非 ヒス トン蛋 白質 お よびH1ヒ ス トン除去の

クロマチ ンの鋳 型活性 とヌク レアーゼ

消化性への影響

岡 山大 学 医 学部 癌 源研 究施 設 生 化学 部(指 導:小 田琢 三 教 授)

入 澤 實 ・ 池 田 正 五

小 田 琢 三

(昭 和57年3月29日 受 稿)

Key words:ク ロマ チ ン, RNAポ リメ ラーゼ,

ヌ ク レアー ゼ

緒 言

真核 細 胞 の クロマ チ ン は, DNA,ヒ ス トン,

非 ヒス トン蛋 白質 の 複合 体 で あ り,そ の 基本 構

造 は, 4種 の ヒス トン(H2A, H2B, H3, H4)

の 各2分 子 が会 合 した8量 体(ヒ ス トン コア)

にDNAが 約1.75回 巻 きつ い た ヌ クレオ ソー ム

コア が連 結DNAで 数 珠 玉 状 に連 な った ヌ クレ

オ ソー ム構 造の 繰 り返 しであ るこ とが知 られ て

い る1).ま たH1ヒ ス トンはヌ クレオ ソー ム 間の

連 結DNAに,ク ロマチ ン を折 りた たむ よ うに

つ い て い る と考 え られ て い る2,3).非 ヒス トン蛋

白質 の分子 種 は数 百 に も及 び,生 物 種や 細胞 分

化 の過 程 で特 異 的 な変 化 を示 す こ とか らDNA

やRNA合 成の 調 節 の主 役 をな す と考 え られ て

いる4～6).ヒ ス トンと非 ヒス トン蛋 白質 を選 択 的

に核 また は クロマ チ ンか ら除去 す る こ とに よ る

クロマ チ ン の形 態変 化 の 電 顕観 察7),転 写鋳 型活

性への影響5,6,8,9), micrococcal nuclease消 化

へ の影 響10～12)を研 究 す る こ とに よ り,ヒ ス トン,

非 ヒス トン 蛋 白質 の機 能 の 研究 が され て い る.

特 にH1ヒ ス トン除去 に よ る クロマ チ ンの構 造

と機 能 の変 化 の研 究 が よ く行 な われ て い る.こ

れ らの研 究 でH1除 去 の 転 写 活性 に 与 え る影 響

につ い て は,促 進 的 に働 くとす る報告6,9)とH1

除去 で は影 響 な くクロマ チ ンにH1を 添加 す る

こ とに よ り転 写 活性 を抑 制 で きる とす る報 告8)

とが あ る.ま たH1除 去 のmicrococcal nucle

aseに よる クロマ チ ンDNAの 消 化 に 与 え る影

響 に つ い て も,消 化DNA断 片 の大 き さに変 化

が あ る とい う報告10)とDNA断 片の 大 き さに変

化 は な く,単 に ヌ ク レア ー ゼ 感受 性 が 高 まる だ

け で あ る とす る報告11,12)とが あ る.本 研 究 は,

塩(NaCl)処 理 に よ りク ロマ チ ンか らH1ヒ

ス トン,非 ヒ ス トン蛋 白質 を除去 し,そ れ に よ

る ク ロマ チ ン構 造 と機 能 の 変 化 を転 写 鋳 型 活性

とmicrococcal nuclease消 化 性 の 面 か ら研 究

した.

材 料 と 方 法

1)核 の分 離

核 はEhrlich腹 水癌 細 胞 よ りHersheyら の方

法13)に 従 って, 10mM Tris-HCl(pH 7.8), 4

mM MgCl2, 1mM EDTA中 でDounceホ モゲ

ナ イザ ー で細 胞 を破壊 して分 離 した.

2)ヒ ス トンH1の 調 製

H1ヒ ス トンは,腹 水 癌 細 胞 の核 よ りJohns

の方 法14)に よ って 調 製 した.

