efecto de la betahistina sobre la actividad …la betahistina se mantiene igual que en los...

BENEMERITA

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA

TESIS PROFESIONAL

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS

Asesores: Dr. Enrique Soto y MC Rosario Vega. Puebla, Pue. Septiembre del 2000

PRESENTA:

HORTENCIA CHÁVEZ OSEKI

INSTITUTO DE FISIOLOGÍA

EFECTO DE LA BETAHISTINA SOBRE LA ACTIVIDAD ELÉCTRICA DE LAS NEURONAS

AFERENTES DE LOS CANALES SEMICIRCULARES DEL AXOLOTL (Ambystoma

tigrinum).

Efecto de la betahistina en los canales semicirculares

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RESUMEN La betahistina (BH), es un análogo de la histamina, y se ha reportado como agonista débil H1 y H2 y como potente antagonista H3. Se usa en la clínica en desórdenes vestibulares centrales y periféricos, en donde se ha demostrado su eficacia en reducir el vértigo, náuseas y vómito, y como terapia de mantenimiento en el síndrome de Menière. Su mecanismo de acción se ha asociado a la capacidad de la droga para aumentar el flujo sanguíneo central, coclear y vestibular; también se ha sugerido que actúa a nivel del núcleo vestibular. Sin embargo, muchos de los casos de vértigo son de origen periférico, y recientemente se reportó que la betahistina disminuye la frecuencia de descarga de las aferentes vestibulares, pero el mecanismo mediante el cual produce sus efectos en la periferia vestibular se desconoce.

Para estudiar el efecto de la betahistina y tratar de dilucidar su mecanismo de acción periférico, hicimos experimentos con registro extracelular multiunitario en el oído aislado del axolotl (Ambystoma tigrinum). La preparación se estimuló con aceleraciones sinusoidales, a fin de registrar la actividad basal y la respuesta a estímulos mecánicos.

Probamos el efecto de la betahistina en un rango de 10 µM a 10 mM, n=32; sobre la descarga basal y la respuesta a estímulos mecánicos; encontramos que la betahistina disminuye la frecuencia en la descarga basal, con una IC50 de 600 µM y la respuesta a estímulos mecánicos con una IC50 de 10 mM. El efecto inhibitorio de la betahistina es dependiente de la dosis y del tiempo de perfusión.

Existen reportes que indican que la histamina ejerce su efecto a través de los receptores colinérgicos; nosotros encontramos que el bloqueo de los receptores colinérgicos con antagonistas muscarínicos (atropina 10 µM, n=3) y nicotínicos (d-tubocurarina 10 µM, n=3), no modifica el efecto de la betahistina. Sin embargo, encontramos que la betahistina 1 mM (n=5) disminuye el efecto excitatorio del carbacol en un 30 ? 3.4%.

Para determinar si la betahistina produce su efecto a través de la sintetasa del óxido nítrico (NOS) inhibimos a esta enzima con L-NOARG 3 µM (n=5), observamos que el efecto de la betahistina se mantiene igual que en los controles.

Con el fin de determinar si la betahistina actúa a nivel postsináptico, estudiamos su interacción (1 y 10 mM) con agonistas de los aminoácidos excitadores como es el ácido kaínico 1 µM (n=6); la betahistina reduce significativamente el efecto excitador del ácido kaínico en 45.5 ? 9.8% y 67.5 ? 2.5, respectivamente. También probamos al ácido quiscuálico (QA), 1 ?M (n=2); la betahistina 1 mM, redujo el efecto excitatorio del ácido quiscuálico en un 39.7 ? 1.8% con respecto al control, aun cuando la liberación del neurotransmisor se bloqueó usando soluciones con alto magnesio y bajo calcio; en estas condiciones, la perfusión de la betahistina (10 ?M a 10 mM, n=15) disminuye el efecto excitatorio del ácido quiscuálico 1 µM (n=15) de una manera dependiente de la dosis.

Estos resultados indican que la betahistina tiene una acción inhibitoria sobre la frecuencia de descarga de las aferentes vestibulares. Su efecto no parece involucrar la vía de la producción del óxido nítrico, ni modificar la liberación de acetilcolina de las fibras eferentes, pero la betahistina bloquea la respuesta excitadora inducida por el carbacol, lo que sugiere que la betahistina pudiera actuar sobre la célula ciliada en lugares diferentes de los receptores colinérgicos. Nuestros resultados también indican que existen receptores para la betahistina ubicados sobre las neuronas aferentes; parte del efecto de la betahistina pudiera estar dado por la activación de estos receptores que podrían afectar indirectamente a los receptores de los

Hortencia Chávez Oseki

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aminoácidos excitadores, o bien por su acción sobre éstos mismos, ya que la inhibición de la betahistina sobre el efecto excitador del QA es dependiente de la dosis y pareciera ser un antagonismo competitivo sobre la inhibición de la respuesta a estímulos mecánicos producida por la betahistina. INTRODUCCIÓN El aparato vestibular se localiza dentro del oído interno y detecta los movimientos de la cabeza y su posición en el espacio; para realizar esta función cuenta con epitelios sensoriales ubicados estratégicamente, que permiten detectar las aceleraciones angulares y lineales de la cabeza (Wilson y Peterson, 1980). El vestíbulo está formado por un laberinto membranoso que se encuentra alojado en un laberinto óseo que lo delimita en toda su extensión. En el interior del laberinto membranoso se encuentra la endolinfa; ésta es un medio con alta concentración de potasio, semejante a la del líquido intracelular (Figura 1), el espacio entre el laberinto membranoso y el óseo está ocupado por la perilinfa, que corresponde al líquido extracelular.

El oído interno de peces y anfibios

consta exclusivamente del sistema vestibular que incluye a los canales semicirculares, a los órganos otolíticos (sáculo, utrículo y lagena) y a los órganos no otolíticos (papila amphibiorum y papila basilar) (Pretch, 1976).

Canales semicirculares El laberinto membranoso incluye tres canales semicirculares de cada lado: anterior, posterior y horizontal, conocidos también como verticales los dos primeros y el último como lateral; los canales son ortogonales entre sí; esta posición les permite detectar aceleraciones angulares en los tres ejes del espacio. El canal anterior de un lado es paralelo al canal posterior del oído opuesto, y los canales horizontales de ambos lados se encuentran en el mismo plano (Anniko, 1988).

Cada uno de los canales semicircula-

Figura 1. Esquema del neuroepitelio vestibular que muestra la composición de la endo y la perilinfa. El epitelio mantiene el gradiente iónico gracias a las uniones estrechas entre las células que lo forman. La corriente de transducción es acarreada principalmente por iones K+ que producen una corriente entrante y depolarizan la célula.


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res presenta una dilatación llamada ámpula; en el interior de ésta se encuentra un epitelio sensorial formado por células sensoriales mecanorreceptoras (células ciliadas) dispuestas en forma de cresta. En la superficie apical de estas células se localiza, excéntricamente, un solo kinocilio, que es un cilio verdadero formado por microtúbulos en el clásico arreglo de 9+2 (figura 2), así como 50 a 100 estereocilios, que son microvellosidades formadas por actina, que van disminuyendo en tamaño conforme se alejan del kinocilio, formando hileras que se unen entre sí y con el kinocilio a través de las “uniones de punta”, las cuales se localizan en la punta de un estereocilio y en la pared lateral del estereocilio que le sigue en tamaño; estas uniones se asocian a canales iónicos mecanosensibles (Gillespie, 1995).

Los cilios están en contacto con una masa gelatinosa conocida como cúpula, que se extiende a través de la ámpula, ocluyéndola. Los desplazamientos de la endolinfa debidos a las aceleraciones angulares de la cabeza, deforman la cúpula e inclinan los cilios; cuando esta inclinación es en dirección al kinocilio, se produce una despolarización de las células ciliadas; cuando la inclinación de los estereocilios es en sentido contrario al kinocilio, se produce una hiperpolarización (Hudspeth, 1983).

Cada canal semicircular se origina y retorna a un saco común llamado utrículo. Los epitelios sensoriales del utrículo y del sáculo se conocen como máculas; por encima de éstas se encuentra la membrana otolítica que es una masa gelatinosa que contiene numerosos otolitos formados por biominerales en un arreglo complejo de proteínas, carbohidratos y cristales de carbonato de calcio (Anniko, 1988; Guevara, 1995). El utrículo está conectado al sáculo y ambos se conocen como órganos otolíticos. La ubicación de las máculas utricular y sacular, permite detectar cambios en las aceleraciones lineales y en la posición del cuerpo con respecto a la gravedad.

Filogenéticamente la aparición de los canales semicirculares y de los órganos otolíticos, ocurre en los vertebrados; los primeros son el Ostracodermo kieraspis y los ciclostomos. Los análogos de los órganos otolíticos en los invertebrados son los estatocistos. Los canales semicirculares no tienen equivalente en los invertebrados; sin embargo, el principio de células ciliadas-cúpula, que sensa el desplazamiento de fluido, sí existe en la línea lateral de los animales inferiores (Gacek, 1974). Nervio vestibular En los anfibios, el nervio vestibular penetra

Figura 2. Microscopia electrónica de transmisión tomada de una célula ciliada de una anguila Moray eel, que muestra un corte a nivel del kinocilio. Puede apreciarse que éste tiene la estructura típica de 9+2 microtúbulos que se encuentra en todos los cilios móviles. Tomado de Popper A. N. Web Pagehttp://www.life.umd.edu/biology/popperlab/ TEM-HC.html.


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en el vestíbulo óseo y se bifurca en una rama anterior gruesa, y una rama posterior más delgada; la rama anterior corre rostrolateralmente y se ramifica para inervar varias áreas receptoras; la primera y más grande ramificación se dirige hacia la mácula del sáculo; posteriormente, esta rama anterior se continúa rostrolateralmente a lo largo de la superficie ventral del utrículo, donde se fusiona con la pared del laberinto membranoso posteriormente se ramifica para inervar a las crestas de los canales semicirculares anterior y lateral (Honrubia y cols., 1989; Guevara, 1995).

La rama posterior es más corta y se ramifica rápidamente proyectándose ventralmente a la lagena, dorsalmente a la papila amphibiorum, y se continúa lateralmente inervando a la papila basilar; termina en el canal posterior, donde forma una Y que penetra en el ámpula para inervar a la cresta (Pretch, 1976).

La inervación está dada por axones de neuronas sensitivas y axones eferentes que inervan a la célula ciliada. Con base en esta inervación, las células ciliadas que forman los epitelios sensoriales se clasifican en dos tipos: las células ciliadas tipo I, con forma de ánfora, en las cuales la fibra aferente primaria forma un cáliz que rodea la superficie basolateral de la célula ciliada y la fibra eferente establece contacto sináptico en forma de botón con la fibra aferente; y las células ciliadas tipo II, filogenéticamente más antiguas, que tienen formas diversas: cilíndricas, ánfora, coma, y redondas, en las que la inervación aferente y eferente se establecen sobre la superficie basolateral de la célula ciliada en forma de botón. El epitelio sensorial de los anfibios tiene exclusivamente células ciliadas de tipo II (Wersäll, 1956; Engström y Engström, 1981). Inervación aferente Los cuerpos de las neuronas aferentes primarias en los anfibios no están

empaquetados formando un ganglio, como en el caso de los mamíferos; sus somas se localizan en la bifurcación del nervio vestibular en las ramas anterior y posterior; las neuronas aferentes son predominantemente bipolares (Pretch, 1976). Los diámetros somáticos de las neuronas aferentes en el axolotl muestran una distribución que no es normal, agrupándose en tres clases principales: pequeñas, con diámetros que van de 8 a 15 µm (el 37%), medianas de 16 a 25 µm (el 49%), y grandes de 26 a 35 µm (el 14%) (Limón, 1998; Limón, 2000).

