes con LNCIT (Zhong et al. 1998a, Sleat et al. 1999). La
mutación c.851G>T p.G284V es muy prevalente en la población procedente de
Newfoundland (Moore et al. 2008) observándose en el 55% de las familias canadienses
(Ju W et al. 2002).
2.3. Forma juvenil (CLN3)
La forma Juvenil de LNC (LNCJ) es reconocida en las descripciones de Stengel
(1826), Batten (1903), Spielmeyer (1905), Vogt (1909) y Sjögren (1931) y también se
denomina enfermedad de Batten o Spielmeyer-Vogt-Sjögren. Es la más prevalente en
Estados Unidos y en los países del norte de Europa (Uvebrant y Hagber 1997,
Wisniewski et al. 1998b).
Los pacientes con LNCJ inician la enfermedad entre los 4-7 años de edad con
déficit visual (Marshall et al. 2005). El deterioro en las habilidades cognitivas y de
lenguaje ocurre hacia los 10 años de edad, coincidiendo con el inicio de la epilepsia. Las
crisis epilépticas más frecuentes son tónico-clónico generalizadas, aunque también se
observan crisis mioclónicas y de tipo parcial (Aberg et al. 2000). Los signos
piramidales, extrapiramidales y la ataxia aparecen en la adolescencia. Otros síntomas
como labilidad emocional y los trastornos del sueño completan el cuadro clínico en la
segunda década de la vida. La supervivencia es variable entre los 16-35 años de edad
(Hofman et al. 1999b).
La LNCJ está causada por mutaciones en el gen CLN3 (MIM #204200) que se
localiza en el cromosoma 16p12 (Eiberg et al. 1989, Gardiner et al. 1990) y contiene 15
exones. La delección c.461-280_677+382del966 (deleción 1.02-kb) ocurre en el 80-
23
85% de los alelos mutados del gen CLN3 (The International Batten Disease Consortium
1995) y origina una proteína truncada de 181 aminoácidos que elimina los exones 7-8,
cuya función es actualmente desconocida (Järvelä et al. 1999). Los pacientes con
mutaciones en el gen CLN3 presentan inclusiones FP o una combinación de FP y CV a
nivel ultraestructural y, generalmente linfocitos vacuolados en el frotis de sangre
periférica.
El curso clínico y la gravedad de la LNCJ pueden ser diferentes dependiendo de
la combinación entre las diferentes mutaciones y la delección 1.02-kb en el gen CLN3.
Los pacientes homocigotos para la delección 1.02-kb presentan generalmente el
fenotipo clásico de LNCJ (Munroe et al. 1997), mientras que los pacientes
heterocigotos compuestos para la delección 1.02-kb y otra mutación en el gen CLN3
pueden presentar un fenotipo variante con una progresión más lenta y curso clínico más
benigno de la enfermedad (Lauronen et al. 1999, Pérez-Poyato et al. 2011).
Algunas mutaciones missense que acontecen en heterocigosis con la deleción
1.02-kb y que se asocian a un curso clínico prolongado LNCJ son: c.302T>C p.L101P,
c.509T>C p.L170P (Munroe et al. 1997) y c.883G>A p.E295K, ésta última ha sido
descrita en pacientes con déficit visual y que permanecen neurológicamente
asintomáticos durante décadas de la vida (Wisniewski et al. 1998a, Zhong et al. 1998b
Arberg et al. 2009). Se ha publicado un paciente heterocigoto compuesto para la
delección 1.02-kb y otra mutación no identificada que inició la enfermedad a los 5
meses de edad (De los Reyes et al. 2004). Estos hallazgos sugieren que la mutación no
identificada y / o factores genéticos podrían ser los responsables de este inicio de la
enfermedad a edad tan precoz.
Un estudio reciente compara las diferencias fenotípicas entre pacientes
homocigotos, heterocigotos para la delección 1.02-kb y homocigotos para la mutación
24
c.1001G>A p.R334H, asociada a ambos fenotipos clásico y variante (Munroe et al.
1997), no encontrando diferencias entre los tres grupos (Adams et al. 2010). Además, la
mutación c.597C>A p.Y199X en homocigosis, identificada en una familia libanesa con
cinco niños afectos, se ha descrito asociada a un curso clínico prolongado (Sarpong et
al. 2009).
La forma variante de LNCJ (vLNCJ) causada por mutaciones gen CLN1 es
clínicamente muy similar a la forma LNCJ producida por mutaciones en el gen CLN3
(Mitchison et al. 1998) a excepción de que la vLNCJ generalmente se inicia con
dificultades de aprendizaje en lugar de déficit visual, la regresión del desarrollo
psicomotor ocurre a edad más precoz y no se observan linfocitos vacuolados en sangre
periférica (Pérez-Poyato et al. 2011). Las mutaciones en el gen CLN1 de estos pacientes
no eliminan completamente la función de la proteína (Mazzei et al. 2002) existiendo un
déficit parcial de PPT1 (Kälviäinen et al. 2007) y GROD a nivel ultraestructural (Aberg
et al. 1998). La mutación c. 223A>C p.T75P es muy común en poblaciones de Estados
Unidos (Das et al. 1998) y Escocia (Munroe et al. 1998).
2.4. Formas variantes infantil tardía
2.4.1. Variante finlandesa (CLN5)
La primera descripción clínica de la variante finlandesa (vLNCITFin) se debe a
Santavuori et al. 1982 y corresponde a una serie de 16 pacientes de Finlandia.
Posteriormente se han publicado otros pacientes procedentes de: The Netherlands
(Holmberg et al. 2000), Colombia (Pineda-Trujillo et al. 2005), Portugal (Bessa et al.
2006), Italia (Cannelli et al. 2007), Afganistán – Pakistán (Lebrun et al. 2009), Qatar
(Al-Kowari MK et al. 2011) y España (Pérez-Poyato et al. 2012b), por lo que podemos
decir que la vLNCITFin presenta una amplia diversidad étnica y geográfica.
25
Las primeras manifestaciones clínicas de la vLNCITFin, observadas en la etapa
preescolar, son déficit de atención / dificultades de concentración (Holmberg et al.
2000). El déficit visual y la torpeza motora comienzan entre los 4.5-7 años de edad. A
medida que la enfermedad progresa, se hace evidente el deterioro cognitivo a la edad de
7 años. La epilepsia, en forma de crisis generalizadas, parciales o secundariamente
generalizadas, puede aparecer entre los 7-8 años, coincidiendo con la ataxia (7-10
años), pero las crisis mioclónicas ocurren algo más tarde (8-9 años) (Santavuori et al.
1991). Los pacientes pierden la deambulación autónoma entre los 9-11 años de edad,
permaneciendo espásticos y en estado vegetativo hasta la edad del fallecimiento que
puede variar entre los 14-21 años (Santavuori et al. 1982).
El gen CLN5 (MIM #256731) se localiza en el cromosoma 13q21.1-q32
(Savukoski et al. 1994), contiene 4 exones y codifica para una glicoproteína soluble
lisosomal de función desconocida y cuya expresión aumenta durante la neurogénesis
cortical (Savukoski et al. 1998, Holmberg et al. 2004). La mutación sin sentido
c.1175_1176delAT p.Y392X es muy prevalente en Finlandia y acontece en el 94% de
los cromosomas (Savuvoski et al. 1998). Existe escasa variabilidad en el fenotipo de los
pacientes en relación con las diferentes mutaciones en el gen CLN5, sin embargo la
vLNCITFin se puede iniciar a edad juvenil (Pineda-Trujillo et al. 2005, Cannelli et al.
2007, Lebrun et al. 2009, Xin et al. 2010) y del adulto (Xin et al. 2010).
2.4.2. Variante juvenil precoz (CLN6)
La forma variante juvenil precoz (vLNCITJuv) fue descrita por Lake y Cavanagh
en 1978 y presenta una distribución mundial (Williams et al. 1999b). La primera y más
amplia serie de pacientes publicada hasta ahora, incluyó 27 niños procedentes de 23
familias no relacionadas de la República Checa (Elleder et al. 1997).
26
La edad de inicio de vLNCITJuv es discretamente más tardía que LNCIT y se
sitúa entre los 3-8 años (Texeira et al. 2003a) aunque los primeros síntomas pueden
aparecer desde los 18 meses de vida (Elleder et al. 1997). La enfermedad se manifiesta
con crisis epilépticas y trastorno motor seguidos de ataxia, disartria, crisis mioclónicas y
regresión cognitiva. El déficit visual aparece más tarde, entre los 4-10 años de edad
junto con la pérdida de la deambulación y los pacientes pueden sobrevivir hasta la
segunda década de la vida en estadío vegetativo (Texeira et al. 2003a).
El gen CLN6 (MIM #601780) se localiza en el cromosoma 15q21-23 (Sharp et
al. 1997), contiene 7 exones y codifica una proteína transmembrana localizada en el
retículo endoplásmico, cuya función es actualmente desconocida (Gao et al. 2002,
Wheeler et al. 2002, Mole et al. 2004).
Las primeras mutaciones en el gen CLN6 fueron identificadas en pacientes
procedentes de Venezuela y Costa Rica donde predomina la mutación nonsense
c.214G>T p.E72X (Gao et al. 2002, Wheeler et al. 2002).Otras mutaciones se han
descrito en pacientes procedentes de Turkía (Siintola et al. 2005) y de Arabia-saudí (Al-
Muhaizea et al. 2009). Mutaciones específicas se asocian a determinadas poblaciones
como la c.460_462delATC p.I154del muy común en Portugal (Texeira et al. 2003b) y
la c.268_271dupAACG p.Val91GlufsX42 que acontece en homocigosis en todos los
pacientes de Newfounland (Moore et al. 2008).
La mayoría de las mutaciones en el gen CLN6 causan la vLNCITJuv y
recientemente se han descrito mutaciones que pueden originar variabilidad en el curso
clínico inter e intra familiar (Cannelli et al. 2009), una progresión más lenta de la
enfermedad (Sharp et al. 2003) y otras asociadas con la forma del adulto o enfermedad
de Kufs tipo A (Arsov et al. 2011).
27
2.4.3. Variante turca (CLN7)
La forma variante turca (vLNCITTur) fue inicialmente descrita en seis familias,
cinco de ellas consanguíneas, procedentes de Turkía (Wheeler et al. 1999).
Posteriormente se publicaron pacientes procedentes de India (Siintola et al. 2007), Italia
(Aiello et al. 2009), Arabia Saudí (Aldahmesh et al. 2009), República Checa (Kousi et
al. 2009), Egipto (Stogmann et al. 2009) y España (Pérez-Poyato et al. 2012b) entre
otros.
La presentación clínica en estos pacientes es similar a la forma LNCIT. La
vLNCITTur se inicia entre los 2-7 años con epilepsia refractaria aunque la ataxia y el
déficit visual también pueden aparecer. La progresión de la enfermedad es rápida con
deterioro motor y cognitivo, ceguera, ataxia y los pacientes pierden la deambulación
autónoma a los 2 años del inicio de la enfermedad (Topcu et al. 2004, Pérez-Poyato et
al. 2012b).
El gen CLN7 (MIM #610951) se localiza en el cromosoma 4q28.1-q28.2
(Siintola et al. 2007), contiene 13 exones y codifica para una proteína de membrana
perteneciente a la superfamilia facilitadora principal de proteínas de transporte
lisosomal (MFSD8) de función desconocida.
Las mutaciones en el gen CLN7/MFSD8 presentan amplia distribución
geográfica y la mutación c.881C>A p.T294K es la más prevalente identificada en 14
pacientes pertenecientes a 12 familias procedentes de Roma originarias de la República
Checa (Kousi et al. 2009). La vLNCITTur presenta un curso clínico homogéneo y
solamente se ha descrito un paciente con fenotipo juvenil asociado a la mutación
c.468_469delinsCC p.Thr156_Ala157delinsthr156_Pro157 (Kousi et al. 2009).
28
2.4.4. Epilepsia progresiva con retraso mental y variante (CLN8)
Las mutaciones en el gen CLN8 causan dos fenotipos diferentes de enfermedad:
la epilepsia del norte, conocida como epilepsia progresiva con retraso mental (EPMR) y
una forma variante de inicio infantil tardío descrita en familias de origen turco
(vLNCIT).
La EPMR fue inicialmente descrita en pacientes de Finlandia (Hirvasniemi et al.
1994) y reconocida como una forma de LNC mediante los estudios neuropatológicos
realizados por Herva et al. (2000). La sintomatología se inicia entre los 5-10 años
(media 6.7) generalmente con crisis generalizadas tónico-clónicas y crisis parciales
complejas en algunos niños (Hirvasniemi et al. 1994) que aumentan en frecuencia en la
pubertad y son refractarias a tratamiento. Progresivamente disminuye la frecuencia de
las crisis, sin observarse remisión completa de las mismas en la edad adulta. A
diferencia de otras formas de LNC, las crisis mioclónicas no son un hallazgo común.
Después de 2-5 años del inicio de la epilepsia se instaura el deterioro cognitivo que
llega a ser moderado a la edad de 11-13 años y, a pesar de la disminución de la
frecuencia de las crisis epilépticas, conduce a retraso mental entre los 30-40 años.
Pueden aparecer trastornos de comportamiento como irritabilidad, inquietud e
inatención y a diferencia de otras formas de LNC, el déficit visual no es un hallazgo
característico. Los pacientes padecen alteraciones de la marcha a los 20-30 años de
edad, y desarrollan ataxia posteriormente, falleciendo después de la quinta década de la
vida (Ranta y Lehesjoki, 2000).
El curso clínico de EPMR ha sido dividido en tres estadios sucesivos
(Hirvasniemi et al. 1995): el primero (desde el inicio hasta la pubertad) se caracteriza
por un aumento en la frecuencia de las crisis tónico-clónicas generalizadas (4-10 / mes)
y rápido deterioro cognitivo. Durante el segundo estadio (juventud) la frecuencia de las
29
crisis disminuye y aparece torpeza motora y ataxia. En la última etapa (adulto) apenas
se observan crisis epilépticas pero el deterioro cognitivo continúa, evidenciándose el
retraso mental a los 40 años de edad.
La forma variante (vLNCIT) fue descrita inicialmente en Turkía, donde existe
un alto índice de consanguindad (Mitchell et al. 2001). Recientemente se han
identificado otros pacientes en Italia (Cannelli et al. 2006, Vantaggiato et al. 2009) e
Israel (Zelnik et al. 2007). Esta forma clínica presenta un inicio más precoz y
rápidamente progresivo que la EPMR. Se inicia entre los 2-7 años de edad, con crisis
mioclónicas y marcha inestable; otros síntomas como el progresivo déficit visual,
epilepsia y ataxia son comunes. La progresión de la enfermedad es tan rápida que a los
dos años del inicio de la sintomatología los pacientes presentan deterioro cognitivo y,
alrededor de los 10 años de edad desarrollan espasticidad, distonía, temblor y otros
signos extrapiramidales. La supervivencia de los pacientes con esta forma clínica no es
aún bien conocida y algunos han sobrevivido hasta la segunda década de la vida. En el
examen ultraestructural predominan los depósitos mixtos FP y CV (Williams et al.
1999c, Topcu et al. 2004), a diferencia de los pacientes con EPMR que presentan
principalmente GROD y CV (Herva et al. 2000).
El gen CLN8 (MIM #600143) se localiza en el cromosoma 8p23 (Tahvanainen
et al. 1994), contiene 3 exones y codifica para una proteína de membrana, localizada en
el retículo endoplásmico, de función desconocida (Ranta et al. 1999). Esta proteína
pertenece a la familia TLC (TRAM-LAG1-CLN8) y su función tiene importancia en el
metabolismo lipídico (Winter y Ponting, 2002).
La mutación missense c.70C>G p.R24G causa EPMR en la mayoría de los
pacientes finlandeses (Ranta et al. 1999) y en homocigosis está asociada con un curso
clínico atípico y prolongado de la enfermedad (Ranta et al. 2004). Se ha descrito un
30
curso clínico aún más benigno en un paciente de Finlandia, heterocigoto para las
mutaciones missense c.70C>G p.R24G y c.709G>A p.Gly237Arg (Siintola et al.
2006a). Las mutaciones c.88delG p.Val29fs y c.544-2566_590del p.Ala182AspfsX49
se asocian con un inicio más precoz y un curso clínico más progresivo, pero cuando se
encuentran en homocigosis con cambios no truncantes, se asocian a un fenotipo más
benigno de enfermedad (Reinhardt et al. 2010).
2.5. Forma congénita (CLN10)
La forma congénita (LNCC) fue descrita por Norman y Wood en 1941 y es la
más grave de todas las LNCs. Se han publicado, hasta ahora, 10 pacientes en la
literatura (Norman y Wood 1941, Brown et al. 1954, Sandbank 1968, Garborg et al.
1987, Barohn et al. 1992, Siintola et al. 2006b, Fritchie et al. 2009). Los enfermos
presentan microcefalia, convulsiones neonatales (incluso intrauterinas), apneas de
origen central y fallecimiento en las primeras horas o semanas de vida. Estudios
neuropatológicos postmortem han confirmado la existencia de atrofia cerebral (Fritchie
et al. 2009) y la presencia de GROD a nivel ultraestructural (Garborg et al. 1987,
Barohn et al. 1992, Steinfeld 2006, Fritchie et al. 2009). Se ha descrito un paciente con
fenotipo juvenil caracterizado por déficit visual y ataxia en edad escolar, deterioro
cognitivo progresivo y ceguera (Steinfeld et al. 2006).
La LNCC está producida por mutaciones en el gen CLN10 (MIM #610127), que
se localiza en el cromosoma 11p15.5 y contiene 9 exones. El gen CLN10 codifica para
la enzima catepsina D (CTSD), proteasa aspártico lisosomal que pertenece a la familia
de las pepsinas (Siintola et al. 2006b). Todas las mutaciones que eliminan
completamente la actividad de la enzima CTSD se asocian con la forma congénita
(Siintola et al. 2006b) mientras que las que mantienen actividad enzimática residual se
asocian con el fenotipo más leve de enfermedad (Steinfeld et al. 2006).
31
3. Exámenes complementarios
3.1. Electroencefalograma
El hallazgo electroencefalográfico característico de las LNCs es el
enlentecemiento progresivo de la actividad de base junto con la presencia de actividad
paroxística focal o generalizada (Sainio, 1997).
En los pacientes con LNCI, el electroencefalograma (EEG) es el primer examen
neurofisiológico que presenta alteraciones (Santavuori et al. 1973) y consisten en una
reacción atenuada a la apertura y cierre ocular alrededor del año de edad y desaparición
de las spindles o husos de sueño a la edad de 2 años (Vanhanen et al. 1997). Además, se
observa un descenso de la amplitud en regiones posteriores a la edad de 1.5-2 años con
evolución a un patrón isoeléctrico entre los 3-4 años de edad (Pampiglione y Harden
1977).
En el EEG de los pacientes con LNCIT se observan característicamente
complejos punta y punta onda en regiones posteriores durante la estimulación luminosa
a bajas frecuencias (1-2 Hz) (Pampiglione y Harden 1973). Este fenómeno puede estar
presente al inicio de la enfermedad, se hace evidente a los a los 3 años de edad y
persiste hasta estadíos avanzados.
Los registros EEG de los pacientes con LNCJ pueden ser normales hasta la edad
de 9 años. Posteriormente, muestran un trazado de base desorganizado, de baja amplitud
y un aumento en la actividad paroxística en forma de complejos puntas y ondas lentas
(Larsen et al. 2001).
El hallazgo electroencefalográfico descrito por Pampiglione y Harden (1973) se
observa a edad más tardía en los pacientes con vLNCITFin (7-8 años) y puede
desaparecer después de los 10 años de edad (Santavuori et al. 1991). Sin embargo, en
los pacientes con la vLNCITJuv este fenómeno puede aparecer entre los 2-4 años y es
32
transitorio (Elleder et al. 1997). En los pacientes con EPMR, el progresivo
enlentecimiento de la actividad de base en los registros EEG es constante durante la
pubertad y la actividad epileptiforme presenta una localización variable en forma de
puntas y ondas agudas (Lang et al. 1997).
3.2. Potenciales evocados visuales (PEV) y electrorretinograma (ERG)
En los pacientes con LNCI, las primeras alteraciones en el PEV se observan
alrededor de los 20 meses y el signo más precoz es la atenuación de las ondas corticales
seguido de un retraso progresivo de las latencias que condiciona ausencia de respuestas
entre los 2-5 años de edad (Vanhanen et al. 1997). Cuando el ERG es realizado con
electrodos corneales, la ausencia de respuestas puede observarse desde los 11 meses de
edad (Raitta y Santavuori 1973) mientras que si el ERG se realiza con estímulo flash,
las respuestas se muestran ausentes entre los 2-5 años de edad (Santavuori et al. 1992).
En fases precoces de la enfermedad, el PEV de los pacientes con LNCIT
presenta característicamente respuestas gigantes (amplitud de 355-375 micV) en
respuesta a la estimulación luminosa intermitente. Este hallazgo es tan llamativo que
cada respuesta del potencial se registra a modo de una gran punta polifásica en regiones
posteriores en el EEG. Se observa, además que el ERG se extingue precozmente, sin
embargo, el déficit visual ocurre en estadíos más avanzados de la enfermedad por lo que
este hallazgo no implica necesariamente pérdida completa de la función de la retina
(Harden et al. 1973).
No se han publicado hallazgos neurofisiológicos característicos en los pacientes
con LNCJ, aunque las alteraciones en el PEV y las respuestas abolidas en el ERG
pueden observarse precozmente, antes incluso del inicio del déficit visual (Raitta y
Santavuori 1981).
33
En los pacientes con vLNCITFin también se registran respuestas gigantes en el
PEV pero a una edad más tardía (7-9.5 años) que en los pacientes con LNCIT y el ERG
puede estar abolido entre los 8-9.5 años de edad (Santavuori et al. 1999).
3.3. Resonancia nuclear magnética
Los hallazgos neuroradiológicos característicos de las LNCs son la presencia de
atrofia cerebral y cerebelosa, leve hiperintensidad de la sustancia blanca en T2 y
adelgazamiento del córtex. Estas alteraciones no son específicas y generalmente se
correlacionan con la duración de la enfermedad (D’Incerti, 2000).
En los pacientes con LNCI las alteraciones en la RNM pueden aparecer antes
del inicio de la sintomatología y varían con la evolución de la enfermedad (Vanhanen et
al. 1995a). En los estadíos iniciales (7-11meses de edad) los tálamos aparecen
hipointesos comparados con la sustancia blanca y los ganglios basales en las imágenes
T2 y, se aprecia hiperintensidad de la sustancia blanca periventricular. La atrofia
cerebral es progresiva, más llamativa que la atrofia cerebelosa y se puede poner de
manifiesto desde los 13 meses de edad (Santavuori et al. 2000). En los primeros 4 años
de la vida estas alteraciones progresan tan rápidamente que la grave atrofia cerebral
incluye tálamos y ganglios basales. A partir de los 4 años los hallazgos descritos
anteriormente se estabilizan al igual que la sintomatología y el córtex cerebral se hace
tan delgado que es difícil diferenciarlo de la sustancia blanca, la cual aparece muy
hiperintensa (Vanhanen et al. 2004).
A diferencia de la LNCI, las alteraciones en la RNM de los pacientes con
LNCIT pueden aparecer un año después del inicio de la sintomatología (Seitz et al.
1998). Los hallazgos neuroradiológicos más característicos de la LNCIT son la
progresiva atrofia cerebral, de predominio infratentorial con afectación cerebelosa, así
34
como la hiperintensidad de la sustancia blanca en T2 con normalidad del tálamo y de los
ganglios basales (Petersen et al. 1996, Seitz et al. 1998).
La RNM puede ser normal antes de los 10 años de edad en pacientes con LNCJ
(Santavouri et al. 2001) y la atrofia cerebelosa aparece precozmente con progresión más
lenta que en los pacientes con LNCIT (Autti et al. 2008). La hipointensidad del tálamo
en T2 es un hallazgo frecuente y la hiperintensidad de la sustancia blanca
periventricular puede estar presente, aunque no de forma tan pronunciada como en
LNCI y LCNIT (D’Incerti 2000, Barkhof et al. 2005).
En los pacientes con vLNCITFin destaca la atrofia cerebelosa que aparece a
edad más precoz que en los pacientes con LNCJ (Autti et al. 1992). Las imágenes de
RNM en T2 muestran hiperintensidad de la sustancia blanca periventricular y del brazo
posterior de la cápsula interna y se observa característicamente hipointensidad del
tálamo respecto a otros ganglios de la base (Autti et al. 1992, Holmberg et al. 2000).
Las alteraciones descritas en la RNM de pacientes con vLNCITJuv son muy
similares a la vLNCITFin y consisten en atrofia cerebral generalizada principalmente a
nivel infratentorial, hipointensidad del tálamo y putamen e hiperintensidad de la
sustancia blanca periventricular (Peña et al. 2001).
La atrofia cerebelosa y de tronco del encéfalo se describen a edad juvenil como
signos iniciales observados en la RNM de pacientes con EPMR. La atrofia cerebral es
de aparición más tardía y se relaciona con el deterioro cognitivo y la duración de la
epilepsia (Hirvasniemi y Karumo, 1994). No se han descrito alteraciones en la
intensidad de la señal en T2 en pacientes con EPMR (Lauronen et al. 2001). Sin
embargo, en los pacientes con la forma variante (vLNCIT) destaca además de la atrofia
cerebral generalizada, un aumento de la señal de la sustancia blanca periventricular y
35
del brazo posterior de la cápsula interna en imágenes T2 (Striano et al. 2007, Reinhart et
al. 2010).
