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ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

OFICINA REGIONAL PARA EUROPA

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de

Alimentos

Sesión nº 5

Electroforesis en gel de agarosa

M. Somma, M. Querci

Electroforesis en Gel de Agarosa 2

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 5

Índice

Sesión nº 5

Electroforesis en Gel de Agarosa

Introducción 3

Principios físicos de la electroforesis en gel de agarosa 3 Componentes de la electroforesis en gel de agarosa 6

Práctica 8

Bibliografía 12



Introducción

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas

en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término

electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de

un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego

phoros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel es una técnica

consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una

placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a

los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula

determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de

un medio gelatinoso.

Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los

péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos

ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas

eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga

neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por

ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos

fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo

(Westermeier, 1997).

La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para

separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y

rápida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse

adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse

en el gel tiñendo con una concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente

intercalante fluorescente que se utiliza como colorante.

En las siguientes secciones se presentan los principios físicos, los componentes

(matriz de gel, tampón, tampón de carga y marcador) y los procedimientos para

preparar la electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989).

Principios físicos de la electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos

nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos

variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN,

se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan

conjuntamente. La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al



tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de fricción del material de gel actúa

como «tamiz molecular», separando las moléculas en función de su tamaño.

Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros,

dependiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores:

• fuerza del campo

• tamaño y forma de las moléculas

• hidrofobicidad relativa de las muestras

• fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas.

Para tener una idea cabal del proceso de separación de las partículas cargadas en

la electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a

esta técnica. Cuando se aplica tensión a los electrodos se genera un gradiente de

potencial (E), que puede expresarse con la siguiente ecuación:

E = V/d (1)

donde V, medida en voltios, es la tensión aplicada y d, la distancia en cm entre los

electrodos.

Al aplicarse el gradiente de potencial (E) se genera una fuerza (F) en una molécula

cargada, que puede expresarse con la siguiente ecuación:

F = Eq (2)

donde q corresponde a la carga en culombios que lleva la molécula. Esta es la

fuerza, medida en newtons, que empuja la molécula cargada hacia el electrodo.

Existe asimismo una resistencia de fricción que ralentiza el desplazamiento de las

moléculas cargadas. Esta fuerza de fricción es función de los siguientes factores:

• tamaño hidrodinámico de la molécula

• forma de la molécula

• tamaño de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis

• viscosidad del tampón.

La velocidad v de una molécula cargada en un campo eléctrico depende del

gradiente de potencial, la carga y la fuerza de fricción de la molécula, y puede

expresarse con la siguiente ecuación:

v = Eq / f (3)

donde f es el coeficiente de fricción.

La movilidad electroforética (M) de un ión puede entonces determinarse dividiendo la

velocidad del ión por el gradiente de potencial:

M = v / E (4)



Además, de la ecuación (3) se infiere que la movilidad electroforética M puede

expresarse de modo equivalente como la carga de la molécula (q) dividida por el

coeficiente de fricción (f):

M = q / f (5)

Cuando se aplica una diferencia de potencial, las moléculas que poseen distintas

cargas globales comenzarán a separarse debido a sus diferentes movilidades

electroforéticas. La movilidad electroforética es un parámetro significativo y

característico de las moléculas o partículas cargadas y depende del valor de pK del

grupo cargado y del tamaño de la molécula o partícula. Incluso las moléculas con

cargas semejantes empezarán a separarse si sus tamaños moleculares son distintos

por cuanto estarán sometidas a fuerzas de fricción diferentes. El ADN bicatenario

lineal migra por las matrices de gel a velocidades inversamente proporcionales al

log10 del número de pares de bases. Las moléculas más grandes migran más

despacio debido a la mayor resistencia de fricción y a la menor eficacia del

desplazamiento a través de los poros del gel.