En el axolotl estas fibras aferentes hacen contacto con células ciliadas de tipo II, formando sinapsis químicas típicas con un espacio sináptico de alrededor de 20 a 30 nm y engrosamiento postsináptico. En la célula ciliada el sitio de liberación del neutrotransmisor (zona activa), se caracteriza por un engrosamiento de la membrana plasmática y por la presencia de cuerpos sinápticos de 0.20 a 0.30 µm rodeados por vesículas sinápticas redondeadas en la proximidad que afronta a la neurona aferente (Guevara, 1992).

Transmisión sináptica Existen evidencias que indican claramente que la liberación del neurotransmisor aferente en las células ciliadas es dependiente de calcio extracelular (Pérez y cols., 1991; Perin y cols., 2000). En las células ciliadas saculares de la rana, se ha reportado que los canales dependientes de voltaje para calcio (VGCCs) se encuentran agrupados específicamente en las zonas activas, y también se ha encontrado la presencia de canales de potasio activados por calcio (BK) (Roberts y cols., 1990; Issa y Hudspeth, 1994). Además, se encontró que el influjo de calcio a través de los VGCCs ocurre en “puntos calientes” que pueden corresponder a un ensamblaje de los sitios de liberación sinápticos (Tucker y Fettiplace,


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1995). Se considera también que la expresión e inserción de los canales dependientes de voltaje para calcio están determinadas por el tamaño y número de zonas activas en cada célula ciliada. En el pollo, la magnitud de la corriente de la célula completa a través de los canales dependientes de voltaje para calcio se correlaciona con el área total de la zona activa de las células ciliadas, las cuales tienen grados variables de inervación aferente (Martínez-Dunst, y cols., 1997).

La sinapsis aferente del sistema vestibular de diferentes especies, tiene propiedades peculiares, ya que la liberación del neurotransmisor se produce de forma continua, y la estimulación de la célula ciliada aumenta o disminuye la cantidad del neurotransmisor liberado por lo que las neuronas aferentes presentan entonces una descarga basal. La capacidad de las células ciliadas para liberar continuamente el neurotransmisor es una función en la que participan el cuerpo sináptico y la ausencia de la proteína de anclaje sinapsina; se ha propuesto que las vesículas sinápticas “maduran” en interacción con el cuerpo sináptico y, a diferencia de otras sinapsis, son liberadas sin pasar por un proceso de anclaje al citoesqueleto -dependiente de sinapsina- (Fuchs, 1996).

La liberación del neurotransmisor en las aferentes vestibulares es un proceso dependiente de calcio extracelular. Tanto la actividad basal como la respuesta a estímulos mecánicos desaparece cuando el calcio extracelular se sustituye por magnesio (Pérez y cols., 1991).

La entrada de calcio a la célula ciliada se da a través de tres vías: 1) canales mecanotransductores, 2) receptores colinérgicos, y 3) canales dependientes de voltaje para el calcio.

Debido a la baja concentración de calcio en la endolinfa, es muy poco probable que por los canales mecanotransductores

ingrese una cantidad significativa de calcio a la célula y que, además, alcance la región sináptica (Tucker y Fettiplace, 1995). Existe evidencia de la presencia de un receptor colinérgico, el cual es un canal catiónico dependiente de ligando por el que entra calcio, éste activa canales de potasio cercanos, pero no logra modificar significativamente la concentración de calcio en la región sináptica (Fuchs y Murrow, 1992). . El estímulo mecánico que flexiona el haz de cilios de la célula ciliada en dirección del kinocilio, produce la apertura de canales catiónicos no selectivos ubicados en las uniones de punta de los estereocilios; la despolarización resultante aumenta la probabilidad de apertura de los canales de calcio dependientes de voltaje localizados en la membrana basolateral de la célula ciliada; éste aumento en la entrada de calcio favorece la fusión de las vesículas sinápticas y la liberación del neurotransmisor aferente, considerándose ésta como una entrada significativa de calcio.

Típicamente, las corrientes de calcio de las células ciliadas se activan rápidamente (con constantes de tiempo de menos de 1 ms) y no se inactivan; estos canales de calcio dependientes de voltaje son sensibles a las dihidropiridinas (DHP); esta sensibilidad y sus características cinéticas, sugieren que se trata de canales de calcio sensibles a DHP o de tipo L (Perin y cols., 2000).

En relación con las características del neurotransmisor aferente, existen evidencias de que es una aminoácido excitador (AAE), probablemente glutamato, aunque pudieran liberarse otros aminoácidos como homocisteato o acetil-aspartil-glutamato (Eybalin, 1993; Guth, 1998a). En los sistemas de células ciliadas que incluyen a la cóclea, el sistema vestibular y la línea lateral, los antagonistas de los receptores a AAE bloquean la transmisión sináptica entre las células ciliadas y las neuronas aferentes (Annoni y cols., 1984; Soto y Vega 1988;


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Prigioni y cols., 1990; Eybalin, 1993; Soto y cols., 1994a; Guth y cols., 1998a). Diversos trabajos han

demostrado que en la sinapsis aferente participan diferentes subtipos de receptores a los AAE. Las aferentes vestibulares responden a los agonistas de los receptores a los AAE de los subtipos NMDA, activados por N-metil-D-aspártico (NMDA), no NMDA, activados por ? -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxasolpropiónico (AMPA) y ácido kaínico (KA), así como receptores de tipo metabotrópico (Eybalin, 1993; Puel, 1994; Kataoka y Ohmori, 1996; Guth y cols., 1998b). Sin embargo, hasta el día de hoy, no se ha definido el papel exacto que tienen los diferentes tipos de receptores a los AAE en la transmisión aferente en el sistema vestibular.

En las neuronas aferentes vestibulares del axolotl coexisten tanto receptores tipo NMDA como no NMDA (KA, y AMPA); estos últimos parecen mediar la descarga basal y principalmente, la respuesta a la estimulación mecánica; es decir, participan en respuestas rápidas y de corta duración, mientras que los receptores NMDA estarían participando en la descarga

basal y en la respuesta tónica y sostenida que se presenta ante la aplicación de glicina (Flores, 1993).

Actividad eléctrica basal y provocada por estímulos mecánicos de las aferentes vestibulares Los potenciales de acción se generan en las neuronas aferentes por medio de la sumación postsináptica espacial y temporal de EPSPs (Rossi y cols., 1977), se originan en el primer nodo de Ranvier en la región donde las dendritas de las neuronas aferentes dejan la membrana basal (Flock y cols., 1973).

La respuesta de las aferentes primarias de los canales semicirculares a la estimulación natural se ha estudiado a través de registros extracelulares multiunitarios desde Ledoux en 1949, citado en Pretch, 1976. Una característica de estas aferentes es su descarga basal o espontánea; ésta se incrementa ante aceleraciones angulares en una dirección, y disminuye al estimularse en sentido opuesto (Pretch, 1976).

Con base en su respuesta a vibraciones sinusoidales, Budelli y Macadar

Figura 3. En A: reconstrucción de terminaciones aferentes del canal semicircular horizontal de un mono ardilla, así como su localización dentro de la cresta; a) una terminación en forma de cáliz simple; b) terminación compleja en forma de cáliz; c) terminación dimórfica y d) terminación en forma de botón. En el inserto la localización de las terminales aferentes sobre un mapa estándar de la cresta. En B: localización de las fibras en las crestas con tterminación en forma de cáliz (arriba), dimórficas (centro), botón (abajo) (modificado de Fernández y cols., 1988).

A B

a d b

c

a b

c d


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en 1979 clasificaron a las aferentes del utrículo de los elasmobranquios en tres tipos: aferentes tipo I, que descargan espontánea-mente, responden a inclinaciones de una manera fásico-tónica y siguen la frecuencia de estimulación aumentando o disminuyendo su frecuencia de descarga cuando se estimulan sinusoidalmente; aferentes tipo II que siempre incrementan su descarga cuando se estimulan con vibraciones, independientemente de la frecuencia de estimulación, y aferentes tipo III, que no presentan descarga espontánea ni ante la estimulación.

Se han identificado tres tipos de terminaciones aferentes sobre las células ciliadas de las crestas de los canales semicirculares de los mamíferos (Figura 3A): las unidades tipo cáliz que inervan a las células ciliadas tipo I; las terminaciones en forma de botón que conectan varias células ciliadas tipo II, y las dimórficas que inervan ambos tipos de células ciliadas (Fernández y cols., 1988).

Las fibras aferentes del vestíbulo se han clasificado por la regularidad de su descarga, tomando en cuenta el coeficiente de variación (CV) de los intervalos entre espigas. El CV varía con el intervalo promedio, por lo tanto, Goldberg y colaboradores (1984) propusieron usar el coeficiente de variación normalizado (CV*) como una forma de clasificar la frecuencia de descarga de las aferentes vestibulares. Basándose en su CV* las neuronas aferentes del vestíbulo fueron clasificadas en: regulares (CV*<0.10), intermedias (0.10<CV*<0.20) e irregulares (CV*>0.20).

Las neuronas aferentes que inervan a los canales semicirculares y a los órganos otolíticos presentan una frecuencia de descarga espontánea que se relaciona con la zona del neuroepitelio a la que inervan, el diámetro axonal (Baird y cols., 1988), y la zona de inicio del potencial de acción (Saidel,

1988), más que con el tipo de célula ciliada con la que establecen sinapsis. Originalmente se pensó que, en los mamíferos, las fibras gruesas con terminación tipo cáliz que inervan la zona central de las crestas y a la estriola en las máculas, podían responder irregularmente debido a la sinapsis con la célula ciliada tipo I, y que las fibras delgadas que inervan a la periferia podían responder regularmente por la sinapsis tipo botón con la célula ciliada tipo II (Figura 3B); sin embargo, Honrubia y cols. (1989), en sus estudios anatómicos y fisiológicos de la rana toro, que solo tiene células ciliadas tipo II, encontraron las mismas relaciones que en los mamíferos: los axones gruesos que inervan a la zona central de la cresta de los canales descargan irregularmente, los axones delgados que proyectan hacia la periferia descargan de forma regular, y los axones de tamaño intermedio pueden descargar regular o irregularmente.

En el canal horizontal se produce un incremento en la frecuencia de descarga basal con la desviación de la cúpula en sentido utriculopetal, y disminución de esta frecuencia cuando la cúpula se desvía en sentido utriculofugal (Blanks y Pretch, 1976). Las respuestas se invierten para los canales anterior y posterior. Esta diferencia en la direccionalidad de las respuestas entre los canales verticales y horizontal, está dada por la diferencia en la polarizacion morfológica de las células ciliadas de estos canales; en el caso del canal horizontal, los cilios se orientan hacia el utrículo, y en los canales verticales, en dirección opuesta. La máxima respuesta se observa cuando el plano de rotación coincide con el plano del canal.

En registros intracelulares, las aferentes del canal semicircular horizontal del pez sapo Opsanus tau se han clasificado en tres grupos de acuerdo con su respuesta ante la estimulación sinusoidal: i) aferentes de baja ganancia que mantienen una


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respuesta relativamente lineal, ii) aferentes de alta ganancia que son sensibles a los cambios de velocidad y iii) aferentes sensibles a los cambios de aceleración. Las aferentes de baja ganancia descargan de manera regular de acuerdo al análisis de intervalos entre espigas, mientras que las de alta ganancia y las sensibles a los cambios de aceleración son irregulares (Boyle y Highstein, 1990). Inervación eferente Las neuronas eferentes periféricas que inervan la porción vestibular del laberinto, fueron inicialmente descritas por Gacek en 1960. Sin embargo, los estudios iniciales sobre las fibras eferentes en el oído de los vertebrados han sido controvertidos, ya que en la identificación ultraestructural de las fibras eferentes se han confundido a las eferentes con sinapsis recíprocas, que existen en muchos vertebrados, principalmente durante el desarrollo (Fritzsch y cols.,1990; Fritzsch, 1996); con las técnicas de degeneración se han identificado falsamente a células de Purkinje cerebelares como eferentes en el oído de la rana (Precht, 1976); y en el caso de algunos estudios histoquímicos se han hecho falsas suposiciones de la uniformidad histoquímica de las neuronas eferentes (Fritzsch, 1996). Con técnicas de peroxidasa de rábano, inmunohistoquímica y análisis ultraestructurales se han identificado las fibras eferentes de los órganos sensoriales vestibulares y receptores auditivos de muchos vertebrados (Dechesne y cols., 1984; Tanaka y cols., 1988; Sans y Highstein 1984). Los datos obtenidos muestran que las neuronas eferentes están localizadas en núcleos únicos que se asocian con motoneuronas faciales en el tallo cerebral de los vertebrados (Pellegrini y cols., 1985).