Existen publicaciones que correlacionan las alteraciones neuroradiológicas
postmorten y las características histopatológicas del material de necropsia. En pacientes
con LNCI, la extrema atrofia cerebral y la hipointensidad de sustancia gris en relación a
la sustancia blanca observadas en imágenes T2 de la RNM postmorten, se corresponden
a nivel histopatológico con pérdida completa neuronal cortical y desaparición de los
axones y las vainas de mielina en la sustancia blanca (Vanhanen et al. 1995b). En
pacientes con LNCJ, las imágenes de hiperintensidad de la sustancia blanca
periventricular observadas en imágenes T2 de la RNM postmorten, se corresponden a
nivel histológico con una importante pérdida de mielina y gliosis (Autti et al. 1997).
3.3.1. Espectroscopía
En la RNM con espectroscopía (RNMs) realizada a pacientes con LNCI entre
los 3-5 meses de edad, la concentración de N-acetil-aspartato (NAA) presenta un ligero
descenso y la relación colina /creatinina está aumentada. A partir de la edad de 17 meses
se puede apreciar un moderado descenso del NAA y la colina permanece aumentada
como signo de demielinización progresiva. En el estadío final (6 años de edad) existe
una desaparición casi completa de los niveles de NAA, colina y creatina lo que indica
pérdida neuroaxonal, demielinización progresiva y gliosis (Vanhanen et al. 2004). Las
concentraciones de mioinositol y lactato permanecen discretamente elevadas en
sustancia blanca y gris (Brockmann et al. 1996).
Existen escasos trabajos publicados respecto a los hallazgos de espectroscopía
en pacientes con LNCIT. El descenso de la concentración de NAA, un aumento de
mioinositol, y la ausencia de lactato se han descrito en esta forma clínica (Seitz et al.
36
1998) aunque se ha publicado un paciente con aumento de lactato en la sustancia blanca
y gris (Brockmann et al. 1996).
A diferencia de la LNCI y LNCIT, la espectroscopía de los pacientes con
LNCJ presenta niveles normales de metabolitos y la progresión de la enfermedad
refleja un descenso del NAA y de la creatina en la sustancia gris cerebral (Brockmann et
al. 1996).
37
4. Diagnóstico
El proceso de diagnóstico de las LCNs es una tarea complicada debido a que son
enfermedades neurodegenerativas poco frecuentes, poco conocidas, con amplia
variabilidad clínica y heterogeneidad genética. El diagnóstico clínico de cada una de
estas enfermedades está basado en la combinación de hallazgos clínicos (edad de
presentación e índice de progresión de la enfermedad) y exámenes complementarios.
Ante un paciente con sospecha clínica de lipofuscinosis neuronal ceroidea el
método de screening más efectivo es la identificación de las inclusiones mediante la
visualización al microscopio óptico de leucocitos o al microscopio electrónico de los
tejidos biopsiados por un profesional anatomopatólogo experto. Sin embargo, un
resultado negativo no excluye el diagnóstico y la morfología del material depositado
puede variar dependiendo del tejido examinado. En este sentido, los estudios de
actividad enzimática (PPT1, TPP1 y CTSD) preceden al estudio de microscopía
electrónica, cuando existe alta sospecha de enfermedad producida por mutación en los
genes CLN1, CLN2 y CLN10 respectivamente.
Ante la sospecha clínica de LNC en un niño menor de 4 años el diagnóstico
clínico más probable es LNCI y/o LNCIT. La determinación enzimática PPT1 y TPP1
confirman el diagnóstico junto con el análisis molecular de los genes CLN1 y CLN2
respectivamente. Los estudios de microscopía electrónica están indicados cuando la
actividad enzimática es normal y es necesario considerar las formas variantes infantil
tardía de LNC (CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8).
Si la enfermedad comienza en un niño en edad escolar con progresivo déficit
visual, debe sospecharse la LNCJ como diagnóstico más probable. En ese caso, la
presencia de linfocitos vacuolados en sangre periférica junto con la identificación de la
38
delección común 1.02-kb en el gen CLN3 y / o la secuenciación completa del gen CLN3
deben ser investigados con el fin establecer el diagnóstico definitivo.
Las formas variantes infantil tardía de lipofuscinosis (vLNCITFin, vLNCITJuv,
vLNCITTur, EPMR, vLNCIT) son muy parecidas clínicamente y las inclusiones son de
tipo mixto, por tanto el único modo de diferenciar definitivamente cada una de estas
entidades y clasificar a los pacientes en la forma clínica correspondiente es el análisis
genético-molecular de cada uno de los genes (CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8)
respectivamente. Sin embargo, el estudio de mutaciones específicas puede ser prioritario
en ciertas poblaciones donde éstas son muy frecuentes: CLN6 (p.E72X) en pacientes de
Costa Rica, CLN7 (p.T294K) en familias gitanas romanas procedentes de la antigua
Checoslovaquia y CLN8 (p.R24G) en pacientes de Finlandia con EPMR.
En aquellas familias con mutación en los genes CLN1, CLN2 ó CLN10
identificada previamente, el diagnóstico prenatal está disponible mediante los estudios
enzimáticos y de genética molecular (Berry-Kravis et al. 2000). En el resto de las
familias estos estudios requieren previa detección de inclusiones en las vellosidades
coriónicas e identificación de las mismas mediante microscopía electrónica.
En el proceso diagnóstico de las LNCs es fundamental la presencia de un equipo
multidisciplinar formado por neuropediatras, neurofisiólogos, neurorradiólogos,
anatomopatólogos, genetistas y bioquímicos, con el fin de diferenciar cada forma clínica
y diagnosticar de modo preciso a cada paciente.
Existen en la literatura publicados diversos algoritmos diagnósticos que facilitan
el diagnóstico de las diferentes formas clínicas de LNC y que se muestran a
continuación:
39
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1428
Figura 3. Algoritmo para el diagnóstico de las lipofuscinosis neuronal ceroidea. Newborn Young child School child Microcephaly Seizures, Retinopaty Seizures developmental standstill (dementia)
Kohlschütter A. y Schulz A. 2009
Figura 4. Algoritmo para el diagnóstico de las lipofuscinosis neuronal ceroidea.
Enzyme activities Cathepsin D PPT1 TPP1 Absent absent absent all normal
Lymphocyte vacuoles Absent present
Electron microscopy
CLN5, 6,7, 8 CLN3 CLN2 CLN1 CLN10
40
Kohan R et al. 2011
Figura 5. Estrategia para el estudio de lipofuscinosis neuronal ceroidea. Conseso del 12th Congreso de LNC celebrado en Hamburgo – Alemania (2009). Coordinado por Dr. R. Williams.
Review clinical diagnosis; complete other neuro-metabolic investigations
Negative enzyme analysis
PPT1 deficiency
TTP1 deficiency
Vacuolated lymphocytes positive
Other diagnosis confirmed
NCL confirmed
CLN1 mutation analysis
CLN2 mutation analysis
CLN3 mutation analysis
Mutation analysis CLN3 CLN5 CLN6
CLN7/MFSD CLN8
Priority dependent on ethnic origin, clinical features, and ultraestructural features
Suspected NCL on basis of clinical features, ophthalmology assessment and neurophysiology findings. No other diagnosis identified.
High index of suspicion
CTSD, TPP1, PPT1 activities, vacuolated lymphocytes, skin biopsy or buffy coat for EM, DNA save
Lymphocytes or skin biopsy for ultra structural analysis (and fibroblast culture)
No positive results
NCL like syndrome
CTSD deficiency
CLN10 mutation analysis
41
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42
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with retinopathy, seizures developm
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entia and dementia (type B
) Figura 7. 13th International C
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eroid Lipofuscinoses (Batten D
isease) & Patient O
rganisation Meeting. London 2012.
Lymphocyte vacuoles
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CLN
12 C
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Type A
Type B
Dominant
43
5. Tratamiento
El tratamiento de un paciente con LNC exige un amplio conocimiento de la
enfermedad y destreza por parte del clínico ya que actualmente no existe un tratamiento
curativo y el deterioro neurológico del paciente puede ser relativamente rápido con
fallecimiento a edad precoz.
El verdadero desafío es prevenir la neurodegeneración, restauraurando la
funcionalidad del sistema nervioso central. En este sentido, actualmente se están
realizando estrategias terapeúticas y diferentes ensayos clínicos
http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=neuronal+ceroid+lipofuscinosis en
pacientes con LNCI, LNCIT y LNCJ. Algunas de estas terapias se describen de forma
sucinta a continuación.
5.1. Terapia de reemplazamiento enzimático
La terapia de reemplazamiento enzimático (ERT) ha obtenido resultados
satisfactorios en enfermedades lisosomales con afectación visceral. En las enfermedades
con afectación del sistema nervioso central (SNC) su efectividad es menor debido a la
existencia de la barrera hematoencefálica (BHE) que no permite el paso de ciertos
compuestos o sustancias. Las formas clínicas de LNCs producidas por mutaciones en
los genes CLN1, CLN2 y CLN10 son enfermedades caracterizadas por déficit parcial o
ausencia total de las enzimas PPT1, TPP1 y CTSD respectivamente. El primer estudio
con ERT para CLN1 fue publicado por Lu et al. (2010) quienes diseñaron una enzima
PPT1 recombinante humana en una línea celular de ovario en un hamster chino. Tras la
inyección por vía intravenosa de la enzima PPT1 en el hamster, se observó incremento
de los niveles en riñón, hígado, corazón, pulmón y bazo, pero mínimamente en cerebro.
La efectividad de la ERT en esta forma clínica y en la LNCIT es un campo de
investigación en la actualidad.
44
5.2.- Terapia génica
La terapia génica implica la introducción de una copia del gen normal y
funcionante mediante la infección directa de células in vivo a través de un virus vector,
el cual es modificado para reducir su virulencia y evitar patogenicidad. Los virus se
utilizan para distribuir una copia normal del gen defectuoso. El gen normal transportado
por el virus vector posee la capacidad de sintetizar y segregar proteína normal. Algunas
células somáticas internalizan la proteína, sin embargo debido a la dificultad para
atravesar la BHE la proteína presenta dificultad para distribuirse en el SNC. La
inyección del virus vector directamente en SNC de pacientes con mutaciones en los
genes CLN2 es una opción terapeútica que está en fase de ensayo clínico en EEUU.
5.3.- Terapia farmacológica
El tratamiento paliativo y sintomático del que pueden beneficiarse los pacientes
con LNC incluye, entre otros: tratamiento de la epilepsia, de las manifestaciones
extrapiramidales y del estado nutricional. Además, es necesario considerar las
interacciones farmacológicas y la susceptibilidad por parte de estos pacientes para
desarrollar reacciones adversas. También hay que tener en cuenta el estado general de
estos pacientes en caso de ser sometidos a procedimientos quirúrgicos que precisen de
anestesia general.
5.3.1.- Tratamiento antiepiléptico
Los fármacos antiepilépticos (FAEs) desempeñan un papel muy importante en el
control de las crisis epilépticas, y deben seleccionarse teniendo en cuenta el tipo de
crisis, el estado clínico del paciente y los efectos secundarios. Con frecuencia son
necesarios varios fármacos para conseguir un adecuado control crítico, difícil de
alcanzar en la mayoría de los pacientes.
45
El Valproato (VPA) es uno de los FAEs básicos en el tratamiento de la epilepsia
de los pacientes con LNC. Es eficaz en las convulsiones generalizadas primarias y
parciales secundariamente generalizadas. Es bien tolerado, sin efectos secundarios
importantes. La combinación de Fenobarbital (PB) y VPA fue utilizada durante muchos
años, pero desde 1990 la Lamotrigina (LTG) ha reemplazado al PB debido a que posee
efectos secundarios menos importantes y ha demostrado su eficacia en las crisis
parciales y generalizadas. La Carbamacepina (CBZ), la Fenitoína (PHT) y la
Vigabatrina (VGB) pueden empeorar las crisis epilépticas mioclónicas por lo que están
contraindicados (Aberg et al. 1999). El Clonacepam (CZP) es el FAE más efectivo en
pacientes con EPMR y cuando se administra en la pubertad puede normalizar las
alteraciones electroencefalográficas (Lang et al. 1997).
5.3.2.- Tratamiento de los síntomas extrapiramidales
Existen pocos estudios controlados que avalen la eficacia de los fármacos
antiparkinsonianos. En un estudio de Aberg et al. (2001) la Levo-dopa demostró un
efecto beneficioso en pacientes con LNCJ, revelando resultados alentadores, mientras
que la Selegilina demostró mínima eficacia.
5.3.3.- Tratamiento nutricional
En las fases iniciales de la enfermedad, en que la deglución está preservada, es
importante mantener una dieta rica en fibra para evitar el estreñimiento. En etapas
avanzadas, cuando los pacientes desarrollan disfagia, la realización de una gastrostomía
endoscópica percutánea (PEG) puede contribuir decisivamente no sólo a una adecuada
nutrición e hidratación sino también, a un adecuado aporte calórico. Además, esta
técnica minimiza los posibles episodios de aspiración pulmonar y facilita la
administración de la medicación, mejorando la calidad de vida del paciente.
47
JUSTIFICACIÓN DE LA UNIDAD TEMÁTICA E HIPÓTESIS 1. Justificación de la unidad temática
2. Hipótesis
49
1. Justificación de la unidad temática
En los últimos 15 años se han producido avances muy importantes en las bases
moleculares de las lipofuscinosis neuronal ceroidea, un grupo de enfermedades que
comparten un amplio e inespecífico espectro de síntomas y que en la infancia, están
causadas por las mutaciones identificadas en los siguientes genes: CLN10/CTSD,
CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8 y CLN8. El propósito de
esta tesis es el estudio de este grupo de enfermedades en la población pediátrica
española obedeciendo a dos motivos principales: 1) Las lipofuscinosis neuronal
ceroidea constituyen uno de los grupos de enfermedades neurometabólicas hereditarias
más frecuentes en la infancia y su estudio podría contribuir a encontrar nuevos pacientes
al ser enfermedades que probablemente se encuentren infradiagnosticadas en la
población pediátrica española 2) La baja prevalencia de las diferentes formas clínicas
de lipofuscinosis neuronal ceroidea ha determinado que aún existan múltiples aspectos
clínicos y genéticos que deberían ser investigados en mayor profundidad para mejorar el
conocimiento de estas enfermedades.
Con este trabajo se pretende avanzar en el estudio de las LNCs, determinar la
distribución de cada forma clínica dentro de la población española y realizar una
adecuada correlación clínico-molecular.
El conjunto de trabajos que forman parte de esta tesis doctoral pretenden dar a
conocer la historia natural de la enfermedad y profundizar en el conocimiento de cada
forma clínica de LNC. El diseño de una adecuada estrategia de diagnóstico clínico,
bioquímico, anatomopatológico y molecular permitirá una mejor caracterización clínica
de los pacientes y el abordaje de los estudios de correlación genotipo-fenotipo en este
grupo de enfermedades poco prevalentes. Este estudio parte de una base clínica, la
actividad asistencial de los neuropediatras de diferentes hospitales de la geografía
50
española que atienden a pacientes con regresión del desarrollo psicomotor, epilepsia y
déficit visual, y se ha desarrollado a través de un trabajo coordinado con profesionales
del campo de las neurociencias, incluyendo bioquímicos clínicos, anatomopatólogos y
genetistas de la provincia de Barcelona para tratar de avanzar en el conocimiento de las
lipofuscinosis neuronal ceroidea en sus aspectos clínicos, bioquímicos,
anatomopatológicos y genéticos. Este abordaje multidisciplinar es hoy en día esencial
para un estudio adecuado de las enfermedades metabólicas neurodegenerativas ya que
permite mejorar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de la enfermedad y futuros
tratamientos a aplicar en nuestros pacientes.
Dado que las LNCs son enfermedades para las que no se dispone de tratamiento
curativo en la actualidad, consideramos que el conocimiento de la historia natural de la
enfermedad será de vital importancia para aplicar futuras terapias, establecer un
pronóstico y valorar los efectos del tratamiento que tratan de enlentecer la progresión de
la enfermedad.
2. Hipótesis
El estudio en profundidad de una amplia serie de pacientes españoles
diagnosticados de LNC en los últimos 37 años y el análisis molecular de la mayoría de
ellos, caracterizará de forma adecuada las diferentes formas clínicas de LNC en España.
La elaboración de una base de datos clínica nos permitirá recopilar los datos
clínicos, bioquímicos, anatomopatológicos y moleculares de los pacientes pediátricos
con diagnóstico probable y confirmado de LNC. El análisis detallado de estos datos nos
ha de permitir describir el espectro clínico y mutacional de la población española con
LNC, elaborar un protocolo de estudio para este grupo de enfermedades y realizar una
adecuada correlación genotipo-fenotipo.
51
OBJETIVOS 1. Objetivo principal
2. Objetivos específicos
53
1. Objetivo principal
Nos proponemos, a través de los estudios realizados en los pacientes españoles
con lipofuscinosis neuronal ceroidea, profundizar en el conocimiento de los aspectos
clínicos y moleculares de este grupo de enfermedades, determinar el espectro
mutacional de los genes CLN1, CLN2, CLN3, CLN5 y CLN7 y establecer una adecuada
correlación genotipo-fenotipo en la población pediátrica de nuestro país.
2. Objetivos específicos
� Valorar la evolución cronológica y severidad de la forma infantil precoz de
lipofuscinosis neuronal ceroidea y describir el espectro mutacional del gen CLN1.
� Estudiar la progresión de la enfermedad y su correlación con el genotipo en
pacientes con la forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea y
mutaciones en el gen CLN2.
� Avanzar en el estudio de la historia natural de la forma juvenil de lipofuscinosis
neuronal ceroidea y diferenciar el curso clínico de la enfermedad en los pacientes
que presentan el fenotipo clásico (cLNCJ) de aquellos con el fenotipo variante
(vLNCJ). Establecer correlaciones genotipo-fenotipo mediante la descripción del
curso clínico y los resultados de los estudios bioquímicos, anatomopatológicos y
moleculares de los genes CLN1 y CLN3.
� Realizar un estudio detallado de la sintomatología que caracteriza a las formas
variantes infantil tardía finlandesa y turca y describir el análisis mutacional de los
genes CLN5 y CLN7 respectivamente.
� Elaborar un protocolo de estudio que facilite el proceso diagnóstico en el conjunto
de las lipofuscinosis neuronal ceroidea y que contribuya a encontrar nuevos
pacientes con las diferentes formas clínicas de LNC en España.
55
PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS 1. Pacientes y diseño del estudio
2. Métodos para el estudio neuropatológico 3. Métodos bioquímicos 4. Métodos para el estudio molecular 5. Aspectos éticos 6. Análisis estadístico
57
1. Pacientes y diseño del estudio
1.1. Para el estudio de la forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCI) se
estudiaron desde el año 1974 a 2011 un total de 6 pacientes (3 varones y 3
mujeres) de edades entre los 3 y 12 años pertenecientes a 5 núcleos familiares y
que presentaron mutaciones en el gen CLN1 y /o déficit de PPT1 y / o GROD a
nivel ultraestructural.
1.2. Para el estudio de la forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea
(LNCIT) se estudiaron desde el año 1979 a 2011 un total de 12 pacientes (8
varones y 4 mujeres) de edad media de 7.4 años (rango 4-14) pertenecientes a 10
núcleos familiares y que presentaron mutaciones en el gen CLN2 y /o déficit de
TPP1 y / o CV a nivel ultraestructural.
1.3. Para el estudio de la forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCJ) se
estudiaron desde el año 1975 a 2010 un total de 24 pacientes españoles (11 varones
y 13 mujeres) de edad mediana de 18.3 años (rango 10-33) pertenecientes a 18
núcleos familiares. Los pacientes se dividieron en dos grupos: variante (vLNCJ)
que incluyó 11 pacientes (edad mediana 18 años, rango 10-23) con mutaciones en
el gen CLN1 y / o GROD a nivel ultraestructural y grupo clásico (cLNCJ) que
incluyó 13 pacientes (edad mediana 18 años, rango 10-33) con mutaciones en el
gen CLN3 y / o FP a nivel ultraestructural.
1.4. Se describieron las características clínicas, anatomopatológicas y moleculares de 3
pacientes con la forma variante infantil tardía finlandesa (vLNCITFin) y
mutaciones en el gen CLN5 y, de un paciente con la forma variante infantil tardía
turca (vLNCITTur) y mutaciones en el gen CLN7, procedentes de diferentes núcleos
familiares.
58
Los datos de cada paciente fueron recogidos mediante la revisión retrospectiva y
prospectiva de las historias clínicas correspondientes y la realización de entrevistas a los
familiares y / o profesionales neuropediatras referentes de los pacientes. Para la
recopilación y posterior análisis detallado de dichos datos, fue necesario crear una base
de datos clínica con 50 ítems (Pérez -Poyato et al. 2011) (Tabla 3).
59
Tabla 3. Ítems de la base de datos clínica de las lipofuscinosis neuronal ceroidea
Ítem# Descripción Ítem# Descripción
1 Fecha exploración 26 Trastorno de aprendizaje
2 Nombre y apellidos paciente 27 Retraso mental
3 Fecha y lugar de nacimiento 28 Bradipsiquia
4 Nombre del medico referente 29 Conducta autista
5 Edad actual del paciente 30 Trastorno de comportamiento
6 Edad al diagnóstico clínico 31 Epilepsia
7 Edad al diagnóstico ultraestructural 32 Tipo de crisis epilépticas
8 Edad al diagnóstico molecular 33 FAE y respuesta al tratamiento
9 Consanguinidad 34 Déficit visual
10 Otros miembros familiares con LNC 35 Ceguera
11 Embarazo 36 Marcha apráxica
12 Parto 37 Ataxia
13 Peso al nacimiento 38 Signos piramidales
14 Hitos del desarrollo psicomotor 39 Espasticidad y contracturas de las extremidades
15 Edad de inicio de la sintomatología 40 Hallazgos en el electroencefalograma
16 Síntoma inicial 41 Atrofia cerebral / cerebelosa (MRI/TC)
17 Edad de la pérdida de la deambulación 42 Hallazgos oftalmológicos
18 Edad de utilizar silla de ruedas 43 Hallazgos en el electrorretinograma
19 Edad de la pérdida de la sedestación 44 Potenciales evocados visuales
20 Edad de la pérdida de la manipulación 45 Linfocitos vacuolados
21 Edad de la pérdida de las frases 46 Estudios enzimáticos
22 Edad de ausencia comunicación verbal 47 Estudios de microscopía electrónica
23 Disfagia 48 Estudios moleculares
24 Sonda nasogástrica / PEG 49 Forma clínica de LNC
25 Edad de la incontinencia urinaria 50 Edad del fallecimiento
60
2. Métodos para el estudio neuropatológico
Las muestras de piel, conjuntiva, apéndice y músculo obtenidas por biopsia
fueron procesadas para estudio con microscopio electrónico. Las muestras se fijaron en
glutaraldehído al 2.5 % en tampón fofato, postfijadas en tetróxido de osmio al 2%,
deshidratadas en gradientes de acetona o alcohol, e incluidas en resinas de epóxido. Las
secciones semifinas fueron teñidas con azul de toluidina y las secciones ultrafinas con
acetato de uranio y citrato de plomo.
Para realizar el estudio neuropatológico cerebral procedente de necropsia de un
paciente con LNCI, el cerebro fue fijado en formalina tamponada al 4% durante 4
semanas y, posteriormente, cortado en secciones coronales. Las secciones hemisféricas
de las diferentes regiones del cerebro, cerebelo y tronco del encéfalo fueron incluidas en
parafina. Las secciones de 4 micras de espesor fueron obtenidas con un microtomo de
deslizamiento, y teñidas con hematoxilina-eosina, Klüver Barrera, PAS e
immunohistoquímica para la proteína glial fibrilar acídica para astrocitos y lectinas para
microglia. Además, otras secciones desparafinas y sin teñir fueron visualizadas con
microscopio de fluorescencia.
3. Métodos bioquímicos
La actividad de las enzimas PPT1 y TPP1 fue medida en muestras de leucocitos
o fibroblastos cultivados. Los análisis enzimáticos fluorométricos fueron realizados
utilizando 4-metillumbeliferil-6-tiopalmitoil � –D-glucosido (Moscerdam Substrates,
Rotterdam, Holland) como sustrato para la enzima PPT1 y Ala-Ala-Phe-7-amido-4-
metilcoumarina (Sigma®) como sustrato para la enzima TPP1. Las mediciones proteicas
se realizaron según el método de Lowry et al. (1951)
61
4. Métodos para el estudio molecular
El estudio molecular de las muestras de los pacientes de esta tesis ha sido
realizado en el Servicio de Bioquímica y Genética Molecular del Hospital Clinic de
Barcelona, a excepción de las muestras en las que se estudiaron los genes CLN5 y CLN7
que se derivaron a un centro externo.
Dado que se trata de una enfermedad muy heterogénea desde el punto vista
genético con 8 genes implicados, la elección del gen a estudiar se ha realizado en base a
la sospecha clínica y a los resultados del estudio de la proteína cuando se ha dispuesto
de ellos.
En primer lugar, se ha realizado una extracción de DNA mediante método
manual de Salting out o mediante un extractor automático Magnapure de Roche. Se ha
partido siempre de muestra de sangre total con un volumen mínimo de 1ml.
