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Johannes Gutenberg-Universität Mainz Institut für Mikrobiologie und Weinforschung
Entwicklung von molekularen Sonden
für die sichere Identifizierung von Hefen
der Gattungen Brettanomyces/Dekkera
Dissertation
zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Am Fachbereich Biologie
der Johannes Gutenberg-Universität Mainz
vorgelegt von
Christoph Röder
geb. am 05.02.1977 in Herborn
Mainz, 2007
Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden von September 2004 bis März 2007
am Institut für Mikrobiologie und Weinforschung der Johannes Gutenberg-Universität
Mainz durchgeführt.
Dekan:
1. Berichterstatter:
2. Berichterstatter:
Tag der mündlichen Prüfung: 25.10.2007
Die Ergebnisse dieser Arbeit sind teilweise in folgenden Publikationen und
Posterpräsentationen veröffentlich:
Publikationen:
Röder, C., König, H. & Fröhlich, J. (2007): Species-specific identification of
Dekkera/Brettanomyces yeasts by fluorescently labeled DNA probes targeting the 26S
rRNA. FEMS Yeast Res. 7: 1013-1026.
Röder, C., von Walbrunn, C. & Fröhlich, J. (2007): Detektion und Untersuchung der
Verbreitung der Wein-relevanten Schädlingshefe Dekkera (Brettanomyces) bruxellensis in
Rheinhessen. Dtsch. Lebensm.-Rundsch. 103: 353-359.
Röder, C., König, H. & Fröhlich, J. (2007): Molekulare Sonden für die sichere
Identifizierung von Spezies der Gattungen Brettanomyces/Dekkera. In Jahresbericht 2006.
Forschungsring des Deutschen Weinbaus (FDW) bei der Deutschen Landwirtschafts-
Gesellschaft (DLG) e. V. Fachzentrum Land- und Ernährungswirtschaft, Frankfurt am
Main, S. 48.
Fröhlich, J., Röder, C., Pfannebecker, J. & Hirschhäuser, S. (2005): Nachweis eines
Lebenskünstlers. Das deutsche Weinmagazin 21: 26-28.
Posterpräsentationen:
Röder, C., König, H. & Fröhlich, J. (2007): Species-specific identification of
Dekkera/Brettanomyces yeasts by fluorescently labeled rDNA probes targeting the 26S
rRNA (Teil 2). Posterpräsentation auf der Jahrestagung der VAAM in Osnabrück und auf
der internationalen Technologiemesse Intervitis Interfructa in Stuttgart.
Röder, C., König, H. & Fröhlich, J. (2006): Species-specific identification of
Dekkera/Brettanomyces yeasts by fluorescently labeled rDNA probes targeting the 26S
rRNA (Teil 1). Posterpräsentation auf der Jahrestagung der VAAM in Jena.
INHALTSVERZEICHNIS I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung............................................................................................................. 1
1.1 Schädlingshefen in der Weinbereitung................................................... 1
1.2 Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera ....................................... 4
1.3 Methoden zur Detektion und Identifizierung ...................................... 12
1.4 Fluoreszenz in situ Hybridisierung ....................................................... 17
1.5 Untersuchungsobjekt Rheinhessenwein ............................................... 22
1.6 Ziele der vorliegenden Arbeit ................................................................ 24
2. Material und Methoden................................................................................ 27
2.1 Verwendete Web-Adressen.................................................................... 27
2.2 Geräte und Hilfsmittel............................................................................ 28
2.3 Verwendete DNA- und RNA-Sequenzen .............................................. 29
2.4 Chemikalien ............................................................................................ 30
2.5 Molekularbiologische Reagenzien und Kits ......................................... 31
2.6 Oligonukleotide (Primer) ....................................................................... 32
2.7 Oligonukleotide (Cy3-markierte Sonden) ............................................ 33
2.8 Puffer und Lösungen .............................................................................. 35
2.8.1 DNA-Isolierung aus Hefen ........................................................ 35
2.8.2 Gelelektrophorese ...................................................................... 35
2.8.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung ............................................ 35
2.8.4 Färbungen .................................................................................. 36
2.9 Medien ..................................................................................................... 37
2.10 Organismen und Kultivierung ............................................................ 38
2.10.1 Brettanomyces/Dekkera-Institutsstämme ................................ 38
2.10.2 Brettanomyces/Dekkera-Eigenisolate...................................... 39
2.10.3 Weitere verwendete Organismen............................................. 41
2.10.4 Probennahme ........................................................................... 41
2.10.5 Isolierung von Brettanomyces/Dekkera-Stämmen .................. 41
2.10.6 Qualitativer Nachweis der Acetat-Produktion......................... 42
INHALTSVERZEICHNIS II
2.10.7 Qualitative Untersuchung der Hydrolyse von Cellulose ......... 42
2.10.8 Untersuchung der Sporulation ................................................. 43
2.11 Untersuchung ribosomaler Gensequenzen......................................... 43
2.11.1 DNA-Isolierung ....................................................................... 43
2.11.2 Untersuchung der 18S rDNA-Sequenzen ................................ 44
2.11.3 Untersuchung der ITS-Region ................................................. 45
2.11.4 Untersuchung der 26S rDNA-Sequenzen ................................ 45
2.11.5 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................... 45
2.11.6 Aufreinigung der PCR-Produkte ............................................. 46
2.11.7 Sequenzierung.......................................................................... 46
2.11.8 Sequenzanalyse........................................................................ 46
2.11.9 Generierung phylogenetischer Stammbäume .......................... 46
2.12 rRNA-Sekundärstrukturen ................................................................. 47
2.13 Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonden .................................. 48
2.14 Fluoreszenz in situ Hybridisierung .................................................... 49
2.14.1 Präparation der Zellen.............................................................. 50
2.14.2 Vorbehandlung der Oligonukleotid-Sonden............................ 50
2.14.3 Hybridisierung ......................................................................... 51
2.14.4 Nachbehandlung des Präparats ................................................ 51
2.14.5 Eigenschaften von DAPI und DABCO ................................... 52
2.14.6 Fluoreszenzmikroskopie .......................................................... 52
2.15 Vitalitätsfärbungen............................................................................... 53
2.15.1 Färbung mit Fun1 und Calcofluor White............................... 54
2.15.2 Färbung mit Fluoresceindiacetat.............................................. 55
2.15.3 Färbung mit SYTOX Green................................................... 55
2.16 Physiologische Art- und Stamm-Differenzierung.............................. 56
2.16.1 Biolog YT Mikrotiterplatten-Test............................................ 56
3. Ergebnisse ........................................................................................... 57
3.1 DNA-Sequenzanalysen bei Brettanomyces/Dekkera ............................ 57
3.1.1 18S rDNA-Sequenzen................................................................ 57
3.1.2 ITS-Regionen............................................................................. 58
3.1.3 26S rDNA-Sequenzen................................................................ 60
INHALTSVERZEICHNIS III
3.2 Die Generierung von 26S rRNA-Sekundärstrukturen ....................... 65
3.3 Entwicklung von spezifischen DNA-Sonden ........................................ 66
3.4 Die Detektion und Identifizierung durch FISH ................................... 72
3.4.1 FISH mit 18S rRNA-gerichteten Sonden .................................. 72
3.4.2 FISH mit 26S rRNA-gerichteten Sonden .................................. 73
3.5 Differenzierung von lebenden und toten Hefe-Zellen ......................... 78
3.5.1 Live/Dead Yeast Viability Kit ................................................. 78
3.5.2 Fluoresceindiacetat .................................................................... 79
3.5.3 SYTOX Green ......................................................................... 80
3.6 Stoffwechselphysiologische Untersuchungen ....................................... 81
3.6.1 Acetat-Produktion bei Brettanomyces/Dekkera spec. ............... 81
3.6.2 Untersuchung der Hydrolyse von Cellulose .............................. 82
3.6.3 Untersuchung der Sporulation ................................................... 83
3.6.4 Art-Differenzierung durch Mikrotiterplatten-Test..................... 83
3.6.5 Stamm-Differenzierung durch Mikrotiterplatten-Test............... 86
3.7 Die regionale Verbreitung von Dekkera bruxellensis .......................... 87
3.7.1 Stamm-Isolierung....................................................................... 87
3.7.2 Regionale Verbreitung in Rheinhessen...................................... 89
4. Diskussion.......................................................................................................... 92
4.1 Sequenzanalysen im rRNA Gen-Cluster .............................................. 92
4.2 Das Sonden-Design auf Basis von Sekundärstrukturen ..................... 95
4.3 Die FISH-Analyse ................................................................................... 97
4.4 Kritische Evaluierung von Vitalitätsfarbstoffen ............................... 100
4.5 Erste physiologische Charakterisierungen......................................... 103
4.5.1 Acetat-Produktion.................................................................... 103
4.5.2 Cellulose-Abbau ...................................................................... 106
4.5.3 Sporenbildung.......................................................................... 107
4.5.4 Differenzierung durch Stoffwechselmuster ............................. 109
4.6 Dekkera bruxellensis in der Weinbauregion Rheinhessen ................ 111
5. Ausblick............................................................................................................ 115
INHALTSVERZEICHNIS IV
6. Zusammenfassung ........................................................................................ 117
7. Literaturverzeichnis .................................................................................... 119
8. Anhang.............................................................................................................. 134
8.1 Vergleichende Sequenzanalysen für die Konstruktion
phylogenetischer Stammbäume........................................................... 134
8.1.1 ITS-Regionen........................................................................... 134
8.1.2 26S rDNA-Sequenzen.............................................................. 136
8.2 Sekundärstrukturen der 26S rRNAs .................................................. 145
8.3 Biolog YT MicroPlateTM Mikrotiterplatten-Test............................... 155
8.4 Mikroskopische Bestimmung der Zelltiter......................................... 157
ABKÜRZUNGEN V
Abkürzungen
Abb. Abbildung bp Basenpaare CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures (Baarn, Niederlande) Cy3 Fluoreszenzfarbstoff Indocarboxycyanin DABCO 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]oktan DAPI 4’,6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid-Hydrat deion. deionisiert dNTP Desoxynukleotidtriphosphat DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig) EDTA Ethylendiamintetraacetat FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung GC Guanin + Cytosin-Gehalt [%] h hour/s (Stunde/n) ITS Internal Transcribed Spacer LSU large subunit (große Untereinheit) M Molar mM Millimolar NCBI National Center of Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase Ketten Reaktion) PNA Peptide-like Nucleic Acid (Peptid-ähnliche Nukleinsäure) rDNA ribosomal Deoxyribonucleic Acid (ribosomale Desoxyribonukleinsäure) rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) rRNA ribosomal ribonucleic acid (ribosomale Ribonukleinsäure) RT Raumtemperatur S Svedberg SDS Sodiumdodecylsulfat SSU Small Subunit (kleine Untereinheit) Tab. Tabelle TBE Tris-Borat-EDTA Tm melting temperature (Schmelztemperatur) TRIS Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan Tween 80 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat ü. N. über Nacht U unit/s (Einheit/en) V Volt YPG Yeast extract-Peptone-Glucose
1. EINLEITUNG 1
1. Einleitung
1.1 Schädlingshefen in der Weinbereitung
Die Weinfermentation ist ein komplexer mikrobiologischer Prozess an dem verschiedene
Hefen und Bakterien beteiligt sind. Hefen sind in der Weinbereitung nicht nur für die
erwünschte alkoholische Gärung verantwortlich, sondern können im Gegensatz dazu auch
zu einer Schädigung, einem Qualitätsverlust und dem Verderb des Weins führen. Eine
Beeinträchtigung durch Hefen kann während des gesamten Prozesses der Weinbereitung,
von der Angärung des Mostes über die Lagerung und Reifung im Fass bis zur Abfüllung
und selbst danach in der Flasche auftreten. Die Schädigung beruht hauptsächlich auf der
Bildung von qualitätsmindernden Stoffen in Most und Wein, einer Hautbildung während der
Lagerung oder der Trübung des Flascheninhalts und Kohlenstoffdioxid-Bildung durch
Vermehrung von Hefen nach der Abfüllung. In einigen Fällen kann die Farbe des Weins
(insbesondere von Rotwein) negativ beeinflusst werden (Suaréz et al. 2007).
Von den vielen bekannten „wilden“ Hefen (Tab. 1), die ebenso wie die „echten“ Weinhefen
(Saccharomyces cerevisiae) überwiegend mit den Trauben, aber auch über andere
Infektionswege in die Weinbereitung eingebracht werden, spielen nach Ablauf der
alkoholischen Gärung nur wenige Arten eine bedeutende Rolle als weinschädigende
Mikroorganismen (Kunkee & Bisson 1993). Gemeinsames Merkmal einiger Vertreter dieser
Gruppe ist deren Alkoholtoleranz und eine erhöhte Resistenz gegenüber des in der
Weinbereitung regelmäßig als antioxidatives und antimikrobielles Mittel eingesetzten
Schwefeldioxids. Aus Sherry-Weinen mit bis zu 22 Vol. % Alkohol (Thomas 1993) und
einem Most mit 2 g/l freiem Schwefeldioxid (Dittrich & Großmann 2005), das entspricht
einem Vielfachen der maximal in Weinen zulässigen Höchstmenge (Ambrosi 2002, VO EG
Nr. 1493/1999), konnten regelrechte „Überlebenskünstler“ isoliert werden. Die langsam
gärende Schwefeldioxid-resistente Hefe Zygosaccharomyces bailii wurde in Traubenmost-
konzentraten gefunden. Dort bildete sie über einen längeren Zeitraum beträchtliche Mengen
an Kohlenstoffdioxid und führte zum Platzen von geschlossenen Behältern (Dittrich &
Großmann 2005). Darüber hinaus bildet diese osmotolerante Hefeart unvollständig geteilte
Sprossverbände aus und bewirkt so einen krümeligen Bodensatz in infizierten Weinen.
Auch Saccharomycodes ludwigii ist äußerst Schwefeldioxid-resistent und kann den
1. EINLEITUNG 2
abgefüllten Wein durch Eintrübung deutlich schädigen. Diese Hefe kann große Mengen von
Acetaldehyd produzieren (Kunkee & Bisson 1993). Zur Gruppe der Apiculatus-Hefen, die
sich morphologisch durch das Auftreten von zitronen- oder keulenförmigen Zellen
auszeichnen (Dittrich & Großmann 2005), gehören neben Saccharomycodes ludwigii auch
die am häufigsten auf Trauben und im Most anzutreffende Wildhefe-Gattung
Hanseniaspora. Insbesondere die Art Hanseniaspora uvarum (teleomorphe Form von
Kloeckera apiculata), die phylogenetisch dem Klyveromyces-Cluster zuzuorden ist (Abb. 1),
dominiert meist zu Beginn einer spontan anlaufenden Gärung (ohne Zugabe von S.
cerevisiae-Reinzuchthefen) die Hefeflora im Most. Die potentielle Schädigung in der
Weinbereitung liegt bei dieser Hefe in der Hemmung der Vermehrung von S. cerevisiae
(Sponholz et al. 1990), unter anderem durch die Bildung von flüchtiger Säure (Essigsäure)
zu Beginn der Gärung (Romano et al. 1992). H. uvarum bildet darüber hinaus
Essigsäureamyl- und Essigsäurethylester, sowie Schwefelwasserstoff (Dittrich & Großmann
2005). Im Gegensatz zur Weinhefe Saccharomyces cerevisiae und den Schädlingshefen
Zygosaccharomyces cerevisiae und Saccharomycodes ludwigii ist die Schwefeldioxid-
Toleranz von H. uvarum jedoch sehr gering. Die Verwendung von Reinzuchthefen (S.
cerevisiae) als Starterkulturen und der prophylaktische Einsatz von Schwefeldioxid als
önologische Maßnahmen in der modernen Weinbereitung reduzieren das Risiko eines
schädlichen Einflusses dieser Hefen auf die Qualität des Weines. An der Entstehung eines
Ester-bedingten Weinfehlers, der auch als „Lösungsmittel-“ oder „Uhu-Ton“ bezeichnet
wird, können weitere Hefen der Gattungen Candida, Metschnikowia und Pichia beteiligt
sein (Sponholz & Dittrich 1974). Diese „Kahm-Hefen“ bilden unter warmen und aeroben
Bedingungen auf Weinen mit niedrigem Alkoholgehalt (< 12 Vol. %) eine „Kahm“-Haut
(Dittrich & Großmann 2005). Diese kann die gesamte Oberfläche des Weines bedecken und
eine dichte Matte bilden. Eine Geschmacksveränderung tritt hierbei durch die Ester-
(hauptsächlich Ethylacetat und Amylacetat), Acetaldehyd- und Essigsäurebildung auf.
Kahmhefen können darüber hinaus unter den aeroben Bedingungen auf der Oberfläche
Ethanol veratmen und somit den Alkoholgehalt des Weines reduzieren.
Zur morphologisch determinierten Gruppe der Apiculatus-Hefen gehören auch die Spezies
der Gattungen Brettanomyces und Dekkera (Dittrich & Großmann 2005). Diese Hefen sind
Untersuchungsobjekt in der vorliegenden Arbeit und über sie wird im nachfolgenden
Kapitel ausführlicher berichtet. Insbesondere in Holzfass-gelagerten Rotweinen führen
bestimmte Sekundärmetabolite (flüchtige Phenole) dieser weltweit verbreiteten und
bekannten Schädlingshefen zur Bildung des berüchtigten „Brettanomyces-“ oder
1. EINLEITUNG 3
„Pferdeschweiß“-Tons (Suárez et al. 2007). Eine starke Acetat-Produktion und ihre
Fähigkeit zur Ausbildung eines Mäusel-Tons (Snowdon et al. 2006) sind für diese sehr
alkoholtoleranten Hefen darüber hinaus charakteristisch. Daher werden sie in der
Weinherstellung zu den am meisten gefürchteten und daher forschungsintensivsten
Weinschädlingen überhaupt gezählt. Sponholz (1992) stellte Z. bailii und
Dekkera/Brettanomyces spec. als gefährlichste Schädlingshefen im Wein dar, Loureiro und
Malfeito-Ferreira (2003) beschrieben Dekkera bruxellensis, Z. bailii und auch S. cerevisiae
als Schädlingshefen im engeren Sinne.
Eine „mikrobielle Schädigung“ kann gerade bei der Herstellung von fermentierten
Getränken oftmals nicht klar definiert werden. Der Übergang von einem positiven Einfluss
auf die Weinqualität im Hinblick auf Aroma, Geschmack und Struktur hin zu einer
deutlichen Qualitätsminderung kann fließend sein. Dabei spielen unterschiedliche Faktoren,
wie z. B. die Konzentrationsverhältnisse und das Zusammenwirken von mikrobiellen
Stoffwechselprodukten eine entscheidende Rolle. Nicht zuletzt bleibt die individuelle
Beurteilung des Produktes durch den Weintrinker von maßgebender Bedeutung. Dieser
Aspekt wird gerade am Beispiel von Einflüssen der Hefe-Gattungen
Brettanomyces/Dekkera deutlich, deren Sekundärmetabolite im Wein von Konsumenten
sehr unterschiedlich bewertet werden (Loureiro & Querol 1999, Loureiro & Malfeito-
Ferreira 2003). Ein weiteres Beispiel für die nicht immer eindeutige Bezeichnung
„Schädlingshefe“ ist Saccharomyces cerevisiae, die einerseits als „Weinhefe“ für die
alkoholische Vergärung des Traubenmostes gezielt eingesetzt wird, aber auf der anderen
Seite nach der Flaschenabfüllung durch Vermehrung und erneut einsetzende Gärung den
Wein durch Trübung, Kohlenstoffdioxid-Entwicklung und Reduzierung der Restsüße
nachträglich schädigen kann.
1. EINLEITUNG 4
Tab. 1. Mit Wein oder Weinbereitung assoziierte Hefen. Die Zahlen entsprechen der fortlaufenden
Nummerierung von Hefe-Spezies im Quellen-Text (Barnett et al. 1990)
31 Candida albicans 261 Dipodascus ingens 408 Pichia membranaefaciens
35 Candida apicola 268 Endomyces fibuliger 440 Pichia silvicola
46 Candida boidinii 276 Filobasidiella neoformans 445 Pichia subpelliculosa
54 Candida cantarellii 277 Filobasidium capsuligenum 466 Rhodotorula aurantiaca
58 Candida catenulata 284 Geotrichum fermentans 469 Rhodotorula bogoriensis
67 Candida diversa 290 Hanseniaspora occidentalis 477 Rhodotorula glutinis
85 Candida glabrata 291 Hanseniaspora osmophila 487 Rhodotorula minuta
94 Candida incommunis 292 Hanseniaspora uvarum 488 Rhodotorula mucilaginosa
95 Candida inconspicua 293 Hanseniaspora valbyensis 497 Saccharomyces cerevisiae
99 Candida intermedia 294 Hanseniaspora vineae 499 Saccharomyces exiguus
131 Candida norvegica 298 Hasegawaea japonica 500 Saccharomyces kluyveri
138 Candida parapsilosis 304 Hyphopichia burtonii 502 Saccharomyces unisporus
153 Candida rugosa 306 Issatchenkia orientalis 503 Saccharomycodes ludwigii
155 Candida sake 318 Kluyveromyces marxianus 511 Schizosaccharomyces pombe
167 Candida solani 321 Kluyveromyces thermotolerans 515 Sporidiobolus pararoseus
173 Candida stellata 328 Leucosporidium scottii 517 Sporidiobolus salmonicolor
177 Candida tenuis 332 Lipomyces starkeyi 531 Sporobolomyces roseus
181 Candida tropicalis 334 Lodderomyces elongisporus 546 Torulaspora delbrueckii
185 Candida vanderwaltii 340 Metschnikowia pulcherrima 547 Torulaspora globosa
187 Candida veronae 341 Metschnikowia reukaufii 562 Trichosporon beigelii
188 Candida versatilis 353 Nadsonia fulvescens 567 Trichosporon pullulans
190 Candida vini 355 Octosporomyces octosporus 572 Wickerhamiella domercqiae
194 Candida zeylanoides 357 Pachytichospora transvaalensis 574 Williopsis californica
196 Citeromyces matritensis 367 Pichia anomala 577 Williopsis saturnus
199 Cryptococcus albidus 375 Pichia canadensis 580 Yarrowia lipolytica
220 Cryptococcus humicolus 377 Pichia carsonii 581 Zygoascus hellenicus
223 Cryptococcus laurentii 385 Pichia etchellsii 582 Zygosaccharomyces bailii
225 Cryptococcus luteolus 389 Pichia farinosa 583 Zygosaccharomyces bisporus
242 Debaryomyces hansenii 390 Pichia fermentans 586 Zygosaccharomyces florentinus
246 Debaryomyces polymorphus 394 Pichia guilliermondii 587 Zygosaccharomyces microellipsoideus
251 Dekkera anomala 402 Pichia jadinii 589 Zygosaccharomyces rouxii
252 Dekkera bruxellensis
1.2 Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera
Hefen der Gattung Brettanomyces wurden erstmals 1903 von Claussen in der
Bierproduktion beschrieben und für die Herstellung englischer Biere patentrechtlich
geschützt (Claussen 1903). 1904 bezeichnete er auf einer Brauerei-Tagung in Kopenhagen
1. EINLEITUNG 5
(Dänemark) Hefen, die bei der Herstellung von britischen Bieren in einer zweiten
Fermentation zur charakteristischen Aroma-Bildung eingesetzt wurden, als
„Brettanomyces“-Hefen (Licker et al. 1998). Die Bezeichnung leitete er von der Verbindung
dieser Hefe („myces“ = Pilz) mit der britischen Brauerei-Industrie („brettano“) ab und
beschrieb Brettanomyces als „British brewing industry fungus“ (Licker et al. 1998). Die
erste systematische Untersuchung von Brettanomyces-Hefen wurde 1940 von M. T. J.
Custers durchgeführt (Custers 1940). Bis dahin wurden diese Hefen hauptsächlich mit Bier
und der Bierherstellung assoziiert. Aus Wein wurde Brettanomyces zum ersten Mal 1930
von den Geisenheimer Önologen Krumbholz und Tauschanoff isoliert, jedoch zunächst als
Mycotorula intermedia (= Dekkera bruxellensis) identifiziert. (Licker et al. 1998). Van der
Walt und van Kerken beobachteten die Bildung von Ascosporen in Hefen, die bis dahin der
nicht-sporulierenden (anamorphen) Gattung Brettanomyces zugeordnet wurden. Daraufhin
schlugen sie die Einordnung von sporenbildenden (teleomorphen) Spezies dieser Hefen in
die neue Gattung Dekkera vor (van der Walt 1964). Im Laufe der Zeit kam es seither immer
wieder zu Umklassifizierungen von Brettanomyces/Dekkera Hefen (vergl. Abb. 1) bedingt
durch deren Sporenbildung bzw. das Fehlen derselbigen. Die Schwierigkeiten bei der
Detektion und Induzierung von Sporen sind heute hinreichend bekannt (van der Walt 1984a,
Kunkee & Bisson 1993). Hinsichtlich der systematischen Nomenklatur herrschte darüber
hinaus Uneinigkeit. In der wissenschaftlichen Literatur tauchte lange Zeit eine ganze Reihe
unterschiedlicher Spezies-Bezeichnungen bzw. Synonyme für ein und dieselbe
Brettanomyces/Dekkera-Art auf. So listet eines der bekanntesten Bestimmungsbücher für
Hefen (Barnett et al. 2000) ganze 13 Synonyme für die am häufigsten isolierte Art Dekkera
bruxellensis auf. Die Untersuchung der ribosomalen RNA Gensequenzen von
Brettanomyces/Dekkera Hefen konsolidierte schließlich eine Klassifizierung in die vier
Arten Dekkera anomala, D. bruxellensis, Brettanomyces custersianus und B. naardenensis.
Sowohl die teilweise Sequenzierung der großen ribosomalen (26S) DNA (Boekhout et al.
1994), die teilweise Sequenzierung der kleinen (18S) und großen (26S) ribosomalen RNA
(Yamada et al. 1994), als auch die vollständige Sequenzierung der 18S rRNA Gene (Cai et
al. 1996) bestätigten die vier Arten als stabile, phylogenetisch distinkte Gruppen. Als fünfte
Art wurde jüngst Eniella nana, ehemals der Gattung Brettanomyces zugehörig, als
Brettanomyces nanus in die Gattung reklassifiziert (vorgeschlagen durch Boekhout et al.
1994). In der heutigen Zeit sind schließlich fünf Arten beschrieben und wissenschaftlich
anerkannt (Smith 1998a, b; Mitrakul et al. 1999, Wheeler et. al. 2000): Dekkera
bruxellensis, D. anomala, Brettanomyces custersianus, B. nanus und B. naardenensis.
1. EINLEITUNG 6
Abb. 1. Phylogenetische Stellung verschiedener Brettanomyces/Dekkera-Arten anhand von 18S rDNA-
Sequenzanalysen (Cai et al. 1996, abgeändert).
Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera gehören systematisch zum Stamm der
Schlauchpilze (Ascomycota) und sind mit den Kahmhefen (z. B. Pichia spec., Candida
spec.) nahe verwandt (Abb. 1). Sie zeigen ebenfalls deren biochemische Charakteristika,
wie zum Beispiel Ethanol-Verwertung. Morphologisch sind sie den typischen Apiculatus-
Hefen ähnlich (Dittrich & Großmann 2005). Charakteristisch für diese Hefen ist das
Vorkommen von spitzbogenartigen (ogivalen) Zellformen. Abhängig von der Art können
die Zellen im Vergleich zur Weinhefe S. cerevisiae sehr klein (B. nanus, Abb. 2) oder auch
1. EINLEITUNG 7
lang gestreckt sein (D. bruxellensis, Abb. 2). Der Durchmesser beträgt 1,5 bis 3,5 µm und
die Länge 3,0 bis 20,0 µm. Unter bestimmten Wachstumsbedingungen können sie sogar
sehr lang gestreckte Zellen mit bis zu 400 µm Länge ausbilden. Bei unvollständiger
Zelltrennung bilden diese Hefen auch septierte Hyphen aus und entwickeln ein
Pseudomycel (Barnett et al. 2000, van der Walt 1984a, b; diese Arbeit). Die morphologische
Entwicklung hängt nicht zuletzt von den jeweiligen Wachstumsbedingungen ab und kann
stark variieren.
Abb. 2. Mikroskopische Abbildung (Phasenkontrast) von Dekkera bruxellensis (a) mit Pseudomycel und
Brettanomyces nanus (b).
Die vegetative Vermehrung erfolgt bei Brettanomyces/Dekkera Hefen, wie bei allen
Vertretern der Ordnung Saccharomycetales durch Knospung. Eine sexuelle Vermehrung
durch Sporenbildung tritt nur bei der Gattung Dekkera auf (van der Walt 1984a). Die häufig
als hutförmig beschriebenen Ascosporen (eine bis vier pro Ascus) sind dabei nicht immer
leicht zu detektieren (s. o.). Ähnlich den bereits erwähnten Kahmhefen bilden manche
Stämme auf Most und Wein eine Haut (Dittrich & Großmann 2005).
Physiologisch unterscheiden sich Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera von der
„echten“ Weinhefe Saccharomyces cerevisiae laut Dittrich & Großmann (2005) in mehreren
Punkten. Sie sind langsame und schwächere Gärer. Nur wenige Stämme können mehr als
12 Vol. % Alkohol bilden. Neben Glucose und Fructose können bestimmte Arten auch
Saccharose vergären. Die alkoholische Fermentation wird bei Brettanomyces/Dekkera durch
anaerobe Bedingungen inhibiert (Kunkee & Bisson 1993). Dieser so genannte „Custers-
(a) 25 µm
(b) 12,5 µm
1. EINLEITUNG 8
Effekt“ wurde von Scheffers & Wilkén (1969) als taxonomisches Merkmal eingeführt.
Glucose wurde unter aeroben Bedingungen schneller zu Ethanol vergoren als unter
anaeroben Bedingungen. Die Alkoholtoleranz dieser Hefen ist beträchtlich. Sie vermehren
sich noch in Weinen mit bis zu 15 Vol. % Alkohol (Dittrich & Großmann 2005). Unter
aeroben Bedingungen können Brettanomyces/Dekkera-Hefen wie die Kahm-Hefen Ethanol
zu Kohlenstoffdioxid und Wasser oxidieren (Rodrigues et al. 2001).
Ihre Kulturen sind kurzlebig, was nicht zuletzt an ihrer starken Essigsäurebildung liegt.
Unter optimalen Bedingungen war ein Stamm von D. bruxellensis in der Lage, aus
Zuckerrohr-Melasse in 100 h über 13 g/l Acetat zu produzieren (Uscanga et al. 2007). Der
Anteil an lebenden Zellen lag in diesem Kulturversuch nur noch unter 40 %. Die Acetat-
Produktion unter den in der Weinherstellung herrschenden Bedingungen ist jedoch geringer.
Bei aerober Kultur konnten einige D. bruxellensis-Stämme in Most in zwölf Monaten bis zu
7 g/l Essigsäure bilden (Dittrich & Großmann 2005). Die Bedeutung dieser Hefen als
mikrobielle Schädlinge liegt aber in weiteren charakteristischen Eigenschaften.
Brettanomyces/Dekkera Hefen sind vor allem hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Produktion
von negativen Aromen in Most und Wein bekannt (Heresztyn 1986, Chatonnet et al. 1995).
Sie wurden darüber hinaus auch aus anderen fermentierten Getränken, wie Sekt, Apfelwein,
Sherry und aus Bier isoliert (Kumara et al. 1993, Ibeas et al. 1996, Ciani & Ferraro 1997,
Coton et al. 2006). Selten konnten diese Hefen auch in anderen Lebensmitteln wie
Limonaden, Rohmilch-Produkte, Joghurt und Feta-Käse gefunden werden (Thomas 1993,
Cosentino et al. 2001, Carrasco et al. 2006). In der Weinbereitung sind sie weit verbreitet
und wurden in nahezu allen Weinbauregionen der Welt identifiziert (Fugelsang 1997).
Hefen der Gattung Dekkera können die Qualität eines Weins durch ihre
Stoffwechselaktivitäten beeinflussen. Hydroxyzimtsäuren sind natürlicher Bestandteil des
Weins und gelangen aus den Beerenhäuten, –kernen und -stielen als Gerbstoffe (Tannine) in
den Most. Diese Verbindungen können durch Mikroorganismen im Wein zu flüchtigen
Phenolen umgewandelt werden (Suárez et al. 2007). An diesem Prozess (Abb. 3) sind zwei
Enzyme beteiligt. Die Hydroxyzimtsäure-Decarboxylase wandelt zunächst die Vorläufer-
verbindungen p-Cumarsäure und Ferulasäure in 4-Vinylphenol bzw. 4-Vinylguajakol um.
Diese werden dann durch die Vinylphenol-Reduktase zu 4-Ethylphenol bzw. 4-
Ethylguajakol reduziert. Der erste enzymatische Schritt kann von vielen Bakterien, Hefen
und Pilzen durchgeführt werden. Die Vinylphenol-Reduktase ist jedoch bei weinrelevanten
Mikroorganismen bisher nur in D. bruxellensis, D. anomala, Pichia guilliermondii sowie in
drei Candida-Arten gefunden worden (Chatonnet et al. 1995, Chatonnet et al. 1997, Dias et
1. EINLEITUNG 9
al. 2003). Weder S. cerevisiae noch Milchsäurebakterien bilden Ethylphenole unter
önologischen Bedingungen (Suaréz et al. 2007). D. bruxellensis hingegen wird wegen der
Fähigkeit zur Produktion großer Mengen dieser Verbindungen als unerwünschte
Schädlingshefe gesehen, obwohl der Einfluss auf das Wein-Aroma unterschiedlich bewertet
wird (Mitrakul et al. 1999, Loureiro & Malfeito-Ferreira 2003). In Rotweinen wird 4-
Ethylphenol ab einer Konzentration von 620 µg/l von einigen Konsumenten als deutliche
Qualitätsminderung betrachtet. Bei weniger als 400 µg/l kann diese Verbindung hingegen
zu einer Steigerung der Komplexität des Aromas beitragen, das von der überwiegenden
Mehrheit der Weintrinker geschätzt wird (Loureiro & Malfeito-Ferreira 2003).
Abb. 3. Entstehung von Ethylphenolen aus ihren Hydroxyzimtsäure Prekursor-Verbindungen (nach Suárez et
al. 2007, abgeändert).
Die sensorischen Eindrücke auf diese charakteristischen Sekundärmetabolite, im
wesentlichen 4-Ethylphenol und 4-Ethylguajakol, wurden als „phenolisch“, „Leder“,
„Pferdeschweiß“, „Stall“, „Heftpflaster“, „Nelken“ oder auch „verbranntes Plastik“
beschrieben (Heresztyn 1986, Chatonnet at al. 1992, Licker et al. 1998). 4-Ethylguajakol
vermittelt darüber hinaus auch „rauchige“ und „erdige“ Nuancen. Die Entdeckung eines
dritten Ethylphenols, dem aus Kaffeesäure gebildeten 4-Ethylcatechol, als Mitverursacher
des Brettanomyces-Fehltons (Hesford & Schneider 2004) wird bisher in den meisten
Ferulasäure
Hydroxyzimtsäure Decarboxylase
4-Ethylphenol 4-Vinylphenol p-Cumarsäure
4-Ethylguajakol 4-Vinylguajakol
Hydroxyzimtsäure Decarboxylase
Vinylphenol Reduktase
Vinylphenol Reduktase
OH
OCH3
OHO
OH
OCH3
CH2
OH
OCH3
CH3
OH
CH3
OH
CH2
OH
OHO
1. EINLEITUNG 10
THP
internationalen Publikationen nicht berücksichtigt. So wird diese Verbindung in einem
aktuellen, umfassenden Review über die Produktion von Ethylphenolen in Wein (Suárez et
al. 2007) nicht erwähnt. Neben diesem als „Brett“-Ton bekannt gewordenen Aromafehler
kann Dekkera anomala auch einen unangenehmen „Mäusel“-Ton durch die Bildung von
Aminosäure-Derivaten, den Tetrahydropyridinen (Abb. 4), verursachen (Grbin & Henschke
2000, Snowdon et al. 2006). Der Geruch der betroffenen Weine soll an Mäuseharn erinnern
(Ditttrich & Großmann 2005) und verstärkt sich im Mund durch den Kontakt mit Speichel
(Suárez et al. 2007). Dieser Fehlton sorgt in der Getränkeindustrie für erheblichen Schaden
(Snowdon et al. 2006). Brettanomyces und Dekkera produzieren darüber hinaus eine ganze
Reihe weiterer flüchtiger Verbindungen mit olfaktorischen Auswirkungen, z. B. ranzige
oder fruchtige Aromanoten (Licker et al. 1998), die Ethylphenol-Bildung bleibt aber der
önologisch bedeutenste Aspekt.
Abb. 4. Vorgeschlagener Stoffwechselweg für die Bildung der Mäuselton-Verbindungen 2-Acetyl-3,4,5,6-
Tetrahydropyridin (ATPH) und 2-Ethyl-3,4,5,6-Tetrahydropyridin (ETHP) über Tetrahydropyridin (THP)
durch Brettanomyces/Dekkera im Wein (nach Snowdon et al. 2006, abgeändert).
Für eine Untersuchung dieser Hefen ist die Kenntnis ihres Vorkommens und ihrer
Verbreitung in der Weinproduktion von wesentlicher Bedeutung. Die am häufigsten aus
Wein isolierte Art Dekkera bruxellensis ist Bestandteil der natürlichen Wildhefe-Flora,
obwohl ihr Vorkommen auf Trauben kontrovers diskutiert wird (Fugelsang 1993, Licker et
al. 1998). Wie bei anderen Wildhefen auch, erstreckt sich ihr Vorkommen auf nahezu alle
mit der Weinherstellung in Zusammenhang stehenden Behälter und Geräte.
Dementsprechend vielseitig sind auch ihre Infektionswege. Licker et al. (1998) beschreiben
kontaminierte Fässer, Schläuche, Maschinen, aber auch Reinigungs-Abwässer, Insekten wie
L-Lysin Ethanol
ETHP ATHP
Reduktion
NH2 NH2
COOH
N
N
O
CH3N
CH3
1. EINLEITUNG 11
Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) oder Bienen (Apis mellifera) und nicht zuletzt die
Luft als Infektionsquellen für die Verbreitung von Brettanomyces/Dekkera. Der Reifung
und Lagerung von Weinen in Holz- oder Barrique-Fässern als typische
Vinifikationsmaßnahme (hauptsächlich bei Rotwein) kommt in diesem Zusammenhang eine
besondere Bedeutung zu. Es erklärt darüber hinaus, warum diese Hefe hauptsächlich aus
Rotweinen und weit weniger aus Weißweinen isoliert wurde. Fugelsang (1997) benannte
hölzerne Gebinde als am häufigsten zitiertes Habitat von Brettanomyces. Hier überleben die
Hefen geschützt in den Ritzen und Spalten (Abb. 5) des Fassholzes und überdauern lange
Zeit bei mangelhaft durchgeführten Reinigungsmaßnahmen (Dittrich & Großmann 2005).
Eichenholz-Fässer sind eine wohlbekannte ökologische Nische für Brettanomyces/Dekkera
(Loureiro & Querol 1999). Obwohl Fässer aus Eichenholz gerade im Barrique-Ausbau
wesentlich zur typischen Aromatisierung von Rotweinen beitragen stellen, sie doch wegen
ihrer porösen, schlecht zu reinigenden und schwer zu sterilisierenden Oberfläche immer
eine potentielle Infektionsquelle für unerwünschte Mikroorganismen dar. Das
kontinuierliche Wiederbefüllen von Fässern und Umfüllen von Weinen führt somit zur
Neuinfektion und Verbreitung dieser Schädlingshefen in den Winzerbetrieben. Zur
Etablierung von Brettanomyces/Dekkera in neuen Barriques trägt bei, dass einige Arten
Glucosidase-Aktivität besitzen und Cellulose-Fragmente verwerten können, die z. B. durch
den Röstungsvorgang in Barrique-Fässern entstehen (Freer 1991, Fia et al. 2005).
Abb. 5. Mikroskopische Abbildung (Phasenkontrast) von D. bruxellensis Hefen (Pfeile) in einer Kavität von
Holz. Mit Rasierklinge angefertigter Dünnschnitt.
50 µm
1. EINLEITUNG 12
Im Produktionsprozess findet eine Kontamination von Weinen durch Wachstum und
Vermehrung von Brettanomyces Hefen hauptsächlich erst nach der alkoholischen und
malolaktischen Fermentation statt, wo sie aufgrund ihrer hohen Alkoholtoleranz, ihres
langsamen Wachstums und ihrer niedrigen Nährstoffansprüche einen Selektionsvorteil
gegenüber der übrigen Weinflora besitzen. Aber auch nach der Abfüllung in der Flasche
können sie dem Wein durch Trübung und Entwicklung von Fehltönen noch schaden (Suarez
et al. 2007). Daher wird Dekkera bruxellensis heute in der internationalen Weinproduktion
als Hauptursache für den Qualitätsverlust oder Verderb von hochwertigen Rotweinen, die in
Eichenholz-Fässern gereift sind, angesehen.
Der „Pferdeschweiß-Ton“ ist im Nachhinein sehr schwierig und nur unter Qualitätseinbußen
aus dem Wein zu entfernen (Eder et al. 2000; Steidel & Renner 2001). Als mögliche
sanierende Maßnahme zur Entfernung oder Reduzierung von 4-Ethylphenol und 4-
Ethylguajakol aus belastetem Wein wurde ein zweistufiger Prozess aus Umkehr-Osmose
und Adsorption an Granulat beschrieben (Ugarte et al. 2005). Diese Methode entfernt
jedoch auch andere, erwünschte Aroma-Verbindungen und kann die Wein-Qualität
nachträglich beeinträchtigen. 4-Ethylphenol und 4-Ethylguajakol können auch durch den
nach der Gärung anfallenden Bodensatz der Weinhefe S. cerevisiae im Wein reduziert
werden (Chassagne et al. 2005). In diesem auch als „Biosorption“ bezeichneten Prozess
erfolgt eine physikalische Aufnahme verschiedener Moleküle durch lebende oder tote
Biomasse. Die Untersuchungen von Chassagne et al. (2005) führten zu dem Ergebnis, dass
die von Brettanomyces/Dekkera gebildeten Phenole eine höhere Affinität zu inaktiven
S. cerevisiae-Zellen aus dem Bodensatz besitzen als zu rehydratisierten Trockenhefe-
Produkten. Diese Beobachtungen könnten zu der Entwicklung einer geeigneten und
kostengünstigen Sanierungs-Methode für Brett-geschädigte Weine führen.
1.3 Methoden zur Detektion und Identifizierung
Aufgrund der hohen potentiellen Schadwirkung von Brettanomyces/Dekkera-Hefen,
insbesondere in der Weinbereitung, ist die Entwicklung von schnellen, verlässlichen und
kostengünstigen Detektions-Methoden für die Winzerbetriebe von großer Bedeutung.
Eine Isolierung und Differenzierung von weinrelevanten Hefen kann über die Kultivierung
auf Selektiv- und/oder Differenzierungsmedien erfolgen und ist auch in der heutigen Praxis
1. EINLEITUNG 13
unumgänglich. Das Augenmerk liegt hierbei auf der Differenzierung der Schädlingshefen
von der „echten“ Weinhefe Saccharomyces cerevisiae oder von anderen „harmlosen“ Hefen
und Pilzen. Die physiologischen Eigenschaften und Fähigkeiten der Schädlingshefen
werden gezielt bei der Zusammensetzung des Mediums berücksichtigt. So hat sich in Bezug
auf Wein die Zugabe von Ethanol (11 Vol. %) als selektives Agens in Medien zur Detektion
von Schädlingshefen als erfolgreich herausgestellt (Loureiro & Malfeito-Ferreira 2003).
Eine andere, häufig zur Differenzierung von eukaryotischen Mikroorganismen eingesetzte
Verbindung ist Cycloheximid (Actidion). Cycloheximid inhibiert die Proteinbiosynthese in
vielen eukaryotischen Organismen. Dieses Antibiotikum wird von dem Bakterium
Streptomyces griseus produziert, hemmt die Peptidyl-Transferase-Aktivität der großen
ribosomalen Untereinheit und verhindert so die translationale Elongation (Obrig et al.
1971). Da Brettanomyces/Dekkera Hefen im Gegensatz zu den meisten anderen Hefen und
Pilzen noch bei 0,001 % - 0,1 % Cycloheximid im Medium wachsen können (Barnett et al.
2000) wird dieses Antibiotikum häufig zur Reduzierung der unerwünschten eukaryotischen
Begleitflora verwendet. Ein wirkungsvolles Dekkera/Brettanomyces-Differenzierungs-
medium (DBDM) wurde von Rodrigues et al. (2001) entwickelt und in ähnlicher
Zusammensetzung auch in dieser Arbeit verwendet. Es basiert auf der Fähigkeit dieser
Hefen zur Produktion von 4-Ethylphenol aus p-Cumarsäure, welches am charakteristischen
Geruch leicht erkannt werden kann. In diesem Medium ist Ethanol die einzige
Kohlenstoffquelle und die Brettanomyces-typische Essigsäure-Produktion kann durch einen
Säure-Base-Indikator leicht detektiert werden (Rodrigues et al. 2001). Der Nachteil von
Selektivmedien allgemein und von DBDM speziell liegt darin, dass längere
Inkubationszeiten (bis zu zwei Wochen) als bei Wachstum auf normalen Nährmedien
benötigt werden. Ursache hierfür ist der Stress, der durch die selektiven Bedingungen auf
die Zellen ausgeübt wird. Neben dem erhöhten Zeitaufwand gibt es zahlreiche andere
Probleme bei der Verwendung von Wachstumsexperimenten zur Detektion und
Identifizierung von Schädlingshefen (Loureiro & Querol 1999, Loureiro & Malfeito-
Ferreira 2003), wie die Notwendigkeit einer großen Anzahl von Tests zur Identifizierung
von Hefen auf Art-Niveau, Art- und Stamm-abhängige Variabilitäten und Vitalitäts-
abhängige Ergebnisse, die zu falschen oder zweifelhaften Identifizierungen führen können.
Der Einsatz moderner, hauptsächlich molekularbiologischer Techniken hat sich als
vorteilhaft gegenüber einer Klassifizierung von Mikroorganismen auf Basis
morphologischer, biochemischer und physiologischer Eigenschaften herausgestellt. Als
Folge der intensiven Untersuchung von Schädlingshefen wurden in den letzten zehn Jahren
1. EINLEITUNG 14
viele verschiedenen Methoden zur Detektion und Identifizierung auf Art- und/oder Stamm-
Ebene beschrieben. Viele dieser Methoden sind jedoch für den Routineeinsatz, insbesondere
in der Getränkeindustrie, nicht geeignet (Loureiro & Querol 1999), aber dennoch von
wissenschaftlicher Bedeutung.
Das Vorkommen bestimmter langkettiger Fettsäuren (hauptsächlich Linolsäure und
Linolensäure) wurde bereits erfolgreich als Biomarker zur Gruppierung von
Schädlingshefen herangezogen (Malfeito-Ferreira et al. 1997). Ein signifikantes Problem
dieser Methode ist das Fehlen einer entsprechenden Datenbank mit hinterlegten Fettsäure-
Profilen für relevante Schädlingshefen. Auf Protein-Ebene reflektieren die Unterschiede in
den Aminosäure-Sequenzen von verschiedenen Organismen ihre genetische Divergenz. Der
Austausch von Aminosäuren kann durch das unterschiedliche Laufverhalten der Enzyme in
einer Gelelektrophorese detektiert werden. Die Untersuchung elektrophoretischer Isoenzym-
Profile („Zymogramme“) ist ein nützliches taxonomisches Werkzeug und wurde sowohl zur
Typisierung von klinischen Isolaten pathogener Hefen (Loureiro & Querol 1999) als auch
zur systematischen Differenzierung von Saccharomyces-Arten eingesetzt (Duarte et al.
1999). Viele molekularbiologische Techniken bedienen sich der ribosomalen RNA Gene,
die in mehreren hundert sich wiederholende Transkriptionseinheiten im Genom
eukaryotischer Organismen auf mehreren Chromosomen vorliegen. Diese Gen-Cluster
kodieren für die 18S, 5.8S und die 26S rRNAs und zwei „Internal Transcribed Spacer“
(ITS1 und ITS2). Diese Regionen sind ubiquitär verbreitet, enthalten konservierte und
variable Sequenzbereiche und sind mit insgesamt ca. 6 kb Länge hinreichend groß
für z. B. Restriktionsanalysen (RFLP, Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus).
