高脂血症治療薬フル パス タチ ン の

抗酸化作用機序 に関する

薬理学的研究

2 0 0 0 年

鈴村 邦治

目次

緒言

第一 車 高コ レス テ ロ

-

ル食負荷ウサギに おける フルパス タチ ン の

L D L 酸化抵抗性上昇作用

第二章 ビタ ミ ンE 欠乏 ハ ム スター におけるフ ルパ スタチ ン の 酸化

ス トレス 上昇抑制作用

第三章 フルパスタチ ンのi n vitr o における鋼誘発L D L 酸化抑制作用

第四章 フル パスタテ ン の 光学異性体および主要代謝物のi n vitr o に

おける銅誘発L D I J 酸化抑制作用

第玉章 フルパ ス タチ ンおよび他の H M G - C o A 還元酵素阻害薬 の

in vi tr o にお ける へ ミ ン 一 過酸化水素誘発L D L 酸化抑御作用

策六章 フルパス タチ ンおよび代謝物の ヒ ドロ キシ ラジカル消去作用

第七草 フルパスタチ ンおよび代謝物の ス ー パ ー オキシ ドア ニ オン消去作用

総括

謝辞

参考文献

主論文目録

主査, 副査名

1 5

2 8

4 6

5 7

7 3

8 0

9 1

9 4

9 5

1 0 5

1 0 6

緒言

近年, 食生活 の 欧米化 , 高齢化 により高脂血症を示す患者が増加する傾向に あ

る . また,こ れと関連して動脈硬化を原因とする虚血性臓器障寧の 発生率は増加

して おり,血中脂質含量を適正値で維持する ことはそれ らの危険を回避するため

に臨床的に重要と考えられて い る . 血中の 低密度リボ蛋白(L D L) 含量と虚血性心疾

慮の発生率の間には相関がある こ とが知られ て い るが , 血中の 未変化のL D L その も

のが動脈硬化 を進展さ せ るとい う報告はほとん どなされて い ない .G old st ei n と

B ro w n らは血中の未変化のL D L で はなく, 酸化変性を受けたL D L が動脈硬化の進展

を誘導する という ｢酸化L D L 仮説+ を提唱した【1] . そ して , そ の後 の 知見も含め

て現在で は,こ の 過程は次の ように考えられ て い る . すなわち,

血 中L D L の血管内

皮周辺 にお ける酸化修飾, 単球の 血管内皮下 へ の 遁走と マ ク ロ フ ァー

ジ へ の 分

化, マ ク ロ フ ァ- ジ へ の ス カベ ン ジャ

ー

レセ プタ ー

を介した酸化L D L の 取り込み,

という過程で ある[2】. そ して こ の 際, 酸化L D L を取り込むス カ ベ ン ジャー

レセ プ

タ ー は, マ ク ロ フ ァー

ジ内の コ レス テ ロー

ル含量によ っ て 制御され る こ となく敬

り込みを続けるた め, マ ク ロ フ ァ-

ジ内に脂肪の 蓄積が起 こ り, 血管内皮下 で の

泡沫化細胞の 形成, 動脈硬化初期病巣の 進展 に つ なが っ て いく と考えられて い る

【礼 従っ て高脂血症の治療にお いて , 酸化L D L の もととな る血中L D L の 含量を低

く制御する だけで なく ,L D L の 酸化に対する抵抗性を高め る ことも出来れば, 血中

の L D L の ｢ 量+ お よび ｢ 質+ の 改善とい う2 つ の 観点で 動脈硬化 の進展抑御に有効

と考えられ る . 実際, 高脂血症モ デル を用い た薬物投与実験 にお い て は, 血中の

L D L 含量を低下させ るだけで なく , 更にL D L の酸化 に対する抵抗性を上昇させ る こ

とによ っ て , 優れた動脈硬化進展抑制効果が得られ る ことが報告されて い る . 【3,

4]

2

フルパスタチ ンは臓器 内コ レス テ ロ- ル合成における律速酵素である3 -

H y d r o x y-3 - m et h ylgl u t a ryl C o e n z y m e A ( H M G - C o A) 遼元酵素の 阻害薬で あり【5 ,

6 , 7] ,

他のス タチ ン系薬物 ( プラバス タチ ン, シ ンパ ス タチ ン等) と同様 に臨床で血中

脂質低下薬として 用 い られて い る . 本化合物は世界初の 全合成の ス タチ ン系薬物

であり, そ の 骨格はプラバス タテ ン , シ ンパ ス タチ ン に代表され る天然物由来の

スタチ ン系薬物とは異な っ て い る[5] . 従 っ て本化合物は主作用 の H M G - C o A 還元酵

素阻害作用以外に もそ れまで の ス タテ ン系薬物が有して い ない構造由来の薬理学

的特徴を有して い る可能性が考えられた .