Se ha realizado el estudio de la región codificante de los genes CLN1, CLN2 y
CLN3 utilizando los primers previamente descritos (Goebel y Wisniewski 2004; Mole
2004; Taschner et al. 2005) mediante SSCPs (single Strand Conformation
Polymorphism) en los casos anteriores al año 2008 y, posteriormente el estudio se
realizó por secuenciación directa bidireccional de las regiones codificantes y límites
exon-intron (50bp).
La mutación recurrente de CLN3 (1.02-kb que contiene los exones 7 y 8)
(GenBank X99832) fue estudiada mediante unos primers diseñados específicamente
(Munroe et al. 1997) y analizada en agarosa.
Las referencias de los genes utilizados para la nomenclatura de las mutaciones
ha sido la siguiente: gen CLN1 (ENSG00000131238), gen CLN2 (ENSG00000166340)
y gen CLN3 (ENSG00000188603).
62
Cundo se encontró un cambio en la secuencia de cualquiera de los genes, se
revisaron bases de datos para ver si estaba descrito previamente: HGMD® Human Gene
Mutation Database – BioBase: www.biobase-international.com/product/hgmd y Batten
disease Resource www.ucl.ac.uk/ncl/.
Si no ha sido descrita previamente se ha utilizado el programa de predicción de
patogenicidad Polyphen 2: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/
Una vez confirmada que se trata de una mutación responsable de enfermedad,
está ha sido estudiada en sus padres (portadores obligados) antes de ofrecer consejo
genético.
5. Aspectos éticos
Todos los padres o tutores legales de los pacientes que participaron en los
diferentes estudios firmaron un consentimiento informado, de acuerdo con la
Declaración de Helsinki de 1964, revisada en Edimburgo en el año 2000.
Los diferentes estudios cuentan con la aprobación del comité de ética y de
investigación del Hospital Sant Joan de Déu y del Hospital Clínic.
6. Análisis estadístico
Las variables clínicas fueron recogidas en una base de datos (Microsoft Excel).
Para los estudios estadísticos se han aplicado las siguientes pruebas:
� Análisis de supervivencia: prueba de Kaplan – Meier
� Ajuste para comparaciones múltiples: prueba de corrección de Bonferroni
63
Los detalles de estas pruebas figuran en cada uno de los artículos publicados.
Los cálculos estadísticos se realizaron con el programa SPSS 17.0. Las pruebas
estadísticas se consideraron significativas para una p< 0.05.
65
RESULTADOS 1. Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración
clínica de una serie de pacientes españoles
2. Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional del
gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles
3. Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico y
estudios genéticos en pacientes españoles
4. Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y
turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea
5. Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea
67
1. Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración
clínica de una serie de pacientes españoles
Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: Follow-up on a Spanish series
María del Socorro Pérez-Poyato, Montserrat Milá Recasens, Isidre Ferrer Abizanda,
Rosario Domingo Jiménez, Amparo López Lafuente, Victoria Cusí Sánchez, Laia
Rodriguez-Revenga, M Josep Coll Rosell, Laura Gort, Pilar Póo Argüelles, Mercé
Pineda Marfa.
Gene 2012; 499: 297-302.
Las manifestaciones clínicas de la forma infantil de lipofuscinosis neuronal
ceroidea (LNCI) han sido ampliamente estudiadas en la población finlandesa
(Santavuori et al. 1973, 1974) y existen publicadas pocas series de pacientes
procedentes de los países del sur de Europa. Se han identificado varias mutaciones en el
gen CLN1 que causan LNCI en determinados países asociadas a un fenotipo severo de
enfermedad.
Describimos de forma detallada las características clínicas, el seguimiento y la
evolución cronológica de la enfermedad en una serie de seis pacientes españoles con
LNCI. Este trabajo contribuye al estudio de la correlación genotipo-fenotipo en
pacientes con LNCI procedentes de países del área Mediterránea y confirma que la
mutación V181M en el gen CLN1 está clínicamente asociada con el fenotipo severo de
esta enfermedad.
69
Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: Follow-up on a Spanish series
Maria Socorro Pérez Poyato a,⁎, Montserrat Milá Recansens c,d, Isidre Ferrer Abizanda e,Rosario Domingo Jiménez f, Amparo López Lafuente g, Victoria Cusí Sánchez b, Laia Rodriguez-Revenga c,d,M. Josep Coll Rosell c,d,h, Laura Gort c,d,h, Pilar Póo Argüelles a, Mercé Pineda Marfa a,c
a Department of Pediatric Neurology, Hospital de Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spainb Service of Anatomical Pathology, Hospital de Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spainc Centre for Biomedical Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto de Salud Carlos III, Spaind IDIBAPS, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spaine Institute of Neuropathology, Service of Anatomical Pathology, IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge, Barcelona, CIBERNED, Spainf Department of Pediatric Neurology, Hospital Virgen de la Arrixaca, Murcia, Spaing Department of Pediatric Neurology, Hospital San Pedro de Alcántara, Cáceres, Spainh Inborn Errors of Metabolism (IBC) - Biochemical and Molecular Genetics Department, Hospital Clínic, Barcelona, Spain
a b s t r a c ta r t i c l e i n f o
Article history:Accepted 9 February 2012Available online 22 February 2012
Keywords:Infantile neuronal ceroid lipofuscinosisFollow-upCLN1/PPT gene
Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis (INCL; NCL1, Haltia-Santavuori disease) is caused by mutations in theCLN1/PPT gene which are associated with an early onset INCL phenotype. The most detailed descriptions ofINCL have come from Finland and a few series have been reported from southern European countries. Clinicalcourse and follow-up of six Spanish patients with INCL are reported with the aim of assessing the chronolog-ical evolution and severity of this disease. The age at disease onset ranged from 8 to 15 months. Delayedmotor skills were the initial symptom when the disease began before 12 months of age, and ataxia was thefirst sign when the disease began later. Cognitive decline, which is described between 12 and 18 months ofage, occurred from 16 to 20 months of age. In our series early stage is characterized by motor impairment,cognitive decline and autistic features. Visual failure may appear simultaneously with the neurological symp-toms, leading quickly to blindness. As reported, psychomotor regression appeared between 2 and 3 years ofage. Myoclonic jerks occurred after 24 months of age and epilepsy was the last symptom of the disease. Wereport two novel mutations in a patient without epilepsy to date and describe the features of two siblings ho-mozygous for the V181M (c.541 G>A) mutation, associated with the most severe INCL phenotype. The clin-ical evolution might be helpful to identify patients affected by this rare disease. Early diagnosis is essential inorder to provide genetic counselling to affected families. Our series may contribute to the study of the geno-type–phenotype INCL correlation in the Mediterranean countries.
© 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Neuronal ceroid lipofuscinosis (NCLs) is one of the most commongroups of progressive neurodegenerative diseases in childhood (Goebeland Sharp, 1998). The global incidence has been reported to be 1/
12,500 live births (Vesa et al., 1995) and the prevalence varies dependingupon ethnicity and country of origin (Cardona and Rosati, 1995; UvebrantandHagberg, 1997). NCLs are characterized by accumulation of autofluor-escent lipopigments in neural and non-neural tissues. The NCLs are de-fined by the astrocytic activation and progressive neuronal loss withinthe central nervous system (Cooper et al., 2006). Phenotypes have beenclassified, considering age of onset, clinical course, and ultrastructuralmorphology, into infantile, late-infantile, juvenile, and adult forms(Goebel et al., 1999).
Infantile NCL (INCL; NCL1, Haltia-Santavuori disease) is character-ized by granular osmophilic deposits (GROD) on ultrastructure(Rapola and Haltia, 1973) and is caused by deficiency of the lysosomalenzyme palmitoyl-protein thioesterase (PPT) (Vesa et al., 1995)which is encoded by the CLN1 gene (Jarvela et al., 1991). Severe phe-notype in INCL is usually associated with mutations in the CLN1 gene,which are likely to abolish the enzymatic activity of PPT (Das et al.,1998). Mutations in the CLN1/PPT gene have been reported to cause
Gene 499 (2012) 297–302
Abbreviation: CT, computed tomography; CZP, Clonazepam; CLB, Clobazam; EEG,Electroencephalography; ERG, Electroretinography; GROD, granular osmophilic depòsit;INCL, NCL1, Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; JNCL, Juvenile neuronal ceroidlipofuscinosis; LINCL, Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; MRI, Magneticresonance imaging; NCL, Neuronal ceroid lipofuscinosis; PPT, Palmitoyl-protein thioester-ase; PB., Phenobarbital; PAS, Periodic acid Schiff; TPM, Topiramate; VPA, Valproic acid;VEP, Visual evoked potential.⁎ Corresponding author at: Hospital Sant Joan de Déu, Passeig de Sant Joan de Déu
No. 2, Esplugues, Barcelona 8950, Spain. Tel.: +34 93 280 4000x2448; fax: +34 93203 3959.
E-mail address: [email protected] (M.S. Pérez Poyato).
0378-1119/$ – see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.doi:10.1016/j.gene.2012.02.013
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Gene
j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate /gene
70
Table1
Summaryof
clinical,b
ioch
emical,u
ltrastructural
andmolecular
data
inSp
anishpa
tien
tswithINCL
.
Data
Patien
t1
Patien
t2
Patien
t3a
Patien
t4a
Patien
t5
Patien
t6
Sex/cu
rren
tag
e(years)
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F/11
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M/12*
M/3
Initialsym
ptom
(Age
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Delay
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Uns
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it(14)
Uns
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yga
it(13)
Uns
tead
yga
it(15)
Delay
edsitting(12)
Age
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nosis(years)
125
103
102
Age
Cogn
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cline(m
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2019
1919
1916
Age
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ars10
mon
ths
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mon
ths
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2ye
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2ye
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2ye
ars5mon
ths
Epile
psy
Refractory
Refractory
Refractory
Refractory
Refractory
No
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clon
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3Ye
ars3mon
ths
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Seizures
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(3ye
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(3ye
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ths)
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,partial
(4ye
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,partial
(4ye
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ths)
No
Interictal
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o—EE
Gba
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onths)
Slow
activity
(20)
Slow
activity
(19)
Slow
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(29)
Slow
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(21)
Slow
activity
(19)
Slow
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spike–slow
wav
ecomplex
es(16)
Cerebral/cereb
ellaratroph
y(A
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+/+
(42)
+/−
(19)
+/−
(29)
+/−
(21)
+/−
(15)
+/−
(16)
Oph
thalmolog
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ings
(Age
)Pa
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(2ye
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mon
ths)
Normal
(2ye
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Papilla
rypa
llor
(2ye
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ths)
/Optic
atroph
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ths
Normal
(1ye
ars10
mon
ths)
Papilla
rypa
llor
(2ye
ars9mon
ths)
Normal
(1ye
ar7mon
ths)
Optic
atroph
y(2
years4mon
ths)
Normal
(2ye
ars4mon
ths)
Electroretinog
raph
y(ERG
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ge)
Abo
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d(3
years6mon
ths)
Abo
lishe
d(3
years4mon
ths)
nd↓↓amplitud
e/(2
years9mon
ths)
↓↓am
plitud
e(2
years4mon
ths)
↓↓am
plitud
e(2
years4mon
ths)
Electron
Microscop
y(Biopsiedtissue
)/PP
T1activity
nmol/h/m
g(con
trol)
GRO
D(brain)/
ndGRO
D(skin)
/nd
nd/
0.78
(59,4)
GRO
D(Skin)
/Und
etectable(35)
GRO
D(M
uscle)/
Und
etectable(30.4)
nd/
0.74
(54,8)
CLN
1mutationa
lana
lysis
ndnd
c.54
1G>A
c.54
1G>A
ndc.53
3A>T+
c.72
2C>T
Mutation
Missens
eMissens
eSp
licing/missens
eAminoacid
chan
ge/predicted
cons
eque
nce
p.Val
181M
etp.Val
181M
etp.Glu
178V
al+
p.Ser241
Leu
Status
Hom
ozyg
ous
Hom
ozyg
ous
Compo
undhe
terozygo
us
⁎Died;
a Patients3an
d4aresiblings;M:male;
F:female;
nd:no
tdo
ne.
298 M.S. Pérez Poyato et al. / Gene 499 (2012) 297–302
71
INCL in families from specific countries. Mutational spectrum in theCLN1/PPT gene causing INCL has not been reported in Spain.
The clinical manifestations of INCL have been widely studied inthe Finnish population (Santavuori et al., 1973, 1974). To date, veryfew reported case series have come from the Mediterranean area.We report the clinical course and the results of biochemical, neuro-pathological and molecular studies carried out in six Spanish patientswith INCL with the aim of assessing the chronological evolution andseverity of this disease.
2. Patients and methods
From 1974 to 2011, six Spanish patients (3 males, 3 females) from5 unrelated families were diagnosed with INCL. Data from each pa-tient were collected from the patient's medical record and completedwith information provided by the physicians in charge and parents.Data were entered into a previously created database (Perez-Poyatoet al., 2011). The study was approved by the Ethics Committee of Hos-pital Sant Joan de Déu in Barcelona, which was the reference hospitalfor the study. Written informed consent was obtained from all par-ents or legal guardians.
Electroencephalography, neuroimaging (brain MRI, CT scan), andophthalmologic studies were available for all patients. Electroretinog-raphy was performed in five patients at least once during the courseof the disease.
Palmitoyl-protein thioesterase (PPT-1) activity was measured insamples of leukocytes or fibroblasts from four patients. Protein mea-surements were performed according to the method of Lowry et al.(1951).
Comprehensivemutationanalysis of thePPT1gene(ENSG00000131238)was undertaken by bidirectional sequencing of coding and exon–intronboundaries region. Genetic studies were carried out in three patients.DNA was not available in the remaining 3 patients. Two patients diedbefore genetic studies were available (patients 1 and 2) and the thirdfamily did not approve this study (patient 5).
Electron microscope examination of biopsied tissues was the mainmorphological diagnostic technique; tissues were obtained according
to routine methods. The histological examination was carried out infour patients, including biopsies of different tissues such as brain(one patient, taken on necropsy), skin (two patients) and muscle(one patient).
The brain was processed for neuropathological studies followingfixation in 4% buffered formalin, and electron microscopic examina-tion after fixation of fresh samples in 2% glutaraldehyde in phosphatebuffer and post-fixation in 0.1% osmium tetroxide.
3. Results
3.1. Clinical evaluation
Table 1 summarizes the clinical, enzymatic and ultrastructuraldata as well as CLN1 mutations identified in our patients. The age atonset of clinical signs and symptoms is shown in Fig. 1.
3.1.1. Family 1Patient 1 was born to unrelated, healthy Caucasian parents in
1974. Delivery and neonatal period were normal. She was able to sitat 10 months but never learned to walk unaided due to spontaneousfalls from the age of 14 months. At 20 months of age her speech grad-ually deteriorated to unintelligible syllables, her motor abilitiesseemed to slow down and she showed poor visual contact. EEGrevealed slowing of the rhythmic activity. At the age 2 y, 5 m her psy-chomotor development had markedly regressed: the girl could not situp by her, or grasp objects, and had lost the ability to speak. Her au-tistic behavior was evident and she showed erratic eye movements.Myoclonic jerks in both arms were observed. In the following months,she presented continuous myoclonic seizures. Physical examinationshowed axial hypotonia and lower limb spasticity. Fundoscopic examrevealed papillary pallor. At the age of 3 years, she become dysphagic,blind, wheelchair bound and without any voluntary movements. Sixmonths later, she developed tonic–clonic generalised seizures whichwere not controlled with phenobarbital (PB) and valproic acid (VPA).EEG showed generalized spike-wave complexes. ERG was abolished.CT scan demonstrated severe cerebral and cerebellar atrophy as well
Fig. 1. Age of Spanish patients with INCL at time of appearance of clinical signs and symptoms.
299M.S. Pérez Poyato et al. / Gene 499 (2012) 297–302
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as hypodensity in the gray-matter structures. The patient died at12 years of age due to respiratory infection.
3.1.2. Family 2Patient 2 is the second child born to non-consanguineous Caucasian
parents in 1983. The neonatal period was unremarkable. He could notsit unaided until he was 8 months. He was able to walk with supportbut never achieved independent walking. He was admitted to hospitalat 19 months of age because he could not sit unaided and had lost thepurposeful hand use and speech, as well as the ability to maintain eyecontact. He showed characteristic knitting hyperkinesias of the upperlimbs and his head circumference was 46 cm (−2 SD). EEG was abnor-mal with slowing of the rhythmic activity. CT scan showed mild gener-alized cortical atrophy. Three months later the myoclonic jerksappeared in the upper part of the body; he showed erratic eye move-ments, axial hypotonia and high extensor tone of the lower extremities.At the age of 2 y, 4 m he presented massive myoclonic seizures and didnot respond to any visual stimuli. Head circumference was 46 cm (−3SD). Fundoscopic examination was normal. By the age of 3 y, 4 m hewas tetraplegic, without response to environmental stimuli, and hishead circumferencewas 47 cm (−3 SD). He developed generalized sei-zures that were resistant to therapy with VPA, PB and clobazam (CLB).EEG showed very low voltage, loss of rhythmic components, irregulardischarges of sharp waves, and spike-wave complexes in different loca-tions. ERG was abolished. VEP evidenced decreased amplitudes anddelayed latencies. At 5 years of age, head circumference remained at47 cm (−4 SD), EEGwas completely hypoactive and brainMRI showedsevere cortical cerebral atrophy involving cerebellum and the entirebrain stem. The entire white matter was extremely hyperintense, sug-gesting demyelinitation. The patient died at 11 years of age in a vegeta-tive state due to recurrent pneumonia.
3.1.3. Family 3Patient 3 was born in 1994 after an uneventful pregnancy. The pa-
tient was the second daughter of healthy, unrelated Caucasian par-ents. Her older sister was diagnosed with Edward syndrome and heryounger sister suffers from INCL (patient 4). At the age of 14 monthsthe patient was able to walk unaided but had frequent falls and anunsteady gait. She showed normal eye contact. At 19 months of ageshe showed continuous irritability and impaired social interaction.Two months later, she lost the ability to walk and began to lose herpreviously acquired speech. She was referred to hospital at 2 y, 5 m,of age because she could not grasp objects and could not sit withoutsupport. She showed absence of verbal communication and impairedsocial interaction. Her head circumference was 47 cm (−1 SD). EEGshowed slowing and poorly structured cerebral activity. MRI showedcortico-subcortical atrophy, thinning of the corpus callosum, and ab-normal increased T2 signal intensity in the white matter. Fundoscopicexam showed bilateral papillary pallor and VEP was normal. At 3 y,5 m of age, she was blind, had difficulty swallowing, and sporadicmyoclonic jerks in upper limbs. Physical examination revealed poorhead control and generalized spasticity with spontaneous ankle clo-nus. Fundoscopic examination showed optic nerve atrophy. MRI dem-onstrated progressive cerebral and cerebellar atrophy. Over thefollowing year, she developed refractory tonic–clonic generalizedand partial seizures. She was treated with PB and gabapentine. EEGbackground was undifferentiated and severely depressed. Head cir-cumference remained at 47 cm (−2 SD). At the age of 7 years, shewas tetraplegic and blind. MRI abnormalities included severe pro-gression of the supra and infra-tentorial brain atrophy. The patientbecame bedridden and died at the age of 11 years.
Patient 4 was born in 2001 and she is the younger sister of patient3. She began to walk at 13 months of age with unsteady gait and fre-quent falls. At the age of 19 months she was unable to walk unaided,lost previously acquired speech and showed poor visual contact. Shesuffered from continuous irritability and insomnia. Two moths later,
she was unable to support herself sitting and had no grasping ability.Neurological examination showed brisk deep tendon reflexes andhead circumference was 47 cm (0.0 SD). Fundoscopic examinationwas normal. EEG revealed abnormally slow background activity.MRI brain imaging showed diffuse cortico-subcortical cerebral atro-phy. At the age of 2 y, 9 m, she lost head control, and sporadic myo-clonic jerks were observed. She had spasticity of the limbs and headcircumference remained at 47 cm (−1 SD). EEG showed diffuse, ir-regular high-voltage slow waves as well as a progressive attenuationof amplitude in background activity. Fundoscopic exam revealed bi-lateral papillary pallor. ERG showed decreased amplitude. At 4 y,6 m of age she developed generalized myoclonic and partial seizuresthat were refractory to lamotrigine, phenobarbital and levetiracetamcombination therapy. EEG was isoelectric. She became tetraplegic,blind and dysphagic; head circumference remained at 47 cm (−2SD). The patient is now 9 years old. She is bedridden with poor re-sponse to environmental stimuli and survives in a vegetative state.
3.1.4. Family 4Patient 5 was born to consanguineous Caucasian parents in 1997;
his mother suffers from mental retardation. Pregnancy, delivery andneonatal period were uneventful. Initial psychomotor developmentwas normal up to the age of 12 months. The development stoppedand 3 months later he had an unsteady gait with frequent falls. EEGwas normal. CT scan showed mild generalized cortical atrophy andtransfontanelar ultrasonography revealed enlargement of the frontalhorns of the lateral ventricles. At 19 months of age, psychomotor de-velopment was markedly regressed: he could not sit unaided and hadlost acquired hand skills and speech, as well as the ability to maintaineye contact. He showed stereotypical hand-washing movements. EEGwas abnormal with slowing of the rhythmic activity. Fundoscopic ex-amination was normal. MRI showed widespread supratentorial atro-phy, enlargement of the ventricles and abnormal increased T2 signalintensity in the subcortical and deep white matter. At 2 y, 4 m ofage he had lost head control and did not respond to any visual stimuli.Neurological examination showed brisk tendon reflexes in the lowerextremities. Fundoscopic examination showed atrophy and narrow-ing of the retinal vessels and ERG was abnormal. He was admittedto a Catholic institution. When he was 3 y, 3 m old, he developedmyoclonic jerks and, a few months later, sporadic tonic–clonic gener-alized seizures that were resistant to therapy with VPA, PB, CLB, clo-nazepam (CZP) and topiramate (TPM). EEG showed very lowvoltage and irregular discharges of sharp waves in different locations.By this time he was blind, dysphagic and tetraplegic. The patient diedat 12 y, 6 m of age in a vegetative state.
3.1.5. Family 5Patient 6 is the first child born to unrelated Caucasian parents in
2008. Sitting unaided was delayed until 12 months of age. At theage of 16 months he had an unsteady gait and was able to take onlya few steps unaided. He had monosyllabic speech but never wasable to respond to his name and showed limited interest in his sur-roundings. Head circumference was 46.5 cm (−1 SD). EEG showedbilateral slow theta-delta activity as well as spike-slow wave com-plexes in the right temporal region. MRI brain imaging revealed cor-ticosubcortical atrophy and T2 hypointensity in the thalami whencompared to the striatum. Two months later he lost the ability towalk, and tremor of the upper limbs was observed. He also began tosleep poorly. At two years of age he had no voluntary hand use orspeech. He showed intermittent hand-to-mouth stereotypy and briskdeep tendon reflexes; head circumference was 47.5 cm (−1 SD). MRIfindings showed progression of the cortico subcortical cerebral atrophy.Five months later neurological examination showed spasticity withspontaneous ankle clonus. ERG evidenced cone amplitude and implicittime delay in both eyes. VEP and fundoscopic examinationwere normal.He is presently 3 years old and has not developed seizures to date.
300 M.S. Pérez Poyato et al. / Gene 499 (2012) 297–302
73
3.2. Enzymatic and molecular studies
Partial deficiency of PPT1 activity was found in patients 3 and 6;levels were undetectable in patients 4 and 5. Mutations in the CLN1gene were identified in two families: two patients harbor thec.541 G>A (p.Val 181Met) mutation in homozygosis (family 3, pa-tients 3 and 4) and the third patient is a heterozygous compoundfor two novel mutations, c.533A>T (p.Glu 178Val) and c.722 C>T(p.Ser241Leu) (family 5, patient 6). In the remaining two patients,data on PPT1 activity were not assessed and DNA was not availableat that time. The diagnosis wasmade based on a typical clinical coursecompatible with ICNL and ultrastructural studies that showed mixedprofiles, predominantly GROD.
3.3. Neuropathological examination (patient 1)
Severe atrophy involved the grey andwhite matter of the cerebrum,cerebellumand brain stem (Fig. 2A).Marked loss of neurons occurred inthe cerebral and cerebellar cortices, striatum and thalamus, and less se-verely in the nuclei of the brain stem, accompanied by reactive astro-cytes, microglia and macrophages filled with lipid droplets. Remainingneurons showed a granular cytoplasm with autofluorescent, PAS-positive and sudanophilic deposits (Fig. 2B and C). Electronmicroscopicexamination revealed the presence of membrane-bound fine granulardense osmiophilic deposits (GRODs) (Fig. 2D and E).
3.4. Biopsy (patients 2, 4 and 5)
GRODs deposits were seen in endothelial cells, pericytes and fibro-blasts in patients 2 and 4 as well as in muscle in patient 5.
4. Discussion
INCL has been widely studied in Finland and it seems to be muchless frequent compared to JNCL in Spain (Perez-Poyato et al., 2011).Our series of six patients with INCL is in agreement with other pub-lished cases from southern European countries and USA (Baumannand Markesbery, 1982; Cardona and Rosati, 1995; Santorelli et al.,1998; Teixeira et al., 2003; Veneselli et al., 2000).