En los mamíferos, la inervación eferente que llega a la cóclea tiene su origen primordialmente en la oliva superior

(Rasmussen, 1953; Schukneht y cols., 1959). En los anfibios, en cambio, las neuronas eferentes se originan a nivel de los núcleos de la formación reticular del bulbo raquídeo (Strutz, y cols., 1980; Fritzsch, 1981; Prigioni y cols., 1983).

Los nervios eferentes destinados al laberinto, se localizan al mismo nivel del núcleo vestibular en todos los vertebrados estudiados (Goldberg y Fernández, 1980; Schwartz y cols., 1981). En la rana, las neuronas eferentes se originan de la parte rostrolateral del núcleo vestibular (Strutz y cols., 1980). Después de abandonar el SNC, las fibras eferentes forman un pequeño haz localizado en la parte ventrocaudal del nervio vestibular en donde se ramifican para inervar a los órganos terminales vestibulares. Los diámetros de las fibras varían entre 2 y 3 ?m. (Pretch, 1976).

Ahora bien, Precht y colaboradores, en 1976, y Strutz y colaboradores, en 1980, reportaron que la ubicación de las neuronas eferentes en los anfibios es en la formación reticular. En el cobayo y el conejo, Rossi y Cortesina, (1965), usando histoquímica contra la AchE, identificaron 3 haces eferentes vestibulares ipsilaterales: el primero originado de la sustancia reticular cercana al rafé medio, el segundo se origina en el núcleo vestibular lateral y el tercero en el núcleo vestibular interpuesto localizado dorsomedial al núcleo vestibular lateral (la desventaja es que la localización histoquímica de la actividad AchE no distingue entre las neuronas colinérgicas y las colinoceptivas). Avrim y Correia, en 1982, inyectando HRP dentro del espacio endolinfático del laberinto en palomas, encontraron neuronas marcadas con HRP ubicadas en 5 grupos: tres se localizaron en el complejo nuclear vestibular ipsilateral (lateral, tangencial y descendente), y dos grupos bilaterales localizados en la formación reticular. En 1987, Carpenter y colaboradores, trabajando en monos,


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colocaron gelfoam con 50% de HRP en el ámpula del canal semicircular horizontal a través de pequeños orificios que posteriormente se sellaron con cera para hueso; en todos los casos se marcaron neuronas eferentes vestibulares bilateralmente; posteriormente, con métodos de inmunocitoquímica, identificaron que las neuronas eferentes vestibulares se localizan en la parte rostral del núcleo abducens, formando una región compacta de células inmunorreactivas al antisuero contra ChAT (enzima de síntesis de la acetilcolina), mientras que las neuronas eferentes cocleares se localizaron en la oliva superior lateral. Podemos concluir que, con respecto a los mamíferos, el origen de las neuronas eferentes cocleares es la oliva superior, pero el de las eferentes vestibulares es el núcleo vestibular lateral y medial ipsi y contralateral, además de la formación reticular (Rossi y Cortisina, 1965; Pretch y cols., 1976; Strutz y cols., 1980; Avrim y Correia, 1982; Carpenter y cols., 1987).

Las neuronas eferentes vestibulares en el axolotl hacen contacto directamente con las células ciliadas de tipo II (Guevara, 1992), como ocurre en todos los anfibios; en los mamíferos que además tienen células ciliadas de tipo I, las sinapsis eferentes se establecen sobre el cáliz de la aferente a través de una sinapsis axo-dendrítica, y sobre las células ciliadas de tipo II en forma de botón; no obstante, en un estudio contradictorio de Ohno y colaboradores en 1993, se reporta que, en la rata, las terminales eferentes inervan exclusivamente los cálices que rodean a las células ciliadas vestibulares de tipo I, y no inervan a las células ciliadas de tipo II. Sin embargo, por la presencia de receptores colinérgicos sobre la célula ciliada, tendría más sentido la inervación eferente sobre la célula ciliada tipo II; además, aunque se ha demostrado que se expresa el ARNm para el receptor nicotínico ? 9 en los dos tipos de células ciliadas, éste

no se traduce como una proteína funcional en las células ciliadas de tipo I, probablemente a través de un control postranscripcional (Lustig y cols., 1999). Evidencia de este control postranscripcional la presentan Maroni y Lisakowsky en 1998, usando un anticuerpo de cobayo dirigido contra el receptor nicotínico ? 9, encuentran inmunorreactividad ? 9 en el polo sináptico de las células ciliadas de tipo II, pero no en las células ciliadas de tipo I, tanto en ratón como en chinchilla.

Existe controversia acerca del tipo de influencia que ejerce la activación eferente sobre la descarga aferente. Desde 1965, Sala reportó que, en el gato, la estimulación del sistema vestibular eferente produce tanto disminución como incremento en la frecuencia de la descarga de las fibras aferentes.

Goldberg y Fernández, en 1980, encontraron que la activación eferente produce facilitación aferente; lo mismo reportaron Highstein y Baker en 1985. Otros autores han encontrado que la respuesta de las aferentes vestibulares ante la estimulación de la vía eferente es inhibición (Valli y cols., 1984), o respuestas mixtas (Bernard y cols., 1985).

Se ha demostrado que el principal neurotransmisor eferente es la acetilcolina (Bobbin y Konishi, 1974; Housley y cols., 1990; Sugai y cols., 1992); ésta actúa sobre dos tipos de receptores: nicotínicos y muscarínicos. El efecto mixto reportado en el sistema vestibular sugiere que ambos tipos de receptores contribuyen a la señalización eferente. En el sistema eferente vestibular, además de la acetilcolina, se coliberan otros neurotransmisores y neuromoduladores entre los que destacan el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), ATP, sustancia P, encefalinas, y neuroquinina A. (Vega y cols., 1991; Aubert y cols., 1995; Scarfone y cols., 1996; Andrianov y Ryzhova, 1999; Vega, 2000).


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La aplicación de acetilcolina en el laberinto aislado de la rana produce cambios facilitatorios e inhibitorios en la descarga de las aferentes vestibulares, con un predominante efecto facilitatorio aparentemente mediado por receptores muscarínicos, ya que el efecto se bloquea con atropina y es remedado por muscarina (Guth y cols., 1986). La estimulación eléctrica del sistema eferente induce grandes hiperpolarizaciones en las células ciliadas saculares de la rana; similares hiper-polarizaciones se producen por acetilcolina exógena, y se bloquean por concentraciones micromolares de d-tubocurarina y concentra-ciones milimolares de atropina (Sugai y cols., 1992). La aplicación directa de acetilcolina produce pequeños incrementos o decrementos en la corriente saliente de potasio en las células ciliadas aisladas de las crestas de los canales semicirculares de la rana; algunos de estos efectos son bloquea-dos con atropina (Housley y cols., 1990).

Existe evidencia de que el receptor de acetilcolina de la célula ciliada es un canal catiónico a través del cual puede entrar calcio, activando a canales de potasio cercanos, lo que explicaría el efecto inhibitorio de la acetilcolina sobre las aferentes vestibulares (Sugai y cols., 1994; Guth y cols., 1990; Guth y cols., 1998b). Sin embargo, también se sabe que la acetilcolina induce respuestas facilitadoras sobre la descarga aferente que estarían mediadas por receptores muscarínicos ubicados sobre la célula ciliada. Hay evidencia que en los epitelios coclear y vestibular existe un sistema de segundos mensajeros IP3 asociados a receptores muscarínicos, probablemente del tipo M1, ya que la aplicación de carbacol induce la liberación de IP3 que es antagonizada por la aplicación de atropina (Ogawa y Schacht, 1993); estos autores discuten que dicha vía de segundos mensajeros se da por la activación de receptores muscarínicos y purinérgicos.

Aubert y colaboradores, en 1995, demostraron la existencia de receptores purinérgicos P2y en los canales semicirculares de la rana, y muestran que el efecto facilitador del carbacol no es afectado por antagonistas P2y (metabotrópico); sin embargo, la enzima nucleótido pirofosfatasa (que usa ATP y NAD como sustrato para formar AMP), sí disminuye el efecto facilitador del carbacol, lo que indicaría que el carbacol y el ATP no funcionan sobre el mismo receptor.

Histamina Barger y Dale, en 1910, fueron los primeros en identificar a la histamina ?2-(4-imidazolil) etilamina? en los extractos del cornezuelo (parásito) de las espigas de centeno, de las cuales se aisló y resultó ser contaminación del cornezuelo por acción bacteriana. Posteriormente, Dale y Laidlaw, en el mismo año, la sometieron a un estudio farmacológico intensivo y descubrieron sus efectos contráctiles potentes sobre los músculos lisos y la acción vasodepresora intensa; reportaron también que los signos inmediatos observados en un animal sensibilizado, cuando se le inyectaba una proteína normalmente inerte, se parecían mucho a los de la intoxicación por histamina.

En 1927, Best y colaboradores, aislaron a la histamina a partir de muestras frescas de hígado y pulmón, estableciendo que ésta es un constituyente natural del organismo; de hecho, el nombre de la histamina deriva del griego histos, que significa tejido. Sin embargo, Dale fue renuente en aceptar que la histamina endógena pudiera funcionar como molécula mensajera, liberarse por los tejidos y afectar la actividad de células blanco, y fue Felderberg quien claramente demostró que la histamina se libera de los pulmones durante la respuesta anafiláctica, y que induce una marcada broncoconstricción (Felderberg, 1927).


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La síntesis de los primeros antagonistas para la histamina, las difenhidraminas, como la mepiramina (pirilamina), conocidos como antihistamínicos clásicos, se realizó por Bovet y Staub, en 1936. Estos autores demostraron la efectividad de tales antagonistas como protectores en casos de broncoespasmos provocados por anafilaxia, o al administrar histamina en cobayos (Hill y cols. 1997). Pero estos antagonistas no bloquearon uniformemente todas las acciones de la histamina, ya que la secreción de ácido gástrico inducida por la histamina no se afectó (Ashford y cols., 1949). También se demostró que el efecto vasodilatodor producido por la histamina, fue reducido parcialmente, sugiriéndose que la vaso-dilatación se produce por combinación de la histamina con más de un receptor (Folkow y cols., 1948). Los efectos mediados por la histamina y que son bloqueados por los antihistamínicos clásicos, se consideraron producidos por la activación del receptor H1 (Ash y Schild, 1966).

Posteriormente, Black y colabora-dores, en 1972, desarrollaron un antagonista específico para el receptor H2 (burimamida) que reduce la secreción de ácido gástrico, así como la vasodilatación, acciones ambas que no son bloqueadas por los antagonistas H1 (Tabla 1).

Posteriormente se estableció que se puede inhibir la síntesis y liberación de la histamina en cortes de corteza cerebral, y los

efectos de agonistas y antagonistas H1 y H2

indicaron la existencia de un receptor diferente. El agonista altamente selectivo R-alfa metilhistamina y el antagonista tioperamida definieron claramente al receptor H3 (Arrang y cols., 1983, 1987a).