近年, フ ルパ ス タチ ンの 高脂血症患者 へ の 投与は, 血中L D L 含量を低下させ るだ

けで なく ,L D L の酸化 に対する抵抗性を高める可能性があ る こ とが報告された

【8】. 既に述べ たよう に, 本作用 は血流中にお ける酸化L D L の 生成抑制という観点

から治療上有用 と思わ れる . しかしなが ら, フ ルパスタチ ン を含むス タチ ン系薬

物の, 抗酸化作用 の 検討 はそれまで ほとん どなされてお らず, そ の抗酸化作用機

序の 解明は, 高脂血症治療薬と して の 臨床における意義か らも重 要と考えられ

た.

本研究で は,i n vi v o の 動物モデル で , フルバ ス タテ ン の 投与が酸化ス トレス の 軽

減に結びつ く かを検討し, 更にi n vitr o の実験 により, そ の作用が フルバスタチ ンお

よび関連化合物の構造由来の抗酸化作用 に起因する もの であるか を検討した.

第 一 章で は, 臨床にお いて報告された フル バスタチ ン投与による 血中L D I .酸化抵

抗性の 上昇作用が , 動物モ デル( 高コ レス テ ロー ル食負荷ウサ ギ) に おい て も再現で

きることを明らか にし, 第二 章で はハ ムスタ ー

の酸化ス トレス 上 昇モ デル で , フ

ルパス タチ ンの 投与が血中脂質の酸化抵抗性 の 上昇だけでなく , 体内の酸化ス ト

レス の 軽減につ なが っ て い る ことを明らか にした . また , 第三 , 四 , 玉 章で はi n

3

vit r o の 薬物添加実験に よ っ て , フ ル パス タチ ンおよびそ の 関連化合物がL D L 酸化を

直接的に顕著 に抑制する こ とを証明した . 最後 に第六, 七 章で はフ ルパス タテ ン

が活性酸素 ( ヒ ドロ キ シ ラジカルやスー パ ー

オキシ ドア ニ オ ン) に対 して も直接

的な消去作用 を有する こ とを明らか にした.

本研究全体で , フルパス タチ ンが主薬効で ある脂質低下作用 以外に, 構造に由

来する抗酸化作用 とい う特徴を有して い る こ とを明 らか にした の で報告する .

弟 一 章 高 コ レス テ ロ ー ル食負荷ウサギにおける フ ルパ ス タテ ン の

L D L 酸化抵抗性上昇作用

序論･

フルパスタチ ン の 高脂血症患者 へ の 投与は, 血中L D L 含量を低下させ る だけでな

く,L D L の 酸化 に対する抵抗性を高める可能性がある こ とが報告され た【8] .

フルパス タチ ン の抗酸化作用機序を詳細に検討 して いくため には , まず上記作

用が ヒト以外 の動物モ デル にお いて も再現で きるか を検討する必 要が ある . そ こ

で本章で は, 高コ レス テ ロー

ル食によ っ て 高脂血症状態 に導い たウサギを用い

て, フ ルパス タチ ンの L D L 酸化抵抗性上昇作用 を検討 した .

実験材料お よび方法

1) 使用薬物

フルパ スタチ ン(ナ トリ ウム塩) および プラ バス タチ ン(ナトリ ウム塩) はサ ン ド(覗

ノバルティ ス フ ァ-

マ) より供与された. 硫酸銅はナカライ テス クか ら購入した .

他の すべ て の 試薬は市販品 の 最高純度の も の を用い た .