In this study, the age at disease onset ranged from 8 to 15 monthsas previously described (Santavuori et al., 1973, 1992; Takano et al.,2008) while other authors found it ranged up to 18 months (Oishiet al., 1999; Santavuori et al., 1974; Topcu et al., 2004). Delayedmotor skills (Baumann and Markesbery, 1982; Santavuori et al.,1974, 1992) and an unsteady gait were observed as initial symptomsof the disease. We observed delayed motor development as the firstsymptom when the disease began before 12 months of age, whilemotor impairment manifested mainly by ataxia was the leading signwhen the disease began later.
Cognitive decline was observed between 16 and 20 months of age(Santavuori et al., 1992; Santorelli et al., 1998) and has been reportedat 12–18 m or even at an earlier age (Baumann and Markesbery,1982; Santavuori et al., 1973, 1974) (mean, 15 months) (Santavuori,1988). Careful clinical assessment regarding the developmental skillsin our patients allowed us to observe that it is characterized by motorimpairment, cognitive decline and autistic features. We were not ableto apply the Weill Cornell LINCL scale (Worgall et al., 2007) in our se-ries because most patients never acquired language and motor dete-rioration was much faster than in LINCL patients.
In our series, patients 4 and 6 showed decreased amplitude of ERGas well as slight or no abnormality on fundoscopy as described byTakano et al. (2008). Also, ERG was abolished at the age of 3 years,
Fig. 2. Neuropathological findings in patient 1. Legend: A. Coronal section of the brain showing severe atrophy of the cerebral cortex, basal ganglia and white matter, together withmoderate enlargement of the lateral ventricles due to generalized brain loss. B. Preserved neurons in the thalamus are filled with PAS positive material, ×200. C. Neurons also showmassive autofluorescent intracytoplasmic material ×400. D and E. Electron microscopic examination shows abundant GRODs in remaining cells ×20,000.
301M.S. Pérez Poyato et al. / Gene 499 (2012) 297–302
74
as previously reported (Arsenio-Nunes and Goutieres, 1975; Haltia,2003; Santavuori et al., 2000; Vanhanen et al., 1997). Our results sug-gest that visual failure may appear in the early stages of the disease,simultaneously with the neurological symptoms leading quickly toblindness. Ophthalmological findings are not found at the earlierstage of the disease whereas ERG abnormalities, especially a markedloss in amplitude, are early findings.
Psychomotor regression was evident between 2 and 3 years ofage. All patients showed loss of sitting ability, purposeful hand useand head control. Most authors reported myoclonic jerks between16 and 24 months of age (Santavuori, 1988; Santavuori et al., 1973,1974; Santorelli et al., 1998; Takano et al., 2008) which occurred ata later age in our series. Epilepsy was the last symptom of the disease;even patient 6 has not developed seizures to date. We think that ep-ilepsy can appear at any time during the course of the disease.
EEG was the first abnormal neurophysiologic test which showedslowing of the rhythmic activity in most patients (Santavuori et al.,1973, 1974; Takano et al., 2008). Regarding brain MRI, our patientsshowed similar findings to what has previously been reported by otherauthors (Santavuori et al., 1992, 2000; Vanhanen et al., 1995, 2004).
A relationship between the absence of PPT1 activity and GROD(Das et al., 1998) and mutations in CLN1 gene and GROD has beenreported (Mole et al., 2005; Wisniewski et al., 2000). The present re-sults confirm that mutations in PPT1/CLN1 gene are associated withreduced PPT1 activity in INCL, as previously reported (Vesa et al.,1995). Most of the identified mutations cause a severe early onsetINCL phenotype, although mutations in PPT1/CLN1 gene may have amilder course of the disease (Bonsignore et al., 2006; Das et al.,2001; Simonati et al., 2009; Waliany et al., 2000) including juvenile-onset phenotype in Latin American patients (Kohan et al., 2009).There is at present a strategy for the diagnosis of the NCLs (Kohanet al., 2009) and an international online clinical registry for geno-type/phenotype correlation: http://www.ucl.ac.uk/ncl.
The p.Val181Met mutation in CLN1 gene which has been previouslydescribed (Das et al., 2001; Teixeira et al., 2003) was found in homozygo-sis in family 3.Moreover, the clinical features and the evolution of the dis-ease in our patients confirm that p.Val181Metmutation is associatedwiththe most severe INCL phenotype when present in the homozygous state.
Regarding the two novel mutations, c.533A>T (p.Glu178Val) ispredicted to affect the donor splice site for intron 5 (NetGene2 soft-ware) and c.722 C>T (p.Ser241Leu) is predicted to affect proteinfunction (classified as probably damaging by Polyphen2 software).Patient 6, who was found to harbor these mutations, is characterizedby a milder course of the disease without epilepsy to date
In summary, INCL is characterized by a severe progressive clinicalcourse. The characteristic clinical findings as well as their chronolog-ical evolution might be helpful to identify patients affected by thisrare disease. Early diagnosis is essential in order to provide geneticcounselling to affected families. Our series might contribute to thestudy of the genotype–phenotype correlation in patients with INCLin the Mediterranean area.
Acknowledgements
We thank Dra. M. Rebollo and Dra I. Alonso Colmenero for thevaluable support and we acknowledge the indispensable cooperationof the families of the patients for participating in this study.
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302 M.S. Pérez Poyato et al. / Gene 499 (2012) 297–302
75
Síntesis de los resultados
� La enfermedad se inició entre los 8 y 15 meses con retraso en el desarrollo
motor y marcha inestable.
� El retraso en el desarrollo motor ocurrió en los pacientes que iniciaron la
enfermedad antes de la edad de 12 meses, mientras que la ataxia se observó en
aquellos pacientes que iniciaron la enfermedad a una edad más tardía.
� El deterioro cognitivo apareció entre los 16 y 20 meses de edad.
� Los pacientes 4 y 6 presentaron un fondo de ojo normal a la misma edad que el
ERG mostró un descenso de la amplitud. Se observaron respuestas abolidas en
el ERG de todos los pacientes a los 3 años de edad.
� Las crisis mioclónicas aparecieron a partir de la edad de 2 años y la epilepsia
caracterizada por crisis generalizadas y parciales, fue el último síntoma de la
enfermedad, incluso el paciente 6 no ha presentado epilepsia a los 3 años de
edad. El EEG mostró un enlentecimiento de la actividad de base entre los 16 y
20 meses de edad en la mayoría de los pacientes.
� La pérdida de la sedestación, manipulación y del control cefálico ocurrió entre
los 2 y 3 años de edad.
� La mutación V181M en el gen CLN1 fue identificada en homocigosis en la
familia 3. Las 2 nuevas mutaciones en el gen CLN1 identificadas en este estudio
corresponden al paciente que en el momento actual no ha desarrollado epilepsia.
77
2. Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional
del gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles
Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: mutations in the CLN2 gene and
clinical course in Spanish patients
María del Socorro Pérez-Poyato, Mercé Pineda Marfa, Isidre Ferrer Abizanda, Laia
Rodriguez-Revenga, Victoria Cusí Sánchez, Maria J Martínez González, Jesús Eiris
Puñal, Alfonso Verdú Pérez, M Mar García González, Antonio Martínez Bermejo,
Elena Martín Hernández, M Josep Coll Rosell, Laura Gort, Montserrat Milá Recansens.
Journal of Child Neurology (aceptado, pendiente de publicación)
La forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea es la segunda forma
clínica más frecuente de las LNCs. Las mutaciones en el gen CLN2 pueden causar
además del fenotipo clásico, otros con inicio de la enfermedad en edad juvenil y un
curso clínico más benigno e incluso se han descrito pacientes con inicio de la
sintomatología en el primer año de vida (Simonati et al. 2000, Ju et al. 2002). Las dos
mutaciones más comunes en el gen CLN2, la mutación de splicing c.509-1G>A y la
mutación sin sentido c.622 C>T, se observan en el 60-78% de los pacientes con LNCIT
(Zhong et al. 1998, Sleat et al. 1999).
Este estudio da a conocer la historia natural y progresión de la enfermedad en 12
pacientes con LNCIT mediante la evaluación de la regresión del desarrollo psicomotor
(edad a la que se inicia la pérdida de los hitos del desarrollo psicomotor previamente
adquiridos), la epilepsia (edad de inicio de las crisis epilépticas) y la edad de inicio de
los principales síntomas y signos. Describimos la correlación con el genotipo y el
espectro mutacional del gen CLN2 en la población española.
79
Original Article
Late Infantile Neuronal CeroidLipofuscinosis: Mutations in the CLN2 Geneand Clinical Course in Spanish Patients
Marıa S. Perez-Poyato, MD1, Merce Pineda Marfa, MD, PhD1,2,Isidre Ferrer Abizanda, MD, PhD3, Laia Rodriguez-Revenga, BS, PhD2,4,Victoria Cusı Sanchez, MD, PhD5, Marıa J Martınez Gonzalez, MD6,Jesus Eiris Punal, MD7, Alfonso Verdu Perez, MD, PhD8,M Mar Garcıa Gonzalez, MD9, Antonio Martınez Bermejo, MD, PhD10,Elena Martın Hernandez, MD, PhD11, M Josep Coll Rosell, PhD12,Laura Gort, PhD2,12, and Montserrat Mila Recansens, PhD2,4
AQ2
AbstractLate infantile neuronal ceroid lipofuscinosis (Jansky-Bielchowsky disease) is a rare disease caused by mutations in the CLN2 gene.We report the clinical outcome and correlate with genotype in 12 Spanish patients with this disease. Psychomotor regression,epilepsy, and other clinical symptoms/signs were assessed. Age at onset of clinical symptoms ranged from 18 months to 3.7 years,and they included delayed speech and simple febrile seizures followed by epilepsy. Partial seizures and myoclonic jerks occurred atan earlier age (median 3.4 and 3.7 years, respectively) than ataxia and cognitive decline (median 4 years). Clinical regression wasinitiated by loss of sentences (median 3.7 years) followed by loss of walking ability and absence of language (median 4.5 years).Patients showed blindness and lost sitting ability at similar age (median 5 years). We report 4 novel mutations in the CLN2 gene.This study provides detailed information about the natural history of this disease.
Keywordsclinical outcome, CLN2 gene, Jansky-Bielschowsky disease, late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, tripeptidyl peptidase 1
Received February 24, 2012. Accepted for publication April 22, 2012.
Neuronal ceroid lipofuscinosis is one of the most
common groups of progressive neurodegenerative diseases
in childhood.1 Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis
(Jansky-Bielchowsky disease) is the second most frequent
form of the 8 neuronal ceroid lipofuscinosis lysosomal storage
disorders2 all of which are genetically determined diseases.3
1Department of Pediatric Neurology, Hospital Sant Joan de Deu, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain2 Centre for Biomedical Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto de Salud Carlos III, Spain3 Institute of Neuropathology, Service of Anatomical Pathology, IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge, Barcelona, CIBERNED, Spain4 Biochemical and Molecular Genetics Department, IDIBAPS, Hospital Clınic, Universitat de Barcelona, Spain5 Service of Anatomical Pathology, Hospital Sant Joan de Deu, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain6Department of Pediatric Neurology, Hospital Cruces, Baracaldo, Bizkaia, Spain7Department of Pediatric Neurology, Hospital Clınico Santiago de Compostela, Spain8Department of Pediatric Neurology, Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain9Department of Pediatric Neurology, Hospital de Figueras, Girona, Spain10Department of Pediatric Neurology, Hospital La Paz, Madrid, Spain11Department of Pediatric Neurology, Pediatric Unit of rare disease, Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain12 Biochemical and Molecular Genetics Department, Inborn Errors of Metabolism (IBC), Hospital Clınic, Barcelona, Spain
Corresponding Author:
Montserrat Mila Recasens, PhD, Biochemical and Molecular Genetics Department, IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona, Centre for Biomedical
Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto de Salud Carlos III, Carrer Villarroel, 170, Barcelona 08036, Spain
Email: [email protected]
Journal of Child Neurology00(0) 1-9ª The Author(s) 2012Reprints and permission:sagepub.com/journalsPermissions.navDOI: 10.1177/0883073812448459http://jcn.sagepub.com
80
Eight causal genes, CLN10/CTSD, CLN1/PPT, CLN2/TTP1,
CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8, CLN8, have been identi-
fied in childhood (http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml).
Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis is rare with an
incidence of 0.46 per 100 000 live births in West Germany4 and
an estimated prevalence of 0.6 to 0.7 per 1000 000 in Northern
Europe.5 It is caused by mutations in the CLN2 gene, located
on chromosome 11q15,6 which encodes the lysosomal
enzyme tripeptidyl peptidase 1.7 Ultrastructural examination
of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis storage bodies
reveals curvilinear bodies (CV) in cells of affected individu-
als.8 Clinically, late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis
is characterized by epilepsy at the age of 2 to 4 years, which
may be manifested by partial or secondary generalized sei-
zures as well as generalized tonic-clonic or absence seizures,
but myoclonus is the most characteristic feature. Sometimes
delayed speech may precede epilepsy. Regression of acquired
skills becomes evident soon thereafter, followed by ataxia,
extrapyramidal, and pyramidal signs. Visual failure leads to
blindness by 5 or 6 years of age. The patients usually die
between 6 and 15 years of age.9,10
Mutations in the CLN2 gene may give rise not only to clas-
sical late-infantile but also to juvenile onset of the disease with
a milder clinical course.3,11–15 Furthermore, patients with onset
of the disease in the first year of life have been reported.16,17
Two common mutations, the splicing mutation c.509-1G>A
and the nonsense mutation c.622 C>T, account for approxi-
mately 60% to 78% of patients with late infantile neuronal cer-
oid lipofuscinosis.18,19
The clinical features of late infantile neuronal ceroid lipo-
fuscinosis are clearly defined and the progressive deteriorating
course of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis has been
assessed by clinical rating scores (modified Hamburg Late
Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis Scale, Weill Cornell
Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis Scale).20,21 In
this study, we report the clinical outcome and correlate with
genotype in 12 Spanish patients with late infantile neuronal
ceroid lipofuscinosis.
Patients and Methods
From 1979 to 2011, a total of 12 Spanish patients (8 males, 4 females)
with a mean age of 7.4 years (range 4-14) from 10 unrelated families
were diagnosed with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. The
study was approved by the Ethics Committee of Hospital Sant Joan de
Deu in Barcelona, which was the reference hospital for the study.
Written informed consent was obtained from all patients, parents, or
legal guardians.
Data from each patient were collected from the patient’s medical
record and completed by information provided by the physicians in
charge and parents. The review of the medical records and the inter-
views was conducted by a single investigator. Data were entered into
a database previously reported22 with 50 items that included age at
diagnosis; initial symptom; age at regression of acquired skills;
type of seizures (myoclonic, myoclonic-atonic, partial, generalized
tonic-clonic, secondarily generalized, atypical absence); main signs
and symptoms; electroencephalographic findings; ophthalmologic
data; electroretinographic findings; visual evoked potentials;
enzymatic assays (tripeptidyl peptidase 1); ultrastructural data and
molecular studies.
Neurophysiological (electroretinography, visual evoked potentials),
neuroimaging (brain magnetic resonance imaging [MRI], computed
tomography scanner), and ophthalmologic studies were available for all
patients. Electroretinography was performed in 9 patients at least once
during the course of the disease. Visual evoked potentials were per-
formed in 7 patients and ophthalmologic evaluations in 11. All patients
underwent neuroimaging studies.
Electron microscope examinations of biopsied tissues were the
main morphological diagnostic technique being obtained according
to routine methods. The histologic examination of biopsy samples was
carried out in 9 patients, including biopsies of the skin (4 patients),
conjunctiva (2 patients), appendix (2 patients), and muscle (1 patient).
The tissue samples were fixed in 2.5% glutaraldehyde in phosphate
buffer, postfixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated through graded
ethanol and embedded in epoxy resin. Semithin sections were stained
with toluidine blue and selected ultra-thin sections with uranyl acetate
and lead citrate.
Tripeptidyl peptidase 1 activity was measured in samples of leuko-
cytes or fibroblasts of 8 patients. The fluorometric enzymatic analy-
ses were performed using Ala-Ala-Phe-7-amido-4-metilcoumarina
(Sigma AQ3) as substrate. Protein measurement was performed according
to the method of Lowry et al (1951).23
Molecular genetics studies were carried out in 9 patients. DNA was
not available in 3 patients, as 1 patient died before genetic studies
were available (case 1) and 1 family did not approve this study (cases
4a and 4b). DNA extraction from whole blood was performed using
an automatic MagnaPure system (Roche Diagnostics AQ4) according to
the manufacturer’s instructions. The presence of mutations was
assessed by direct sequencing of the 13 exons of the CLN2 gene
using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems, Foster City, CA) and an ABI3130 automatic sequencer
(Applied Biosystems).
The primary endpoints of the study were the assessment of
psychomotor regression (time to reach regression of acquired skills),
epilepsy (age at onset of seizures), and the age at onset of main clin-
ical symptoms/signs of the disease. Nonparametrical survival esti-
mation was performed by means of a Kaplan-Meier analysis. The
time variable was computed as the time interval from birth to the
onset of psychomotor regression, epilepsy, and clinical symptoms/
signs of the disease. In the absence of this information, the follow-
up time was censured at the last visit. Data were analyzed with the
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) computer program
(version 17.0).
Results
Enzymatic, Molecular Studies, and UltrastructuralFindings
Partial deficiency of tripeptidyl peptidase 1 activity was found
in 8 patients, 6 of them also showed mutations in the CLN2
gene (cases 5, 6, 7, 8a, 8b, and 9). In the remaining 4 patients,
data on tripeptidyl peptidase 1 activity were not assessed; 3 of
these patients belonged to 3 unrelated families harboring muta-
tions in the CLN2 gene (cases 2, 3, and 10) and in the remaining
patient the diagnosis was made by a typical clinical course
compatible with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis
2 Journal of Child Neurology 00(0)
81
and ultrastructural studies that showed curvilinear bodies
inclusions (case 1).
Mutations in the CLN2 gene were present in 10 cases (8
unrelated) (Table 2). The nonsense mutation c.622 C>T leading
to R208stop accounted for 20% of the CLN2 mutated chromo-
somes and the splicing mutation (IVS5-1G>C) for a 6%.
Electron microscopy examination of biopsies revealed the
presence of membrane-bound curvilinear inclusions in various
cell types including endothelial cells, pericytes, smooth muscle
cells, fibroblasts, Schwann cells, and glands depending on the
tissue available for study. Curvilinear inclusions in fibroblast in
a case of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis are shown
in Figure 1.
Individualized clinical, enzymatic, and ultrastructural data
are shown in Table 1.
Regression of Acquired Skills
As shown in Table 3, at the time of the study all patients had
lost the ability to speak in full sentences at a median age of
3.7 years (95% CI 3.1-4.3). Loss of walking ability and com-
plete absence of language appeared in 92% of patients at a
median age of 4.5 years (95% CI 4.3-4.6 vs 95% CI 4.1-4.8).
The median age at which patients became wheelchair bound
was quite similar to that which they lost their sitting ability,
purposeful hand use and urinary sphincter control. Dysphagia
was observed at a median age of 5.4 years (95% CI 4.4-6.3).
Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time
of regression of acquired skills are shown in Figure 2A.
Epilepsy
Myoclonic jerks were observed in all patients at a median age
of 3.7 years (95% CI 3.4-4) and partial seizures with secondary
generalization were reported in 83% of patients at a median of
3.4 years (95% CI 2.9-3.8). Myoclonic-atonic seizures were
observed in 75% of patients at a median age of 4.1years
(95% CI 3.5-4.7) and generalized tonic-clonic seizures
appeared in 58% of patients at a median age of 4 years (95%CI 3.3-4.6). Continuous myoclonus was observed in 92% of
patients at a median of 4.7 years (95% CI 4.2-5.2). Kaplan-
Meier estimates of the age of the patients at the time of appear-
ance of seizures are shown in Figure 2B.
Clinical Signs and Symptoms
The presenting symptoms included seizures (6 patients),
delayed speech (5 patients), and clumsiness (1 patient); they
were observed between 18 months and 3.7 years of age (mean
2.2 years). Initial seizures were partial status epilepticus (case
4a), partial (case 4b) and simple febrile that were followed by
myoclonic-atonic seizures (cases 1, 9), myoclonic jerks
(case2), and generalized seizures (case5) (Table 1).
All patients developed ataxia at a median age of 4 years
(95% CI 3.9-4.1), and cognitive decline was observed in 92%of patients at a similar age (median 4 years, 95% CI 3.5-4.4)
whereas visual failure appeared at an earlier age (median 3.8
years, 95% CI 3.2-4.4). Tremor occurred in 92% of patients
earlier than both spasticity (median age 4.9 years; 95% CI
3.8 - 5.9) and blindness (median age 5.1 years; 95% CI 4.6-
5.6). Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the
time of appearance of clinical signs and symptoms are shown
in Figure 2C.
The MRI abnormalities in a patient with late infantile neu-
ronal ceroid lipofuscinosis are shown in Figure 3.
Discussion
Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis occurs worldwide
and it seems to be less frequent compared to the juvenile form
in Spain.22 The main clinical features and ultrastructural data of
this disease have been previously described.8,24 However, there
have been no reports of the rate of disease progression and its
correlation with mutations in the CLN2 gene in our country.
Our series was quite homogeneous both clinically and
pathologically whereas clinical heterogeneity in late infantile
neuronal ceroid lipofuscinosis has been previously described.25
The age at onset of the disease ranged between 18 months and
3.7 years (mean 2.2 years), similar to what has been previously
described by Topcu et al26 and other authors have reported
onset between 2 and 3.5 years27 and up to 4 years.14,28
Careful clinical assessment regarding the regression of
acquired skills allowed us to observe that it may be initiated
by the onset of loss of sentences by 3 years of age. During the
second stage of the disease, patients lost their walking ability
and showed nonverbal communication. Finally, patients lost
their sitting ability, purposeful hand use, and urinary control
sphincter and became wheelchair-bound at a median age of 5
years2 followed by dysphagia within a few months.
The initial manifestations of the disease were delayed
speech development in patients who never completely acquired
language capacity2,8,29 and simple febrile seizures followed by
epilepsy as reported occasionally.12,28 An initial diagnosis of
Figure 1. Curvilinear inclusions in fibroblasts in oneAQ1 case of CLN2mutation (ultrathin section stained with uranyl acetate and lead citrate,�42 000).
Perez-Poyato et al 3
82
Table
1.Clinicalfeatures,enzymaticandultrastructuralstudiesin
Spanishpatients
withlate
infantile
neuronalceroid
lipofuscinosis
Case
number
Sex
Age (y)
Consan-
guinity
Presenting
symptom
Age
atfirst
symptom/
ageat
diagno
sis(y)
Seizures
(age,
y/mo)
Myoclonusjerks/
continuo
usmyoclonus
(age,y/m
o)
Cognitive
decline
(age,y/mo)
Ataxia
(age,y/m
o)
Ophthalmologic
findings(age,y/mo)
VEP
(age,y/mo)
ERG
(age,y/m
o)
Cerebral/
cerebellar
atrophy
(age,y/m
o)
TPP
1activity
nmol/h/m
g(control)
Electron
microscopy
(biopsiedtissue)
1M
9*Yes
Simplefebrile
seizures
2/6
Myoclonic-atonic
(3y7mo)
4y4mo/4
y9mo
4y
4y
Papillary
pallor(5
y)Opticnerve
atrophy(7
y)
Norm
al(4
y9
mo)
Decreased
amplitud
e(4
y9mo)
þ/þ
(5y)
ND
CV(conjunctive)
2M
10*
No
Simplefebrile
seizures
3.7/6
Myoclonic-atonic
(4y9mo)
3y10
mo/5
y6
mo
4y
3y10
mo
Papillary
pallor(5
y6mo)
Giant
responses
(5y3mo)
#voltage,
(5y3
mo)
-/þ
(3y10mo)
ND
CV(appendix)
3M
7*Yes
Delayed
speech
2/7
Generalized/Partial
(3y7mo)
3y/5y
3y6mo
3y9mo
Papillary
pallor(3
y)Opticnerve
atrophy(5
y)
Abo
lished(5
y6
mo)
Abo
lished(5
y6
mo)
-/þ
(3y6m
o)
ND
CV(appendix)
4aM
6*No
Partialstatus
epilepticus
3.4/5
Partialstatus
epilepticus
3y7mo/4
y3mo
3y7mo
4y2mo
Papillary
pallor(5
y)Delayed
latency
(4y)
Abo
lished(4
y)þ/
þ(5
y)2.9(125.1)
CV(skin)
4bF
8*No
Partialseizures
3/4
Partialseizures
3y9mo/3
y11
mo
3y6mo
4y
ND
ND
Norm
al(3
y5
mo)
þ/þ
(4y)
0.8(125.1)
ND
5M
14*
No
Simplefebrile
seizures
1.6/7
Generalized
(4y)
5y/7y
5y6mo
5y5mo
Norm
al(6
y)ND
ND
þ/þ
(4y9mo)
9,8(403)
CV(m
uscle)
6M
6*No
Delayed
speech
2/4
Partial(2
y11
mo)
3y7mo/4
y3y3mo
3y7mo
Norm
al(3
y9mo)
ND
Norm
al(3
y7
mo)
þ/þ
(3y3mo)
1.7(223)
CV(skin)
7F
11No
Delayed
speech
2/7
Generalized
(3y
4mo)
3y10
mo/6
y4y
4y
Norm
al(3
y4mo)
Giant
responses
(3y4mo)
Norm
al(4
y5
mo)
–/þ
(3y4mo)
21.20(788.90)
CV(skin)
8aM
6*No
Clumsiness
2/6
Partial(3
y8mo)
4y3mo/6
y4y3mo
4y6mo
Peripheral
pigm
entary
clum
ping
(5y)
Norm
al(4
y6
mo)
ND
–/þ
(3y8mo)
4.7(1003.1)
CV(conjunctive)
8bF
6*No
Delayed
speech
2/2
Partial(3
y5mo)
3y7mo/5
y4y10
mo
4y
Peripheral
pigm
entary
clum
ping
(5y)
ND
ND
–/þ
(3y5mo)
11.3
(1003.1)
ND
9M
7No
Simplefebrile
seizures
2.5/3
Myoclonic-atonic
(2y6mo)
2y6mo/3
y6mo
3y6mo
4y
Norm
al(3
y)ND
Norm
al(3
y7
mo)
Norm
al(3
y)13.10(674)
ND
10F
4No
Delayed
speech
2/4
Partial(3
y3mo)
3y9mo/4
y4y
3y9mo
Papillary
pallor(3
y10
mo)
#voltage(3
y9
mo)
#voltage(3
y9
mo)
–/þ
(3y4mo)
ND
CV(skin)
Abbreviations:CV,curvilinearbodies;(*),died;ERG,electroretinography;F,female;M,male;
ND,notdoneorunknown;TPP1,Tripeptidylpeptidase1;VEP,visualevokedpotentials.