Biosíntesis de la histamina La histamina penetra pobremente la barrera hematoencefálica, pero puede formarse localmente en el cerebro, ya que se detectó la formación en vivo de histamina después de la administración de su precursor radioactivo L- histidina (Schwartz y cols., 1991). La biosíntesis de histamina requiere el transporte de la L-histidina al interior de la célula y su descarboxilación por la L-histidina descarboxilasa, con una constante de Michaelis (Km) y una velocidad máxima (Vmax) que cambian con el pH y con la fuerza iónica del medio; a pH 7.0, en buffer estándar, la Km

de la L-histidina es de 0.1 mM, valor cercano a la concentración plasmática. Esta enzima es bloqueada irreversiblemente por el inhibidor ? -fluorometilhistidina (Garbag y cols., 1980). El transporte de la L-histidina es saturable y dependiente de energía. El sistema de transporte en cortes cerebrales y en sinaptosomas es parcialmente independiente de Na+ y K+, y los análisis cinéticos revelan la presencia de componentes de alta y baja afinidad. No hay evidencia de la presencia de un sistema de transporte de L-histidina en las neuronas histaminérgicas (Hegstrand y Simon, 1985).

La L-histidina descarboxilasa se ha purificado a partir de varios tejidos periféricos con gran actividad catalítica, y se ha reportado que, para su activación, se requiere del fosfato de piridoxal como cofactor. La L-histidina descarboxilasa cerebral es similar a la de otros tejidos, pero la administración del cofactor en extractos cerebrales no produce una mayor actividad catalítica de la enzima (Schwartz y cols.,1991).

Molécula de histamina y sus derivados.


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Funciones de la histamina endógena La histamina desempeña actividades fisiológicas importantes; es uno de los mediadores almacenados en las células cebadas o mastocitos; su liberación como consecuencia de la interacción del antígeno con los anticuerpos IgE en la superficie de dicha célula interviene en las respuestas de hipersensibilidad inmediata y en las alergias; tiene acción en el músculo liso de bronquios y de vasos sanguíneos; interviene, además, en la regulación de la secreción de ácido gástrico, y se ha identificado también como neurotransmisor en el sistema nervioso central, en donde se han descrito los tres tipos de receptores para histamina (Babe y Serafin, 1996).

Receptor para histamina H1 El mecanismo primario por medio del cual los receptores H1 producen la respuesta funcional en las células, es la activación de la vía de la fosfolipasa C, a través de una proteína G que se relaciona probablemente con la familia Gq/11, aumentando la acumulación de inositol trifosfato y la movilización de calcio en muchos tejidos y tipos celulares (Hill, 1990; Leurs y cols., 1995b).

La histamina, a través de los receptores H1, puede estimular la actividad de la sintetasa de óxido nítrico a través de una vía dependiente de Ca2+/calmodulina y de la posterior activación de la guanilato ciclasa soluble, en estudios bioquímicos en células endoteliales cultivadas (Schmidt y

Tabla 1. Receptores a la histamina

Receptor

Mecanismo de Transducción

Proteína G

Asociada

Agonistas

Antagonistas

Histamina H1

+ fosfolipasa C (Gq/11)

Histamina (1) 2-[3-(trifluorometil)fenilhistamina] (*) 2 tiazolyletilamina (2) 2 piridiletilamina 2 metilhistiamina Betahistina

Mepiramina (*) Clorferinamina Triprolidina Temelastina Difenihidramina Tripelenamina Prometazina

Histamina H2

+ Adenilato ciclasa (Gs)

Histamina (1) Amthamina (*) Dimaprit Impromidina (2) Arpromidina (2) Betahistina

Cimetidina(*) Ranitidina Tiotidina Zolantidina Famotidina

Histamina H3

- Fosfolipasa C? - Adenilato

ciclasa?

(Go) (Gi)

Histamina (1) R-(? )-metilhistamina Imetit (*) Immepip N? -metilhistamina (1)

Tioperamida (*) Clobenpropit Iodofenpropit Iodoproxifan Betahistina

1 No selectivo (*)>potencia agonista (*) Kb baja 2 antagonista H3

Los agonistas y antagonistas para los tres tipos de receptores aparecen en el orden de mayor potencia. Modificado de Hills, y Cols., 1997.


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cols., 1990) y en una preparación de pulmón aislado de cobayo (Leurs y cols., 1991a),

La estimulación del receptor H1 en las células vasculares produce aumento de la permeabilidad vascular - como resultado de la contracción de las células endoteliales-, síntesis de prostaciclinas, síntesis del factor inhibidor de plaquetas, liberación del factor von Willebrand y liberación de óxido nítrico. En la médula adrenal produce liberación de catecolaminas, y en las células cromafines induce la liberación de leu-encefalina y metencefalina (Hill y cols., 1997).

Hill y colaboradores desarrollaron la ?3H? mepiramina para el receptor H1, la cual se ha usado exitosamente para detectar a los receptores H1 en una gran variedad de tejidos, entre los que se cuentan al cerebro de mamíferos, músculo liso de vías respiratorias, tracto gastrointestinal, sistema genitourinario y al sistema cardiovascular; sin embargo, la ?3H? mepiramina también se une a sitios secundarios no H1 en músculo liso de intestino (Hill y Young, 1980), o células He-La (Arias-Montaño y Young, 1993); la quinina se ha usado para inhibir la unión no específica en hígado de rata (Liu y cols., 1992); sin embargo, no todos los sitios de unión secundarios se pueden inhibir por quinina (Dickenson y Hill, 1994).

El papel fisiológico de los receptores H1 en el sistema nervioso central no está completamente clarificado. La primera generación de antagonistas H1

(antihistamínicos clásicos) estimula y deprime al sistema nervioso central. A veces con dosis terapéuticas se produce estimulación en pacientes, que refieren inquietud y dificultad para conciliar el sueño, pero el embotamiento del estado de alerta, tiempos más lentos de reacción y somnolencia son las manifestaciones más comunes (Babe y Serafin,1996). Estos antihistamínicos clásicos cruzan rápidamente la barrera hematoecefálica (Schwartzy cols., 1981; Leurs y cols., 1995b); mientras que los

antagonistas H1 de la segunda generación (no sedantes), no atraviezan en grado apreciable la barrera hematoencéfalica y en la falta de sedación difieren notablemente de los antihistamínicos clásicos, lo que podría tener gran beneficio clínico (Sorkin y Heel, 1985).

Receptor para histamina H2 El receptor para la histamina H2 se acopla a la adenilato ciclasa a través de la familia de proteínas Gs y estimula la acumulación de cAMP en varios tejidos, incluido el cerebro (Hill, 1990; Leurs y cols., 1995b).

La activación de los receptores H2, a diferencia de la de los receptores H1, inhibe la liberación del ácido araquidónico (Hill y cols., 1997).

Las funciones centrales de los receptores H2 no han sido bien caracterizadas; sin embargo, se han identificado funciones antinociceptivas y en la secreción de prolactina (Hill y cols., 1997).

Estos receptores tienen un potente efecto sobre la secreción de ácido gástrico (Black y Shankley 1985), y la inhibición de una variedad de funciones dentro del sistema inmune (Hill 1990). Sobre los basófilos y las células cebadas, regulan negativamente la liberación de histamina. En los linfocitos, la activación de los receptores H2 inhibe la síntesis de anticuerpos, la proliferación de las células T, la citolisis mediada por células y la producción de citoquinas (Melmon y cols., 1974; Melmon y Khan 1987). En el SNC, la activación de los receptores de histamina H2 disminuye la corriente de potasio dependiente de calcio en las neuronas piramidales del hipocampo (Hass y Konnerth 1983). Receptores para histamina H3 El receptor H3 fue descrito inicialmente como autorreceptor que regula la síntesis y liberación de histamina en la corteza


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cerebral, cuerpo estriado e hipocampo de rata (Arrang y cols., 1983, 1987a, 1988a).

Diferencias en la distribución de los sitios de unión de los receptores H3, y en los niveles de histidina descarboxilasa sugieren que los receptores H3 no están confinados a las neuronas que contienen histamina dentro del SNC (Arrang y cols., 1987a). Se ha confirmado que los receptores H3 participan también en la regulación de la liberación de serotonina (Schlicker y cols., 1988), acetilcolina (Clappham y Kilpatrick, 1992) y dopamina (Schlicker y cols., 1993) en el cerebro de mamíferos.

El mecanismo propuesto para los receptores H3 es que la histamina, al unirse a este receptor, activa a una proteína G llamada Gi que inhibe a la adenilato ciclasa, impidiendo la formación de AMP cíclico (Hill y cols., 1997).

Histamina en el sistema nervioso central Los estudios de lesión realizados por Garbarg, en 1974, demostraron por primera vez la existencia de neuronas histaminérgicas en el cerebro de mamífero; ésto se confirmó con estudios de inmunohistoquímica al detectar la enzima de síntesis, su origen y proyecciones, y se ha establecido que puede ser liberada por despolarización y que su liberación es dependiente de calcio; la recaptura es rápida y puede modificarse instantáneamente (Psychoyos, 1978). Se detectó también la formación in vivo de histamina después de administrar su precursor radioactivo L-histidina (White, 1960).

Los cuerpos celulares de las neuronas histaminérgicas están concentrados en un área muy pequeña del cerebro: el núcleo tuberomamilar del hipotálamo posterior (Figura 4). Se ha encontrado que los

Figura 4. Vías histaminérgicas ascendentes y descendentes que parten del núcleo tubero mamilar del hipotálamo posterior. AH, área hipotalámica anterior; Cer, cerebelo; CG, sustancia gris central; CX, corteza cerebral; DR, núcleo dorsal del rafé; f, fornix; Hip, hipocampo; LS, septum lateral; MD, tálamo mediodorsal; OB, bulbo olfatorio; Sol, núcleo del tracto solitario; VDB, núcleo de la banda diagonal; VMH, núcleo hipotalámico ventromedial. Tomado de Schwartz, 1997.


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receptores tipo H1 se localizan principalmente en las células piramidales del hipocampo y en las células de Purkinje del cerebelo (Schwartz, 1997). El bloqueo de estos receptores se produce durante la terapia con algunos antihistamínicos, antipsicóticos y antidepresivos, y da cuenta de parte de las propiedades sedantes de estas drogas. En el cerebro, los receptores tipo H2 se expresan de forma abundante en el caudado putamen y en la corteza cerebral; en menor concentración se presentan también en las células piramidales del hipocampo y en las células granulares del cerebelo (Traiffort y cols., 1992a). La activación de los receptores H2 despolariza a las neuronas piramidales del hipocampo, vía inhibición de la corriente de K+ dependiente de Ca2+ (Hass y Konnerth, 1983). Los receptores H3 son los menos estudiados; se propone que en el SNC actúan fundamentalmente como autorreceptores a nivel presináptico donde, amén de inhibir la liberación de histamina, pueden también influir la liberación de otros neurotransmisores como acetilcolina (Clappham y Kilpatrick 1992), serotonina (Schlicker y cols., 1988), y dopamina (Schlicker y cols., 1993). A nivel periférico pueden modificar la liberación de neuropéptidos de las fibras amielínicas de tipo C (Schwartz, 1997).

Histamina en el sistema vestibular La histamina y otras sustancias que contienen imidazol, como la L-histidina, la carnosina y la hormona liberadora de tirotropina, aumentan la frecuencia de descarga de las aferentes de los canales semicirculares de la rana; la histamina ejerce este efecto excitador sobre las aferentes vestibulares con una IC50 de 100 nM (Housley y cols., 1988). Un inhibidor irreversible de la histidina descarboxilasa, la alfa-fluorometil histidina, produce una reducción dependiente de la concentración en la actividad espontánea de las neuronas

aferentes, sugiriendo entonces que la enzima de síntesis para la histamina se requiere para la actividad espontánea de las aferentes vestibulares (Housley y cols., 1988; Guth y cols., 2000). Cuando se perfunde con bajo calcio y alto magnesio o bien con 5 mM de cadmio, iones que reducen la liberación del neurotransmisor de las células ciliadas, la histamina no produce su efecto facilitador (Guth y cols., 2000).