3)ク ロ マ チ ンの 調 製

ク ロマ チ ン は,核 よ りZubayら の方法15)を一

部 改 良 して4℃ にお い て次 の 如 く調 製 した.す

なわ ち核 約30gを80mlの10mM Tris-HCl(pH

7.4), 0.14M NaCl, 10mM EDTA, 0.5mM

phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF)中

で 日立VA-10Pブ レ ンダー で2分 間 ホ モゲ ナ イ

ズ し, 2,000×g, 5分 間遠 心 した,沈 渣 を さ ら

721

722 入澤 實 ・池 田正 五 ・小 田琢 三

に2回 同様 の 操 作 を行 ない,最 終 の 沈 渣 を80ml

の5mM Tris-HCl(pH 7.4), 0.5mM PMSF

に懸 濁 し, 2lの 同 溶液 に 一 晩透 析 した.透 析 後

ブ レ ンダー にて5分 間 ホモ ゲ ナ イ ズ し, 10,000

×g, 30分 間遠 心 し,そ の 上 清 を粗 ク ロマ チ ン標

品 と仮 称す る.

4)粗 クロマ チ ンのNaCl処 理

粗 ク ロマ チ ン溶 液か らあ る種 の蛋 白質 を除 く

ため に,ク ロマ チ ン溶液 を攪 拌 しなが ら,固 形

NaClを 終 濃度 が それ ぞ れ0.15M, 0.35M, 0.6

Mに な るよ うに加 え,さ らに30分 間攪 拌 した.

解 離 した 蛋 白質 と クロマ チ ン を分 離 す るため,

日立RPS-25-2A用 チ ュー ブ に5mlの60%蔗 糖,

5mM Tris-HCl(pH 7.4), 0.5mM PMSFを 入

れ,そ の上 に15mlの15%蔗 糖, 5mM Tris-HCl

(pH 7.4), 0.5mM PMSFに そ れ ぞれ0.15M,

0.35M, 0.6M NaClを 含 む 溶液 をのせ,さ らに

先 に調 製 した試 料 の0.15M, 0.35M, 0.60M溶

液 を等 しいNaCl濃 度 の 蔗糖 液 の上 に重 層 し,

74,000×g, 18時 間 遠心 し, 60%蔗 糖 画 分 を分

取, 2lの5mM Tris-HCl(pH 7.8)に 対 して透

析 した.透 析 後 テ フ ロ ン ホモ ゲナ イザ ー に て ホ

モ ゲナ イズ し, 10,000×g, 30分 間 遠心 し,そ の

上 清 を以 後 の実 験 に用 い た.

5) DNAと 蛋 白質 の定 量

クロマ チ ンのDNAは ジフ ェ ニル ア ミン法16)

に よ って 測定 した.ク ロマ チ ン の蛋 白含 量は 牛

血清 ア ル ブ ミン を標準 としてLowryら の方 法17)

に よ って 測定 した.

6)ク ロマ チ ン蛋 白の ゲル 電気 泳 動

全 蛋 白質 はLaemmli18)に よ る15% SDS-ポ

リア ク リル ア ミドゲル電 気 泳動 で解 析 した.

7) NaCl処 理 ク ロマ チ ンの 鋳 型 活性 測 定

ク ロマ チ ンの 鋳 型活 性 は, DNAと して3.6μg

を含 む0.15M, 0.35M, 0.60M NaCl処 理 クロ

マ チ ン及 び0.60M NaCl処 理 クロマ チ ンに0.4

μgのH1ヒ ス トンを加 え た4種 の溶 液 を37℃,

10分 間 前 処 理 した 後,終 濃度 が50mM Tris-HCl

(pH 7.8), 5mM MgCl2, 0.1mM dithiothrei

tol(DTT), 0.2mM ATP, 0.2mM CTP, 0.2

mM GTP, 0.02mM〔3H〕UTP(2μCi), 1単

位 の 大 腸 菌RNAポ リメラ ーゼ(Miles Lab.)

とな るよ うに した0.25mlの 反応液 を用いてHidaka

らの方 法19)に よ って 測定 した.

