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ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS

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Page 1: BMC Electroforesis

ELECTROFORESISELECTROFORESIS

Page 2: BMC Electroforesis

ELECTROFORESISELECTROFORESIS

Definición: Método de análisis basado en la migración diferencial de sustancias en solución cargadas eléctricamente, por efecto de la aplicación de un campo eléctrico.

Page 3: BMC Electroforesis

Aplicación aAplicación a: :

                Proteínas en general Proteínas en general                 ADN y ARN ADN y ARN                 NucleótidosNucleótidos                AminoácidosAminoácidos                 PolisacáridosPolisacáridos                Fosfolípidos.Fosfolípidos.

Page 4: BMC Electroforesis

CLASIFICACION:CLASIFICACION:

a) a) Según el soporteSegún el soporte::

                Geles de poliacrilamidaGeles de poliacrilamida    Geles de agarosaGeles de agarosa                               Tiras de acetato de celulosaTiras de acetato de celulosa                 Geles de almidónGeles de almidón                 Papel de filtro  Papel de filtro

b) b) Según las características de la moléculas a separarSegún las características de la moléculas a separar::

 *  * CCargaarga * *  Peso molecular (P.M.)Peso molecular (P.M.) *  * Punto isoeléctrico (p.I)Punto isoeléctrico (p.I) * Combinaciones de las anteriores* Combinaciones de las anteriores

Page 5: BMC Electroforesis

TEORIATEORIA  Una partícula cargada eléctricamente con la carga Una partícula cargada eléctricamente con la carga qq colocada en un medio determinado y bajo la acción de un colocada en un medio determinado y bajo la acción de un campo eléctrico se verá sometida a dos fuerzas: campo eléctrico se verá sometida a dos fuerzas:

A) la A) la fuerza de atracciónfuerza de atracción o o fuerza propulsorafuerza propulsora, llamada , llamada fuerza eléctrica ( fuerza eléctrica (FeFe) )

B) la B) la fuerza resistentefuerza resistente, llamada resistencia viscosa (, llamada resistencia viscosa (FsFs).).  A)    Fuerza eléctrica: (1) Fe = E . qA)    Fuerza eléctrica: (1) Fe = E . q

FeFe V V E : campo eléctrico E : campo eléctrico

EE = ---- = ------ = ---- = ------ V : diferencia de potencial aplicada sobre la longitud ( l )V : diferencia de potencial aplicada sobre la longitud ( l )

qq I I qq : carga de la partícula : carga de la partícula   

Page 6: BMC Electroforesis

B)B)        Resistencia viscosaResistencia viscosa: ( 2 ) : ( 2 ) FsFs = = 66rr vv   = viscosidad del medio = viscosidad del medior = radio de la partícular = radio de la partículavv = velocidad de la partícula = velocidad de la partícula

  La partícula es empujada por la La partícula es empujada por la FeFe y su velocidad ( y su velocidad (vv) ) aumenta hasta un valor tal que ambas fuerzas se aumenta hasta un valor tal que ambas fuerzas se equilibran: equilibran: EE . . qq = = 66 r v r v

qqDespejando la velocidad tenemos: (3) Despejando la velocidad tenemos: (3) vv = = EE . ----- . ----- 66 r r   

Fe = Fs

Page 7: BMC Electroforesis

Según (3) la velocidad será: v = E . , v = V/l .  La velocidad de la partícula (v) en una electroforesis es proporcional al campo aplicado (E) y a su Movilidad Electroforética ().

   q qq qEn cambio, el factor ----- depende del medio ( En cambio, el factor ----- depende del medio ( ) y de la partícula ---- ) y de la partícula ---- 6 6 r r r r   q qEsta relación: ---- , se llama Esta relación: ---- , se llama Movilidad ElectroforéticaMovilidad Electroforética 6 6 r r

q q y se representa por la letra y se representa por la letra 66 r r

Page 8: BMC Electroforesis

Electroforesis en tiras de Electroforesis en tiras de acetato de celulosaacetato de celulosa

Siembra

- +

AnodoCátodo

Page 9: BMC Electroforesis

SiembraSiembra

- +-+

Fuente de Poder (V)

Cátodo Anodo

++

+-

Page 10: BMC Electroforesis

SiembraSiembra

- +-

+

Fuente de Poder (V)

Cátodo Anodo

++

+-

Page 11: BMC Electroforesis

SiembraSiembra

- +-

+

Fuente de Poder (V)

Cátodo Anodo

++

+-

Page 12: BMC Electroforesis

SiembraSiembra

- +-

+

Fuente de Poder (V)

Cátodo Anodo

++

+-

Page 13: BMC Electroforesis

SiembraSiembra

- +-

+

Fuente de Poder (V)

Cátodo Anodo

++

+-

Page 14: BMC Electroforesis

SiembraSiembra

- +-

+

Fuente de Poder (V)

