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ENZIMAS
• Substâncias orgânicas de estrutura complexa geradas no interior da célula
• aceleram reações químicas que ocorrem em sistemas biológicos.
• Podem ser encontradas em células animais ou de plantas, bem como em microorganismos.
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• Quimicamente, são proteínas globulares constituídas de longas cadeias de aminoácidos unidas por ligações peptídicas
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Cadeia com menos de 50 AA peptídeos.
Proteínas cadeias maiores
20 aminoácidos comumente encontrados nas proteínas:
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ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL
Podem ter 4 tipos de estrutura
• Estrutura primária:
- mais simples e mais importante, pois dele deriva todo o arranjo espacial da molécula- é somente a seqüência dos aminoácidos, sem se preocupar com a orientação espacial
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• Estrutura secundária
- rotação das ligações entre os carbonos dos aminoácidos de seus grupamentos amina e carboxila.
Alfa-hélice:
- forma mais comum; - hélice em espiral - as cadeias laterais dos se distribuem para fora da hélice;- ponte H.
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Folha beta ou folha pregueada.
- arranjados em paralelo ou no sentido anti-paralelo.
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• Estrutura terciária
- resulta do enrolamento da hélice ou da folha pregueada, - estabilizada por pontes de hidrogênio e pontes de enxofre,
- têm seqüências de aminoácidos diferentes, refletindo estruturas e funções diferentes,
- Forças fracas, podem ser facilmente quebradas – desnaturação
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• Estrutura quaternária
- possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas.- a estrutura tridimensional destas é a estrutura quaternária.- Ex: hemoglobina - sua estrutura é formada por quatro cadeias polipeptídicas
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Estreita relação entre a estrutura da enzima e sua função:
• são altamente específicas
• somente certos substratos sofrem sua ação e unicamente um tipo de reação ocorre, sem reações colaterais ou produtos derivados,
• se sua estrutura mudar – não catalisa mais aquele substrato
Como isso ocorre?
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O substrato liga-se à enzima através do sítio ativo, local onde ocorrerá a reação catalisada pela enzima.
SÍTIO ATIVO
• resíduos de aminoácidos capazes de interagir com o substrato e formação do produto.
• Estes resíduos denominam-se grupos catalíticos
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Representação esquemática da estrutura tridimensional da lipase de
Pseudomonas cepacia.
Ser
His
Asp
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Teoria da “chave-fechadura” proposta por Emil Fischer
O sítio ativo possui uma conformação cujos grupos ligantes R dos aminoácidos estão corretamente posicionados, e sua conformação é complementar a estrutura do substrato
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Modelo do “encaixe induzido”, proposto por Koshland
o sítio ativo é uma região flexível cuja forma pode ser induzida para alojar compostos estruturalmente semelhantes.
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Vantagens de utilizá-las como catalisadores:
aumentam de várias ordens de grandeza a velocidade das reações,
as reações ocorrem em condições suaves de temperatura, pressão, e em meio de pH e concentração salina praticamente constantes,
são altamente específicas e capazes de diferenciar estereoisômeros de certos compostos, sem formar subprodutos,
têm capacidade de regular processos,
como aceleram a velocidade da reação sem alterar o equilíbrio termodinâmico, elas podem catalisar um grande número de reações.
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União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (UIBBM)
• classificadas em seis grandes grupos, de acordo com o tipo de reação envolvida
• Cada enzima descrita recebe um número de classificação, conhecido por “E.C.”, que é composto por 4 dígitos:
1. Classe 2. Sub-classe dentro da classe 3. grupos químicos específicos que participam da
reação. 4. a enzima, propriamente dita
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Classificação das Enzimas - UIBBM
Classe Tipo de Reação Subclasse
Oxidoredutases Transferência de elétrons ou
remoção de hidrogênio
Hidrogenases, oxidases,
peroxidases, etc
Transferases Reações de transferência de
grupos
Transaldolases,
transcetolases, etc
Hidrolases Reações de hidrólise Estearases, lipases ,
peptidases, fosfatases, etc
Liases Reações de adição de grupos
a dupla ligação ou formação
de duplas ligações por
remoção de grupos
Descarboxilases,
cetoácidoliases, hidroliases, pectato liase
Isomerases Transferência de grupos
dentro da molécula para
produzir isômeros
Racemases, epimerases,
oxirredutases, mutase, etc
Ligases Formação e clivagem de
ligações C-O, C-S, C-C e C-
N e ésteres de fosfato
1
2
3
4
5
6
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Exemplo:
Pectato Liase EC 4.2.2.2
liase
carbono-oxigênio liase
ativa em polissacarídeos
Pectato liase
EC 4.2.2.2
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COFATORES ENZIMÁTICOS E COENZIMAS
Cofatores:
• um ou mais íons inorgânicos que podem ser necessários para a função de uma enzima.
• não estão ligados permanentemente à molécula da enzima mas, na ausência deles, a enzima é inativa.