Insbesondere das 5.8S rRNA Gen mit den beiden flankierenden, zum Teil hochvariablen
ITS-Regionen, aber auch die 18S rRNA wurden für eine PCR-Amplifizierung mit
anschließender Restriktionsanalyse zur Identifizierung von verschiedenen Hefe-Spezies
(Loureiro & Querol 1999) inklusive Brettanomycves/Dekkera (Egli & Henick-Kling 2001,
Renouf et al. 2006) verwendet. Die AFLP-Methode (Amplifizierungs-Fragment-Längen-
Polymorphismus) basiert auf der selektiven PCR von Restriktionsfragmenten, die bei einem
vollständigen Restriktionsverdau genomischer DNA entsteht (Curtin et al. 2007). Die
Verbindung der Polymerase-Ketten-Reaktion mit der denaturierenden Gradienten
Gelelektrophorese (PCR-DGGE) ermöglichte die Untersuchung von komplexen
mikrobiellen Lebensgemeinschaften ohne einer vorherigen Spezies-Isolierung. Bei dieser
Methode kann von der Anzahl der amplifizierten DNA-Fragmente des Bandenmusters
direkt auf die Artenvielfalt geschlossen werden. Eine Identifizierung erfolgt dann durch
1. EINLEITUNG 15
Sequenzierung des PCR-Produkts aus der jeweiligen Bande und einem Sequenz-Vergleich
mit in Datenbanken hinterlegten DNA-Sequenzen. Renouf et al. (2006) untersuchten mit
Hilfe dieser Technik unter ökologischen Gesichtpunkten die Hefe-Flora, inklusive
Brettanomyces, im Verlauf der Weingärung. Weitere Untersuchungen auf Basis der PCR
sind darüber hinaus die Randomly-Amplified-Polymorphic-DNA (RAPD)-PCR, die auf der
Amplifizierung von zufälligen DNA-Segmenten mit Hilfe eines kurzen, unspezifischen
Primers beruht und die Amplifizierung von einfachen, repetitiven DNA-Sequenzen, den so
genannten Mikrosatelliten (Loureiro & Querol 1999). Beide Fingerprint-Methoden
generieren ein Art- und/oder Stamm-spezifisches Bandenmuster, jedoch bleibt die
Reproduzierbarkeit ein Hauptproblem der RAPD-PCR. Die in unserem Institut entwickelte
nSAPD-PCR („nested Specifically Amplified Polymorphic DNA“) verbesserte sowohl die
Differenzierungsmöglichkeiten als auch die Reproduzierbarkeit dieser Technik (Fröhlich &
Pfannebecker 2006) und wurde bereits erfolgreich für eine Stammunterscheidung von
Dekkera bruxellensis-Isolaten aus Weinproben (diese Arbeit) eingesetzt (Pfannebecker
2005). Die Amplifizierung mit externen und internen Primern („nested“-PCR) ist eine viel
versprechende Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen. Mittels dieser konnten
Brettanomyces-Arten aus Sherry (Ibeas et al. 1996) und ohne vorherige Isolierung und
Kultivierung direkt aus Wein detektiert werden (Navascués & Rasines 2003). Der große
Vorteil einer Real-Time oder quantitativen PCR (qPCR) liegt in der Möglichkeit der
gleichzeitigen Quantifizierung einer mikrobiellen Population. Phister et al. (2003)
entwickelten eine Real-Time PCR-Methode zur Detektion von D. bruxellensis in Wein mit
einer Auflösungsgrenze von bis zu 1 Zelle/ml.
Eine andere Anwendung von Oligonukleotiden als zur Amplifizierung von DNA-Sequenzen
ist ihre Verwendung als molekulare Sonden in der Fluoreszenz in situ Hybridisierung
(FISH). Hierbei sind die Oligonukleotide mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt und
dienen als spezifische Sonden für eine mikroskopische Detektion ganzer Zellen in
Untersuchungsproben. Diese Methode ist wesentlicher Bestandteil der vorliegenden Arbeit
und wird in dem nachfolgenden Kapitel näher beschrieben.
Die Pulsfeld Gelelektrophorese (PFGE) ermöglichte die Auftrennung von Hefe-
Chromosomen (Deak 1995) und machte die auf Deletionen, Insertionen und
Translokationen beruhenden chromosomalen Polymorphismen zum ersten Mal sichtbar. Da
diese Technik komplex und zeitaufwendig ist und die Untersuchung einer größeren Anzahl
von Proben nicht zulässt, wurden in der Literatur bisher kaum Anwendungen in Bezug auf
Schädlingshefen beschrieben. Die Analyse des Genoms aus Mitochondrien (mtDNA) stellt
1. EINLEITUNG 16
ein weiteres nützliches Werkzeug für taxonomische Studien dar. Hefen unterscheiden sich
hinsichtlich der Größe und der Sequenz ihrer mtDNA signifikant. Die mitochondrialen
Genome der Brettanomyces/Dekkera-Arten variieren in ihren Größen von 28 bis 101 kb
(Hoeben et al. 1993). Esteve-Zarzoso et al. (1998) entwickelten eine mtDNA-
Restriktionsanalyse zur Charakterisierung von Wildhefe-Stämmen, unter anderem auch von
Brettanomyces-Arten. Bei der Durchführung der Methode ist eine Isolierung von
Mitochondrien oder eine spezielle Aufreinigung der DNA nicht mehr notwendig.
Kurtzman (2006) diskutiert in einem Review weitere DNA-basierende Methoden zur
Identifizierung von Hefen. Die Gensequenz-Analyse der Domänen 1 und 2 (D1/D2) in der
DNA, die für die rRNA der großen ribosomalen Untereinheit kodiert (LSU rDNA), hebt er
als besonders geeignet hervor (Kurtzman & Robnett 1998). Die Untersuchung dieser
variablen Regionen hat sich bis heute etabliert und im Allgemeinen beschränken sich die
Zielsequenzen für Primer- und Sonden-gestützte Methoden auch auf die D1/D2-Domänen
am 5’ Ende der LSU rDNA bzw. rRNA.
Schließlich kann eine Detektion signifikanter Mengen von Ethylphenolen im Wein ebenfalls
als Indiz für eine Aktivität von Brettanomyces/Dekkera verwendet werden, da weder andere
Hefen noch Milchsäurebakterien diese Verbindungen unter önologischen Bedingungen
produzieren (Suárez et al. 2007). Eine Kombination von Gas-Chromatographie und Massen-
Spektrometrie (GC/MS) kann 4-Ethylphenol und 4-Ethylguajakol mit hoher Sensitivität
identifizieren und quantifizieren. Die Kopplung dieser Technik mit der sensorischen
Analyse durch einen erfahrenen Prüfer (GC/MC/Olfaktometrie) ist eine sehr leistungsfähige
Methode in der Qualitätskontrolle von Wein (Suárez et al. 2007). Allerdings hat diese
Methode den Nachteil, dass es bei einem positiven Testergebnis für vorbeugende
önologische Maßnahmen bereits zu spät ist.
Eine schnelle Identifizierung von unerwünschten Mikroorganismen ist in der
Lebensmittelindustrie von besonderer Bedeutung. PCR-basierende Methoden können daher
effizient in der Qualitätskontrolle zur Detektion und Identifizierung von Hefen eingesetzt
werden. Trotz dieses Vorteils ergeben sich Schwierigkeiten in der Beurteilung der
eigentlichen Kontamination durch fehlende Zellzahlbestimmungen bzw. das Fehlen einer
Differenzierung von lebenden und toten Zellen. Die Isolierung von Schädlingshefen durch
Selektiv- und/oder Differenzierungsmedien bleibt daher wichtiger Bestandteil einer
umfassenden Betrachtung von Hefe-Infektion in der Nahrungs- und Getränkeindustrie.
1. EINLEITUNG 17
1.4 Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von intakten Zellen ist besonders für die
direkte Detektion und Identifizierung von Mikroorganismen in ihrer natürlichen Umgebung
geeignet. Als primäre Methode geht sie nicht den Umweg über eine DNA-Isolierung, die
durch Störstoffe aus der Untersuchungsprobe, Zell-Protein, Fremd-DNA oder RNA belastet
sein kann, sondern die Zielregionen verbleiben in der Zelle und werden dort detektiert. Im
Gegensatz zu Nukleinsäureanalysen durch eine Southern- oder Northern-Blot-
Hybridisierung wird bei dieser Technik das Hybridisierungs-Signal nicht auf einer festen
Trägermembran, sondern direkt im biologischen Präparat (in situ) sichtbar. Hinsichtlich des
Signal-gebenden Systems gibt es neben dem direkten Nachweis (diese Arbeit) die
Möglichkeiten der Autoradiographie und der Immuncytochemie (Leitch et al. 1994).
Folglich richten sich die Methoden zum Nachweis und zur Visualisierung der Signale nach
der Art der Markierung der Sonde. Radioaktiv markierte Sonden werden durch
Autoradiographie nachgewiesen. Durch die Emissionsenergie der verwendeten Isotope
werden Silberhalogenide in einer auf das Präparat aufgetragenen Emulsion zu metallischem
Silber reduziert. Die Silberkörner markieren dann im Lichtmikroskop die
Hybridisierungsstellen der Sonden. Bei der Immuncytochemie werden Nukleinsäuresonden,
an die ein Markermolekül (z. B. Digoxigenin) gekoppelt ist, durch Antikörper
nachgewiesen, die das eigentliche Signal tragen. In einem einstufigen Verfahren ist ein
primärer Antikörper gegen die Markierung einer Sonde gerichtet. In der zweistufigen Form
des Nachweisverfahrens bindet ein sekundärer Antikörper mit Signal an den primären
Antikörper. Besitzt dieser mehrere Bindungstellen (multiklonaler Antikörper) wird das
Signal durch die Anbindung mehrerer sekundärer Antikörper verstärkt (Leitch et al. 1994).
Nichtradioaktive Signale können durch Enzyme (Farbreaktionen/Präzipitate durch
Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase), Metalle (kollodidales Gold), oder
Fluoreszenzfarbstoffe, die an die Sonde bzw. den Antikörper gebunden sind, generiert
werden. Die direkte Fluoreszenzmarkierung bietet gegenüber den anderen Signal-gebenden
Systemen die Vorteile einer sehr guten Auflösung (keine Signalstreuung), eines geringen
Zeitaufwands bis zur Darstellung des Ergebnisses, der Möglichkeit einer
Mehrfachmarkierung, einer einfach durchzuführenden Gegenfärbung und einer relativ
ungefährlichen Durchführung (keine radioaktive Strahlung). Die wichtigsten Arbeitsschritte
der Fluoreszenz in situ Hybridisierung sind in Abbildung 6 dargestellt. Das biologische
1. EINLEITUNG 18
Material wird zuerst präpariert und eine geeignete Nukleinsäuresequenz als Sonde mit
einem Marker gekoppelt. Sowohl diese Sonde als auch das biologische Material werden
anschließend denaturiert, damit alle Nukleinsäuren einzelsträngig vorliegen. Unter
kontrollierten experimentellen Bedingungen hybridisiert dann die einzelsträngige Sonde mit
einer komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz des biologischen Präparats
(Zielsequenz). Das neu gebildete doppelsträngige Molekül lässt sich aufgrund seiner
Markierung nachweisen, indem die Region, an der die Hybridisierung stattgefunden hat,
durch ein mikroskopisches Verfahren sichtbar gemacht wird.
Abb. 6. Schematischer Überblick über den Ablauf der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH).
Herstellung des biologischen Präparats
Generierung der Sonde mit Markierung
Denaturierung von Sonde und Präparat
Hybridisierung
Waschen
Kontrastierung durch Gegenfärbung
Stabilisierung des Signals
Mikroskopische Darstellung
1. EINLEITUNG 19
Im Unterschied zur Durchlichtmikroskopie wird ein Präparat in der Auflichtmikroskopie
von oben beleuchtet. Das hat den Vorteil, dass Objekte auch auf undurchsichtigen
Trägermaterialien, wie z.B. Filter, sichtbar gemacht werden können. Außerdem erzeugt
dieses Verfahren kontrastreichere Bilder als die Durchlichtmikroskopie, da Signal, Präparat
und Hintergrundlicht unterschiedlich reflektieren. Mit dieser Technik können auch
schwache Hybridisierungs-Signale sichtbar gemacht werden.
Das Prinzip der Fluoreszenzmikroskopie beruht darauf, dass in delokalisierten
Elektronensystemen von Fluoreszenzfarbstoffen Elektronen durch Photonen des
Anregungslichts mit bestimmtem Energiegehalt auf höhere Energieniveaus gehoben werden
können. Dieser Zustand ist instabil und kurzzeitig. Beim Zurückfallen in den Grundzustand
wird Energie in Form von Licht freigesetzt. Dieses Fluoreszenzlicht ist immer energieärmer,
also langwelliger als das Anregungslicht (Stokes’sche Verschiebung).
Wesentliches Bauelement eines Epifluoreszenzmikroskops ist ein so genannter Filterblock,
der aus drei Einheiten besteht. Ein Filterblock besteht aus einem Anregungsfilter, einem
dichromatischen Teilerspiegel und einem Sperrfilter (Abb. 7 a). Durch den Anregungsfilter
wird im Mikroskop die geeignete Wellenlänge für den verwendeten Fluoreszenzfarbstoff,
wie z. B. Cy3 (Abb. 7 b) eingestellt. Das Licht wird auf das Objektiv auf das Präparat
fokussiert. Das emittierte Fluoreszenzlicht trifft auf den dichromatischen Teilerspiegel, der
kurzwelliges Licht wieder zurück auf das Präparat reflektiert (Abb. 7 c). Längerwelliges
Fluoreszenzlicht passiert den Teilerspiegel und trifft auf den Sperrfilter, der nur Licht
oberhalb einer bestimmten Wellenlänge durchlässt. Für jeden Fluoreszenzfarbstoff gibt es
einen jeweils geeigneten Filterblock. Es gibt auch Kombinationsfilter, die zwei bis drei
verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig darstellen können. Ein Filterwechsel ist in
diesem Fall nicht mehr notwendig und die räumliche Ausrichtung des Präparats wird durch
ein Umschalten des Filters nicht mehr beeinträchtigt.
Fluoreszenzfarbstoffe verblassen durch das Anregungslicht trotz der Anwendung von
Antibleichmittel, wie z. B. DABCO (Leitch et al. 1994), schon nach kurzer Zeit. Daher
muss das Ergebnis während der Epifluoreszenzmikroskopie relativ schnell photographisch
dokumentiert werden.
1. EINLEITUNG 20
Abb. 7. (a) Schematische Darstellung des Strahlengangs eines Epifluoreszenzmikroskops (nach Leitch et al.
1994, abgeändert). (b) Fluoreszenz-Spektrum des Sonden-Farbstoffs Cy3 (http://probes.invitrogen.com/
servlets/spectra?fileid=cy2igg). (c) Wirkungsweise des dichroischen Teilerspiegels im Zusammenhang mit den
Spektraldaten von Cy3 (http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/filtercubes/green/cy3/
cy3index.html). Die Transmission (Y-Achse) bezieht sich auf den Teilerspiegel („Dichroic Mirror“, gelbe
Linie). Er lässt die Emissionsstrahlung hauptsächlich im gelb-orangen Spektralbereich passieren, während die
Anregungsstrahlung im grünen Bereich reflektiert wird (Transmission gegen 0).
Die Detektion und/oder Identifizierung von weinrelevanten Mikroorganismen mit
fluoreszenzmarkierten Sonden, die an spezifische Regionen der rRNA binden, wurde bereits
in früheren Untersuchungen erfolgreich angewandt (Fröhlich et al. 2003, Hirschhäuser et al.
2005), einschließlich bei Brettanomyces/Dekkera und anderen Hefen (Stender et al. 2001,
Xufre et al. 2006).
Die Effizienz der Hybridisierung zeigt sich in der Intensität des Fluoreszenz-Signals der
Sonden und hängt nicht unwesentlich von der Permeabilität der Zellwand und dem
Ribosomen-Gehalt der Zellen ab (Amann et al. 1995). Darüber hinaus ist die Zugänglichkeit
der Zielregionen für die Sonden signifikant. Viele wissenschaftliche Studien setzen sich mit
den Problemen des Sonden-Designs auseinander und diskutieren verschiedene
(b)
(c) (a)
Präparat
Objektivlinse
dichromatischer Teilerspiegel
kurzwelliges Anregungslicht
langwelliges Emissionslicht
Langwellen-Sperrfilter
Okular
Anregungsfilter
Epifluoreszenz- beleuchtung
1. EINLEITUNG 21
Möglichkeiten die Signalstärke zu verbessern. Es herrscht Übereinstimmung, dass schwache
Sonden-vermittelte Fluoreszenz-Signale unter anderem auf Sekundär- und Tertiätstrukturen
der rRNA, also rRNA-rRNA Interaktionen, und/oder auf Protein-rRNA Verbindungen in
den Ribosomen zurückzuführen sind (Amann et al. 1995, Fuchs et al. 2000, Inacio et al.
2003). Die Publikation von Behrens et al. (2003a) deutet darauf hin, dass die Protein-rRNA
Interaktionen bei Escherichia coli keinen signifikanten Einfluß auf die Zugänglichkeit der
Zielsequenzen in der kleinen ribosomalen Untereinheit (SSU) haben. Durch systematische
Untersuchung der Signalstärken aus Hybridisierungs-Experimenten konnten Karten
entwickelt werden, die die in situ Zugänglichkeit der 16S rRNA (Behrens et al. 2003b) und
23S rRNA (Fuchs et al. 2001) von E. coli, sowie der D1/D2-Regionen der LSU rRNA von
S. cerevisiae (Inacio et al. 2003) darstellen. Wenig später schlussfolgerten Yilmaz et al.
(2004) jedoch, daß die Fluoreszenz-Ausbeute in FISH-Anwendungen nicht allein anhand
der Zugänglichkeit von rRNA-Bereichen vorhersagbar ist, sondern im Wesentlichen von
dem untersuchten Organismus und der genauen Position der Zielsequenz abhängt. Die
Autoren berechneten in dieser Studie die Affinität der Sonde mit ihrer Zielregion auf Basis
thermodynamischer Daten von nichtkovalenten Wechselwirkungen in Nukleinsäuren. Laut
ihrer letzten Veröffentlichung (Yilmaz et al. 2006) gibt es keine wirklich unzugänglichen
Zielbereiche in der 16S rRNA von E. coli. Für die Entwicklung von effizienten Fluoreszenz-
Sonden empfahlen Yilmaz et al. die Berücksichtigung der thermodynamischen Affinität, der
Hybridisierungs-Kinetik und der Quenching-Effekte durch Wechselwirkung des Sonden-
Farbstoffs mit den Basen der Zielregion. Indes können die rRNA-Karten für E. coli und S.
cerevisiae zur Darstellung von zugänglichen Regionen nicht ohne weiteres auf andere
Mikroorganismen extrapoliert werden (Fröhlich et al. 2003), da sich ihr Geltungsbereich
wahrscheinlich nur auf phylogenetisch nahe verwandte Arten erstreckt.
1. EINLEITUNG 22
1.5 Untersuchungsobjekt Rheinhessenwein
Rheinhessen ist mit 26.281 Hektar (Stand 2006) Rebfläche die größte Weinbauregion in
Deutschland (Deutsches Weininstitut GmbH; Mainz). Das Anbaugebiet umfasst über ein
Viertel der deutschen Gesamtrebfläche. Somit kommt, rein statistisch, jeder vierte deutsche
Wein aus Rheinhessen. 20 % der Region Rheinhessen in Rheinland-Pfalz, die auch die
waldärmste Deutschlands ist, ist mit Rebstöcken bepflanzt. Die Weinbauregion Rheinhessen
erstreckt sich linksrheinisch zwischen Mainz, Worms, Alzey und Bingen (Abb. 19). Die drei
Bereiche Wonnegau, Bingen und Nierstein zerfallen in 24 Großlagen, die sich wiederum in
434 Einzellagen aufgliedern (Koch 1995; http://www.biologie.de/ biowiki/Rheinhessen). Im
Nordwesten der Region liegt der Bereich Bingen zwischen Alzey Ingelheim und Bingen.
Östlich davon befindet sich der größte und bedeutendste Bereich Nierstein, der im Norden
bis an die Landeshauptstadt Mainz heranreicht. Der Wonnegau erstreckt sich als südlichster
und kleinster Bereich zwischen Worms und Alzey. Über 3500 Winzer produzieren pro Jahr
mehr als 2,5 Mio. Hektoliter Wein (Statistisches Bundesamt, Wiesbaden). Von den 136
Gemeinden Rheinhessens betreiben nur 3 keinen Weinbau. Rheinhessen ist zudem eines der
traditionsreichsten Anbaugebiete, in dem bereits seit 20 v. Chr. Wein angebaut wird
(http://www.biologie.de/biowiki/Rheinhessen). In Nierstein befindet sich die älteste,
urkundlich belegte Weinlage Deutschlands. Bis Anfang der 80er-Jahre wurde in
Rheinhessen vornehmlich Quantität erzeugt, was sich in keinem allzu guten Ruf resultierte.
Bekannt ist in diesem Zusammenhang die „Liebfrauenmilch“ aus der gleichnamigen
Großlage. Seitdem hat jedoch ein Umdenken eingesetzt, und einer neuen Winzergeneration
ist es zu verdanken, dass in Rheinhessen qualitativ hochwertige Weine erzeugt werden, die
zu den besten in Deutschland gezählt werden (Ambrosi 2001). Auf die 13 Weinbauregionen
in Deutschland bezogen kommt der größte Anteil an Prädikatsweinen (28,6 %, Stand 2005)
aus Rheinhessen (Statistisches Bundesamt, Wiesbaden). In einer weiteren Beziehung sind
die rheinhessischen Winzer in Deutschland Vorreiter. Hier gibt es den größten Anteil an
Öko-Winzern, die nach den Richtlinien des ökologischen Weinbaus arbeiten (Ambrosi
2001).
In Rheinhessen entstehen durch die lokal unterschiedlichen Bedingungen sehr
unterschiedliche Weine. Nirgendwo sonst in Deutschland werden heute so viele
verschiedene Rebsorten angepflanzt. Bereits 32,4 % der Rebfläche in Rheinhessen sind
Rotweine (Stand 2006). 2002 waren es nur 25,1 % (Deutsches Weininstitut GmbH, Mainz).
1. EINLEITUNG 23
Als Folge des Klimawandels und der Konsumenten-Nachfrage wird der Rotwein-Anbau in
Zukunft voraussichtlich weiterhin ansteigen. Das Sortenspektrum wird von Weißweinen
dominiert. Allen voran Müller-Thurgau (16,0 % der gesamten Rebfläche) und Riesling
(12,2 %). Weiterhin Silvaner (9,5 %), Kerner (5,1 %) Grauer Burgunder (4,3 %), und
Scheurebe (3,9 %). Bei den Rotweinen besitzt der Dornfelder den größten Anteil an der
Gesamtfläche (13,3 %). Danach folgen Portugieser (6,8 %), Spätburgunder (5,1 %) und
Regent (3,1 %). (Deutsches Weininstitut GmbH, Mainz, http://www.deutscheweine.de;
Statistisches Bundesamt, Wiesbaden, http://www.destatis.de).
In Zusammenhang mit der zunehmenden Rotweinproduktion steht der Ausbau von Weinen
in Holz- oder Barrique-Fässern, die ein bevorzugtes Habitat für die hier untersuchten
Brettanomyces/Dekkera-Hefen darstellen (Kapitel 1.2). Die Bezeichnung Barrique leitet
sich von dem im Bordeaux verwendeten Fass-Typ mit dem Volumen von ungefähr 225
Litern aus speziellem Eichenholz von Bäumen bestimmter Gegenden, z. B. aus dem
französischen Limousin oder dem Allier (Steidl & Renner 2001), aber auch anderer
Holzarten wie zum Beispiel Akazien oder Kastanien ab (Koch 1995; http://www.wein-
plus.de). Durch den Barrique-Ausbau (Reifung) erfolgt ein Aromatisieren des Weines, weil
zusätzliche Stoffe, insbesondere Gerbstoffe und Vanillin in den Wein gelangen. Außerdem
wird der Wein durch den minimalen Luftaustausch (Mikroaerobisierung) beeinflusst. Der
Wein erhält dadurch eine oxidative Reife. In Frankreich hat dieses Verfahren seit über 300
Jahren Tradition. Bereits durch einmaliges Verwenden eines Fasses verliert dieses bis zu
85 % seiner Aromen (http://www.wein-plus.de). Ein Barrique-Fass kann deshalb nur zwei-
bis dreimal belegt werden und muß dann durch ein neues ersetzt werden. Eine Alternative
ist die Rekonditionierung gebrauchter Barriques (http://www.thonhauser.net, http://www.
ktbl.de/weinbau/atw148.pdf) bei der die Fässer gereinigt und die Innenseiten der
Fassdauben abgehobelt werden. Das Barrique erhält außerdem eine neue „Röstung“ durch
starkes Erhitzen. Der Grad der Röstung (Toastungsgrad) ist neben dem Alter des Fasses
maßgeblich für die Entwicklung der typischen Aromen im Wein verantwortlich, wobei das
Spektrum von „Vanille“ (schwächere Röstung) bis „Kaffee“ und „Kakao“ (stärkere
Röstung) reicht (Steidl & Renner 2001). Bei dem Röstvorgang entstehen
Zersetzungsprodukte von Cellulose (Cellodextrine, Cellobiose), die von einigen
Brettanomyces/Dekkera-Hefen verwertet werden können (Kapitel 1.2). Deshalb stellen auch
neue Barrique-Fässer eine potentielle Infektionsquelle für Brettanomyces dar. Der Barrique-
Ausbau wird vor allem bei Rotwein praktiziert, ist aber auch bei weißen Weinen zu finden
(Ambrosi et al. 2002).
1. EINLEITUNG 24
1.6 Ziele der vorliegenden Arbeit
Das vorliegende Forschungsvorhaben dient dazu, die hauptsächlich in Wein und Most
auftretenden Schädlingshefen der Gattungen Brettanomyces bzw. deren teleomorphe Form
Dekkera zu detektieren und zu identifizieren. Dazu werden fluoreszenzmarkierte
Oligonukleotidsonden in einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) eingesetzt. Die
zuvor notwendige Generierung von Art-spezifischen DNA-Sonden soll anhand von rRNA-
Sekundärstrukturen erfolgen. Dabei ermöglichen die spezifischen Sekundärstrukturen eine
exakte Lokalisation der Sonden-Zielregionen und die Umsetzung eines neuen
Gemeinschafts-Sonden Konzepts (Fröhlich et al. 2003). Hierbei unterstützen sich teilweise
komplementäre oder direkt benachbarte Sonden gegenseitig in der Anbindung an die
Zielregionen der hochstrukturierten rRNA. Im Gegensatz zu dem bisher bekannten Helfer-
Prinzip mit unmarkierten Oligonukleotiden (Fuchs et al. 2000) sollen in dieser Arbeit alle
verwendeten DNA-Sonden fluoreszenzmarkiert werden und dadurch die Signalstärke in der
Zelle zusätzlich optimieren.
Die 26S rDNA gilt als besonders geeignet, um Hefen auf Artniveau zu unterscheiden
(Kurtzman & Robnett 1998). Durch eine vollständige Sequenzierung der 26S rDNAs aller
Brettanomyces/Dekkera-Arten sollen geeignete Sequenzbereiche zur Identifizierung der
Hefe-Spezies aufgefunden werden. Die Sequenzdaten der 26S rDNAs sind für die fünf
beschriebenen Brettanomyces/Dekkera-Spezies in öffentlichen Datenbanken bisher nicht
oder nur teilweise und in schlechter Qualität (viele undefinierte Nukleotide) vorhanden.
Außerdem sind die bekannten hochvariablen D1/D2-Regionen am 5’-Ende der Sequenzen
für die Entwicklung von Oligonukleotid-Sonden zur Detektion und Identifizierung von
Hefen der Gattung Brettanomyces/Dekkera patentrechtlich geschützt (Hyldig-Nielsen et al.
2000).
Die Untersuchungen gliedern sich in folgende Abschnitte (Abb. 8):
� DNA-Isolierung, Amplifizierung und Untersuchung der SSU/LSU rRNA-Gene und der
ITS-Regionen aller Brettanomyces/Dekkera-Arten hinsichtlich ihrer Eignung als
phylogenetische Marker für eine Art- und/oder Stamm-Differenzierung, insbesondere
durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung.
� Vollständige Sequenzierung der 26S rRNA Gene der fünf Brettanomyces/Dekkera-
Spezies zum Auffinden hochvariabler Sequenzbereiche.
1. EINLEITUNG 25
� Generierung von Art-spezifischen Sekundärstrukturen der 26S rRNAs auf Basis einer
bereits hinterlegten Sekundärstruktur von Saccharomyces cerevisiae.
� Entwicklung von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden gemäß dem Gemeinschafts-
Sonden Konzept (Fröhlich et al. 2003, Röder et al. 2007a), das zur Optimierung der
Signalstärke dient.
� Überprüfung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit bereits vorhandenen Gattungs-
spezifischen Sonden, die an die 18S rRNA von Brettanomyces/Dekkera binden.
� Untersuchung der Spezifität und der Signalstärke von den neu generierten 26S rRNA-
gerichteten Sonden und Sonden-Mischungen (Gemeinschafts-Sonden) unter
Berücksichtigung der Hybridisierungs-Temperatur.
Abb. 8. Schematischer Überblick über den gesamten Prozess der Entwicklung und Anwendung von rRNA-
gerichteten DNA-Sonden. Details siehe Text und vgl. Kapitel Material und Methoden.
FISH
Anreicherung/ Isolierung
Hyb
ridi
sier
ung
Weinprobe
Gesamt-DNA
rDNA-Sequenz
rDNA/rRNA-Datenbank
DNA-Sonden
rRNA- Sekundärstruktur
Stamm- sammlung
1. EINLEITUNG 26
Die Differenzierung von lebenden und toten Zellen ist ein wichtiger Aspekt für eine
Beurteilung der tatsächlichen Kontamination durch Schädlingshefen. Daher sollen in dieser
Studie zusätzlich zur mikroskopischen Detektion und Identifizierung durch Fluoreszenz in
situ Hybridisierung verschiedene mikroskopisch auswertbare Vitalitätstests hinsichtlich
ihrer Anwendbarkeit auf Brettanomyces/Dekkera-Hefen überprüft werden.
Drei charakteristische physiologische Eigenschaften dieser Hefen, die in der entsprechenden
Literatur häufig diskutiert werden, sollen im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls untersucht
werden. Im Einzelnen sind dies: die Acetat-Produktion, die Hydrolyse von Cellulose und
die Sporulation von Brettanomyces/Dekkera-Spezies.
Der zweite, ökologisch orientierte Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit umfasst die
Untersuchung der regionalen Verbreitung dieser Hefen in der Weinbauregion Rheinhessen.
Dabei soll die neu entwickelte Sonden-Methode in der Praxis angewendet werden (Routine-
Analysen) und ihre Sensitivität und Verlässlichkeit durch die Überprüfung einer möglichst
großen Anzahl aus Wein isolierter Brettanomyces/Dekkera-Stämme abgesichert werden.
Folgende Aspekte wurden diesbezüglich berücksichtigt:
� Überprüfung der Anwendbarkeit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit den neu
entwickelten DNA-Sonden auf Brettanomyces/Dekkera-Isolate aus Wein.
� Probennahme (Rotweine) in Winzerbetrieben der Bereiche Wonnegau, Nierstein und
Bingen in der Weinbauregion Rheinhessen.
� Isolierung von Brettanomyces/Dekkera-Stämmen durch Kultivierungsversuche mit
semiselektiven Medien. Detektion und Identifizierung über FISH und rDNA-
Sequenzanalysen.
� Art- und Stamm-Differenzierung durch einen physiologischen Mikrotiterplatten-Test
(Biolog, Hayward, USA).
� Darstellung der Ergebnisse durch Kartierung und statistische Erhebung.
2. MATERIAL UND METHODEN 27
2. Material und Methoden
2.1 Verwendete Web-Adressen
Kulturensammlungen
� http://www.cbs.knaw.nl/databases/index.htm
� http://www.dsmz.de/
Datenbanken zur Primer-, Sonden- und Sequenzanalyse
� http://www.mwg-biotech.com/html/all/index.php
� http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
� http://www.operon.com/oligos/toolkit.php
Datenbanken für rRNA-Sequenzen und rRNA-Sekundärstrukturen
� http://www.imb-jena.de/RNA.html
� http://www.rna.ccbb.utexas.edu/
Informationen über Winzer und Weinproduktion in Rheinhessen
� http://www.biologie.de/biowiki/Rheinhessen
� http://www.destatis.de/themen/d/thm_land.php
� http://www.deutscheweine.de/
� http://www.rheinhessenwein.de/winzer/index.php
� http://www.wein-wg.de/wwg/rheinhessen/
� http://www.wein-plus.de/
Literatursuche
� http://portal.isiknowledge.com/
� http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed
� http://www.scopus.com/scopus/home.url
2. MATERIAL UND METHODEN 28
2.2 Geräte und Hilfsmittel
� Agarose-Elektrophorese-Einheit (Bio-Rad, München)
� Computersoftware zum Sequenzvergleich und zur Stammbaum-Analyse
� ClustalX 1.83 (Thompson et al. 1997)
� PHYLIP Package 3.65 (Felsenstein 1989)
� Tree View 1.6.6 (Page 1996)
� Computersoftware zur Generierung von RNA Sekundärstrukturen
� RNAstructure 4.2 (Mathews et al. 2004)
� GSview 4.4
� Computersoftware für Mikrotiterplatten-Assays
� MikroWin 2000 (Mikrotek Laborsysteme, Overath)
� Deckgläser 18 x 18 mm, 24 x 60 mm (Menzel, Braunschweig)
� Diagnostik Objektträge, teflonbeschichtet (Menzel, Brauschweig)
� Digitalkamera Coolpix 4500 (Nikon, Tokyo, Japan)
� Fluoreszenzmikroskop Axiophot 2 (Zeiss, Göttingen)
� Filtersätze (Zeiss, Göttingen; AF Analysetechnik, Tübingen)
� 01 (Anregung: 365 nm, Emission: 397 nm)
� 10 (Anregung: 450-490 nm, Emission: 515-565 nm)
� 28 (Anregung: 406-423 nm, 530-545 nm, Emission: 430-467 nm, 618-675 nm)
� F41-007 (Anregung: 575 nm, Emission: 605 nm)
� Geldokumentationseinheit (Polaroid, Offenbach) inkl. Bedienungssoftware
(Intas, Göttingen)
� Hybridisierungsgefäße Cellstar® 50 ml PP-Tubes (Greiner Bio-One, Frickenhausen)
� Hybridisierungsofen (Shel Lab, Oregon, USA)
� Mikroskop Laborlux 11 (Leitz, Wetzlar)
� Mikrotiterplatten-Reader Multiskan Plus MKII (Dunn, Labortechnik, Asbach)
� Mikrotiterplatten-Test, YT MicroPlateTM, Biolog Inc., Hayward, USA
� pH-Meter CG840 (Schott, Mainz)
� Photometer 1101 M (Eppendorf, Hamburg)
� Sterilfilter Minisart 0,22 µm (Sartorius, Göttingen)
2. MATERIAL UND METHODEN 29
� Thermocycler
� Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg)
� Progene-Techne (Thermo-Dux, Wertheim)
� Thermomixer 5436 (Eppendorf, Hamburg)
� Transilluminator (Biometra, Göttingen)
� Vortex-Gerät Vibrofix VF1 Electronic (Ika Labortechnik, Staufen)
� Zentrifugen
� Centrifuge 5403 (Eppendorf, Hamburg)
� Biofuge pico (Heraeus, Osterode)
2.3 Verwendete DNA- und RNA-Sequenzen
Tab. 2. Für die Generierung von Primern, phylogenetischen Stammbäumen und
Sekundärstrukturen verwendete DNA- und RNA-Sequenzen aus Datenbanken.
Organismus Sequenz Zugriffsnummer (Acc.)a
Dekkera anomala 18S rDNA X83818
Dekkera bruxellensis 18S rDNA X58052
Saccharomyces cerevisiae 18S rDNA Z75578
Saccharomyces cerevisiae ITS-Region Z95939
Candida albicans LSU rDNA X70659
Endomyces fibuliger LSU rDNA U09238
Saccharomyces cerevisiae LSU rDNA J01355
Schizosaccharomyces japonicus LSU rDNA Z32848
Saccharomyces cerevisiae LSU rDNA / rRNAb U53879
a NCBI-Datenbank (GenBank). b LSU rRNA-Gensequenz und -Sekundärstruktur (http://www.rna.ccbb.utexas.edu/).
2. MATERIAL UND METHODEN 30
2.4 Chemikalien
� Agar (Difco, Detroit)
� Agarose: peqGold Standard-Agarose (Peqlab, Erlangen)
� Ampicillin (Sigma, München)
� β-Mercaptoethanol (Roth, Karlsruhe)
� Borsäure (Roth, Karlsruhe)
� Bromkresolgrün (Sigma, München)
� Calciumcarbonat (Merck, Darmstadt)
� Carboxymethylcellulose (Fluka, Neu-Ulm)
� Cycloheximid (Sigma, München)
� DABCO (Sigma, München)
� DAPI (Fluka, Neu-Ulm)
� Dextransulfat (Roth, Karlsruhe)
� Dimethylsulfoxid (DMSO) (Roth, Karlsruhe)
� EDTA (Roth, Karlsruhe)
� Essigsäure (Roth, Karlsruhe)
� Ethanol (Roth, Karlsruhe)
� Ethidiumbromid (Roth, Karlsruhe)
� Fluoresceindiacetat (Fluka, Neu-Ulm)
� Glucose (Merck, Darmstadt)
� Glycerin (Roth, Karlsruhe)
� Hefeextrakt (Marcor, NJ, USA)
� Kongorot (Sigma, München)
� Kadifit SO2 (Erbslöh, Geisenheim)
� Kalium-Acetat (Roth, Karlsruhe)
� Natriumchlorid (Roth, Karlsruhe)
� Natriumhydroxid (Roth, Karlsruhe)
� Natriumdodecylsulfat (Merck, Darmstadt)
� p-Cumarsäure (Fluka, Neu-Ulm)
� Pepton (Roth, Karlsruhe)
� TRIS/HCl (Roth, Karlsruhe)
� Triton X-100 (Merck, Darmstadt)
� Wasser (deion.): Milli RO Plus (Millipore, Eschborn)
2. MATERIAL UND METHODEN 31
2.5 Molekularbiologische Reagenzien und Kits
� DNeasy® Tissue Kit (Qiagen, Hilden)
� DNA-Längenstandards (Fermentas, St. Leon-Rot)
� GeneRulerTM 100 bp DNA ladder
� Lambda DNA/EcoRI+Hind III, Marker 3
� dNTP-Mix (je 2,5 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP) (Peqlab, Erlangen)
� Live/Dead® Yeast Viability Kit:
Fun® 1, Calcofluor White (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon)
� Lyticase (Fluka, Neu-Ulm)
� Magnesiumchlorid-Lösung (25 mM) (Peqlab, Erlangen)
� MassRulerTM (6 x) Loading Dye Solution (Fermentas, St. Leon-Rot)
� Oligonukleotide (MWG, Ebersberg; Operon, Köln):
� PCR-Primer (100 µM)
� FISH-Sonden, Cy3 modifiziert (5’-Ende) (100 µM)
� PCR-Puffer (10x) (Peqlab, Erlangen)
� QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden)
� Ribonuklease A (Roche, Mannheim)
� SYTOX® Green Nucleic Acid Stain (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon)
� Taq-Polymerase SAWADY (5U/µl) (Peqlab, Erlangen)
Tab. 3. Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe und Filtersätze für die Fluoreszenz in situ
Hybridisierung und die Lebend-/Totzellenfärbungen
Farbstoff Anregung (nm)a Emission (nm)a Filterb
DAPIc 358 461 01, 28
FDA 495 513 10
SYTOX® Greenc 504 523 10
Fun® 1 480 590 10, 28
Calcofluor White 440 510 10, 28
Cy3c 547 563 F41-007, 28
a Maximalwerte der jeweiligen Spektren. b Bezeichnung entsprechend den Herstellerangaben (Zeiss, Göttingen; AF Analysetechnik,
Tübingen). c An DNA assoziiert.
2. MATERIAL UND METHODEN 32
2.6 Oligonukleotide (Primer)
Tab. 4. Verwendete Primer zur Amplifizierung der ITS1/5.8S/ITS2 Regionen, der partiellen 18S rDNAs,
der kompletten 26S rDNAs sowie für die schrittweise Sequenzierung der 26S rDNAs
Primera Sequenz (5’→3’) Relative Positionb GC (%) Tm (°C)c
ITS1/5.8S rDNA/ITS2 Sequenz
ITS1 (For) TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 1770-1789 63 61.0
ITS4 (Rev) TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 154-173 45 55.3
partielle 18S rDNA-Sequenz
Oxy 5.1 (For) CCA GCA GC(C/T) GCG GTA ATT 565-582 58 57.1
ITS2 (Rev) GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 393-412 55 59.4
26S rDNA-Sequenz
For-26S-1 CTC AAA TCA GGT AGG AGG 121-138 50 53.7
Rev-26S-2 CGT AAC AAC AAG GCT AC 3454-3470 47 50.4
26S rDNA-Sequenzierung
26S-Rev-1 CTT GTT CGC TAT CGG TC 449-465 53 52.8
26S-For-2 GTT GTT TGG GAA TGC AGC 386-403 50 53.7
26S-Rev-2 CTA TTC AGG CAT AGT TCA C 925-943 42 52.4
26S-For-3 CTT GAA ACA CGG ACC AAG 753-770 50 53.7
26S-Rev-3 GTC TAG ATG AAC TAA CAC C 1318-1336 42 52.4
26S-For-4 GTA AGC AGA ACT GGC G 1239-1254 56 51.7
26S-Rev-4 CTC CGG ATA AAC CAA TTC 1824-1841 44 51.4
26S-For-5 GAA TGT GGA GAC GCC G 1757-1772 63 54.3
26S-Rev-5 CAC TGG GCA GAA ATC AC 2297-2313 53 52.8
26S-For-6 GAA CTG GTA CGG ACA AG 2217-3233 42 52.8
26S-Rev-6 GAG ATT TCT GTT CTC CAT G 2778-2796 59 52.4
26S-For-7 CAT TGT CAG GTG GGG AG 2706-2722 59 55.2
26S-Rev-7 CAG TAG GGT AAA ACT AAC C 3081-3099 42 52.4
26S-For-8 CGG CTC TTC CTA TCA TAC 2985-3002 50 53.7
a Forward (For) und Reverse (Rev) Primer. b Die Positionsangaben beziehen sich auf Sequenzen von Saccharomyces cerevisiae (Z75578 / ITS1, Oxy 5.1;
J01355 / ITS4, For-26S-1, For-26S-2, 26S-Rev-1 bis 26S-For-8; Z95939 / ITS2). c Mittlere Schmelztemperaturen laut Herstellerangaben (Formel siehe unten).
Formel zur Tm-Berechnung (MWG, Ebersberg): Tm [°C] = 69.3 + 41
n = Anzahl der jeweiligen Basen; L = Länge des Oligonukleotids (> 15)
(nG + nC) 650L L
2. MATERIAL UND METHODEN 33
2.7 Oligonukleotide (Cy3-markierte Sonden)
Tab. 5. 18S rRNA-gerichtete, Cy3-markierte DNA-Sonden für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Sonde Sequenz (5’→3’) Relative Positiona GC (%) Tm (°C)b
B_brux_anom1 GTC CCA GGT GAG GGT CG 1700-1716 71 60.0
B_brux_anom2 CTC CCA GGT CCA ATC CTG A 1676-1694 58 58.8
B_anom3 TCA ACA CCC GAA GGT GCC TA 705-724 55 59.4
B_brux_anom4 ACC GGC CCC CCA AGC C 642-657 81 62.0
B_brux_anom5 TCG GGC GGT TA(C/T) CCA GTA CTC GCC G 666-690 66 70.4
B_brux_anom5a TA(C/T) CCA GTA CTC GCC GAA TGG 661-681 55 60.8
a Die Positionsangaben beziehen sich auf die Sequenz von Saccharomyces cerevisiae (Z75578). b Mittlere Schmelztemperaturen laut Herstellerangaben (Kapitel 2.6).
Tab. 6. 26S rRNA-gerichtete, Cy3-markierte DNA-Sonden für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Sondea Sequenz (5’→3’) Relative Positionb
Spezifische Basenc GC (%)
26S-D.anom. 1.1 TAC CGC ACC CGA AGG CAC T 2115-2133 3 63
26S-D.anom. 1.2 TGT CCG CGT CTA GAC ACG 2150-2167 3 61
26S-D.anom. 1.3 CGG AGG CTG GTA CCT GT 2165-2181 2 65
26S-D.anom. 2.1 GGA TCA ACG GCA CAA AAG GC 2680-2699 3 55
26S-D.anom. 3/4.1 CCT TAA CAG AAT TAA GGC GTT G 1668-1689 2 41
26S-D.brux. 1.1 CGT CTA GGC CTC GCC GT 2145-2161 3 71
26S-D.brux. 1.2 CAA GAC CCT TCT CCC AAC A 2076-2094 2 53
26S-D.brux. 1.3 CAA GTG CAC AGC TAT CTC C 2103-2121 2 53
26S-D.brux. 2.1 CGG ATC AAC GGC CTA ATA C 2680-2698 3 53
26S-D.brux. 3/4.1 TTA CGT TGC CGT CGT AAT AAA TT 1737-1759 2 35
26S-D.brux. 3/4.2 GGC ATG AAG AAT ATC TGT CTT C 1918-1939 2 41
26S-D.brux. 5.1 CTT ACT CAA ATC CCT CCG GT 879-898 2 50
26S-B.custer. 1.1 TAC CGG AAC GAC CGC AGT 2178-2195 5 61
26S-B.custer. 1.2 TGT CAC AGG CCT CTA CAT TG 2149-2168 3 50
26S-B.custer. 1.3 TCG CAG CGT CAT CCC G 2078-2093 5 69
26S-B.custer. 2.1 CCC GGA TCA CCT ATA GAT AG 2678-2697 4 50
26S-B.custer. 3/4.1 CTG AAT ATT GCT TCG TTC CTG 1916-1936 5 43
26S-B.custer. 3/4.2 CGC TTA CGT TGC CGT CTC 1740-1757 3 61
26S-B.custer. 3/4.3 TTT ACA GAG TTA CCT TAC TCC 1648-1668 9 38
26S-B.custer. 3/4.4 GAG GCA GTA TAC AAA AGT ACA C 1672-1693 7 41
2. MATERIAL UND METHODEN 34
Tab. 6. Fortsetzung
Sondea Sequenz (5’→3’)c Relative Positionb
Spezifische Basenc GC (%)
26S-B.custer. 6.1 GGA ACT AGA ACA CCC ACC 3355-3372 3 56
26S-B.custer. 6.2 CAC GCT CCC CTA GTA TG 3321-3337 5 59
26S-B.custer. 6.3 TCC AGC GAC CTT ACG GC 3298-3314 3 65
26S-B.nanus 1.1 TGG TCG TTA CTG GGA GCT 2184-2201 4 56
26S-B.nanus 1.2 CTC GCC TTT CGG TGT CTC 2066-2083 4 61
26S-B.nanus 1.3 CGA AAA CTG AGC TTT GCG A 2165-2183 5 47
26S-B.nanus 1.4 TTC CAA AAA CCC CGC TTC G 2085-2103 6 53
26S-B.nanus 1.5 GTT TTC GAA CAG AAC AGG GC 2144-2163 6 33
26S-B.nanus 1.6 GGT CGT AAA ACT TGT AAA ACT 2113-2133 8 33
26S-B.nanus 2.1 GGA CAC GCC GCT TTT GCT A 2665-2683 3 58
26S-B.nanus 3/4.1 CTT TCG ATG GAC ACT TGA TCA G 1674-1695 4 46
26S-B.nanus 3/4.2 CGG AAT CTT GAC CGG G 1707-1722 2 63
26S-B.nanus 3/4.3 CGG CTA ACG TTT GAG TAA GG 1870-1889 7 50
26S-B.nanus 5.1 TCA AAT CCG GCC ACC GC 872-888 4 65
26S-B.nanus 5.2d CTG CAC GCC TTC ACA GC 842-858 4 65
26S-B.nanus 5.3 GCG TAT TGG GTT TTA CTC AC 798-817 3 45
26S-B.nanus 6.1d TTC CGC ATG TAC GCC GC 3336-3352 3 65
26S-B.naard. 1.1 GGG ACG CCG CCG AAG CA 2182-2198 10 77
26S-B.naard. 1.2 CCC ACC TAC TCG ACC CTT A 2055-2073 4 58
26S-B.naard. 1.3d GCC CGA AAG CTC TTC TCC C 2115-2133 7 63
26S-B.naard. 1.4 TGT CTA AGA CTA GGA GAA GGA 2150-2170 7 43
26S-B.naard. 1.5 CGC CTC TTC TAC CAC CCA 2076-2093 3 61
26S-B.naard. 2.1 AAT TGC CCT TTA ACC GGC GT 2674-2693 5 50
26S-B.naard. 3/4.1 GTA AAT TAG CCT TTT GAA ACG GAG 1660-1683 3 38
26S-B.naard. 3/4.2 TTC CCT TTC GAT AGG AGG CT 1687-1706 3 50
26S-B.naard. 5.1d GTA AGG GCT CCG TCC TAC 830-847 2 61
26S-B.naard. 5.2 TCC TTC CAA TAA ATA TCT GGA TCG 865-888 2 38
26S-B.naard. 6.1d CGC CAA GAG TGC CAG C 3335-3350 2 57
26S-B.naard. 6.2d GCA GAC ACC CAA GGC C 3355-3370 2 57
a Spezifische Sonden für D. anomala (D.anom.), D. bruxellensis (D.brux.), B. custersianus (B.custer.), B.
nanus (B.nanus) und B. naardenensis (B.naard.). Die Tm-Werte sind in Tabelle 14 dargestellt. b Die Positionsangaben beziehen sich auf die Sequenz von Saccharomyces cerevisiae (J01355). c Die spezifischen Basen (rot-markiert) unterscheiden sich von allen anderen Brettanomyces/Dekkera-Arten
und von Saccharomyces cerevisiae (U53879). d Sonden generiert, aber nicht getestet.