4
83
late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis patients may be
suspected in the presence of regression or delayed speech.
Most authors have described epilepsy, which may be mani-
fested by any type of seizures as the presenting symptom
between 2 and 4 years of age10,14,26,30–34 (median 3 years).35
The estimated median age at onset of partial seizures by age
3.4 years, followed by myoclonic jerks that occurred between
3 and 4 years of age in our patients, was similar to what pre-
viously has been reported. The clinical course of progressive
myoclonic epilepsy became evident in our series during
follow-up. Generalized tonic-clonic seizures have been
reported as the most prominent seizure type of the disease26
and may be preceded by simple febrile seizures.12,28 In con-
trast, in our series generalized tonic-clonic seizures were less
frequent. Epileptic seizures were absent in one late infantile
neuronal ceroid lipofuscinosis patient with protracted clinical
course.13 All these data suggest that the spectrum of epilepsy
in patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis
may be surprisingly broad.
Electroencephalographic findings in most patients showed
spikes and slow waves superimposed on irregular slow back-
ground activity on both hemispheres, mostly in the posterior
regions, during the course of the disease.36 In contrast to other
authors, polyphasic high-voltage posterior spikes when photic
stimulation was performed at low frequency were not observed
in our series.30,37,38
In the present study, visual failure appeared after the onset
of epilepsy32,35 and it has been reported at a median age of 4
years35 leading to blindness by 5 or 6 years.10,24
Ataxia was the third symptom of the disease after the onset
of epilepsy38 and visual failure in our series, and it occurred at a
similar median age as that of cognitive decline (4 years)
although it may appear earlier (median 3.5 years, range 2.5-
4.6) in patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscino-
sis.2 Severe motor impairment with hand tremor and spasticity
was observed at advanced stages of the disease in our patients.
We were not able to apply the rating scales of disease sever-
ity (scale developed by Steinfeld et al 2002; modified Hamburg
Table 2. Mutations in the CLN2 gene identified in Spanish patients
Casenumber
NucleotideChange Mutation
Amino acidchange/ predictedconsequence Status Location
Number ofindividuals
with mutationin the family Reference
2 c.622C>Tc.1222-1224del
Nonsense Del 3bp
p.R208XFrameshiftafter S408
Compoundheterozygous
Exon 6 Exon 8 1 Sleat et al 1997This study
3 c.17þ1G>T Splice site Homozygous Intron 1 1 Kousi et al 20095 c.880G>A Missense p.S293N 2nd
mutation notfound
Compoundheterozygous
Exon 7 1 This study
6 c.797G>Ac.1016G>A
MissenseMissense
p.R266Qp.R339Q
CompoundHeterozygous
Exon 7 Exon 8 1 Mila, personalcommunicationPal et al 2009
7 c.509-1G>Ac.165 C>T
Splice siteMissense
p.Q56X Compoundheterozygous
Intron 5 Exon 3 1 Sleat et al 1997 Thisstudy
8 c.622C>T Nonsense p.R208X Homozygous Exon 6 2 Sleat et al 19979 c.616C>T
c.1506G>CMissense Splicesite
p.R206C Compoundheterozygous
Exon 6 Intron 6 1 Mole et al 1999 Thisstudy
10 c.827A>T Missense p.D276V Homozygous Exon 7 1 Kohan et al 2009
Table 3. Age at the time of psychomotor regression, epilepsy, andclinical signs and symptoms
Patients with late infantile neuronalceroid lipofuscinosis (n ¼ 12)
Age, years median No impairment(95% CI) % patients
Regression acquired skillsLoss of walking ability 4.5 (4.3-4.6) 8.3Becoming wheelchair-bound 5 (4-5.9) 16.7Loss of sitting ability 5 (4.7-5.2) 33.3Loss of purposeful hand use 5 (4.4-5.5) 25Loss sentences 3.7 (3.1-4.3) 0No language 4.5 (4.1-4.8) 8.3Dysphagia 5.4 (4.4-6.3) 25Urinary incontinence 5 (3.1-6.8) 41.7
EpilepsyMyoclonic-atonic seizures 4.1 (3.5-4.7) 25Myoclonic jerks 3.7 (3.4-4) 0Continuous myoclonus 4.7 (4.2-5.2) 8.3Partial seizures 3.4 (2.9-3.8) 16.7Generalized tonic-clonic 4 (3.3-4.6) 41.7Atypical absence seizures 4.3 (3.1-5.4) 33.3
Clinical signs and symptomsCognitive decline 4 (3.5-4.4) 8.3Visual failure 3.8 (3.2-4.4) 16.7Blindness 5.1 (4.6-5.6) 8.3Tremor 4.2 (3.4-5) 8.3Ataxia 4 (3.9-4.1) 0Spasticity 4.9 (3.8-5.9) 16.7
Perez-Poyato et al 5
84
Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis Scale and Weill
Cornell Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis Scale)20,21
because most patients had died and the remaining 3 patients
were in an advanced stage of the disease at the time we under-
took this study.
Only a few studies have described neuroradiologic imaging
in living patients with late infantile neuronal ceroid lipofusci-
nosis, demonstrating progressive gray matter atrophy promi-
nent in the infratentorial regions. Brain MRI findings in our
series were similar to previous reports.31,33,39
The relationship between the absence of tripeptidyl peptidase
1 activity and curvilinear bodies9,19,40 and mutations in CLN2
gene and curvilinear bodies has been reported.3,8 The present
results confirm that mutations in the CLN2 gene are associated
with reduced tripeptidyl peptidase 1 activity in late infantile neu-
ronal ceroid lipofuscinosis, as previously reported.19 According
to the present results, 2 of theCLN2mutations identified by Sleat
et al (1997)7 were less frequent (78% vs 26%) than previously
reported in other studies.18–21 This may be due to the higher
genetic heterogeneity present in the Spanish population, which
is well known in other recessive diseases.
On the other hand, in agreement with Kohan et al (2009)14
the presence of the p.D276V missense mutation was found in
homozygosis in 1 Paraguayan patient, in agreement with other
cases of Latin American origin.
In summary, the clinical progression of late infantile neuro-
nal ceroid lipofuscinosis in our study population was relatively
homogeneous. Genetic heterogeneity of late infantile neuronal
ceroid lipofuscinosis was demonstrated in the 10 families stud-
ied. The knowledge of the natural history of the disease can
provide basic information for designing health care plans and
to prepare for future clinical trials.
Acknowledgments
This work has been approved by the responsible authorities of Hospi-
tal Sant Joan de Deu, which was the reference hospital for the study.
The authors are grateful to Drs M. Rebollo and MI. Alonso Colme-
nero and the Spanish Association of Families Affected by NCL for the
valuable support and indispensable cooperation. Statistical support
was provided by Raquel Iniesta (Fundacio Sant Joan de Deu, ISCIII
CA08/00151).
Author Contributions
MSP-P contributed to the design of the study, reviewed the medical
records, took part in the analysis and interpretation the data, wrote the
first draft, and prepared the final draft of the manuscript. She had full
Figure 2. Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time of regression of acquired skills (A), epilepsy (B), and main signs andsymptoms of the disease (C) among 12 Spanish patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.
6 Journal of Child Neurology 00(0)
85
access to study data and takes responsibility for the integrity of the study.
MPM contributed to the design of the study and acquisition of data, par-
ticipated in the statistical analysis, interpretation of data, writing of the
manuscript, and approved the final draft. IFA performed histopathologic
studies, contributed to analysis of data and drafting, reviewed the manu-
script for intellectual content, and approved the final draft. LRR contrib-
uted to genetic studies and approved the final draft. VCS performed
histopathologic studies and approved the final draft. MJMG, JEP, AVP,
MMGG, AMB, and EMH provided case histories for the study, acquired
data, reviewed the manuscript for intellectual content, and approved the
final draft. MJCR and LG performed enzymatic studies, reviewed the
manuscript for intellectual content, and approved the final draft. MMR
was the principal investigator, performed the genetic studies, contributed
to the design of the study and acquisition of data, participated in writing
of the manuscript and approved the final draft. She had full access to
study data and takes responsibility for the integrity of the study, and con-
trolled the decision to publish.
Declaration of Conflicting Interests
The authors declared no potential conflicts of interest with respect to
the research, authorship, and/or publication of this article. AQ5
Funding
The authors received no financial support for the research, authorship,
and/or publication of this article. AQ6
Patient consent: Obtained
Ethical Approval
The study was approved by the Ethics Committee of Hospital Sant
Joan de Deu in Barcelona.
Figure 3. Patient 8a at 3 years 8 months (A-B) and 4 years 6 months of age (C-D). Sagittal T1(A) and axial fluid-attenuated inversion recoverysections (B) showing mild cerebellar atrophy and a subtle increase in the periventricular white matter signal intensity. Sagittal T1(C) and axialfluid-attenuated inversion recovery sections (D) showing progression of the cerebellar and the supratentorial atrophy. The abnormal periven-tricular white matter signal intensity becomes more obvious.
Perez-Poyato et al 7
86
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Perez-Poyato et al 9
89
Síntesis de resultados
� La enfermedad se inició entre los 18 meses y los 3.7 años con crisis epilépticas
(6 pacientes), retraso del lenguaje (5 pacientes) y torpeza motora (1 paciente).
Las convulsiones febriles simples se observaron inicialmente seguidas de crisis
mioclónicas, mioclono-atónicas, generalizadas y crisis de tipo parcial,
incluyendo un caso de estatus epiléptico.
� La pérdida de la capacidad para construir frases se observó en todos los
pacientes a los 3.7 años de edad mediana y la pérdida de la deambulación y
ausencia del lenguaje se observaron en el 92% de los pacientes a la edad
mediana de 4.5 años. La edad a la que los pacientes fueron dependientes de silla
de ruedas fue muy similar a la de la pérdida de la sedestación, manipulación y
control de esfínteres (edad mediana 5 años).
� Las crisis mioclónicas aparecieron en todos los pacientes a la edad mediana de
3.7 años y las crisis parciales se observaron en el 83% de los pacientes a los 3.4
años de edad mediana. Las crisis mioclono-atónicas ocurrieron en el 75% de los
pacientes a los 4.1 años de edad mediana y las crisis tónico-clónicas
generalizadas se observaron en el 58% de los pacientes a la edad mediana de 4
años. Las crisis mioclónicas continuas ocurrieron en el 92% de los pacientes a
los 4.7 años de edad mediana.
� El déficit visual ocurrió a la edad mediana de 3.8 años, después del inicio de la
epilepsia, la ataxia se observó a los 4 años de edad mediana junto con el
deterioro cognitivo y la ceguera ocurrió a la edad mediana de 5.1 años en el 92%
de los pacientes.
� La mutación c.622 C>T se identificó en el 20% de los cromosomas y la c.509-
1G>A en el 6%. Este trabajo aporta 4 nuevas mutaciones en el gen CLN2.
91
3. Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico
y estudios genéticos en pacientes españoles
Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis: clinical course and genetic Studies in
Spanish patients
María del Socorro Pérez-Poyato, Montserrat Milá Recasens, Isidre Ferrer Abizanda,
Raquel Montero Sánchez, Laia Rodríguez Revenga, Victoria Cusí Sánchez, Mª Mar
García González, Rosario Domingo Jiménez, Rafael Camino León, Ramón Velázquez
Fragua, Antonio Martínez-Bermejo, Mercé Pineda Marfa.
Journal of inherited Metabolic Disease 2011; 34:1083-1093
La mayoría de los pacientes con la forma juvenil de lipofuscinosis neuronal
ceroidea (LNCJ) son homocigotos para la deleción 1.02-kb en el gen CLN3 y presentan
el fenotipo clásico, mientras que los pacientes heterocigotos compuestos para esta
deleción pueden presentar fenotipos atípicos y un curso clínico más benigno de la
enfermedad. La forma variante de LNCJ causada por mutaciones en el gen CLN1 es
clínicamente muy similar a la producida por mutaciones en el gen CLN3.
En este trabajo se establecen correlaciones genotipo-fenotipo en 24 pacientes
con LNCJ divididos en dos grupos: aquellos con mutaciones en el gen CLN1 y / o
GROD a nivel ultraesructural (grupo vLNCJ) y los que presentan mutaciones el gen
CLN3 y / o FP a nivel ultraestructual (grupo cLNCJ). Se describe la historia natural de
la enfermedad en ambos grupos de pacientes mediante la valoración del deterioro
psicomotor considerando la edad a la que se inicia la regresión de los diferentes hitos
del desarrollo psicomotor previamente adquiridos, la edad de aparición del deterioro
cognitivo y la edad de inicio de los principales síntomas y signos de la enfermedad.
93
ORIGINAL ARTICLE
Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis: clinical courseand genetic studies in Spanish patients
María-Socorro Pérez-Poyato & Montserrat Milà Recansens & Isidre Ferrer Abizanda &
Raquel Montero Sánchez & Laia Rodríguez-Revenga & Victoria Cusí Sánchez &
M. Mar García González & Rosario Domingo Jiménez & Rafael Camino León &
Ramón Velázquez Fragua & Antonio Martínez-Bermejo & Mercè Pineda Marfà
Received: 6 January 2011 /Revised: 17 March 2011 /Accepted: 21 March 2011# SSIEM and Springer 2011
AbstractBackground Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis(JNCL, NCL3, Batten disease) is usually caused by a1.02-kb deletion in the CLN3 gene. Mutations in the CLN1gene may be associated with a variant form of JNCL(vJNCL). We report the clinical course and molecularstudies in 24 patients with JNCL collected from 1975 to2010 with the aim of assessing the natural history of thedisorder and phenotype/genotype correlations.Patients and methods Patients were classified into the
groups of vJNCL with mutations in the CLN1 gene and/orgranular osmiophilic deposit (GROD) inclusion bodies (n=11) and classic JNCL (cJNCL) with mutations in the CLN3gene and/or fingerprint (FP) profiles (n=13). Psychomotorimpairment included regression of acquired skills, cognitivedecline, and clinical manifestations of the disease. We usedKaplan-Meier analyses to estimate the age of onset ofpsychomotor impairment.Results Patients with vJNCL showed learning delay at anearlier age (median 4 years, 95% confidence interval [CI]
Communicated by: Sedel Frederic
Competing interest: None declared.
M.-S. Pérez-Poyato : R. Montero Sánchez :M. Pineda MarfàDepartments of Pediatric Neurology and Clinical Biochemistryand Centre for Biomedical Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto de Salud Carlos III, Hospital de Sant Joan de Déu,Esplugues de Llobregat,Barcelona, Spain
M. Milà Recansens : L. Rodríguez-RevengaBiochemical and Molecular Genetics Department and Centre forBiomedical Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto deSalud Carlos III, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona,Barcelona, Spain
M. Milà RecansensIDIBAPS, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona,Barcelona, Spain
I. Ferrer AbizandaDepartment of Pathology, Hospital Universitari de Bellvitge,L’Hospitalet de Llobregat,Barcelona, Spain
V. Cusí SánchezDepartment of Pathology, Hospital de Sant Joan de Déu,Esplugues de Llobregat,Barcelona, Spain
M. M. García GonzálezUnit of Pediatric Neurology, Hospital de Figueres,Girona, Spain
R. Domingo JiménezUnit of Pediatric Neurology, Hospital Virgen de la Arrixaca,Murcia, Spain
R. Camino LeónUnit of Pediatric Neurology, Hospital Reina Sofía,Córdoba, Spain
R. Velázquez Fragua :A. Martínez-BermejoService of Pediatric Neurology, Hospital La Paz,Madrid, Spain
M. Pineda Marfà (*)Department of Pediatric Neurology, Hospital Sant Joan de Déu,Passeig de Sant Joan de Déu 2, E-08950 Esplugues de Llobregat,Barcelona, Spaine-mail: [email protected]
J Inherit Metab DisDOI 10.1007/s10545-011-9323-7
94
3.1–4.8) than those in the cJNCL group (median 8 years,95% CI 6.2–9.7) (P=0.001) and regression of acquiredskills at a younger age. Patients with vJNCL showed amore severe and progressive clinical course than those withcJNCL. There may be a Gypsy ancestry for V181Lmissense mutation in the CLN1 gene.Conclusions The rate of disease progression may be usefulto diagnose vJNCL or cJNCL, which should be confirmedby molecular studies in CLN1/CLN3 genes. Further studiesof genotype/phenotype correlation will be helpful forunderstanding the pathogenesis of this disease.
Introduction
Neuronal ceroid lipofuscinosis (NCLs) is one of the mostcommon groups of progressive neurodegenerative diseases inchildhood (Goebel and Sharp 1998). The NCLs are autosomalrecessive lysosomal-storage disorders characterized by adiffuse accumulation of lipofuscin and ceroid in neural andnonneural tissues. Electron microscopy studies remain essen-tial to identify granular osmiophilic deposits (GROD),curvilinear profiles (CV), fingerprint profiles (FP) or mixed-type inclusions (Goebel 1996). Clinically, NCLs are charac-terized by seizures, progressive deterioration of cognition,motor function impairment (ataxia, spasticity), and vision loss.
Phenotypes have been classified considering age of onset,clinical course, and ultrastructural morphology into infantile,late-infantile, juvenile, and adult forms (Goebel et al. 1999;Santavouri et al. 2000; Haltia 2003) The current geneticclassification encompasses clinical heterogeneity with moresevere and more benign phenotypes, depending mostly onhow profoundly the genetic defect affects the function of theencoded protein (Goebel and Wisniewski 2004). To date tenforms with nine disease genes causing human NCL havebeen identified: CLN10/CTSD, CLN1/PPT, CLN2/TTP1,CLN3, CLN4, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8, CLN8, andCLCN6 (Siintola et al. 2006; Mole 2006).
Juvenile NCL (JNCL; NCL3, Batten’s disease orSpielmeyer-Vogt-Sjögren’s disease) is the most common formin the United States and Europe (Wisniewski et al. 1998b).The most frequent mutation causing JNCL is a 1.02-kbdeletion in the CLN3 gene on chromosome 16p12.1–11.2,accounting for about 80–85% of mutated alleles (TheInternational Batten Disease Consortium 1995; Mole et al.2005). Two different disease courses have been distinguishedin JNCL patients. Most homozygous patients for the 1.02-kbdeletion show classic JNCL (cJNCL). However, patientswho are compound heterozygotes for this deletion may haveatypical phenotypes, including a milder course of the disease(Lauronen et al. 1999). Mutations in the CLN1 gene producea variant form of JNCL (vJNCL) which is characterized bythe presence of GROD and which is clinically similar to
JNCL due to mutations in CLN3 (Mitchison et al. 1998;Mazzei et al. 2002). The variation of distribution of differentphenotypes of JNCL in various countries may be due togenetic differences and to date several disease pointmutations have been identified (Hofmann et al. 1999)(http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml).
This study was conducted to describe the clinical courseand the results of neuropathological and molecular studiescarried out in 24 Spanish patients with JNCL with the aimof assessing the natural history of the disease and toestablish genotype/phenotype correlations.
Subjects and methods
From 1975 to 2010, a total of 24 Spanish patients (11 males, 13females) with amean age 18.3 years (range 10–33) and from 18unrelated families were diagnosed with JNCL. Eleven patients(median age 18 years, range 10–23) presented mutations in theCLN1 gene and/or GROD inclusion bodies (vJNCL group)and 13 patients (median age 18 years, range 10–33) harboredmutations in the CLN3 gene and/or FP profiles (cJNCLgroup). The study was approved by the Ethics Committee ofHospital Sant Joan de Déu in Barcelona, which was thereference hospital for the study. Written informed consent wasobtained from all patients, parents, or legal guardians.
Data from each patient were collected from the patient’smedical records and completed by information provided bythe physicians in charge and the parents when necessary. Thereview of the medical records and the interviews wereconducted by a single investigator (M.S.P-P.). A databasewith 50 items was developed to enter the data (Table 1), whichincluded demographics; age at diagnosis; first symptom(delayed sitting /walking, seizures, visual failure, autisticbehavior, attention deficit, delayed speech, learning delay,clumsiness, loss of speech); type of seizures (myoclonic,myoclonic-atonic, partial, generalized tonic-clonic, second-arily generalized, atypical absence); age at regression ofacquired skills; cognitive decline; salient signs and symp-toms; electroencephalographic findings (background abnor-mality, generalized and focal paroxysmal activity, atypicalhigh voltage slow spikes and waves to low frequency photicstimulation in the posterior regions, vanishing EEG);ophthalmologic data (maculopathy, vessels attenuation,peripheral pigmentary clumping, optic nerve pallor/atrophy);electroretinographic findings (decreased amplitude, delayedlatency, attenuation of cortical waves, extinguished); visualevoked potentials (VEP) (decreased amplitude, delayedlatency, attenuation of cortical waves, abolished VEP, giantVEP); enzymatic assays (palmitoyl-protein thioesterase 1[PPT1), tripeptidyl peptidase 1 [TTP1]); electron microscopydata; and molecular studies.
Neurophysiological (electroretinography, VEP), neuroi-maging (brain MRI, CT scan), and ophthalmologic studies
J Inherit Metab Dis
95
were available for 22 of the 24 patients. Electroretinographywas performed in 21 patients at least once during the course ofthe disease. All patients underwent EEG. Brain imagingstudies were performed in 19 of 24 patients, and ophthalmo-logic evaluations in 18.
Electron microscope examinations of biopsied tissueswere the main morphological diagnostic technique beingobtained according to routine methods. The histologicalexamination of biopsy samples was carried out in 16patients, including biopsies of the skin (nine patients),conjunctive (two patients), appendix (three patients), andmuscle (two patients). The samples were fixed in 2.5%glutaraldehyde in phosphate buffer, post-fixed in osmiumtetroxide, dehydrated through graded acetone or alcoholand embedded in epoxy resins. Semi-thin sections werestained with toluidine blue and selected ultra-thin sectionswith uranyl acetate and lead citrate.
Palmitoyl-protein thioesterase (PPT-1) activity was mea-sured in samples of leukocytes or fibroblasts of eightpatients. The fluorimetric enzymatic analyses were per-formed using 4-methylumbelliferyl-6-thiopalmitoil β-D-glucoside (Moscerdam Substrates, Rotterdam, Holland) assubstrate. Protein measurements were performed accordingto the method of Lowry et al. (1951).
In all patients, peripheral blood DNA samples werestudied for the entire open reading frame and splice site(50 bp exon-intron boundaries) of the CLN1 and CLN3genes. The only large deletion studied was 1.02-kb in theCLN3 gene. Molecular studies were performed by single-strand conformation polymorphism analysis and sequenc-ing of abnormal patterns in the CLN1 and CLN3 genes.Genetics studies were carried out on the most patients.DNA was not available in two patients. One patient diedprior genetic studies were available (case 1) and the secondfamily did not approve this study (case 8).
The primary endpoint of the study was the assessment ofpsychomotor impairment (time to reach regression ofacquired skills, cognitive decline, and clinical symptoms/signs of the disease) in the groups of vJNCL and cJNCL.The age of onset of psychomotor impairment was taken assurvival data (i.e., time interval from birth to the onset ofpsychomotor impairment). In the absence of this informa-tion, data were censored at the age at the last visit.Estimates were made using the Kaplan-Meier survivalanalysis and survival curves were compared using the log-rank test. Adjustment for multiple comparisons was madeusing Bonferroni’s correction. Data were analyzed with theSPSS computer program (version 17.0).