8)ヌ ク レアー ゼ 消 化

クロマ チ ンDNAの ヌ クレア ー ゼ 感受 性 の 測

定 は次 の よ うに行 な った. DNAと して9.0μg

を含 む0.15M, 0.35M, 0.60M NaCl処 理 クロ

マ チ ン及 び0.60M NaCl処 理 クロマ チ ン にH1

2.0μgを 加 え た4種 の クロマ チ ン溶 液 を37℃,

10分 間 前処 理 した後,終 濃度 が20mM Tris-HCl

(pH 7.8), 2mM CaCl2, 4単 位 のmicrococ

cal nuclease(Worthington Biochemical

Corp.)と な るよ うに した反 応 液0.25mlを37℃ で

所 定 の 時 間DNAを 消化 させ た 後,等 量 の 氷冷

20%TCAを 加 え,さ らに2mlの10% TCAを

加 えて, 2,000×g, 1時 間 遠 心 し,沈 渣 を4ml

の10%TCAで2回 遠 心 洗 浄 し,酸 不 溶 性画 分

に 回収 され たDNAを ジ フ ェニ ル ア ミン法 に よ

り定 量 した.ま た ヌ クレア ー ゼ 消化 パ ター ンの

差 異 を観 察 す る ため に別 の 試 験 管 に て前 述 の反

応 を行 ない,等 量 の20mM EDTA, 1%SDS,

を加 え反 応 を停 止 した.そ れ か らMarmur法20)

でDNAを 抽 出 した.ヌ ク レアー ゼ で 消 化 され

たDNA断 片は, 40mM Tris-HCl(pH 7.8),

20mM酢 酸 ナ ト リウ ム, 2mM EDTAを 含 む

6%ポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル電 気 泳 動 によ り解

析 した.

実 験 結 果

1)塩 処理 クロマ チ ンの性 状

0.15M, 0.35M, 0.6M NaClで 処 理 した クロ

マ チ ンの 蛋 白質/DNAの 重 量 比 は,そ れ ぞれ

1.70, 1.65, 1.49で,処 理 す るNaCl濃 度 が 高

い程 ク ロマ チ ンか ら 多 くの 蛋 白質 が解 離 した.

クロマ チ ン を0.35M NaClで 処 理 す るこ とに よ

り,一 部 非 ヒス トン蛋 白質 とわず か のH1ヒ ス

トンが 解 離 抽 出 され, 0.6M NaCl処 理 では,ク

ロマ チ ンか ら,か な りの 非 ヒス トン蛋 白質が 抽

出 され る と と もにH1ヒ ス トンが 完 全 に抽 出除

去 され た(図1).ま たH2A, H2B, H3, H4

ヒス トンは,こ れ らの塩 処理 で ほ とん ど抽 出 さ

れ なか った(図1).

2)塩 処理 ク ロマチ ンの転 写 活性

H1ヒ ス トンのほ とん どはず れ て い な い0.35M

NaCl処 理 ク ロマ チ ン, 0.6M NaCl処 理H1除

非 ヒス トン蛋 白質お よびH1ヒ ス トン除去 の クロマ チ ンの 鋳 型 活性 と

ヌ ク レアー ゼ 消化 性 へ の影 響 723

図1　 塩 処理 ク ロマ チ ンの 蛋 白ゲ ル 電 気 泳 動

蛋 白質 の 解 析 は 材 料 と方 法 に 従 っ て行

な った.

A. 60%蔗 糖 分 画 に 回収 され た ク ロマ チ

ン蛋 白質

B.重 層 した塩 処 理 ク ロマ チ ン層 に 残 っ

た 蛋 白質

a. 0.15 NaCl処 理b. 0.35M Na

Cl処 理

c. 0.60M NaCl処 理

去 ク ロマ チ ン,精 製 二 本 鎖DNAの 鋳 型 活性 は,

0.15M NaCl処 理 クロマ チ ン のそ れ に対 して,

それ ぞ れ約2倍, 2.5倍, 3.7倍 とな っ た(図2).

またH1除 去 クロマ チ ンにH1ヒ ス トン をH1

ヒス トン/DNA重 量 比0.11で 加 え,材 料 と方 法

に述べ て い る よ うに して調 製 した再 構 成 クロマ

チ ンの鋳 型 活性 は, 0.6M NaCl処 理H1除 去

クロマ チ ンの そ れ よ り低 か っ た(図2).

3)塩 処 理 ク ロマ チ ンの ヌ クレア ー ゼ 消化

図2　 塩 処 理 ク ロマ チ ン の転 写鋳 型 活 性

材 料 と方 法 に 述 べ て あ る よ うにDNA,

NaCl処 理 クロマ チ ン(DNAと して

3.6μg)及 びH1除 去 クロマ チ ン(DNA

と して3.6μg)H1ヒ ス トン0.4μgと で

再 構 成 させ た クロ マ チ ン を用 い てRN

A合 成 させ 酸不 溶性 放射 活 性 を測定 した.