En estudios realizados en el laberinto de la rana, se ha encontrado que el antagonista más selectivo para los receptores H1, la pirilamina (10µM) reduce el efecto excitador de la histamina; también los antagonistas H1, difenhidramina y tripelenamina disminuyen la frecuencia de descarga de las aferentes, pero a concentraciones más altas (100µM); el agonista H1, 2-3-trifluorometilfenilhistamina (HTMT) produce facilitación de las aferentes vestibulares. Por otra parte, el agonista selectivo H2, dimaprit, produce una ligera facilitación, y la cimetidina, un antagonista H2, también reduce muy ligeramente la frecuencia de descarga basal de las aferentes vestibulares, indicando que los receptores H2 no producen un efecto significativo sobre la actividad de las aferentes vestibulares. El agonista selectivo H3, R alfa metilhistamina, induce una facilitación dependiente de la dosis (1-10µM) de las aferentes de los canales semicirculares en concentraciones tres órdenes de magnitud superiores a su Kd, y dos antagonistas H3, tioperamida y clobenpropit, no producen ningún efecto sobre la descarga basal de las aferentes en dosis hasta de 10 µM. El efecto de la histamina y del HTMT fue antagonizado por la betahistina y los antagonistas H1 pirylamina y difenhidramina. En conjunto, estos resultados indican que la histamina tiene un papel importante en la neurotransmisión en los canales semicirculares, y que los receptores para la


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histamina presentes en las células del vestíbulo de la rana son predominantemente del tipo H1 (Norris y cols., 1988; Housley y cols., 1988; Guth y cols., 2000).

Los antagonistas muscarínicos atropina y propilbenzililcolina, reducen el efecto facilitador de la histamina, al igual que los antagonistas H1 reducen el efecto facilitador del carbacol, sugiriendo que la histamina puede favorecer la liberación de la acetilcolina de las fibras eferentes, o bien activar a los receptores colínérgicos ubicados en la célula ciliada; sin embargo, en experimentos de deferentación, el efecto facilitador de la histamina permanece (Norris y cols., 1988; Guth y cols., 2000).

Tomoda y colaboradores, en 1997, reportaron que en las células ciliadas aisladas de la cresta ampular del cobayo, existe un aumento significativo en la concentración de calcio intracelular como resultado de la aplicación de histamina en presencia de calcio extracelular; observaron también que, en ausencia de calcio extracelular, se produce un ligero incremento en la concentración de calcio intracelular; estos autores proponen que esta respuesta es mediada por receptores H1, H2 y H3, ya que antagonistas H1 (prometazina), H2 (cimetidina) y H3 (tioperamida) bloquean completamente la respuesta de calcio inducida por la histamina.

Uno de los problemas aún no aclarados respecto del papel de la histamina en el sistema vestibular, es el de precisar el origen de esta sustancia. Parece claro que existen receptores para histamina en el oído interno, pero no sabemos de dónde proviene el ligando endógeno para estos receptores. Miller y Schwartz, en 1983, demostraron que la N-acetilhistidina puede liberarse de los fotorreceptores de los anuros junto con el glutamato, aspartato, putrescina y cadaverina. En 1991, Drescher y Drescher, extrajeron, a través de HPLC, a la N-acetilhistidina en concentraciones milimolares

en una preparación de capa aislada de células ciliadas del sáculo de la trucha; además, obtuvieron glutamato, fosfoserina y fosfoetanolamina; la fracción del nervio sacular presentó un espectro diferente de aminas primarias, en lo que concierne principalmente a los dipéptidos de la histidina carnosina y homocarnosina, en una razón de 1:10; en ambos extractos obtuvieron también histidina. La N-acetilhistidina, en concentraciones micromolares, produce un efecto facilitador sobre los canales semicirculares de la rana (Drescher y Drescher, 1991). Housley y cols., en 1988, reportaron que la carnosina produjo facilitación en las aferentes vestibulares.

Un antisuero que reacciona con carnosina, homocarnosina y anserina, produce un intenso inmunomarcaje en las células ciliadas de los canales semicirculares de la rana (Panzanelli y cols., 1994).

Existe la posibilidad, entonces, de que el mediador endógeno no sea la histamina en sí, sino una sustancia química cercana como la carnosina o la N-acetilhistidina, y que los efectos de los antagonistas H1 y de la betahistina sobre la actividad basal se produzcan por antagonismo de estos análogos endógenos de la histamina y no con la histamina per se.

Betahistina

La betahistina (N-alfa-metil-2-piridiletil-amina), es un análogo de la histamina. Evaluada con base en su capacidad para competir con la mepiramina tritiada en el cerebelo de cobayo y en cortes de corteza cerebral de rata se ha reportado que tiene actividad agonista parcial, débil, sobre el receptor H1 (Arrang y cols., 1983, Wang y Dutia, 1995). También se ha reportado su acción como agonista parcial, débil, sobre los receptores H2 con base en la acumulación de AMPc estimulada por la betahistina en cortes de hipocampo, acción que fue antagonizada con cimetidina (Hill y


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cols., 1997). Asimismo, se ha encontrado que la betahistina tiene una potente acción antagonista H3, ya que fue capaz de bloquear completamente y en forma dependiente de la concentración, la estimulación de los autorreceptores por la aplicación de histamina exógena en cortes de corteza cerebral de rata (Arrang y cols., 1985).

La betahistina fue introducida como droga activa en el tratamiento de ciertos desórdenes vasomotores (Horton y von Leden, 1962), y desde entonces se ha usado ampliamente y de manera eficaz en la clínica en casos de desórdenes vestibulares centrales y periféricos, en los que se reporta que la administración de betahistina reduce significativamente la incidencia y severidad del vértigo, y produce una disminución en la incidencia de náuseas y vómito (Wilmont y Menon, 1976; Aataa, 1991; Oosterveld, 1984; Kingma, 1997; Gordon y Shupak, 1999; Lamm y Arnold, 2000). También se ha reportado la superioridad de la betahistina con respecto de otras drogas usadas en casos del síndrome de Mèniere, sobre todo en la terapia de mantenimiento (Aantaa, 1991), y su eficacia en casos de vértigo periférico sin causa establecida (Canti y cols., 1981). Su efecto clínico se ha atribuido al aumento del flujo sanguíneo en los sistemas vestibular y coclear en modelos animales (Martínez, 1972). Se ha reportado que la betahistina aumenta el flujo sanguíneo regional en pacientes con enfermedad cerebrovascular (Meyer y cols., 1974), y que hay una mejoría de la función mental en pacientes ancianos, con efectos sedantes mínimos (Fujino y cols., 1996).

En experimentos con registro extracelular de neuronas del núcleo vestibular medial en rebanadas del tallo cerebral de ratas, la aplicación de histamina produce una excitación dependiente de la dosis; la aplicación de la triprolidina,

antagonista H1, reduce el efecto excitador de la histamina en esta preparación y la betahistina produce una ligera acción excitatoria; a pesar de su aparente poca potencia, la betahistina reduce significativamente el efecto excitador de la histamina (Horii y cols., 1993). Los efectos de la betahistina corresponden a la acción de un agonista parcial H1 sobre las neuronas del núcleo vestibular medial, presumiblemente ocupando sitios receptores en competencia con la histamina endógena (Wang y Dutia, 1995).

La ventaja de la betahistina sobre la histamina en la terapia de vértigo es que la administración de la histamina es intravenosa y la duración del efecto es corta, comparada con la administración oral y el margen terapéutico amplio de la betahistina (Aantaa, 1991). Recientemente se ha observado que la betahistina produce una disminución de la frecuencia de descarga de las aferentes vestibulares en el canal semicircular aislado de la rana (Botta y cols., 1998). Estudios farmacocinéticos muestran que, en el hígado la betahistina se transforma en aminoetilpiridina (M1), hidroxietilpiridina (M2) y se excreta en la orina como ácido piridilacético (M3). Estudios en que se ha probado la acción de los metabolitos de la betahistina sobre la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares de la rana, demuestran que la M1 (1µM), reduce la frecuencia en la descarga basal de las aferentes vestibulares sin afectar la respuesta a estímulos mecánicos; los otros metabolitos estudiados no tuvieron ningún efecto (0.1µM a 10mM); estos resultados indican que, probablemente, la acción antivértigo de la betahistina está también presente en su metabolito aminoetilpiridina. De hecho, se ha propuesto que la acción de la betahistina estaría dada inicialmente por este agente y sería sostenida a largo plazo por su metabolito M1 (Botta y cols., 2000).


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La betahistina inhibe la respuesta facilitatoria de un agonista específico H1, la R-alfa metilhistamina (Guth y cols., 2000).

JUSTIFICACIÓN Se desconoce el mecanismo mediante el cual la betahistina produce sus efectos en la periferia vestibular, razón por la que decidimos estudiar su acción sobre la actividad eléctrica de las neuronas aferentes vestibulares y sus interacciones con agonistas y antagonistas de las sinapsis aferente y eferente.

HIPÓTESIS Pensamos que la acción de la betahistina es debida a que activa receptores específicos ubicados en las fibras eferentes y en las células ciliadas, modificando la liberación de acetilcolina de las eferentes, la producción de óxido nítrico por las células ciliadas y la liberación del neurotransmisor aferente.

OBJETIVOS ?? Definir la acción y construir la curva

dosis-efecto de la betahistina sobre la descarga basal y la respuesta a estímulos mecánicos de las aferentes vestibulares.

?? Estudiar cómo se modifica el efecto de la

betahistina cuando se bloquean los

receptores colinérgicos con atropina y d-tubocurarina.

?? Estudiar cómo se modifica el efecto de

agonistas colinérgicos con la aplicación de betahistina.

?? Estudiar cómo se modifica el efecto de la

betahistina cuando se perfunden bloqueadores de la sintetasa de óxido nítrico.

?? Estudiar si la betahistina es capaz de

modificar el efecto de agonistas a aminoácidos excitadores.

MATERIAL Y MÉTODOS Animal de experimentación Se utilizó como animal de experimentación, el ajolote (Ambystoma tigrinum). Éste es el estado larvario de la salamandra. Se eligieron de manera aleatoria, sin considerar edad ni sexo, y entre 30 y 60 gramos de peso.

Figura 5. Esquema del oído interno del axolotl por su cara ventral. Se destacan las fibras que inervan a los canales semicirculares anterior (AC) y posterior (PC), el utrículo (u), el sáculo (S), la lagena (L) y la papila basilar (BP). Para nuestros experimentos aislamos las ramas anterior y posterior y registramos de la rama anterior.


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Obtención de la preparación Para obtener la preparación del oído interno aislado del axolotl, se decapitó al animal cortando por delante de las branquias; posteriormente se separó el maxilar inferior del superior; de este último se desprendió el epitelio que cubre el paladar, se identificó el oído interno por dos zonas blanquecinas a cada lado de la línea media que corresponden a los otolitos de los sáculos. Se resecó la parte ventral de las cápsulas óticas con un bisturí; la preparación se colocó en una cámara con solución Ringer para anfibio para continuar la disección bajo microscopio estereoscópico (Nikon, SMZ- 10), hasta visualizar las diferentes estructuras del oído. Se tuvo cuidado en descubrir las ámpulas de los canales anterior y lateral, así como las fibras nerviosas de

cada una de ellas. Se disecó el VIII par craneal en todo su trayecto hasta su entrada al tallo cerebral, donde se seccionó. Las fibras provenientes de cada estructura se separaron, de manera que la rama vestibular quedó dividida en dos fascículos (Figura 5): uno proveniente de los canales anterior, lateral y del utrículo (rama anterior), y el otro del sáculo, lagena, canal posterior y papila amphibiorum (rama posterior). La región ósea que comprende la cápsula ótica se separó del resto del cráneo y se fijó con un alfiler a la cámara de registro. Sustancias utilizadas La preparación fue perfundida con solución Ringer para anfibio con la siguiente composición (en mM): NaCl 111, KCl 2.5, MgCl2 1, CaCl2 1.8, Hepes 5 y Glucosa 10.