Cátodo Anodo

++

+-

Page 15: BMC Electroforesis

Carga de aminoácidos en función del Carga de aminoácidos en función del pHpH

COOH

H3N+ C H

H

Glicina

Page 16: BMC Electroforesis

Carga de aminoácidos en función del Carga de aminoácidos en función del pHpH

COOH

H3N+ C H

H

Glicina

COO-

H3N+ C H

H

NaOH

pHpK1: 2.34

+ + -

Page 17: BMC Electroforesis

Carga de aminoácidos en función del Carga de aminoácidos en función del pHpH

COOH

H3N+ C H

H

Glicina

COO-

H3N+ C H

H

NaOH

pHpK1: 2.34

+ + -

H2N C H

COO-

H

-pK2: 9.6

pI: 5.97

Page 18: BMC Electroforesis

Ejercicio:Ejercicio:

Para separar una mezcla de proteínas se realizó una electroforesis con

un buffer pH= 4.5. De acuerdo a la siguiente tabla de datos, conteste:

Proteína pI

a....................2.3

b....................4.5

c..................10.5

d....................9.2

e.....................3.8

A. La proteína e migró al cátodo.

B. Las proteínas a y d migraron al cátodo.

C. La proteína a está más alejada que la e del lugar de siembra.

D. La proteína e está más alejada que la a del lugar de siembra.

Page 19: BMC Electroforesis

EjercicioEjercicioCuál es el mejor buffer para separar estas cuatro proteínas:

Proteína pI a..............5.2 b..............7.4 c..............8.5 d..............3.4

Buffer pH 1.............9.2 2.............8.5 3.............5.2 4.............3.0

Page 20: BMC Electroforesis

Electroforesis de ProteínasElectroforesis de Proteínas

1)1) SDS-PAGESDS-PAGE

2) Enfoque iso-eléctrico Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing)(Iso-electric focusing)

3)3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)

Page 21: BMC Electroforesis

2-Mercaptoetanol ?

SDS - PAGESDS - PAGEGeles de poliacrilamidaGeles de poliacrilamida

El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el esqueleto polipeptídico y les confiere carga negativa.

Page 22: BMC Electroforesis

1. Armado del soporte

2. Formación del gel

3. Siembra de la muestra

4. Corrida

5. Fijación y Coloración

6. Desteñido

7. Secado

8. Análisis

PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO

Page 23: BMC Electroforesis

Siembra-

+

Page 24: BMC Electroforesis

Determinación de Pesos Moleculares por SDS-PAGEDeterminación de Pesos Moleculares por SDS-PAGE

66000

4500034700

19000

10000

St. (PM)Muestra

Banda 1Banda 2

Curva de Calibración de proteínas por SDS-PAGE al 12 %

y = -73873x + 67578R2 = 0,9569

0

1000020000

30000

40000

5000060000

70000

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Rf (cm)

PM

Rf=Distancia Recorrida por Proteína.

Movilidad relativa de una Proteína (Rf). También llamado relación al frente.

B1=5.43 cmB2=5.55 cm

D.R.Col = 9.4 cm.Calcular el Rf y el PMpara cada muestra.

Azul de Bromofenol

Distancia Recorrida por Colorante.

Page 25: BMC Electroforesis

Electroforesis de ProteínasElectroforesis de Proteínas

1)1) SDS-PAGESDS-PAGE

2) Enfoque iso-eléctrico Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing)(Iso-electric focusing)

3)3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)

Page 26: BMC Electroforesis

Enfoque iso-eléctrico Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing) (Iso-electric focusing)

NaOH

H3PO4

pH10

3

Dos corridas:1) Enfoque de anfolitos, gradiente de pH.2) Enfoque de proteínas.

Page 27: BMC Electroforesis

Electroforesis de ProteínasElectroforesis de Proteínas

1)1) SDS-PAGESDS-PAGE

2) Enfoque iso-eléctrico Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing)(Iso-electric focusing)

3)3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)

Page 28: BMC Electroforesis

2-D PAGE 2-D PAGE (PAGE Bidimensional)(PAGE Bidimensional) Electroenfoque

SDS-PAGE

(Separación por pI)

(Separación por Peso Molecular)

Page 29: BMC Electroforesis

ELECTROFORESISELECTROFORESIS  

Uso en la profesión veterinaria, fundamentalmente en la separación e identificación de sustancias de componentes biológicos, especialmente líquidos como: suero, orina, líquido cefaloraquídeo, líquido de punciones, leche, etc.

Page 30: BMC Electroforesis

Separar e identificar las fracciones de caseínas

bovinas y caprinas por SDS-PAGE.

Análisis de proteínas lácteas por Análisis de proteínas lácteas por electroforesiselectroforesis

Las proteínas de la leche se dividen en dos grupos:A) Caseínas son las que precipitan a pH 4.6 a 20ºC. Están compuestas

por las fracciones s1, s2, y corresponden al 80 % del total de

proteínas lácteas.B) Proteínas del suero: -lactalbúmina y -lactoglobulina.

Las caseínas son muy importantes por su valor nutritivo y también por su influencia sobre los derivados lácteos. Hay alta correlación entre contenido de caseínas y rendimiento quesero; también influyen sobre características tales como el sabor, textura, etc.