2. MATERIAL UND METHODEN 35
2.8 Puffer und Lösungen
2.8.1 DNA-Isolierung aus Hefen
� Sorbitol-Lösung
� Sorbitol 1 M
� EDTA 100 mM
� β-Mercaptoethanol 14 mM
� deion. Wasser ad 50 ml
2.8.2 Gelelektrophorese
� Agarosegel (1,5 %)
� Agarose 1,2 g
� 1 x TBE-Puffer 80 ml
� TBE-Elektrophoresepuffer (10 x, pH 8,3)
� TRIS/HCl 890 mM
� Borsäure 890 mM
� EDTA 20 mM
� deion. Wasser ad 1000 ml
2.8.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung
� Ethanolreihe (50 %, 70 %, 96 %)
� Ethanol (96 %) in deion. Wasser
� Hybridisierungspuffer
� TRIS-Puffer (pH 7,2) 200 mM
� NaCl-Lösung 2,7 M
� SDS-Lösung 10 %
� Dextransulfat 0,1 g
� deion. Wasser ad 1 ml
2. MATERIAL UND METHODEN 36
� Waschpuffer
� Identische Zusammensetzung wie der Hybridisierungspuffer,
jedoch ohne Dextransulfat.
� Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide
� Cy3-Sonden 50 pmol/µl
� in sterilem, deion. Wasser
� DAPI (1000 x)
� DAPI 2 mg
� steriles, deion. Wasser ad 1 ml
� DABCO
� DABCO 234 mg
� Glycerin 8 ml
� steriles, deion. Wasser ad 10 ml
2.8.4 Färbungen
� Kongorot-Färbelösung
� Natriumhydroxid 2 mM
� Kongorot 0,2 %
� deion. Wasser ad 1000 ml
� Kongorot-Entfärbelösung
� NaCl 1 M
� NaOH 2 mM
� deion. Wasser ad 1000 ml
2. MATERIAL UND METHODEN 37
2.9 Medien
� YPG-Medium (pH 6,5)
� Hefeextrakt 10 g
� Pepton aus Fleisch 20 g
� Glucose 10 g
� Calciumcarbonat 10 g
� Agar 15 g
� deion. Wasser ad 1000 ml
Das Medium wurde für 20 min bei 121 °C autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C
wurden 20 mg Cycloheximid (0,002 %) und 100 mg Ampicillin (0,01 %) in das Medium
zugegeben. Beide Antibiotika wurden zuvor in Lösung mit einem geeigneten Filter
(Porengröße 0,22 µm) sterilfilitriert.
Für die Anreicherung aus Weinproben wurden jeweils 5 ml YPG-Flüssigmedium mit
Cycloheximid und Ampicillin (Konzentrationen s. o.) in Reagenzgläsern angesetzt.
� DBDM (Dekkera-Brettanomyces-Differenzierungs-Medium)
nach Rodrigues et al. 2001 (abgeändert)
� Hefeextrakt 10 g
� Pepton aus Fleisch 20 g
� Glucose 10 g
� Agar 20 g
� Ampicillin 80 mg
� Cycloheximid 20 mg
� p-Cumarsäure 100 mg
� Bromkresolgrün 22 mg
� Ethanol (reinst, 99 %) 60,6 ml
� deion. Wasser ad 1000 ml
Ampicillin, Cycloheximid und Ethanol wurden nach dem Autoklavieren des Grundmediums
steril zugegeben.
2. MATERIAL UND METHODEN 38
� CMC (Carboxymethylcellulose) -Agar
� Carboxymethylcellulose 10 g
� Triton X-100 1 ml
� Agar 15 g
� deion. Wasser ad 1000 ml
Als obere Schicht (0,5 cm) auf YPG-Agarplatten.
� Sporulationsmedium (Malzagar)
� Malzextrakt 30 g
� Agar 20 g
� deion. Wasser ad 1000 ml
� SPA-Sporulationsmedium
� Kalium-Acetat 10 g
� Hefeextrakt 2,5 g
� Glucose 1 g
� Agar 20 g
� deion. Wasser ad 1000 ml
Soweit nicht anders angegeben wurden alle Nährmedien bei 121 °C für 20 min autoklaviert
und nach dem Abkühlen auf ca. 50-60 °C in sterile Petrischalen gegossen.
2.10 Organismen und Kultivierung
2.10.1 Brettanomyces/Dekkera-Institutsstämme
Die Typstämme der fünf bisher bekannten Brettanomyces/Dekkera-Arten sowie einige D.
bruxellensis-Isolate waren in der Kulturensammlung des Instituts vorhanden (Tab. 7).
2. MATERIAL UND METHODEN 39
Tab. 7. Brettanomyces/Dekkera-Institutsstämme
Stamm Gattung / Art Herkunfta Isoliert aus Land
St. 374 D. bruxellensis IMW Sekt Deutschland
St. 566 D. bruxellensis IMW Sekt Deutschland
St. 567 D. bruxellensis IMW Sekt Deutschland
St. 568 D. bruxellensis IMW Sekt Deutschland
St. 569 D. bruxellensis IMW Sekt Deutschland
St. 573 D. bruxellensis AG Henick-Kling Wein USA (NY)
DSM 70732T D. anomala DSMZ Bier Deutschland
DSM 70001T D. bruxellensis DSMZ Lambic Bier Belgien
CBS 4805T B. custersianus CBS Bantu Bier Südafrika
CBS 1945T B. nanus CBS Flaschenbier Schweden
CBS 6042T B. naardenensis CBS Limonade Niederlande
St. 579 D. bruxellensis AG Henick-Kling Wein USA (CA)
a Institut für Mikrobiologie und Weinforschung (IMW) in Mainz; Cornell University, Department of Food
Science and Technology (AG Henick-Kling) in New York (USA); Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)
in Utrecht (Niederlande). T = Typstamm.
Die Brettanomyces/Dekkera-Institutsstämme wurden als Reinkulturen auf YPG-Schrägagar
(ohne Cycloheximid) in Stammhaltung genommen. Nach dem Anwachsen (ca. 1 Woche bei
30 °C; B. nanus und B. naardenensis bei 20 °C) wurden die Hefen im Kühlschrank (4 °C)
aufbewahrt und alle 3 Monate auf neuen YPG-Schrägagar überimpft. Für DNA-Isolierung,
Färbungen, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und Stoffwechselversuche wurden
die Stämme auf YPG-Agar-Platten (ohne Cycloheximid) ausgestrichen und bei 30 °C (B.
nanus und B. naardenensis bei 20 °C) 3-4 Tage (B. nanus 1 Woche) bis zur Zellernte
inkubiert.
2.10.2 Brettanomyces/Dekkera-Eigenisolate
Tab. 8. Brettanomyces/Dekkera-Eigenisolate aus Weinproben
Stamma Gattung / Art Herkunft Region Isoliert aus
St. 9A D. bruxellensis Schafhausen Wonnegau Spätburgunder
St. 9B D. bruxellensis Schafhausen Wonnegau Spätburgunder
2. MATERIAL UND METHODEN 40
Tab. 8. Fortsetzung
Stamma Gattung / Art Herkunft Region Isoliert aus
St. 30A D. bruxellensis Alsheim Nierstein St. Laurent
St. 30B D. bruxellensis Alsheim Nierstein St. Laurent
St. 34A D. bruxellensis Mettenheim Nierstein Cabernet Sauvignon
St. 34B D. bruxellensis Mettenheim Nierstein Cabernet Sauvignon
St. 35A D. bruxellensis Mettenheim Nierstein Merlot
St. 35B D. bruxellensis Mettenheim Nierstein Merlot
St. 75A D. bruxellensis Abenheim Wonnegau Dornfelder
St. 75B D. bruxellensis Abenheim Wonnegau Dornfelder
St. 76 D. bruxellensis Abenheim Wonnegau Dornfelder
St. 115 D. bruxellensis Flomborn Wonnegau Portugieser
St. 128 D. bruxellensis Framersheim Wonnegau Cabernet Sauvignon
St. 153A D. bruxellensis Guldental Nahe Regent
St. 153B D. bruxellensis Guldental Nahe Regent
St. 153C D. bruxellensis Guldental Nahe Regent
St. 179A D. bruxellensis Weinolsheim Nierstein Cabernet Sauvignon
St. 179B D. bruxellensis Weinolsheim Nierstein Cabernet Sauvignon
St. 183A D. bruxellensis Uelversheim Nierstein Frühburgunder
St. 183B D. bruxellensis Uelversheim Nierstein Frühburgunder
St. 190A D. bruxellensis Dolgesheim Nierstein Portugieser
St. 190B D. bruxellensis Dolgesheim Nierstein Portugieser
St. 198 D. bruxellensis Alzey Wonnegau Dornfelder
St. 199 D. bruxellensis Alzey Wonnegau Dornfelder
St. 200 D. bruxellensis Alzey Wonnegau Spätburgunder
St. 230 D. bruxellensis Biebelnheim Nierstein Dornfelder
St. 238A D. bruxellensis Gau-Odernheim Nierstein Cuvee
St. 238B D. bruxellensis Gau-Oderbheim Nierstein Cuvee
St. 243 D. bruxellensis Bermersheim Nierstein St. Laurent
St. 244A D. bruxellensis Bermersheim Nierstein Regent
St. 244B D. bruxellensis Bermersheim Nierstein Regent
St. 253 D. bruxellensis Weinsberg Württemberg Lemberger-Mitos
St. 254 D. bruxellensis Weinsberg Württemberg Lemberger-Mitos
St. 255 D. bruxellensis Weinsberg Württemberg Spätburgunder
St. 256 D. bruxellensis Weinsberg Württemberg Lemberger-Mitos
St. 259A D. bruxellensis Mainz Nierstein Dornfelder
St. 259B D. bruxellensis Mainz Nierstein Dornfelder
St. 260A D. bruxellensis Mainz Nierstein Dornfelder
St. 260B D. bruxellensis Mainz Nierstein Dornfelder
2. MATERIAL UND METHODEN 41
Tab. 8. Fortsetzung
Stamma Gattung / Art Herkunft Region Isoliert aus
St. 282 D. bruxellensis Ingelheim Bingen Spätburgunder
St. 283 D. bruxellensis Ingelheim Bingen Regent
St. 295 D. bruxellensis Großwinternheim Bingen Dornfelder
St. 296 D. bruxellensis Großwinternheim Bingen Dornfelder
St. 299 D. bruxellensis Gau-Algesheim Bingen Merlot
a Verschiedene Stämme aus einer Weinprobe sind mit A, B, C bezeichnet.
2.10.3 Weitere verwendete Organismen
Tab. 9. Als Negativ-Kontrolle für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung verwendete Organismen
Stamm Gattung / Art Herkunfta Isoliert aus
St. 43 Saccharomyces cerevisiae IMW Wein
B70 Oenococcus oeni IMW Wein
a Institut für Mikrobiologie und Weinforschung (IMW) in Mainz.
2.10.4 Probennahme
Für die Isolierung neuer Brettanomyces/Dekkera-Stämme aus Wein wurden insgesamt 299
Weinproben aus 113 Winzerbetrieben untersucht. Dabei wurden 291 Weinproben für die
Untersuchung der regionalen Verbreitung dieser Hefen in der deutschen Weinbauregion
Rheinhessen aus 110 Winzerbetrieben direkt vor Ort entnommen. Die Winzerbetriebe
gehörten zu den Bereichen Wonnegau, Nierstein und Bingen in Rheinhessen. Die
Probennahme richtete sich gezielt auf Rotweine in Holz- oder Barrique-Fässern. Laut
Literatur (Fugelsang 1993, Chatonnet et al. 1995, Dittrich & Großmann 2005) konnte hier
mit der größten Wahrscheinlichkeit eine Brettanomyces/Dekkera Infektion angenommen
werden. Jeweils 50 ml der zu untersuchenden Weine wurden direkt aus den Gebinden
entnommen und bis zur Verwendung im Kühlschrank gelagert.
2.10.5 Isolierung von Brettanomyces/Dekkera-Stämmen
In einer Vorkultur wurden jeweils 5 ml YPG-Flüssigmedium (mit Cycloheximid und
Ampicillin) mit 2 ml der aufgeschüttelten Weinproben in Reagenzgläsern angeimpft und
aerob auf dem Schüttler (120 rpm) bei 30 °C für 1 Woche inkubiert. Danach wurden 50 µl
2. MATERIAL UND METHODEN 42
dieser Vorkultur auf YPG-Agarplatten (mit Cycloheximid und Ampicillin) ausplattiert und
bei 30 °C für 7 bis 14 Tagen (oder bis Kolonien sichtbar wurden) inkubiert. Die Zellen
einzelner Kolonien wurden mikroskopisch kontrolliert und bei Vorhandensein von
apiculaten Hefen (Kurtzman & Fell 1998; Barnett et al. 2000) erneut ausgestrichen. Durch
wiederholte Vereinzelung konnten nach mindestens zweimaligem Ausstreichen auf YPG-
Agar schließlich Reinkulturen gewonnen werden. Eine physiologische Identifizierung der
Hefe-Spezies erfolgte über Wachstumsversuche auf DBDM (Dekkera-Brettanomyces-
Differenzierungs-Medium). Hierfür wurde eine Kolonie oder ein Tropfen einer
Hefesuspension auf dem Differenzierungsmedium ausgestrichen und für 14 Tage bei 30 °C
inkubiert. Die systematische Identifizierung der Isolate konnte molekularbiologisch mittels
Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit Gattungs- und Art-spezifischen DNA-
Sonden, sowie über Sequenzvergleiche der 18S rDNA- und ITS-Regionen durchgeführt
werden.
2.10.6 Qualitativer Nachweis der Acetat-Produktion
Die für Hefespezies der Gattungen Brettanomyces/Dekkera charakteristische Essigsäure-
Produktion (Dittrich & Großmann 2005) wurde sowohl bei den Typstämmen der fünf Arten
(Tab. 7) als auch bei den Eigenisolaten (Tab. 8) durch Wachstumsversuche untersucht.
Zusätzlich zu dem pH-abhängigen Farbumschlag in den Wachstumsversuchen auf DBDM
sollte die Auflösung von Calciumcarbonat als Indiz für die Säureproduktion verwendet
werden. Hierfür wurden die jeweiligen Hefe-Stämme auf YPG-Agarplatten mit
Calciumcarbonat ausgestrichen und 14 Tage bei 30 °C inkubiert.
2.10.7 Qualitative Untersuchung der Hydrolyse von Cellulose
Sowohl die fünf Typstämme von Brettanomyces/Dekkera als auch die im Rahmen dieser
Arbeit isolierten Stämme wurden auf ihre Fähigkeit zur Hydrolyse von Cellulose hin
untersucht. Dazu wurden die Hefestämme auf YPG-Agarplatten mit einer oberen Schicht
(0,5 cm) aus CMC (Carboxymethylcellulose) -Agar ausgestrichen und 14 Tage bei 30 °C
inkubiert. Nach dem Entfernen des Zellmaterials von den Kulturplatten und Abspülen mit
sterilem deion. Wasser erfolgte eine Anfärbung mit alkalischer Kongorot-Lösung für 1 - 2 h
bei RT. Anschließend wurden die Agarplatten mit Entfärbelösung für mindestens 6 h oder
ü. N. bei RT entfärbt und, wenn notwendig, mit 1 N HCl kontrastiert. Darüber hinaus wurde
untersucht, ob eine Hydrolyse von Cellulose durch Essigsäure möglich ist. Hierzu wurde
jeweils 5 µl Essigsäure in verschiedenen Konzentrationen (10 % - 100 % in deion. Wasser)
2. MATERIAL UND METHODEN 43
auf den Agar getropft und ü. N. bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte die oben
beschriebene Färbung und Entfärbung.
2.10.8 Untersuchung der Sporulation
Die taxonomische Einordnung der in dieser Arbeit untersuchten Hefe-Spezies basiert auf
der dokumentierten Beobachtung (Kurtzmann & Fell 1998) von Ascosporenbildung
(teleomorphe Gattung Dekkera) bzw. dem Fehlen einer sexuellen Reproduktion (anamorphe
Gattung Brettanomyces). Durch Wachstumsversuche auf verschiedenen sporen-
induzierenden Medien sollte die Sporulation sowohl der Typstämme als auch der
Eigenisolate untersucht werden. Die Hefestämme wurden hierfür auf Malzagar (Smith &
van Grinsven 1984) und auf SPA-Sporulationsmedium (de Souza Liberal et al. 2007)
ausgestrichen bzw. als Zellsuspension aufgetragen. Innerhalb einer Inkubationsdauer von 3
Wochen bei 30 °C erfolgte eine regelmäßige mikroskopische Kontrolle der Hefezellen.
2.11 Untersuchung ribosomaler Gensequenzen
Zur Identifizierung von Mikroorganismen wird häufig die Sequenzierung der SSU
ribosomalen Gensequenzen (16S rDNA bei Bakterien und Archaeen bzw. 18S rDNA bei
Eukaryoten) und der LSU ribosomalen Gensequenzen (26S/28S rDNA) sowie der Internal
Transcribed Spacer-Regionen (ITS-Regionen) bei Eukaryoten verwendet. Da die Gene für
die ribosomalen RNAs (rRNAs) zum Teil hoch konserviert sind, können Primer verwendet
werden, die auch noch nicht bekannte Arten nachweisen. Die Sequenzen können dann mit
allen bereits bekannten Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken verglichen werden. Mit
dieser Methode können sowohl taxonomische Identifizierungen erfolgen, als auch die
phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse in einer Stammbaum-Analyse ermittelt
werden. Darüber hinaus müssen für die Entwicklung von spezifischen rRNA gerichteten
DNA-Sonden die Gensequenzen potentieller Zielregionen amplifiziert, sequenziert und
miteinander verglichen werden.
2.11.1 DNA-Isolierung
Die Isolierung genomischer DNA aus den Hefe-Stämmen erfolgte mit dem DNeasy®Tissue
Kit (Qiagen, Hilden) nach den Vorgaben des Herstellers. Als Ausgangsmaterial wurde eine
2. MATERIAL UND METHODEN 44
Suspension (in deion. Wasser) mit 5 x 107 bis 1 x 108 Zellen einer 2 - 3 Tage alten Kultur
von YPG-Agarplatten eingesetzt. Die Zellwände konnten mit dem Enzym Lyticase und
Sorbitol-Lösung nach Anleitung des Herstellers aufgeschlossen werden. Lyticase besitzt
zusätzlich zu ihrer β-(1,3)-Glucanase-Aktivität auch eine Protease-Aktivität (Scott &
Schekman 1980). Die Isolierung der genomischen DNA erfolgt mit dem Kit über eine
Silica-Gel-Membran ohne organische Extraktion. Hierbei bindet die DNA nach der Zell-
Lyse selektiv an die Membran der DNeasy-Säulen. Proteine und zweiwertige Kationen
werden durch mehrere Waschschritte von der Säule entfernt. Nach der Elution wurde die
Reinheit der DNA photometrisch überprüft. Das Verhältnis der Absorptionen bei 260 nm
(DNA) und 280 nm (Proteine) erlaubte hierbei Rückschlüsse auf eine Kontamination mit
Proteinen, die im UV-Bereich absorbieren. Bei pH 7,5 besitzt reine DNA ein A260/A280-
Verhältnis von 1,8 - 2,0 (Handbuch DNeasy®Tissue Kit, Qiagen, Hilden). Die isolierte DNA
wurde bis zu ihrer Verwendung bei -20 °C aufbewahrt.
2.11.2 Untersuchung der 18S rDNA-Sequenzen
Die Amplifizierung partieller 18S rDNA-Sequenzbereiche (Abb. 15) erfolgte mit den
konservierten Primern Oxy 5.1 (For) und ITS2 (Rev) (White et al. 1990) in einer PCR. Der
Reaktionsansatz ist in Tabelle 10 und das verwendete Thermocycler-Programm in
Tabelle 11 dargestellt.
Tab. 10. Zusammensetzung der PCR-Reaktionsansätze
Komponente Volumen
PCR-Puffer (10x) 5 µl
MgCl-Lösung (25 mM) 3 µl
dNTP-Mix (je 2,5 mM) 4 µl
Forward (For)-Primer (10 pmol/µl) 2 µl
Reverse (Rev)-Primer (10 pmol/µl) 2 µl
Taq-Polymerase (2,5 U/µl) 1 µl
steriles, deion. Wasser 28-31 µl
Template DNA 2-5 µl
Gesamtvolumen 50 µl
2. MATERIAL UND METHODEN 45
Tab. 11. Thermocycler-Programm zur Amplifizierung der 18S rDNA-Sequenz
Programm Temperatur (°C) Zeit (min) Zyklen
Initial-Denaturierung 95 3,0 1
Denaturierung 95 0,5
Annealing 58 1,0
Elongation 72 1,0
35
Finale Elongation 72 5,0 1
2.11.3 Untersuchung der ITS-Region
Die Amplifizierung der Internal Transcribed Spacer-Regionen (Abb. 15) erfolgte mit den
konservierten Primern ITS1 und ITS4 (White et al. 1990) in einer PCR wie in Tabelle 10
beschrieben. Abweichend zum Thermocycler-Programm in Tabelle 11 betrug die
Annealing-Temperatur in dieser Reaktion 55 °C und die Elongations-Zeit 0,5 min.
2.11.4 Untersuchung der 26S rDNA-Sequenzen
Die Amplifizierung und Sequenzierung der 26S rDNA-Sequenzen wurde bei den fünf
Brettanomyces/Dekkera-Typstämmen (Tab. 7) und dem Isolat D. bruxellensis St. 579
durchgeführt. Für die PCR Reaktionen wurden Primer in konservierten Sequenzbereichen
generiert. Der Forward-Primer For-26S-1 sollte durch Sequenzvergleiche der ITS1/ITS4
PCR-Produkte direkt hinter die ITS-Region an den Anfang der 26S rDNA gelegt werden.
Der Reverse-Primer Rev-26S-2 wurde ebenso wie die Sequenzier-Primer durch den
Vergleich mit hinterlegten LSU rRNA-Gensequenzen verschiedener Hefen und
Ascomyceten in konservierte Regionen gelegt. Abweichend zum PCR-Programm in
Tabelle 11 betrug bei der PCR zur Amplifizierung der 26S rDNA-Sequenzen die
Annealing-Temperatur 50 °C und die Elongations-Zeit 3,5 min.
2.11.5 Agarose-Gelelektrophorese
Durch Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung konnte die erfolgreiche
Amplifizierung der Gensequenzen überprüft werden. Hierzu wurde Agarose in 1x TBE-
Puffer aufgekocht und das Gel in eine Form gegossen in die ein Kamm eingesetzt wurde.
Nachdem das Gel abgekühlt war und sich verfestigt hatte, wurde der Kamm entfernt und das
Agarose-Gel in eine mit 1 x TBE-Puffer gefüllte Elektrophorese-Kammer eingesetzt. In die
Geltaschen wurden jeweils 5µl PCR-Produkt, gemischt mit 1 µl 6x Ladepuffer, pipettiert.
Die Elektrophorese erfolgte bei einer Spannung von 95 V für 20 - 30 min. Anschließend
2. MATERIAL UND METHODEN 46
wurde das Gel mit Ethidiumbromid-Lösung (1 mg/l) angefärbt (30 min). Die Auswertung
erfolgte unter UV-Licht (312 nm) mit einem Transilluminator und wurde photographisch
dokumentiert (Geldokumentationseinheit Polaroid, Offenbach mit Bedingungssoftware
Intas, Göttingen).
2.11.6 Aufreinigung der PCR-Produkte
Die PCR-Produkte wurden vor der Sequenzierung mit dem QIAquick® PCR Purification Kit
(Qiagen, Hilden) nach Anweisung des Herstellers aufgereinigt. Dadurch wurden
unerwünschte PCR-Rückstände wie Primer, dNTPs und Taq-Polymerase entfernt, die sich
negativ auf die Sequenzierung auswirken können.
2.11.7 Sequenzierung
Die Sequenzierung der aufgereinigten PCR-Produkte erfolgte nach der Didesoxy-Methode
(Sanger et al. 1977) mit den jeweiligen PCR-Primern und wurde von den Firmen
Genterprise (Mainz), MWG (Martinsried) und Brain (Zwingenberg) als Auftragsarbeit
durchgeführt.
2.11.8 Sequenzanalyse
Neu identifizierte DNA-Sequenzen wurden mit hinterlegten Sequenzen aus der NCBI
Datenbank (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) verglichen (Blast-Suche). Zur
Generierung von Primern, fluoreszenzmarkierten Sonden sowie zur phylogenetischen
Analyse wurden Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Programm ClustalX 1.83
(Thompson et al. 1997) erstellt.
2.11.9 Generierung phylogenetischer Stammbäume
Die Berechnung und Konstruktion von phylogenetischen Stammbäumen erfolgte mit den
Programmen PHYLIP Package 3.65 (Felsenstein 1989) und Tree View 1.6.6 (Page 1996).
Zur statistischen Absicherung wurden Bootstrap-Analysen durchgeführt (Felsenstein 1989)
und aus den Datensätzen ein Konsensus-Baum erstellt. Der Bootstrap-Wert gibt für jede
Verzweigung an, wie oft sie aus den Datensätzen berechnet werden konnte. Für die
Generierung des phylogenetischen Stammbaums auf Basis der ITS-Regionen wurde eine
Sequenz von S. cerevisiae (Acc. Z95939) als Außengruppe miteinbezogen. Für die
Erstellung des 26S rDNA-basierenden Baums wurde die Sequenz von S. cerevisiae (Acc.
J01355) als Außengruppe verwendet.
2. MATERIAL UND METHODEN 47
2.12 rRNA-Sekundärstrukturen
Eine Umwandlung der ribosomalen RNA-Sekundärstruktur eines verwandten Organismus
(Saccharomyces cerevisiae) in die Sekundärstruktur der untersuchten Sequenz
(Brettanomyces/Dekkera spp.) kann bei ausreichender Sequenzhomologie vorgenommen
werden. Die Generierung von LSU rRNA-Sekundärstrukturen auf der Basis einer bereits
bekannten rRNA-Sekundärstruktur erfolgte in einer komplexen Abfolge mehrerer
Programmierungs- und Formatierungsschritte mit den Programmen ClustalX 1.83
(Thompson et al. 1997), Microsoft Word und Excel, sowie GSview 4.4 und RNAstructure
4.2 (Mathews et al. 2004). Das Prinzip und die genaue Durchführung basierten im
Wesentlichen auf den Arbeiten von Fröhlich (1999) und Hirschhäuser (2002, 2005). Im
Folgenden wird die Vorgehensweise erläutert und die Abfolge zusammenfassend
beschrieben.
� Download der bereits bekannten LSU rRNA-Sekundärstruktur der nahe verwandten
Hefe Saccharomyces cerevisiae von der Homepage des Institute for Cellular and
Molecular Biology and The Section for Integrative Biology, University of Texas
(http://www.rna.ccbb.utexas.edu, Gutell et al. 1993, Cannone et al. 2002) und der
zugehörigen Sequenz (Acc. U53879; Johnston et al. 1997) von der NCBI (National
Center of Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.com) Datenbank.
� Umformatierung der rDNA-Sequenzen in rRNA-Sequenzen durch Austausch von T
(Thymin) gegen U (Uracil).
� Sequenz-Alignment der bekannten rRNA-Sequenz (S. cerevisiae) mit der rRNA-
Sequenz der zu generierenden Sekundärstruktur (Brettanomyces/Dekkera) mit ClustalX
1.83.
� Programmierung und Einfügen der Sequenzhomologien und -unterschiede, sowie
Löschen und Einfügen von Koordinaten bei Basen-Deletionen bzw. -Insertionen in MS
Excel.
2. MATERIAL UND METHODEN 48
� Einfügen der geänderten Sequenz, der neuen Koordinaten und der Befehle zur farblichen
Markierung von Sequenzunterschieden in das Programm der ursprünglichen
Sekundärstruktur.
� Graphische Darstellung in GSview 4.4 und Korrektur der Bindungszeichen in
doppelsträngigen rRNA-Bereichen, sowie Änderung des Layouts in MS Word zur
Berücksichtigung von Insertionen und Deletionen.
Nach der oben beschriebenen Vorgehensweise wurden neue, Art-spezifische 26S rRNA-
Sekundärstrukturen für alle fünf Brettanomyces/Dekkera-Arten (Typstämme, Tab. 7)
generiert. Dabei erfolgte die Konstruktion der ersten neuen Sekundärstruktur für
D. anomala (DSM 70732T) auf Basis der ursprünglichen Sekundärstruktur von S.
cerevisiae. Alle weiteren Strukturen wurden für jede Brettanomyces/Dekkera-Art
nacheinander anhand der jeweils vorher generierten Sekundärstruktur erstellt (Röder et al.
2007a). Hochvariable Bereiche in den 26S rRNA-Sekundärstrukturen wurden unter
Verwendung des Programms RNAstructure 4.2 (Zuker 2000) neu gefaltet und konnten
somit ihrem nativen Zustand annähernd dargestellt werden. Die konformative
Determination konservierter Bereiche begrenzt den Spielraum der neu zu berechnenden
Faltungen soweit, dass ein auf thermodynamischen Algorithmen basierende
Faltungsprogramm eine realistische Sekundärstruktur generiert (Fröhlich, persönliche
Mitteilung). Die Strukturänderungen konnten durch Verschieben der Koordinaten-Punkte,
die die genaue Position jeder Base in der zweidimensionalen Darstellung festlegen in MS
Excel übernommen werden.
2.13 Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonden
Ein Sequenzvergleich der vollständigen LSU rRNA Gene von D. anomala, D. bruxellensis,
B. custersianus, B. naardsenensis, B. nanus und S. cerevisiae wurde mit ClustalX 1.83
durchgeführt. Das Sequenzalignment und die Informationen aus den Sekundärstrukturen
bezüglich der zweidimensionalen Anordnung der Sequenzen wurden in Kombination
verwendet, um potentielle Art-spezifische Zielregionen für Oligonukleotid-Sonden zu
lokalisieren. Die Sequenzen der Sonden sind hierbei revers komplementär zu ihrer
2. MATERIAL UND METHODEN 49
N
CH3CH3
Oligonukleotid-Sequenz-3'
N+
CH3CH3
OH Cy3
Zielregion. Wenn möglich, wurden Zielsequenzen ausgewählt, die teilweise komplementär
zueinander oder direkt benachbart waren, um die in situ Zugänglichkeit der rRNA in dieser
Region für die Sonden gemäß dem Helfer-Sonden-Prinzip (Fuchs et al. 2000) und dem
Gemeinschafts-Sonden-Effekt (Fröhlich & König 2002, Fröhlich et al. 2003, Hirschhäuser
et al. 2005, Röder et al. 2007a) zu verbessern. Durch Variation der Sequenzlängen konnten
die mittleren Schmelztemperaturen (Tm) von Sonden, die in Kombination eingesetzt werden
sollten, aufeinander abgestimmt werden. Zur Überprüfung der Spezifität der
Sondensequenzen für die jeweilige Brettanomyces/Dekkera-Art wurde ein
Datenbankvergleich (NCBI, BLAST-Suche) durchgeführt. Darüber hinaus erfolgte eine
Überprüfung der Sondensequenzen auf Komplementarität zu sich selbst und zu möglichen
Gemeinschafts-Sonden über ein online-Programm (Oligo Analysis & Plotting Tool,
http://www.operon.com/oligos/toolkit.php). Die am 5’-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Cy3 (Abb. 9) markierten Oligonukleotide wurden von MWG (Ebersberg)und Operon (Köln)
synthetisiert und mit HPLC gereinigt.
Abb. 9. Struktur des Fluoreszenzfarbstoffs 5-N, -Ethyl-N’-Caprylsuccinimidtetramethylindocarbocyanin
(Cy3) als Markierung für Oligonukleotid-Sonden.
2.14 Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wird das Signal (Fluoreszenzlicht) direkt
im biologischen Präparat (in situ) generiert. Sie dient in der vorliegenden Arbeit der
spezifischen Detektion und Identifizierung von Hefen der Gattungen Brettanomyces/
Dekkera in der Mikroflora von Weinproben bzw. in künstlichen Mischungen aus
verschiedenen Hefen und Bakterien. Das Prinzip der FISH besteht in der Anlagerung von
Oligonukleotid-Sonden, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, an spezifische
2. MATERIAL UND METHODEN 50
Nukleinsäuresequenzen in der Zelle (Leitch et al. 1994). In dieser Arbeit wurde die FISH
mit Cy3-markierten DNA-Sonden durchgeführt, deren Sequenzen komplementär zur
Basenabfolge von Zielregionen der 18S (SSU) ribosomalen RNA bzw. der 26S (LSU)
rRNA von Brettanomyces/Dekkera-Hefen waren. Das Sondensignal wurde nach Anregung
des Fluoreszenzfarbstoffes im Präparat über Epifluoreszenzmikroskopie dargestellt. Als
Negativ-Kontrollen wurden bei der Überprüfung der 18S rRNA-gerichteten Sonden auch
Zellen von Saccharomyces cerevisiae und Oenococcus oeni (Tab. 9) hybridisiert.
2.14.1 Präparation der Zellen
Jeweils 1 ml der auf Brettanomyces zu untersuchenden Probenlösung bzw. der
Zellsuspension wurde in 1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg) überführt und bei
5000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Mikroorganismen in 500 µl
deion. Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Anschließend erfolgte die Resuspension
in 1 ml Waschpuffer. Jeweils 5 µl der Suspension wurden gleichmäßig auf die Felder eines
teflonbeschichteten Diagnostik-Objektträgers (Abb. 10 a) aufgetragen. Nach dem
Antrocknen bei RT erfolgte eine Fixierung der Zellen auf dem Objektträger für 10 min bei
90 °C. Direkt im Anschluss an diese Hitzefixierung wurde das Präparat in aufsteigender
Reihenfolge mit 50 Vol. % und 70 Vol. % wässrigen Ethanol-Gemischen und abschließend
zweimal mit 96 Vol. % Ethanol für jeweils 5 min entwässert und dann luftgetrocknet.
2.14.2 Vorbehandlung der Oligonukleotid-Sonden
Vor der Hybridisierungsreaktion wurden die Sonden in Form einer Hybridisierungslösung
direkt auf das vorbereitete biologische Präparat gegeben. Diese enthielt Salze, Dextransulfat
und Natriumdodecylsulfat. Die gelösten Salze bestimmen die Ionenstärke der Lösung und
wirken stabilisierend auf Nukleinsäure-Doppelstränge. Dextransulfat ist ein Polymer mit
hohem Molekulargewicht, das die Geschwindigkeit der Hybridisierung erhöht (Leitch et al.
1994). Natriumdodecylsulfat (SDS) erleichtert als Tensid das Eindringen der Sonden in die
Zelle durch Permeabilisierung der Cytoplasmamembran.
In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf, Hamburg) wurden 45 µl Hybridisierungspuffer
mit 5 µl Sondenmischung (äquimolar) gemischt und für 15 min bei 70 °C im Heizblock
denaturiert. Dies verhindert mögliche Basenpaarungen innerhalb einer sowie zwischen
verschiedenen Sonden. Da die Fluoreszenzmarkierung (Cy3) lichtempfindlich ist, erfolgten
alle Versuchsabläufe mit den Sonden im Dunkeln.
2. MATERIAL UND METHODEN 51
2.14.3 Hybridisierung
Das denaturierte Sonden-Lösungsgemisch wurde direkt nach dem Verdampfen des Ethanols
gleichmäßig auf den Objektträger aufgetragen und mit einem Deckglas (24 x 60 mm)
abgedeckt. Der abgedeckte Objektträger wurde anschließend in eine vorgewärmte
Hybridisierungskammer (50 ml Greiner Reaktionsgefäß, Abb. 10 b) gelegt, die zuvor mit
einem befeuchteten (Waschpuffer) Filterpapierstreifen versehen worden war und im
Hybridisierungsofen bei der jeweils benötigten Hybridisierungstemperatur für mindestens
3 h oder ü. N. inkubiert.
Abb. 10. Teflon-beschichteter Diagnostik-Objektträger mit 12 Proben-Fenstern (a) und Hybridisierungs-
kammer mit Objektträger (b) für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung.
2.14.4 Nachbehandlung des Präparats
Nach erfolgter Hybridisierung wurde das Deckglas entfernt und der Objektträger zweimal
bei der jeweils benötigten Waschtemperatur in jeweils 50 ml vorgewärmten Waschpuffer
für 10 min unter stringenten Bedingungen inkubiert. Die Waschtemperaturen lagen hierbei 1
bis 4 °C (Tab. 14) über den Hybridisierungstemperaturen. Danach erfolgte die Gegen-
färbung des Präparats mit DAPI. Dazu wurde der noch feuchte Objektträger mit 50 µl
DAPI-Lösung überschichtet und mit einem Deckglas abgedeckt. Nach 15 min Inkubation
bei Raumtemperatur erfolgte nach dem Entfernen des Deckglases ein kurzer Waschschritt
mit deion. Wasser. Danach wurden 50 µl DABCO aufgetragen und das Präparat wieder mit
einem Deckglas versehen. Bis zur mikroskopischen Auswertung erfolgte die Aufbewahrung
des Objektträgers im Dunklen.
(a) (b)
2. MATERIAL UND METHODEN 52
2.14.5 Eigenschaften von DAPI und DABCO
Der Fluoreszenzfarbstoff DAPI (Abb. 11 a) interkaliert in doppelsträngige DNA (Tanious et
al. 1992) und bindet an Proteinen und färbt somit alle vorhandenen prokaryotischen und
eukaryotischen Zellen. DAPI wird durch UV-Licht angeregt (Absorptionsmaximum: 385
nm) und emittiert blaues Licht (Emissionsmaximum: 461 nm). Der Einsatz von DABCO
(Abb. 11 b) beruht auf der Eigenschaft, Fluoreszenzsignale weniger schnell ausbleichen zu
lassen (Leitch et al. 1994). Die Verbindung wirkt hierbei als Antioxidans.
Abb. 11. Molekülstrukturen von (a) 4’, 6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) und (b) 1, 4-
Diazabicylo-[2.2.2]oktan bzw. Triethyldiamin (DABCO).
2.14.6 Fluoreszenzmikroskopie
Die Auswertung der Hybridisierung erfolgte mit einem Epifluoreszenzmikroskop
Axiophot 2 (Zeiss, Göttingen; Abb. 12 a) bei 400- bzw. 1000-facher Vergrößerung. Bei der
Epifluoreszenzmikroskopie (Abb. 12 b) trifft das Licht zur Anregung des Sonden-Farbstoffs
von oben durch den Filterblock und das Objektiv auf das Präparat. Die emittierte,
längerwellige Fluoreszenz-Strahlung gelangt durch das Objektiv und den Filterblock zu dem
Okular. Für die jeweiligen Farbstoffe wurden die entsprechend geeigneten Filterblöcke
verwendet (vgl. Tab. 3). Mit dem für Cy3 und DAPI konstruierten Kombinationsfilter 28
(Zeiss, Göttingen) konnten beide Signale parallel sichtbar gemacht werden. Die
mikroskopischen Abbildungen wurden mit einer Digitalkamera (Coolpix 4500, Nikon,
Tokyo) direkt über das Okular photographisch dokumentiert.
N
NNH
NH2
NH2+
NH2
NH2+ Cl
-
Cl-
DAPI DABCO(a) (b)
2. MATERIAL UND METHODEN 53
Abb. 12. Epifluoreszenzmikroskop Axiophot 2 (a) von Zeiss (Göttingen) und schematische Darstellung des
Strahlengangs (b). Die verwendeten Filterblöcke (vgl. Tab. 3) bestehen jeweils aus den drei Komponenten
Anregungsfilter, dichroischer Teilerspiegel und Emissionsfilter (siehe auch Kapitel 1.4).
2.15 Vitalitätsfärbungen
Neben der Detektion und Identifizierung von Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera
ist die Differenzierung von toten und lebenden Zellen ein wichtiges Indiz für die
Beurteilung der tatsächlichen Kontamination bzw. Infektion im Wein. Die
Stoffwechselaktivität und folglich die Bildung der sensorisch auffälligen
Sekundärmetabolite durch die Hefe-Zellen können so besser abgeschätzt werden. In dieser
Arbeit wurden verschiedene Vitalitätsfärbungen bezüglich der Anwendbarkeit auf
Brettanomyces/Dekkera-Hefen überprüft. Die Lebend-/Totzellen-Differenzierungen
erfolgten mit Reinkulturen verschiedener D. bruxellensis-Stämme parallel zur Fluoreszenz
in situ Hybridisierung. Zur gezielten Abtötung von Hefen für die Anfärbung toter Zellen
wurde das in der Weinbereitung gebräuchliche Produkt „Kadifit“ (Erbslöh, Geisenheim)
verwendet. Bei Kadifit (E 224) handelt es sich um reines Kaliumdisulfit (K2S2O5) zur
(a) (b)
Epifluoreszenz- beleuchtung
Anregungsfilter
Emissionsfilter
Dichroischer Teilerspiegel
Filterblock
Mikroskop- Objektiv
Präparat
Mikroskop- Okular
2. MATERIAL UND METHODEN 54
Schwefelung von Maische, Most und Wein. Kadifit wurde in einer Konzentration von
1 mg/ml eingesetzt.
Sowohl bei Flüssigansätzen, als auch bei hitzefixierten Präparaten, wurden nach den
Fluoreszenzfärbungen einige µl DABCO auf die gefärbten Zellsuspensionen gegeben, um
ein zu schnelles Ausbleichen zu verhindern.
2.15.1 Färbung mit Fun 1 und Calcofluor White
Die Hefezellen wurden mit dem Live/Dead Yeast Viability Kit nach den Anweisungen des
Herstellers (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) angefärbt. Hierbei bilden nur die
stoffwechselaktiven Zellen mit intakter Cytoplasmamembran durch den
Fluoreszenzfarbstoff Fun 1 (Abb. 13 a) die charakteristischen rot-fluoreszierenden
Strukturen in den Vakuolen der Zellen aus (Lloyd & Hayes 1995). Calcofluor White
(Abb. 13 b) ist ein, im UV-Bereich anregbarer Farbstoff der die Zellwände insbesondere
von Pilzen und Hefen anfärbt (Mazzoni et al. 1993).
Abb. 13. Molekülstrukturen von (a) 2-Chlor-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methyliden)-1-
phenylquinolinium Iodid (Fun1) und (b) Fluorescent Brightener 28 (Calcofluor White).
NH
N
N
N
NOHOH
NH
S OH
O
O
CH CH
SO
OOH
NH
N
N
N
NOH OH
NH
Calcofluor White
N+
S
CH3
N
Cl
Fun1(a)
(b)
I-
2. MATERIAL UND METHODEN 55
2.15.2 Färbung mit Fluoresceindiacetat
Fluoresceindiacetat (FDA, Abb. 14) ist eine Verbindung, die erst nach einer Esterspaltung
als Fluoreszenzfarbstoff wirksam wird. Durch Esterase-Aktivität in der stoffwechselaktiven
Zelle kann FDA in freies Fluorescein umgewandelt werden (Rotman & Papermaster 1966).
Fluorescein ist ein Triphenylmethan-Farbstoff aus der Gruppe der Phthalsäurefarbstoffe. In
vitalen Zellen emittiert FDA nach Abspaltung der beiden Acetat-Gruppen bei Anregung mit
blauem Licht grünes Fluoreszenzlicht (Tab. 3). Die Hefesuspensionen (1 ml) wurden mit
10 µl FDA-Lösung [1 mg/ml, in Dimethylsulfoxid (50 %, in deion. Wasser)] versetzt und
mindestens 1 h bei RT inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren (5 min, 7000 rpm) erfolgte ein
kurzer Waschschritt mit deion. Wasser. Die Zellen wurden anschließend in deion. Wasser
resuspendiert und sofort mikroskopisch untersucht.
Abb. 14. Molekülstruktur von Fluoresceindiacetat (FDA).
2.15.3 Färbung mit SYTOX Green
SYTOX Green (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der
ähnlich wie DAPI oder Ethidiumbromid in die doppelsträngige DNA von Pro- und
Eukaryoten interkaliert. Da die Cytoplasmamembran von lebenden Zellen für SYTOX
Green in der Regel nicht permeabel ist, werden nur Nukleinsäuren in toten Zellen angefärbt
(Lebaron et al. 1998). Ebenso wie FDA emittiert SYTOX Green bei Anregung mit blauem
Licht in den Zellen grünes Fluoreszenzlicht (Tab. 3). Eine Molekülstruktur des Farbstoffs
konnte nicht ermittelt werden. Die Anfärbung der Hefezellen erfolgte nach den Vorgaben
des Herstellers. Hierzu wurden Hefe-Suspensionen (in 0,9 % Natriumchlorid-Lösung) mit
SYTOX Green (5 mM Lösung in Dimethylsulfoxid) in einer Konzentration von 25 µM
O
CH2Cl
O O
O
CH3 O O CH3
O
FDA
2. MATERIAL UND METHODEN 56
versetzt und 10 min bei RT inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden anschließend mit dem
Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
2.16 Physiologische Art- und Stamm-Differenzierung
Hefen können nicht nur durch molekularbiologische Methoden wie Gensequenz-Analysen
oder FISH (diese Arbeit), sondern auch durch Untersuchung ihrer physiologischen
Eigenschaften differenziert werden.
2.16.1 Biolog YT Mikrotiterplatten-Test
Der YT MicroPlateTM Test (Biolog Inc., Hayward, USA) bietet die Möglichkeit zur
Identifizierung und Charakterisierung von verschiedenen Hefe-Spezies. In dieser Arbeit
sollte die Methode darüber hinaus zur Differenzierung auf Stamm-Niveau verwendet
werden. Die Durchführung der Tests erfolgte nach den Angaben des Herstellers
(http://www.biolog.com/pdf/YT%20chart.pdf). Alle untersuchten Brettanomyces/Dekkera-
Stämme wurden vor dem Test drei Tage lang auf YPG-Agarplatten ohne Cycloheximid
kultiviert. Die Zellen wurden nach der Ernte in sterilem deion. Wasser resuspendiert und die
Zelldichte der Suspension über photometrische Messung bei einer Wellenlänge von 578 nm
auf einen vom Hersteller vorgegebenen Standard eingestellt. Anschließend wurden jeweils
100 µl der Zellsuspension in die 96 Vertiefungen der Biolog YT Mikrotiterplatten gegeben,
die verschiedene Kohlenstoff-Quellen enthielten (Anhang). Nach einer Anfangs-Messung
(T = 0 h) mit dem Mikrotiterplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 620 nm und der
Analyse-Software MikroWin 2000 erfolgten die weiteren photometrischen Messungen nach
72 h. Die Platten wurden während dieser Zeit bei 30 °C inkubiert. Da einige Hefe-Arten
durch den im Testsystem verwendeten Redox-Farbstoff Tetrazolium-Violett gehemmt
werden könnten, sind die YT Mikrotiterplatten sowohl mit Oxidations- als auch mit
Assimilations-Tests bestückt. Tetrazolium-Violett diente in den Tests als kolorimetrischer
Indikator für die Oxidation eines Substrats. Die Tests zur Assimilation von verschiedenen
Kohlenstoffquellen wurden turbidimetrisch ausgewertet. Nach den photometrischen
Messungen wurden die Daten (Extinktionswerte) als Stoffwechselmuster graphisch
dargestellt und zur Untersuchung der verwandtschaftlichen Verhältnisse für eine Cluster-
Analyse mit dem PHYLIP Package 3.65 (Felsenstein 1989) verwendet.
3. ERGEBNISSE 57
3. Ergebnisse
3.1 DNA-Sequenzanalysen bei Brettanomyces/Dekkera
Abb. 15. Schematische Darstellung des repetitiven, ribosomalen Gen-Clusters in Eukaryoten. Die 26S/28S
und die 5.8S rDNAs kodieren für die rRNAs der großen ribosomalen Untereinheit (LSU). Die 18S rDNA
kodiert für die rRNA der kleinen ribosomalen Untereinheit (SSU). Zwei Internal Transcribed Spacer (ITS) -
Regionen umgeben die 5.8S rDNA. Die Bindungspositionen der verwendeten Forward- und Reverse-Primer
sind durch Pfeile dargestellt.
3.1.1 18S rDNA-Sequenzen
Um die verwandtschaftlichen Verhältnisse der fünf bisher bekannten
Brettanomyces/Dekkera-Arten darstellen zu können, wurden zunächst hinterlegte 18S
rDNA-Sequenzen der Hefen miteinander verglichen. Die phylogenetische Analyse der SSU
rDNA-Sequenzen aus der NCBI-Datenbank zeigte die enge Verwandtschaft der
verschiedenen Brettanomyces/Dekkera-Arten. Das Alignment (Daten hier nicht gezeigt) der
hinterlegten Sequenzen ermöglichte zwar eine Differenzierung von D. bruxellensis, B.
custersianus, B. naardenensis und B. nanus, aber die Art D. anomala unterschied sich nur in
9 Basen innerhalb der ca. 1,8 kb großen Gensequenz von der nächstverwandten Art D.
bruxellensis. Die große Homologie der bisher untersuchten geringen Anzahl an 18S rDNA-
Sequenzen ließ daher nur eine kleine Auswahl von Gattungs-spezifischen Sonden für die
Fluoreszenz in situ Hybridisierung zu. Die 18S rDNA-Sequenzen aus mehreren
26S/28S rDNA18S rDNA ITS-Region
ITS 1 5.8S rDNA ITS 2
Oxy 5.1 ITS1
ITS2
Rev-26S-2 ITS4
For-26S-1
3. ERGEBNISSE 58
Eigenisolaten wurden auch hinsichtlich ihrer Mikroheterogenität auf Stamm-Niveau
untersucht. Durch die Sequenzierung von ca. 700 bp der ca. 1,8 kb großen PCR-Amplifikate
mit den Primern Oxy 5.1 und ITS 2 (Abb. 15 u. 16) und eine anschließende Datenbanksuche
(BLAST, NCBI/GenBank) konnten fünf von sechs Isolaten eindeutig als Dekkera
bruxellensis identifiziert werden. Bei einem Isolat handelte es sich um eine verwandte Hefe
(Candida spec.). Ein Sequenzvergleich unter den fünf D. bruxellensis-Stämmen ergab eine
Identität von 100 % in dem untersuchten 18S rDNA-Sequenzbereich.