La corriente que atraviesa la solución entre los electrodos es conducida

principalmente por los iones del tampón, si bien una pequeña proporción lo es por

los iones de la muestra. La relación entre intensidad I, tensión V y resistencia R se

expresa según la ley de Ohm:

R = V / I (6)

Esta ecuación muestra que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la

separación electroforética aumentando la tensión V aplicada, lo cual dará lugar al

correspondiente incremento de la intensidad de la corriente I. La distancia migrada

será proporcional a la intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensión (V) y

el incremento correspondiente de intensidad e (I) ocasionaría uno de los principales

problemas que plantea la mayor parte de las formas de electroforesis, a saber, la

generación de calor. Este fenómeno queda ilustrado con la siguiente ecuación, en la

que la potencia (W, medida en vatios) generada durante la electroforesis equivale al

producto de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la intensidad:

W = I2R (7)

Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforético se

disipa en forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales:

• aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el

consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas

• formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las

muestras separadas



• inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por

ejemplo, desnaturalización del ADN)

• disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia

del medio.

Componentes de la electroforesis en gel de agarosa

Agarosa

La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con

un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad

básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-

anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla

con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean

fundamentalmente para separar las moléculas grandes con un peso molecular de

más de 200 kDa.

Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución

limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser

difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse.

Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un

tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde

y se convierte en una solución transparente. A continuación, se vierte esta solución

en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma

un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene

determinada por su concentración.

Tampón de electroforesis

La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza

iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica

es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de

elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una

importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se

desnaturaliza.

Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo

bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o tris-

fosfato (TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8). Los

tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradas



y se conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una

concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No

obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona un poder más que suficiente y

en la actualidad prácticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se

practican utilizando esta concentración.

Concentración de agarosa

Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velocidades a

través de los geles según la concentración de agarosa. En función de la

concentración de agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que

contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por

lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (véase el

cuadro 1).

Cuadro 1. Concentración recomendada de gel de agarosa para separar moléculas de

ADN lineales.

% de agarosa Gamas de tamaños de ADN (pb)

0,75 10 000 – 15 000

1,0 500 – 10 000

1,25 300 – 5 000

1,5 200 – 4 000

2,0 100 – 2 500

2,5 50 – 1 000

ADN marcador

Para una tensión, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampón

determinadas, la distancia de migración depende del peso molecular del material

inicial. Así pues, debe cargarse un ADN marcador de tamaño conocido en las

ranuras situadas en los extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un

marcador contiene un número determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual

facilita la labor de determinar el tamaño de los ADN desconocidos en caso de que se

produjese alguna distorsión sistemática del gel durante la electroforesis.



Tampón de carga

Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en

primer lugar con un tampón de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y

un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de

bromocresol, etc.). La cantidad máxima de ADN que puede cargarse depende del

número de fragmentos. La cantidad mínima de ADN que puede detectarse mediante

fotografía de los geles teñidos con bromuro de etidio es de aproximadamente 2 ng

en una banda de 0,5 cm de ancho. Si una banda de este ancho contiene más de

500 ng de ADN, la ranura estará sobrecargada y se producirá emborronamiento. El

tampón de carga se emplea con tres fines:

• aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan

uniformemente en el pocillo

• añadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga

• incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace

hacia el ánodo a una velocidad previsible.

Práctica

Advertencia: El bromuro de etidio es una sustancia mutágena/carcinógena potente y moderadamente tóxica. Se deberán llevar siempre guantes cuando se manipulen soluciones y geles que contengan bromuro de etidio.

Instrumental

• Unidad de electroforesis horizontal con alimentación eléctrica

• Horno microondas o incubador-agitador

• Micropipetas

• Tubos de reacción de 1,5 ml

• Balanza que pueda pesar 0,01 g

• Espátulas

• Soporte para tubos de reacción

• Material de vidrio

• Transiluminador (radiación UV, 312 nm)

• Instrumentos para documentación (por ejemplo, cámara Polaroid o magnetoscopio).