Figura 6. Montaje de la preparación del vestíbulo aislado para la estimulación mecánica en una plataforma rotatoria. La preparación se sometió a aceleraciones sinusoidales por medio de un motor con servomecanismo cuya velocidad y características de giro fueron controladas por un generador de funciones. En la plataforma se montó el amplificador, los manipuladores, el electrodo de succión y el sistema de aplicación de drogas. Una vez amplificada, la señal fue llevada por medio de un conector rotatorio a un osciloscopio, a un discriminador de ventana y a una computadora para su análisis.


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En algunos experimentos la preparación fue perfundida con solución Ringer con bajo calcio y alto magnesio (0.09 y 10 mM respectivamente). El pH de la solución se ajustó a 7.4 usando NaOH. La osmolaridad de la solución fue de 240 mosm.

Los fármacos utilizados en esta preparación fueron diclorhidrato de betahistina (Formenti, Italia), cloruro de carbamilcolina (carbacol), cloruro de d-tubocurarina, sulfato de atropina, N? -nitro-L-arginina (L-NOARG), ácido kaínico, ácido quiscuálico, L-argininina y glicina (Sigma Chemical Co. USA). Aplicación de las drogas La preparación se colocó en una cámara de registro con un volumen de 2 ml, y fue perfundida con la solución Ringer con un flujo de 1 ml por minuto, excepto durante la estimulación mecánica. El carbacol, el ácido kaínico y el ácido quiscuálico se aplicaron por microperfusión, 20 µl cada vez, a través de una micropipeta que se conectó a una jeringa Hamilton. La punta de la micropipeta se colocó en la cercanía de la sinapsis y la droga se expulsó por presión. Esta técnica tiene la ventaja de permitir aumentos momentáneos en la concentración del fármaco, sin embargo, impide conocer la concentración final de la droga porque la concentración inicial decae rápidamente de manera exponencial. En este trabajo todas las concentraciones se expresan como la concentración originalmente contenida en la pipeta. Los demás fármacos se aplicaron por perfusión en el baño. Estimulación mecánica Para la estimulación mecánica, la cámara de registro, los manipuladores y el amplificador se colocaron sobre una plataforma rotatoria construida con dos placas de acrílico montadas sobre un servomotor (figura 6) Aerotech, modelo 49179. La aceleración del motor fue controlada por un generador de

funciones (Hewlett-Packard modelo, 8904A), cuya señal pasó previamente por un amplificador de corriente que sirvió para alimentar el motor. La señal de comando del generador de funciones y la salida del tacómetro del motor se visualizaron en la pantalla de un osciloscopio (Textronix, 2216). La salida del tacómetro se llevó, además, a un amplificador de AC (P15D, Grass) y, de ahí, a un convertidor analógico digital de 12 bits (MBC metrabyte DAS-16). Se digitalizó la señal a la frecuencia establecida por el bin de conteo en el programa de análisis de espigas. La señal del tacómetro se usó para correlacionar la amplitud y fase de la respuesta en función de la amplitud y frecuencia del estímulo mecánico.

La preparación se estimuló con aceleraciones sinusoidales a una frecuencia de 0.2 Hz y con una aceleración angular pico de 440 grados/seg. En estos experimentos fue importante lograr que el canal semicircular lateral quedara ubicado en el plano horizontal, de manera que las aceleraciones de la plataforma fueran un estímulo ideal para el canal del cual registramos. Estos experimentos se diseñaron de forma tal que el desplazamiento (rotación) de la plataforma de registro, sería equivalente a una flexión lateral del cuello del axolotl.

Técnica de registro La actividad eléctrica de las fibras aferentes vestibulares se registró usando un electrodo de succión (A-M Systems), cuya punta se llenó con solución Ringer hasta hacer contacto con un alambre de plata clorurada que se encuentra en el interior del electrodo. Mediante un manipulador se afrontó el electrodo al extremo libre del nervio y se succionó aplicando presión negativa; de esta manera se forma un sello de alta resistencia eléctrica entre el interior y el exterior del electrodo, lo que determina que se puedan registrar las variaciones de voltaje del nervio.


21

Esta técnica permite mantener registros estables durante varias horas. El electrodo de succión se conectó a una amplificador AC (Grass, P-15) y, a través de un conector rotatorio, se llevó a un osciloscopio (Textronix, 2216) y un discriminador de ventana (WPI, 121). La salida del discriminador de ventana se llevó a una computadora en la que, mediante un programa específico de análisis desarrollado en nuestro laboratorio, se construyeron las gráficas de frecuencia de descarga de las fibras aferentes (Soto y Vega, 1987). Protocolo experimental En todos los experimentos se hizo un registro control antes de cualquier manipulación farmacológica; este control consistió en el registro de la descarga basal durante un minuto y, posteriormente, la respuesta a 7 ciclos de estimulación sinusoidal con una frecuencia de 0.2 Hz. Se realizaron también controles para verificar que la perfusión no

produjera por sí misma ningún tipo de respuesta mecánica con cambio ostensible en la actividad de las neuronas aferentes vestibulares. Análisis estadístico Para el análisis de los resultados, el registro de la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares se llevó a un discriminador de ventana y de ahí a una computadora para su procesamiento en forma de gráficas de frecuencia en función del tiempo (Soto y Vega, 1987). Para analizar el efecto producido por una droga, tanto sobre la descarga basal como sobre la respuesta a estímulos mecánicos, se utilizó la prueba estadística no paramétrica U de Mann Whitney (Soto y cols., 1989). Para comparar los efectos de una droga entre varios registros de la actividad basal, los resultados se normalizaron como porcentaje con respecto al control. En la respuesta a la estimulación mecánica se midió el tamaño de 5 picos y se obtuvo la media.

Figura 7. En A, gráfica de frecuencia en función del tiempo que muestra la acción típica de la betahistina. La perfusión de la betahistina decrementa la descarga basal y la respuesta producida por los estímulos mecánicos. Los registros muestran el control, la descarga basal y la evocada los 5 y 10 min. de perfusión de la betahistina. Las barras grises corresponden a los periodos de estimulación mecánica (ips= impulsos por segundo). En B, la curva dosis-efecto de la acción de la betahistina sobre la descarga basal y la evocada mecánicamente en las aferentes de los canales semi-circulares. La curva se construyó con base en los registros a los 10 min de perfusión de la betahistina. Cada punto representa la media ± el error estándar de cuando menos 5 experimentos.

30 s

100 ips

Log [betahistina] mM0.01 0.1 1 10

% D

esca

rga

Con

trol

25

50

75

100

125evocadabasal

BetahistinaControl

A

B

1 mM


22

RESULTADOS Se registró la actividad basal y la respuesta a estímulos mecánicos de las aferentes vestibulares en un total de 149 experimentos. Betahistina La betahistina (BH) se probó inicialmente aplicándola por microperfusión 20 µl en concentraciones de 100 µM (n=2), 0.1 mM (n=2), 1 mM (n=2) y 10 mM (n=2). En ninguna de estas concentraciones se encontró un efecto significativo. Posteriormente, aplicamos la droga perfundiendo la preparación con una concentración de 100 µM; en este caso observamos una disminución de la frecuencia en la descarga basal y de la respuesta a los estímulos mecánicos de las aferentes de los canales semicirculares. Con base en este resultado, y considerando el curso temporal de la acción de la betahistina, se decidió que, en adelante se tomarían registros de la

actividad eléctrica de las aferentes vestibulares luego de 1, 5 y 10 minutos de perfusión de la droga. Perfundimos a la betahistina por sustitución en el baño en concentraciones de 0.01 a 10 mM (n=32) y observamos una disminución en la frecuencia de la descarga basal y, en menor proporción, en la respuesta a estímulos mecánicos de las aferentes de los canales semicirculares. Encontramos que el efecto inhibitorio de la betahistina es dependiente del tiempo de perfusión y de la concentración. En todos los casos el efecto de la betahistina fue reversible con el lavado. En estas concentraciones, la betahistina inhibió la descarga basal de las neuronas aferentes de los canales semicirculares vestibulares con una IC50 de 600µM y produjo una inhibición de la respuesta a estímulos mecánicanicos con una IC50 de 10 mM a los 10 minutos de perfusión (Figura 7B). Cabe destacar que, a la concentración más baja (0.01 mM), el efecto de la betahistina sobre la actividad basal mostró una excitación y no una

Figura 8. Registros de la descarga en reposo y ante la estimulación mecánica de las neuronas aferentes de los canales semicirculares. La aplicación de d-tubocurarina (d-T) 10 µM no produce un efecto por sí misma La aplicación de la betahistina 1 mM en presencia de la d-T produce un efecto inhibidor semejante al que se presenta en la condición control.

1 minExp 355

Control BH + d-Td-T 10 µM, 10 min Lavado 35 min

50 ips


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inhibición (Figura 7B). En la figura 7A se observa un registro de la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares, en el que la betahistina 1mM disminuyó tanto la actividad espontánea como la respuesta a estímulos mecánicos; su efecto revirtió a los 20 minutos de lavado. Atropina, d-tubocurarina y betahistina Las concentraciones utilizadas de los antagonistas colinérgicos se eligieron con base en un reporte de la literatura que indica que, con estas concentraciones, se bloquean completamente los receptores tanto muscarínicos como nicotínicos (Sugai, y cols., 1992).

Perfundimos atropina 10 ?M por sustitución en el baño y no observamos ningún cambio significativo en la descarga basal de las aferentes vestibulares (n=18).

Perfundimos d-tubocurarina (d-T) 10 ?M por sustitución en el baño y tampoco se modificó ostensiblemente la actividad eléctrica basal de las neuronas aferentes de los canales semicirculares (n=18).

Posteriormente estudiamos la interacción entre estos antagonistas

muscarínicos y nicotínicos con la betahistina. Después del registro control, perfundimos durante 10 minutos atropina 10 µM, luego de este tiempo registramos la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares; posteriormente el Ringer de la cámara fue sustituido por otro que contenía atropina 10 µM más betahistina 1 mM (n=3); el efecto de la betahistina permaneció como en el control.

Se sustituyó en el baño a la d-tubocurarina 10 µM y se perfundió durante 10 minutos, añadiendo al Ringer la betahistina 1mM ( n=3); observamos que el efecto de la betahistina se mantiene como en el control. Los antagonistas colinérgicos no produjeron cambios significativos en el efecto de la betahistina. En la figura 8 se muestra el registro de la frecuencia de descarga de las neuronas aferentes de los canales semicirculares; en donde se observa que no se modifica la actividad basal ni la respuesta a estímulos mecánicos después de 10 minutos de perfusión de d-tubocurarina 10 µM, con respecto al control; sin embargo, al añadir betahistina durante 10 minutos, se observa el efecto inhibitorio igual que en el control.

20 ips

1 min

Betahistina 1 mM

Carbacol 200 µM Carbacol 200 µM

Figura 9. Interacción entre betahistina y carbacol. La aplicación de betahistina inhibe el efecto excitador del carbacol (n=5) en un 30%. Este efecto inhibidor de la betahistina sobre las respuestas provocadas por el carbacol puede deberse a una acción pre o postsináptica de la betahistina.