Abb. 16. PCR-Produkte der 18S rDNA-Sequenzen von den Isolaten St. 9A (1), St. 18 (2), St. 30A (3), St. 34A
(4), St. 34B (5) und St. 35A (6) nach Amplifizierung mit den Primern Oxy 5.1 und ITS 2. Längenstandard M:
Lambda DNA / EcoRI+HindIII. Bei Isolat St. 18 (2) handelte es sich um Candida spec., bei allen anderen
Isolaten um Stämme von D. bruxellensis.
3.1.2 ITS-Regionen
Die ITS-Regionen von allen Brettanomyces/Dekkera-Typstämmen sowie von sechs Isolaten
aus Wein- und Sekt-Proben (Tab. 6) konnten mit den Primern ITS 1 und ITS 4 amplifiziert
werden (Abb. 15 u. 17). Nach der Sequenzierung der PCR-Produkte konnte ein
Sequenzvergleich mit dem Programm ClustalX 1.83 durchgeführt werden und die ITS-
Regionen der Stämme hinsichtlich ihrer Homologie bzw. Variabilität miteinander
verglichen werden (siehe Anhang 8.1.1). Die Ergebnisse von phylogenetischen Analysen
mit PHYLIP (Felsenstein 1989) konnten graphisch in einem Konsensus-Stammbaum
(Abb. 18) unter Verwendung von Tree View 1.6.6 (Page 1996) dargestellt werden. Sowohl
durch den Vergleich mit NCBI-Datenbank-Sequenzen als auch durch ihre Position im
phylogenetischen Baum ließen sich die untersuchten Isolate eindeutig als Stämme der Art
Dekkera bruxellensis identifizieren. Im Gegensatz zur 5.8S rDNA, die bei den
Brettanomyces/Dekkera-Hefen nur sehr wenige Art-spezifische Nukleotide aufwies, zeigten
ca. 1,8 kb
M 1 2 3 4 5 6 M
3. ERGEBNISSE 59
die ITS 1 und ITS 2-Bereiche eine hohe Sequenz-Variabilität. Die 5.8S rDNA, der ITS 1
und der ITS 2-Bereich waren in allen untersuchten D. bruxellensis-Stämmen konserviert
(≥ 99% Sequenzhomologie).
Abb. 17. PCR-Produkte der ITS-Regionen von der Positiv-Kontrolle S. cerevisiae St. 43 (1) und den D.
bruxellensis- Isolaten St. 374 (2), St. 566 (3), St. 567 (4), St. 568 (5), St. 573 (6), St. 579 (13), sowie den
Typstämmen von D. anomala (8), D. bruxellensis (9), B. custersianus (10), B. nanus (11) und B. naardenensis
(12) nach Amplifizierung mit den Primern ITS 1 und ITS 4. Längenstandard M: GeneRulerTM 100 bp DNA
ladder.
Abb. 18. Phylogenetischer Stammbaum auf Basis der ITS-Regionen von Dekkera/Brettanomyces-Arten und
D. bruxellensis-Stämmen (St.) mit Saccharomyces cerevisiae als Außengruppe. Der Konsensus-Baum wurde
aus 100 Maximum Likelihood-Bäumen unter Einbeziehung von 304 Alignment-Positionen berechnet. Drei
verschiedene Bootstrap-Analysen dienten der statistischen Absicherung: Parsimony, Neighbor-Joining, und
Maximum Likelihood. Der Maßstrich entspricht einer phylogenetischen Distanz von 10 %.
ca. 500 bp
M 1 2 3 4 5 6 M 8 9 10 11 12 13 M
S. cerevisiae (Acc. Z95939)
B. custersianus (CBS 4805T)
B. nanus (CBS 1945T)
D. anomala (DSM 70732T)
St. 567
St. 374
St. 568D. bruxellensis (DSM 70001T)
St. 579St. 573
St. 566
0.1
B. naardenensis (CBS 6042T)
100/100/99
56/63/71
72/82/65100/100/-
100/-/97
* * 62/62/64
3. ERGEBNISSE 60
3.1.3 26S rDNA-Sequenzen
Für die Untersuchung der 26S rDNA standen für Hefen der Gattungen
Brettanomyces/Dekkera nur Teilsequenzen der D1/D2-Region in der NCBI-Datenbank zur
Verfügung. Die hinterlegten Sequenzen waren teilweise von geringer Qualität, mit
mehrdeutigen Basenzuordnungen. Dennoch gilt diese Region als besonders geeignet, Hefen
auf Artniveau zu unterscheiden (Kurtzman & Robnett 1998). Die vollständige
Sequenzierung der 26S rDNAs aus den bisher bekannten Brettanomyces/Dekkera-Arten
sollte in dieser Arbeit der Generierung von artspezifischen DNA-Sonden auf der Basis von
rRNA-Sekundärstrukturen dienen.
Zur Amplifizierung der 26S rDNA-Sequenzen wurde ein Forward-Primer generiert, der in
konservierten Sequenzbereichen innerhalb der Gattungen Brettanomyces/Dekkera bindet.
Hierzu wurden die 3’-Bereiche der sequenzierten ITS-Regionen aller Typstämme und D.
bruxellensis-Institutsstämme miteinander verglichen (ClustalX-Alignment; Abb. 19 a). Bei
der Untersuchung der ITS-Regionen konnten auch die angrenzenden 5’-Enden der 26S
rDNAs amplifiziert und sequenziert werden. Der Reverse-Primer wurde in einen Bereich
am 3’-Ende des Gens gelegt, der in verschiedenen Ascomyceten konserviert ist (Abb. 19 b).
Die Gen-Sequenzen von Candida albicans (Acc. X70659), Saccharomyces cerevisiae
(Acc. J01355), Endomyces fibuliger (Acc. U09238) und Schizosaccharomyces japonicus
(Acc. Z32848) waren in der NCBI-Datenbank (GenBank) hinterlegt. Durch Variation der
Sequenzlänge konnten die Schmelztemperaturen der zwei Primer aufeinander abgestimmt
werden. Die mittleren Schmelztemperaturen der Primer For-26S-1 und Rev-26S-2 sind in
Tabelle 4 dargestellt.
3. ERGEBNISSE 61
CTCAAATCAGGTAGGAGG
ITS 2 26S rDNA
For-26S-1
(a)
26S rDNA
CATCGGAACAACAATGCRev-26S-2
(b)
St. 374 ...CCCCAGTTACC-AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... St. 566 ...CCCCAGTTACC-AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... St. 568 ...CCCCAGTTATC-AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... St. 567 ...CCCCAGTTACC-AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... St. 573 ...CCCCAGTTATC-AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... St. 579 ...CCCCAGTTATC-AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... D. bruxellensisT ...CCCCAGTTATC-AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... D. anomalaT ...CCCCAATTTTCTAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... B. custersianusT ...----------CTACGATTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... B. naardenensisT ...AATGA--CCTTGACGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... B. nanusT ...----------TTAATTGCCACCTCAAATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAA... * ***********************************
C. albicans ...ACAACGGAGTATTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTACGATC-TGC-TG...3437 (Acc. X70659) S. cerevisiae ...ACAACGGGGTATTGTAAGCGGTAGAGTAGCCTTGTTGTTACGATC-TGC-TG...3911 (Acc. J01355) E. fibuliger ...ACAACGGGGTATTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTACGATC-TGC-TG...3817 (Acc. U09238) S. japonicus ...GGAACGGGGTATTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTACGATCCTGCCTG...3414 (Acc. Z32848) ***** ************************************* *** **
Abb. 19. Generierung des Forward- (a) und des Reverse-Primers (b) in konservierten Sequenzbereichen zur
Amplifizierung der 26S rDNA von Brettanomyces/Dekkera spec. Am 5’-Ende der 26S rDNA (a) wurden die
ITS-Sequenzierergebnisse der Brettanomyces/Dekkera-Typstämme (T) und der D. bruxellensis-Isolaten (St.)
miteinander verglichen. Für die Suche von konservierten Regionen am 3’-Ende der 26S rDNA wurden
hinterlegte Sequenzen aus der NCBI-Datenbank von Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Endomyces
fibuliger und Schizosaccharomyces japonicus miteinander verglichen (b).
3. ERGEBNISSE 62
Abb. 20. PCR-Produkte der 26S rDNA-Sequenzen von den Typstämmen (1) Dekkera anomala (DSM
70732T), (2) D. bruxellensis (DSM 70001T), (3) Brettanomyces custersianus (CBS 4805T), (4) B. nanus (CBS
1945T), (5) B. naardenensis (CBS 6042T) und dem Isolat (6) D. bruxellensis 579 nach Amplifizierung mit den
Primern For-26S-1 und Rev-26S-2. Längenstandard M: Lambda DNA / EcoRI+HindIII.
Die ca. 3,4 kb großen PCR-Produkte der 26S rDNA-Sequenzen (Abb. 20) wurden
aufgereinigt und konnten schrittweise mit 14 Sequenzier-Primern (Tab. 4), die in
konservierten Regionen von hinterlegten Sequenzen verschiedener Ascomyceten (Abb. 19 b)
binden, in beiden Richtungen als Auftragsarbeit (Brain, Zwingenberg) sequenziert werde.
Die Nukleotid-Sequenzen der 26S rDNAs wurden bei GenBank in der NCBI-Datenbank
hinterlegt.
Tab. 12. Hefe-Stämme und GenBank-Zugriffsnummern der 26S rDNA-Sequenzen
Art Stamm Herkunfta Zugriffsnummer (Acc.)
D. anomala DSM 70732T DSMZ DQ406714
D. bruxellensis DSM 70001T DSMZ DQ406715
D. bruxellensis St. 579 AG Henick-Kling DQ406716
B. custersianus CBS 4805T CBS DQ406717
B. nanus CBS 1945T CBS DQ406718
B. naardenensis CBS 6042T CBS DQ406719
a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig; Cornell
University, Department of Food Science and Technology (AG Henick-Kling) in New York
(USA); Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) in Utrecht (Niederlande). T = Typstamm.
M 1 2 3 4 5 6 M
ca. 3,4 kb
3. ERGEBNISSE 63
Auf Basis der 26S rDNA-Sequenzen (siehe Anhang 8.1.2) von allen fünf
Brettanomyces/Dekkera-Arten und von Saccharomyces cerevisiae (Acc. J01355) konnte
nach dem Sequenzvergleich (ClustalX 1.83) eine phylogenetische Analyse mit PHYLIP
(Felsenstein 1989) durchgeführt werden. Der phylogenetische Baum (Abb. 21) wurde mit
dem Programm Tree View 1.6.6 (Page 1996) dargestellt und bearbeitet.
Abb. 21. Phylogenetischer Stammbaum auf Basis der LSU rDNA-Sequenzen der Brettanomyces/Dekkera-
Arten sowie von Saccharomyces cerevisiae als Außengruppe. Der Konsensus-Baum wurde aus 100 Maximum
Likelihood-Bäumen unter Einbeziehung von 3240 Alignment-Positionen berechnet. Drei verschiedene
Bootstrap-Analysen dienten der statistischen Absicherung: Parsimony, Neighbor-Joining und Maximum
Likelihood. Der Maßstrich entspricht einer phylogenetischen Distanz von 1 %.
73/87/55
B. naardenensis (CBS 6042T)Acc. DQ406719
Saccharomyces cerevisiae Acc. J01355
B. nanus (CBS 1945T)Acc. DQ406718
B. custersianus (CBS 4805T)Acc. DQ406717
D. anomala (DSM 70732T)Acc. DQ406714
D. bruxellensis (DSM 70001T)Acc. DQ406716
D. bruxellensis (St. 579) Acc. DQ406715
100/100/100
100/100/100
100/100/100
100/100/100
0.01
3. ERGEBNISSE 64
Durch die vollständige Sequenzierung der 26S rDNAs aller fünf bisher bekannter
Brettanomyces/Dekkera-Arten (Tab. 11) konnten in dieser Arbeit weitere hochvariable
Sequenzbereiche gefunden werden (Tab. 12). Diese Regionen wurden durch eine
vergleichende Sequenzanalyse (ClustalX 1.83; Thompson et al. 1997) identifiziert. Dabei
wurden sowohl alle Brettanomyces/Dekkera-Arten als auch die Hefe Saccharomyces
cerevisiae, für die eine LSU rRNA-Sekundärstruktur existierte (Cannone et al. 2002;
www.rna.ccbb.utexas.edu), miteinander verglichen (Anhang 8.1.2). Das Alignment der
rDNA-Sequenzen zeigte, dass sich die Art-spezifischen Bereiche nicht nur auf die ca. 600
bp großen D1/D2-Domänen am 5’-Ende der 26S rDNA beschränken, sondern in mehreren
Clustern über die ca. 3,4 kb große Gensequenz verteilt sind. Eine Anzahl von sechs
variablen Regionen, die hinter den D1/D2-Domänen (in 3’-Richtung) positioniert sind und
als V1 bis V6 bezeichnet wurden, konnten zur Generierung von spezifischen DNA-Sonden
verwendet werden.
Auf den 26S rDNAs der Brettanomyces/Dekkera-Hefen befindet sich hinter den D1/D2-
Domänen, in 3’-Richtung gesehen, der erste variable Bereich zwischen den Sequenz-
Positionen 801 und 885 [bezogen auf die Sequenz von S. cerevisiae (Acc. J01355)]. Die
nächsten zwei Regionen mit divergenten Nukleotiden erstrecken sich dicht neben einander
über die Positionen 1649 bis 1740 (V3) und 1873 bis 1932 (V4). Die meisten
artspezifischen Basen der 26S rDNAs (bezogen auf die Sequenzlänge) konnten im Cluster
V1 zwischen den Positionen 2063 und 2202 gefunden werden. Diese Region übertrifft sogar
die Variabilität der D1 oder D2-Domäne. Ein weiterer Bereich (V2) befindet sich zwischen
den Positionen 2670 und 2695. Die letzte Region V6 (Position 3300 bis 3373) am 3’-Ende
der 26S rDNA zeigte ebenfalls eine ausreichend hohe Variabilität zur Generierung von Art-
spezifischen DNA-Sonden.
Die sechs hochvariablen Regionen (V1-V6) sind hinsichtlich ihrer Position, ihrer Größe und
ihrer Spezifität im Vergleich mit den bekannten D1/D2-Domänen in Tabelle 13 dargestellt.
3. ERGEBNISSE 65
Tab. 13. Spezies-spezifische Nukleotide und Sequenzlängen der hochvariablen Regionen der 26S rDNAs
rDNA-Region
D1/D2 V1-V6 V1 V2 V3 V4 V5 V6
Relative Positiona 121- 748
802- 3373
2064- 2201
2671- 2694
1649- 1740
1872- 1931
802- 884
3300- 3373
Sequenz-Länge (bp)b 385 505 137 26 100 75 89 78
Spezifische Nukleotide
D. anomalaT 6 19 8 3 3 - 2 3
D. bruxellensisT 13 18 7 3 3 2 2 1
B. custersianusT 46 59 16 5 18 6 1 13
B. nanusT 53 75 35 3 10 8 14 5
B. naardenensisT 48 73 43 6 10 2 7 5
a Die Positionsangaben beziehen sich auf Saccharomyces cerevisiae (Acc. J01355). b Hochvariable Sequenzbereiche ohne konservierte Abschnitte. Die Sequenz-Längen beziehen sich auf
D. bruxellensis (Acc. DQ406715). T = Typstamm.
3.2 Die Generierung von 26S rRNA-Sekundärstrukturen
Für jede Brettanomyces/Dekkera-Art konnte jeweils eine spezifische Sekundärstruktur ihrer
26S rRNA generiert werden (Anhang 8.2). Dies wurde durch den Vergleich einer 26S
rDNA-Sequenz von Brettanomyces/Dekkera mit einer hinterlegten Sequenz bzw. deren
Sekundärstruktur von der nahe verwandten Hefe Saccharomyces cerevisiae (Cannone et al.
2002) ermöglicht. Die Sekundärstrukturen stimmten in allen fünf Brettanomyces/Dekkera-
Arten zu über 80 % überein. Mit dem Programm RNAstructure 4.2 (Mathews et al. 2004)
konnten die hochvariablen Bereiche hinsichtlich ihrer Struktur überprüft werden.
Strukturänderungen wurden über MS Word in die Ausgangsstruktur von S. cerevisiae durch
Verschieben von Basen und Bindungszeichen eingearbeitet. In den meisten Fällen führte
dies zu Deletionen, Insertionen oder Positionsänderungen von Basen innerhalb
einzelsträngiger Loops bzw. Verkürzungen oder Verlängerungen von doppelsträngigen
Sequenzbereichen (Abb. 22 - 26).
3. ERGEBNISSE 66
3.3 Entwicklung von spezifischen DNA-Sonden
Eine Anzahl von 49 Cy3-markierten Oligonukleotiden (Tab. 6) konnte in dieser Arbeit als
Sonden und Gemeinschafts-Sonden (‚side probes’, Röder et al. 2007a) generiert werden, die
an hochvariable rRNA-Regionen strangabwärts der D1/D2-Domänen binden (Abb. 22 - 26).
Nicht immer waren die Positionen der spezifischen Nukleotide in den Sekundärstrukturen
dazu geeignet, Sonden zu entwickeln, die sich gegenseitig in ihrer Anbindung an die
Zielsequenzen unterstützen (Gemeinschafts-Sonden). Um die Möglichkeit einer
unspezifischen Sonden-Bindung auszuschließen, wurden keine allgemeinen Helfer-Sonden
verwendet (O’Meara et al. 1998), sondern ausschließlich spezifische Oligonukleotide.
Folgende grundlegenden Eigenschaften wurden bei der Generierung der DNA-Sonden
berücksichtigt und haben sich in den Hybridisierungs-Experimenten bewährt:
� Sequenzlänge der Oligonukleotide 16 - 26 bp.
� GC-Gehalt zwischen 40 - 70 %.
� Schmelztemperaturen (Tm) zwischen 55 - 65 °C.
� Tm-Differenz von Gemeinschafts-Sonden unter 5 °C.
� Keine Selbstkomplementarität in der Sequenz, die zu Haarnadelstrukturen führen kann.
� Keine Komplementärsequenzen zwischen verschiedenen Sonden.
� Keine PolyA- und GC-Folgen.
� Berücksichtigung der jeweiligen Sekundärstruktur der Zielregion:
- Einzelsträngige Ziel-Bereiche können die Anbindung der Sonden erleichtern.
- Teilweise komplementäre Gemeinschafts-Sonden können sich gegenseitig in der
- Anbindung an doppelsträngige Bereiche unterstützen.
- Komplementärbereiche von Gemeinschafts-Sonden sollten nicht mehr als 50 % der
Nukleotid-Längen umfassen.
- Direkt benachbarte Sonden können sich gegenseitig unterstützen.
Die Sonden beinhalten jeweils zwei bis zehn Art-spezifische Basen (Tab. 6). Der Vergleich
mit hinterlegten rDNA-Sequenzen aus der NCBI-Datenbank (Blast-Suche) ergab
hinsichtlich der Zielsequenzen keine Übereinstimmungen mit anderen Wein-relevanten
Hefen, Pilzen oder Bakterien.
3. ERGEBNISSE 67
Abb. 22. Modelle der variablen LSU rRNA-Regionen von D. anomala (DQ406714). Die Strukturen sind
Ausschnitte aus der Gesamtstruktur (Anhang 8.2). Sie basieren auf der LSU rRNA-Sekundärstruktur von S.
cerevisiae (Cannone et al. 2002) und wurden mit Hilfe von RNAstructure 4.2 generiert. Die Begrenzungen der
sechs variablen Sequenzereiche (V1-V6) sind durch kurze Pfeile dargestellt. Rot-markierte Nukleotide sind
Art-spezifisch und unterscheiden sich von allen anderen Brettanomyces/Dekkera-Arten und von S. cerevisiae.
Die Zielregionen für Cy3-markierte DNA-Sonden sind mit blauen Linien markiert.
G V2
D.anom.2.1
CGGA
GCUGGAUCG
C AAGAUCCA C
GU
UC U G
GAA
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G G C G G C C U UU
UGUGCCGUUGAUCCG5’3’
5’
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AA
C U C C G U UU
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CC
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CCUG
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AG
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GCG
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A
CG
GU
CCG
UGAAAAUCCACA
GGA
GAGAGA
AUU
CUUCAUGCCAAGUCGU
D.anom.3/4.1
V3
V4
3’
3’
D.anom.1.2
D.anom.1.1
D.anom.1.3
GGCAGAGUGGGUUGU
GUGC
AG
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AGG
AGGAGAC
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AGUGCC
U
UC
GGGUGC
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A
GA C G C G
GA C A A C
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C AGCC
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G
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GU
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A G CGG A A
G G AUU U GA
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UUG G G U G G A
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GG
AAUG
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5’3’
V5
G G U GC AUU
AGUGCCGUCGCUGAGACCAUAUCAGGCGGGCGAUGGGGCACCAGGUGG
AA
A G A C C G G G U G U U C U U G C C U G
V6
5’3’
3. ERGEBNISSE 68
Abb. 23. Modelle der variablen LSU rRNA-Regionen von Dekkera bruxellensis (DQ406715). Die Strukturen
sind Ausschnitte aus der Gesamtstruktur (Anhang 8.2). Sie basieren auf der LSU rRNA-Sekundärstruktur von
S. cerevisiae (Cannone et al. 2002) und wurden mit Hilfe von RNAstructure 4.2 generiert. Die Begrenzungen
der sechs variablen Sequenzereiche (V1-V6) sind durch kurze Pfeile dargestellt. Rot-markierte Nukleotide
sind Art-spezifisch und unterscheiden sich von allen anderen Brettanomyces/Dekkera-Arten und von S.
cerevisiae. Die Zielregionen für Cy3-markierte DNA-Sonden sind mit blauen Linien markiert.
5’3’ D.brux.2.1
G CGGA
GCUGGAUCG
C AAGAUCCA C
GU
UC U G
GAA
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G G C G G U A UU
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V2
V6
3’ 5’ G G U A C AUU
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AA
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3’ 5’
V5 D.brux.5.1
CG
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5’ 3’
V3
V4
D.brux.3/4.2
D.brux.3/4.1
A G U CGAUCC
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A CU U G G
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GACG
GC A
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CC
GGCAUGGGC
CCUG
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ACGCCUUAA
CACCCCGGAAUUGGUU
UA U C C G G A G A G G G G G U
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AG
AGC G U G G C
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GCG
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A
CG
GU
CCG
UGAAAAUCCACA
GAA
GACAGA
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CUUCAUGCCAAGUCGU
U
5’ 3’
D.brux.1.2
D.brux.1.1
D.brux.1.3
GGCAGAGUGGGUUGUUGGG
AG
AAGGGUCUUGCGG
AGG
AGGAGAU
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UGUGCA
CUU
GUGUGC
GGU
GGUUUCC
ACC
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A
GA C G C C G A U A A C
A GGCAC
C AGCC
UU C
G
GGCU
UGCC
GU
CCGCUCUGC GA
U
V1
3. ERGEBNISSE 69
Abb. 24. Modelle der variablen LSU rRNA-Regionen von B. custersianus (DQ406717). Die Strukturen sind
Ausschnitte aus der Gesamtstruktur (Anhang 8.2). Sie basieren auf der LSU rRNA-Sekundärstruktur von S.
cerevisiae (Cannone et al. 2002) und wurden mit Hilfe von RNAstructure 4.2 generiert. Die Begrenzungen der
sechs variablen Sequenzereiche (V1-V6) sind durch kurze Pfeile dargestellt. Rot-markierte Nukleotide sind
Art-spezifisch und unterscheiden sich von allen anderen Brettanomyces/Dekkera-Arten und von S. cerevisiae.
Die Zielregionen für Cy3-markierte DNA-Sonden sind mit blauen Linien markiert.
CG
UAGGUCG
GA
GC
UG
UUA
AAGGCG
CA C
GAUCGACCGAUCCA
GAAG
UUUUU A U C U
G AA G G AUU U G
AG U
AA
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GGAA
UG
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GA GCAUA
3’ 5’
V5
B.custer.2.1
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C AAGAUCCA C
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V2
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B.custer.1.3
B.custer.1.2
B.custer.1.1
UC
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GGC
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V1 5’ 3’
V6
G C C GU
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GCUGGAACCAUACUAGGGGAGCGUGGGGACAUCUACGG
AAA G G U G G G U G U U C U A G U U C C 3’ 5’
B.custer.6.3B.custer.6.2
B.custer.6.1
B.custer.3/4.3
B.custer.3/4.2
B.custer.3/4.1
UA G U C
GAUCC
UAGGAG
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AA
C U C U G UA
AAAA
UGUGUAC
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U
GUAUACUGCCU
C CG
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UU
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GGA
GCG
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A
CG
GU
CCG
UGAAAAUCCACA
GGA
ACGAAGCAA
UAUU
CAGCAUGCCAAGUCGU
5’ 3’
V3
V4
B.custer.3/4.4
3. ERGEBNISSE 70
Abb. 25. Modelle der variablen LSU rRNA-Regionen von Brettanomyces nanus (DQ406718). Die Strukturen
sind Ausschnitte aus der Gesamtstruktur (Anhang 8.2). Sie basieren auf der LSU rRNA-Sekundärstruktur von
S. cerevisiae (Cannone et al., 2002) und wurden mit Hilfe von RNAstructure 4.2 generiert. Die Begrenzung
der sechs variablen Sequenzereiche (V1-V6) ist zum Teil durch kurze Pfeile dargestellt. Rot-markierte
Nukleotide sind Art-spezifisch und unterscheiden sich von allen anderen Brettanomyces/Dekkera-Arten und
von S. cerevisiae. Die Zielregionen für Cy3-markierte DNA-Sonden sind mit blauen Linien markiert.
V1
5’ 3’
B.nanus 1.2
B.nanus 1.4
B.nanus 1.6
B.nanus 1.5 B.nanus 1.3
B.nanus 1.1 A
GGGUCG
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C ACCGAAA
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5’3’ A C GU
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AA
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B.nanus 6.1
5’3’
V2
B.nanus 2.1
CGGA
GCUGGACCG
C AAGGUCCA C
G
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A
GC
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CCG
5’
V3
V4
3’
B.nanus 3/4.1B.nanus 3/4.2
UA G U C
GAUCC
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A
AC U C UG U U
UAA
ACACU
GA
UCA
AGUGUCC
AU C
GA A A
G GGGA C
CCGG
UCA A G A
UU
CCGGG
A CU U G G
AU A U G G A
U
U
CU
UCACG
GC A
ACGUA
ACAGA
AU G C G G A
GA CG
CC
GGCAUGAGC
CCUG
GGAGGAGUU
UUC
U U UU C U U G U
UA
ACGGCCCAU
CACCC
UG
GAAU
UGGUUU
A U C C GG
A G A GG
G G G UU
UU AU G G C C G G AA
GAGC G C G G C
C UUA C
U CAA
ACGUUAGCCGCGUCC
GGU
GCG
CUCAUG
A
CG
GU
CCU
UGAAAAUCCGCA
GGA
AGGAAU
AGU
UUUCAUGCCAAG
UCGU
B.nanus 3/4.3
5’3’
V5
B.nanus 5.1
CG
CAGGUCC
GA
GCGC
UG
UG
AAG
GCGUG
CA G
GACCGACCGAUCCGGCG
GU
G G C C G G AUU U GA
G UAA
AUGC G
AG U G U
UUG G G U G A G
UAAAACCCA
AUACGC
GG
AAUG
AAAGUGAA
GA GCAU
UA
B.nanus 5.3
B.nanus 5.2
3. ERGEBNISSE 71
Abb. 26. Modelle der variablen LSU rRNA-Regionen von Brettanomyces naardenensis (DQ406719). Die
Strukturen sind Ausschnitte aus der Gesamtstruktur (Anhang 8.2). Sie basieren auf der LSU rRNA-
Sekundärstruktur von S. cerevisiae (Cannone et al., 2002) und wurden mit Hilfe von RNAstructure 4.2
generiert. Die Begrenzung der sechs variablen Sequenzereiche (V1-V6) ist zum Teil durch kurze Pfeile
dargestellt. Rot-markierte Nukleotide sind Art-spezifisch und unterscheiden sich von allen anderen
Brettanomyces/Dekkera-Arten und von S. cerevisiae. Die Zielregionen für Cy3-markierte DNA-Sonden sind
mit blauen Linien markiert.
B.naard.5.1
5’
V2
3’B.naard.2.1
CGAAGCUGGACCG
C AAGGUCCA C
UU
U C U
A
G
CAA
AC G C C
GG U
UA
AAGGGCAAUUCG
5’ 3’
V3
V4
B.naard.3/4.1
B.naard.3/4.2
UA G C
G
UCCUA
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AU G U G G A
GA CG
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3’ 5’
V5 B.naard.5.2
CG
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V6
3’ 5’ A C AUU
AGUGUCGCUGGAACCAUAGCAGGCUGGCGCUGGCACUCUUG
GCGG
AAA G G C
CU U G G G U G U C U G C C G G
B.naard.6.1
B.naard.6.2
V1
5’ 3’
B.naard.1.2
B.naard.1.5
B.naard.1.4
UCUAAGGGUCG
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UGGU
AGA
AGAGGC
GGGGGGAGGGAGAGAGGGGGGGAGAAGAGCUU
UCGGGCUUUUUUCUUUCUCUUUUUCCUUCUCCU
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CA C C U C C A U
UAG
UUGC
UU C
GGCGGC
G
U
CCC
CCUAC A U
U
UAAC
GACC A
ACUUAGA
B.naard.1.1
B.naard.1.3
3. ERGEBNISSE 72
3.4 Die Detektion und Identifizierung durch FISH
3.4.1 FISH mit 18S rRNA-gerichteten Sonden
In Vorversuchen wurden bereits vorhandene DNA-Sonden (Tab. 5), die an die 18S rRNA
(SSU) von Brettanomyces/Dekkera binden, in Hybridisierungen eingesetzt. Die Sonden
ermöglichten in künstlichen Mischungen aus verschiedenen Hefen und Milchsäurebakterien
eine Identifizierung auf Gattungsniveau (Abb. 27). Eine zusätzliche Permeabilisierung der
Hefezellwand durch Resuspension der Zellen mit Waschpuffer vor der Hitzefixierung führte
zu einer besseren Durchlässigkeit für die Oligonukleotid-Sonden und somit zu einem
stärkeren Fluoreszenz-Signal.
Abb. 27. Mikroskopische Aufnahmen der FISH einer künstlichen Mischung aus D. bruxellensis (DSM
70001T), B. naardenensis (CBS 6042T), Saccharomyces cerevisiae (St. 43) und Oenococcus oeni (B 70) mit
einer 18S rRNA-Sondenmischung (Tab. 5). (a) Ansicht mit Kombinationsfilter für Cy3-markierte DNA-
Sonden (rot) und DAPI (blau). (b) Ansicht mit Cy3-Sondenfilter.
D. bruxellensis
B. naardenensis
O. oeni
S. cerevisiae
(a)
(b)20 µm
20 µm
3. ERGEBNISSE 73
3.4.2 FISH mit 26S rRNA-gerichteten Sonden
Eine Art-spezifische Detektion und Identifizierung konnte erstmals mit den in dieser Arbeit
entwickelten Sonden erreicht werden (Abb. 28, 29), die an hochvariable Sequenzbereiche
der 26S rRNA in den Brettanomyces/Dekkera-Spezies binden. Die FISH-Experimente
wurden mit unterschiedlichen Hybridisierungs- und Waschtemperaturen durchgeführt, um
die Spezifität und das Signal zu optimieren. Die Signalstärken konnten visuell evaluiert und
in vier Kategorien eingeteilt werden (Tab. 14, Abb. 28). Neunundzwanzig Cy3-markierte
DNA-Sonden (67 % von allen untersuchten Sonden) lieferten ein deutliches Fluoreszenz-
Signal mit einer zumindest „mittleren“ Intensität. Fünf von ihnen zeigten bei der
mikroskopischen Auswertung sogar eine überdurchschnittlich hohe Intensität. Bei drei
Sonden (26S-B.nanus 1.3, 26S-B.nanus 1.5, 26S-B.nanus 3/4.1) konnte kein eindeutiges
Signal beobachtet werden. Darüber hinaus konnte eine signifikante Erhöhung der
Fluoreszenz-Ausbeute durch die Applikation von Gemeinschafts-Sonden (26S-D.anom. 1.2,
1.3; 26S-B.custer. 1.2, 1.3; 26S-B.custer. 6.1, 6.2, 6.3; 26S-B.nanus 1.1, 1.2; 26S.-B.nanus
3/4.1, 3/4.2; 26S-B.naard. 1.1, 1.2; 26S-B.naard. 1.4, 1.5; 26S-B.naard. 3/4.1, 3/4.2) in den
Hybridisierungs-Ansätzen festgestellt werden. Schließlich wurde auch eine Steigerung der
Sonden-Spezifität in Ansätzen mit Gemeinschafts-Sonden (26S-D.brux. 3/4.1, 3/4.2; 26S-
B.custer. 3/4.3, 3/4.4; 26S-B.custer. 6.1, 6.2, 6.3) beobachtet.
Tab. 14. Ergebnisse der Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit Cy3-markierten DNA-Sonden
In situ Hybridisierung Fluoreszenz-Signala
Sondenb Tm (°C)c TH (°C)d TW (°C)d D. anom. D. brux. B. custer. B. nanus B. naard.
26S-D.anom.1.1 61.0 56.0 59.0 + +/– – – – 26S-D.anom.1.2 58.2 50.0 54.0 + – – – –26S-D.anom.1.3 58.6 50.0 52.0 + – – – –26S-D.anom.1.2 26S-D.anom.1.3
58.2 58.6 50.0 52.0 ++ – – – –
26S-D.anom.2.1 59.4 55.0 57.0 +/– – – – – 26S-D.anom.3/4.1 56.5 50.0 52.0 +/– – – – – 26S-D.brux. 1.1 60.0 56.0 58.0 – + – – –26S-D.brux. 1.2 60.2 53.0 55.0 – ++ – – – 26S-D.brux. 1.1 26S-D.brux. 1.2
60.0 60.2 56.0 57.0 – ++ – – –
26S-D.brux. 1.3 56.7 54.0 56.0 – + – – –26S-D.brux. 2.1 60.2 56.0 57.0 – + – – –
3. ERGEBNISSE 74
Tab. 14. Fortsetzung
In situ Hybridisierung Fuoreszenz-Signala
Sondenb Tm (°C)c TH (°C)d TW (°C)d D. anom. D. brux. B. custer. B. nanus B. naard.
26S-D.brux.3/4.1 55.3 52.0 54.0 + + – – –26S-D.brux.3/4.2 56.5 52.0 54.0 +/– + – – – 26S-D.brux.3/4.1 26S-D.brux.3/4.2
55.3 56.5 52.0 54.0 – + – – –
26S-D.brux.5.1 57.3 54.0 57.0 +/– ++ – – – 26S-B.custer. 1.1 58.2 54.0 55.0 – +/– – – – 26S-B.custer. 1.2 57.3 54.0 57.0 – – + – –26S-B.custer. 1.3 56.9 50.0 52.0 – – + – –26S-B.custer. 1.2 26S-B.custer. 1.3
58.2 56.9 55.0 56.0 – – ++ – –
26S-B.custer. 2.1 57.3 52.0 54.0 – – + – –26S-B.custer.3/4.1 55.9 52.0 54.0 – – + – –26S-B.custer.3/4.2 58.2 52.0 54.0 – +/– + – – 26S-B.custer.3/4.126S-B.custer.3/4.2
55.9 58.2 53.0 54.0 – +/– + – –
26S-B.custer.3/4.3 54.0 52.0 54.0 – +/– + – – 26S-B.custer.3/4.4 59.7 56.0 58.0 – – + – –26S-B.custer.3/4.326S-B.custer.3/4.4
54.0 59.7 52.0 54.0 – – ++ – –
26S-B.custer.6.1 60.7 57.0 60.0 – – + – –26S-B.custer.6.2 60.0 56.0 59.0 – +/– + – – 26S-B.custer.6.3 62.4 58.0 61.0 – +/– + – – 26S-B.custer.6.1 26S-B.custer.6.2 26S-B.custer.6.3
60.7 60.0 62.4
57.0 60.0 – – ++ – –
26S-B.nanus 1.1 56.7 53.0 55.0 – – – +/– – 26S-B.nanus 1.2 58.2 53.0 55.0 – – – +/– – 26S-B.nanus 1.1 26S-B.nanus 1.2
56.7 58.2 53.0 55.0 – – – + –
26S-B.nanus 1.3 54.5 48.0 51.0 – – – – –26S-B.nanus 1.4 56.7 50.0 52.0 – +/– – – – 26S-B.nanus 1.3 26S-B.nanus 1.4
54.5 56.7 48.0 51.0 – +/– – +/– –
26S-B.nanus 1.5 57.3 52.0 54.0 – – – – –26S-B.nanus 1.4 26S-B.nanus 1.5
56.7 57.3 52.0 54.0 – – – – –
26S-B.nanus 1.6 54.8 52.0 54.0 +/– +/– – – – 26S-B.nanus 1.5 26S-B.nanus 1.6
57.3 54.8 48.0 51.0 +/– – – – –
26S-B.nanus 2.1 58.8 50.0 54.0 – – – ++ – 26S-B.nanus 3/4.1 55.9 52.0 54.0 – – – – –
3. ERGEBNISSE 75
Tab. 14. Fortsetzung
In situ Hybridisierung Fuoreszenz-Signala
Sondenb Tm (°C)c TH (°C)d TW (°C)d D. anom. D. brux. B. custer. B. nanus B. naard.
26S-B.nanus 3/4.2 54.3 52.0 54.0 – – – +/– – 26S-B.nanus 3/4.126S-B.nanus 3/4.2
55.9 54.3 52.0 54.0 – – – + –
26S-B.nanus 3/4.3 57.3 50.0 54.0 +/– – – +/– – 26S-B.nanus 5.1 57.6 53.0 55.0 – – – + –26S-B.nanus 5.3 58.4 56.0 57.0 – – – ++ – 26S-B.naard. 1.1 62.4 58.0 59.0 – – – – +/– 26S-B.naard.1.2 58.8 53.0 55.0 – – – – +26S-B.naard.1.1 26S-B.naard.1.2
62.4 58.8 54.0 56.0 – – – – ++
26S-B.naard. 1.4 56.5 50.0 52.0 – – – – +/– 26S-B.naard. 1.5 58.2 53.0 55.0 – – – – +26S-B.naard. 1.4 26S-B.naard. 1.5
56.5 58.2 55.0 56.0 – – – – ++
26S-B.naard. 1.1 26S-B.naard. 1.4 26S-B.naard. 1.5
62.4 56.5 58.2
54.0 58.0 +/– +/– +/– +/– ++
26S-B.naard.2.1 57.3 52.0 54.0 +/– +/– – – + 26S-B.naard.3/4.1 57.6 52.0 54.0 – – – – +26S-B.naard.3/4.2 57.3 52.0 54.0 – – – – +26S-B.naard.3/4.1 26S-B.naard.3/4.2
57.6 57.3 52.0 54.0 – – – – ++
26S-B.naard.5.2 57.6 52.0 54.0 – – – – +
a Visuelle Klassifizierung in vier Kategorien: – kein Signal, +/– niedrig, + mittel, ++ hoch (vgl. Abb. 28). b Die Sonden wurden einzeln getestet und in Kombination (Gemeinschafts-Sonden). c Mittlere Schmelztemperaturen laut Herstellerangaben (Formel siehe Kapitel 2.6). d Verschiedene Temperaturen wurden für die Hybridisierung (TH) und die Waschritte (TW) angewandt. Die
optimalen Temperaturen sind hier gezeigt.
3. ERGEBNISSE 76
Abb. 28. Evaluierte Fluoreszenz-Kategorien: (a) niedrig (+/–), D. bruxellensis (DSM 70001T) hybridisiert mit
26S-D.brux. 3/4.2; (b) mittel (+), D. bruxellensis (DSM 70001T) hybridisiert mit 26S-D.brux. 1.1; (c) hoch
(++), D. bruxellensis (DSM 70001T) hybridisiert mit 26S-D.brux. 1.1, 1.2.
Abb. 29. Mikroskopische Aufnahmen aller Brettanomyces/Dekkera-Spezies nach Fluoreszenz in situ
Hybridisierung mit Art-spezifischen Cy3-markierten DNA-Sonden und Gegenfärbung mit DAPI. Es wurden
Reinkulturen und Zellmischungen aus allen fünf Arten verwendet. Dargestellt sind Phasenkontrast-Aufnahmen
(a, d, g, j, m), fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen mit Kombinationsfilter (b, e, h, k, n) für Cy3 (pink) und
DAPI (blau) sowie mit Cy3-Sondenfilter (c, f, i, l, o) (orange). D. anomala (DSM 70732T) wurde mit den
Sonden 26S-D.anom. 1.2, 1.3 in einer Speziesmischung (a, b) und in Reinkultur (c) hybridisiert. D.
bruxellensis (DSM 70001T) mit der Sonde 26S-D.brux. 1.2 in Speziesmischung (d, e) und in Reinkultur (f). B.
custersianus (CBS 4805T) mit der Sonde 26S-B.custer. 1.2 in Speziesmischung (g, h, i). B. nanus (CBS 1945T)
mit der Sonde 2.1 in Speziesmischung (j, k) und in Reinkultur (l). B. naardenensis (CBS 6042T) mit den
Sonden 26S-B.naard. 1.1, 1.2 in Speziesmischung (m, n) und in Reinkultur (o).
(a) (c) (b) 25 µm 25 µm 25 µm
(b) (c) (a) 25 µm 25 µm25 µm
3. ERGEBNISSE 77
Abb. 29. Fortsetzung
(j)
(m) (o) (n)
(k) (l)
(d) (e)
(g)
(f)
(h) (i)
25 µm 25 µm 25 µm
25 µm 25 µm 25 µm
25 µm 25 µm 25 µm
25 µm 25 µm 25 µm
3. ERGEBNISSE 78
3.5 Differenzierung von lebenden und toten Hefe-Zellen
Um das Ausmaß einer Infektion bzw. die tatsächliche Schadwirkung durch Spezies der
Gattungen Brettanomyces/Dekkera in zukünftigen Untersuchungen abschätzen zu können,
wurden verschiedene Färbetechniken hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit auf diese Hefen
untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass einige etablierte Methoden zur Unterscheidung
von lebenden und toten Hefe-Zellen, wie die Anfärbung mit wässriger Methylenblau-
Lösung (hier nicht gezeigt) oder die Verwendung des Live/Dead Yeast Viability Kit
(Molecular Probes Inc, Eugene, Oregon) bei Brettanomyces/Dekkera-Hefen zu keinem
eindeutigen Ergebnis führten.
3.5.1 Live/Dead Yeast Viability Kit
Das Live/Dead Yeast Viability Kit ist für Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera als
mikroskopisch auswertbarer Vitalitätsnachweis nicht geeignet, da die Ausbildung der
charakteristischen rot-fluoreszierenden Strukturen (Abb. 30 b) in den Vakuolen von
lebenden Zellen nicht oder nur in sehr geringem Maße stattfand (Abb. 30 c). In
stoffwechselaktiven Zellen von S. cerevisiae wurden diese zylindrischen intravakuolären
Strukturen (engl. „CIVS“) innerhalb einer Stunde produziert. Diese Strukturen haben einen
Durchmesser von ungefähr 0.5-0.7 µm und sind ein bis mehrere µm lang
(Produktinformation, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon). Sie wurden häufig frei
beweglich in den Vakuolen der Zellen beobachtet. Die Intensität der Färbung und das
Ausmaß der CIVS in den Hefezellen konnte durch die Konzentration des Farbstoffs Fun 1
(Lloyd & Hayes 1995) beeinflusst werden. Der im UV-Bereich anregbare Farbstoff
Calcofluor White (Mazzoni et al. 1993) färbte zur Kontrastierung die Chitin-haltigen
Zellwände der Hefen sehr gut an (Abb. 30 a - c).
3. ERGEBNISSE 79
Abb. 30. Ergebnis der Anfärbung von S. cerevisiae nach 30 min Inkubation (a), nach 60 min Inkubation (b)
und von D. bruxellensis nach 60 min Inkubation (c) mit Calcofluor White (blau, Zellwände) und Fun 1 (rot,
CIVS in stoffwechselaktiven Zellen). Ansicht im Fluoreszenzmikroskop mit Kombinationsfilter (28).
3.5.2 Fluoresceindiacetat
Mit Fluoresceindiacetat (FDA) konnte die Esterase-Aktivität in lebenden Brettanomyces/
Dekkera-Zellen nachgewiesen werden. Die Cytoplasmamembran von lebenden Zellen ist
für den unpolaren hydrophoben Ester permeabel. Die Substanz diffundiert in die Zellen und
wird von unspezifischen, cytosolischen Esterasen in Fluorescein und Acetat hydrolysiert.
Fluorescein kann aufgrund seiner Polarität aktive Zellmembranen nur langsam passieren
und akkumuliert in vitalen (Esterase-aktiven) Zellen. Eine Bindung an Peptide verhindert
darüber hinaus eine Diffusion durch die Membran („molecular trap“, Abb. 27). Freies
Fluorescein leuchtet unter UV-Bestrahlung intensiv grün (Abb. 32).
Abb. 31. Umwandlung von Fluoresceindiacetat (FDA) in der Zelle.
O
CH2Cl
COOH
OH O O
CH2S-Peptid
COOH
OH OO
CH2Cl
O O
O
CH3 O O CH3
O
Esterasen SH-Peptid
FDA Fluorescein
(a) (b) (c) 25 µm25 µm25 µm
3. ERGEBNISSE 80
Abb. 32. Ergebnis der Anfärbung von D. bruxellensis mit FDA. Eine Zellzahl-abhängige Steigerung der
Fluoreszenz-Intensität war bereits anhand verschiedener Verdünnungsstufen der Zellsuspension in 1,5 ml
Reaktionsgefäßen (a) zu erkennen (links: unverdünnt, Mitte: 10-1, rechts 10-2 Verdünnung, jeweils mit 10µl
FDA-Lösung versetzt, nach 1 h Inkubation bei RT). Mikroskopische Abbildungen einer Suspension, die mit
Kadifit behandelt wurde (b) im Phasenkontrast mit Fluoreszenz-Darstellung (Doppelbelichtung) und einer
unbehandelten Suspension im Phasenkontrast (c) und als Fluoreszenz-Aufnahme mit Filter 10 (d).
3.5.3 SYTOX Green
Die Substanz Sytox Green (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) wurde ursprünglich
zur Überprüfung der Vitalität von Bakterien entwickelt. Der Farbstoff besitzt eine hohe
Affinität zu Nukleinsäuren und kann die Membran von lebenden Zellen nicht passieren.
Sytox Green dient daher dem Nachweis von Zellen, die einen Verlust ihrer Membran-
Integrität aufweisen und somit als nicht mehr lebensfähig angesehen werden können.
Die Anwendung des Tests auf abgestorbenen Brettanomyces/Dekkera-Zellen führte zu
einem deutlich Fluoreszenz-Signal (Abb. 33). Dabei fluoreszierte der Farbstoff in den
Zellen, ähnlich wie Fluorescein, bei Anregung mit UV-Licht im grünen
Wellenlängenbereich.
(c) (d)
(b) (a) 25 µm
25 µm 25 µm
3. ERGEBNISSE 81
Abb. 33. Ergebnis der Anfärbung einer Zellsuspension aus allen fünf Brettanomyces/Dekkera-Arten mit
SYTOX Green. Ansicht im Phasenkontrast (a) und als Fluoreszenz-Aufnahme (b) mit Filter 10. Durch die
Zugabe von Kadifit wurde der überwiegende Anteil der Hefezellen in diesem Versuch abgetötet. Das
Fluoreszenz-Signal ging überwiegend von den Zellkernen aus, da SYTOX Green hier in die DNA
interkalierte.
3.6 Stoffwechselphysiologische Untersuchungen
3.6.1 Acetat-Produktion bei Brettanomyces/Dekkera spec.
Die bereits bekannte und für diese Hefen charakteristische Acetat-Produktion (Dittrich &
Großmann 2005) konnte bei allen fünf Brettanomyces/Dekkera-Arten sowie bei den
untersuchten D. bruxellensis-Eigenisolaten durch den Farbumschlag von blau-grün (pH 5,4)
nach gelb (< pH 4,0) beim Wachstum auf DBDM-Agar festgestellt werden (Abb. 34 a).
Außerdem wurde in diesen Kultivierungsversuchen die Entwicklung eines eigentümlichen,
phenolischen Geruchs durch die Bildung von 4-Ethylphenol aus p-Cumarsäure
wahrgenommen. Die Typstämme lösten darüber hinaus die Calciumcarbonat-Schicht bei
Wachstumsversuchen auf YPG-Medium unterschiedlich schnell auf (Abb. 34 b). B.
naardenensis (CBS 6042T) löste das Calciumcarbonat am schnellsten auf, gefolgt von B.
custersianus (CBS 4805T), D. anomala (DSM 70732T) und D. bruxelllensis (DSM 70001T).
Bei B. nanus (CBS 1945T) war die Acetat-Produktion im Vergleich zu den anderen Arten
am geringsten.