△ 0.15M NaCl処 理 ク ロマ チ ン

□ 0.35M NaCl処 理 ク ロマ チ ン

○ 0.60M NaCl処 理 ク ロマ チ ン

● 0.60M NaCl処 理 ク ロマ チ ン

とH1と で 再 構 成 させ た クロマ

チ ン

× 精 製DNAを 鋳 型 として用 いた.

抽 出精 製DNA, 0.6M NaCl処 理H1除 去 ク

ロマ チ ン, 0.6M NaCl処 理 ク ロマ チ ン とH1

ヒス トン とでH1ヒ ス トン/DNA重 量 比0.22で

材料 と方 法 に従 って 調 製 した再 構 成 ク ロマ チ ン,

0.35M NaCl処 理 クロマ チ ン, 0.15M処 理 クロ

マ チ ンの 順 に ヌ ク レアー ゼ 感受 性 が 高 く,こ の

実験 条件 で15分 間 ヌ ク レア ー ゼ 消化 させ た と き

のDNA可 溶化 率 は,そ れ ぞ れ97, 58, 53, 48,

40%で あ った(図3).ま た0.15M, 0.35M, 0.6

M NaCl処 理 クロマ チ ンの ヌ ク レアー ゼ で 消 化

され て で きた ヌ ク レオ ソー ム モ ノマーDNAの

大 き さは ほぼ 同 じで あ っ たが,そ の 出現 時 間 は

処 理 す る塩 濃度 が 高 い程 早 か った(図4).

724 入 澤 實 ・池 田正 五 ・小 田琢 三

図3　 NaCl処 理 ク ロマ チ ンの ヌ ク レア ー ゼ

感 受 性

材 料 と方 法 に 述べ て あ る よ うにDNA,

NaCl処 理 クロ マ チ ン(DNAと して9

μg)及 びH1除 去 クロマ チ ン(DNA

と して9μg)とH1ヒ ス トン2.0μgと

で再 構 成 させ た ク ロマ チ ン を ヌ ク レア

ー ゼ で 消 化 し,酸 不 溶 性 画 分 のDNA

を定 量 し,元 の クロ マ チ ンDNAと の

差 を酸 可 溶性DNAと して,可 溶 化率

を算 出 した.

△ 0.15M NaCl処 理 クロ マ チ ン

□ 0.35M NaCl処 理 クロ マ チ ン

○ 0.60M NaCl処 理 ク ロマ チ ン

● 0.60M NaCl処 理 ク ロマ チ ン

とH1と で 再構 成 させ た クロマ

チ ン

× 精 製DNAを ヌ クレ ア ー ゼ で

消 化 した.

考 察

ヒ ス トン と非 ヒ ス トン 蛋 白質 を核 ま たは クロ

マ チ ン よ り選 択 的 に 抽 出す る こ とに よ り引 き起

こ され る クロマ チ ンの性 状 の 変化 を研 究 す る こ

とに よ り,そ れ らの機 能 と存 在部 位 が 研 究 され

て い る5～12).特 にH1ヒ ス トンに 関す る研 究 が

よ く行 なわ れ て お り, H1除 去に よる クロマチ ン

の 形態 変 化7),転 写 鋳 型 活性 の変 化5,6,8), micro

coccal nuclease感 受 性 の 変 化10～12)等か ら, H1

図4　 Micrococcal nuclease消 化DNA断 片

の ゲ ル電 気 泳 動

NaCl処 理 ク ロマ チ ン を材 料 と方 法 に

従 っ て ヌ ク レア ー ゼ 消 化 を行 な い,得

られ たDNA断 片 を ゲ ル電 気 泳動 した.

A.ヌ クレア ー ゼ 消 化 前 の ク ロマ チ ン

DNA

B.ヌ クレ ア ー ゼ 消 化2分 の ク ロマ チ ン

DNA

C.ヌ クレ ア ー ゼ消 化5分 の ク ロマ チ ン

DNA

a. 0.15M NaCl処 理 ク ロマ チ ンDNA

b. 0.35M NaCl処 理 ク ロマ チ ンDNA

c. 0.60M NaCl処 理 ク ロマ チ ンDNA

ヒス トンは クロマ チ ンの凝 集 に関 与 して い る と

推 測 され て い る.