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Carbacol Con el fín de estudiar aún más las posibles interacciones de la betahistina con los receptores colinérgicos, decidimos usar el carbacol. Probamos el efecto del carbacol sobre la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares y lo aplicamos por microperfusión 20 µl cada vez, en un rango entre 10 y 300 µM (n=20); no tuvo un efecto significativo sobre la respuesta a estímulos mecánicos; en contraste, produjo un incremento de larga duración (3-5 minutos) en la descarga basal de las neuronas aferentes de los canales semicirculares. El efecto del carbacol en las concentraciones usadas fue independiente de la concentración (se obtuvo prácticamente el mismo efecto a todas las dosis). Carbacol y betahistina Con el fin de definir si existe alguna forma de interacción entre los receptores a histamina y los mecanismos que median la respuesta a la acetilcolina, decidimos perfundir la preparación con betahistina 1 mM durante 10 minutos. Una vez que se ha desarrollado el efecto inhibidor de la betahistina, se aplicó por microperfusión carbacol 200 µM (n=5). Decidimos usar esta concentración de

carbacol porque está reportado que produce una activación inespecífica de receptores tanto muscarínicos, como nicotínicos (Guth y cols., 1986).

La betahistina redujo la acción excitatoria del carbacol en un 30 ? 3.4 % con respecto al control, sin modificar significativamente su curso temporal (figura 9). L-NOARG y betahistina Para estudiar si la acción de la betahistina sobre la descarga del nervio aferente está relacionada con la generación de óxido nítrico, perfundimos durante 10 minutos, un antagonista de la sintetasa de óxido nítrico (L-NOARG) en una concentración de 3 µM. La concentración de 3 µM se eligió considerando la IC50 de este agente, del que previamente hemos estudiado su acción sobre la descarga de las aferentes de los canales semicirculares (Flores y cols., 1996). El L-NOARG produjo una disminución del 19 ? 4.4% en la descarga basal y de 11.2 ? 4.4% en la respuesta a estímulos mecánicos (n=5); posteriormente, al Ringer con L-NOARG se añadió betahistina 1 mM (n=5). El efecto inhibidor de la betahistina se mantiene

Control L-NOARG L-NOARG + BH

30 s

25 ips

Figura 10. La administración previa de L-NOARG no modifica el efecto inhibitorio de la betahistina. La figura muestra la actividad control, la actividad eléctrica después de 10 minutos de perfusión de L-NOARG 3 µM y el registro después de 10 minutos de añadir betahistina 1 µM. Las barras grises representan los periodos de la estimulación mecánica.


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como en el control (tabla 2). En el caso de la perfusión con L-NOARG, el efecto de la betahistina no se elimina completamente, aún después de 60 minutos de lavado. En la Figura 10, se muestran tres registros consecutivos en los que se observa el efecto del L-NOARG 3 µM y después el efecto

inhibitorio de la betahistina 1 µM que permanece como en el control. Con el fin de analizar con mayor detalle la posible influencia sobre la producción de NO, decidimos estudiar el efecto de la L-arginina, que es el sustrato natural para la NOS, y que tiene un efecto excitatorio sobre la actividad en reposo de las neuronas del estatocisto del calamar y la jibia (Tu y Budelmann, 1999). En nuestra preparación, la L-arginina se administró inicialmente por microperfusión 1; n=2, 10; n=2 y 100 ?M; n=2, y 10 mM (n=2,), y no se

observaron cambios en la actividad basal de las aferentes vestibulares; después se aplicó por perfusion en el baño en concentraciones de 100?M; n=2 y 10 mM; n=2; en la concentración más alta se observó un aumento en la frecuencia de descarga basal

de las aferentes vestibulares. Posteriormente se adicionó L-arginina (1 µM; n=4) al Ringer normal por perfusión en el baño y no se modificó la descarga basal de las neuronas aferentes vestibulares. Medimos el pH de la solución Ringer al adicionar la L-arginina, obteniéndose un valor de 7.38. Es importante

considerar el hecho de que la solución Ringer no cambie el pH después de administrar al aminoácido L-arginina.

Se ha reportado que la glicina es un coagonista de los receptores NMDA en el sistema nervioso central y en el oído interno (Johnson y Ascher, 1987; Soto y cols., 1994). Al perfundir glicina 1 ?M, n=4, no se modifica la descarga basal de las neuronas aferentes vestibulares. Encontramos que la perfusión de la preparación con una solución Ringer a la cual se ha adicionado L-arginina 1 µM y glicina 1 µM presenta una actividad más

estable a lo largo del tiempo. Curiosamente, en estas condiciones, y a pesar de la falta de un efecto excitador evidente de la L-arginina, la aplicación de L-NOARG 3 µM produce un efecto inhibidor mayor de un 18 % en la actividad basal y de 5.8 % en la respuesta a

Tabla 2. Efectos de la betahistina (BH) y L-NOARG sobre las aferentes vestibulares Ringer normal n basal provocada L-NOARG, 3 µM 5 19 ? 4.4 % 11.2 ? 4.4 % BH, 1 mM 5 43 ? 8.8 % 28.2 ? 5.5. % BH después de L-NOARG 5 46 ? 9.2 % 30.8 ? 8.2 % Ringer con glicina y L-arginina L-NOARG, 3 µM 4 37.3 ? 11.2 % 17 ? 4.7 % BH, 1 mM 4 45.3 ? 6.2 % 29.8 ?4.7 % BH después de L-NOARG 4 46 ? 6.9 % 26 ? 6.8 %

Tabla 3. Efecto de la BH sobre el efecto excitador del KA

BH ?M? % de disminución del efecto excitatorio del KA 10 µM

n

1x10-3 45.5 ? 9.8% 4 1x10-2 67.5 ? 2.5% 2


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estímulos mecánicos con respecto al que se produce en Ringer normal. En estas condiciones, el efecto inhibidor de la betahistina sobre la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares se mantiene como en

el control (tabla 2).

Acido kaínico y betahistina Se aplicó por microperfusión 20 µl de

ácido kaínico (KA) 10 ?M (n=4); y

Figura 11. Interacciones entre la betahistina y el ácido kainico (KA). En la figura observamos la respuesta control de las aferentes de los canales semicirculares a la aplicación de 20 µl de KA 10 µM y, después, la disminución del efecto del KA luego de 10 minutos de perfusión con betahistina 1 mM.

KA

Betahistina 1 mM

30 s

50 ips

KA

20 IPS

1 min

QA 1 µM

Figura 12. Interacción de la betahistina con el ácido quiscuálico (QA) en Ringer con bajo calcio y alto magnesio. En la figura se observa la disminución (55 %) en el efecto excitador del QA después de 10 minutos de perfusión de betahistina 1 mM (trazo en gris), con respecto al control (trazo en negro).


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observamos que induce un fuerte efecto excitatorio en la descarga basal de las neuronas aferentes de los canales semicirculares. La perfusión en el baño durante 10 minutos de betahistina 1 mM (n=4), reduce el efecto excitatorio del ácido kaínico (10 ?M) en un 45.5 ? 9.8% con respecto al control.Probamos también la concentración de la BH 10 mM (n=2) por perfusión en el baño durante 10 minutos; esta concentración reduce el efecto excitatorio del ácido kaínico (10 ?M) en un 67.5?2.5%) con respecto al control (tabla 3). En la figura 11, se muestra el registro de la frecuencia de descarga de las aferentes vestibulares; en donde se observa la disminución del efecto de la microperfusión del ácido kaínico 10 ?M después de 10 minutos de perfusión de betahistina 1 mM. Acido quiscuálico y betahistina El ácido quiscuálico (QA), se aplicó a nuestra preparación (20 ? l por microperfusión) 1 ?M (n=5); este indujo un efecto excitatorio sobre la descarga basal de las aferentes de los canales semicirculares; cuando se perfundió en el baño a la betahistina 1 mM, el efecto excitatorio del ácido quiscuálico disminuyó en un 39.7 ? .1.8% con respecto al control.

Con el fin de definir si el efecto inhibidor de la betahistina sobre las respuestas provocadas por el ácido quiscuálico se produce a nivel postsináptico, bloqueamos la liberación del neurotransmisor aferente perfundiendo la preparación con Ringer con bajo Ca y alto Mg (0.09 y 10 mM respectivamente) en estas condiciones como se ha reportado previamente en nuestro laboratorio (Pérez y cols, 1993), la actividad basal y la respuesta a estímulos mecánicos desaparece. La microperfusión con ácido quiscuálico (1 ?M, n=13) produce una respuesta excitatoria muy poderosa de las neuronas aferentes vestibulares (Figura 12) . Cuando perfundimos a la betahistina (0.001-

10 mM), el efecto excitador del ácido quiscuálico 1 µM disminuye de manera dependiente de la concentración de betahistina (tabla 4).

En la figura 12, podemos ver un registro de la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares estimuladas por la aplicación de ácido quiscuálico 1 µM, en Ringer con bajo calcio y alto magnesio, antes y después de la perfusión de betahistina 1 mM.

Cabe destacar que el efecto inhibidor de la betahistina sobre la respuesta provocada por el ácido quiscuálico cuando se ha bloqueado la liberación de neurotransmisor produce una curva concentración efecto que es paralela a la curva de inhibición de la respuesta a estímulos mecánicos producida por la betahistina (Figura 13). Este hecho apunta claramente a un efecto del tipo de antagonismo competitivo. DISCUSIÓN Probamos varias hipótesis en relación con el mecanismo de acción de la betahistina en la periferia vestibular. La betahistina produce un efecto inhibitorio significativo sobre la descarga basal de las neuronas aferentes vestibulares, como ha sido reportado previamente (Botta y cols., 1998). También establecimos que la betahistina ejerce un ligero efecto inhibitorio sobre la respuesta a estímulos mecánicos. El efecto inhibitorio de la betahistina se observó después de que la droga estuvo en contacto con la preparación algunos minutos (5-10 minutos). La baja potencia y la latencia de sus efectos apuntan hacia el hecho de que la betahistina tiene una acción compleja, involucrando probablemente a segundos mensajeros.


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Resultados previos de inmunohisto-química en nuestro laboratorio indican que el óxido nítrico es producido por las células ciliadas, y que la producción de NO se da bajo la influencia de las fibras eferentes (Flores y cols., 1996). También se ha postulado que la producción de NO de las células ciliadas pueda ser modulada a través de un autorreceptor para el neurotransmisor aferente ( Prigioni y cols., 1990; Guth y cols., 1998b). El óxido nítrico generado a nivel de las células ciliadas podría afectar tanto a las neuronas aferentes como a las eferentes, además de participar en la regulación del flujo sanguíneo en el oído interno en el axolotl (Flores y cols., 1996).

Reportes previos han propuesto la hipótesis de que la acción periférica de la

betahistina está dada por un aumento en la microcirculación local en el laberinto (Martínez, 1972). Usando flujometría Doppler, se ha demostrado que la betahistina aumenta el flujo sanguíneo vestibular en el ámpula del canal posterior del cobayo (Dziadzola y cols., 1999).

Nosotros estudiamos los efectos de la betahistina en presencia de un antagonista de la NOS, el L-NOARG. La hipótesis a probar fue que la betahistina podría modular la producción de NO en el oído interno y, consecuentemente, inducir una modificación local del flujo sanguíneo. Nuestros resultados indican que el bloqueo de la NOS no modifica significativamente la acción de la betahistina sobre la descarga eléctrica de las neuronas afererentes de los canales semicirculares, por lo que podríamos considerar que, en lo

Figura 13. Efecto inhibitorio de la betahistina sobre el efecto evocado por el ácido quiscuálico en Ringer con bajo calcio y alto magnesio. La curva dosis efecto de la betahistina sobre el QA (1 µM) tiene una cinética muy similar a la curva de inhibición de la respuesta evocada mecánicamente producida por la betahistina (cada punto en la gráfica corresponde a 3 experimentos, excepto a la dosis de 0.1 mM en donde son 4 experimentos.