(a) (b) 25 µm 25 µm
3. ERGEBNISSE 82
Abb. 34. Qualitativer Nachweis der charakteristischen Essigsäure-Produktion durch Wachstumsversuche von
Brettanomyces/Dekkera-Spezies auf DBDM (a) und auf YPG-Medium mit Calciumcarbonat-Schicht am
Plattenboden (b). Die Kulturen der Typstämme (574: D. anomala, 575: D. bruxellensis, 576: B. custersianus,
577: B. nanus, 578: B. naardenensis) wurden 14 Tage bei 30 °C auf dem jeweiligen Medium inkubiert.
Aufnahme der Kulturplatten von oben (a) bzw. von unten (b). Durch Auflösung des Calciumcarbonats wurden
die Ausstriche sichtbar.
3.6.2 Untersuchung der Hydrolyse von Cellulose
Spezies der Gattungen Brettanomyces/Dekkera können überwiegend aus Wein, der in Holz-
bzw. Barrique-Fässern gelagert wurde, isoliert werden. Chatonnet et al. (1992)
identifizierten Fässer aus Eiche als ökologische Nische für diese Hefen. Dabei kommen dem
Holz-Polymer Cellulose bzw. dessen Abbauprodukte (Cellodextrine, Cellobiose) eine Rolle
als potentielle Kohlenstoff-Quelle zu. Die Spaltung von Cellulose konnte in dieser Arbeit
sowohl durch Wachstumsversuche von D. bruxellensis-Stämmen auf Nährboden mit
Carboxymethylcellulose (CMC) als auch durch die Zugabe von Essigsäure in einem
Kontrollversuch beobachtet werden (Abb. 34). Kongorot wurde bei der Anfärbung
ausgesalzt und adsorbierte an die Cellulose-Polymere im Medium. Nach Inkubation mit der
Entfärbelösung waren die Lyse-Zonen, in denen der Farbstoff nicht an die Cellulose
angelagert werden konnte, als transparente Bereiche deutlich zu erkennen.
Die Aufspaltung von Cellulose in den Wachstumsversuchen (Abb. 35 a) kann anhand dieser
Beobachtungen auf die Essigsäure-Produktion von D. bruxellensis zurückzuführen sein.
(a) (b)
3. ERGEBNISSE 83
Abb. 35. Ergebnisse der Kongorot-Färbung. Wachstumsversuch mit fünf verschiedenen D. bruxellensis-
Eigenisolaten, die mit der Impföse als radiale Striche auf YPG-Agar mit CMC aufgetragen und 14 Tage bei
30 °C inkubiert wurden (a). Nach dem Entfernen der Hefe-Zellen wurde das Medium 1 h mit Kongorot-Lsg.
gefärbt und ÜN in Entfärbelösung inkubiert. Die Wirkung von Essigsäure auf CMC ist in (b) dargestellt.
Verschiedene Konzentrationen (10 % - 100 %) wurden auf eine CMC-Platte aufgetragen und ÜN bei RT
inkubiert. Nach Färbung und Entfärbung konnten die Lyse-Zonen durch Kontrastierung mit 1N HCL sichtbar
gemacht werden.
3.6.3 Untersuchung der Sporulation
Weder bei den Typstämmen der Brettanomyces/Dekkera-Arten noch bei den Eigenisolaten
konnte eine Sporulation nach Inkubation auf Malzagar und SPA-Sporenmedium beobachtet
werden. Auch nach mehrwöchiger Inkubation wurde keine Sporenbildung festgestellt. Die
Schwierigkeit bei der Induzierung und Detektion von Sporen bei diesen Hefen ist bekannt
(Kreger-van Rij 1984).
3.6.4 Art-Differenzierung durch Mikrotiterplatten-Tests
Neben den molekularbiologischen Methoden zur Spezies-Differenzierung konnte in der
vorliegenden Arbeit der physiologischer Mikrotiterplatten-Test YT MicroPlateTM (Biolog
Inc., Hayward, USA) zur Art- und Stammdifferenzierung verwendet werden. Die Fähigkeit
der Hefe-Spezies zur Oxidation oder Fermentation eines bestimmten Substrats im Test
durch ein Isolat ergab hierbei ein charakteristisches Stoffwechselmuster. Diese
physiologischen „Fingerabdrücke“ waren für jede Brettanomyces/Dekkera-Art spezifisch
(Abb. 36). Die von diesen Ergebnissen abgeleiteten Verwandtschaftsverhältnisse der
(a) (b)
3. ERGEBNISSE 84
Typstämme konnten nach einer Cluster-Analyse mit ClustalX 1.83 in MS Excel graphisch
dargestellt werden (Abb. 36).
Abb. 36. Ergebnisse des physiologischen Mikrotiterplatten-Tests (Biolog, USA). Die photometrisch
bestimmten Wachstumsaktivitäten (Y-Achse, relative Einheiten) von den Typstämmen (T) der fünf
Brettanomyces/Dekkera-Arten (Z-Achse) in Bezug auf die jeweiligen Substrate (X-Achse, 96 Ansätze, siehe
Anhang 8.3) ergaben die spezifischen Stoffwechselmuster („metabolic fingerprints“).
0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
0 9
1
10 20 30 40 50
60 70 80
90
0
0,5
1,0 B. naardenensisT
B. nanusT
B. custersianusT
D. bruxellensisT
D. anomalaT
OD620nm
3. ERGEBNISSE 85
Bei der Darstellung von Verwandtschaftsverhältnissen (Abb. 37, 39) wurden alle
photometrisch gemessenen Wachstumsaktivitäten nicht mehr quantitativ erfasst, sondern als
0/1-Matrix (0 = kein Wachstum, 1 = Wachstum) berücksichtigt. Mit dem PHYLIP Package
3.65 (Felsenstein 1989) konnte anhand dieser Daten eine Cluster-Analyse durchgeführt
werden. Eine Darstellung des Baums erfolgte anschließend mit Tree View 1.6.6. Die
Verwandtschaftsverhältnisse auf Basis dieser physiologischen Daten stimmten mit den
phylogenetischen Ergebnissen durch den Vergleich der 26S rDNA-Sequenzen überein
(Abb. 37).
Abb. 37. Gegenüberstellung der Verwandschaftsverhältnisse auf Basis des LSU rDNA-Sequenzvergleichs mit
dem Ergebnis der Cluster-Analyse anhand der physiologischen Daten aus dem Biolog Mikrotiterplatten-Test.
Die Maßstäbe stellen die jeweiligen Unterschiede in Prozent dar (1 % phylogenetische Distanz, bzw. 10
Unterschiede hinsichtlich 100 positiv bewerteter Test-Reaktionen). S. cerevisiae und D. bruxellensis (St. 579)
wurden im Mikrotiterplatten-Test nicht untersucht.
B. naardenensis (CBS 6042T)Acc. DQ406719
Saccharomyces cerevisiae Acc. J01355
B. nanus (CBS 1945T)Acc. DQ406718
B. custersianus (CBS 4805T)Acc. DQ406717
D. anomala (DSM 70732T)Acc. DQ406714
D. bruxellensis (DSM 70001T)Acc. DQ406716
D. bruxellensis (St. 579) Acc. DQ406715 0.1 0.01
LSU rDNA-Sequenzvergleich Biolog Cluster-Analyse
3. ERGEBNISSE 86
3.6.5 Stamm-Differenzierung durch Mikrotiterplatten-Test
Abb. 38. Ergebnisse des physiologischen Mikrotiterplatten-Tests (Biolog, USA) bei Isolaten aus Wein. Die
photometrisch bestimmten Wachstumsaktivitäten (Y-Achse, relative Einheiten) von 22 D. bruxellensis-
Stämmen (Z-Achse) in Bezug auf die jeweiligen Substrate (X-Achse, 96 Ansätze, vgl. Anhang 8.3) ergaben
die verschiedenen Stoffwechselmuster („metabolic fingerprints“) der Eigenisolate.
Die Stoffwechselmuster der Eigenisolate (Abb. 38) ermöglichten zum Teil eine
Differenzierung auf Stamm-Niveau. Die isolierten Stämme zeigten ein sehr vielfältiges
D.brux.9A
D.brux.9B
D.brux.30A
D.brux .30B
D.brux.34A
D.brux.35A
D.brux.75A
D.brux.76A
D.brux.115
D.brux.128
D.brux.153A
D.brux .179B
D.brux.183A
D.brux.183B
D.brux.190A
D.brux.190B
D.brux.198
D.brux.200
D.brux.G1
D.brux.G5
D.brux.230
D.brux .238A
0
0 1
0 2
0 3
04
0 5
0 6
0 7
0 8
0 9
1
St. 238ASt. 230
St. 256St. 253
St. 200St. 198
St. 190BSt. 190A
St. 183B
St. 183A
St. 179B
St. 153A
St. 128
St. 115
St. 76A
St. 75A
St. 35A
St. 34A
St. 30B
St. 30A
St. 9B
St. 9A
1,0
0,5
0
OD620nm
10 20 30 40 50 60 70 80 90
3. ERGEBNISSE 87
Stoffwechselspektrum. Einige D. bruxellensis-Isolate konnten viele verschiedene
Substanzen metabolisieren (z. B. St. 179B, St. 183A, St. 183B), wohingegen andere
Stämme im Test (St. 9A, St. 9B, St. 128) nur Glucose verwerteten. Das schwache
Wachstum der Isolate St. 9A, St. 30A, St. 35A und St. 128 erschwerte darüber hinaus eine
genaue Differenzierung durch den Mikrotiterplatten-Test.
Alle untersuchten Isolate unterschieden sich hinsichtlich ihres Stoffwechselmusters deutlich
von dem als Referenz mitgeführten Typstamm von D. bruxellensis (Abb. 39).
Abb. 39. Ergebnis der Cluster-Analyse von 22 D. bruxellensis-Isolaten und dem D. bruxellensis-Typstamm
DSM 70001T (D. brux.T) auf Basis der physiologischen Ergebnisse (Mikrotiterplatten-Test, Biolog, USA). Der
Maßstab entspricht einem Unterschied von 10 Merkmalen hinsichtlich 100 positiv bewerteter Test-Reaktionen.
3.7 Die regionale Verbreitung von Dekkera bruxellensis
3.7.1 Stamm-Isolierung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden hauptsächlich Weinproben aus der Weinbauregion
Rheinhessen für eine Stamm-Isolierung von Brettanomyces/ Dekkera-Hefen verwendet. Die
D. brux.T
St. 238A
St. 153A
St. 30B
St. 253 St. 256
St. 179BSt. 183A
St. 183B St. 198
St. 200
St. 34A
St. 115 St. 190A
St. 190B
St. 230
St. 75ASt. 30ASt. 35ASt. 76A
St. 9ASt. 9B St. 128
0.1
3. ERGEBNISSE 88
Proben wurden in semiselektivem Hefe-Medium (YPG) mit Ampicillin und Cycloheximid
vorkultiviert, um auch geringe Zellzahlen, die unterhalb der mikroskopischen Detektions-
grenze von ca. 15 Zellen pro ml liegen, mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
detektieren zu können. Ampicillin inhibierte hierbei bakterielles Wachstum und
Cycloheximid die Vermehrung der meisten unerwünschten, eukaryotischen
Mikroorganismen, die sensitiv auf dieses Antibiotikum reagierten. Nach anschließender
Inkubation auf ebenfalls semiselektivem YPG-Agar konnte dann das Wachstum von
Cycloheximid-resistenten Hefen beobachtet werden. Die mikroskopische Detektion einer
apikulaten Zellmorphologie lieferte darüber hinaus ein weiteres Indiz für eine Infektion mit
Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera (Dittrich & Großmann 2005). Während der
Isolierungsversuche konnte in seltenen Fällen auch ein Wachstum von Hefen mit runder
Zellmorphologie beobachtet werden. Ein Isolat wurde hierbei als Vertreter der Gattung
Candida identifiziert (vgl. Abb. 16).
Parallel zu den Kultivierungsversuchen erfolgte eine direkte Untersuchung der Weinproben
durch FISH, insbesondere dann, wenn die Probe schon sensorisch auffällig geworden war.
Bei infizierten Proben wurden auch die Zelltiter durch FISH bestimmt. Durch Anwendung
der in dieser Arbeit beschriebenen FISH-Methode mit spezifischen DNA-Sonden konnten
alle 44 Isolate als Stämme der Art Dekkera bruxellensis identifiziert werden (vgl. Tab. 15 u.
16). Durch Ansequenzierung der Spezies-spezifischen ITS-Region bzw. der 26S rDNA und
anschließendem Sequenzvergleich (Blast, GenBank) konnte dieses Ergebnis bestätigen
werden.
Während der Isolierungsversuche wurden Unterschiede in der Kolonie-Morphologie einiger
Hefen festgestellt (Abb. 40). Dies ließ auf das Vorhandensein unterschiedlicher Stämme in
den betroffenen Weinproben schließen. Diese Vermutung konnte durch einen
physiologischen Mikrotiterplatten-Test (Kapitel 3.5.2) und eine molekularbiologische
Fingerprint-Methode (nSAPD-PCR, Pfannebecker 2005) bestätigt werden.
3. ERGEBNISSE 89
Abb. 40. Zwei unterschiedliche Kolonieformen („matt“ und „glänzend“) von D. bruxellensis aus einer
infizierten Weinprobe nach 14-tägiger Inkubation bei 30 °C auf YPG-Agar (a) und auf DBDM (b). Der pH-
Indikator Bromkresolgrün akkumulierte hierbei nach längerem Wachstum auf DBDM in den Kolonien.
3.7.2 Regionale Verbreitung in Rheinhessen
Die Weinprobennahme zur Untersuchung der regionalen Verbreitung von Brettanomyces/
Dekkera-Hefen in der deutschen Weinbauregion Rheinhessen erfolgte überwiegend im
Bereich Wonnegau, aber auch in den Bereichen Nierstein und Bingen (Abb. 41). Sie
umfasste 110 willkürlich ausgesuchte Winzerbetriebe mit Holz- und/oder Barrique-Ausbau.
In 15 % dieser Betriebe konnte eine Infektion mit D. bruxellensis in mindestens einem Wein
mit der neu entwickelten FISH-Methode nachgewiesen werden (vgl Tab. 15). Insgesamt
wurden im Rahmen dieser Arbeit 299 Rotweinproben untersucht. Die Zellzahlen in den
infizierten Weinproben konnten, sofern sie über der methodischen Auflösungsgrenze von
ca. 15 Zellen/ml lagen, mit dem Zählraster im Okular des Fluoreszenzmikroskops bestimmt
werden. Mit einer Umrechnungsformel (Anhang 8.4) ließen sich die Zelltiter, bezogen auf 1
ml Wein, berechnen (Tab. 16).
Tab. 15. Statistische Auswertung der Weinproben-Untersuchungen
Untersuchung Gesamt Rheinhessen
Weinproben 299 291
Weinproben, infiziert 31 (10 %) 25 (9 %)
Winzerbetriebe 113 110
Winzerbetriebe, infiziert 20 (18 %) 17 (15 %)
Identifizierung D. bruxellensis (100 %) D. bruxellensis (100 %)
Isolate / Stämme 44 37
(a) (b) 1 mm
3. ERGEBNISSE 90
Abb. 41. Ergebnis der Untersuchung der regionalen Verbreitung von Hefen der Gattungen
Brettanomyces/Dekkera in den Bereichen Wonnegau, Nierstein und Bingen der Weinbauregion Rheinhessen
in Rheinland-Pfalz.
Weinproben ohne Brettanomyces-Infektion
Weinproben mit Brettanomyces-Infektion
3. ERGEBNISSE 91
Tab. 16. Dekkera bruxellensis-Isolate aus infizierten Weinproben von Rheinhessen
Probe Rebsorte Herkunft Zellzahl/mla Isolateb
9 Spätburgunder Schafhausen < 15 St. 9A, St. 9B
30 St. Laurent Alsheim < 15 St. 30A, St. 30B
34 Cabernet Sauvignon Mettenheim < 15 St. 34A, St. 34B
35 Merlot Mettenheim < 15 St. 35A, St. 35B
75 Dornfelder Abenheim 1,2x104 St. 75A, St. 75B
76 Dornfelder Abenheim 3,6x104 St. 76
115 Portugieser Flomborn < 15 St. 115
128 Cabernet Sauvignon Framersheim < 15 St. 128
179 Cabernet Sauvignon Weinolsheim < 15 St. 179A, St. 179B
183 Frühburgunder Uelversheim < 15 St. 183A, St. 183B
190 Portugieser Dolgesheim < 15 St. 190A, St. 190B
198 Dornfelder Alzey 3,4x106 St. 198
199 Dornfelder Alzey 4,3x106 St. 199
200 Spätburgunder Biebelnheim < 15 St. 200
230 Dornfelder Gau-Odernheim < 15 St. 230
238 Cúvee Gau-Odernheim < 15 St. 238A, St. 238B
243 St. Laurent Bermersheim 4,9x106 St. 243
244 Regent Bermersheim 3,8x106 St. 244A, St. 244B
259 Dornfelder Hechtsheim 7,4x107 St. 259A, St. 259B
260 Dornfelder Hechtsheim 2,0x106 St. 260A, St. 260B
282 Spätburgunder Ingelheim 6,7x103 St. 282
283 Regent Ingelheim 6,3x106 St. 283
295 Dornfelder Großwinternheim < 15 St. 295
296 Dornfelder Großwinternheim < 15 St. 296
299 Merlot Gau-Algesheim < 15 St. 299
a Die Zellzahl-Abschätzung erfolgte durch Auszählung der Signal-gebenden Hefezellen in einer
geeigneten Verdünnung bzw. Ankonzentrierung über ein Zählraster im Okular des Fluoreszenz-
mikroskops. b Alle Isolate konnten über die Art-spezifischen FISH-Sonden und über Ansequenzierung der 26S rDNA
als Dekkera bruxellensis identifiziert werden.
4. DISKUSSION 92
4. Diskussion
4.1 Sequenzanalysen im rRNA Gen-Cluster
Die ribosomalen DNA/RNA-Sequenzen vieler Mikroorganismen sind bekannt und bestehen
aus Regionen höherer und geringerer Konservierung. Die phylogenetische Analyse der 18S
rDNA, die für die kleine ribosomale Untereinheit kodiert, zeigt die enge Verwandtschaft der
verschiedenen Brettanomyces/Dekkera-Arten (Abb. 1, Cai et al. 1996). Aufgrund der hohen
Sequenzidentität ist eine Art-Differenzierung auf Basis der 18S rDNA nicht immer möglich.
Insbesondere ließen sich keine spezifischen DNA-Sonden für D. bruxellensis und D.
anomala generieren, deren Sequenzen sich hier nur in sehr wenigen Basen voneinander
unterscheiden. Folglich ist eine Differenzierung auf Stamm-Niveau anhand dieser
Sequenzen nicht möglich, wie vergleichende Analysen von partiellen 18S rDNA-Sequenzen
aus D. bruxellensis-Isolaten zeigten (Daten hier nicht gezeigt). Eine frühere Studie (Cai et
al. 1996) beschrieb bereits eine vollständige Identität der 18S rDNA-Sequenzen von drei
Brettanomyces anomalus (heute: Dekkera anomala)-Stämmen.
Zwei „Internal Transcribed Spacer“-Bereiche (ITS1 und ITS2) trennen in allen Eukaryoten
die konservierte 18S und 26S von der 5.8 S rDNA (Abb. 15). Sie werden zwar auch
transkribiert, besitzen aber keine genau definierte Funktion und werden im Zuge der rRNA-
Prozessierung aus dem Primärtranskript herausgespleißt (Knippers 2006). Daher unterliegen
die ITS-Bereiche einem geringeren evolutionären Selektionsdruck (Musters et al. 1990) und
sind weniger konserviert als die rRNA-Gene. Folglich können sie für die Unterscheidung
von Hefe-Spezies in verschiedenen Gattungen verwendet werden. In mehreren Arbeiten
wurde die RFLP oder die Sequenzanalyse der 5.8S rDNA und der flankierenden ITS1- und
ITS2- Bereiche für eine effiziente, relativ einfache und gut reproduzierbare Identifizierung
von Weinhefen vorgeschlagen (Egli & Henick-Kling 2001, Nisiotou & Gibson 2005). Die
geringe variable Länge der ITS-Region (450-850 bp in Hefen) beschränkt natürlich den
Informationsgehalt der Sequenz, so dass umfangreiche phylogenetische Analysen einer
großen Anzahl verschiedener Spezies nicht möglich sind. In einigen Fällen kann dagegen
die Längen-Variabilität der ITS-Regionen zu einer vorläufigen Differenzierung von Hefe-
Arten verwendet werden (Nisiotou & Gibson 2005). Die mit den Primern ITS1 und ITS4
amplifizierten PCR-Produkte der ITS-Region von Brettanomyces/Dekkera besitzen im
4. DISKUSSION 93
Vergleich zu den meisten anderen Weinhefen eine sehr geringe Größe (Nisiotou & Gibson
2005). So unterschieden sich die Amplifikate der D. bruxellensis-Isolate von dem PCR-
Produkt der DNA aus S. cerevisiae um ca. 400 bp (Abb. 17). Dieses Merkmal könnte den
ersten Hinweis für das Vorkommen dieser Hefen in dem betreffenden Wein liefern. Wie die
Sequenzvergleiche (Anhang 8.1.1) der vorliegenden Untersuchung gezeigt haben, ist die
5.8S rDNA in Brettanomyces/Dekkera konserviert und besitzt nur wenige spezifische
Nukleotide in einigen Arten. In der Arbeit von Nisiotou & Gibson (2005) wurden in den
untersuchten Saccharomyces-Arten gar keine variablen Basen in diesem Bereich gefunden.
In dieser Arbeit konnten vergleichende Sequenzanalysen auf Basis der sequenzierten ITS-
Regionen aus fünf Brettanomyces/Dekkera-Typstämmen durchgeführt werden und in einem
phylogenetischen Baum dargestellt werden (Abb. 18). Im Unterschied zu den Ergebnissen
der phylogenetischen Analyse von Egli & Henick-Kling (2001), die auf Restriktionsmustern
der ITS-Regionen basieren, ist D. bruxellensis hier am nächsten mit D. anomala verwandt,
und nicht mit B. custersianus. Dieses Ergebnis entspricht auch den phylogenetischen
Verwandtschaftsverhältnissen, die hier anhand der 26S rDNA-Sequenzvergleiche gefunden
wurden (Abb. 21). Innerhalb der variablen ITS1- und ITS2-Bereiche unterschieden sich nur
sieben Sequenzpositionen in einigen der hier untersuchten D. bruxellensis-Stämme (Anhang
8.1.1) voneinander. Ein nahezu identisches Resultat beschrieben Egli & Henick-Kling
(2001) nach ihrer Untersuchung von zehn Isolaten dieser Hefe-Spezies.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass weder die 18S rRNA noch die 5,8S rRNA von
Brettanomyces/Dekkera-Hefen als Zielregionen für einen Satz aus mehreren, sensitiven und
sich gegenseitig unterstützenden Sonden, die diese Hefen auf Art-Niveau sicher
differenzieren, geeignet sind. Da die variablen ITS1- und ITS2-Bereiche aus dem prä-
rRNA-Transkript herausgeschnitten werden und in den Ribosomen nicht mehr vorhanden
sind, können sie ebenfalls nicht als effizientes Sonden-Ziel dienen, sondern allenfalls für
PCR- und Restriktions-Analysen herangezogen werden (Loureiro & Querol 1999).
Im Vergleich zu den Sequenzen der 18S rRNAs und der ITS-Regionen waren die 26S
rRNA-Sequenzen aufgrund ihrer Größe und ihrer hohen Variabilität als Zielregionen für die
Entwicklung von Spezies-spezifischen DNA-Sonden besonders geeignet. Die
Sequenzierung der vollständigen 26S rRNA-Gene von den fünf derzeit bekannten
Brettanomyces/Dekkera-Arten D. bruxellensis, D. anomala, B. custersianus, B. nanus und
B. naardenensis lieferte neue Sequenz-Daten für eine taxonomische Diskriminierung und
phylogenetische Analysen. Alle Sequenzen wurden daher in der NCBI-Datenbank
(GenBank) öffentlich hinterlegt (Tab. 12). Darüber hinaus ermöglichte die Sequenzierung
4. DISKUSSION 94
eine Generierung von spezifischen Primern und Sonden für die Entwicklung geeigneter
PCR- und FISH-Methoden.
Die auf Basis dieser 26S rDNA-Sequenzen ermittelten phylogenetischen Verwandtschafts-
verhältnisse (Abb. 21) unterscheiden sich zum Teil von der D1/D2-basierenden Phylogenie
früherer Studien (Kurtzman & Robnett, 1998). Anhand des phylogenetischen Baums, der
die kompletten 26S rDNA-Sequenzen berücksichtigt, zeigt sich in Übereinstimmung mit
dem D1/D2-Baum, dass die in der Weinherstellung verbreitete und bekannteste Art D.
bruxellensis sehr nahe mit D. anomala verwandt ist. Die genetische Similärität spiegelt sich
scheinbar in den physiologischen und ökologischen Gemeinsamkeiten wieder. Beide
Spezies gehören der teleomorphen ascosporenbildenden Form Dekkera an und wurden von
der anamorphen Form Brettanomyces taxonomisch getrennt. Auch D. anomala wurde
bereits aus Wein isoliert (Barnett et al. 1990, Thomas 1993, Coton et al. 2006), die drei
übrigen Brettanomyces-Arten dagegen nicht. Im Gegensatz zu dieser phylogenetischen
Übereinstimmung ist B. custersianus, nach den eigenen Ergebnissen, mit D. bruxellensis
und D. anomala näher verwandt und B. naardenensis sowie B. nanus von allen anderen
Arten phylogenetisch weiter entfernt, als dies im D1/D2-Stammbaum von Kurtzman &
Robnett (1998) dargestellt wurde.
Durch vergleichende Sequenzanalysen konnten in der vorliegenden Arbeit sechs variable
26S rDNA-Regionen hinter den bekannten D1/D2-Domänen identifiziert werden. Zur
Unterscheidung der Hefe-Arten wurden in früheren Studien bereits verschiedene
Sequenzbereiche der LSU rRNA-Gene untersucht. Yamada et al. (1994) analysierten die
Divergenz von zwei 26S rRNA-Regionen in Brettanomyces/Dekkera-Spezies. Ein variabler
Bereich überschneidet sich hierbei mit der Region V3, die in dieser Arbeit identifiziert
wurde. Die phylogenetischen Beziehungen von Vertretern der Pilz-Gattung Coprinus
(Basidiomyceten) wurden anhand von sieben divergenten Domänen der LSU rRNA-
Gensequenzen überprüft (Hopple & Vilgalys 1999). Von den zwei divergentesten Domänen
(D2 und D8) überschneidet sich D8 [entspricht nach Hassouna et al. (1984) den relativen
Sequenzpositionen 1909-2114 in S. cerevisiae] mit V1 (Tab. 13), der variable Bereich mit
den meisten Art-spezifischen Nukleotiden in dieser Arbeit. Auf der anderen Seite
korrespondiert eine der am wenigsten divergenten Domänen (D7) mit der hochvariablen
Region V3 (diese Arbeit), die auch von Yamada et al. (1994) zur Differenzierung von
Brettanomyces/Dekkera-Spezies verwendet wurde.
Der Vergleich der vollständigen 26S rDNA-Sequenzen von zwei D. bruxellensis-Stämmen
(Anhang 8.1.2) sowie der partiellen Gensequenzen (5’-Anfang) aus 7 D. bruxellensis-
4. DISKUSSION 95
Isolaten (Daten hier nicht gezeigt) zeigte keine Stamm-spezifischen Sequenzpositionen im
D1/D2-Bereich. Dennoch wurden in einer anderen Studie (Curtin et al. 2007), bei der
Untersuchung von 18 D. bruxellensis-Isolaten aus Australien, in 4 Sequenzen 1 - 2
Substitutionen innerhalb der D1/D2-Region gefunden. Möglicherweise basiert diese
Diversität auf fehlerhaften Sequenzierungen oder aber auf den Folgen geographischer
Gegebenheiten (Herkunft der Isolate z. T. bis 4000 km voneinander entfernt).
Das rRNA Gen-Cluster beinhaltet Sequenzbereiche, die in unterschiedlichem Maße
konserviert sind und daher zur Identifizierung von Organismen unterschiedlicher Taxa
dienen können. In Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera bietet nur die 26S rDNA
aufgrund ihrer Länge und ihrer teilweise hohen Variabilität das Potential für die sichere
Differenzierung auf Spezies-Ebene durch eine FISH-Methode. Eine Stamm-Differenzierung
ist anhand von rDNA-Sequenzen bei D. bruxellensis aufgrund der hohen Identität nicht
möglich. Die variableren ITS1/2-Bereiche lassen nichtsdestotrotz die Differenzierung
einiger D. bruxellensis-Stämme bzw. Stamm-Gruppen (Abb. 18) durch geeignete PCR-
Methoden zu.
4.2 Das Sonden-Design auf Basis von Sekundärstrukturen
Im Vorfeld dieser Arbeit konnten bereits DNA-Sonden entwickelt werden, die an die 18S
rRNA von Brettanomyces/Dekkera binden und somit eine Gattungs-spezifische Detektion
derselben ermöglichten (diese Arbeit). Auch hierbei diente eine adaptierte 18S rRNA-
Sekundärstruktur von S. cerevisiae (U53879) als Orientierungs-hilfe für die Wahl geeigneter
Sonden-Zielregionen.
Bei der Generierung neuer 26S rRNA-Sekundärstrukturen hat es sich als sehr vorteilhaft
herausgestellt, dass auf die Referenzstruktur einer relativ nahe verwandten Art (S.
cerevisiae) zurückgegriffen werden konnte. Aufgrund der vergleichsweise geringen Anzahl
variabler Sequenzpositionen blieb die Grundstruktur größtenteils erhalten. Vor dem
Hintergrund, dass die Anpassung der rRNA-Sekundärstruktur an die neue Sequenz dennoch
einen sehr komplexen und aufwendigen Prozess darstellte, der viele manuell ausgeführte
Arbeitsschritten benötigte (Kapitel 2.12, Hirschhäuser 2002), entstand auch die Überlegung,
zur Entwicklung einer geeigneten Software (siehe Ausblick). Durch Kombination der
Ergebnisse aus vergleichenden Sequenzanalysen mit der auf die jeweilige Hefe-Spezies
4. DISKUSSION 96
adaptierten Sekundärstruktur ließen sich die variablen Sequenzbereiche der 26S rRNA
zweidimensional darstellen. Die Positionen der variablen Bereiche (V1-V6) in den neu
generierten rRNA-Sekundärstrukturen stimmen weitgehend mit den Ergebnissen zur
Kartierung der Variabilität von verschiedenen eukaryotischen LSU rRNA-Gensequenzen
(Ben Ali et al. 1999) überein. Die Sequenzbereiche V1-V6 beinhalten Regionen mit den
höchsten Substitutionsraten, die aus vergleichenden Sequenzanalysen von 77
phylogenetisch diversen eukaryotischen Organismen resultierten. Anhand dieser Daten
wurde von Ben Ali et al. (1999) eine Variabilitäts-Karte für LSU rRNA-Gene auf Basis
einer Sekundärstruktur von S. cerevisiae generiert (Ben Ali et al. 1999,
http://psb.ugent.be/rRNA/ varmaps/Scer_1-su.html). Die Bereiche V1 [E20-E20_2; Helix-
Nummerierung nach De Rijk et al. (1999)] und V6 (H1_1-H1_3) gehören zu den hoch-
variablen Regionen, die in S. cerevisiae, aber nicht in den meisten (≥ 75 %) anderen
Organismen vorhanden sind, die in der Studie untersucht wurden. V2 (G5_1 und G5_2) und
V5 (D3-D5_1) entsprechen in ihrer Position ebenso Teilabschnitten von insgesamt 10
hochvariablen Regionen, die von Ben Ali et al. (1999) identifiziert wurden. Obwohl die
Bereiche V3 (E8-E11_1) und V4 (E15) eine große Anzahl variabler Nukleotide in der Karte
aufweisen, wurden sie von den Autoren dennoch nicht als distinkte variable Regionen
angesehen. Folglich gibt es auf der LSU rRNA weitere potentielle Ziel-Regionen für die
Entwicklung von spezifischen DNA-Sonden (Abb. 22 a - e). Darüber hinaus sollte
berücksichtigt werden, dass es bei der praktischen Anwendung von Sonden, insbesondere
im hochvariablen D1/D2-Bereich (Stender et al. 2001), patentrechtlich festgelegte
Beschränkungen gibt (Hyldig-Nielsen et al. 2000).
In der vorliegenden Arbeit konnte durch eine neue Sonden-Methode die Hybridisierung der
Sonden mit den Ziel-Regionen erleichtert und folglich die Signalstärke erhöht werden. Dies
wurde durch den Einsatz von teilweise komplementären oder direkt benachbarten
fluoreszenzmarkierten Gemeinschafts-Sonden (‚side’ probes, Röder et al. 2007a)
ermöglicht, die die Zugänglichkeit der hoch strukturierten rRNA verbessern. Die Sonden
unterstützen sich hierbei gegenseitig in ihrer Bindung an die Zielregionen. Diese Ergebnisse
stimmen mit Beobachtungen aus früheren Studien (Fuchs et al. 2000) überein, in denen
unmarkierte Oligonukleotide als Helfer-Sonden zu einer signifikanten Verbesserung der
FISH von 16S rRNA in E. coli geführt haben. Fuchs et al. (2000) schlussfolgerten, dass
Helfer und Sonden unabhängig von einander reagieren und daher die Spezifität der
Hybridisierungs-Reaktion nicht negativ beeinflussen. Diese Feststellung konnte auch mit
den Gemeinschafts-Sonden bestätigt werden. Bis auf eine Ausnahme (Sondenmischung
4. DISKUSSION 97
26S-B.naard. 1.1, 1.4, 1,5) wurde keine Signal-Abschwächung und kein Spezifitäts-Verlust
bei der Verwendung von mehreren DNA-Sonden in den FISH-Experimenten festgestellt.
Durch die Berücksichtigung der Sekundärstrukturen der Zielregionen und des
Gemeinschafts-Sonden-Konzepts bleibt das Sonden-Design kein rein empirischer Prozess,
wie von Stahl & Amann (1991) beschrieben, sondern lässt eine gewisse Voraussage der
Effizienz und Sensitivität zu.
4.3 Die FISH-Analyse
Im Verlauf der Überprüfung der neu generierten Sonden wurden verschiedene
Hybridisierungs- und Waschtemperaturen getestet. Dabei lagen die Hybridisierungs-
temperaturen bis zu 10 °C unterhalb der mittleren Schmelztemperaturen der
Oligonukleotide und die Waschtemperaturen 1 bis 5 °C über den jeweiligen
Hybridisierungstemperaturen. Die physikalisch-chemischen Parameter, die die Ergebnisse
von Hybridisierungs-Experimenten wesentlich beeinflussen können, werden unter dem
Begriff „Stringenz“ zusammengefasst. Die Stringenz, mit der die FISH durchgeführt wird,
bestimmt den ungefähren Prozentsatz korrekt gepaarter Nukleotide im Doppelstrang aus
Sonde und Zielsequenz (Leitch et al. 1994). Mit folgender Formel lässt sich die Stringenz
abschätzen:
Stringenz (%) = 100-Mf (Tm-Ta)
Mf = Fehlpaarungsfaktor (1 für Sonden über 150 bp, 5 für Sonden unter 20 bp Länge),
Tm = mittlere Schmelztemperatur (°C), Ta = Temperatur (°C), bei der die Hybridisierung
bzw. die Waschschritte durchgeführt werden.
In den vorliegenden Hybridisierungsversuchen unterschied sich Tm von Ta zwischen 0 °C
und 6.4 °C (Tab. 14), das entspricht einer Stringenz von 100 % bis 68 %. Im Durchschnitt
betrug die Differenz zwischen Tm und Ta 2.7 °C, was einer Stringenz von 87 % entspricht.
Die Stringenz hängt von der Temperatur, der Ionenstärke und der Konzentration
helixdestabilisierender Moleküle (z. B. Formamid, hier nicht verwendet) in den
Hybridisierungs- und Waschlösungen ab (Leitch et al. 1994). Unter stringenten
4. DISKUSSION 98
Bedingungen bleiben nur Sonden mit nahezu perfekt komplementären Sequenzen gepaart.
Mit abnehmender Stringenz erhöht sich in den Hybriden die Zahl der Basenfehlpaarungen.
Mit der Abschätzung des Anteils falsch gepaarter Basen ergibt sich ein Anhaltspunkt für die
Spezifität des Signals. Da die 26S rRNA jedoch in den Ribosomen mit Proteinen assoziiert
ist, lässt sich die Stringenz nicht exakt berechnen.
In der Literatur wurde bereits sehr detailiert auf mögliche Probleme bei in situ
Hybridisierungen mit rRNA-Zielregionen hingewiesen (Amann et al., 1995). Grundlegend
von Bedeutung ist die Quantität und die Zugänglichkeit der Sonden-Zielregionen. Da der
zelluläre Ribosomen-Gehalt direkt mit den Wachstumsraten der Organismen korreliert,
könnte es bei langsam wachsenden Zellen, zu denen Brettanomyces/Dekkera-Hefen
insbesondere zählen, Schwierigkeiten bei der Detektion aufgrund eines niedrigen rRNA-
Gehalts geben. Die Erreichbarkeit der Zielregionen in den Ribosomen kann darüber hinaus
durch zwei verschiedene Faktoren beeinträchtigt werde. Zum einen muss die Permeabilität
der Zellwand und Zellmembran für die fluoreszenzmarkierten Sonden gewährleistet sein.
Auf der anderen Seite können rRNA-rRNA und/oder rRNA-Protein Interaktionen in den
Ribosomen die Hybridisierung der Sonden negativ beeinflussen. Durch die Vorversuche mit
bereits vorhandenen DNA-Sonden, die an die 18S rRNA von Brettanomyces/Dekkera
binden, konnten in dieser Arbeit mögliche Probleme bezüglich eines eventuell zu niedrigen
Ribosomen-Gehalts oder einer limitierten Sonden-Diffusion ausgeschlossen werden.
Der Einsatz von Gemeinschafts-Sonden in den Hybridisierungsversuchen resultierte in den
meisten Fällen in einer Steigerung der Fluoreszenz-Ausbeute. Dies bewirkte ein besseres
Kontrastverhältnis zu der teilweise störenden Eigenfluoreszenz von Weinbestandteilen und
anderen speicherstoffhaltigen Hefen, insbesondere von S. cerevisiae, in den
Untersuchungsproben. Dennoch ergaben einige Ansätze keine oder nur mangelhafte
Ergebnisse, insbesondere in der Hefe B. nanus (vgl. Tab. 14). Es ist bisher nicht bekannt, ob
die 26S rRNA in dieser Art spezielle rRNA-rRNA und/oder rRNA-Protein
Wechselwirkungen aufweist, die sich von denen der anderen Brettanomyces/Dekkera-
Spezies unterscheiden. Möglicherweise traten in diesem Fall auch andere Positions-Effekte
als die erschwerte Zugänglichkeit der Ziel-Region auf. In einer früheren Untersuchung
(Behrens et al. 2003a, b) variierten die gemessenen Fluoreszenz-Intensitäten von einigen
sich um wenige Nukleotide überlappende DNA-Sonden zwischen Klasse I (stärkstes Signal)
und Klasse VI (schwächstes Signal). Behrens et al. (2003a, b) argumentierten, dass in diesen
Regionen die Sonden-vermittelte Fluoreszenz auch durch Sequenz-spezifische Auslöschung
des Fluoreszenz-Signals durch Elektronen-Energie-Transfer negativ beeinflusst werden
4. DISKUSSION 99
könnte. Gleichwohl konnten in der vorliegenden Arbeit schließlich zwei sensitive
Oligonukleotid-Sonden (26S-B.nanus 2.1, 26S-B.nanus 5.3) generiert werden, die für B.
nanus spezifisch sind und ein deutliches Fluoreszenz-Signal in den Hybridisierungs-
versuchen ergaben.
Im Unterschied zu vielen anderen Methoden zur Detektion von Schädlingshefen in
Lebensmitteln, wie die Kultivierung auf selektiven Medien oder molekularbiologische
Techniken (Loureiro & Malfeito-Ferreira 2003), verbindet die FISH die Vorzüge einer
direkten Methode zur Detektion, Identifizierung und Zellzahl-Bestimmung ohne die
Notwendigkeit einer vorausgehenden Kultivierung. Eine prozessbegleitende Qualitäts-
sicherung ist durch die Anwendung zeitintensiver Testverfahren unmöglich. Die klassischen
Methoden für eine Identifizierung und Quantifizierung einer Brettanomyces-Kontamination
durch Kultivierungsversuche auf semiselektivem Anreicherungsmedium mit anschließender
Charakterisierung durch biochemische und physiologische Analysen sowie mikroskopischer
Untersuchung dauern 1 bis 2 Wochen (Fugelsang 1997). Demgegenüber kann die
Hybridisierung bereits nach 3-4 Stunden über Mikroskopie ausgewertet werden. Eine
verlängerte Inkubation der Sonden (z. B. über Nacht) liefert jedoch eine höhere
Fluoreszenz-Ausbeute und damit intensivere Signale. Weitere Vorteile der FISH im
Vergleich zu anderen Methoden sind, neben dem geringen Zeitaufwand, die relativ einfache
Durchführung und Interpretation der Ergebnisse. Die Fluoreszenz-Signale in den Zellen sind
in der Regel leichter zu interpretieren als z. B. unsichere Ergebnisse von Stoffwechsel-Tests
oder komplexe Profile von Gel-Banden.
Neben der FISH gibt es heute ein Vielzahl weiterer, spezieller Sonden-Methoden wie z. B.
die CARD (Catalyzed Reporter Deposition)-FISH (Pernthaler et al. 2002), Smart Probes
(Yamane 2000), Kissing Probes (Brown et al. 2001) oder Molecular Beacons (Lenaerts et
al. 2007). Eine frühere Forschungsarbeit (Stender et al. 2001) beschäftigte sich ebenfalls mit
der Detektion von Brettanomyces/Dekkera. Stender et al. verwendeten aber Peptid-ähnliche
Nukleinsäure-Sonden (PNA probes) zur Identifizierung von D. bruxellensis. Trotz ihrer
hervorragenden Hybridisierungs-Eigenschaften, wie ihre hohe Sensitivität und Spezifität,
bleiben PNA-Sonden aufgrund ihrer hohen Herstellungskosten (ca. 10-20-mal höher als
Oligonukleotid-Sonden) für Routine-Analysen in der Wein-Industrie ungeeignet. Außerdem
erfassen die in der vorliegenden Arbeit generierten Sonden spezifisch alle fünf bisher
bekannten Brettanomyces/Dekkera-Arten. Folglich kann diese Methode nicht nur zur
Identifizierung von D. bruxellensis in Wein sondern auch zur Detektion von anderen
Lebensmittel-schädigenden Spezies (Thomas 1993) angewendet werden.
4. DISKUSSION 100
Darüber hinaus kann man die hier entwickelte FISH-Methode mit einer zusätzlichen
Anfärbung kombinieren, die eine Differenzierung von lebenden und toten Zellen
ermöglicht. Dies ist ein sehr nützlichesWerkzeug, insbesondere für die Kontrolle von Hefe-
Populationen und die Beurteilung der tatsächlichen Auswirkung einer Infektion im Wein.
Trotz ihrer vielfältigen Möglichkeiten sind FISH-Techniken mit DNA- oder PNA-Sonden in
der Wein- und Getränke-Analytik bisher nicht geläufig (Loureiro & Malfeito-Ferreira
2003). Dies hängt wahrscheinlich unter anderem damit zusammen, dass für die
Geräteausstattung ein relativ kostspieliges Fluoreszenzmikroskop notwendig ist. Zudem
stehen althergebrachte Methoden, wie Plattierungsversuche (z. B. MicroQit Detect,
Schliessmann, Schwäbisch Hall) und die chemische Analyse der Sekundärmetabolite
weiterhin im Vordergrund und haben einen scheinbar unverrückbaren Platz in der gängigen
Routine-Diagnostik eingenommen.
4.4 Kritische Evaluierung von Vitalitätsfarbstoffen
Eine Zellzahlbestimmung gibt bei ökologischen Untersuchungen keine Auskunft darüber,
ob die detektierten Mikroorganismen in der Untersuchungsprobe physiologisch aktiv sind.
Oft befindet sich ein beträchtlicher Anteil der Zellen in einem Ruhezustand und ist
physiologisch inaktiv. Aus diesem Grunde sind verschiedene Färbemethoden entwickelt
worden, die es ermöglichen sollen, lebende, stoffwechselaktive Mikroorganismen
mikroskopisch direkt zu erfassen und sie von toten bzw. inaktiven Zellen zu differenzieren
(= „Vitalfärbungen“) (Bast 2001). Die Vitalitätsfärbung erlebt heute in Verbindung mit
neuen mikroskopischen Verfahren eine „Renaissance“, nachdem zuvor die Möglichkeiten
dieser Technik als ausgeschöpft galten. Da fluoreszierende Zellen wesentlich besser zu
erkennen und zu zählen sind als nichtfluoreszierende, verwendet man für Vitalfärbungen
bevorzugt Fluoreszenzfarbstoffe („Vitalfluorchromierung“).
Hinsichtlich des eigentlichen Nachweises gibt es unterschiedliche Prinzipien, z. B. die
Verwendung von Redoxindikatoren, wie z. B. Methylenblau (Bast 2001), die über eine
Farbänderung entsprechende Reaktionen in der stoffwechselaktiven Zelle ohne UV-Licht
sichtbar machen. Viele Hefen (z. B. S. cerevisiae, jedoch nicht Dekkera/Brettanomyces
spec.) und Bakterien lassen sich sehr einfach durch den basischen Anilinfarbstoff
Methylenblau anfärben (Daten hier nicht gezeigt). Der wasserlösliche, blaue Farbstoff ist
4. DISKUSSION 101
ein guter Wasserstoff-Akzeptor und wird nur in lebenden (stoffwechselaktiven) Zellen in
die reduzierte, farblose Leukoform überführt. Ein sehr häufig verwendetes Indiz für eine
lebende Zelle ist das Vorhandensein einer intakten Plasmamembran. Ein Verlust der
Membranintegrität ermöglicht im Gegenzug eine Diffusion von Farbstoffen, z. B. Sytox
Green (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) in die geschädigte Zelle. Hier binden sie
schließlich an verschiedene Zellbestandteile z. B. Proteine oder Nukleinsäuren (Sytox
Green) (Lebaron et al. 1998). Für eine Gegenfärbung der übrigen lebenden Zellen kann der
DNA-interkalierende Fluoreszenzfarbstoff DAPI (Tanious et al. 1992) oder Calcofluor
White (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon), ein Farbstoff, der chitinhaltige Zellwände
anfärbt (Mazzoni et al. 1993), als geeignete Kontrastierung eingesetzt werden. Der
Nachweis von Enzym-Aktivitäten, z. B. von unspezifischen Esterasen bei Anfärbung mit
Fluoresceindiacetat (FDA) (Rotman & Papermaster 1966), oder anderen, zum Teil
unbekannten biochemischen Prozessen, wie bei Fun 1 (Molecular Probes Inc., Eugene,
Oregon) (Lloyd & Hayes 1995), dient ebenfalls der Identifizierung von stoffwechselaktiven
Zellen in der Untersuchungsprobe.
Als Kontrolle der physiologischen Aktivität der untersuchten Hefen wurden im Rahmen
dieser Arbeit verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe evaluiert. Die Farbstoffe Fun 1,
Calcofluor White, Fluoresceindiacetat (FDA) und Sytox Green wurden hierbei zur
Differenzierung von lebenden und toten Hefezellen in Kulturen und Weinproben eingesetzt.
Das Live/Dead® Yeast Viability Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) wurde laut
Herstellerangaben bereits an verschiedenen Hefe- und Pilz-Spezies unter verschiedenen
Laborbedingungen getestet. Der Farbstoff Fun 1 fluoresziert nicht in wässriger Lösung. Er
bindet in Zellen an Nukleinsäuren und Proteinen und führt zu einer grün-gelben Fluoreszenz
in Hefen mit geringer oder keiner Stoffwechselaktivität (Henry-Stanley et al. 2004). In
physiologisch aktiven Zellen enstehen hingegen sogenannte CIVS (zylindrische
intravakuoläre Strukturen) in weniger als einer Stunde. Durch biochemische Reaktionen,
von denen bisher nur bekannt ist, dass sie sehr Temperatur- und ATP-abhängig sind
(Millard et al. 1997) wird Fun 1 modifiziert und fluoresziert im roten Wellenlängenbereich.
Der Transport des Fluorogens von dem Cytosol der Zelle in die Vakuole erfolgt nicht in
toten Zellen (Millard et al. 1997), daher können hier keine CIVS beobachtet werden.
Grundlegend benötigt eine Bildung der CIVS sowohl Membranintegrität als auch
Stoffwechselaktivität von lebenden Hefen (Henry-Stanley et al. 2004). Nach den
Ergebnissen dieser Arbeit ist das Standardprotokoll mit Fun 1 jedoch nicht für Hefen der
4. DISKUSSION 102
Gattungen Brettanomyces/Dekkera geeignet. Die Produktion der für diese Färbemethode
charakteristischen CIVS erfolgte, im Gegensatz zu Versuchen mit S. cerevisiae, in den
untersuchten Zellen dieser Hefe-Gattungen nicht oder nur in sehr geringem Maße (Abb. 30).
Eine eindeutige Differenzierung der Zellen war nicht möglich. Nichtsdestotrotz ließen sich
die Zellwände von Brettanomyces/Dekkera mit Calcofluor White sehr gut anfärben.