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Coenzimas:
• compostos orgânicos, quase sempre derivados de vitaminas,
• a fração protéica de uma enzima, na ausência do seu cofator, é chamada de apoenzima.
• enzima + Cofator, chamamos de holoenzima.
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IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
As enzimas quando imobilizadas:
retém sua configuração estrutural devido as ligações de hidrogênio que ocorrem na superfície do material
dificuldade de vibração
Aumento da estabilidade térmica.
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O principal interesse em imobilizar
uma enzima é obter um biocatalisador com
atividade e estabilidade que não sejam
afetadas durante o processo.
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Vantagens da imobilização:
aumenta a estabilidade das enzimas,
baixo custo,
facilita a separação e recuperação das enzimas,
reutilização, possibilitando operações contínuas.
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Tipos de Suporte
• materiais inertes com pouca ou nenhuma interferência no comportamento cinético da enzima.
• O suporte para ser efetivo na imobilização deve:
- deixar a enzima acessível aos substratos, - manter a atividade por um longo período- possibilitar a regeneração do sistema suporte/enzima ao final do processo, sem que ocorra a perda da atividade enzimática.
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Exemplos de suportes inertes
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Confinamento em matriz
• Polímeros naturais: gel de agar, caseinato de sódio
• Orgonogéis de microemulsão óleo-água, aerogéis de sílica.
Confinamento em microcápsula
• Gelatina, quitosana, alginato carragenana com cloreto de cálcio ou potássio
Ligações cruzadas
• Hexametilenodiamina e glutaraldeído
Ligações em suportes
• Adsorção física: álcool polivinílico (PVA), xantana, quitosana, galactomanana, poli-oxido de etileno (PEO), poli(ácido acrílico) (Carbopol), nylon 6.
• Adsorçção covalente: sílica, alumina, celulose, poli(etilenoglicol) (PEG), metoxi(polietilenoglicol)-p-nitrofenil carbonato.
• Adsorção iônica: resinas de troca iônica: DEAE-sefadex, carboximetilcelulose, Dowex 66, duolite 568N)
Sistema bifásico
Solvente orgânicoÁgua + enzima
Enzima
Métodos de Imobilização de Enzimas
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Atividade Enzimática
Atividade biológica capacidade que as enzimas possuem de reagir com determinados constituintes das
células
irá depender da estrutura da proteína
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As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas
O que importa não é a massa, mas a atividade
Proteínas desnaturadas
Conserva a massa protéica
Sem atividade catalítica
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Dosagem: através da medida de sua atividade
Avaliada pela velocidade da reação que a enzima catalisa ([S] ou [P])
uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)
Pro
duto
µm
ol/m
L
velocidade constante
velocidade decresce
Tempo (min.)
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Atividade medida da velocidade de reação em condição inicial (velocidade constante)
A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades (U).
1 U é a quantidade de enzima capaz de formar 1µmol de produto por
minuto em condições ótimas
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Métodos para a determinação da atividade de enzimas:
Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo.
Métodos para avaliar as [ ] das espécies:
• Muito diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria...
• Menos diretos: - Medida da Viscosidade.
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Pectinase
1mL/L 0,1 mL
0,1 mL solução enzima +
0,9 mL: solução de pectina +
2mL DNS
Total = 4mL
Após 5 min dosa-se produto: 0,476 µmol/mL
0,476 µmol/mL em 5 min 0,0952 µmol/min
A = 0,0952 х 4mL х 1000 = 380,8 µmol mL-1min-1
A = 380,8 U/mL
Exemplo: Determinar a atividade de pectinase (quebra a pectina):
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A velocidade das reações enzimáticas varia com diversos fatores:
• pH
• substrato
• concentração de enzima
• temperatura.
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Valor de pH ótimo = atividade máxima;
Velocidade da reação : pH afasta do ótimo;
Influência do pH: dos grupos dissociáveis;
• Influência do pH
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Um equilíbrio químico de um ácido fraco pode ser escrito como:
HA A- + H+
As concentrações de HA e de A- dependem do pH
pH HA A-
pH ótimo
concentração hidrogeniônica (H+) que leva a molécula de enzima à conformação ideal para exercer seu papel
catalítico
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pH ótimo: determinado a partir de uma curva do efeito do pH na atividade enzimática
muitas enzimas apresentam uma curva indicando que não existe um único valor de pH ótimo, mas uma faixa de pH ótimo (6,0 a 8,5).
6 > pH > 8,5 = inativação irreversível.
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RTekk
0
T velocidade de reação = energia cinética;
K é função crescente da T Lei de Arrhenius
• Influência da temperatura
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Note que quanto maior a temperatura de, mais rápido é o processo de desnaturação térmica.
Rompidas as pontes de hidrogênio alterações estruturas = nova conformação;T desnaturação pouco acima da T ótima.
T muito elevadas = desnaturação da enzima
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• Efeito da concentração do substrato na velocidade da reação
Cinética Enzimática