Item# Description Item# Description
1 Examination data 26 Learning delay
2 Name and surname 27 Mental retardation
3 Date and birth place 28 Bradypsychia
4 Name of attending physician 29 Autistic behavior
5 Age at examination 30 Behavior disturbances
6 Age at clinical diagnosis 31 Epilepsy
7 Age at structural diagnosis 32 Type of seizures
8 Age at molecular diagnosis 33 Anticonvulsants and response to treatment
9 Consanguinity 34 Visual failure
10 Other family members with NCL 35 Blindness
11 Pregnancy 36 Apraxic gait
12 Delivery 37 Ataxia
13 Weight at birth 38 Pyramidal signs
14 Early psychomotor development 39 Spasticity and retraction of limbs
15 Age at onset of symptoms 40 Electroencephalographic findings
16 First symptom 41 Brain/cerebellar atrophy (MRI/CT)
17 Age at loss of walking ability 42 Ophthalmologic findings
18 Age at wheelchair-bound 43 Electroretinographic data
19 Age at loss of sitting ability 44 Visual evoked potentials
20 Age at loss of purposeful hand use 45 Vacuolated lymphocytes
21 Age at loss of sentence 46 Enzymatic assays
22 Age at nonverbal communication 47 Electron microscopic features
23 Dysphagia 48 Molecular studies
24 Nasogastric tube/feeding button 49 Clinical form
25 Age at urinary incontinence 50 Age of death
Table 1 Items of the clinicaldatabase
J Inherit Metab Dis
96
Tab
le2
Clin
ical
features,en
zymatic,an
dultrastruc
turalstud
iesin
JNCL
Spa
nish
patie
nts
Case
numbe
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Age
years
Con
sang
uinity
Presenting
symptom
Age
atfirst
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nosis
Myo
clon
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Respo
nseto
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Refractory
Pap
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r/(16)
+/+
(11)
NA
GROD,RL
(skin)
vJNCL
2aa
F23
Yes
Delay
edsp
eech
3/8
++++/−
Refractory
NA
NA
NA
NA
vJNCL
2ba
F17
Yes
Los
sof
speech
4/7
++++/−
Refractory
Optic
nerve
pallo
r/(7)
+/−
(7)
NA
GROD,RL,CV
(skin)
vJNCL
3aF
20No
Delay
edsp
eech
2/11
+++/++
Refractory
Pap
illary
pallo
r/(11)
+/−
(9)
NA
GROD
(con
junc
tiva)
vJNCL
4aa
M19
Yes
Delay
edsp
eech
2/9
++++/−
Con
trolled
Optic
nerve
atroph
y/(9)
+/+
(9)
NA
GROD
(app
endix)
vJNCL
4ba
M18
Yes
Learningde
lay
4/6
++++/−
Con
trolled
Optic
nerve
atroph
y/(8)
NA
NA
GROD
(skin)
vJNCL
4cF
12Yes
Learningde
lay
3/7
+++/−
Con
trolled
NA
/(7)
+/+
(7)
NA
NA
vJNCL
4dF
12Yes
Clumsine
ss4/2
+++++/−
Con
trolled
NA
/(7)
NA
1.6(6
–38)
NA
vJNCL
4eM
10Yes
Delay
edsp
eech
2/1
+++++/−
Con
trolled
NA
/(7)
NA
1.8(6
–38)
NA
vJNCL
5F
23Yes
Learningde
lay
4/8
+++++/++
Refractory
Optic
nerve
atroph
y/(8)
+/+
(8)
0.45
(6–3
8)GROD,FP
(app
endix)
vJNCL
6aF
17Yes
Learningde
lay
6/8
+++/−
Con
trolled
Optic
nerve
atroph
y/NA
+/+
(7)
2.4(con
trol
114)
NA
vJNCL
7aa
M33
No
Visua
lfailu
re6/18
−/+++
Refractory
Optic
nerve
atroph
y/(6)
−/−
(7)
NA
Intracytop
lasm
icinclus
ions
cons
istent
with
NCL
(mus
cle)
cJNCL
7bM
29No
Visua
lfailu
re6/6
−/+++
Refractory
Optic
nerve
atroph
y/(6)
−/+
(15)
NA
NA
cJNCL
8aF
26No
Seizu
res
4/18
++/+++
Refractory
NA
NA
NA
FP
(skin)
cJNCL
9M
25No
Visua
lfailu
re5/15
−/++
Con
trolled
Pap
illary
pallo
r/(12)
+/−
(15)
NA
NA
cJNCL
10F
24No
Visua
lfailu
re7/7
−/++
Con
trolled
Optic
nerve
atroph
y/(17)
−/−
(9)
NA
Intracytop
lasm
icinclus
ions
cons
istent
with
NCL
(skin)
cJNCL
11a
M18
Yes
Delay
edsp
eech
2/7
+++++/++
Refractory
Pap
illary
pallo
r/(7)
+/−
(7)
NA
FP
(con
junc
tiva)
cJNCL
12F
19No
Los
sof
speech
4/6
+++++/+++
Refractory
Normal
/(7)
+/+
(5)
Normal
FP,
CV
(app
endix)
cJNCL
13M
17No
Visua
lfailu
re5/13
−/++
Con
trolled
NA/(9)
−/−
(7)
NA
Intracytop
lasm
icinclus
ions
cons
istent
with
NCL
(skin)
cJNCL
14F
14Yes
Learningde
lay
7/10
−/++
Con
trolled
Periphe
ral
pigm
entary
clum
ping
/(10)
−/−
(7)
NA
FP,
CV
(skin)
cJNCL
15F
13No
Delay
edwalking
2/9
++/−
Con
trolled
Pap
illary
pallo
r/(10)
−/−
(9)
Normal
FP,
GROD
(skin)
cJNCL
J Inherit Metab Dis
97
Results
Enzymatic and molecular studies
In the group of 11 patients with vJNCL, a partial deficiencyof PPT1 activity was found in four patients (cases #4d, #4e,#5, and #6) who also showed mutations in the CLN1gene. In the remaining seven patients, data on PPT1activity were not assessed; five of these patients belongedto two unrelated families harboring mutations in the CLN1gene (cases #2a, #2b, #4a, #4b, and #4c) and theremaining two patients were included in the vJNCL groupbecause of a typical clinical course compatible withvJNCL and ultrastructural studies that showed mixedprofiles, predominantly GROD.
In the group of 13 patients with cJNCL, mutations inthe CLN3 gene were identified in 12 (92.3%). Fivepatients (41.7%) were found to have the 1.02-kb deletionon both chromosomes, whereas three patients werecompound heterozygotes for the 1.02-kb deletion. Theremaining four patients showed different mutations in theCLN3 gene. One patient (case #8) was included in thecJNCL group due to typical clinical course compatiblewith JNCL and ultrastructural studies showing FP inclu-sions. Vacuolated lymphocytes in peripheral blood werepresent in three cJNCL patients (cases #9, #11, and #15).In the remaining cJNCL patients, this study was notperformed.
Individualized clinical, enzymatic, and ultrastructuraldata as well as CLN1 and CLN3 allele mutations are shownin Tables 2 and 3. GROD inclusions in the blood vesselwall in a case of vJNCL are shown in Fig. 1, and FPinclusions in endothelial cells in two different CLN3 casesare shown in Fig. 2.
Regression of acquired skills
As shown in Table 4, regression of acquired skillsoccurred at an earlier age in patients with vJNCL than inthose with cJNCL, with statistically significant differencesfor all comparisons. On the other hand, the percentage ofpatients who did not show psychomotor impairment washigher in the cJNCL group than in the vJNCL group. Atthe time of the study, all patients with vJNCL had losttheir walking and sitting abilities, as well as to speak infull sentences, and urinary sphincter control. Loss ofsentences was observed at a median age of 8 years (95%CI 6.4–9.8) among vJNCL patients as compared with amedian of 20 years (95% CI 10.4–29.5) among those withcJNCL (P<0.001); absence of language appeared at amedian age of 10 years (95% CI 9–10.9) and 23 years(95% CI 7–38.9), respectively (P=0.002). Both vJNCLand cJNCL patients lost their walking ability andC
ase
numbe
rSex
Age
years
Con
sang
uinity
Presenting
symptom
Age
atfirst
symptom
/ag
eat
diag
nosis
Myo
clon
ic/
gene
raliz
edtonic-clon
icseizures
Respo
nseto
antie
pileptic
treatm
ent
Oph
thalmolog
icfind
ings
/ex
tingu
ishe
dERG
(age
,ye
ars)
Cereb
ral/
cerebe
llar
atroph
y(age
,yrs)
PPT1activ
itynm
ol/h/m
g(con
trol
rang
e)
Electron
microscop
y(biops
iedtis
sue)
Group
16M
12Yes
Visua
lfailu
re8/10
++/−
Con
trolled
Pap
illarypa
llor/
Low
amplitu
de(9)
−/−
(11)
Normal
NA
cJNCL
17M
12No
Learningde
lay
6/8
−/−
NA
Pap
illarypa
llor/
Low
amplitu
de(7)
−/−
(8)
NA
Intracytop
lasm
icinclus
ions
cons
istent
with
NCL
(skin)
cJNCL
18F
10No
Visua
lfailu
re6/8
−/++
Con
trolled
Pap
illarypa
llor/
Low
amplitu
de(7)
−/−
(7)
Normal
Intracytop
lasm
icinclus
ions
cons
istent
with
NCL
(mus
cle)
cJNCL
aDied;
M:male;
F:female;
NA:no
tassessed
;CV:cu
rviline
arinclus
ions
;RL:rectiline
arco
mplex
.
J Inherit Metab Dis
98
purposeful hand use few years after loss of sentences.Sitting ability was lost during adolescence in the vJNCLgroup and in adulthood in cJNCL patients (12 vs 31 years,P=0.001). Kaplan-Meier estimates of the age of thepatients at the time of regression of acquired skills areshown in Fig. 3A and B.
Cognitive decline
Except for behavior disturbances, all parameters of cognitivedecline (learning delay, mental retardation, bradypsychia, andautistic behavior) appeared at an earlier age in the vJNCLgroup as compared with the cJNCL group, and all differenceswere statistically significant (Table 4). Learning delay andmental retardation were observed in all vJNCL patients andin 92% of cJNCL patients. Learning delay occurred at amedian age of 4 years among vJNCL patients and mentalretardation at a median age of 5 years. However, in thecJNCL group learning delay and mental retardation occurredlater and at a more variable age. Kaplan-Meier estimates ofthe age of the patients at the time of regression of acquiredskills are shown in Fig. 3 C and D.
Table 3 Mutations identified in JNCL Spanish patients
Mutations in the CLN1 gene
Casenumber
Nucleotidechange
Mutation Aminoacid change/predicted consequence
Status Location Number of individualswith mutation in the family
2 c.541 G>T Missense V181L Homozygous Exon 6 2
4 c.541 G>T Missense V181L Homozygous Exon 6 5
5 c.541 G>T Missense V181L Homozygous Exon 6 1
6 c.541 G>T Missense V181L Homozygous Exon 6 1
Mutations in the CLN3 gene
7 c.462-677del (g.6060-7025del) c.374 G>A
1.02-kb deletionMissence/Splice site
Frameshift after C153S125N
Compoundheterozygous
Intron 6–8 Exon 5 2
9 c.462-677del(g.6060-7025del)
1.02-kb deletion Frameshift after C153 Homozygous Intron 6–8 1
10 c.462-677del(g.6060-7025del)
1.02-kb deletion Frameshift after C153 Homozygous Intron 6–8 1
11 c.622-623insT 1 bp insertion Frameshift after L207 Homozygous Exon 8 1
12 c.462-677del(g.6060-7025del)Not found
1.02-kb deletion Frameshift after C153 Compoundheterozygous
Intron 6–8 1
13 c.462-677del(g.6060-7025del)
1.02-kb deletion Frameshift after C153 Homozygous Intron 6–8 1
14 c.462-677del(g.6060-7025del)
1.02-kb deletion Frameshift after C153 Homozygous Intron 6–8 1
15 c.575 G>A c.622-623instT
Missense 1 bpinsertion
G192E Frameshiftafter L207
Compoundheterozygous
Exon 8 Exon 8 1
16 c.265 C>T Nonsense R89X Homozygous Exon 4 1
17 c.462-677del(g.6060-7025del)
1.02-kb deletion Frameshift after C153 Homozygous Intron 6–8 1
18 c.370insT c.1001 G>A 1 bp insertion Missense Frameshift after C153R334H
Compoundheterozygous
Exon 5 Exon 13 1
References: M. Milà and J. Mallolas, personal communication (cases 2, 4, 5, and 6); The International Batten Disease Consortium, 1995 (cases 7,9, 10, 12, 13, 14, and 17); M. Milà, personal communication (case 11); M. Milà, personal communication and Taschner et al., unpublished results(case 15); Sims, personal communication and Munroe et al. 1997 (case 18); the present study (cases 7 and 16).
Fig. 1 GROD inclusions in the blood vessel wall in a case of vJNCL(ultrathin section stained with uranyl acetate and lead citrate x 12,000)
J Inherit Metab Dis
99
Clinical signs and symptoms
Presenting symptoms of learning delay and delayed and lossof speech were observed predominantly in vJNCL (8 of 11patients) compared to cJNCL (4 of 13 patients) group. Visualfailure was more common as initial symptom in cJNCL thanvJNCL patients (Table 2). The median age at which visualfailure appeared in the two groups of patients was quitesimilar (P=0.088) (Table 4). Significant differences werefound for the age at which vJNCL patients were blind(median 8 years, 95% CI, 6.8–9.1) compared to cJNCL(median 12 years, 95% CI 11.2–12.7) (P<0.001). All vJNCLpatients developed apraxic gait and ataxia during theirchildhood whereas 69% of cJNCL patients both appearedduring adolescence (P<0.001, P=0.001, respectively). Themedian age at which pyramidal signs and spasticity wereobserved was the later and it was significant earlier invJNCL compared to cJNCL patients (P<0.001) (Table 4).
With respect to epilepsy, the median age was notsignificantly different between two groups (P=0.003) and
occurred before than blindness both vJNCL (median 7 years,95% CI 5.9–8) and cJNCL patients (median 10 years, 95%CI 7–12.9). The vJNCL patients had mainly myoclonicseizures whereas the cJNCL patients showed predominantlygeneralized tonic-clonic seizures. Pharmacological control ofseizures with anticonvulsant drugs was more satisfactory incJNCL patients than in vJNCL (Table 2). Optimal seizurecontrol was found in patients on valproic acid monotherapy,combination of valproic acid and carbamazepine, or combi-nation of valproic acid and clobazam.
Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at thetime of appearance of clinical signs and symptoms areshown in Fig. 3E and F.
Discussion
JNCL is the most prevalent type of NCL in North Europeancountries (Uvebrant and Hagberg 1997). Several mutationsin the CLN1 and CLN3 genes are associated with familiesfrom specific countries (http://www.ucl.ac.uk/ncl.genetics.shtml). The progression of the disease has been shown to bedifferent and patients with a more benign or delayed coursehave been reported (Wisniewski et al. 1999). Mostmutations in the JNCL genes are associated with a classicphenotype and a less severe disease is probably due tomutations that do not completely abolish the function of theencoded protein (Mitchison et al. 1998; Das et al. 1998;Lauronen et al. 1999; Mazzei et al 2002). At the time weundertook this study no comprehensive detailed studies ofJNCL had been carried out in Spain. We aimed to describethe natural history of the disease between two groups JNCLpatients (vJNCL and cJNCL). Our study tries to find anaccurate genotype-phenotype correlation.
Most patients who did not show regression of acquiredskills belonged to cJNCL group and vJNCL patientsshowed loss of acquired skills at an earlier age than didpatients with cJNCL. We observed slower progression ofthe disease in cJNCL than in vJNCL patients. Carefulclinical assessment regarding the regression of develop-mental skills in these two groups of JNCL patients allowedus to observe that it may be initiated by the onset of loss ofsentences followed by loss of walking ability. During thesecond stage of the disease the patients lose the purposefulhand use. Finally, patients lost their sitting ability. Accord-ing to other authors, the learning disabilities presented atthe earliest age in vJNCL (Philippart et al. 1995) and mostvJNCL patients presented mental retardation earlier thandid cJNCL patients. Additionally, learning delay occurredafter the onset of visual loss in cJNCL patients (Marshall etal. 2005). This finding suggests that the clinical course ofthe disease is more severe and progressive in vJNCL thanin cJNCL patients. An initial diagnosis of vJNCL patients
Fig. 2 A and B. Fingerprint inclusions in endothelial cells in twodifferent cases of CLN3 mutations (ultrathin section stained withuranyl acetate and lead citrate x 42,000)
J Inherit Metab Dis
100
may be suspected in the presence of learning delay andregression or delayed speech. Visual failure was the firstsymptom of the disease by 7 years of age as described inpatients with mutations in the CLN3 gene (Marshall et al.2005; Moore et al 2008; Sarpong et al 2009), while otherauthors referred it between 10 to 14 years in vJNCLpatients (Hofman and Taschner 1995; Philippart et al 1995).A phenotype characterized by visual failure and increasedsurvival was observed in compound heterozygous CLN3(cases 7a, 7b). In these patients the evolution to blindnesswas more severe and the cognitive deterioration occurredslightly later and more slowly than in homozygous patients(Wisniewski et al. 1998a and 1998b; Lauronen et al. 1999;Munroe et al. 1997; Aberg et al. 2009).
Epilepsy was the third symptom of the disease after theonset of visual failure and learning delay in both vJNCL andcJNCL patients. The estimated median age at onset of seizuresin our cJNCL patients was similar to what previously has beenreported in patients with mutations in the CLN3 gene (Aberget al. 2009; Moore et al. 2008; Sarpong et al. 2009). In ourseries, epilepsy with later onset appeared only in compound
heterozygous CLN3 patients (cases 7a, 7b) (Wisniewski et al.1998b; Aberg et al. 2009). Most cJNCL patients hadgeneralized tonic-clonic seizures and were often reasonablywell controlled as described in other series (Aberg et al.1999; Aberg et al. 2000; Sarpong et al. 2009). The blindnessoccurred a few years later than epilepsy in our series. Motordecline with ataxia and spasticity was observed duringadvanced stages of the disease. Most cJNCL patients showednormal MRI brain imaging in the early stages of disease(Santavouri et al. 2001) and vJNCL patients showed brainatrophy before the age of 12. Cerebellar atrophy was themain radiological sign in both groups of patients, although itis not an unequivocal sign of the disease (D’Incerti 2000;Autti et al. 2008).
A relationship between the absence of PPT1 activity andGROD (Das et al. 1998) and mutations in CLN1 gene andGROD has been reported (Mitchison et al. 1998; Mazzei etal. 2002; Mole et al. 2005). The present results confirm thatmutations in PPT1/CLN1 gene are associated with reducedPPT1 activity in vJNCL, as previously reported (Kalviainenet al. 2007). Moreover, GROD inclusions have been found in
Table 4 Age at the time of psychomotor impairment and clinical signs and symptoms
vJNCL patients (n=11) cJNCL patients (n=13) P value
Age, years median(95% CI)
No impairment %patients
Age, years median(95% CI)
No impairment %patients
Regression acquired skills
Loss of walking ability 9 (7.3–10.6) 0 21 (11.6–30.3) 38.5 < 0.001
Becoming wheelchair-bound 10 (6.7–13.2) 0 23 (12.6–33.3) 38.5 0.003
Loss of sitting ability 12 (8.4–15.5) 0 31 61.5 0.001
Loss of purposeful hand use 11 (8.3–13.6) 9.1 22 (13.6–30.3) 50 0.001
Loss sentences 8 (6.4–9.8) 0 20 (10.4–29.5) 38.5 < 0.001
No language 10 (9–10.9) 9.1 23 (7–38.9) 46.2 0.002
Dysphagia 12 (9.9–14) 9.1 22 (17.8–29.6) 53.8 < 0.001
Urinary incontinence 9 (7.5–10.4) 0 23 (18.2–27.7) 38.5 < 0.001
Cognitive decline
Learning delay 4 (3.1–4.8) 0 8 (6.2–9.7) 7.7 0.001
Mental retardation 5 (4.9–5.6) 0 11 (9.4–12.5) 7.7 < 0.001
Bradypsychia 7 (5.3–8.6) 9.1 14 (7–20.9) 23.1 0.024
Autistic behavior 7 (5.3–8.6) 9.1 17 (1.6–32.3) 46.2 0.001
Behavior disturbances 8 (6.5–9.7) 9.1 10 (8.3–11.6) 15.4 0.150
Clinical signs and symptoms
Visual failure 5.5 (4.8–6.1) 0 6.5 (5.6–7.3) 0 0.088
Blindness 8 (6.8–9.1) 0 12 (11.2–12.7) 15.4 < 0.001
Epilepsy 7 (5.9–8) 0 10 (7–12.9) 7.7 0.003
Apraxic gait 6.6 (5.8–7.4) 0 12 (9.9–14) 7.7 < 0.001
Ataxia 8 (6.9–9) 0 17 (7.7–26.2) 30.8 0.001
Pyramidal signs 8.5 (6.8–10) 0 20 (11.5–28.4) 38.5 < 0.001
Spasticity 10 (8.3–11.6) 0 18 (6.9–29) 38.5 < 0.001
J Inherit Metab Dis
101
all six cases carrying mutations in CLN1 gene. Interestingly,other inclusions including rectilinear, curvilinear and FPwere also found in some individuals.
Regarding CLN3 cases, intracytoplasmic inclusionswith FP were found in five cases, whereas the character-istics of the deposit were not specified in the other fivecases. However, in these cases, the pathologic study
disclosed ‘deposits consistent with NCL’. These biopsieswere not available for further re-examination. Curvilinearbodies and GROD inclusions associated with FP werepresent in three cases, as described in other studies (Aberget al 1998).
The present observations highlight the need for accuratecombined methods in the diagnosis of juvenile NCL. Clinical
Fig. 3 Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time of regression of acquired skills (a and b), cognitive decline (c and d), andmain signs and symptoms of the disease (e and f) among 24 Spanish patients with JNCL
J Inherit Metab Dis
102
symptoms prompt the identification of abnormal deposits,enzymatic deficits and genetic studies. Although crucial someyears ago, neuropathological findings with negative results inbiopsy samples do not rule out NCL (Das et al. 1998), and acombination of variegated deposits may occur in someindividuals. Regional variations should also be consideredwhen using skin, appendix, rectal mucosa or conjunctivetissue, as there is no proof that different tissues are equallyaffected at the same time in the progression of the disease.Further genetic studies in this area are still needed.
The presence of V181L missense mutation in CLN1 genewas found in homozygosis in nine patients belonging to fourunrelated consanguineous Gypsy families. There may be aGypsy ancestry for this mutation. Variability in the age atonset and presenting symptoms in families harboring othermutations (V181M) has been reported (Wisniewski et al.2000). It may be possible that still unknown epigeneticfactors may account for this interfamilial and interfamilialphenotypic variability.
The most common form of JNCL is caused by mutationsin CLN3 gene, being a 1.02-kb deletion the most prevalentmutation identified (The International Batten DiseaseConsortium 1995). On the basis of our results, the 1.02- kbdeletion was present in 54% of the mutated alleles. Thisfrequency is lower than previously reported (Munroe et al.1997; Wisniewski et al. 2000; Mole et al. 2005).
In summary, early clinical diagnosis of JNCL may besuspected on the basis of the symptomatology and age atdisease onset. The rate of disease progression may lead us to aclinical diagnosis of vJNCL or cJNCL which may beconfirmed bymolecular studies in CLN1/CLN3 genes. Furtherstudies of genotype/phenotype correlation will be helpful forunderstanding the pathogenesis of the disease. Early diagno-sis is crucial to be able to apply therapeutic options.
Acknowledgments We are indebted to Drs Armstrong, Vernet,Vilaseca, Coll and Gort, and the families of the patients for thevaluable support and indispensable cooperation, and Dr Marta Pulidofor editing the manuscript and editorial assistance (medical editingservices were provided on behalf of the authors).
Funding None
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J Inherit Metab Dis
105
Síntesis de resultados
� El retraso y /o regresión del lenguaje y el trastorno de aprendizaje se observaron
como síntomas iniciales principalmente en los pacientes con vLNCJ y el déficit
visual fue más común como síntoma de inicio en los pacientes con cLNCJ.
� La regresión de los hitos del desarrollo psicomotor previamente adquiridos
ocurrieron a una edad más precoz en los pacientes con vLNCJ que en los
pacientes cLNCJ y el deterioro psicomotor ocurrió en un mayor porcentaje de
pacientes con vLNCJ que cLNCJ.
� La pérdida de la capacidad para construir frases se inició a la edad mediana de 8
años en los pacientes con vLNCJ y a los 20 años de edad mediana en los
pacientes con cLNCJ. La pérdida de la deambulación y de la manipulación se
observaron unos años más tarde después del inicio de la pérdida de las frases en
todos los pacientes. La ausencia de lenguaje se observó a la edad mediana de 10
años en los pacientes con vLNCJ y a los 23 años de edad mediana en los
pacientes con cLNCJ. La pérdida de la sedestación ocurrió durante la
adolescencia en los pacientes con vLNCJ y en la edad adulta en los pacientes
con cLNCJ.
� Todos los parámetros que se estudiaron para valorar el deterioro cognitivo
(trastorno de aprendizaje, retraso mental, bradipsiquia y conducta autista)
aparecieron a edad más precoz en los pacientes con vLNCJ que en los pacientes
con cLNCJ. El trastorno de aprendizaje se observó a la edad mediana de 4 años
en todos los pacientes con vLNCJ y a la edad mediana de 8 años en el 92% de
los pacientes con cLNCJ. El retraso mental ocurrió a los 5 años de edad mediana
en todos los pacientes con vLNCJ y a la edad mediana de 11 años en el 92% de
los pacientes con cLNCJ.
106
� El déficit visual apareció a una edad similar en todos los pacientes del estudio
mientras que la ceguera ocurrió a la edad mediana de 8 años en los pacientes con
vLNCJ y a la edad mediana de 12 años en los pacientes con cLNCJ. La epilepsia
ocurrió antes que la ceguera en los pacientes con vLNCJ (edad mediana 7 años)
y en los pacientes con cLNCJ (edad mediana 10 años) siendo las crisis
mioclónicas más frecuentes en los pacientes con vLNCJ y las tónico-clónicas
generalizadas en los pacientes con cLNCJ. La ataxia ocurrió durante la infancia
en todos los pacientes con vLNCJ y se observó durante la adolescencia en el
69% de los pacientes con cLNCJ.