Die Zellfärbungen mit den Fluoreszenzfarbstoffen FDA und Sytox Green lieferten in
dieser Arbeit vergleichbar gute Ergebnisse in den untersuchten Hefen. Der Vorteil von FDA
gegenüber Sytox Green besteht darin, dass die Zellen nach der Anfärbung gleichmäßig
stark fluoreszieren (Abb. 32 d), da das freie Fluorescein im Cytoplasma akkumuliert. Da
Sytox Green in toten Zellen mit hoher Affinität an doppelsträngige Nukleinsäuren bindet,
konzentriert sich das Signal bei Eukaryoten auf den Zellkern (Abb 33 b) und wird zur
Zellperipherie hin deutlich schwächer. Demgegenüber blieb das Fluoreszenz-Signal von
Sytox Green längere Zeit (z. T. mehrere Tage) stabil und mikroskopisch auswertbar,
während das freie Fluorescein in den Ansätzen mit FDA bereits nach kurzer Zeit (≤ 1
Stunde) wieder aus den Zellen diffundierte. Zudem zeigte FDA nach einer gewissen
Lagerzeit durch natürliche Hydrolyse in Lösung eine hohe „Eigenfluoreszenz“. Beide
Prozesse führten zu einem unvorteilhaften Hintergrund in den Präparaten, der die
mikroskopische Auswertung gelegentlich sehr erschwerte. Die Effektivität des bekannten
und häufig verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs Sytox Green wird in der Literatur
unterschiedlich bewertet. Veldhuis et al. (1997) untersuchten die Eigenschaften des
Farbstoffs zur Anfärbung von marinem Phytoplankton in Verbindung mit einer
Quantifizierung der zellulären DNA über Durchflusscytometrie. Sie beschrieben in ihrer
Studie vor allem die positiven Eigenschaften des Farbstoffs Sytox Green, der in ihren
Versuchen bereit nach 15 min Inkubationszeit die maximale Fluoreszenz-Ausbeute zeigte.
Das grüne Fluoreszenz-Signal überlappte nicht mit der roten Autofluoreszenz des Planktons
und ermöglichte in ihren Experimenten eine Differenzierung von lebenden und toten Zellen.
Demgegenüber beobachteten Lebaron et al. (1998) in einer Studie über die Effektivität von
Sytox Green zur Abschätzung der Vitalität in Escherichia coli und Salmonella
typhimurium, dass die Färbung mit Sytox Green im Vergleich mit Plattierungsversuchen
den Anteil der toten Zellen unter Umständen zu niedrig bestimmt. Sie begründeten diese
Ergebnisse mit dem Auftreten von strukturellen Änderungen der doppelsträngigen DNA
(„coiling“) in Zellen mit permeabilisierter Membran, das ein Interkalieren des Farbstoffs
verhindern könnte.
4. DISKUSSION 103
Alle untersuchten Fluoreszenzfarbstoffe sind als zusätzliche Färbung für die FISH-Methode
nur bedingt geeignet. Die Vorbehandlung der Zellen für die Hybridisierung, insbesondere
die Hitzefixierung und die Entwässerung schließen eine direkte Anfärbung desselben
Ansatzes aus. Fixiert man die Zellen erst nach der Vitalitätsfärbung auf dem Objektträger,
wird zum einen die ursprüngliche Anordnung der Zellen im Präparat verändert und zum
anderen ist das Wiederfinden des Objektausschnitts für die FISH problematisch. Für eine
mikroskopische Auswertung können jedoch Vitalitätsfärbungen mit Reinkulturen parallel
zur FISH-Methode in separaten Ansätzen durchgeführt werden.
4.5 Erste physiologische Charakterisierungen
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neben dem hauptsächlich molekularbiologisch
ausgerichteten Schwerpunkt auch einige physiologische Eigenschaften von
Brettanomyces/Dekkera-Hefen untersucht. In der Wein-relevanten Hefe-Forschung werden
die Essigsäure-Produktion, die β-Glucosidase-Aktivität und die Differenzierung der
ascosporogenen Gattung Dekkera von der asexuellen, nicht sporulierenden Gattung
Brettanomyces immer wieder diskutiert (Loureiro & Malfeito-Ferreira 2003, Fia et al. 2005,
de Souza Liberal et al. 2007, Uscanga et al. 2007). Die Versuche zu den oben erwähnten
Themen besaßen in der vorliegenden Arbeit hauptsächlich qualitativen Charakter und
lieferten die Grundlagen für weiterführende Forschungsarbeiten.
Schließlich konnten physiologische Eigenschaften, insbesondere die Stoffwechsel-
fähigkeiten, zur Differenzierung von Brettanomyces/Dekkera-Arten und D. bruxellensis-
Isolaten herangezogen werden. Die Ergebnisse hierzu wiesen darauf hin, dass eine
Differenzierung von Hefen anhand ihrer Stoffwechselmuster mit einem Mikrotiterplatten-
Test bis auf Stamm-Niveau erfolgen kann.
4.5.1 Acetat-Produktion
Die Bildung von Essigsäure in geruchlich und geschmacklich unangenehmen
Konzentrationen ist der häufigste und folgenschwerste Weinfehler (Dittrich 1984). Acetat
kann in Most und Wein von vielen verschiedenen Mikroorganismen gebildet werden
(Dittrich & Großmann 2005). Die nach ihr benannten Essigsäurebakterien sind jedoch in der
4. DISKUSSION 104
Weinherstellung weniger an der Essigsäureproduktion beteiligt, da sie Acetat nur unter
aeroben Bedingungen durch Oxidation von Ethanol bilden. Heterofermentative
Milchsäurebaktereien, wie Oenoccocus oeni, Leuconostoc- und Lactobacillus-Spezies sind
die wichtigsten Verursacher des sogenannten Essigstichs. Darüber hinaus können die im
Most vorhanden „Wildhefen“ größere Konzentration an Essigsäure produzieren. Die
„echte“ Weinhefe S. cerevisiae bildet während der Weinbereitung 0,2 - 0,4 g/l Essigsäure
(Dittrich & Großmann 2005). Die bekannten Schädlingshefen Hanseniaspora uvarum,
Zygosaccharomyces spec., Saccharomycodes ludwigii, Pichia anomala und Candida spec.
können dagegen mehr als 1 g/l bilden. Die gesetzlich festgelegten Grenzwerte für
Essigsäure liegen für verkehrsfähige Weine bei 1,08 g/l (Weißwein) bzw. 1,20 g/l (Rotwein)
(VO EG Nr. 1493/1999). Darüber hinaus darf der zulässige Gehalt an flüchtiger Säure in
den Qualitätsstufen „Beerenauslese“ bzw. „Eiswein“ 1,8 g/l und in der Qualitätsstufe
„Trockenbeerenauslese“ bis zu 2,1 g/l betragen (VO EG Nr. 1622/2000). Hefen der
Gattungen Brettanomyces/Dekkera werden in der Literatur als starke Acetat-Produzenten
bezeichnet (Chatonnet et al. 1995). Dittrich & Großmann (2005) beschrieben für
Brettanomyces/Dekkera spec. die Produktion von 7,2 g/l Essigsäure in zwölf Monaten bei
aerober Kultur in Most. Der für diese Hefen typische „Custers-Effekt“ (Scheffers 1969,
Wijsman et al. 1984, Kunkee & Bisson 1993) äußert sich in einer Steigerung der
Fermentationsleistung unter aeroben Bedingungen, verbunden mit einer starken Tendenz
zur Acetat-Bildung unter gleichzeitiger Reduzierung von NAD+ (Carrascosa et al. 1981).
Die Bildung von Acetat kann bei Brettanomyces/Dekkera zum einen über die Verwertung
von Ethanol erfolgen (Gancedo & Serrano 1989). Ethanol wird hierbei durch eine Alkohol-
Dehydrogenase zu Acetaldehyd oxidiert. In einem zweiten Schritt erfolgt die Oxidation zu
Essigsäure durch eine Aldehyd-Dehydrogenase. Durch Freisetzung aus Acetylphosphat, das
aus dem Pentosephosphat-Abbau des Zuckers stammt, entsteht ebenfalls Essigsäure
(Dittrich & Großmann 2005). Der größte Anteil von Acetat wird in Brettanomyces/Dekkera
jedoch im Zuge der Glucose-Fermentation durch Oxidation von Acetaldehyd durch
Aldehyd-Dehydrogenasen gebildet. Acetaldehyd entsteht als ein primäres Gärungs-
nebenprodukt durch Decarboxylierung von Pyruvat.
Die Essigsäureproduktion steigt mit zunehmendem Glucose-Gehalt, sowohl im Most als
auch unter Kulturbedingungen und verursacht bei Brettanomyces/Dekkera das langsame
Wachstum und das frühe Absterben der Kulturen (Selbstvergiftung). Acetat ist bei niedrigen
pH-Werten für die Hefen toxisch. Die Säure kann nur in der undissoziierten Form durch die
Plasmamembran diffundieren, woraufhin es zu einer intrazellulären Ansäuerung kommt und
4. DISKUSSION 105
schließlich zur Denaturierung von Proteinen. Aus diesem Grund wurde für Isolierungs- und
Kultivierungsversuche generell Calciumcarbonat (1 % w/v) in Flüssig- und Festmedien
zugegeben. Das Calciumcarbonat wird in Abhängigkeit von der Acetatproduktion der
jeweiligen Spezies unterschiedlich schnell zu Calcium-Acetat und Kohlenstoffdioxid
aufgelöst (Abb. 34 b). Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten D. bruxellensis-Stämme
zeigten zum Teil eine unterschiedlich stark ausgeprägte Tendenz zur Bildung von
Essigsäure, wie anhand der Auflösung der Calciumcarbonat-Schicht in YPG-Agar
(Abb. 34 b) und dem Farbumschlag des pH-Indikators in DBDM (Abb. 34 a) zu erkennen
war. Das Dekkera/Brettanomyces-Differenzierungsmedium (DBDM) nach Rodrigues et al.
(2001) hat sich als aussagekräftiger, qualitativer Test zu einem vorläufigen Nachweis dieser
Hefen in Wein bewährt. Gegenüber dem kommerziell erhältlichen Brettanomyces-
Nachweistest MicroQit Detect (Schliessmann Kellerei-Chemie GmbH & Co.KG,
Schwäbisch Hall) bietet es den Vorteil einer wesentlich höheren Selektivität. Es
differenziert nicht nur über die Cycloheximid-Resistenz von Brettanomyces/Dekkera, die
auch bei anderen Wildhefen zu finden ist (z. B. Candida, diese Arbeit), sondern ermöglicht
einen sensorischen Nachweis der Produktion von 4-Ethylphenol und weist die hohe
Essigsäure-Bildung durch einen pH-Indikator nach.
Betrachtet man die großen Unterschiede hinsichtlich der Stoffwechsel-Aktivitäten in den
Eigenisolaten (Abb. 38), kann man mit großer Wahrscheinlichkeit annehmen, dass auch die
Acetat-Produktion Stamm-abhängig ist. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass B.
naardenensis wesentlich schneller und/oder größere Mengen Essigsäure in Kultur auf YPG-
Medium produziert, als die übrigen Brettanomyces/Dekkera-Arten. Dies konnte auch bei
Wachstumsversuchen auf DBDM beobachtet werden. In einer früheren Studie wurde die
Essigsäureproduktion von vier Brettanomyces/Dekkera-Stämmen (D. bruxellensis und B.
custersianus) quantifiziert (Castro-Martinez et al. 2005). Dabei stellt sich heraus, dass D.
bruxellensis die höchste Produktivität besaß. Die Spezies B. naardenensis wurde hierbei
nicht untersucht. Aufgrund der hohen Produktionsrate von 7 g/l Essigsäure in 100 h bei
aerobem Wachstum in Batch-Kultur wurden diese Hefen als potentielle Acetat-Produzenten
für die industrielle Essigsäure-Produktion vorgestellt. In einer vor kurzem erschienenen
Arbeit (Uscanga et al. 2007) konnte die Essigsäure-Produktion durch D. bruxellensis sogar
auf 13 g/l in 100 h gesteigert werden. Nach diesem Zeitraum betrug der Anteil an lebenden
Zellen in der Batch-Kultur allerdings weniger als 40 %. Dies zeigt wiederum die toxische
Wirkung dieser Säure bei niedrigen pH-Werten. Für die Möglichkeit einer industriellen
Verwendung der Eigenschaften dieser Hefen spricht auch eine weitere Beobachtung von
4. DISKUSSION 106
Uscanga et al. (2007). Der höchste Ertrag und die beste Produktivität in der
Essigsäurebildung wurde durch Inkubation dieser Hefen in Zuckerrohr-Sirup (6 %
Saccharose) erreicht, dem billigsten Ausgangsmaterial unter allen getesteten Substanzen.
4.5.2 Cellulose-Abbau
Die Fähigkeit zur Verwertung von Cellulose-Fragmenten (Cellodextrine, Cellobiose) durch
β-Glucosidasen wurde schon in verschiedenen Wein-relevanten Hefen, unter anderen auch
in Brettanomyces/Dekkera, untersucht (Freer 1991, McMahon et al. 1999, Fia et al. 2005).
Dabei stellte sich heraus, dass diese Enzym-Aktivitäten in „Wildhefen“ größer sind als in S.
cerevisiae (McMahon et al. 1999).
Der Ausbau von Wein im Holz- oder Barrique-Fass ermöglicht selbst bei sehr niedrigem
Restzuckerghalt (< 1 g/l) das Überleben von Brettanomyces/Dekkera-Hefen. Dies hängt mit
ihrer Fähigkeit zur Verwertung von Cellulose-Fragmenten (Cellodextrine, Cellobiose)
zusammen. Ihre Glucosidase-Aktivität wurde bereits in mehreren Publikationen beschrieben
(Van der Walt 1984a, b; Freer 1991; Shantha Kumara et al. 1993, McMahon et al. 1999, Fia
et al. 2005). Eine α-Glucosidase-Aktivität wurde erstmals von Shantha Kumara et al. (1993)
in Brettanomyces lambicus (heute: D. bruxellensis) sowohl intra- als auch extrazellulär
beobachtet. Freer (1991) beschrieb die Cellobiose-Verwertung von B. claussenii, D.
intermedia (heute: D. bruxellensis) und B. anomalus (heute: D. anomala) durch eine
cytoplasmatisch lokalisierte β-Glucosidase. Außerdem fand er auch enzymatische
Aktivitäten zur Hydrolyse von Cellodextrinen, allerdings nur in homogenisierten Zellen.
Acht von zehn untersuchten Brettanomyces-Stämmen zeigten in der Arbeit von McMahon
et al. (1999) β-Glucosidase-Aktivität. In D. anomala wurde sowohl extra- als auch
intrazelluläre Aktivität gefunden (Fia et al. 2005). Dieselbe Studie beschreibt darüber hinaus
eine hohe Variation der Aktivität in den untersuchten Stämmen. Unter den im Wein
vorhandenen Bedingungen, bei niedrigen pH-Werten, hohen Alkohol-Konzentrationen und
Sauerstoffmangel, wird jedoch die Synthese und Aktivität der β-Glucosidase gehemmt
(McMahon et al. 1999). Ebenso ist bekannt, dass Glucose die Produktion und Aktivität des
Enzyms reprimiert (Freer 1991, McMahon et al. 1999, Fia et al. 2005). Da hohe pH-Werte
und aerobe Bedingungen für die Enzym-Aktivität und folglich für eine Vermehrung von
Brettanomyces in einer ansonsten nährstoffarmen Umgebung förderlich sind, sollten diese
Bedingungen im Sinne einer Prävention bei der Weinherstellung vermieden werden.
Brettanomyces/Dekkera-Hefen besitzen keinen Cellulase-Enzym-Komplex und können
daher Cellulose auch nicht direkt verwerten. In der Regel entstehen die verwertbaren
4. DISKUSSION 107
Abbauprodukte der Cellulose aus dem Fass-Holz durch starke Hitzeeinwirkung (Pyrolyse)
im Röstungs-Prozess bei der Herstellung von Barrique-Fässern. Deshalb ist das Risiko einer
Vermehrung von Brettanomyces/Dekkera auch bei der Verwendung von frischen Barriques
groß, da diese vermehrt Cellobiose enthalten (Eder 2000). Erste Ergebnisse aus dieser
Arbeit (Abb. 35) weisen darauf hin, dass die Hefen durch Sezernierung großer Mengen von
Essigsäure (Dittrich & Großmann 2005) die entsprechenden Fragmente durch Säure-
hydrolyse lokal aus Cellulose selbst generieren können. Dies würde unter anderem auch
erklären, warum nicht geröstete Holz-Fässer und ältere Barriques, deren Gehalt an
Cellulose-Fragmenten nach mehreren Belegungen stark reduziert ist, trotzdem eine hohe
Anfälligkeit für eine Brettanomyces-Infektion aufweisen.
4.5.3 Sporenbildung
Die Bildung von Ascosporen ist ein wichtiges Kriterium für die taxonomische Einordnung
von Hefen (Kreger-van Rij 1987). Zur Klassifizierung von Hefen wurden die
Zellmorphologie, die Art der sexuellen Reproduktion, bestimmte physiologische
Aktivitäten, verschiedene biochemische Eigenschaften und Sequenzvergleiche der Genome
durch DNA-DNA Reassoziation berücksichtigt (Barnett et al. 1990).
Hefen können sich sexuell durch die Ausbildung von Ascosporen (z. B. Dekkera),
Teliosporen oder Basidien vermehren. Bei der Einordnung von ascosporogenen Hefen ist es
von Bedeutung, ob die Asci von vegetativen (diploiden) Zellen (z. B. bei Dekkera) gebildet
werden oder durch die Konjugation von (haploiden) Zellen bzw. durch die Konjugation
einer Mutterzelle mit ihrer Ausknospung entstehen (Barnett et al. 2000). Die Entwicklung
der Asci, die Form und die Anzahl der Ascosporen pro Ascus sind weitere Merkmale, die
zur Differenzierung von Hefe-Gattungen als auch zur Unterscheidung von Arten innerhalb
einer Gattung verwendet wurden. Die beiden teleomorphen Arten D. bruxellensis und D.
anomala (Smith 1998a, b) bilden in ihren Asci (Abb. 38 a) ein bis vier glatte, hutförmige
Ascosporen (Abb. 38 b), die schon früh nach der Reifung aus dem sich auflösenden Ascus
entlassen werden (van der Walt 1984a). Die sexuelle Reproduktion von Hefen, verbunden
mit einer Bildung von Ascosporen, wird in der Natur selten beobachtet, sondern eher unter
Laborbedingungen (Fugelsang 1997). Obwohl der sexuelle Zyklus vermutlich auch unter
den natürlichen Lebensbedingungen vorkommt, kann er im Labor von der Kultivierung auf
speziellen Sporenmedien abhängig sein. In der Literatur werden verschiedene Medien zur
Sporeninduzierung in Dekkera beschrieben, z. B. SPA(Acetat)-Medium (de Souza Liberal et
4. DISKUSSION 108
al. 2006), Malzagar (Smith & van Grinsven 1984, Kurtzman & Fell 1998) oder mit
Vitaminen angereicherte Medien (van der Walt 1984a, Fugelsang 1997).
Abb. 38. Mikroskopische Aufnahmen von (a) Dekkera anomala (CBS 8138) mit Ascosporen in einem sich
auflösenden Ascus (Pfeil), (b) Dekkera anomala (CBS 8139) mit hutförmigen Ascosporen (Pfeile).
Elektronenmikroskopische Aufnahme. Abbildungen aus Smith & van Grinsven (1984), abgeändert.
Eine Induzierung und Detektion der Sporulation in Hefen der Gattung Dekkera ist jedoch
problematisch (Smith & van Grinsven 1984, van der Walt 1984a, Kunkee & Bisson 1993)
und konnte auch in der vorliegenden Untersuchung nicht beobachtet werden. Die
Sporulationsrate wurde mehrfach als spärlich bezeichnet (van der Walt 1984a, Smith & van
Grinsven 1984) und soll sogar unter idealen Sporulations-Bedingungen unter 1 % liegen
(Fugelsang 1997). Fugelsang (1997) diskutiert mehrere Gründen, warum eine sexuelle
Reproduktion unter Laborbedingungen nicht beobachtet werden kann. Da die Sporulation
wahrscheinlich in einem sehr engen Zeitfenster abläuft, könnte sie im Labor leicht
übersehen werden, wenn die Kulturen nicht zum richtigen Zeitpunkt untersucht werden. In
diesem Zusammenhang wäre es auch möglich, dass sich die Ascosporen sehr schnell zu
neuen, vegetativen Zellen entwickelt haben ohne vorher bemerkt zu werden. Da man bei
Dekkera keine Paarungs-Typen gefunden hat, wird angenommen, dass die Hefen
homothallisch sind (Van der Walt 1984a) und für eine sexuelle Reproduktion das
Aufeinandertreffen von kompatiblen Paarungs-Typen nicht notwendig ist. Schließlich
können auch verschiedene chemische oder physikalische (z. B. Temperatur) Parameter der
Kulturbedingungen das Auftreten eines sexuellen Zyklus in den untersuchten Dekkera-
Hefen verhindert haben.
(a) (b)
10 µm 1 µm
4. DISKUSSION 109
4.5.4 Differenzierung durch Stoffwechselmuster
Konventionelle physiologische Methoden zur Identifizierung von Hefen sind zeit- und
materialaufwändig, schwierig durchzuführen und liefern häufig mehrdeutige Ergebnisse
(Kreger-van Rij 1984, Barnett et al. 1990, Deak 1995). Verschiedene Systeme wurden
bereits für eine schnelle Identifizierung von Hefen, insbesondere von klinisch relevanten
Arten, entwickelt. Bekannt sind in diesem Zusammenhang z. B. die Diagnostik-Kits API
20C und ATB 32C (bioMérieux, Frankreich). Viele der heute erhältlichen Kits enthalten nur
eine sehr begrenzte Auswahl an Tests und erfassen einige wichtige, Lebensmittel-relevante
Schädlingshefen gar nicht (Praphailong et al. 1996). Das YT MicroPlateTM Biolog-System
(Biolog Inc., Hayward, USA) ist ein halbautomatisches, Datenbank-gestütztes Test-System
zur Identifizierung von Hefen. Es basiert auf einem Mikrotiterplatten-Test mit 96 Ansätzen,
der eine Auswahl verschiedener dehydratisierter Kohlenstoff-Quellen für Assimilations-
und Oxidations-Tests beinhaltet (http://www.biolog.com/pdf/YT%20chart.pdf). Die
Ergebnisse der Stoffwechselaktivitäten liefern einen „physiologischen Fingerabdruck“ für
jedes Isolat. Dieser kann zur Spezies-Identifizierung mit den Profilen von Hefen verglichen
werden, die in einer Datenbank hinterlegt sind. Diese Datenbank ist jedoch nicht frei
zugänglich und wurde auch nicht für die vorliegende Arbeit verwendet. Ähnliche Biolog
Test-Systeme wurden auch zur Identifizierung von Bakterien entwickelt werden (Stager &
Davis 1992). Das YT MicroPlateTM Biolog-System wurde in einer Arbeit von Praphailong
et al. (1996) für die Identifizierung von 21 Hefe-Arten (insgesamt 72 Stämme) aus Wein
und Nahrungsmitteln evaluiert. Obwohl in ihrer Arbeit einige Schwierigkeiten hinsichtlich
der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei einigen Hefe-Arten beschrieben wurden, die im
Wesentlichen mit den Kulturbedingungen in Zusammenhang standen, konnten alle
untersuchten Dekkera/Brettanomyces-Hefen korrekt identifiziert werden. Der Biolog-Test
erwies sich darüber hinaus in der Arbeit von Praphailong et al. (1996) für D. bruxellensis als
reproduzierbar (fünf Wiederholungen mit identischen Ergebnissen).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Biolog Test-System für eine erste physiologische
Differenzierung von Brettanomyces/Dekkera-Arten verwendet und die Stoffwechsel-Profile
mit den phylogenetischen Verwandschaftsverhältnissen in Beziehung gesetzt. Aufgrund der
hohen Variabilität auf Stammebene (siehe unten) sind Stoffwechseleigenschaften als
phylogenetische Marker in der Regel nicht geeignet. In dem vorliegenden Fall korrelierten
jedoch die Stoffwechselmuster der Brettanomyces/Dekkera-Typstämme Spezies-spezifisch
mit den vergleichenden 26S rDNA-Sequenzanalysen (Abb. 37), dass heißt, die genetisch
determinierten Verwandtschaftsverhältnisse repräsentierten hier auch die physiologischen
4. DISKUSSION 110
Gemeinsamkeiten und Unterschiede. Hinsichtlich der Reproduzierbarkeit zeigten die
Testansätze mit D. bruxellensis durchschnittlich 5 % Abweichung bezüglich positiv
bewerteter Test-Reaktionen. Insgesamt belief sich die Fehlerabweichung bei allen mehrfach
getesteten Brettanomyces/Dekkera-Arten und -Stämmen auf durchschnittlich 5,3 %
innerhalb einer Spannweite von 1 % - 13 %. Mögliche Ursachen hierfür könnten
Unterschiede in den Vorkulturbedingungen, der Nährstoffzusammensetzung des Mediums,
dem Alter der Kultur, der Dichte des Inokulums oder den Inkubationsbedingungen sein. Da
diese Parameter möglichst konstant gehalten wurden, ist es jedoch wahrscheinlicher, dass
die physiologische Aktivität der Hefen durch andere Faktoren, z. B. die dicht aufeinander
folgenden Reproduktionszyklen durch wiederholtes Ausstreichen der Stammkulturen stärker
beeinflusst wird.
Eine Differenzierung auf Stammniveau ist durch vergleichende Sequenzanalysen der 26S
rDNAs nicht möglich. Auch die hochvariablen ITS-Regionen ermöglichen höchstens eine
Unterscheidung von Stamm-Gruppen. Eine Differenzierung der isolierten D. bruxellensis-
Stämme konnte dennoch über eine molekularbiologische Fingerprint-Methode (nSAPD-
PCR, Pfannebecker 2005) (Daten hier nicht gezeigt) und zum Teil auch anhand der
Ergebnisse aus dem Mikrotiterplatten-Test (Biolog, USA) erfolgen (Abb. 39). Obwohl das
Biolog-System für eine Stamm-Differenzierung nicht explizit vorgesehen ist, lässt es sich,
nach den Ergebnissen dieser Arbeit, auch für diese Zwecke verwenden. Problematisch war
in diesem Zusammenhang jedoch die äußerst geringe Aktivität in einigen untersuchten
Stämmen, z. B. 9A, 9B, 35A, 76A und 128. Diese Hefen konnten zum Teil nur Glucose
verwerten und ließen sich daher nicht ausreichend differenzieren (Abb. 39). Da der Test
nach 72 h ausgewertet wurde, sind bei sehr langsam wachsenden Stämmen falsch negative
Ergebnisse jedoch durchaus möglich. Das physiologische Potential von D. bruxellensis
spiegelte sich nichtsdestoweniger in einer erstaunlich hohen Diversität der Stoffwechsel-
Profile wieder und impliziert eine effiziente Anpassung dieser Hefe an die wechselhaften
Nährstoffbedingungen bzw. Substratverfügbarkeiten in Most und Wein. Interessanterweise
zeigten einige Stämme, die aus ein und demselben Wein isoliert wurden, wie z. B. 30A, 30B
oder 183A, 183B, sehr unterschiedliche Stoffwechsel-Eigenschaften. Möglicherweise haben
diese D. bruxellensis-Stämme ihre Nährstoffansprüche bzw. ihre Stoffwechsel-Aktivitäten
als Vorraussetzung für eine unproblematische Koexistenz in einer eng umgrenzten
ökologischen Nische aufeinander abgestimmt.
Nichtsdestotrotz sind die physiologischen Variabilitäten zwischen den untersuchten
Stämmen zum Teil größer als zwischen den Brettanomyces/Dekkera-Arten. Daher ist die
4. DISKUSSION 111
Identifizierung eines D. bruxellensis-Isolats auf Basis dieses Tests unter den gegebenen
Umständen nicht möglich.
4.6 Dekkera bruxellensis in der Weinbauregion Rheinhessen
In dieser Studie konnte die Nachweisempfindlichkeit und die Möglichkeit für eine
routinemäßige Anwendung der oben beschriebenen FISH-Methode durch die Isolierung
mehrerer D. bruxellensis-Stämme aus Weinproben überprüft werden. Darüber hinaus wurde
das Vorkommen und die geographische Verbreitung dieser Hefe in der deutschen
Weinbauregion Rheinhessen erstmals untersucht (Röder et al. 2007b). Aus der umfang-
reichen Analyse von Rotweinen resultierte eine statistische Datenerhebung, die darauf
hinweist, dass diese Hefe, zumindest in der regionalen Weinherstellung, weiter verbreitet
ist, als allgemein von Winzern und Önologen angenommen wird.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Untersuchung 37 Stämme aus 291 rheinhessischen
Weinen isoliert werden. Aus fast 50 % der infizierten Weinproben aus den Bereichen
Wonnegau, Nierstein und Bingen wurden jeweils zwei, bereits morphologisch
unterscheidbare Stämme isoliert (Tab. 16). Die zwei Kolonieformen traten regelmäßig in
den verschiedenen Kulturansätzen auf. Diese Beobachtung wurde in der entsprechenden
Fachliteratur bisher noch nicht beschrieben. Durch vergleichende Sequenzanalysen (ITS-
Regionen, D1/D2-Regionen) konnten alle Isolate als Stämme der Art D. bruxellensis
identifiziert werden. Diese Ergebnisse ließen sich durch die FISH-Experimente mit Art-
spezifischen Sonden bestätigen. D. bruxellensis wird auch in der Literatur als die am
häufigsten aus Wein isolierte Brettanomyces/Dekkera-Spezies beschrieben (Thomas 1993,
Chatonnet 1995, Fugelsang 1997). Curtin et al. (2007) isolierten und identifizierten in einer
sehr umfangreichen Studie 244 D. bruxellensis-Stämme aus 31 Weinbauregionen
Australiens.
Obwohl D. bruxellensis in einzelnen Fällen auch aus Weißwein und Sekt isoliert werden
konnte, begünstigt gerade Rotwein in hölzernen Gebinden das Vorkommen dieser Hefen.
Dies hat unter anderem folgende Gründe. Bei der Rotweinherstellung gelangen aus der
Beerenschale, den Samen und dem Stielgerüst wesentlich mehr Phenolsäure-Verbindungen
in die Maische als bei anderen Weinen. Diese Zimtsäurederivate (insbesondere p-
Cumarsäure und Ferulasäure) können als Precursor-Verbindungen von Brettanomyces/
4. DISKUSSION 112
Dekkera-Spezies zu den flüchtigen Ethylphenolen umgewandelt werden, die schließlich das
charakteristische „Brett-Aroma“ hervorrufen (Chatonnet et al. 1992, 1995). In der zweiten
enzymatischen Reaktion dieses Prozesses (Abb. 3) wird die Vinylgruppe der Phenole zum
Ethyl-Rest reduziert. Dabei wird NADH oxidiert. Dieser reduzierende Schritt könnte durch
die Regenerierung von NAD+, das bei niedrigem Sauerstoffgehalt in der Zelle limitiert ist,
den Stoffwechsel der Hefen aufrechterhalten (Fugelsang & Edwards 2007). Darüber hinaus
bietet der spezielle Ausbau von Rotwein im Barrique dieser Spezies einen gewissen Vorteil,
da sie Cellulose-Fragmenten (siehe oben) verwerten können. Die poröse und schwer zu
reinigende Oberfläche des Holzes bietet beste Möglichkeiten zur Überdauerung dieser
Mikroorganismen, die mit ihrem Pseudomycel in Ritzen und Spalten der Fässer eindringen
und dort geschützt lange Zeit überdauern können. Darüber hinaus führt der bei der
Rotweinbereitung erhöhte Sauerstoffkontakt durch das mehrfache Umfüllen und die
Mikroaerobisierung im Holz- oder Barrique-Ausbau zu einer erhöhten
Fermentationsleistung („Custers-Effekt“, Scheffers 1979) von D. bruxellensis (Van Urk
1990, Kunkee & Bisson 1993). Auf S. cerevisiae wirkt Sauerstoff dagegen inhibierend
(Lagunas et al. 1982). Einen Selektionsvorteil gegenüber vielen anderen Weinhefen erhält
D. bruxellensis im Rotwein, der in der Regel mehr Alkohol enthält als Weißwein, auch
aufgrund der hohen Alkoholtoleranz von bis zu 15 Vol. % (Dittrich & Großmann 2005).
Im Rahmen der Untersuchungen implizierte eine Detektion von D. bruxellensis nicht
zwangsläufig eine Schädigung der infizierten Weine. Obwohl die meisten positiv getesteten
Weinproben bereits sensorisch auffällig waren, wurde nur in Ausnahmefällen die
Auswirkung auf das Aroma als deutlich negativ empfunden. Von den hier untersuchten
Proben war lediglich ein Wein in Geruch und Geschmack deutlich geschädigt. Die
Brettanomyces-typischen Aromanoten können in einer amtlichen Qualitätsweinprüfung zur
Ablehnung führen. Interessanterweise werden Stämme dieser Hefen für die Nachgärung von
bestimmten englischen und belgischen Bier-Sorten, wie Lambic, Stout und Gueuze
(säurereiche Ales in Belgien) gezielt eingesetzt (Vanderhaegen et al. 2003). Da die
animalischen, leder-artigen Aromanoten in verschiedenen Rotweinen ein internationales
Flair implizieren, wird der Einfluss von Brettanomyces-typischen Sekundärmetaboliten auf
das Weinaroma unterschiedlich beurteilt (Kunkee & Bisson 1993, Mitrakul et al 1999, Eder
2000). Der einflussreiche Weinkritiker Robert Parker (http://www.erobertparker.com/)
betont in seinen Kommentaren immer wieder, dass ein kleiner Brett-Charakter positiv für
den Wein sei. Dies ist besonders dann der Fall, wenn die Brett-Töne aufgrund einer
geringfügigen Infektion oder durch einen geringen Gehalt an Precursor-Verbindungen im
4. DISKUSSION 113
Most, nicht dominant auftreten und zur Abrundung des Weinaromas beitragen. In
Abhängigkeit von den Konzentrationen (siehe Einleitung) ergeben sich durchaus positive
Effekte auf die geschmackliche Komplexität, die von der überwiegenden Mehrheit der
Konsumenten geschätzt wird (Loureiro & Malfeito-Ferreira, 2003).
Vor diesem Hintergrund entstand auch die Idee, Brettanomyces-Hefen in geeigneter Form
für eine kontrollierte Aromatisierung von Weinen einzusetzen. In Zusammenarbeit mit der
Firma Erbslöh AG in Geisenheim, wurde in einem Vorversuch eine Mikroverkapselung mit
Alginat von Hefen des D. bruxellensis-Stamms 30A (Abb. 39 a, b) durchgeführt (Cavis
GmbH, Mainz-Hechtsheim). Die Verkapselung dient der Immobilisierung von Hefen und
findet z. B. mit S. cerevisiae bereits in der Flaschenvergärung von Sekt Verwendung. Die
spezielle Mikrokapsel (Abb. 39 c) isoliert die Mikroorganismen vom umgebenden Medium
(Wein), schützt sie vor schädigenden Einflüssen und erhöht die mechanische Stabilität
(Cavis GmbH).
Abb. 39. Immobilisierte D. bruxellensis (Stamm 30A)-Hefen [Produktpackung (a) und Mikrokapseln in
Petrischale (b)]. Die Hefen wurden mit einer von Cavis GmbH (Mainz-Hechtsheim) patentierten Multi-Layer-
Capsule (MLC)-Technologie (c) verkapselt [Abb. (c): http://www.cavis.de]. Mehrere Polymerschichten (c, 2-
5) aus natürlichen Polykationen bzw. Polyanionen (z. B. Poly-L-Lysin, Chitosan, Alginat, Polyethylenamine)
umhüllen einen Alginat-Kern (1), der die Hefen enthält. Die Schichten regulieren die Permeabilität und sind
für die Stabilität der Kapsel verantwortlich. Außerdem bestimmt die äußere Hülle die
Oberflächeneigenschaften der Kapsel.
Durch das Verkapseln von lebenden Zellen in entsprechend durchlässigen Hüllen entstehen
miniaturisierte Bioreaktoren. Die Precursor-Verbindungen diffundieren in die Kapsel ein,
werden dort umgesetzt und anschließend wieder in den Wein abgegeben. Durch Entfernung
(a) (c)(b)
4. DISKUSSION 114
der Kapseln kann die Aromatisierung jederzeit unterbrochen werden, wenn der gewünschte
Geschmack erreicht wurde. Aufgrund ihrer Größe lassen sich die Kapseln nach Beendigung
des Vorgangs leicht wieder aus dem Wein entfernen.
Wie sich im Rahmen der Probennahme herausgestellt hat, verschneiden die Winzer in der
Regel die infizierten Weine um die entsprechenden Geschmacksstoffe auf ein akzeptables
Maß zu reduzieren. In diesem Zusammenhang ist die Einhaltung önologischer Maßnahmen
zur Kellerhygiene, wie das sorgfältiges Filtrieren und die Zugabe von Schwefeldioxid vor
dem Umfüllen des betreffenden Weins zu beachten (Steidl & Renner 2001), um einer
unkontrollierten Verbreitung von Brettanomyces-Hefen vorzubeugen.
5. AUSBLICK 115
5. Ausblick
Sonden-Methoden wie die Fluoreszenz in situ Hybridisierung ermöglichen es, verschiedene
Mikroorganismen spezifisch in einer komplexen Lebensgemeinschaft zu lokalisieren, zu
identifizieren und zu quantifizieren. Vor dem Hintergrund, dass sich nach wie vor die
meisten Mikroorganismen mit den zur Verfügung stehenden Methoden nicht im Labor
kultivieren lassen, gewinnt diese kultivierungsunabhängige Methode weiterhin an
Bedeutung.
Für ein effizientes Design von rRNA-bindenden Sonden sind die tatsächlichen
Strukturverhältnisse in den Zielregionen von wesentlicher Bedeutung. Um die komplexe
Generierung von spezifischen rRNA-Sekundärstrukturen in Zukunft zu vereinfachen, wurde
die Programmierung einer entsprechenden Software (Structure Star 1.0) in Auftrag gegeben
(P. Ricke, freier Bioinformatiker, Arnsberg). Structure Star ermöglicht das Visualiseren von
Primär- und Sekundärstrukturdaten („Referenzsequenzen“) der Gutell-Lab-CRW-
Datenbank (http://www.rna.ccbb.utexas.edu/) und das Übertragen dieser Informationen auf
homologe Sequenzen („Arbeitssequenzen“), für die zunächst lediglich die Primärstruktur
(Sequenz) bekannt sein muss. Von der Referenzsequenz abweichende Bereiche der
Arbeitssequenz können anschließend mittels eines Mfold (http://www.
bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)-Interface (Schnittstelle zu einer Software, die
Sekundärstrukturen vorhersagt) thermodynamisch neu berechnet oder auch manuell
angepasst werden (P. Ricke, persönliche Mitteilung). Anhand dieser neu generierten SSU
bzw. LSU rRNA-Sekundärstrukturen lassen sich zukünftig für verschiedene Organismen-
Arten geeignete Zielbereiche für die Entwicklung von DNA-Gemeinschafts-Sonden
detektieren. Dies ermöglicht eine umfassende Anwendung der neu etablierten FISH-
Methode (Fröhlich et al. 2002, Röder et al. 2007). Vor dem Hintergrund einer Vielzahl
verschiedener molekularer Nachweismethoden (Kurtzman, 2006) gilt es, die Vorteile der
Fluoreszenz in situ Hybridisierung weiter auszubauen und die Methode an den Organismus
bzw. die Hefe-Spezies anzupassen. Die hier vorgestellte FISH-Methode ist eine schnelle,
spezifische und relativ kostengünstige Nachweismethode für Hefen der Gattungen
Brettanomyces/Dekkera und könnte, unter anderem in der Weinherstellung, individuell eine
prozessbegleitende Qualitätssicherung und eine präventive Kellerhygiene fördern.
5. AUSBLICK 116
In zukünftigen Untersuchungen sollte geklärt werden, inwieweit sich regionsbezogene
Verbreitungswege aus den Verwandschaftsverhältnissen ableiten lassen, die möglicherweise
durch Tiere (z. B. Vogelschwärme) verursacht werden oder auch anthropogenen Einflüssen
unterliegen. Hierbei müssen die Ergebnisse von Cluster-Analysen mit der geographischen
Herkunft der Isolate verglichen werden. Eine Differenzierung auf Stamm-Niveau bildet in
jedem Fall die Basis für eine Rückverfolgbarkeit („Traceability“) von Wein-relevanten
Mikroorganismen und unterstützt die Untersuchung von möglichen Infektionswegen, über
die bisher nur wenig bekannt ist. Neue Erkenntnisse unter diesem Aspekt sind sowohl für
die Etablierung neuer, präventiver Hygienemaßnahmen als auch zur wirtschaftlichen
Schadensbegrenzung in der Weinproduktion von großer Bedeutung.
Weitere Untersuchungen sollten darüber hinaus zur Stoffwechselphysiologie von
D. bruxellensis in Most und Wein unternommen werden. Hierbei gilt es insbesondere zu
klären, inwieweit die Stamm-abhängige physiologische Aktivität mit der Produktion der
Spezies-typischen Sekundärmetabolite korrespondiert. Im Hinblick auf eine mögliche
Verwendung von Brettanomyces-Hefen zur gezielten Aromatisierung von Rotwein könnten
darauf hin mit geeigneten Stämmen erste Kultivierungsversuche in Kooperation mit
Winzerbetrieben angestellt werden. Der Einfluss einer Immobilisierung durch
Mikroverkapselung auf die physiologische Aktivität dieser Hefen steht darüber hinaus auch
im Blickpunkt zukünftiger Untersuchungen.
6. ZUSAMMENFASSUNG 117
6. Zusammenfassung
Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera sind vor allem in der Produktion von
fermentierten Getränken, insbesondere in der Bier-, Sekt- und Weinherstellung bekannt. In
der Weinbereitung sind sie weit verbreitet und werden hier zu den Schädlingshefen gezählt.
Sie können insbesondere durch die Bildung der charakteristischen Sekundärmetaboliten 4-
Ethylphenol und 4-Ethylguajakol zu einer geschmacklichen Veränderung des Weins
führen.
Trotz der ökonomischen Signifikanz, vor allem in der Weinproduktion, haben sich bisher
nur sehr wenige Studien mit der Detektion oder Differenzierung von
Brettanomyces/Dekkera-Spezies beschäftigt. Aufgrund ihres langsamen Wachstums werden
diese Hefen bei Routineanalysen mit konventionellen Kultivierungsmethoden leicht
übersehen, bis der Wein ernsthaft durch einen unangenehmen Geruch und Geschmack
geschädigt ist. Ein schneller und eindeutiger Nachweis von Brettanomyces/Dekkera ist
jedoch bis heute problematisch.
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit als Themenschwerpunkt eine
Methode zur sicheren Detektion und Identifizierung aller bekannten Spezies dieser
Gattungen entwickelt. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) stellte sich als eine
hierfür besonders geeignete Methode heraus, da sie einen direkten mikroskopischen
Nachweis dieser Organismen in der Untersuchungsprobe ermöglichte. Im Hinblick auf die
Generierung Art-spezifischer DNA-Sonden wurden die ribosomalen Gen-Cluster der
verschiedenen Spezies hinsichtlich potentieller Zielregionen analysiert.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die 26S rDNA des ribosomalen
Genclusters von Brettanomyces/Dekkera-Arten, neben den D1/D2-Domänen, mehrere hoch
variable Sequenzbereiche besitzt. Diese Regionen sind bei Brettanomyces/Dekkera und
wahrscheinlich auch bei anderen eukaryotischen Organismen unterschiedlicher Taxa sowohl
für phylogenetische Analysen als auch für Detektions- und Identifizierungs-Methoden wie
die FISH besonders geeignet. Eine signifikante Steigerung des Sonden-vermittelten
Fluoreszenz-Signals konnte durch die Anwendung eines neuen Sonden-Konzepts realisiert
werden. Der Einsatz von fluoreszenzmarkierten Gemeinschafts-Sonden (‚side’ probes), die
sowohl die in situ Zugänglichkeit der Zielregionen erleichtern als auch das Fluoreszenz-
6. ZUSAMMENFASSUNG 118
Signal verstärken, trägt wesentlich zur Verbesserung von ehemals beschriebenen FISH-
Methoden bei.
Mit der hier vorgestellten Sonden-Methode ließen sich zum ersten Mal alle fünf
Brettanomyces/Dekkera-Arten sicher und eindeutig identifizieren. Anhand der
Untersuchung von infizierten Weinproben unterschiedlicher Herkunft konnten die Eignung
und die Sensitivität dieser Methode für die angewandte Routine-Analyse überprüft werden.
Da eine Detektion dieser Hefen allein noch keinen Hinweis über das tatsächliche Ausmaß
einer Infektion gibt, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Vitalitätsfärbungen
hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit auf Brettanomyces/Dekkera evaluiert. Dabei stellte sich
heraus, dass nicht alle untersuchten Methoden zur Differenzierung von lebenden und toten
Zellen für diese Hefen geeignet sind. Bei der Untersuchung von Weinproben sollte eine
Überprüfung der physiologischen Aktivität der detektierten Hefen durch Anfärbungen mit
geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen Sinnvollerweise immer parallel zu den Hybridisierungs-
versuchen durchgeführt werden.
Eine Differenzierung von Brettanomyces/Dekkera-Hefen auf Art- und Stamm-Niveau
konnte in dieser Arbeit durch einen physiologischen Mikrotiterplatten-Test (Biolog, USA)
vorgenommen werden. Diese Methode lieferte für die Hefen spezifische
Stoffwechselmuster die als „physiologische Fingerabdrücke“ miteinander verglichen
werden konnten. Interessanterweise stimmten hierbei die aus diesen Daten resultierten
Beziehungen der Hefe-Spezies mit den phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnissen auf
Basis der vergleichenden 26S rDNA-Sequenzanalysen überein. Die untersuchten
D. bruxellensis-Isolate zeigten ein sehr vielfältiges Stoffwechselspektrum und unterschieden
sich alle wesentlich von dem entsprechendem Typstamm. Ihre Fähigkeit zur Verwertung
verschiedenster Substrate ließ auf eine komplexe Anpassung der Stämme an die
unterschiedlichen Nährstoffbedingungen in Most und Wein schließen.
In einem weiteren, ökologisch orientierten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde die
Verbreitung von Brettanomyces/Dekkera in der Weinbauregion Rheinhessen untersucht.
Hierbei stellte sich heraus, dass in 15 % der untersuchten Winzerbetriebe diese Hefe in
Rotweinproben gefunden werden konnte. D. bruxellensis ist daher in der regionalen
Weinherstellung weiter verbreitet als allgemein angenommen wurde. Insgesamt konnten im
Rahmen der Probenuntersuchungen aus 299 Weinen 44 D. bruxellensis-Stämme isoliert
werden, die für zukünftige Forschungsarbeiten in die institutseigenen Stammsammlung
aufgenommen wurden.
7. LITERATURVERZEICHNIS 119
7. Literaturverzeichnis
Amann, R.W., Ludwig, W. & Schleifer, K.H. (1995): Phylogenetic identification and in situ
detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59: 143-
169.
Ambrosi, H. (2001): Wein Enzyklopädie. Gräfe und Unzer Verlag, München.
Ambrosi, H., Paul, A., Perscheid, M., Runck, K.H., Seckler, H. & Piroué, S. (2002): Wein
von A-Z. Gondrom Verlag, Bindlach.
Barnett, J.A., Payne, R.W. & Yarrow, D. (1990): Yeasts: Characteristics and identification
(2nd ed.). Cambridge Univ. Press, Cambridge.
Barnett, J.A., Payne, R.W. & Yarrow, D. (2000): Yeasts: Characteristics and identification
(3rd ed.). Cambridge Univ. Press, Cambridge.
Bast, E. (2001): Mikrobiologische Methoden: eine Einführung in grundlegende Arbeits-
techniken. Spektrum, Akademischer Verlag, Heidelberg.
Behrens, S., Fuchs, B.M., Mueller, F. & Amann, R. (2003a): Is the in situ accessibility of
the 16S rRNA of Escherichia coli for CY3-labeled oligonucleotide probes predicted
by a three-dimensional structure model of the 30S ribosomal subunit? Appl. Environ.
Microbiol. 69: 4935-4941.
Behrens, S., Rühland, C., Inacio, J., Huber, H., Fonseca, A., Spencer-Martins, I., Fuchs,
B.M. & Amann, R. (2003b): In situ accessibility of small subunit ribosomal RNA of
members of the domains Bacteria, Archaea and Eucarya to Cy3-labeled
oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 69: 1748-1758.
7. LITERATURVERZEICHNIS 120
Ben Ali, A., Wuyts, J., De Wachter, R., Meyer, A. & Van de Peer, Y. (1999): Construction
of a variability map for eukaryotic large subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Res.
27: 2825-2831.
Boekhout, T., Kurtzman, C.P., O’Donnell, K. & Smith, M.T. (1994): Phylogeny of the yeast
genera Hanseniaspora (anamorph Kloeckera), Dekkera (anamorph Brettanomyces),
and Eniella as inferred from partial 26S ribosomal DNA nucleotide sequences. Int. J
Syst. Bacteriol. 44: 781-786.
Brown, L.J., May, J.P. & Brown, T. (2001): Synthesis of a modified thymidine monomer for
site-specific incorporation of reporter groups into oligonucleotides. Tetrahedron
Lett. 42: 2587-2591.
Cai, J., Roberts, I.N. & Collins, M.D. (1996): Phylogenetic relationships among members of
the ascomycetous yeast genera Brettanomyces, Debaryomyces, Dekkera, and
Kluyveromyces deduced by small-subunit rRNA gene sequences. Int. J. Syst.