本 研 究 で は, 0.15M, 0.35M, 0.6M NaCl

処 理 してH1ヒ ス トンと一 部の非 ヒス トン蛋 白質

を クロマ チ ンか ら除 去 す る こ とに よ り起 こ る転

写鋳 型 活 性 及 び ヌ クレア ー ゼ感 受 性 の 変化 よ り,

これ ら核 蛋 白質 の機 能 を研 究 した.そ の結 果,

クロマ チ ン よ りH1ヒ ス トン を完 全 除 去 す るこ

とに よ り,明 らか に転 写 鋳 型 活性 の促 進 と ヌ ク

レアー ゼ 感受 性 の増 加 が み られ た が, 0.35M

NaClに よ るわ ず か のH1ヒ ス トンの 除去 と一部

の非 ヒス トン蛋 白質の 除去 で も,こ れ らの促 進 な

い し増加 が認め られ た ことか らH1ヒ ス トンのみ

で な く, 0.35M NaClで 抽 出 され る非 ヒス トン

非 ヒス トン蛋 白質 お よびH1ヒ ス トン除去 の クロマ チ ンの鋳 型活性 と

ヌ クレア ー ゼ消 化 性へ の影 響 725

蛋 白質 も クロマ チ ンの 高 次構 造 に 関 与 してい る

こ とが推 定 され た.ま たH1ヒ ス トン及 び一部

の非 ヒス トン蛋 白質 を ク ロマチ ンか ら除 去 し,

micrococcal nuclease消 化 を行 な って も,ヌ ク

レア ー ゼ感 受 性 が高 ま るだ け で,消 化 され て く

る ヌ ク レオ ソー ム ・コアDNAの 大 きさ に変 化

が ない こ とか ら,こ れ らの 蛋 白質 は主 と して ヌ

クレオ ソー ム 間 の連 結DNAに 結合 して,ク ロ

マ チ ンの高 次 構 造 に関 係 して い る と思 われ る.

結 論

Ehrlich腹 水 癌 細 胞 クロマ チ ンか ら0.15～0.6

M NaClで 蛋 白質 を抽 出 す るこ とに よ り起 こる

クロマ チ ンの 構 造 と機 能 の変 化 を研 究 した.ク

ロマ チ ンを0.6M NaCl溶 液 で処理す る こ とに よ

り,ヒ ス トンの 中でH1ヒ ス トンが 選 択 的 に 抽

出 され た.ク ロマ チ ン を高 い塩 濃度 で処 理 す る

程,多 くの 蛋 白質 が クロマ チ ンか ら抽 出 され,

処理 クロマ チ ンの 鋳 型 活性 と ヌ クレ アー ゼ 感受

性 が増 大 した. H1ヒ ス トン とH1除 去 クロマ チ

ン とで調 製 した再 構 成 クロマ チ ンの 転 写 活性 及

び ヌ クレア ーゼ 感 受性 は, H1除 去 クロマ チ ンの

そ れ よ り低 か っ た.処 理 した塩 濃度 に関 係 な く

又 クレア ーゼ で消 化 されて で きた ヌ ク レオ ソー

ム ・モ ノマ ーDNAの 大 き さは,ほ ぼ 一 定 で あ

っ た.

謝 辞

本研究 を遂行す るにあた り,多 大な る御協力 をい

ただ きま した教室の方 々に心 か ら感謝申 し上げ ます.

文 献

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非 ヒス トン蛋 白質 お よびH1ヒ ス トン除去 の ク ロマ チ ンの 鋳 型 活性 と

ヌ クレ アー ゼ 消化 性 へ の 影響 727

Effects of stepwise extraction of nonhistone proteins

and H1 histone on template activity of chromatin and

on digestion of chromatin by micrococcal nuclease

Minoru IRISAWA, Shogo IKEDA and Takuzo ODA

Department of Biochemistry, Cancer Institute, Okayama University

Medical School, Okayama 700, Japan

(Director: Prof. T. Oda)

Changes in the structure and function of Ehrlich ascites tumor cell chromatin induced

by extracting with 0.15 to 0.6M NaCl were analyzed. H1 histone was selectively extracted from chromatin by treating with 0.6M NaCl. The higher the salt concentration

that was applied to the chromatin, the larger the amount of proteins that was extracted, and the higher the template activity and micrococcal nuclease sensitivity that were

attained. The chromatin reconstituted from H1 histone and H1-depleted chromatin showed reduced template activity and reduced nuclease sensitivity. The size of nuclease-digested DNA fragments (nucleosome monomer) were identical regardless of the depletion of H1 histone and some non-histone proteins.