� La mutación V181L en el gen CLN1 fue identificada en homocigosis en nueve
pacientes pertenecientes a cuatro familias consanguíneas, no relacionadas, de
etnia gitana.
� La deleción 1.02-kb en el gen CLN3 estuvo presente en el 54% de los alelos
mutados. Este trabajo aporta dos nuevas mutaciones en el gen CLN3.
107
4. Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y
turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea
María del Socorro Pérez-Poyato, Montserrat Milá Recasens, Isidre Ferrer Abizanda,
Victoria Cusí Sánchez, María Vázquez López, Rafael Camino León, M Josep Coll
Rosell, Laura Gort, Mercé Pineda Marfa
Rev Neurolog 2012; 54:544-550
Es conocido que las formas variantes infantil tardía son el grupo más heterogéneo
de las LNCs, presentan gran variabilidad fenotípica y las inclusiones celulares suelen
ser de tipo mixto, todo ello complica el diagnóstico en estos pacientes. Además, la
mayoría de los pacientes proceden de Finlandia (CLN5 o variante finlandesa;
Santavuori et al. 1991) y Turkía (CLN7 o variante turca; Topcu et al. 2004).
Describimos el fenotipo de 3 pacientes con la forma variante infantil tardía
finlandesa (vLNCITFin) y el de un paciente con la forma variante infantil tardía turca
(vLNCITTur) procedentes de diferentes núcleos familiares. Documentamos la
enfermedad mediante los estudios anatomopatológicos y el análisis mutacional de los
genes CLN5 y CLN7. La descripción clínico-molecular, por primera vez, de estos cuatro
pacientes españoles añade información al espectro clínico de este grupo de
enfermedades poco prevalentes en nuestro país y que presentan una distribución
geográfica cada vez más amplia.
109
544 www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
NOTA CLÍNICA
Introducción
Las lipofuscinosis neuronales ceroideas (LNC) cons-
tituyen uno de los grupos de enfermedades neuro-
degenerativas de herencia autosómica recesiva más
frecuentes en la infancia [1]. Se caracterizan por un
acúmulo intracelular de ceroidolipofuscina que ori-
gina diferentes patrones ultraestructurales. Las LNC
son enfermedades genéticamente determinadas [2];
se han identificado ocho genes responsables de los
diferentes fenotipos clínicos en la infancia: CLN10/CTSD, CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8 y CLN8 [3,4].
En la edad pediátrica, las formas clínicas princi-
pales son infantil (LNCI), infantil tardía (LNCIT),
juvenil (LNCJ) y la forma congénita (LNCC), de
reciente descripción [5]. Los síntomas comunes a
los diferentes tipos de LNC son déficit visual, de-
terioro cognitivo y motor progresivo, epilepsia y
evolución a estado vegetativo con fallecimiento a
una edad precoz. Las características moleculares,
enzimáticas y ultraestructurales de las diferentes
formas clínicas de LNC se describen en la tabla I.
La existencia de formas variantes en la forma
infantil tardía (vLNCIT) ha llegado a ser amplia-
mente reconocida, ya que la correlación entre el
defecto genético y la edad de inicio no es absoluta,
las inclusiones celulares suelen ser de tipo mixto
[6] y la función de las proteínas codificadas por los
genes CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8 se desconoce
actualmente. La distribución geográfica de los fe-
notipos variante finlandesa (vLNCITFin) y variante
turca (vLNCITTur) puede deberse a diferencias ge-
néticas, y varias mutaciones ya se han identificado
(http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml). Resul-
tan necesarias estrategias adecuadas que contribu-
yan al estudio de correlación genotipo-fenotipo en
las LNC.
Describimos a cuatro pacientes procedentes de
diferentes familias españolas con vLNCITFin (tres
casos) y vLNCITTur (un caso): curso clínico, estu-
dios anatomopatológicos y análisis mutacional de
los genes CLN5 y CLN7.Proponemos un algoritmo que facilite el proceso
diagnóstico en este grupo de enfermedades poco pre-
valentes.
Lipofuscinosis neuronal ceroidea: algoritmo diagnóstico y descripción clínica de las variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y turca (CLN7)
María del Socorro Pérez-Poyato, Montserrat Milà-Recasens, Isidre Ferrer-Abizanda, Victoria Cusí-Sánchez,
María Vázquez-López, Rafael Camino-León, M. Josep Coll-Rosell, Laura Gort, Mercè Pineda-Marfà
Introducción. Las lipofuscinosis neuronales ceroideas (LNC) se clasifican, según la edad de inicio de la sintomatología, en
cuatro formas clínicas principales en la infancia: infantil, infantil tardía, juvenil y congénita (CLN1, CLN2, CLN3 y CLN10).
Las formas variantes infantiles tardías (CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8) se caracterizan por una gran variabilidad fenotípica y la
mayoría de los pacientes proceden de Finlandia y Turquía (variante finlandesa, CLN5, y turca, CLN7).
Casos clínicos. Se describen tres pacientes con la variante finlandesa y un cuarto paciente con la variante turca, proce-
dentes de diferentes familias. Se propone un algoritmo que facilite el diagnóstico de este grupo de enfermedades poco
prevalentes. Las pacientes con la variante finlandesa iniciaron un trastorno de conducta entre los 2,6 y 4,6 años seguido
de dificultades de aprendizaje y déficit visual a los 6 años de edad. Las crisis epilépticas generalizadas y mioclonoatónicas
aparecieron a los 7 años con sacudidas mioclónicas posteriormente. Las pacientes desarrollaron ataxia y ceguera a los 9
años, y manifestaron una importante discapacidad a los 11 años de edad. El paciente con la variante turca presentó epi-
lepsia refractaria desde los 2 años de edad seguido de un rápido deterioro con ataxia, pérdida de la deambulación en los
dos a tres años siguientes y estado vegetativo a los 11 años.
Conclusiones. El espectro de las formas variantes de LNC presenta una distribución geográfica cada vez más amplia. Nues-
tro estudio aporta tres nuevas mutaciones en el gen CLN5 y propone un protocolo de diagnóstico que facilite los estudios
de correlación genotipo-fenotipo.
Palabras clave. Algoritmo. CLN5. CLN7. Curso clínico. Lipofuscinosis neuronal ceroidea. Variantes finlandesa y turca.
Servicio de Neurología Pediátrica
(M.S. Pérez-Poyato, M. Pineda-
Marfà); Servicio de Anatomía
Patológica (V. Cusí-Sánchez);
Hospital Sant Joan de Déu;
Esplugues de Llobregat, Barcelona.
Sección de Errores Innatos del
Metabolismo, IBC (M.J. Coll-Rosell,
L. Gort); Servicio de Bioquímica
y Genética Molecular (M. Milà-
Recasens); IDIBAPS; Hospital Clínic;
Universitat de Barcelona; Barcelona.
Instituto de Neuropatología;
Servicio de Anatomía Patológica;
IDIBELL; Hospital Universitari de
Bellvitge; L’Hospitalet de Llobregat,
Barcelona (I. Ferrer-Abizanda).
Centro de Investigación Biomédica
en Red de Enfermedades Raras,
CIBER-ER; Instituto de Salud
Carlos III; Madrid (M.Milà-Recasens,
M.J. Coll-Rosell, L. Gort, M. Pineda-
Marfà). Servicio de Neurología
Pediátrica; Hospital Gregorio
Marañón; Madrid (M. Vázquez-
López). Unidad de Neurología
Pediátrica; Hospital Reina Sofía;
Córdoba, España (R. Camino-León).
Correspondencia:
Dra. María del Socorro Pérez
Poyato. Servicio de Neurología
Pediátrica. Hospital Sant Joan
de Déu. Pg. Sant Joan de Déu, 2.
E-08950 Esplugues de Llobregat
(Barcelona).
Fax:
+34 932 033 959.
E-mail:
Agradecimientos:
A la Dra. Armstrong y a la Asociación
Española de Familias Afectadas por
Lipofuscinosis, por su inestimable
colaboración, y a los Drs. Uta
Gölnitz (Alemania) y Lenka Dvorakova
(Rep. Checa), por su contribución
en la realización de los estudios
genéticos.
Aceptado tras revisión externa:
17.01.12.
Cómo citar este artículo:
Pérez-Poyato MS, Milà-Recasens M,
Ferrer-Abizanda I, Cusí-Sánchez V,
Vázquez-López M, Camino-León R,
�
110
545www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
Lipofuscinosis neuronal ceroidea: variantes infantil tardía finlandesa y turca
Casos clínicos
Caso 1
Niña sin antecedentes familiares de interés ni con-
sanguinidad. A los 2 años y 6 meses presentó conduc-
ta inquieta, atención deficiente y frecuentes disla-
lias, y a los 4 años de edad se detectó trastorno del
aprendizaje escolar e inició tratamiento psicopeda-
gógico sin mejoría evidente. A los 6 años y 10 meses
se evidenció regresión cognitiva, actitud bradipsí-
quica y torpeza motora. Se le realizó un fondo de ojo
con resultado normal y una tomografía axial com-
putarizada craneal que mostró atrofia del vermis ce-
rebeloso. A los 7 años y 5 meses comenzó con epi-
lepsia refractaria caracterizada por crisis tonicocló-
nicas generalizadas y parciales. El electroencefalo-
grama (EEG) mostró ondas lentas generalizadas de
predominio posterior y la resonancia magnética (RM)
craneal reveló una atrofia cerebelosa progresiva.
Con 8 años de edad aparecieron crisis mioclóni-
cas y en la exploración neurológica destacaba bra-
dipsiquia, ataxia, temblor y dismetría. El fondo de
ojo mostró atrofia papilar bilateral y el electrorreti-
nograma (ERG) puso de manifiesto latencias retra-
sadas y voltaje disminuido. En el potencial evocado
visual (PEV) la estimulación con flash provocó res-
puestas corticales paroxísticas en la línea media oc-
cipital con morfología de punta onda de 300 μV de
amplitud.
Ante la sospecha clínica de LNC se realizó una
biopsia de piel que evidenció cuerpos curvilíneos
(CV). El análisis enzimático en fibroblastos de PPT1
(palmitoilproteína tioesterasa 1) y TPP1 (tripepti-
dilpeptidasa 1) fue normal. A los 9 años la paciente
presentó mioclonías continuas y lenguaje escaso
con bisílabos. Progresivamente perdió la deambu-
lación autónoma a los 11 años, presentaba comu-
nicación gestual y disfagia y a los 15 años de edad
falleció en estado vegetativo. El estudio genético
mediante secuenciación directa de la región codifi-
cante de los genes CLN3, CLN6 y CLN8 resultó ne-
gativo. El diagnóstico de vLNCITFin se realizó me-
diante el análisis mutacional del gen CLN5, que re-
veló una 4-bp deleción en homocigosis (c.1002-
1006del AACA; p.Lys368SerfsX15) en el exón 4 [7].
Caso 2
Niña con antecedentes familiares de consanguini-
dad en segundo grado. A los 4 años y 6 meses de
edad presentaba dificultad en el aprendizaje escolar
y trastorno de conducta manifestado por hiperacti-
vidad y atención deficiente. A los 7 años y 4 meses
comenzó con crisis mioclonoatónicas y crisis par-
ciales con generalización secundaria. El EEG mos-
tró actividad de base lenta y actividad paroxística
bilateral con tendencia a la generalización. Al mes
siguiente presentó crisis generalizadas tonicoclóni-
cas y mioclónicas refractarias al tratamiento anti-
epiléptico. La exploración neurológica evidenció ac-
titud bradipsíquica, ataxia, leve dismetría y temblor.
La RM craneal mostró atrofia cerebelosa.
Ante la sospecha clínica de LNC se le realizó una
biopsia de piel que no evidenció material de depó-
sito. Con 8 años y 9 meses la paciente presentaba
mioclonías continuas, inició disfagia y había perdi-
do la deambulación autónoma y el lenguaje. En el
fondo de ojo destacaba atrofia papilar bilateral; ante
la sospecha clínica de LNCJ se solicitó un estudio
de linfocitos vacuolados en sangre periférica y un
estudio enzimático de PPT1 y molecular del gen
CLN3, con resultados negativos.
A los 10 años el PEV evidenció una respuesta
cortical paroxística de muy elevado voltaje en la re-
gión occipital. El estudio enzimático de TPP1 fue
normal y la biopsia apendicular mostró depósitos
granulares osmofílicos (GROD). La paciente falleció
a los 11 años en estado vegetativo. El diagnóstico de
vLNCITFin se realizó mediante el análisis mutacio-
nal del gen CLN5, que reveló una duplicación en
homocigosis de 25 nucleótidos en el exón 4 (c.1116_
1140dup25nt; p.L381fs) no descrita previamente.
Caso 3
Niña sin antecedentes familiares de interés, ni con-
sanguinidad. A los 3 años y 6 meses inició dislalias,
por lo que requirió tratamiento con logopedia. A la
edad de 5 años presentó disminución en el rendi-
miento escolar y recibió tratamiento psicopedagó-
gico. A los 6 años se evidenciaba regresión cogniti-
va, los padres apreciaban que había disminuido la
capacidad de memorizar y presentaba torpeza mo-
tora. A los 7 años y 6 meses presentó dos crisis
mioclonoatónicas y el EEG mostró trazado de base
lento y frecuentes paroxismos generalizados de
punta onda de elevada amplitud. La RM craneal fue
normal. En el fondo de ojo se apreció alteración
pigmentaria macular, el PEV mostró latencias in-
crementadas y el ERG estaba abolido. El estudio de
linfocitos vacuolados en sangre periférica fue posi-
tivo y la biopsia apendicular evidenció inclusiones
tipo finger print (FP) (Fig. 1).
Ante la sospecha clínica de LNCJ se solicitó un
estudio molecular del gen CLN3, con resultado ne-
gativo. El estudio enzimático PPT1 y TPP1 fue nor-
mal. A los 8 años y 10 meses la paciente inició crisis
et al. Lipofuscinosis neuronal
ceroidea: algoritmo diagnóstico y
descripción clínica de las variantes
infantil tardía finlandesa (CLN5) y
turca (CLN7). Rev Neurol 2012;
54: 544-50.
© 2012 Revista de Neurología
111
546 www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
M.S. Pérez-Poyato, et al
mioclónicas, ataxia, temblor y dismetría. El EEG
mostró trazado hipoactivo. A la edad de 9 años pre-
sentó crisis tonicoclónicas generalizadas, mioclo-
nías continuas, dificultad en la deglución y pérdida
de la deambulación autónoma. El diagnóstico de
vLNCITFin se realizó mediante el análisis mutacio-
nal del gen CLN5, que reveló una deleción en el
exón 3 (c.507delT; p.I169fs) y otra en el exón 4
(c.924_925delAT; p.F309fs) no descritas previamen-
te. El estudio genético familiar confirmó el estado
portador de los padres. Actualmente, a los 11 años,
presenta comunicación gestual, ausencia de control
cefálico y de manipulación y precisa de alimentación
por gastrostomía endoscópica percutánea.
Caso 4
Niño con antecedentes familiares de consanguini-
dad en primer grado. A los 2 años inició crisis mio-
clonoatónicas, y en los meses siguientes, crisis par-
ciales. A los 4 años y 6 meses se añadieron crisis
mioclónicas refractarias al tratamiento antiepilép-
tico y se evidenció regresión cognitiva, pérdida de
frases adquiridas, ataxia y dismetría. El fondo ojo
fue normal y la RM craneal mostraba atrofia cere-
belosa. A la edad de 5 años el paciente perdió la
deambulación autónoma y un año después presen-
tó disfagia y afasia. El deterioro neurológico fue
progresivo y a los 8 años presentó continuas mio-
Tabla I. Características moleculares, enzimáticas y ultraestructurales de las diferentes formas clínicas de lipofuscinosis neuronal ceroidea.
Epónimo OMIM Gen Locus ReferenciaMutación común
/localizaciónEnzima Localización
Fenotipo
ultraestructural
Material
proteico
Infantil (LNCI) Haltia-Santavuori
256730 CLN1 1p32Järvelä et al
(1991)
Arg122Trp
Exón 4
Arg151STOP
Exón 5
PPT1Interior del
lisosomaGROD SAP
Infantil tardía (LNCIT)
Juvenil (LNCJ)
Adulto (LNCA)
Clásica
(LNCIT)
Jansky-
Bielschowsky204500 CLN2 11p15
Sharp et al
(1997)
IVS5-1G>C
Intrón 5
Arg208STOP
Exón 6
TPP1Interior del
lisosomaCV SCMAS
vLNCITFin Variante
finlandesa256731 CLN5 13q22
Savukoski et al
(1994)
Tyr392STOP
Exón 4CLN5
Sistema del
lisosomaGROD, RL, CV, FP SCMAS
vLNCITJuv Lake-Cavanagh 601780 CLN6 15q21-23Sharp et al
(1997)
E72X
Exón 3CLN6
Retículo
endoplásmicoGROD, RL, CV, FP SCMAS
vLNCITTur Variante turca 610951 CLN74q28.
1-28.2
Williams et al
(1999)Thr294Lys MFSD8
Membrana
lisosomalGROD, RL, CV, FP SCMAS
EPMR
Epilepsia
progresiva con
retraso mental600143 CLN8 8p23
Tahvanainen
(1994)
Arg24Gly
Exón 2
CLN8Retículo endoplásmico
Golgi
GROD, CV
SCMAS
vLNCITVariante infantil
tardía
Topcu et al
(2004)FP, CV
Juvenil (LNCJ)Spielmeyer-
Vogt-Sjögren204200 CLN3 16p12
Eiberg et al
(1989)
1,02 kb deleción
Intrón 6-8CLN3
Membrana
lisosomalFP SCMAS
Congénita Congénita 610127 CLN10 11p15.5Martin et al
(1999)CTSD
Interior del
lisosomaGROD SAP
CTSD: catepsina D; CV: inclusiones curvilíneas; FP: finger print o huella dactilar; GROD: depósitos granulares osmofílicos; PPT1: palmitoilproteína tioesterasa 1; RL: inclusiones rectilíneas; SAP:
proteínas activadoras de los esfingolípidos o saposinas; SCMAS: subunidad c de ATP sintasa mitocondrial; TPP1: tripeptidilpeptidasa 1.
Infa
nti
l ta
rdía
112
547www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
Lipofuscinosis neuronal ceroidea: variantes infantil tardía finlandesa y turca
clonías y movimientos oculares erráticos. El ERG y
los PEV mostraron respuestas ausentes.
Ante la sospecha clínica de LNC se realizó biop-
sia muscular y de piel que reveló abundantes CV. El
estudio enzimático PTT1 y TPP1 fue negativo así
como el análisis mutacional de los genes CLN6 y
CLN8. El diagnóstico de vLNCITTur se realizó me-
diante el análisis molecular del gen CLN7, que re-
veló la mutación c.881C>A (p.T294K) en homoci-
gosis (exón 10). Actualmente, con 11 años, el pacien-
te se encuentra desconectado del medio y en estado
vegetativo.
La tabla II resume los datos clínicos y los resultados
de los estudios anatomopatológicos y moleculares
realizados en nuestros pacientes.
Discusión
La vLNCITFin se ha estudiado ampliamente en Fin-
landia [8-10] y es mucho menos frecuente compa-
rada con la LNCJ en España [11] y en el resto del
mundo [12]. Nuestra serie de tres pacientes con
vLNCITFin coincide con otros casos publicados pro-
cedentes de Colombia (tres pacientes) [13], Portu-
gal (un paciente) [14], Italia (dos pacientes) [15],
Afganistán-Pakistán (cuatro pacientes) [16] y Qatar
(dos pacientes) [17].
El curso clínico de nuestros pacientes con vLN-
CITFin es similar a las series de pacientes finlande-
ses [8-10] y los de origen árabe [17] previamente
publicados. La sintomatología se inició con trastor-
no de conducta y atención deficiente entre los 2,6 y
los 4,6 años [14,17] seguidos de trastorno de apren-
dizaje y déficit visual o torpeza motora alrededor
de los 6 años de edad [10]. Las dislalias, considera-
das fisiológicas antes de los 4 años de edad, se ob-
servaron en dos pacientes y no han sido descritas
previamente, a diferencia del retraso en la adquisi-
ción del lenguaje [16].
Las crisis epilépticas generalizadas y mioclono-
atónicas aparecieron a los 7 años de edad, al igual
que el paciente descrito en Portugal [14], pero han
sido descritas a los 4 años [16] y entre 8-11 años en
la serie de pacientes finlandeses [8,9], generalmente
seguidas de sacudidas mioclónicas unos meses más
tarde. Las crisis mioclónicas también se han obser-
vado como síntoma inicial a los 3 años de edad [17]
y después de la aparición de crisis tonicoclónicas
generalizadas dentro del grupo de epilepsias mio-
clónicas progresivas [18]. Coincidiendo con el ini-
cio de la epilepsia y años después de la regresión
cognitiva, los pacientes presentan ataxia, general-
mente entre los 7 y 9 años de edad. A esta edad el
ERG está abolido y pueden evidenciarse respuestas
corticales gigantes en el PEV [8,9]. Los pacientes
manifiestan una importante discapacidad entre los
7 y 11 años de edad [10].
Las mutaciones en el gen CLN5 pueden asociar-
se además a una edad de inicio juvenil con déficit
visual [13], deterioro cognitivo [15,16] y con tras-
torno motor en la edad adulta [19]. Hemos obser-
vado la existencia de linfocitos vacuolados en nues-
tro tercer paciente, característicos de la LNCJ, no
detectados en otros pacientes con mutaciones en el
gen CLN5 [8,9,13,17]. Estos hallazgos sugieren que
el análisis mutacional del gen CLN5 debería am-
pliarse a pacientes con fenotipo juvenil, una vez ex-
cluidas las mutaciones en el gen CLN3 y con nor-
mal actividad enzimática PPT1 y TPP1.
El curso clínico del paciente con vLNCITTur es
similar a la serie original de pacientes turcos [20]; la
epilepsia refractaria es el signo guía, seguido de un
rápido deterioro con ataxia, pérdida de la deambu-
lación en los dos a tres años siguientes y déficit vi-
sual posteriormente (4-10 años de edad). La mu-
tación c.881C>A (p.T294K) en homocigosis se ha
asociado a este fenotipo en pacientes procedentes
de Turquía, República Checa [21] e Italia [22].
Las LNC presentan heterogeneidad genética (mu-
taciones en diferentes genes pueden originar simi-
lares fenotipos clínicos), heterogeneidad alélica (di-
ferentes mutaciones en el mismo gen pueden ori-
ginar diferentes fenotipos clínicos) y, por último,
pueden ser fenotípicamente heterogéneas incluso
Figura 1. Inclusiones finger print o huella dactilar en las células endo-
teliales del caso 3.
113
548 www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
M.S. Pérez-Poyato, et al
dentro de la misma familia. Además, la vLNCIT es
el grupo más heterogéneo de las LNC [4,6], con
mutaciones en cuatro genes conocidos y con gran
variabilidad fenotípica, lo que complica el diagnós-
tico en estos pacientes. Se conocen diversos algorit-
mos para el estudio de las LNC [23]. Basándonos en
Tabla II. Datos clínicos, anatomopatológicos y moleculares en pacientes con mutaciones en los genes CLN5 y CLN7.
Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4
Sexo / Edad actual Mujer / 15 años (fallecida) Mujer / 11 años (fallecida) Mujer / 11 años Varón / 11 años
Consanguinidad No Sí No Sí
Síntoma inicial (edad)
Trastorno de la
conducta/dislalias
(2 años y 6 meses)
Trastorno de la conducta
(4 años y 6 meses)
Dislalias
(3 años y 6 meses)
Crisis epilépticas
(2 años)
Edad en el momento
del diagnóstico 15 años 11 años 9 años 10 años
Edad de inicio del
trastorno de aprendizaje4 años 4 años 5 años –
Edad de inicio de la
regresión cognitiva 6 años y 10 meses 7 años y 5 meses 6 años 4 años y 6 meses
Edad de inicio de la ataxia 8 años 7 años y 5 meses 8 años y 10 meses 4 años y 6 meses
Epilepsia Refractaria Refractaria Refractaria Refractaria
Crisis epilépticas
(edad)
Generalizada, parcial
(7 años y 5 meses)
Mioclonoatónica, parcial
(7 años y 4 meses)
Mioclonoatónica
(7 años y 6 meses)
Mioclonoatónica, parcial
(2 años)
Edad de inicio de
las crisis mioclónicas8 años 7 años y 5 meses 8 años y 10 meses 4 años y 6 meses
Edad de inicio de las
mioclonías continuas9 años 8 años y 9 meses 9 años 8 años
Atrofia cerebral/cerebelosa
(edad)
–/+ (6 años y 10 meses)
+/+ (7 años y 5 meses)–/+ (7 años y 5 meses) –/– (7 años y 6 meses) –/+ (4 años y 6 meses)
Fondo de ojo (edad) Atrofia papilar bilateral
(8 años)
Atrofia papilar bilateral
(8 años y 9 meses)
Palidez papilar
(7 años y 6 meses)
Normal
(4 años y 6 meses)
Potenciales evocados
visuales (edad)
Respuesta cortical gigante
(8 años)
Respuesta cortical gigante
(10 años)
Aumento de latencias
(7 años y 4 meses)
Respuesta ausente
(8 años)
Electrorretinograma
(edad)
Latencias retrasadas, voltaje ↓
(8 años)No realizado
Abolido
(7 años y 10 meses)
Abolido
(8 años)
Microscopía electrónica
(tejido biopsiado)
Inclusiones curvilíneas
(piel)
Depósitos granulares
osmofílicos (apéndice)
Finger print (apéndice)
Inclusiones curvilíneas
(piel y músculo)
Gen identificado CLN5 CLN5 CLN5 CLN7
Análisis mutacional c.1002-1006del AACA c.1116_1140dup25nt c.507delT/c.924_925delAT c.881C>A
Cambio de aminoácido p.Lys368SerfsX15 p.L381fs p.I169fs/p.F309fs p.T294K
Estado Homocigosis Homocigosis Heterocigosis Homocigosis
Referencia bibliográfica Kohan et al (2008) Este estudio Este estudio Aiello et al (2009)
114
549www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
Lipofuscinosis neuronal ceroidea: variantes infantil tardía finlandesa y turca
lo publicado en la bibliografía y en la experiencia
diagnóstica de nuestros pacientes, proponemos una
estrategia de actuación que pueda ser de utilidad en
los estudios de correlación genotipo-fenotipo de
este grupo de enfermedades (Fig. 2). En la mayoría de los pacientes la determinación
PPT1 orientará el diagnóstico, ya que las mutacio-
nes en el gen CLN1 pueden originar fenotipos con
edad de inicio en la infancia hasta la edad adulta. La
deficiencia de TPP1 puede orientar en fenotipos in-
fantil tardía clásica y juvenil. Cuando los resultados
de las determinaciones enzimáticas sean normales,
debemos considerar el diagnóstico de las formas
variantes de la LNCIT (vLNCITFin, vLNCITJuv, vL-
NCITTur, epilepsia progresiva con retraso mental).