Bacteriol. 56: 542-549.
Cannone J.J., Subramanian S., Schnare M.N., et al. (2002): The comparative RNA web
(CRW) site: an online database of comparative sequence and structure information
for ribosomal, intron, and other RNAs. BMC Bioinformatics 3: 2.
Carrasco, M.S., Moragues, L.G., Vignatti, C.I., Scarinci, H.E. & Simonetta, A.C. (2006):
Characterisation and technological aspects of yeasts isolated from raw milk and
different types of cheese produced in Argentinia. Aust. J. Dairy Technol. 61: 21-25.
Carrascosa, J.M., Viguera, M.D., Nuez de Castro, I. & Scheffers, W.A. (1981): Metabolism
of acetaldehyde and Custers effect in the yeast Brettanomyces abstinens. Antonie
Van Leuuwenhoek 47: 209-215.
Castro-Martinez, C., Escudero-Abarca, B.I., Gomez Rodriguez, J., Hayward-Jones, P.M. &
Aguilar-Uscanga, M.G. (2005): Effect of physical factors on acetic acid production
in Brettanomyces strains. J. Food Process Eng. 28: 133-143.
7. LITERATURVERZEICHNIS 121
Chassagne, D., Guilloux-Benatier, M. Alexandre, H. & Voilley A. (2005): Sorption of
wine volatile phenols by yeast lees. Food Chem. 91: 39-44.
Chatonnet, P., Dubourdieu, D., Boidron, J.N & Pons, M. (1992): The origin of ethylphenols
in wines. J. Sci. Food Agric. 60: 165-178.
Chatonnet, P., Dubourdieu, D. & Boidron, J.N. (1995): The influence of Brettanomyces /
Dekkera sp. yeasts and lactic acid bacteria on the ethylphenol content of red wines.
Am. J. Enol. Vitic. 46: 463-468.
Chatonnet, P., Viala, C. & Dubourdieu, D. (1997): Influence of polyphenolic components of
red wines on the microbial synthesis of volatile phenols. Am. J. Enol. Vitic. 48: 443-
448.
Ciani, M. & Ferraro, L. (1997): Role of oxygen on acetic acid production by
Brettanomyces/Dekkera in winemaking. J. Sci. Food. Agric. 75: 489-495.
Claussen, N.H. (1903): Improvements in and connected with the manufacture of English
beers or malt liquors and in the production of pure yeast cultures for use therein.
Eng. Pat. 28, 184, p. 204.
Cosentino, S., Fadda, M.E., Deplano, M., Mulargia, A.F. & Palmas F. (2001): Yeasts
associated with Sardinian ewe’s dairy products. Int. J. Food Microbiol. 69: 53-58.
Coton, E., Coton, M., Levert, D., Casaregola, S. & Sohier, D. (2006): Yeast ecology in
French cider and black olive natural fermentations. Int. J. Food Microbiol. 108: 130-
135.
Curtin, C.D., Bellon, J.R., Henschke, P.A., Godden, P.W. & de Barros Lopes, M.A. (2007):
Genetic diversity of Dekkera bruxellensis yeasts isolated from Australian wineries.
FEMS Yeast Res. 7: 471-481.
Custers, M.T.J. (1940): Onderzeokingen over het Gistseglacht Brettanomyces. Dissertation,
Universität Delft.
7. LITERATURVERZEICHNIS 122
Deak, T. (1995): Methods for the detection and identification of yeasts in foods. Trend Food
Sci. Tech. 6: 287-292.
De Rijk, P., Robbrecht, E., de Hoog, S., Caers, A., Van de Peer, Y. & de Wachter, R.
(1999): Database on the structure of large subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids
Res. 27: 174-178.
De Souza Liberal, A.T., Basilio, A.C.M., do Monte Resende, A., Brasileiro, B.T.V., da
Silva-Filho, E.A., de Morais, J.O.F., Simoes, D.A. & de Morais M.A. (2007):
Identification of Dekkera bruxellensis as a major contaminant yeast in continuous
ethanol fermentation. J. Appl. Microbiol. 102: 538.547.
Dias, L., Pereira-da-Silva, S., Tavares, M., Malfeito-Ferreira, M. & Loureiro, V. (2003):
Factors affecting the production of 4-ethylphenol by the yeast Dekkera bruxellensis
in enological conditions. Food Microbiol. 20: 377-384.
Dittrich, H.D. (1984): Essigstich – Noch immer Weinfehler Nr. 1. Ursachen und
Zusammenhänge. Deutsch. Weinb. 39: 1154-1163.
Dittrich H.D., Großmann, M. (2005): Mikrobiologie des Weines. Ulmer, Stuttgart
Duarte, F.L., Pais, C., Spencer-Martins, I. & Leao, C. (1999): Distinctive electrophoretic
isoenzyme profiles in Saccharomyces cerevisiae sensu stricto. Int J. System.
Bacteriol. 49: 1907-1913.
Eder, R. (2000): Pferdeschweiß. In Eder et al. (Hrsg.), Weinfehler - Erkennen, Vermeiden,
Beheben. Ulmer, Stuttgart, S. 110-115.
Egli, C.M. & Henick-Kling, T. (2001): Identification of Brettanomyces/Dekkera species
based on polymorphism in the rRNA internal transcribed spacer region. Am. J. Enol.
Vitic. 52: 241-247.
Esteve-Zarzoso, B., Manzanares, P., Ramón, D. & Querol, A. (1998): The role of non-
Saccharomyces in industrial winemaking. Int. Microbiol. 1: 143-149.
7. LITERATURVERZEICHNIS 123
Felsenstein J (1989) PHYLIP - Phylogeny Inference Package (Version 3.2). Cladistics 5:
164-166.
Fia, G., Giovani, G. & Rosi I. (2005): Study of β-glucosidase production by wine-related
yeasts during alcoholic fermentation. A new rapid fluorimetric method to determine
enzymatic activity. J. Appl. Microbiol. 99: 509-517.
Freer, S.N. (1991): Fermentation and aerobic metabolism of cellodextrins by yeasts. Appl.
Environ. Microbiol. 57: 655-659.
Fröhlich, J. (1999): Entwicklung und Einsatz von Isolierungstechniken zur
phylogenetischen Charakterisierung symbiontischer Mikroorganismen im Darm von
Termiten. Dissertation, Universität Ulm.
Fröhlich, J. & König, H. (2002): Gensonden zum Nachweis von Spezies der Gattung
Oenococcus. Patent application DE10204858.4.
Fröhlich, J. & Pfannebecker, J. (2006): Spezies-unabhängiges Nachweisverfahren für
biologisches Material. Patentanmeldung DE 102 06 022 569.
Fröhlich, J., König, H., Bandenburg, B. & Hirschhäuser, S. (2003): Gene probes for the
detection of the Oenococcus species. Patent application WO 03/066894 A2.
Fuchs, B.M., Glöckner, F.O., Wulf, J. & Amann, R. (2000): Unlabeled helper
oligonucleotides increase the in situ accessibility to 16S rRNA of fluorescently
labeled oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 66: 3603-3607.
Fuchs, B.M., Syutsubo, K., Ludwig, W. & Amann, R. (2001): In situ accessibility of
Escherichia coli 23S rRNA to fluorescently labeled oligonucleotide probes. Appl.
Environ. Microbiol. 67: 961-968.
Fugelsang, K.C. (1993): Brettanomyces and Dekkera: Implications in winemaking. In
Gump, B.H. (Ed.), Beer and Wine Production: Analysis, Characterization, and
Technological Advances. ACS Symposium Series 536: 110-131.
7. LITERATURVERZEICHNIS 124
Fugelsang, K.C. (1997): Yeasts and molds. In Fugelsang, K.C. (Ed.), Wine Microbiology.
Chapman and Hall, New York, pp. 68-116.
Fugelsang, K. C. & Edwards, C. G. (2007): Wine microbiology, practical applications and
procedures. Springer, New York.
Gancedo, C. & Serrano, R. (1989): Energy-yielding metabolism. In Rose, A.H. & Harrison,
J.S. (Eds.), The Yeasts, 2nd ed., vol. 3. Academic Press, London, pp. 205-251.
Gilliland, R.B. (1961): Brettanomyces. I. Occurence, characteristics, and effects on beer
flavour. J. Inst. Brew. 67: 257-261.
Grbin, P.R. & Henschke, P.A. (2000): Mousy off-flavour production in grape juice and wine
by Dekkera and Brettanomyces. Aust. J. Grape Wine R. 6: 255-262.
Gutell, R.R., Gray, M.W. & Schnare, M.N. (1993): A compilation of large subunit (23S and
23S-like) ribosomal RNA structures: 1993. Nucleic Acids Res. 21: 3055-3074.
Hassouna, N., Michot, B. & Bachellerie, J. (1984): The complete nucleotide sequence of a
mouse 28S rRNA gene. Implications for the process of size increase of the large
subunit in higher eukaryotes. Nucleic Acids Res. 12: 3563-3583.
Henry-Stanley, M.J., Garni, R.M. & Wells, C.L. (2004): Adaption of FUN-1 and Calcofluor
white stains to assess the ability and viable and nonviable yeast to adhere to and be
internalized by cultured mammalian cells. J. Microbiol Methods 59: 289-292.
Heresztyn, T. (1986): Metabolism of volatile phenolic compounds from hydroxycinnamic
acids by Brettanomyces yeasts. Arch. Microbiol. 146: 96-98.
Hesford, F. & Schneider, K. (2004): Die Entdeckung eines dritten Ethylphenols als
Mitverursacher des Brettanomyces-Fehltons. Schweiz. Z. Obst-Weinbau 13: 11-13.
7. LITERATURVERZEICHNIS 125
Hirschhäuser, S. (2002): Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Einzelzell-
Mikromanipulation als neue Anwendungen bei der Identifizierung von Oenococcus
oeni- Stämmen. Diplomarbeit, Universität Mainz.
Hirschhäuser, S., Fröhlich, J., Gneipel, A., Schönig, I. & König, H. (2005): Fast protocols
for the 5S rDNA and ITS-2 based identification of Oenococcus oeni. FEMS
Microbiol. Lett. 244: 165-171.
Hoeben, P., Weiller, G. & Clark-Walker, G.D. (1993): Larger rearranged mitochondrial
genomes in Dekkera/Brettanomyces yeasts are more closely related than smaller
genomes with a conserved gene order. J. Mol. Evol. 36: 263-269.
Hopple, J.S. & Vilgalys, R. (1999): Phylogenetic relationships in the mushroom genus
Coprinus and dark-spored allies based on sequence data from the nuclear gene
coding for the large ribosomal subunit RNA: divergent domains, outgroups, and
monophyly. Mol. Phylogenet. Evol. 13: 1-10.
Hyldig-Nielsen, J.J., O’Keefe, H.P. & Stender, H. (2000): Probes, probe sets, methods and
kits pertaining to the detection, identification and/or enumeration of yeast;
particularly in wine. Patent application: WO 0077259.
Ibeas, J.I., Lozano, I., Perdigones, F. & Jimenez, J. (1996): Detection of Dekkera-
Brettanomyces strains in sherry by a nested PCR method. Appl. Environ. Microbiol.
62: 998-1003.
Inacio, J., Behrens, S., Fuchs, B.M., Fonseca, A., Spencer-Martins, I. & Amann, R. (2003):
In situ accessibility of Saccharomyces cerevisiae 26S rRNA to Cy3-labelled
oligonucleotide probes comprising the D1 and D2 domains. Appl. Environ.
Microbiol. 69: 2899-2905.
Johnston, M., Hillier, L., Piles, et al. (1997): The nucleotide sequence of Saccharomyces
cerevisiae chromosome XII. Nature 387: 87-90.
Koch, H.-J. (1995): Rheinhessisches Weinlexikon. Verlagsgruppe Rhein Main, Mainz.
7. LITERATURVERZEICHNIS 126
Knippers, R. (2006): Molekulare Genetik. Thieme, Stuttgart.
Kreger-van Rij (1984): The Yeasts, a Taxonomic Study. Elsevier, Amsterdam.
Kreger-van Rij (1987): Classification of yeasts. In Rose, A.H. & Harrison, J.S. (Eds.), The
Yeasts, Biology of Yeasts (2nd ed.). Academic Press, London, pp. 5-61.
Kunkee, R. & Bisson, L. (1993): Winemaking yeasts. In Rose, A.H. & Harrison, J.S. (Eds.),
The Yeasts, Yeast Technology (2nd ed.). Academic Press, London, pp. 69-127.
Kurtzman, C.P. (2006): Yeast species recognition from gene sequence analyses and other
molecular methods. Mycoscience 47: 65-71.
Kurtzman, C.P. & Fell, J.W. (1998): The Yeasts, a Taxonomic Study. Elsevier,
Amsterdam.
Kurtzman, C.P. & Robnett, C.J. (1998): Identification and phylogeny of ascomycetous
yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial
sequences. Antonie Van Leeuwenhoek 73: 331-371.
Lagunas, R., Dominguez, C., Busturia, A. & Saéz, M. J. (1982): Mechanisms of appearance
of the Pasteur Effect in Saccharomyces cerevisiae: Inactivation of sugar transport
systems. J. Bacteriol. 152: 19-25.
Lebaron, P., Catala, Ph., Parthuisop, N. (1998): Effectiveness of SYTOX Green stain for
bacterial viability assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64:2697-2700.
Leitch, A.R., Schwarzacher, T., Jackson, D. & Leitch I.J. (1994): In situ-Hybridisierung.
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.
Lenaerts, J., Lappin-Scott, H.M. & Porter, J. (2007): Improved fluorescent in situ
hybridization method for detection of bacteria from activated sludge and river water
by using DNA molecular beacons and flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 73:
2020-2023.
7. LITERATURVERZEICHNIS 127
Licker, J.L., Acree, T.E. & Henick-Kling, T. (1998): What is „Brett“ (Brettanomyces)
Flavor? ACS Symposium Series 714: 96-115.
Loureiro, V. & Malfeito-Ferreira, M. (2003): Spoilage yeasts in the wine industry. Int. J.
Food Microbiol. 86: 23-50.
Loureiro, V. & Querol, A. (1999): The prevalence and control of spoilage yeasts in food and
beverages. Trends Food Sci. Technol. 10: 356-365.
Lloyd, D. & Hayes, A.J. (1995): Vigour, vitality and viability of microorganisms. FEMS
Microbiol. Lett. 133: 1-7.
Malfeito-Ferreira, M., Tareco, M. & Loureiro, V. (1997): Fatty-acid profiling: A feasible
typing system to trace yeast contamination in bottling plants. Int. J. Food Microbiol.
38: 143-155.
Mathews, D.H., Disney, M.D., Childs, J.L., Schroeder, S.J., Zuker, M. & Turner, D.H.
(2004): Incorporating chemical modification constraints into a dynamic
programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. P. Natl. Acad.
Sci. USA 101: 7287-7292.
Mazzoni, C., Zarzov, P. Rambourg, A. & Mann, C. (1993): The SLT2 (MPK1) MAP kinase
homolog is involved in polarized cell growth in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell
Biol. 123: 1821-1833.
McMahon, H., Zoecklein, B.W., Fugelsang, K. & Jasinski, Y. (1999): Quantification of
glycosidase activities in selected yeasts and lactic acid bacteria. J. Ind. Microbiol.
Biotechnol. 23: 198-203.
Millard, P.J., Roth, B.L., Thi, H.-P.,T., Yue, S.T. & Haugland R.P. (1997): Development of
the FUN-1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of
yeasts. Appl Environ. Microbiol. 63: 2897-2905.
7. LITERATURVERZEICHNIS 128
Mitrakul C.M., Henick-Kling T. & Egli C.M. (1999): Discrimination of
Brettanomyces/ Dekkera yeast isolates from wine by using various DNA fingerprint
methods. Food Microbiol 16: 3-14.
Musters, W., Planta, R.J., van Heerikhuizen, H. & Raué, H.A. (1990): Functional analysis of
the transcribed spacers of Saccharomyces cerevisiae ribosomal DNA: it takes a
precursor to form a ribosome. In Hill et al. (Eds.), The Ribosome: Structure,
Function, and Evolution. American Society for Microbiology, Washington DC,
pp. 435-442.
Navascués, E. & Rasines, G. (2003): Método de detección directa de Brettanomyces spp. en
vinos de crianza en barrica. Enologos, 23: 24-26.
Nisiotou, A.A. & Gibson, G.R. (2005): Isolation of culturable yeasts from market wines and
evaluation of the 5.8S-ITS rDNA sequence analysis for identification purposes. Lett.
Appl. Microbiol. 41: 454-463.
Obrig, T.G., Culp, W.J., McKeehan, W.L. & Hardesty, B. (1971): The mechanism by which
cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on
reticulocyte ribosomes. J- Biol. Chem. 246: 174-181.
O’Meara, D., Nilsson, N., Nygren, P., Uhlén, M. & Lundeberg, J. (1998): Capture of single-
stranded DNA assisted by oligonucleotide modules. Anal. Biochem. 255: 195-203.
Page, R.D.M. (1996): TreeView: An application to display phylogenetic trees on personal
computers. Computer Applications in the Bioscience 12: 357-358.
Pernthaler, A. Pernthaler, J. & Amann, R. (2002): Fluorescence in situ hybridization and
catalyzed reporter deposition for the identification of marine bacteria. Appl. Environ.
Microbiol. 68: 3094-3101.
Pfannebecker, J. (2005): Entwicklung einer PCR-Methode zur Stammanalyse von pro- und
eukaryotischen Mikroorganismen aus Wein. Diplom-Arbeit, Universität Mainz.
7. LITERATURVERZEICHNIS 129
Phister, T.G. & Miller, D.A. (2003): Real-time PCR assay for detection and enumeration of
Dekkera bruxellensis in wine. Appl. Environ. Microbiol. 69: 7430-7434.
Praphailong, W., Van Gestel, M., Fleet, G.H. & Heard, G.M. (1996): Evaluation of the
Biolog system for the identification of food and beverage yeasts. Lett. Appl.
Microbiol. 24: 455-459.
Renouf, V., Falcou, M., Miot-Sertier, C., Perello, M.C., Revel, G.D. & Lonvaud-Funel, A.
(2006): Interactions between Brettanomyces bruxellensis and other yeasts species
during the initial stages of winemaking. J. Appl. Microbiol. 100: 1208-1219.
Röder, C., König, H. & Fröhlich, J. (2007a): Species-specific identification of Dekkera/
Brettanomyces yeasts by fluorescently labeled DNA probes targeting the 26S rRNA.
FEMS Yeast Res. 7: 1013-1026.
Röder, C., von Walbrunn, C & Fröhlich, J. (2007b): Detektion und Untersuchung der
Verbreitung der Wein-relevanten Schädlingshefe Dekkera (Brettanomyces)
bruxellensis in Rheinhessen. Dtsch. Lebensm.-Rundsch. 103: 353-359.
Rodrigues, N., Gonçalves, G., Pereira-da-Silva, S., Malfeito-Ferreira, M. & Loureiro, V.
(2001): Development and use of a new medium to detect yeasts of the genera
Dekkera/Brettanomyces. J. Appl. Microbiol. 90: 588–599.
Romano, P., Suzzi, G., Comi, G. & Zironi, R. (1992): Higher alcohol and acetic acid
production by apiculate wine yeasts. J. Appl. Bacteriol. 73: 126-130.
Rotman, B. & Papermaster, B.W. (1966): Membrane properties of living mammalian cells
as studied by enzymatic hydrolysis of fluorogenic esters. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 55: 134-141.
Sanger, F., Niclen, S. & Coulen, A.R. (1977): DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74: 5463-5467.
7. LITERATURVERZEICHNIS 130
Scheffers, W. A. (1979): Anaerobic inhibition in yeasts (Custers effect). Antonie Van
Leeuwenhoek 45: 150.
Scheffers, W.A. & Wilkén, T.O. (1969): The Custer effect (negative Pasteur effect) as a
diagnostic criterion for the genus Brettanomyces. Antonie Van Leeuwenhoek.
Supplement: Yeast Symposium, 35: 31-32.
Scott, J.H. & Schekman, R. (1980): Lyticase: endoglucanase and protease activities that act
together in yeast cell lysis. J.Bacteriol. 2: 414-423.
Shantha Kumara, H.M.C. De Cort, S. & Verachtert, H. (1993): Localization and
characterization of α-Glucosidase activity in Brettanomyces lambicus. Appl Environ.
Microbiol. 59: 2352-2358.
Smith, M.T.H. (1998a): Dekkera van der Walt. In Kurtzman C.P. & Fell J.W. (Eds.), The
Yeasts, a Taxonomic Study (4th ed.). Elsevier, Amsterdam, pp. 174-177.
Smith, M.T.H. (1998b):Brettanomyces Kufferath et van Laer. In The Yeasts, a Taxonomic
Study (4th ed.). Elsevier, Amsterdam, pp. 450-453.
Smith, M.T. & van Grinsven, A.M. (1984): Dekkera anomala sp. nov., the teleomorph of
Brettanomyces anomalus, recovered from spoiled soft drinks. Antonie van
Leeuwenhoek 50: 143-148.
Snowdon, E.M., Bowyer, M.C., Grbin, P.R. & Bowyer, P.K. (2006): Mousy off-flavor: A
review. J. Agric. Food Chem. 54: 6465-6474.
Sponholz, W.R. (1992): Wine spoilage by microorganisms. In Fleet, G.H. (Ed.), Wine
Microbiology and Biotechnology. Harwood Academic Publishers, Reading,
pp. 395-419.
7. LITERATURVERZEICHNIS 131
Sponholz, W.R., Dittrich, H.H. (1974): Die Bildung von SO2-bindenden
Gärungsnebenprodukten, höheren Alkoholen und Estern bei einigen
Reinzuchthefestämmen und bei einigen für für die Weinbereitung wichtigen
„wilden“ Hefen. Wein-Wiss. 29: 301-314.
Sponholz, W.R., Dittrich, H.H. & Han, K. (1990): Die Beeinflussung der Gärung und der
Essigsäureethylesterbildung durch Hanseniaspora uvarum. Wein-Wiss. 45: 65-72.
Stager, C.E. & Davis, J.R. (1992): Automated systems for identification of microorganisms.
Clin. Microbiol. Rev. 5: 302-327.
Stahl, D.A. & Amann, R. (1991): Development and application of nucleic acid probes. In
Stackebrandt, E. & Goodfellow, M. (Eds.), Nucleic acid techniques in bacterial
systematics. John Wiley & Sons, New York, pp. 205-248.
Steidl, R. & Renner, W. (2001): Moderne Rotweinbereitung. Ulmer, Stuttgart.
Stender, H., Kurtzman, C., Hyldig-Nielsen, J.J., Sørensen, D., Broomer, A., Oliveira, K.,
Peery-O´Keefe, H., Sage, A., Young, B. & Coull, J. (2001): Identification of
Dekkera bruxellensis (Brettanomyces) from wine by fluorescence in situ
hybridization using peptide nucleic acid probes. Appl. Environ. Microbiol. 67:
938-941.
Suárez, R., Suárez-Lepe, J.A. Morata, A. & Calderón, F. (2007): The production of
ethylphenols in wine by yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera: A review.
Food Chem. 102: 10-21.
Tanious, F.A., Veal, J.M., Buczak, H., Ratmeyer, L.S. & Wilson, W.D. (1992): DAPI (4’,6-
diamidino-2-phenylindole) binds differently to DNA and RNA: minor-groove
binding at AT sites and intercalation at AU sites. Biochemistry 31: 3103-3112.
Thomas, S. (1993): Yeasts as spoilage organisms in beverages. In Rose, A.H. & Harrison,
J.S. (Eds.), The Yeasts, 2nd ed., vol. 5. Academic Press, London, pp. 517-561.
7. LITERATURVERZEICHNIS 132
Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins, D.G. (1997): The
CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment
aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 24: 4876-4882.
Ugarte, P., Agosin, E., Bordeu, E. & Villalobos J.I. (2005): Reduction of 4-ethylphenol and
4-ethylguajakol concentration in red wines using reverse osmosis and adsorption.
Am. J. Enol. Vitic. 56: 30-36.
Uscanga, M.G.A., Abarca, B.I.E., Rodriguez, J.G. & Garcia, R.C. (2007): Carbon sources
and their effect on growth, acetic acid and ethanol production by Brettanomyces
bruxellensis in batch culture. J. Food Process Eng. 30: 13-23.
Vanderhaegen, B., Neven, H., Coghe, S., Verstrepen, K.J., Derdelinckx, G. & Verachtert, H.
(2003): Bioflavoring and beer refermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:
140-150.
Van der Walt, J.P. (1964): Dekkera, a new genus of the Saccharomycetaceae. Antonie van
Leeuwenhoek 30: 273-280.
Van der Walt, J.P. (1984a): Dekkera van der Walt. In Kreger-van Rij, N.J.W. (Ed.), The
Yeasts, a Taxonomic Study (3rd ed.). Elsevier, Amsterdam, pp. 146-150.
Van der Walt, J.P. (1984b): Brettanomyces Kufferath et van Laer. In Kreger-van Rij, N.J.W.
(Ed.), The Yeasts, a Taxonomic Study (3rd ed.). Elsevier, Amsterdam, pp. 146-150.
Van Urk, H., Voll, W. S. L., Scheffers, W. A. & Van Dijken, J. P. (1990): Transient-state
analysis of metabolic fluxes in crabtree-positive and crabtree-negative yeasts. Appl.
Environ. Microbiol. 56: 281-287.
Veldhuis, M.J.W., Cucci, T.L. & Sieracki, M.E. (1997): Cellular DNA content of marine
phytoplankton using two new fluorochromes: Taxonomic and ecological
implications. J. Phycol. 33: 527-541.
7. LITERATURVERZEICHNIS 133
Wheeler, D.L., Chappey, C., Lash, A.E., Leipe D.D., Madden, T.L., Schuler, G.D.,
Tatusova, T.A. & Rapp, B.A. (2000): Database resources of the National Center for
Biotechnology Information. Nucleic Acids Res. 28: 10-14.
White, T.J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J. (1990): Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocolls: A Guide to
Methods and Applications. Academic Press Inc., pp. 315-322.
Wijsman, M.R., van Dijken, J.P., van Kleeff, B.H.A. & Scheffers, W.A. (1984): Inhibition
of fermentation and growth in batch cultures of the yeast Brettanomyces intermedius
upon a shift from aerobic to anaerobic conditions (Custer effect). Antonie van
Leeuwenhoek 50: 183-192.
Xufre, A., Albergaria, H., Inácio, J., Spencer-Martins, I. & Girio, F. (2006): Application of
fluorescence in situ hybridization (FISH) to the analysis of yeast population
dynamics in winery and laboratory grape must fermentations. Int. J. Food Microbiol.
108: 376-384.
Yamada, Y., Matsuda, M., Maeda, K. & Mikata, K. (1994): The phylogenetic relationships
of species of the genus Dekkera van der Walt based on the partial sequences of the
18S and 26S ribosomal RNAs (Saccharomycetaceae). Biosci. Biotechnol. Biochem.
58: 1803- 1808.
Yamane, A. (2000): Smart probe: A novel fluorescence quenching-based oligonucleotide
probe carrying a fluorophore and an intercalator. Nuleic Acids Symp. Ser. 44:
297-298.
Yilmaz, L.S. & Noguera, D.R. (2004): Mechanistic approach to the problem of
hybridization efficiency in fluorescent in situ hybridization. Appl. Environ.
Microbiol. 70: 7126-7139.
Zuker, M. (2000): Calculating nucleic acid secondary structure. Curr. Opin. Struct. Biol. 3:
303-310.
8. ANHANG 134
8. Anhang
8.1 Vergleichende Sequenzanalysen für die Konstruktion phylogenetischer
Stammbäume
8.1.1 ITS-Regionen
Die mit einer „1“ versehenen Sequenzpositionen wurden für die phylogenetische
Stammbaum-Analyse (Abb. 18) verwendet. Eine hinterlegte Sequenz von S. cerevisiae
(Acc. Z95939) wurde als Außengruppe einbezogen. Typstämme (T) und Isolate (St.) siehe
Tabelle 7.
B. custersianusT CGAGTGCAAGCATTATACACATGTTTTCA---TTAGC-ATACA----AACACAAC----A B. nanusT CAAGTAAAAACTTGCAAGCAACCTTGCCAGC-TCCGCCATACACGTGAGTAATTA----C B. naardenensisT GAAGATAATTGGACGTTTCATTTTTGTGACG-TCCCAAAAAAACAC-TTTAAATC----T D. brux. St. 374 CCCGTGCAGA--CACGTGGATAAGCAA-------GGATAAAAATACATTAAATTT----- D. brux. St. 566 CCCGTGCAGA--CACGTGGATAAGCAA-------GGATAAAAATACATTAAATTT----- D. brux. St. 568 CCCGTGCAGA--CACGTGGATAAGCAA-------GGATAAAAATACATTAAATTT----- D. brux. St. 567 CCCGGGCAGA--CACGTGGATAAGCAA-------GGATAAAAATACATTAAATTT----- D. brux. St. 573 CCCGTGCAGA--CACGTGGATAAGCAA-------GGATAAAAATACATTAAATTT----- D. brux. St. 579 CCCGTGCAGA--CACGTGGATAAGCAA-------GGATAAAAATACATTAAATTT----- D. bruxellensisT CCCGTGCAGA--CACGTGGATAAGCAA-------GGATAAAAATACATTAAATTT----- D. anomalaT CCCGTGCAGAAACACATGTATGAGGAAATTATAGGGAGAAATCCATATAAAACACGCAAA S. cerevisiae CCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAA * * * *
111111111100111111111111111000000011101111100001111111100000 B. custersianusT AACCAAAATTTATCAACA---CTTTA---TTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC B. nanusT AAACAGTACCTGTCAACAT-ACGAAA---TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC B. naardenensisT ATATTTTAT-TGTCGAAATTACAAAAAGTTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC D. brux. St. 374 ATTTAGTTT-AGTCAAGAAAG---AAT-TTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC D. brux. St. 566 ATTTAGTTT-AGTCAAGAAAG---AAT-TTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC D. brux. St. 568 ATTTAGTTT-AGTCAAGAAAG---AAT-TTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC D. brux. St. 567 ATTTAGTTT-AGTCAAGAAAG---AAT-TTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC D. brux. St. 573 ATTTAGTTT-AGTCAAGAAAG---AAT-TTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC D. brux. St. 579 ATTTAGTTT-AGTCAAGAAAG---AAT-TTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC D. bruxellensisT ATTTAGTTT-AGTCAAGAAAG---AAT-TTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC D. anomalaT ATATATTTT-AGTCAAATAAATGAAAA-TTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC S. cerevisiae TTTTCGTAACTGGAAATTTTA--AAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC * * * ************** ************** 111111111011111111000000110001111111111111111111111111111111 B. custersianusT TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATAACTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA B. nanusT TCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATAACTAATGTGAATTGCAGATTTT-GTGA B. naardenensisT TCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATAACTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA D. brux. St. 374 TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA D. brux. St. 566 TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA D. brux. St. 568 TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA D. brux. St. 567 TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA D. brux. St. 573 TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA D. brux. St. 579 TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA D. bruxellensisT TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA
8. ANHANG 135
D. anomalaT TCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTTTCGTGA S. cerevisiae TCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGA **** ********** ********* ******* **************** ** **** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111101111 B. custersianusT ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTTG B. nanusT ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCTTTTGGTATTCCGAAAGGCATGCCTGTTTG B. naardenensisT ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCACCCCCTGGTATTCTGGGGGGTATTCCTGTTTG D. brux. St. 374 ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTG D. brux. St. 566 ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTG D. brux. St. 568 ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTG D. brux. St. 567 ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTG D. brux. St. 573 ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTG D. brux. St. 579 ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTG D. bruxellensisT ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTG D. anomalaT ATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTG S. cerevisiae ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGC-CCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTG ******** * *************** ** ******** ** ** ******** 111111111111111111111111111011111111111111111111111111111111 B. custersianusT AGCGTCATTTCCTTCTAACTATACAGTAGTTGTGATGAC-GGCACCGC--GTGCGG-TCC B. nanusT AGCGTGACAACGCCTCCATTGGCCTCCAATGGTATTGTG-GATACATA--GTA----TCC B. naardenensisT AGCGTCATTTCCTTCTCA-----CGCAAGTGGTTTTGAA-GATACCTCTCGTGGGGTTTC D. brux. St. 374 AGCGTCATTTCCTTCTCACTATTT---AGTGGTTATGAG-ATTACACGA-GGGTGTTTTC D. brux. St. 566 AGCGTCATTTCCTTCTCACTATTT---AGTGGTTATGAG-ATTACACGA-GGGTGTTTTC D. brux. St. 568 AGCGTCATTTCCTTCTCACTATTT---AGTGGTTATGAG-ATTACACGA-GGGTGTTTTC D. brux. St. 567 AGCGTCATTTCCTTCTCACTATTT---AGTGGTTATGAG-ATTACACGA-GGGTGTTTTC D. brux. St. 573 AGCGTCATTTCCTTCTCACTATTT---AGTGGTTATGAG-ATTACACGA-GGGTGTTTTC D. brux. St. 579 AGCGTCATTTCCTTCTCACTATTT---AGTGGTTATGAG-ATTACACGA-GGGTGTTTTC D. bruxellensisT AGCGTCATTTCCTTCTCACTATTT---AGTGGTTATGAG-ATTACACGA-GGGTGTTTTC D. anomalaT AGCGTCATTTCCTTCTCACTTCTCTGGAGTGGTTATGAG-AATACGCGG-TAGTGTTTTC S. cerevisiae AGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGA-GTTAAC ***** * * * * ** ** ** * 111111111111111111000001000111111111111011111111001110000111 B. custersianusT GTCGAAGAGAA-------------TGACAGTTA------------ACGGA---------- B. nanusT ACCAAAAAGAA-------------AGTACG---------------AAGAA---------- B. naardenensisT TTTCAAAGGAATTCTGAATTT---AGTTGGCTTCTT--GTTTGCTAACAACGGTT----- D. brux. St. 374 TTCAAAGGGAA--------------GAGGGGAG-----TGAGGGGA-TAATGATT----- D. brux. St. 566 TTCAAAGGGAA--------------GAGGGGAG-----TGAGGGGA-TAATGATT----- D. brux. St. 568 TTCAAAGGGAA--------------GAGGGGAG-----TGAGGGGA-TAATGATT----- D. brux. St. 567 TTCAAAGGGAA--------------GAGGGGAG-----TGAGGGGA-TAATGATT----- D. brux. St. 573 TTCAAAGGGAA--------------GAGGGGAG-----TGAGGGGA-TAATGATT----- D. brux. St. 579 TTCAAAGGGAA--------------GAGGGGAG-----TGAGGGGA-TAATGATT----- D. bruxellensisT TTCAAAGGAAA--------------GAGGGGAGAG---TGAGGGGA-TAATGATT----- D. anomalaT TTGAAAGGGAAAGGGGGAAAGCCCGGTGGGGAGTATACTGGGAGGAGTAATAATT----- S. cerevisiae TTGAAATTGCTGGCCTT-TTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTG ** * *
111111111110000000000000011111000000000000000101110000000000 B. custersianusT -GTAAGGTTTCGACCA------GTCGTTGA-------------------------CTTTT B. nanusT -TTAAGGTTTCGGCCA------GGCTTTGT-------------------------TATTT B. naardenensisT -TTAAGGTTTCGACCA------TTCGTTGAAAGCAAAA---------------AGTAGTC D. brux. St. 374 -T-AAGGTTTCGGCCG------TTCATTATTTTTTTT----------------TTCTCCC D. brux. St. 566 -T-AAGGTTTCGGCCG------TTCATTATTTTTTTT----------------TTCTCCC D. brux. St. 568 -T-AAGGTTTCGGCCG------TTCATTATTTTTTCT----------------T-CTCCC D. brux. St. 567 -T-AAGGTTTCGGCCG------TTCATTATTTTTTTT----------------TTCTCCC D. brux. St. 573 -T-AAGGTTTCGGCCG------TTCATTATTTTTTCT----------------T-CTCCC D. brux. St. 579 -T-AAGGTTTCGGCCG------TTCATTATTTTTTCT----------------T-CTCCC D. bruxellensisT -T-AAGGTTTCGGCCG------TTCATTATTTTTTTC----------------TTCTCCC D. anomalaT -ACAAGGTTTCGGCCGA-----TTTATTGCGTCTTCTAGCAACTCCTACTGAGTCCCCCC S. cerevisiae CTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTT **** * * **
010111111111111100000011111111000000000000000000000000011111 B. custersianusT A------TCT B. nanusT T------TTT B. naardenensisT AATGACCTTG
8. ANHANG 136
D. brux. St. 374 CCAGTTACC- D. brux. St. 566 CCAGTTACC- D. brux. St. 568 CCAGTTATC- D. brux. St. 567 CCAGTTACC- D. brux. St. 573 CCAGTTATC- D. brux. St. 579 CCAGTTATC- D. bruxellensisT CCAGTTATC- D. anomalaT CCAATTTTCT S. cerevisiae ATACTGAGCG
1000000110
8.1.2 26S rDNA-Sequenzen
Die mit einer „1“ versehenen Sequenzpositionen wurden für die phylogenetische
Stammbaum-Analyse (Abb. 21) verwendet. Eine hinterlegte Sequenz von S. cerevisiae
(Acc. J01355) wurde als Außengruppe einbezogen. Zugriffsnummern für Sequenzen von
Typstämmen (T) und Isolat (St.) siehe Tabelle 12.