Log [betahistina] mM0.01 0.1 1 10

% d

e la

resp

uest

a co

ntro

l

25

50

75

100

125evocadabasalBH + QA


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que respecta a la actividad eléctrica, la betahistina no tiene influencia sobre la vía de producción del NO. En nuestra preparación in vitro no hay flujo sanguíneo, por lo que la evaluación de las acciones del óxido nítrico en este trabajo se basa exclusivamente en la actividad eléctrica de las neuronas aferentes. La probabilidad de que fuentes de NO que no son capaces de influenciar la descarga de las neuronas aferentes vestibulares podrían ser afectadas por la betahistina y mediar algunos de sus efectos clínicos permanece abierta. De hecho, se ha descrito que la vasculatura de la región de células oscuras de la cresta ampular del cobayo está inervada por fibras trigeminales que constituyen un sistema para las respuestas vasadilatadoras no relacionadas con la inervación del VIII par en la periferia vestibular (Vass y cols., 1998).

Se ha reportado, en estudios bioquímicos, que la histamina, a través de los receptores H1, estimula la actividad de la sintetasa de óxido nítrico en células endoteliales cultivadas, (Schmidt y cols., 1990); y en muestras de tejido pulmonar (Leurs y cols., 1991a).

En el vestíbulo de la rana se ha demostrado la presencia de receptores H1, así como la inhibición dependiente de la dosis del efecto facilitador de la histamina al aplicar betahistina (Guth y cols., 2000). Nuestros resultados indican que el bloqueo de la NOS con L-NOARG no modifica el efecto de la betahistina, ya que de ser éste el mecanismo de acción, no esperaríamos el efecto inhibitorio de la betahistina.

También nos planteamos la hipótesis de que la betahistina podría modificar la liberación del neurotransmisor eferente, y de esta manera modificar la entrada sensorial vestibular al sistema nervioso central. Estudiamos la interacción entre antagonistas muscarínicos y nicotínicos con la betahistina; el hecho de que tales antagonistas no modifiquen el efecto inhibitorio de la betahistina implica que esta droga no es

capaz de inducir la liberación de acetilcolina de los axones eferentes seccionados en nuestra preparación del oído aislado. En estos experimentos, la influencia de otras sustancias además de la ACh, que pueden liberarse de las terminales eferentes, no fue analizada, como el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) que se ha reportado que induce facilitación de las aferentes en el órgano de la línea lateral (Adams, y cols., 1987; Bailey y Sewell, 2000); péptidos opioides, principalmente agonistas del receptor kappa que disminuyen la frecuencia de descarga de las aferentes de los canales semicirculares del axolotl (Vega, 2000), y la leu-encefalina que también disminuye la frecuencia de descarga de las aferentes vestibulares de la rana (Andrianov y Rhizova, 1999).

Se ha sugerido que la histamina podría favorecer la liberación de acetilcolina de las fibras eferentes, o activar a los receptores colinérgicos (Housley y cols., 1998). Nosotros demostramos que el bloqueo de los receptores colinérgicos, nicotínicos y muscarínicos con d-tubocurarina y atropina, respectivamente, no modifica el efecto de la betahistina; más bien encontramos que la betahistina bloquea la respuesta excitadora inducida por el agonista colinérgico inespecífico, carbacol. Estos hechos sugieren que la betahistina pudiera actuar sobre la célula ciliada en lugares diferentes de los receptores colinérgicos, pero que afectan la activación de éstos. Permanece entonces abierta la posibilidad de alguna interacción indirecta entre los receptores de histamina y los de ACh sobre la célula ciliada, probablemente a través de la modulación de segundos mensajeros.

El efecto excitador del carbacol se podría explicar, por su unión a receptores muscarínicos, cuya activación a través de proteínas G favorece el aumento en el calcio intracelular y la posterior liberación del neurotransmisor aferente (Guth, 1990).


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Encontramos que la excitación producida por el carbacol se abole al perfundir atropina, y se reduce con la aplicación de d-tubocurarina (resultados no mostrados), lo que indica la presencia de receptores muscarínicos en el vestíbulo del axolotl. Sin embargo, Bailey y Sewell (2000), proponen que la activación de los receptores nicotínicos que son canales a través de los cuales pasa calcio, podrían activar a canales de potasio dependientes de calcio, y producir hiperpolarización en las células ciliadas, como la reportada en el sáculo de la rana (Sugai y cols, 1992), y al mismo tiempo, éste calcio ser capaz de inducir la liberación del neurotransmisor aferente. La presencia de proteínas que capturan calcio en la célula ciliada, sumamente eficaces, reducirian ésta posibilidad (Roberts y cols., 1990; Tucker y Fettiplace, 1995).

Existe también la posibilidad de que los receptores para la betahistina estén ubicados sobre las neuronas aferentes. Para probar esta hipótesis decidimos estudiar las interacciones de la betahistina con agonistas de receptores a aminoácidos excitadores (ácido kaínico y ácido quiscuálico). Encontramos que la betahistina disminuye el efecto excitador del kaínico y del quiscuálico, indicando que la betahistina podría interactuar con receptores ubicados en las neuronas aferentes, y que la activación de éstos determina la reducción en la respuesta a la aplicación exógena de agonistas a los AAE. Otra posibilidad es que existan receptores presinápticos histaminérgicos sobre la célula ciliada cuya activación por la aplicación exógena del ácido quiscuálico o ácido kaínico module negativamente la liberación del neurotransmisor, o bien, que la betahistina interaccione con receptores

histaminérgicos sobre la célula ciliada y que la activación de éstos active autorreceptores a AAE sobre la célula ciliada, reduciendo así la liberación del neurotransmisor aferente. Para descartar esta última hipótesis, perfundimos nuestra preparación con Ringer con bajo calcio y alto magnesio, que, se sabe, bloquea la liberación del neurotransmisor, y tanto la actividad basal como la respuesta a estímulos mecánicos desaparecen (Pérez y cols., 1991). En estas condiciones, la aplicación de betahistina reduce el efecto excitador del ácido quiscuálico, lo que indica que el efecto inhibidor de la betahistina se produce predominantemente sobre las neuronas aferentes vestibulares a través de receptores para la betahistina ubicados sobre las neuronas aferentes; parte del efecto de la betahistina estaría dado a través de la activación de éstos receptores que podrían afectar indirectamente a los receptores de los aminoácidos excitadores, o bien actuar sobre estos mismos, ya que la disminución del efecto excitador del ácido quiscuálico es dependiente de la dosis y la curva de inhibición producida por la betahistina sobre la disminución del efecto provocado por el quiscuálico presenta una cinética similar a la curva de inhibición a la respuesta a estímulos mecánicos producida por la betahistina, lo que apunta hacia un antagonismo competitivo en esta respuesta mecánica y parecería tener un mecanismo diferente para la respuesta basal. Se ha reportado que la betahistina atenúa significativamente la rotación inducida por la microinyección de ácido kaínico dentro del núcleo vestibular medial (O´Neill y cols., 1999), indicando que la betahistina reduce la excitabilidad de las neuronas aferentes.


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En el trabajo publicado que acompaña a esta tesis (anexo I), en las conclusiones apuntamos que una posibilidad que entonces quedaba abierta era que la betahistina actuara a nivel de receptores presinápticos modificando la liberación de neurotransmisor, y que, por algún mecanismo X, esta acción presináptica pudiera a su vez modificar la respuesta a la aplicación exógena de ácido kaínico. Está claro que un mecanismo como el propuesto implicaría que la aplicación exógena de agonistas de los AEE no sólo activara receptores postsinápticos sino que además actuara sobre receptores presinápticos (por ejemplo de tipo metabotrópico descritos por Guth y cols, en 1998, pero que en trabajos previos en nuestro laboratorio no se encontraron en el oído del axolotl (Flores, 1993), que modificaran la liberación del neurotransmisor aferente. Lo que estábamos realmente

pensando entonces al abrir esta posibilidad, es que parte de la respuesta a la aplicación de un agonista de AEE fuera debida a la interacción con receptores postsinápticos, y otra parte debida a modificaciones en la liberación del neurotransmisor aferente, y que por tanto, fármacos capaces de modificar la liberación del neurotransmisor pueden producir un aparente efecto postsináptico, ya que modificarían también la respuesta a la aplicación de agonistas de los receptores a los AEE. Por eso consideramos que era indispensable y muy importante realizar la serie experimental en que bloqueamos completamente la liberación del neurotransmisor aferente mediante el uso de soluciones con alto Mg2+ y bajo Ca2+, ya que de esta manera la modificación en la respuesta a la aplicación de un agonista de los AEE no puede, en teoría, tener ningún componente presináptico. Es por eso que, en

Figura 14. Hipótesis probadas acerca del sitio de acción de la betahistina en la periferia vestibular. Nuestros resultados indican que la betahistina tiene su sitio de unión sobre las neuronas aferentes, lo que puede explicar su efecto inhibitorio y la inhibición del efecto excitatorio del KA y del QA aún en condiciones en que se inhibe la liberación del neurotransmisor aferente en Ringer con alto Mg++ y bajo Ca++. La influencia de la betahistina en la liberación del neurotransmisor eferente, la generación del NO y la activación de autorreceptores presinápticos aferentes se descartó (sitios de unión cruzados). La unión de la betahistina en sitios sobre la célula ciliada que modifican el efecto de la Ach no se descarta y se considera como una posibilidad alternativa.


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este trabajo, la figura14 en que se resumen las conclusiones, es diferente a la que publicamos en el trabajo que se incluye en el anexo I, ya que hemos logrado excluir la participación de receptores presinápticos a los AEE en el efecto inhibidor de la betahistina sobre las respuestas provocadas por los agonistas de los AEE. CONCLUSIONES 1.- La betahistina disminuye la frecuencia en la descarga basal y, en menor proporción, la respuesta a estímulos mecánicos de las neuronas aferentes de los canales semicirculares. 2.- El efecto de la betahistina se mantiene después de la perfusión con L-NOARG éste efecto de la betahistina permanece aún después de mantener activa a la NOS con L-arginina y activados a los receptores NMDA con glicina. 3.- Demostramos que el bloqueo de los receptores colinérgicos nicotínicos y muscarínicos con d-tubocurarina y atropina, respectivamente, no modifica el efecto de la BH; más bien, la BH bloquea la respuesta excitadora inducida por agonistas colinérgicos (carbacol), lo que indica que la betahistina puede actuar sobre la célula ciliada en lugares diferentes de los receptores colinérgicos, pero que afectan la activación de éstos. 4.- La BH disminuye el efecto excitador del ácido kaínico, lo que indica que los receptores para la BH están ubicados sobre las neuronas aferentes. 5.- Probamos también que la betahistina disminuye el efecto excitador del ácido quiscuálico, aun en Ringer con bajo calcio y alto magnesio que bloqua la liberación del neurotransmisor aferente, lo que descarta la posibilidad de que la betahistina esté actuando a nivel de autorreceptores para aminoácidos excitadores ubicados en la célula ciliada.

Perspectivas de trabajo. 1.-Definir si otros fármacos como la tioperamida (antagonista H3), tienen un efecto semejante a la betahistina; y si la betahistina reduce el efecto del agonista específico H3 (R-alfa-metilhistamina). 2.- Definir si el metabolito de la betahistina, la aminoetilpiridina (M1) reproduce los efectos postsinápticos de la betahistina. 3.- Definir si la betahistina antagoniza la respuesta de otros agonistas de los AAE más específicos como el AMPA. 4.- En caso de tener una respuesta positiva en la acción antagonista sobre los AAE, y negativa con respecto al punto 1, proponer a la betahistina como un antagonista de los AAE. 5.- En caso contrario (positivo el punto 1, y negativo el punto 3), tratar de definir el mecanismo de acción por medio del cual los receptores H3 inhiben la respuesta de los AAE. Bibliografía

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efecto de la betahistina sobre la actividad …la betahistina se mantiene igual que en los...

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