Dado que los estudios genéticos en estas formas clí-
nicas pueden ser laboriosos, es aconsejable com-
probar la existencia de inclusiones típicas de LNC
mediante estudios de microscopía electrónica, an-
tes de proceder al análisis mutacional (CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8). Es imprescindible la existencia de
profesionales con experiencia en microscopía elec-
trónica, dada la importancia del diagnóstico y la di-
ficultad de la técnica.
En conclusión, nuestro estudio añade información
clínica y aporta tres nuevas mutaciones al espectro
de las formas variantes de las LNC, que presentan
una distribución geográfica cada vez más amplia.
Establecemos un protocolo de actuación que ayude
Figura 2. Algoritmo diagnóstico en los estudios de correlación genotipo-fenotipo de las lipofuscinosis neuronales ceroideas.
115
550 www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
M.S. Pérez-Poyato, et al
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a realizar estudios de correlación genotipo-fenotipo
mediante la identificación de las mutaciones y la
realización de una adecuada caracterización clínica
de los pacientes.
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Neuronal ceroid lipofuscinosis: diagnostic algorithm and clinical description of the Finnish (CLN5)
and Turkish (CLN7) variants late infantile
Introduction. The neuronal ceroid lipofuscinosis are classified based on age at onset into four main clinical forms in child-
hood: infantile, late infantile, juvenile and congenital (CLN1, CLN2, CLN3 and CLN10). The variant late infantile forms
(CLN5, CLN6, CLN7 and CLN8) are characterized by a wide variability of the clinical phenotypes and the most patients are
originated from Finland and Turkey (Finnish, CLN5, and Turkish, CLN7 variants).
Case reports. We describe three unrelated patients with Finnish variant and another patient with Turkish variant. We
describe an algorithm to facility the diagnosis of these low prevalence diseases. Patients with Finnish variant started with
behaviour disorder between 2.6 and 4.6 years of age followed by learning difficulties and visual failure at an age of 6
years. Generalised tonic-clonic and myoclonic seizures were observed at 7 years of age with myoclonic jerks later on.
Patients developed ataxia and blindness within 9 years and increasingly disability at 11 years of age. The patient with
Turkish variant started with refractory epilepsy at age of 2, followed by a severe neurodegeneration manifested by ataxia,
loss of walking ability within 2-3 years and vegetative state at 11 years of age.
Conclusions. The clinical spectrum of the variant late infantile forms shows a wide geographical distribution. We report
three novel mutations in the CLN5 gene and a diagnostic algorithm to facility the correlation genotype-phenotype studies.
Key words. Algorithm. Clinical course. CLN5. CLN7. Finnish and Turkish variants. Neuronal ceroid lipofuscinosis.
117
Síntesis de los resultados
� Los tres pacientes con vLNCITFin, procedentes de diferentes familias y
Comunidades Autónomas de la geografía española, presentaron un fenotipo
similar a las series de pacientes finlandeses (Santavuori et al. 1982, 1991) y de
origen árabe (Holmberg et al. 2000) previamente publicadas.
� La sintomatología se inició con trastorno de conducta y / o atención deficiente
entre los 2.6 y 4.6 años de edad seguidos de trastorno de aprendizaje y déficit
visual vs torpeza motora alrededor de la edad de 6 años. Las crisis epilépticas
generalizadas y mioclono-atónicas aparecieron un año más tarde y fueron
seguidas de crisis mioclónicas. Coincidiendo con el debut de la epilepsia y años
después de la regresión cognitiva, los pacientes presentaron ataxia, generalmente
entre los 7-9 años de edad y severa discapacidad antes de la edad de 11 años.
� Observamos la presencia de linfocitos vacuolados en un paciente con vLNCITFin
y mutación en el gen CLN5 y confirmamos la existencia de diferentes
inclusiones celulares en cada uno de los pacientes con vLNCITFin.
� Este trabajo aporta 3 mutaciones nuevas en el gen CLN5, expandiendo así el
espectro mutacional de esta forma clínica de lipofuscinosis neuronal ceroidea.
� Describimos el primer paciente español con vLNCITTur cuyo fenotipo fue similar
a la serie original de pacientes de origen turco (Topcu et al. 2004) y se
caracterizó por epilepsia, como síntoma inicial, seguida de un rápido deterioro
con ataxia, pérdida de la deambulación entre los 2-3 años siguientes y posterior
déficit visual.
119
5. Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea
Las LNCs presentan heterogeneidad genética (mutaciones en diferentes genes
pueden originar similares fenotipos clínicos), heterogeneidad alélica (diferentes
mutaciones en el mismo gen pueden originar similares fenotipos clínicos) y, por último,
pueden ser fenotípicamente heterogéneas incluso dentro del mismo núcleo familiar.
Basándonos en los algoritmos previamente publicados en la literatura y en
nuestra experiencia en el diagnóstico de pacientes con LNC, establecemos un protocolo
de estudio para este grupo de enfermedades que por un lado, ayude a realizar adecuadas
correlaciones genotipo-fenotipo mediante la identificación de las mutaciones y la
realización de una adecuada caracterización clínica de los pacientes y por otro,
contribuya a encontrar nuevos pacientes con LNC en nuestra población (Figura 8).
12
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123
DISCUSIÓN CONJUNTA 1. Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración
clínica de una serie de pacientes españoles
2. Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional del
gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles
3. Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico y
estudios genéticos en pacientes españoles
4. Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y
turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea
125
Las lipofuscinosis neuronal ceroidea son uno de los grupos más frecuentes de
enfermedades progresivas neurodegenerativas de la infancia (Goebel and Sharp, 1998).
Clínicamente se caracterizan por crisis epilépticas, deterioro cognitivo, trastorno motor
(ataxia y espasticidad) y déficit visual. Los diferentes fenotipos clínicos se han asociado
a mutaciones en los ocho genes responsables de las diferentes formas clínicas en la edad
pediátrica (CLN10/CTSD, CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN5, CLN6,
CLN7/MFSD8 y CLN8).
Esta tesis versa sobre el estudio de la historia natural de la enfermedad en cada
una de las formas clínicas principales de LNC debido, por un lado, a que en la mayoría
de las ocasiones el diagnóstico se realiza de forma tardía al ser enfermedades poco
conocidas y de baja prevalencia; y por otro, porque es de vital importancia la aplicación
de escalas de valoración clínica para el desarrollo de futuras terapias y participación de
pacientes en ensayos clínicos, al ser enfermedades para las que no se dispone de
tratamiento curativo en la actualidad.
En este trabajo hemos ampliado el espectro clínico-mutacional de las
lipofuscinosis neuronal ceroidea en la población española, mediante la caracterización
clínica de pacientes y la identificación de nuevas mutaciones en los genes CLN1, CLN2,
CLN3, CLN5 y CLN7 y, hemos dado a conocer la distribución de las diferentes formas
clínicas de LNC en España. Este estudio ha sido el primer paso dentro de la creación de
un protocolo diagnóstico para la identificación de pacientes con lipofuscinosis neuronal
ceroidea en nuestro país y la realización de correlaciones genotipo-fenotipo.
126
1. Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración
clínica de una serie de pacientes españoles
Las series más amplias de pacientes con LNCI proceden de Finlandia
(Santavuori et al. 1973, 1974) y las descripciones publicadas de pacientes procedentes
de los países del sur de Europa (Baumann y Markesbery, 1982, Cardona y Rosati 1995,
Santorelli et al. 1998, Veneselli et al. 2000, Texeira et al. 2003) son similares a nuestra
casuística de seis pacientes en España.
Según nuestros resultados, la enfermedad se inició entre los 8 y los 15 meses de
edad aunque puede ocurrir hasta los 18 meses (Santavuori et al. 1974, Oishi et al. 1999,
Topcu et al. 2004) y se caracterizó por un trastorno motor (retraso motor o ataxia),
deterioro cognitivo y rasgos autistas. La observación de que a la misma edad los
pacientes presenten fondo de ojo normal y alteraciones en el ERG, nos sugiere que el
déficit visual puede aparecer en estadíos precoces de la enfermedad, simultáneamente
con los síntomas neurológicos, conduciendo rápidamente a la ceguera.
A diferencia de la mayoría de autores que observan las crisis mioclónicas entre
los 16 y 24 meses de edad (Santavuori et al. 1973, 1974, 1988, Santorelli et al. 1998,
Takano et al. 2008), en nuestra serie ocurrieron más tarde, entre los 2 y 3 años de edad
y, la epilepsia fue el último síntoma, incluso un paciente no ha desarrollado epilepsia a
la edad de 3 años. Estos hallazgos dan idea del espectro tan amplio de la epilepsia en la
LNCI pudiendo aparecer en cualquier momento durante el curso de la enfermedad. El
EEG es el primer examen neurofisiológico alterado en los pacientes con LNCI, antes
incluso del inicio de la epilepsia, y muestra un enlentecimiento de la actividad rítmica
de base (Santavuori et al. 1973, 1974, Takano et al. 2008), lo que nos sugiere la
posibilidad de solicitar este examen complementario como herramienta útil en la
práctica clínica diaria, ante el inicio de la sintomatología neurológica. Todos los
127
pacientes se mantienen en estado vegetativo desde aproximadamente la edad de cuatro
años hasta el fallecimiento que suele ocurrir en la primera década de la vida, lo que
confirma la severidad y agresividad de esta forma clínica.
Nuestros resultados han confirmado que la mutación p.Val181Met en el gen
CLN1, previamente descrita por Das et al. 2001 y Texeira et al. 2003, está asociada con
el fenotipo severo de LNCI cuando se presenta en homocigosis.
2. Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional
del gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles
La forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea presenta una
distribución mundial y tanto sus características clínicas como los hallazgos
ultraestructurales están claramente definidos en la literatura (Mole et al. 2005). Sin
embargo, el índice de progresión de la enfermedad y su correlación con las mutaciones
en el gen CLN2 no habían sido descritos previamente.
La mayoría de los autores describen la epilepsia, manifestada por cualquier tipo
de crisis, como el síntoma inicial de la enfermedad entre los 2 y 4 años. Destacamos
como manifestaciones iniciales de la enfermedad el retraso del lenguaje, en aquellos
pacientes que no llegaron a adquirir esta capacidad completamente, y las crisis febriles
simples seguidas de epilepsia, lo cual ha sido publicado en muy pocos pacientes
(Hartikainen et al. 1999, Barisic et al. 2003). Por otro lado, el disponer de una serie de
12 pacientes nos ha permitido valorar por primera vez la regresión del desarrollo
psicomotor que se inicia con la pérdida de la capacidad para construir frases alrededor
de los 3 años de edad. Durante el segundo estadio de la enfermedad los pacientes
pierden la deambulación y presentan ausencia de comunicación verbal. Finalmente, la
128
pérdida de la sedestación, manipulación y del control de esfínteres ocurre alrededor de
los 5 años seguido de disfagia, tan sólo unos meses más tarde.
Las crisis epilépticas tónico-clónicas generalizadas han sido descritas como el
tipo más frecuente (Topcu et al. 2004). Sin embargo, en nuestra serie la epilepsia se
inició con crisis parciales a la edad mediana de 3.4 años seguidas de crisis mioclónicas
que originaron el desarrollo posterior de una epilepsia mioclónica progresiva en todos
los pacientes. El déficit visual ocurrió después de la epilepsia y la ataxia fue el tercer
síntoma de la enfermedad apareciendo a los 4 años junto con el inicio del deterioro
cognitivo. Los pacientes presentaron temblor y espasticidad en los estadíos avanzados
de la enfermedad.
Según nuestros resultados, los pacientes presentaron un fenotipo similar, a
diferencia de otras series que describen heterogeneidad clínica (Zhong et al. 2000). Las
dos mutaciones más comunes identificadas en el gen CLN2 por Sleat et al. (1997)
fueron menos frecuentes (78% vs 26%) que en otros estudios, lo que confirma la amplia
heterogeneidad genética en la población española observada también en otras
enfermedades de herencia autosómica recesiva.
3. Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico
y estudios genéticos en pacientes españoles
El estudio en profundidad de una amplia serie de pacientes españoles con la
forma juvenil de lipofuscionosis neuronal ceroidea ha permitido ampliar el
conocimiento sobre la historia natural de la enfermedad en pacientes con fenotipo LNCJ
y mutaciones en los genes CLN1 y CLN3. Destacamos el curso clínico más severo y
progresivo en los pacientes con mutaciones en el gen CLN1 considerando que en estos
pacientes la regresión del desarrollo psicomotor ocurre a edad más precoz que en los
129
que presentan mutaciones en el gen CLN3. Describimos por primera vez dicha regresión
en ambos grupos de pacientes iniciada con la pérdida de la capacidad para construir
frases, seguido por la pérdida de la deambulación. Durante el segundo estadio de la
enfermedad los pacientes pierden la manipulación y finalmente, la sedestación.
Antes de la realización de este trabajo, el déficit visual era considerado
generalmente el síntoma inicial en los pacientes con LNCJ independientemente del gen
responsable de la enfermedad. Aportamos que en pacientes con mutaciones en el gen
CLN1 la enfermedad generalmente se inicia con trastornos de aprendizaje o retraso /
regresión del lenguaje, mientras que en los pacientes con mutaciones en el gen CLN3
suele ser el déficit visual el síntoma inicial más común, seguido por las dificultades de
aprendizaje. Confirmamos la existencia de un fenotipo caracterizado por déficit visual y
mayor supervivencia en pacientes heterocigotos para la deleción 1.02-kb en el gen
CLN3 los cuales presentan deterioro cognitivo a edad más tardía y de forma más
progresiva que los pacientes homocigotos para dicha deleción (Wisniewski et al. 1998a,
Lauronen et al. 1999, Aberg et al. 2009).
Hemos descrito la epilepsia como el tercer síntoma en los pacientes con LNCJ,
después del trastorno de aprendizaje y el déficit visual. La ceguera ocurrió varios años
después de la epilepsia y el deterioro motor manifestado por ataxia y espasticidad
ocurrió en estadíos avanzados de la enfermedad.
La identificación de la mutación V181L en homocigosis en el gen CLN1 en
nueve pacientes pertenecientes a cuatro familias diferentes, consanguíneas, de etnia
gitana hace intuir que en pacientes originarios de dicha etnia, la identificación de esta
mutación sea prioritaria.
130
4. Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y
turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea
En este trabajo se realiza por primera vez la descripción de tres pacientes con
vLNCITFin y mutaciones en el gen CLN5 y se confirma la escasa variabilidad en el
fenotipo de estos pacientes en relación con las diferentes mutaciones en el gen CLN5.
Coincidiendo con publicaciones anteriores, queda constatado que la vLNCITFin es
menos frecuente que la LNCJ en España (Pérez-Poyato et al. 2011) y en el resto del
mundo (Goebel y Wisniewski, 2004) y que nuestra casuística es similar a la de otras
series previamente publicadas en los países del área Mediterránea (Bessa et al. 2006,
Cannelli et al. 2007).
Destacamos las dislalias como síntoma de presentación, no descrito
previamente, a diferencia del retraso en la adquisición del lenguaje (Lebrum et al.
2009). Aunque las dislalias son consideradas fisiológicas antes de los 4 años de edad,
podrían orientar, según la evolución de la enfermedad, sobre esta forma clínica.
Describimos por primera vez la presencia de linfocitos vacuolados en un
paciente con vLNCITFin. La sospecha diagnóstica inicial en este paciente fue de LNCJ
ante la similitud en el fenotipo y la presencia característica de este hallazgo en los
pacientes con mutaciones en el gen CLN3. Este hecho, nos sugiere que el análisis
mutacional del gen CLN5 debería ampliarse a pacientes con fenotipo juvenil, actividad
enzimática PPT1 y TPP1 normal y análisis mutacional del gen CLN3 negativo.
Dada la reciente descripción del gen CLN7 como causante de vLNCITTur
(Siintola et al. 2007) y la progresiva identificación de nuevas mutaciones en la
actualidad, la descripción de este primer paciente nos hace sospechar de la probable
existencia de otros casos infradiagnosticados en España y nos alienta a descubrir la
existencia de otros nuevos pacientes.
131
CONCLUSIONES
133
1. Se confirma que la forma infantil precoz de lipofuscinosis neuronal ceroidea
se caracteriza por un severo y progresivo curso clínico. Se ha demostrado
que en nuestra población, la mutación V181M del gen CLN1 está asociada
con el fenotipo más severo de la enfermedad.
2. La forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea presenta un curso
clínico muy homogéneo en la población española. Se demuestra la existencia
de heterogeneidad genética en las 10 familias estudiadas con LNCIT.
3. Se ha diferenciado detalladamente el curso clínico de la forma juvenil de
lipofuscinosis neuronal ceroidea en los pacientes españoles con los fenotipos
clásico (cLNCJ) y variante (vLNCJ) y se han establecido correlaciones
genotipo-fenotipo. Se considera la posibilidad de realizar un diagnóstico
precoz de LNCJ en base a la sintomatología inicial y la edad de inicio. El
índice de progresión de la enfermedad orienta hacia los fenotipos causados
por mutaciones en los genes CLN1 / CLN3 y el diagnóstico definitivo deberá
confirmarse mediante el análisis mutacional de dichos genes.
4. Se ha ampliado la distribución geográfica de las formas variante infantil
tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea y se ha descrito el espectro clínico-
mutacional de las formas variantes infantil tardía finlandesa y turca en
España.
5. Los trabajos que conforman esta tesis doctoral han sido fundamentales para
la elaboración de un protocolo diagnóstico el cual permite realizar estudios
de correlación genotipo-fenotipo y amplía el espectro clínico-mutacional en
la población española afectada de lipofuscinosis neuronal ceroidea.
135
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Zhong N, Wisniewski KE, Hartikainen J, Ju W, Moroziewicz DN, McLendon L,
Sklower Brooks SS, Brown WT. Two common mutations in the CLN2 gene underlie
late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Clin Genet 1998a; 54:234-238
Zhong N, Wisniewski KE, Kaczmarski AL, Ju W, Xu WM, Xu WW, Mclendon L, Liu
B, Kaczmarski W, Sklower Brooks SS, Brown WT. Molecular screening of Batten
disease: identification of a missense mutation (E295K) in the CLN3 gene. Hum Genet
1998b; 102: 57-62
Zhong N, Moroziewicz DN, Ju W, Jurkiewicz A, Johnston L, Wisniewski KE, Brown
WT. Heterogeneity of late-infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Genet Med 2000;
2:312-318
171
ANEXO 1. Comunicaciones científicas a congresos relacionadas con el tema
2. Otras publicaciones
173
1. Comunicaciones científicas a congresos relacionadas con el tema
� Neuronal ceroid lipofuscinosis from our children’s hospital. Pérez Poyato MS,
Pineda Marfa M, Cusí Sánchez V, Ferrer Abizanda I, Milá Recasens M. Póster.
Annual Symposium of the Society for the Study of Inborn Errors of Metabolism
(SSIEM). Lisboa, Portugal. 2-5 Septiembre 2008.
� Lipofuscinosis neuronal ceroidea en la edad pediátrica. Pérez Poyato MS, M.
Pineda Marfa, V. Cussí, I. Ferrer, M. Milá. Comunicación oral. XXXIII Reunión
Anual de la Sociedad Española de Neurología Pediátrica. Zaragoza. 18-19
Septiembre 2008.
� Lipofuscinosis neuronal ceroidea. Ponencia. Reunión Anual de la Sociedad
Aragonesa de Neurofisiología Clínica. Zaragoza. 20 Mayo 2009.
� Neuronal ceroid lipofuscinosis from our children’s hospital. Pérez Poyato MS,
Pineda Marfa M, Cusí Sánchez V, Ferrer Abizanda I, Milá Recasens M. Póster. 12th
International Congress on Neuronal Ceroid Lipofuscinoses (NCL). Hamburgo,
Alemania. 3-6 Junio 2009.
� Lipofuscinosis neuronal ceroidea en un hospital de referencia pediátrico. Pérez
Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M.
Póster. VIII Congreso Nacional de Errores Congénitos del Metabolismo (AECOM).
Bilbao. 22-23 Octubre 2009.
� Neuronal ceroid lipofuscinoses from our Spanish children’s hospital. Pérez
Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M.
Póster. 11th International Child Neurology Congress. El Cairo, Egipto. 2-7 Mayo
2010.
174
� The natural history and genotype-phenotype correlations in Spanish patients
with Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis. Pérez Poyato MS, Montero Sánchez
R, Milá Recasens M, Cusí Sánchez V, Ferrer Abizanda I, Coll MJ, Domingo
Jiménez R, Pineda Marfa M. Póster. Annual Symposium of the Society for the
Study of Inborn Errors of Metabolism (SSIEM). Póster. Estambul, Turquía. 31
Agosto - 3 Septiembre 2010.
� Historia natural y correlación genotipo-fenotipo en pacientes españoles con la
forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea. Pérez Poyato MS, Milá
Recasens M, Montero Sánchez R, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa
M. Comunicación oral premiada. VIII Congreso Nacional de la Sociedad Española
de Neurología Pediátrica. Córdoba. 20-23 Octubre 2010.
� Historia natural y correlación genotipo-fenotipo en pacientes españoles con la
forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea. Pérez Poyato MS, Milá
Recasens M, Montero Sánchez R, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa
M. Comunicación oral. LXII Reunión Anual de la Sociedad Española de
Neurología. Barcelona. 18 Noviembre 2010.
� Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis: clinical evolution and genetic Studies in
Spanish patients. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Montero
Sánchez R, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M. Póster. 9th Congress of the European
Paediatric Neurology Society. Cavtat, Dubrovnik, Croacia. 11-14 Mayo 2011.
� Lipofuscinosis neuronal ceroidea forma infantil precoz: descripción clínica de
la primera serie de pacientes españoles. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M,
Domingo Jiménez R, López Lafuente A, Póo Argüelles P, Pineda Marfa M.
Comunicación oral premiada. XXXV Reunión Anual de la Sociedad Española de
Neurología Pediátrica. Granada. 16-18 Junio 2011
175
� Lipofuscinosis Neuronal Ceroidea forma Infantil Precoz: descripción clínica de
la primera serie de pacientes españoles. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M,
Ferrer Abizanda I, Coll Rosell MJ, Domingo Jiménez R, López LafuenteA, Póo
Argüelles P, Pineda Marfa M. Comunicación oral. LXIII Reunión Anual de la
Sociedad Española de Neurología. Barcelona. 15-19 Noviembre 2011.
� Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis: mutation in the CLN2 gene and
clinical course in Spanish patients. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer
Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M. Póster. 13th International Congress on
Neuronal Ceroid Lipofuscinoses (NCL). Londres. 28-31 Marzo 2012
� Lipofuscinosis neuronal ceroidea infantil tardía: descripción clínica de la forma
clásica (CLN2) y las variantes finlandesa (CLN5), juvenil precoz (CLN6) y turca
(CLN7). Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V,
Coll Rosell MJ, Pineda Marfa M. Comunicación oral premiada. XXXVI Reunión
Anual de la Sociedad Española de Neurología Pediátrica. Santander. 31 Mayo-2
Junio 2012
176
2. Otras publicaciones
� Pérez-Poyato MS, O’Callaghan M, Pineda Marfa M. Initiation and discontinuation
of substrate inhibitor treatment in patients with Niemann-Pick type C disease. Gene
2012 (aceptado, in press).
� Pérez-Poyato MS, Pineda Marfa M. New agents and approaches to treatment in
Niemann-Pick type C disease. Curr Pharm Biotechnol 2011; 12: 897-901.
� Pineda M, Pérez-Poyato MS, O’Callaghan M, Vilaseca MA, Pocovi M, Domingo R,
Portal LR, Pérez AV, Temudo T, Gaspar A, Peñas JJ, Roldán S, Fumero LM, de la
Barca OB, Silva MT, Macías-Vidal J, Coll MJ. Clinical experience with miglustat
therapy in pediatric patients with Niemann-Pick disease type C: a case series. Mol
Genet Metab 2010; 99: 358-366.