Objetivo 1:

Page 31: BMC Electroforesis

ResultadosResultados

Page 32: BMC Electroforesis

Caseínas CaprinasCaseínasCaseínas BovinasBovinas

C.S. C.T.-CnC.B. C.B.C.B.S. C.B.S.

s2s1

s1 y

s2

SDS-PAGE

St. St. St.

C.B.: Muestras individuales bovinasC.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma)-Cn.: St. de beta-caseína (Sigma).

C.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma)C.S.: St. de Caseína Caprina (Sigma).C.T.: Muestra de Caseína Caprina de la raza Toggenburg.

St.M M M

Page 33: BMC Electroforesis

Objetivo 2:Objetivo 2:

Estudiar la actividad proteolítica de la enzima Pepsina porcina sobre la

B.S.A. (Albúmina Sérica Bovina)

Page 34: BMC Electroforesis

ResultadoResultado

Pocillos:1: St (PM): 14.3, 18.4, 24, 34.7, 45, 66 KD.2: (BSA) a tiempo “0” con Pepsina.3: Idem 2 pero a t: “10” minutos.4: a “20” min.5: a “30” min.6: a “45” min7: a “60” min.8: St igual que en pocillo 1

Tiempo en minutos en degradación de BSA por Pepsina porcina. BSA 0 10 20 30 45 60 (min)          

  St. 0 10 20 30 45 60 St.        

 

 P: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Page 35: BMC Electroforesis

HemoglobinaHemoglobinaHemoglobina (PM=64500): formada por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas (141 aa) y dos cadenas (146 aa).Cada subunidad tiene un grupo Hemo con un átomo de Hierro en estado ferroso (Fe2+) que son los que convierten a la Hb en una proteína cromogénica.

Evaluar el comportamiento de la Hemoglobina

corrida por SDS-PAGE, bajo condiciones

desnaturalizantes.

Objetivo 3:

Page 36: BMC Electroforesis

ResultadosResultados

Page 37: BMC Electroforesis

SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)

SDS-PAGE (12%)Tinción con Azul de

Coomasie

(BSA) SUEROHb

PM aprox.

64.500

34.000

17.00014.000

Page 38: BMC Electroforesis

SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)

SDS-PAGE (12%)Tinción con Azul de

Coomasie SDS-PAGE (15%) Sin tinción

(BSA) SUEROHb

Hb en diferentes concentraciones

PM aprox.

64.500

34.000

17.00014.000

17.00014.000

PM aprox.

Page 39: BMC Electroforesis

EjerciciosEjercicios11)  Se realiza una electroforesis en un buffer pH 7.6, de una mezcla de tres proteínas (a, b y c) cuyos pI son:        pI (a) = 4.3        pI (b) = 5.6        pI (c) = 8.3 De acuerdo con estos datos:A a) las proteínas (a) y (b) migrarán al ánodo.B b) las proteínas (b) y (c) migrarán al ánodo.C c) las proteínas (a) y (b) migrarán al cátodo.

 d) la proteína (b) migrará al cátodo.      

Page 40: BMC Electroforesis

e Se desea separar por electroforesis una mezcla de tres proteínas (I, II, y III) utilizando un buffer pH 5.2. Teniendo en cuenta los siguientes datos: pI P.M. I ………...4.7……..110.000 II ..……...4.0………60.000 III ..……...6.9……..150.000  Puede predecirse que: Aa)    la proteína I se dirigirá al ánodo, y las proteínas II y III al cátodo.Bb)    II estará más alejada que I del lugar de siembra.Cc)    III estará más cerca del ánodo que I y II.Dd)     I estará más alejada que II del lugar de siembra.

2)

Page 41: BMC Electroforesis

3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas.  PROTEINAS PM pI Albúmina 69000 4.9 1-globulina 195000 2.7 2-globulina 820000 5.4 -globulina 143000 5.6 -globulina 160000 7.3

pH 2 pH 9

Page 42: BMC Electroforesis

3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas.  PROTEINAS PM pI Albúmina 69.000 4.9 1-globulina 195.000 2.7 2-globulina 820.000 5.4 -globulina 143.000 5.6 -globulina 160.000 7.3

pH 2 pH 9Electroenfoque

SDS-PAGE

Page 43: BMC Electroforesis

•1,2 y 3.) Proceso de Purificación.•4.) Proteína Purificada•5.) El material purificado (banda C) con tres marcadores de peso molecular A, B y D.

4) La figura adjunta muestra un gel SDS-PAGE. Las proteínas han sido teñidas con azul de coomassie. Se han aplicado 5 muestras distintas:

¿Cuál es el peso molecular de la proteína pura?

D

St. P.M.A......100.000B........40.000D.........4.000

Curva de calibración de estándares de P.M. por SDS-PAGE.

y = -134904x + 118644R2 = 0,9992

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1Rf

P.M

.

A

B

D

Page 44: BMC Electroforesis

5) La protein-kinasa dependiente de cAMP de mamíferos muestra un peso molecular en condiciones nativas de 178.000. En SDS-PAGE esta proteína da lugar a una banda de 39000 y otra de 50000.

¿Cómo se explican estos resultados?