Reactivos

• Agarosa adecuada para electroforesis de ADN

• Tris[hidroximetil] aminometano (Tris) CAS 77-68-1

• Ácido bórico

• Na2EDTA CAS 6381-92-6

• Bromuro de etidio CAS 1239-45-8

• Sacarosa

• Cianol de xileno FF CAS 2650-17-1

• ADN marcadores:

Lambda ADN EcoRI/HindIII digerido (u otros marcadores adecuados

similares)

Escalera de ADN de 100 pb.

Tampón de TBE 10x (1 litro)

Tris [hidroximetil] aminometano (Tris) 54,0 g

Ácido bórico 27,5 g

Na2EDTA 7,44 g

• Mezclar el reactivo con agua desionizada para obtener una solución de un litro con

un pH de 8,3.

• Conservar a temperatura ambiente.

Tampón de carga 6x (10 ml)

Cianol de xileno FF 0,025 g

Sacarosa 4 g

• Añadir sacarosa y cianol de xileno FF al agua desionizada para obtener 10 ml de

solución.

• Mezclar la solución, pasar por autoclave y conservar a 4°C.



Procedimiento

• Sellar los bordes de un molde de plástico limpio y seco con cinta adhesiva o de

otro modo. Colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos

completos al añadir la solución de agarosa.

• Diluir tampón de TBE 10x y preparar la cantidad adecuada de tampón de TBE

0,5x para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel.

• Pesar la agarosa en polvo según lo indicado en el cuadro 2 y añadirla a una

cantidad apropiada de tampón de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con

tapa suelta (normalmente 150 ml de solución de gel para un molde de 15 x 15

cm y 100 ml de gel para un molde de 15 x 10 cm).

Cuadro 2. Concentraciones de gel de agarosa empleadas durante el curso.

GM

O3

GM

O4

ZEIN

3

ZEIN

4 p3

5S-c

f3

p35S

-cr4

H

A-n

os11

8-f

HA

-nos

118-

r C

RYI

A3

CR

YIA

4 G

M07

GM

08

GM

3

GM

4 A

DN

genó

mic

o

0,8 - 1% X

1,5% X X

2,0% X X X X X

• Calentar la mezcla en un horno microondas o al baño maría hasta que se

disuelva la agarosa (comprobar el volumen de la solución tras haberla

calentado).

• Enfriar la mezcla a 50 - 60°C y añadir bromuro de etidio (de una solución madre

de 10 mg/ml) hasta lograr una concentración final de 0,2 µg/ml y mezclar bien.

• Verter la solución en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de gel

empleado debe corresponder a un grosor de aproximadamente 3 - 5 mm.

• Una vez completamente formado el gel, retirar cuidadosamente el peine y la

cinta adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.

• Añadir tampón de TBE 0,5x a la unidad de electroforesis de modo que el gel

quede cubierto por una capa de aproximadamente 2 - 5 mm.



Preparar muestras y marcador para ADN genómico del siguiente modo:

Muestra Marcador

Agua 3 µl Agua 6 µl Tampón de carga 2 µl Tampón de carga 2 µl Muestra 5 µl λ ADN EcoR I / Hind III 2 µl 10 µl 10 µl

Preparar muestras y marcador para productos de PCR del siguiente modo:

Muestra Marcador

Tampón de carga 2 µl Escalera de ADN de 100 pb15 µl Muestra 8 µl

10 µl

• Cargar 10 µl de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador

adecuado en las calles primera y última.

• Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables eléctricos para que el

ADN migre hacia el ánodo y aplicar una tensión de 5 - 10 V/cm.

• Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la distancia

adecuada a través del gel (~ 40 - 60 minutos).

• Desconectar la corriente y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el

gel en un transiluminador UV y fotografiarlo.

• Tirar el gel en el recipiente para residuos sólidos destinado al bromuro de etidio

previsto a tal fin.



Bibliografía

Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). «Gel electroforesis of DNA» en:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory

Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,

NY, USA, capítulo 6.

Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and

Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.

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