D. bruxellensisT GAGGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGC D. brux. St. 579 GAGGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGC D. anomalaT GAGGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGC B. custersianusT GAGGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGC B. nanusT GAGGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGC B. naardenensisT GAGGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGC S. cerevisiae GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGG-ATTGC *** *********************************************** ** ***** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CCCAGTAATGGCGAATGAAGCGGCAAGAGCCCAAATTTGAAATCGGG--CAACCG----- D. brux. St. 579 CCCAGTAATGGCGAATGAAGCGGCAAGAGCCCAAATTTGAAATCGGG--CAACCG----- D. anomalaT CCCAGTAATGGCGAATGAAGCGGCAAGAGCCCAAATTTGAAATCAGG--CCCTCGCGGCT B. custersianusT CTCAGTAATGGCGAACGAAGCGGCAACAGCCCAAATTTGAAATCTGG--CGTAAGCC--- B. nanusT CTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCGAATTTGAAATCAAG--TTTTCT----- B. naardenensisT CTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCGAATTTGAAATC--C--TCTTCGGAG-- S. cerevisiae CTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCC * ***** ***** ********** *** * *********** 111111111111111111111111110111111111111111110110010111100000 D. bruxellensisT --AGTTGTAATTTGGAGACGGGACACTAGAGAGGAG-GAAGGCGATT----AAGTGCCTT D. brux. St. 579 --AGTTGTAATTTGGAGACGGGACACTAGAGAGGAG-GAAGGCGATT----AAGTGCCTT D. anomalaT TGAGTTGTAATTTGGAGACGGGATACTAGAGAGAGG-GAGGGCGACT----AAGTGCCTT B. custersianusT CGAGTTGTAATTTGGAGGTAGACTATTTGGGTGTCT-GT-GTCAACT----AAGTGCCTT B. nanusT TGAATTGTAATTTGAAGAAGCGTCGCAAGGTGGAGT-GA--TAGTGC----AAGTGCCTT B. naardenensisT -GAGTTGTAATTTGAAGCTGGTTCTTTAGGGAGTTTTGTTTTTGGCTGCGGAAGTGCCTT S. cerevisiae CGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGT--TCCTTGTCT----ATGTTCCTT * ********** ** * * ** **** 011111111111111111011111111111111001011011111110000111111111 D. bruxellensisT GGAACAGGCTGCCGTAGAGGGTGAGAGCCCCGTGAATCG-CTGGA--GACCGATCAATTA D. brux. St. 579 GGAACAGGCTGCCGTAGAGGGTGAGAGCCCCGTGAATCG-CTGGA--GACCGATCAATTA D. anomalaT GGAACAGGCTGCCGTAGAGGGTGAGAGCCCCGTGAGTCG-CGTGA--ACTTGATCAATTA B. custersianusT GGAATAGGCCGCCGTAGAGGGTGAGAGCCCCGTGAGTTGACTAGC--AGTTATTCAGTT- B. nanusT GGAACAGGCCGCCAAGGAGGGTGAGAGCCCCGTGACACTACCACCG-ACACCGTCAGCGA B. naardenensisT GGAACAGGCCGCCGTGGAGGGTGAGAGCCCCGTATCGTGGCCAGCA-AGATTTTCGTATA S. cerevisiae GGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGCATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAA **** *** * * ********* ***** * 111111111111111111111111111111111110111010110001001001110111
8. ANHANG 137
D. bruxellensisT GTGCCCGCCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTATATTCCAT D. brux. St. 579 GTGCCCGCCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTATATTCCAT D. anomalaT GTGCCCGCCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTATATTCCAT B. custersianusT -TGTCTTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGATTGCAGCTCTAAGTGGGTGGTATATTCCAT B. nanusT -TGCCT--CGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGCGGGTGGTATATTCCAT B. naardenensisT AGGGCTAGCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTATATTCCAT S. cerevisiae GTGCCTT-CGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT * * *** ****************** ************ ******** ******* 111111011111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CTAAGGCTAAATATTAGCGAGAGACCGATAGCAAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAA D. brux. St. 579 CTAAGGCTAAATATTAGCGAGAGACCGATAGCAAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAA D. anomalaT CTAAGGCTAAATATTAGCGAGAGACCGATAGCAAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAA B. custersianusT CTAAGGCTAAATAATAGCGAGAGACCGATAGCAAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAA B. nanusT CTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCAAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAA B. naardenensisT CTAAGGCTAAATATGGGCGAGAGACCGATAGCAAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAA S. cerevisiae CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAA **** ******** **************** *************************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT AGAACTTTGGAAAGAGAGTGAAATAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTTGAT D. brux. St. 579 AGAACTTTGGAAAGAGAGTGAAATAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTTGAT D. anomalaT AGAACTTTGGAAAGAGAGTGAAATAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTTGAT B. custersianusT AGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATCTGAT B. nanusT AGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTTGAT B. naardenensisT AGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTTGAT S. cerevisiae AGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGAT ********* ************* **************************** ** **** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CCGACATGGTGTTTAGCAGCGGCCCGTTCCTCGTGGATGGGTGCACCT-GGTTTACACTG D. brux. St. 579 CCGACATGGTGTTTAGCAGCGGCCCGTTCCTCGTGGATGGGTGCACCT-GGTTTACACTG D. anomalaT CCGACATGGTGTTTAGCAGCGGCCCGTTCCTCGTGGATGGGTGCACCT-GGTTTACACTG B. custersianusT CCGACGTGGTATTTAGATGTCGCCTGC-CCTTGTGGC-GGGTGCTCCA-TTTTTTTACTG B. nanusT CCGACAGACCTTTTAA-----------------------GGTG--------------GTG B. naardenensisT CCGACATGGTATTTAGATGTCGCTTGC-CCCCGTGGC-GGGCGCTCCA-TCTTTTTACTG S. cerevisiae CAGACATGGTGTTTTG-TGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTG * *** *** ** * ** 111111111111111100110111010111111111011111111111010111011111 D. bruxellensisT GGCCAGCATCGGTTCTGGGAGCCATATACGGGGTTCGTGAATGTGGCCCT--TCGATTCT D. brux. St. 579 GGCCAGCATCGGTTCTGGGAGCCATATACGGGGTTCGTGAATGTGGCCCT--TCGATTCT D. anomalaT GGCCAGCATCGGTTCTGGGAGCCATATACGGGGCCGGCGAATGTGGCCCT--TCGATTCT B. custersianusT GGCCAGCGTGAGTTAGAAGGGGATGAAAAGGCGGGAACGAATGTAGCCTTCCTCCCTTTG B. nanusT --CCAGCATCGGTTGGCGAAGAAGGATAAAGGTGTGGC-AATGTGCCCCT---------- B. naardenensisT GGCCAGCATCGGTGCTGGGCGGGACAGGAGGTTTCTGTGAATGTAGCCCT--TC------ S. cerevisiae GGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGG-AATGTAGCTTGCCTC------ ***** * ** * * ***** * 111111111111111111111101011111111010101111111111110011001100 D. bruxellensisT GTCGGAGGGTGTTATAGCGCGGA--CATCTTGTGGCTAGCCGGGACCGGGGACTGCGG-- D. brux. St. 579 GTCGGAGGGTGTTATAGCGCGGG--CATCTTGTGGCTAGCCGGGACCGGGGACTGCGG-- D. anomalaT GTCGGAGGGTGTTATAGCGCCAG--CCAGACGTGGCTATCCGGGACCGGGGACTGCGG-- B. custersianusT GGAGAGGGGTGTTATAACATTCC--TGTTTAGTTCCTTTCTG--ACTGAGGTCCGCGG-- B. nanusT ---TCGGGGAGTTATAGGCCGCG--CACAGACTT-CTCTTGGCGACCGAGGACTGCGGAA B. naardenensisT ----GGGGAACTTATAGAACAGGATTCATACGTCTCTCCCCGGTACCGAGGACTGCGG-- S. cerevisiae ---GGTAAGTATTATAGCCTGTG--GGAATACTG-CCAGCTGGGACTGAGGACTGCGA-- ***** * * * ** * ** * *** 100110111111111111011010010001011101110111111111111111111100 D. bruxellensisT ----TGACT--TGTCACCAAGGATGCTGGCAGAACGAGCAAATACCACCCGTCTTGAAAC D. brux. St. 579 ----TGACT--TGTCACCAAGGATGCTGGCAGAACGAGCAAATACCACCCGTCTTGAAAC D. anomalaT ----CGATTC-TATCGCCAAGGATGCTGGCAGAACGAGCAAATACCGCCCGTCTTGAAAC B. custersianusT ----TTTTT--TATTACCAAGGACGCTGGCAGAACGAGCAGATACCGCCCGTCTTGAAAC B. nanusT GTAGTGTTTACTGCTTCCAAGGATGCTGGCAGAACGAGCAAATACCGCCCGTCTTGAAAC
8. ANHANG 138
B. naardenensisT ------------GAAACCAAGGATGCTGGCATAACGAGCAAATACCGCCCGTCTTGAAAC S. cerevisiae ---------C-GTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAAC ****** ******* ** * * ** ** ************* 000011001001110111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT ATGGACCAAGGAGACTAACGTCTATGCGAGTGTTTGGGTGGATAAAACTCATTAACGCGG D. brux. St. 579 ATGGACCAAGGAGACTAACGTCTATGCGAGTGTTTGGGTGGATAAAACCCATTAACGCGG D. anomalaT ATGGACCAAGGAGACTAACGTCTATGCGAGTGTTTGGGTGGATAAAACCCATTAACGCGG B. custersianusT ATGGACCAAGGAGACTAACGTCTATGCGAGTGTTTGGGTGGATAAAACCCAT-AACGCGG B. nanusT ATGGACCAAGGAGACTAACGTTTATGCGAGTGTTTGGGTGAGTAAAACCCAA-TACGCGG B. naardenensisT ATGGACCAAGGAGACTAACGTCTATGCGAGTGTTTGGGTGG--AAAACTCAC-AACGCGA S. cerevisiae ACGGACCAAGGAGTCTAACGTCTATGCGAGTGTTTGGGTGT--AAAACCCAT--ACGCGT * *********** ******* ****************** ***** ** ***** 111111111111111111111111111111111111111111111111111101111111 D. bruxellensisT AATGAAAGTGAACGTAGGTCGGAGCCCCCTTGGGG-GCGCACGATCGACCGATCCCGATG D. brux. St. 579 AATGAAAGTGAACGTAGGTCGGAGCCCCCTTGGGG-GCGCACGATCGACCGATCCCGATG D. anomalaT AATGAAAGTGAACGTAGGTCGGAGCCCTCTCGGGG-GCGCACGATCGACCGATCCCGATG B. custersianusT AATGAAAGTGAACGTAGGTCGGAGC--TGTTAAAG-GCGCACGATCGACCGATCCAGAAG B. nanusT AATGAAAGTGAACGCAGGTCCGAGCGCTGTGAAGGCGTGCAGGACCGACCGATCCGGCGG B. naardenensisT AATGAAAGTGAACGTAGGACGGAGC--CCTTACGG-GCGCACGTCCGACCGATCCAGATA S. cerevisiae AATGAAAGTGAACGTAGGTTGGGGC-CTCGCAAGAGGTGCACAATCGACCGATCCTGATG ************** *** * ** * *** ********** * 111111111111111111111111101111110110111111111111111111101111 D. bruxellensisT TTTT-ACCGGAGGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTA D. brux. St. 579 TTTT-ACCGGAGGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTA D. anomalaT TTTT-AGCGGAAGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTA B. custersianusT TTTTTATCTGAAGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTA B. nanusT --T-----GGCCGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTA B. naardenensisT TTT--ATTGGAAGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTA S. cerevisiae TCTT---CGGATGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTA * * ************************************************ 111101011110111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT TGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTG D. brux. St. 579 TGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTG D. anomalaT TGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTG B. custersianusT TGCCTGAATAGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTG B. nanusT TGCCTGAATAGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTG B. naardenensisT TGCCTGAATAGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTG S. cerevisiae TGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGTAGCGGTTCTGACGTG ************* ****************************** *************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTG D. brux. St. 579 CAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTG D. anomalaT CAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTG B. custersianusT CAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTG B. nanusT CAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTG B. naardenensisT CAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTG S. cerevisiae CAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTG ************************************************************ 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT GTTCCTGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGAAGCTCGT--AGCAGTTTTATGAGGTAAA D. brux. St. 579 GTTCCTGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGAAGCTCGT--AGCAGTTTTATGAGGTAAA D. anomalaT GTTCCTGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGAAGCTCGT--AGCAGTTTTATGAGGTAAA B. custersianusT GTTCCTGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGAAGCTCGT--AGCAGTTTTATGAGGTAAA B. nanusT GTTCCTGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGAAGCTCATTTAACAGTTTTATGGGGTAAA B. naardenensisT GTTCCTGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGAAGCTCAGT-GACAGTTTTATGAGGTAAA S. cerevisiae GTTCCTGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGAAGCTCGT--ATCAGTTTTATGAGGTAAA ************************************* ********** ****** 111111111111111111111111111111111111111001111111111111111111 D. bruxellensisT GCGAATGATTAAAGGATCTGGGGCCGAAAAGGCTGCAGCCTATTCTCAAACTTTAAATAT D. brux. St. 579 GCGAATGATTAAAGGATCTGGGGCCGAAAAGGCTGCAGCCTATTCTCAAACTTTAAATAT D. anomalaT GCGAATGATTAAAGGATCTGAGGCCGAAAAGGCTTCAGCCTATTCTCAAACTTTAAATAT
8. ANHANG 139
B. custersianusT GCGAATGATTAAAGGACCCGGGACCGAAAAGGTTGCGGCCTATTCTCAAACTTTAAATAT B. nanusT GCGAATGATTAGAGGTCTTGGGATCGAAATGATTCTAGCCTATTCTCAAACTTTAAATAT B. naardenensisT GCGAATGATTAGAGGTCTTGGGATCGAAATGATCTTAACCTATTCTCAAACTTTAAATAT S. cerevisiae GCGAATGATTAGAGGTTCCGGGGTCGAAATGACCTTGACCTATTCTCAAACTTTAAATAT *********** *** * * ***** * ********************** 111111111111111111111111111111111101111111111111111111111111 D. bruxellensisT GTAAGAAGTCCTTGTTGCTTAGTTGAACGTGGACAGTTGAATGCAGAGCTTTTAGTGGGC D. brux. St. 579 GTAAGAAGTCCTTGTTGCTTAGTTGAACGTGGACAGTTGAATGCAGAGCTTTTAGTGGGC D. anomalaT GTAAGAAGTCCTTGTTGCTTAGTTGAACGTGGACAGTTGAATGCAGAGCTTTTAGTGGGC B. custersianusT GTAAGAAGTCCTTGTTGCCTAAGCGAACGTGGACAGTTGAATGCAGAGCTTTTAGTGGGC B. nanusT GTAAGAAGTCCTTGTTACTTAATTGAACGTGGACAGTTGAATGGAGAGCTTTTAGTGGGC B. naardenensisT GTAAGAAGTCCTTGTTACTTAATTGAACGTGGACAGTCGAATGTTGAGCTTTTAGTGGGC S. cerevisiae GTAAGAAGTCCTTGTTACTTAATTGAACGTGGACATTTGAATGAAGAGCTTTTAGTGGGC **************** * ** *********** * ***** *************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGGGATGAACCGAACGTGAAGTTAAGGTGCCGG D. brux. St. 579 CATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGGGATGAACCGAACGTGAAGTTAAGGTGCCGG D. anomalaT CATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGGGATGAACCGAACGTGAAGTTAAGGTGCCGG B. custersianusT CATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCAATGCGGGATGAACCGAACGTGAAGTTAAGGTGCCAG B. nanusT CATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGGGATGAACCGAACGTGAAGTTAAGGTGCCAG B. naardenensisT CATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGGGATGAACCGAACGTGAAGTTAAGGTGCCAG S. cerevisiae CATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGGGATGAACCGAACGTAGAGTTAAGGTGCCGG *********************** ******************** ************ * 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT AATGCGCGCTCATCAGACACCAGAAAAGGTGTTGGTCCATCTAGACAGCCGGACGGTGGC D. brux. St. 579 AATGCGCGCTCATCAGACACCAGAAAAGGTGTTGGTCCATCTAGACAGCCGGACGGTGGC D. anomalaT AATGCGCGCTCATCAGACACCAGAAAAGGTGTTGGTCCATCTAGACAGCCGGACGGTGGC B. custersianusT AATGCGCGCTCATCAGACACCAGAAAAGGTGTTGGTCCATCTAGACAGCCGGACGGTGGC B. nanusT AATGCGCGCTCATCAGACACCAGAAAAGGTGTTGGTCCATCTAGACAGCCGGACGGTGGC B. naardenensisT AATGCGCGCTCATCAGACACCAGAAAAGGTGTTGGTCCATCTAGACAGCCGGACGGTGGC S. cerevisiae AATACACGCTCATCAGACACCACAAAAGGTGTTAGTTCATCTAGACAGCCGGACGGTGGC *** * **************** ********** ** *********************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CATGGAAGTCGGAAACCGCTAAGGACTGTGTAACAACTCACCGGCCGAATGAACCAGCCC D. brux. St. 579 CATGGAAGTCGGAAACCGCTAAGGACTGTGTAACAACTCACCGGCCGAATGAACCAGCCC D. anomalaT CATGGAAGTCGGAAACCGCTAAGGATTGTGTAACAACTCACCGGCCGAATGAACCAGCCC B. custersianusT CATGGAAGTCGGAAACCGCCAAGGAATGTGTAACAACTCACCGGCCGAATGAACCAGCCC B. nanusT CATGGAAGTCGGAACCCGCCAAGGAGTGTGTAACAACTCACCGGCCGAATGAACCAGCCC B. naardenensisT CATGGAAGTCGGAAACCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCGGCCGAATGAACCAGCCC S. cerevisiae CATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCGGCCGAATGAACTAGCCC ************** **** ***** **************************** ***** 111111111111111111111111101111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT TGAAAATGGATGGCGCTCAAGCGCGTTACCTATACTTCGCCGTCACGGATGGAATATAAA D. brux. St. 579 TGAAAATGGATGGCGCTCAAGCGCGTTACCTATACTTCGCCGTCACGGATGGAATATAAA D. anomalaT TGAAAATGGATGGCGCTCAAGCGCGTTACCTATACTTCGCCGTCACGGATGGAATACAAA B. custersianusT TGAAAATGGATGGCGCTCAAGCGCGTTACCTATACTTCGCCGTCACTGCTAGCA------ B. nanusT TGAAAATGGATGGCGCTCAAGCGCGTTACCTATACTTTGCCGTCACAGCGTGGT------ B. naardenensisT TGAAAATGGATGGCGCTTAAGCGCGTTACCTATACTTCGCCGTCATGGATAGGGT----- S. cerevisiae TGAAAATGGATGGCGCTCAAGCGTGTTACCTATACTCTACCGTCAGGGTTGATATG---A ***************** ***** ************ ****** * 111111111111111111111111111111111111111111111111111101100001 D. bruxellensisT TTCTGTGACGAGTAGGCAGGCGTGGGGGTC--AGTGACGAAGCCTCTTGGCGTGAGCCTG D. brux. St. 579 TTCTGTGACGAGTAGGCAGGCGTGGGGGTC--AGTGACGAAGCCTCTTGGCGTGAGCCTG D. anomalaT CTCTGTGACGAGTAGGCAGGCGTGGGGGTC--AGTGACGAAGCCTCTTGGCGTGAGCCTG B. custersianusT CGCGGTGACGAGTAGGCAGGCGTGGGGGTCCTAGTGACGAAGCCTCA-GGCGTGAGCCCG B. nanusT -GCTGTGACGAGTAGGCAGGCGTGGGGGTC--CGTGACGAAGCCTCG-GGCGTGAGCCTG B. naardenensisT TGCCATGACGAGTAGGCAGGCGTGGGGGTC--AGTGACGAAGCCTTG-GGCGTGAGCCTG S. cerevisiae TGCCCTGACGAGTAGGCAGGCGTGGAGGTC--AGTGACGAAGCCTAG-ACCGTAAGGTCG * ******************** **** ************ *** ** * 111111111111111111111111111111001111111111111100111111111111
8. ANHANG 140
D. bruxellensisT GGTGGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGATTCTT D. brux. St. 579 GGTGGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGATTCTT D. anomalaT GGTGGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGATTCTT B. custersianusT GGTGGAACGGCCCCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAACGAGAT-CTT B. nanusT GGTCGAACGGCCCCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGAG-CTT B. naardenensisT GGTCGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGAT-CTT S. cerevisiae GGTCGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGAA-CTT *** ******** ************************************* **** *** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111110111 D. bruxellensisT TGAAGACTGAAGTGGGGAAAGGTTCCATAACAACAGCAGTTGGATATGGGTTAGTCGATC D. brux. St. 579 TGAAGACTGAAGTGGGGAAAGGTTCCATAACAACAGCAGTTGGATATGGGTTAGTCGATC D. anomalaT TGAAGACTGAAGTGGGGAAAGGTTCCACAACAACAGCAGTTGGATGTGGGTTAGTCGATC B. custersianusT TGAAGACTGAAGTGGGGAAAGGTTCCATATCAACAGCAGTTGGATATGGGTTAGTCGATC B. nanusT TGAAGACTGAAGTGGGGAAAGGTTCCATATCAACAGCAGTTGGATATGGGTTAGTCGATC B. naardenensisT TGAAGACTGAAGTGGGGAAAGGTTCCATATCAACAGCAGTTGGATATGGGTTAGTCGATC S. cerevisiae TGAAGACTGAAGTGGGGAAAGGTTCCACGTCAACAGCAGTTGGACGTGGGTTAGTCGATC *************************** ************** ************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CTAAGAGATGGGGGAACTCCGTTTCAAAGCCTTAATTTGTTTTAAGGCACCATCGAAAGG D. brux. St. 579 CTAAGAGATGGGGGAACTCCGTTTCAAAGCCTTAATTTGTTTTAAGGCACCATCGAAAGG D. anomalaT CTAAGAGATGGGGGAACTCCGTTTCAACGCCTTAATTC-TGTTAAGGCACCATCGAAAGG B. custersianusT CTAAGGAGTAAGGTAACTCTGTAAAAATGTGTACTTTTGTATACTG---CCTCCGAAAGG B. nanusT CTAAGAGATGGGGAAACTCTGTTTTAAACACTGATCAAGTGT-------CCATCGAAAGG B. naardenensisT CTAAGAGATGGGGAAACTCCGTTTCAAAAGGCTAATTTACTTTAGCCTCCTATCGAAAGG S. cerevisiae CTAAGAGATGGGGAAGCTCCGTTTCAAAGGCCTGATTTTATGCAGGCCACCATCGAAAGG ***** * ** * *** ** ** * ******* 111111111111101111111111111110111111111111110101111111111111 D. bruxellensisT GAACCCGGTTAATATTCCGGGACTTGGATATGGGAAAATTTATTACGACGGCAACGTAAA D. brux. St. 579 GAACCCGGTTAATATTCCGGGACTTGGATATGGGAAAATTTATTACGACGGCAACGTAAA D. anomalaT GAACCCGGTTAATATTCCGGGACTTGGATATGGGGA--T--TTTACGACGGCAACGTAAA B. custersianusT GAACCCGGTTAATATTCCGGGACTTGGATATGGGAA---TTTTTGAGACGGCAACGTAAG B. nanusT GGACCCGGTCAAGATTCCGGGACTTGGATATGG--A-----TTCTTCACGGCAACGTAAC B. naardenensisT GAATCTGGTTAATATTCCAGAACTTGGATATGG--AT-TTTTATAACACGGCAACGTAAC S. cerevisiae GAATCCGGTAAA-ATTCCGGAACTTGGATATGG--A-----TTCTTCACGGCAACGTAAC * * * *** ** ***** * ************ * ************ 111111111111111111111111111111111101001111111011111111111110 D. bruxellensisT GGAATGTGGAGACGCCGGCATGGGCCCTGGGAGGAGTTTTCTTTTCTTGTTAACGCCTTA D. brux. St. 579 GGAATGTGGAGACGCCGGCATGGGCCCTGGGAGGAGTTTTCTTTTCTTGTTAACGCCTTA D. anomalaT GGAATGTGGAGACGCCGGCATGGGCCCTGGGAGGAGTTTTCTTTTCTTGTTAACGCCTTA B. custersianusT CGAATGTGGAGACGCCGGCATGGGCCCTGGGAGGAGTTTTCTTTTCTTGTTAACACTCTA B. nanusT AGAATGCGGAGACGCCGGCATGAGCCCTGGGAGGAGTTTTCTTTTCTTGTTAACGGCCCA B. naardenensisT AGAATGTGGAGACGCCGGTATGGGCCCTGGGAGGAGTTTTCTTTTCTTACTAACAGTCTA S. cerevisiae TGAATGTGGAGACGTCGGCGTGAGCCCTGGGAGGAGTTATCTTTTCTTCTTAACAGCTTA ***** ******* *** ** *************** ********* **** * 011111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT ACACCCCGGAATTGGTTTATCCGGAGAGGGGGTTTTATGGGCGGAAGAGCGTGGCCCAAA D. brux. St. 579 ACACCCCGGAATTGGTTTATCCGGAGAGGGGGTTTTATGGGCGGAAGAGCGTGGCCCAAA D. anomalaT ACACCCCGGAATTGGTTTATCCGGAGAGGGGGTTTTATGGGCGGAAGAGCGTGGCCCAAA B. custersianusT TCACCCCGGAATTGGTTTATCCGGAGAGGGGGTTTTATGGGTGGAAGAGCGTGGCCTAC- B. nanusT TCACCCTGGAATTGGTTTATCCGGAGAGGGGGTTTTATGGCCGGAAGAGCGCGGCCTTA- B. naardenensisT ACACCCTGGAATTGGTTTATCCGGAGAGGGGGTTTTATGGCTGGAAGAGCGCGGCCT--- S. cerevisiae TCACCCTGGAATTGGTTTATCCGGAGATGGGGTCTTAGGGCTGGAAGAGGCCAGCAC--- ***** ******************** ***** *** ** ******* ** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111110 D. bruxellensisT ATTTATTTTGCAGTTAGCCACGTCTGGAGCGCTCATGACGGTCCGTGAAAATCCACAGAA D. brux. St. 579 ATTTATTTTGCAGTTAGCCACGTCTGGAGCGCTCATGACGGTCCGTGAAAATCCACAGAA D. anomalaT ATTTATTTTGCAGTTAGCCACGTCTGGAGCGCTCATGACGGTCCGTGAAAATCCACAGGA B. custersianusT -----TTTTTCTGTTAGCCACGTCTGGAGCGCTCATGACGGTCCGTGAAAATCCACAGGA B. nanusT -----CTCAAACGTTAGCCGCGTCCGGTGCGCTCATGACGGTCCTTGAAAATCCGCAGGA
8. ANHANG 141
B. naardenensisT ----------CTGTTTGCTGCGTCCGGTGCGCTCATGACGGTCCTTGAAAATCCACAGGA S. cerevisiae ------------CTTTGCTGGCTCCGGTGCGCTTGTGACGGCCCGTGAAAATCCACAGGA ** ** ** ** ***** ****** ** ********* *** * 000001111010111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT GACAG---ATATTCTTCATGCCAAGTCGTACTAATAACCGCAGCAGGTCCTCAAGGTTAG D. brux. St. 579 GACAG---ATATTCTTCATGCCAAGTCGTACTAATAACCGCAGCAGGTCCTCAAGGTTAG D. anomalaT GAGAG---ATATTCTTCATGCCAAGTCGTACTAATAACCGCAGCAGGTCCTCAAGGTTAG B. custersianusT ACGAAGCAATATTCAGCATGCCAAGTCGTACTAATAACCGCAGCAGGTCCTCAAGGTTAG B. nanusT AGGAA----TAGTTTTCATGCCAAGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTTAG B. naardenensisT AGAAA----TTATTTTCATGCCAAGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTTAA S. cerevisiae AGGAA----TAGTTTTCATGCTAGGTCGTACTGATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAA * * * ***** * ******** **************** ****** * 101110001111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CAGCCTCTAGTTGATAGAATAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAACATAGATCCGTAACTT D. brux. St. 579 CAGCCTCTAGTTGATAGAATAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAACATAGATCCGTAACTT D. anomalaT CAGCCTCTAGTTGATAGAATAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAACATAGATCCGTAACTT B. custersianusT CAGCCTCTAGTTGATAGAATAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAACATAGATCCGTAACTT B. nanusT CAGCCTCTAGTTGATAGAATAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAACAGATCCGTAACTT B. naardenensisT CAGCCTCTAGTTGATAGAATAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAACATAGATCCGTAACTT S. cerevisiae CAGCCTCTAGTTGATAGAATAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTT ******************************************** * ************* 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CGGGATAAGGATTGGCTCTAAGGGTCGGGCAGAGTGGGTTGTTGGGA-GAAGGGTCTTGC D. brux. St. 579 CGGGATAAGGATTGGCTCTAAGGGTCGGGCAGAGTGGGTTGTTGGGA-GAAGGGTCTTGC D. anomalaT CGGGATAAGGATTGGCTCTAAGGGTCGGGCAGAGTGGGTTGTGTGCA-GAAGGGCGTGGC B. custersianusT CGGGATAAGGATTGGCTCTAAGGGTCGGGTATACTGGGTTGCGGGAT-GACG----CTGC B. nanusT CGGGATAAGGATTGGCTCTAAGGGTCGGGGAGACACCGAAAGGCGAGCGAAGCG--GGGT B. naardenensisT CGGGATAAGGATTGGCTCTAAGGGTCGAGTAGGTGGGGATGGGTGGTAGAAGAG-GCGGG S. cerevisiae CGGGATAAGGATTGGCTCTAAGGGTCGGGTAGTGAGGGCCTTGGTCA-GACGCAGCGGGC *************************** * * * ** * * 111111111111111111111111111110111111111111111010111101000111 D. bruxellensisT G-GAGGAGGAGATAGCTGTGCACTTGTGTGCGGTGGTTT--CCACCACG-GCGAGGCCTA D. brux. St. 579 G-GAGGAGGAGATAGCTGTGCACTTGTGTGCGGTGGTTT--CCACCACG-GCGAGGCCTA D. anomalaT GTGAGGAGGAGACAGCAGTGCCTTCGGGTGCGGTAGTTT--CCACCACGTGCCGTGTCTA B. custersianusT GAGTGGATG-GATAGCTTCGGC----GGTCCGTCCGTT------CAATG---------TA B. nanusT TTTTGGAAAGGACAAGTTTTACAAGTTTTACGACCTGTA--CG-CCCTG---------TT B. naardenensisT GGGAGGGAGAGAGGGGGGGAGAAGAGCTTTCGGGCTTTTTTCTTTCTCTTTTTCCTTCTC S. cerevisiae GTGCTTGTG-GACTGCTTGGTG-GGGCTTGCTCTGCTAGGCGGACTACTTGCG-TGCCTT ** * * * 101111101111011111110000010111111101111001011111101100010111 D. bruxellensisT GACGCCGATAACAGGCACCAGCCTTCGGGCTTGCCGTCCGCTCTGCGATTAAC-GACCGA D. brux. St. 579 GACGCCGATAACAGGCACCAGCCTTCGGGCTTGCCGTCCGCTCTGCGATTAAC-GACCGA D. anomalaT GACGCGGACAACAGGTACCAGCCTCCGGGCTTGCCGTCCGCTCTGCAATTAAC-GACCGA B. custersianusT GAGGCCTGTGACAG--ACCGTACTGCGGTCGT----TCCGGTATACGATTAAC-GACCAA B. nanusT CTGTTCGAAAACCT--CGCAAAGCTCAGTTTT------CGAGCTCCCAGTAAC-GACCAA B. naardenensisT CTAGTCTTAGACACCTCCATTAGTTGCTTCGGCGGCGTCCCCCTACATTTAAC-GACCAA S. cerevisiae GTTGTAGACGGCCTTGGTAGGTCTCTTGTAGACCGTCGCTTGCTACAATTAACAGATCAA * * * * **** ** * * 110111110111110011111011111111110100111111110101111110111111 D. bruxellensisT CTTAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCTGACTGTCTAATTAAAGCATAGCATTGCGAAG D. brux. St. 579 CTTAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCTGACTGTCTAATTAAAGCATAGCATTGCGAAG D. anomalaT CTTAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCTGACTGTCTAATTAAAGCATAGCATTGCGAAG B. custersianusT CTTAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCTGACTGTCTAATTAAAGCATAGCATTGCGAAG B. nanusT CTTAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGCGATG B. naardenensisT CTTAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCTGACTGTCTAATTAAACCATAGCATTGCGATG S. cerevisiae CTTAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGCGATG ******************************************** ************* * 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT GTCAGAAAGTGATGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAA D. brux. St. 579 GTCAGAAAGTGATGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAA D. anomalaT GTCAGAAAGTGATGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAA
8. ANHANG 142
B. custersianusT GTCAGAAAATGATGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAA B. nanusT GTCAGAAAATGATGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAA B. naardenensisT GTCAGAAAGTGATGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAA S. cerevisiae GTCAGAAAGTGATGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAA ******** *************************************************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT GAAATTCAACGAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAA D. brux. St. 579 GAAATTCAACGAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAA D. anomalaT GAAATTCAACGAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAA B. custersianusT GAAATTCAACGAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAA B. nanusT GAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAA B. naardenensisT GAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAA S. cerevisiae GAAATTCAACCAAGCGCGAGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAA ********** ******* ***************************************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT ATGCCTCGTCATCTAACTAGTGACGCGCATGAATGGATTAATGAGATTCCCACTGTCCCT D. brux. St. 579 ATGCCTCGTCATCTAACTAGTGACGCGCATGAATGGATTAATGAGATTCCCACTGTCCCT D. anomalaT ATGCCTCGTCATCTAACTAGTGACGCGCATGAATGGATTAATGAGATTCCCACTGTCCCT B. custersianusT ATGCCTCGTCATCTAACTAGTGACGCGCATGAATGGATTAATGAGATTCCCACTGTCCCT B. nanusT ATGCCTCGTCATCTAACTAGTGACGCGCATGAATGGATTAATGAGATTCCCACTGTCCCT B. naardenensisT ATGCCTCGTCATCTAACTAGTGACGCGCATGAATGGATTAATGAGATTCCCACTGTCCCT S. cerevisiae ATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCT **************** ************************ ****************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT ATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAG D. brux. St. 579 ATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAG D. anomalaT ATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAG B. custersianusT ATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAG B. nanusT ATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAG B. naardenensisT ATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAG S. cerevisiae ATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAG ************************************************************ 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT AAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGAGGGTGTAGAAT D. brux. St. 579 AAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGAGGGTGTAGAAT D. anomalaT AAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGAGGGTGTAGAAT B. custersianusT AAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGAGGGTGTAGAAC B. nanusT AAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGAGGGTGTAGAAT B. naardenensisT AAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGAGGGTGTAGAAT S. cerevisiae AAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAGAGACATAGAGGGTGTAGAAT *************************************** ******************* 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT AAGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACCTTTATCGTTTTTTTACTTATTCAA D. brux. St. 579 AAGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACCTTTATCGTTTTTTTACTTATTCAA D. anomalaT AAGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACCTTTATCGTTTTTTTACTTATTCAA B. custersianusT AAGTGGGAGCTTCGGCGCCAGTGAAATACCACTACCTTTATAGTTTTTTTACTCATTCAA B. nanusT AAGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACCTTTATAGTTTTTTTACTTATTCAA B. naardenensisT AAGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACCTTTATAGTTTTTTTACTTATTCAA S. cerevisiae AAGTGGGAGCTTCGGCGCCAGTGAAATACCACTACCTTTATAGTTTCTTTACTTATTCAA ******************* ********************* **** ****** ****** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT TTAAGCGGAGCTGGATCGCAAGATCCACGTTCTGGAATTGAAAGGCGG--TATTAGGCCG D. brux. St. 579 TTAAGCGGAGCTGGATCGCAAGATCCACGTTCTGGAATTGAAAGGCGG--TATTAGGCCG D. anomalaT TTAAGCGGAGCTGGATCGCAAGATCCACGTTCTGGAATTGAAAGGCGGCCTTTTGTGCCG B. custersianusT TTGAGCGGAGCTGGATCGCAAGATCCACGTTCTAGCATC--AAGCCTATCTATA-----G B. nanusT TGAAGCGGAGCTGGACCGCAAGGTCCACGTTCTAGCA----AAAGCGGCGTGTC---C-- B. naardenensisT TTAAGCGAAGCTGGACCGCAAGGTCCACTTTCTAGCA----AACGCCGGTTAAAG----G S. cerevisiae TGAAGCGGAGCTGGAATTCATTTTCCACGTTCTAGCATTCAAGGTCCCATTCGGG----G * **** ******* ** ***** **** * * * * * 111111111111111111111111111111111111111011111111001110000101
8. ANHANG 143
D. bruxellensisT TTGATCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAA D. brux. St. 579 TTGATCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAA D. anomalaT TTGATCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAA B. custersianusT GTGATCCGGGTTGGAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAA B. nanusT GTGATCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAA B. naardenensisT GCAATTCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAA S. cerevisiae CTGATCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAA ** ******* ********************************************** 011111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT AAGATAACGCAGATGTCCTAAGGGGGACTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTGGAACAAA D. brux. St. 579 AAGATAACGCAGATGTCCTAAGGGGGACTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTGGAACAAA D. anomalaT AAGATAACGCAGATGTCCTAAGGGGGACTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTGGAACAAA B. custersianusT AAGATAACGCAGATGTCCTAAGGGGGACTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAAA B. nanusT AAGATAACGCAGATGTCCTAAGGGGGACTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAAA B. naardenensisT ACGATAACGCAGATGTCCTAAGGGG-ACTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAAA S. cerevisiae ACGATAACGCAGATGTCCTAAGGGGGGCTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAAA * *********************** ************************* ******* 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT AGGGTAAAAGTCTCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCAT-GAAAGTGTGGC D. brux. St. 579 AGGGTAAAAGTCTCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCAT-GAAAGTGTGGC D. anomalaT AGGGTAAAAGTCTCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCAT-GAAAGTGTGGC B. custersianusT AGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCAT-GAAAGTGTGGC B. nanusT AGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCAT-GAAAGTGTGGC B. naardenensisT AGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCAT-GAAAGTGTGGC S. cerevisiae AGGGTAAAG--CCCCTT-AGTTTGATTT-CAGTGTGAATACAAACCATTGAAAGTGTGGC ******** * **** * ******** ******************* *********** 111111111111111111111111111111111111111111111111011111111111 D. bruxellensisT CTATCGATCCTTTAGTCCCTCAGAGTTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGG D. brux. St. 579 CTATCGATCCTTTAGTCCCTCAGAGTTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGG D. anomalaT CTATCGATCCTTTAGTCCCTCAGAGTTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGG B. custersianusT CTATCGATCCTTTAGTCCCTCAGAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGG B. nanusT CTATCGATCCTTTAGTCCCTCAGAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGG B. naardenensisT CTATCGATCCTTTAGTCCCTCAGAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGG S. cerevisiae CTATCGATCCTTTAGTCCCTCGGAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGG ********************* ** *********************************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT GATAACTGGCTTGTGGCAGTCAAGCGTTCATAGCGACATTGCTTTTTGATTCTTCGATGT D. brux. St. 579 GATAACTGGCTTGTGGCAGTCAAGCGTTCATAGCGACATTGCTTTTTGATTCTTCGATGT D. anomalaT GATAACTGGCTTGTGGCAGTCAAGCGTTCATAGCGACATTGCTTTTTGATTCTTCGATGT B. custersianusT GATAACTGGCTTGTGGCAGTCAAGCGTTCATAGCGACATTGCTTTTTGATTCTTCGATGT B. nanusT GATAACTGGCTTGTGGCAGTCAAGCGCTCATAGCGACATTGCTTTTTGATTCTTCGATGT B. naardenensisT GATAACTGGCTTGTGGCAGTCAAGCGCTCATAGCGACATTGCTTTTTGATTCTTCGATGT S. cerevisiae GATAACTGGCTTGTGGCAGTCAAGCGTTCATAGCGACATTGCTTTTTGATTCTTCGATGT ************************** ********************************* 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAAT D. brux. St. 579 CGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAAT D. anomalaT CGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAAT B. custersianusT CGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAAT B. nanusT CGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAAT B. naardenensisT CGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAAT S. cerevisiae CGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAAT ************************************************************ 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT AGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGAG D. brux. St. 579 AGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGAG D. anomalaT AGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGAG B. custersianusT AGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGAG B. nanusT AGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGAG
8. ANHANG 144
B. naardenensisT AGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGAG S. cerevisiae AGGGAACATGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGAA ******* *************************************************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT GAGTCATCTCGATAGTAATTGAACTTAGTACGAGAGGAACCGTTCATTCAGATCATTGGT D. brux. St. 579 GAGTCATCTCGATAGTAATTGAACTTAGTACGAGAGGAACCGTTCATTCAGATCATTGGT D. anomalaT GAGTCATCTCGATAGTAATTGAACTTAGTACGAGAGGAACCGTTCATTCAGATCATTGGT B. custersianusT GTGTCATCTCGATAGTAATTGAACTTAGTACGAGAGGAACCGTTCATTCAGATCATTGGT B. nanusT GTGTCATCTCAATAGTAATTGAACTTAGTACGAGAGGAACCGTTCATTCAGATCATTGGT B. naardenensisT ACGTCATCTCAATAGTAATTGAACTTAGTACGAGAGGAACCGTTCATTCAGATCATTGGT S. cerevisiae TGTTACCAGCAATAGTAATTGAACTTAGTACGAGAGGAACAGTTCATTCGGATAATTGGT * * ***************************** ******** *** ****** 101111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT AATTGCGGCTGCCTGAGCGGGCACTACCGCGAAGCTATCATCTGTTGGATTATGGCTGAA D. brux. St. 579 AATTGCGGCTGCCTGAGCGGGCACTACCGCGAAGCTATCATCTGTTGGATTATGGCTGAA D. anomalaT AATTGCGGCTGCCTGAGCGGGCACTACCGCGAAGCTATCATCTGTTGGATTATGGCTGAA B. custersianusT AATTGCGGCTGCCTGAGCGGGCACTACCGCGAAGCTATCATCTGTTGGATTATGGCTGAA B. nanusT ATTTGCGGCTGCCTGAACAGACACTACCGCGAAGCTATCATCTGTTGGATTATGGCTGAA B. naardenensisT ATTTGCGGCTGCCTGAACAGACATTACCGCGAAGCTATCATCTGTTGGATTATGGCTGAA S. cerevisiae TTTTGCGGCTGTCTGATCAGGCATTGCCGCGAAGC-ACCATCCGCTGGATTATGGCTGAA ********* **** * * ** * ********* * **** * *************** 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 D. bruxellensisT CGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCTAGACAGGGGATGATTAATTTTAGTGCCTTGCTGTTA D. brux. St. 579 CGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCTAGACAGGGGATGATTAATTTTAGTGCCTTGCTGTTA D. anomalaT CGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCTAGACAGGGGATGATTAATTTT-GTGCCTTGCTGTTA B. custersianusT CGCCTCTAAGTCAGAATCCGTGCTAGAAAGGGGATGATTA-TTTTAGTGCCTTGCCTTTA B. nanusT CGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCTAGAAAGGG-ATGATT--TTAT---GCCTTGCTAT-A B. naardenensisT CGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCTAGAAAGGG-ATGATT--TTTTTATGCCTTGCTATTA S. cerevisiae CGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCTAGAACGCG-GTGATT--TCTTTGCTCCACACAAT-- ******************* ******* * * ***** * * ** * * 111111111111111111111111111111111111111101111011111111110111 D. bruxellensisT CTAGAAGGATACGAATAAGGCGGTACATTAGTGCCGTCGCTGAGACCATATCAGGCGGGC D. brux. St. 579 CTAGAAGGATACGAATAAGGCGGTACATTAGTGCCGTCGCTGAGACCATATCAGGCGGGC D. anomalaT CTAGAAGGATACGAATAAGGCGGTGCATTAGTGCCGTCGCTGAGACCATATCAGGCGGGC B. custersianusT CTAGAAGGATACGAATAAGGCCGT-----AAG---GTCGCTGGAACCATACTAGGGGAGC B. nanusT CTAGAAGGATACGAATAAGGCACG---T-AGT---GTCGCTGGAACCATATCAGGCGGGC B. naardenensisT CTAGAAGGATACGAATAAGGCACA---TTAGT---GTCGCTGGAACCATAGCAGGCTGGC S. cerevisiae ATAGATGGATACGAATAAGGCGTCC---TTGTGGCGTCGCTG-AACCATAGCAGGCTAGC **** *************** ******* ****** *** ** 111111111111111111111111000111111011111111011111111111111111 D. bruxellensisT GATGGGACACCAGGCGGAAAGGCCGGGTGTTCTTGTCTGCGGATAGCAATGTCAAGAGTG D. brux. St. 579 GATGGGACACCAGGCGGAAAGGCCGGGTGTTCTTGTCTGCGGATAGCAATGTCAAGAGTG D. anomalaT GATGGGGCACCAGGTGGAAAGACCGGGTGTTCTTGCCTGCGGATAGCAATGTCAAGAGTG B. custersianusT GTGGGGACATCTA-CGGAAAGGT-GGGTGTTCTAGTTCCCGGATAGCAATGTCAAGAGGG B. nanusT GGCGGCGTACATG-CGGAAAGGC-TTGTGCGCTTGCCCGCGGATAGCAATGTCGAGAATG B. naardenensisT GCTGGCACTCTTGGCGGAAAGGCCTTGGGTGTCTGCCGGCGGATAGCAATGTCGAGAATG S. cerevisiae AACGGTGCACTTGGCGGAAAGGCCTTGGGTGCTTGCTGGCGAATTGCAATGTCATTTTGC ** ****** * * * ** ** ******** 111111111111111111111111111111111111101111111111111111111111 D. bruxellensisT GCAAGGAGAGATCCTTTGCAGACGACTTAAATGTACAACGGGGTATTGTAAGCAGT D. brux. St. 579 GCAAGGAGAGATCCTTTGCAGACGACTTAAATGTACAACGGGGTATTGTAAGCAGT D. anomalaT GCAAGGAGAGATCCTTGGCAGACGACTTAAATGTACAACGGGGTATTGTAAGCAGT B. custersianusT GCGAGGAGAGATCCTTTGTAGACGACTTAAATGTACAACGGGGTATTGTAAGCAGT B. nanusT GCGAGGATAGATCCTTTGCATACGACTTAAATGTACAACGGGGTATTGTAAGCAGT B. naardenensisT GCGAGGAAAGATCCTTTGCATACGACTTAAATGTACAACGGGGTATTGTAAGCAGT S. cerevisiae GTGGGGATAAATCATTTGTATACGACTTAGATGTACAACGGGGTATTGTAAGCGGT * *** * *** ** * * ******** *********************** ** 11111111111111111111111111111111111111111111111111111111
8. ANHANG 145
8.2 Sekundärstrukturen der 26S rRNAs
Neu generierte 26S rRNA-Sekundärstrukturen von Brettanomyces/Dekkera spec. auf Basis
von S. cerevisiae (Acc. U53879, Gutell 1993, http://www.rna.ccbb.utexas.edu/). Die 5’-
Enden der Strukturen sind mit den 5.8S rRNAs assoziiert. Intramolekulare Wechsel-
wirkungen (Tertiärstruktur) sind durch schwarze Linien dargestellt. Rot-markierten Basen
unterscheiden sich von den Sequenzen der jeweiligen Vorgänger-Strukturen (vs). Die
D1/D2-Region und die variablen Bereiche (V1-V6) sind eingezeichnet (kurze Pfeile).
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 5' half
Dekkera anomala(DSM 70732T)vsSaccharomyces cerevisiae(U53879)
October 2005
5'-5.8S 3'-5.8S
5'-26S
3' half
3'
5'
5' 3'a
a
b
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DSM 70732T
(Acc. DQ406714) vs
S. cerevisiae (Acc. U53879)
LSU (26S) ribosomale RNA, 5’-Ende
D. anomala D1/D2
III
III
IV
V5
V3
V4
3’-Hälfte
5’-5.8S 3’-5.8S
5’-26S
8. ANHANG 146
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 3' half
Dekkera anomala(DSM 70732T)vs
Saccharomyces cerevisiae(U53879)
October 2005
3'-26S
A UAGAA
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A G A C C G G G U G U U C U U G C C U G CG
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ACGACUUAA
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CAACGGGG
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UG
U AAG
CAG
UAGAGUAGCCU
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-- -
----
- ---
- ------
-
--------
Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 3’-Ende
D. anomala DSM 70732T
(Acc. DQ406714) vs
S. cerevisiae (Acc. U53879)
III
III
IV
V6
V1 V2
5’-Hälfte
3’-26S
8. ANHANG 147
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 5' half
Dekkera bruxellensis(DSM 70001T)vs
Dekkera anomala(DSM 70732T)
November 2005
5'-5.8S 3'-5.8S
5'-26S
3' half
3'
5'
5' 3'a
a
b
bAAAAC
UUUCAACAAUG
GA
UC
UC U
UG G U U C U C G C G U
CGA
UG
AAG
AGC
GCA
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GA
UACU
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GA
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UCGUG
AA
UCAU C
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UCUU G A A C G
CAC A
UUGC G
CCC
CUGGU A U
UC
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GG
GC A
UG
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Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 5’-Ende
D. bruxellensisDSM 70001T
(Acc. DQ406715) vs
D. anomalaDSM 70732T
(Acc. DQ406714)
V5
D1/D2
V4
V3
III
III
IV
3’-Hälfte
5’-5.8S 3’-5.8S
5’-26S
8. ANHANG 148
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 3' half
Dekkera bruxellensis(DSM 70001T)vs
Dekkera anomala(DSM 70732T)
November 2005
3'-26S
A UAGAA
UA
A UGUAGAUA
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------------------
-- -
----
- ---- ------
-
--------
Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 3’-Ende
D. bruxellensisDSM 70001T
(Acc. DQ406715) vs
D. anomalaDSM 70732T
(Acc. DQ406714)
III
III
IV
V1
V2
V6
5’-Hälfte
3’-26S
8. ANHANG 149
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 5' half
Brettanomyces custersianus(CBS 4805T)vs
Dekkera bruxellensis(DSM 70001T)
May 2006
5'-5.8S 3'-5.8S
5'-26S
3' half
3'
5'
5' 3'a
a
b
bAAAC
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Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 5’-Ende
B. custersianusCBS 4805T
(Acc. DQ406717) vs
D. bruxellensisDSM 70001T
(Acc. DQ406715)
D1/D2
V5
V3
V4
III
III
IV
3’-Hälfte
5’-5.8S 3’-5.8S
5’-26S
8. ANHANG 150
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 3' half
Brettanomyces custersianus(CBS 4805T)vs
Dekkera bruxellensis(DSM 70001T)
May 2006
3'-26S
A UAGAA
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CA
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UG
U AAG
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UAGAGUAGCCU
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-- -
----
- ---- ------
-
-
-------
Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 3’-Ende
B. custersianusCBS 4805T
(Acc. DQ406717) vs
D. bruxellensisDSM 70001T
(Acc. DQ406715)
IV
III
III
V1
V2
V6
5’-Hälfte
3’-26S
8. ANHANG 151
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 5' half
Brettanomyces nanus(CBS 1945T)vs
Brettanomyces custersianus(CBS 4805T)
May 2006
5'-5.8S 3'-5.8S
5'-26S
3' half
3'
5'
5' 3'a
a
b
bAAAC
UUUCAACAACGGA
UC
UC U
UG G U U C U C G C A U
CGA
UG
AAG
AGC
GCA
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UC
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--
--
--
--
--
--
--
GAGGAC C C G C U
G A A CUU A A
GC
AUAUCAAU
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AA
AG
AAAC
CA
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GG
CGAG
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GG
CA
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AAUUUGAAAUCAAGU
U UU
CUUGAAUUGUAAUU UGA A
G AA
G C G U C G CA A
G G U GG A
G U GA
U A G U GC
A A GUGCCUUGG AA
CAGGCC G
CC A
AGG
AGGGUG
AGAGC
CCCGUG
ACACUA
CCAC
CGACACC
GUC
AGCGAUGC
CUCGAAGAGU
CGAGUUGU
UUGG
GA
A U GCA GCUCUAA
GC
GG
GU
GGUA
U A UUC
CAUCU A A G
GC
UA
AA
UA
UUG
GCGAGAGA
CCG
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GU
ACAG
UG
A U GG
AA A G
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A A G A GAGUGAA AUAGUACGUGAAAUUGUUGAAAGGGAAGG
GU
AU
UU
GA
UC
CG
AC
AG
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Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 5’-Ende
B. nanusCBS 1945T
(Acc. DQ406718) vs
B. custersianusCBS 4805T
(Acc. DQ406717)
D1/D2
V5
V3
V4
III
III
IV
3’-Hälfte
5’-5.8S 3’-5.8S
5’-26S
8. ANHANG 152
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 3' half
Brettanomyces nanus(CBS 1945T)vs
Brettanomyces custersianus(CBS 4805T)
May 2006
3'-26S
A UAGAA
UA
A UGUAGAUA
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------------------
-- -
----
- ---- ------
-
-
-------
Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 3’-Ende
B. nanusCBS 1945T
(Acc. DQ406718) vs
B. custersianusCBS 4805T
(Acc. DQ406717)
V6
V1
V2
III
III
IV
5’-Hälfte
3’-26S
8. ANHANG 153
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 5' half
Brettanomyces naardenensis(CBS 6042T)vs
Brettanomyces nanus(CBS 1945T)
May 2006
5'-5.8S 3'-5.8S
5'-26S
3' half
3'
5'
5' 3'a
a
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bAAAC
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B. nardenensisCBS 6042T
(Acc. DQ406719) vs
B. nanusCBS 1945T
(Acc. DQ406718)
Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 5’-Ende
D1/D2
V5
V3
V4
III
III
IV
3’-Hälfte
5’-5.8S 3’-5.8S
5’-26S
8. ANHANG 154
Secondary Structure: large subunit ribosomal RNA - 3' half
Brettanomyces naardenensis(CBS 6042T)vs
Brettanomyces nanus(CBS 1945T)
May 2006
3'-26S
A UAGAA
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A UGUAGAUA
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UG
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------------------
-- -
----
- ---- ------
-
-
-------
Sekundärstruktur: LSU (26S) ribosomale RNA, 3’-Ende
B. nardenensisCBS 6042T
(Acc. DQ406719) vs
B. nanusCBS 1945T
(Acc. DQ406718)
III
III
IV
V6
V1
V2
5’-Hälfte
3’-26S
8. ANHANG 155
8.3 Biolog YT MicroPlateTM Mikrotiterplatten-Test
Die Mikrotiterplatten (Biolog, Hayward, USA) wurden bei 30 °C inkubiert und nach 72 h
die Extinktionen photometrisch bei 620 nm gemessen. In der Tabelle 17 sind die im Test
verwendeten Substrate bzw. Substratkombinationen und die Ergebnisse, auf denen die
graphischen Darstellungen (Abb. 36, 38) basieren, dargestellt. Die hier aufgeführten
Ergebnisse stellen die Differenzen zwischen den Messwerten nach 72 h und den Anfangs-
Messwerten (T = 0 h), jeweils bereinigt um die Messwerte der Kontrollansätze (Wasser),
dar. Negative Ergebnisse wurden als 0 definiert.
Tab. 17. Ergebnisse des Biolog YT MicroPlateTM Mikrotiterplatten-Tests für die Typstämme (T)
Testa Substrat D. anomalaT
D. bruxellensisT
B. custersianusT
B. nanusT
B. naardenensisT
1. Wasser 0 0 0 0 0,199 2. Cellobiose 0,175 0 0 0 0,304
3. N-Acetyl- D-Glucosamin 0 0 0 0 0,418
4. Acetat 0 0 0 0 05. Gentiobiose 0,137 0 0 0 0,337 6. α-D-Glucose 0,58 0,183 0,989 0,11 0,813 7. Formiat 0 0 0 0 08. Maltose 0,171 0,12 0 0 0 9. D-Galactose 0,086 0 0 0,105 0,199
10. Propionat 0 0 0 0 011. Maltotriose 0,079 0,11 0 0 0 12. D-Psicose 0 0 0,101 0 0 13. Succinat 0 0 0 0 014. D-Melezitose 0 0,087 0 0 0 15. L-Sorbose 0 0 0 0 016. Methyl-Succinat 0 0 0,109 0 0 17. D-Melibiose 0 0 0 0 018. Salicin 0,179 0 0 0 0 19. L-Aspartat 0 0 0 0 020. Palatinose 0,274 0,096 0 0 0 21. D-Mannitol 0 0 0 0 022. L-Glutamat 0 0 0 0 023. D-Raffinose 0 0 0 0 024. D-Sorbitol 0 0 0 0 025. L-Prolin 0 0 0 0 026. Stachyose 0 0 0 0 027. D-Arabitol 0 0 0 0 0,104 28. D-Gluconat 0 0 0 0 029. Sucrose 0,387 0,185 0 0 0 30. Xylitol 0 0 0 0 0,16 31. Dextrin 0 0 0 0 032. D-Trehalose 0 0,122 0,399 0 0,179 33. Glycerin 0 0 0,16 0 0 34. Inulin 0 0 0 0 035. Turanose 0,197 0,148 0 0 0
8. ANHANG 156
Tab. 17. Fortsetzung
Testa Substrat D. anomalaT
D. bruxellensisT
B. custersianusT
B. nanusT
B. naardenensisT
36. Tween 80 0 0 0 0 037. Wasser 0,12 0,175 0,226 0,076 0,202 38. Cellobiose 0,522 0 0 0,27 0,199
39 N-Acetyl- D-Glucosamin 0,222 0 0 0 0,244
40. Malitol 0,261 0,419 0 0 0 41. D-Xylose 0 0 0 0 0,156 42. Fumarat 0 0 0 0 043. Gentiobiose 0,51 0 0 0,241 0,19 44. D-Glucosamin 0 0 0 0 045. D-Mannitol 0 0 0 0,178 0,121
46. Methyl-Succinat + D-Xylose 0 0 0 0 0
47. L-Malat 0 0 0 0 048. Maltose 0,463 0,494 0 0,197 0 49. α-D-Glucose 0,526 0,554 0,507 0 0,527 50. D-Sorbitol 0 0 0 0,151 0,094
51. N-Acetyl- L-Glutamat + D-Xylose
0 0 0 0 0,126
52. Methyl-Succinat 0 0 0 0 053. Maltotriose 0,464 0,501 0 0 0 54. D-Galactose 0,256 0 0 0,253 0 55. Adonitol 0 0 0 0,149 0
56. Chinasäure + D-Xylose 0 0 0 0 0,155
57. Brom-Succinat 0 0 0 0 058. D-Melezitose 0,555 0,527 0 0 0 59. D-Psicose 0 0 0 0,276 0 60. D-Arabitol 0 0,111 0 0,147 0
61. D-Glucuronat + D-Xylose 0 0 0 0 0,161
62. L-Glutamat 0 0 0 0 063. D-Melibiose 0 0 0 0 064. L-Rhamnose 0 0 0 0,257 0 65. Xylitol 0 0 0 0,09 0,098
66. Dextrin + D-Xylose 0 0 0 0,075 0
67. γ-Amino-Butyrat 0 0 0 0 068. Palatinose 0,457 0,481 0 0 0 69. L-Sorbose 0 0 0 0 070. Erythritol 0 0 0 0,163 0
71. α-D-Lactose + D-Xylose 0,524 0 0 0 0,174
72. α-Ketoglutarat 0 0 0 0 073. D-Raffinose 0 0 0 0 0
74. α-Methyl- D-Glucosid 0,313 0,425 0 0,188 0
75. Glycerin 0 0 0 0 0
76. D-Melibiose + D-Xylose 0 0 0 0 0,164
77. 2-Keto- D-Gluconat 0 0 0 0 0
78. Stachyose 0 0 0 0 0
8. ANHANG 157
Tab. 17. Fortsetzung
a Die Tests 1-36 enthalten Tetrazolium-Violett als kolorimetrischen Indikator für die Oxidation.
8.4 Mikroskopische Bestimmung der Zelltiter
Formel zur Zellzahl-Abschätzung: c [Zellen/ml] =
F Verdünnungs- bzw. Konzentrierungsfaktor
Z gezählte Zellen des gesamten Zählrasters
r Radius der Objektträger-Felder (2,5 mm)
V Gesamtvergrößerung (400x)
L auf Objektträger-Feld aufgetragenes Aliquot (5 µl)
K Kantenlänge des Zählrasters im Okular (12,5 mm)
Testa Substrat D. anomalaT
D. bruxellensisT
B. custersianusT
B. nanusT
B. naardenensisT
79. β-Methyl- D-Glucosid 0,354 0 0 0 0
80. Tween 80 0 0 0 0 0
81. D-Galactose + D-Xylose 0,249 0 0 0,086 0,201
82. D-Gluconat 0 0 0 0 083. Sucrose 0,555 0,531 0 0 0 84. Amygdalin 0,123 0 0,095 0 0,184 85. L-Arabinose 0 0 0 0 0
86. m-Inositol + D-Xylose 0 0 0 0 0,216
87. Dextrin 0 0 0 0 088. D-Trehalose 0,519 0,542 0,281 0 0,206 89. Arbutin 0,255 0 0 0,177 0 90. D-Arabinose 0 0 0 0 0
91. 1,2 Propandiol + D-Xylose 0 0 0 0,232 0,187
92. Inulin 0 0 0 0 093. Turanose 0,509 0,501 0 0 0 94. Salicin 0,27 0 0 0 0 95. D-Ribose 0 0 0 0 0
96. Acetoin + D-Xylose 0 0 0 0 0,21
π x F x Z x r2 x V2
0,1 x L x K2