2) 使用動物, 投与条件

北山ラ ベ ス から購入 した雄性の 日本白色種ウサギ(8 週齢) を室温2 3 - 25 ℃ ,1 2 時間

の明暗周期下で通常食にて1 週間安定化飼育した . そ の後, 下記 の よう に群分け

し,A 群は通常食で , そ れ以外の 群は0 .5 % コ レス テ ロ

ー ル食で さらに1 週間飼育

後, 薬物投与を開始した .A : 通常食群( N = 1 2) ,

B : 0 .5 % コ レス テ ロ ー ル含有食 コ ン

トロ-

ル群(N = 1 1) ,C : 0

.5 % コ レス テロ

ー

ル含有食 十 フルパス 夕チ ン(1 m gn 'g/d ay)

秤(N - 1 2) ,D : 0 ･ 5 % コ レス テ ロ

ー ル含有食 十 フルパス 夕チ ン(3 m 〆k g/d ay) 秤(N = 1 2) ,

E : 0 .5 % コ レス テ ロー

ル含有食＋ プラバスタチ ン(3 m g k g/d ay) 秤(N = 1 2),F : 0 ･ 5 % コ

レステ ロー

ル含有食十 α トコ フ ェ ロー

ル(1 5 0 m g n ig/d ay 相当渥餌) 秤( N = 6) .C

,D

,

E 群の薬物は1 日1 回午前中に経口投与,

.F 群は渥餌投与した . 実験期間中飼料は全

て の 群で1 0 0 g/d ay/b o dy の 制限給餌とし, 摂食量の変動が生 じない よう配慮した .

3) 採血 L D L の調製

薬物の投与開始時(高コ レス テロー

ル食負荷開始1週間後) に耳静脈より ヘ パ リ ン

含有シリン ジで1 m l の 採血 をし, 速やか に冷却遠心(1 5 0 0 Ⅹ g ,1 0 m i n) して上層の 血

衆を得た . 薬物投与終了時に は,ベ ントパル ビタ

ー

ル麻酔下腹部大動脈か らヘ パ

リン含有シリ ンジで全採血 し, 同様に血衆を得た .

薬物投与開始前及び投与終了後の 血衆脂質値 の 測定は市販の キ ッ トで行い , 袷

コ レステ ロー

ルはコ レス テザイ ムV 5 5 5 (栄研化学) , トリ グリセ リドは トリ グリザイ

ム(栄研化学) を用 い た .

血衆から の L D L ( 1 .0 1 9 < d < 1 . 0 6 3 g/ m l) の分離はH a v el らの 方法【9] に準じて超遠心

法で行っ た . すなわち, 血祭に塩化ナ トリウム を添加する こ と によ り, 比重 を

d = 1 . 01 9 にした. 1 5 0 0 0 0 Ⅹ g で2 0 時間超遠心し( ペ ッ クマ ン,

X L 19 0) , 得られた浮連

層(d < 1 .0 1 9) は廃棄した . 続いて 下層部を同様にd = 1 ･ 0 63 に合わせ , さらに1 5 00 0 0 Ⅹ

g で2 0 時間超遠心し, 浮遊上層部(1 .01 9 < d < 1 ･ 0 6 3 g/ m l) を得た .L D L のタ ン/ 1

o

ク量

はB C A 蛋白定量試薬 を用 いて測定し,P B S (p H 7 .4) で蛋白量5 0 jL g/ m l にして実験に

用いた .

3) L D L の酸化

6

L D L 中の 脂質酸化 の進行度は,L D L 中の 高度不飽和脂肪酸 の酸化 的崩壊 によ っ て

生ずる共役ジ エ ン量 を,2 3 4 n m の 吸光度で経時的に測定し求めた【1 0] .

酸化の開始5 分前か ら酸化が終了する6F寺間後 までL D L (5 0 /上g/ m l) を3 7 ℃でイ ンキ

ュ- ベ

- シ ョ ン し, 酸化は終濃度で5 LL M の C u S O . を添加し開始した .2 3 4 n m の 吸

光度はD U - 65 0 ス ペ ク トルメー

ター

( ペ ック マ ン) によ っ て1 0 分毎に測定した . ラグ段

階の終了時間( ラグタイム) , 共役ジエ ン量が最大値 を示す時間( マ ッ クス タイム)

は, 常法どおり吸光度 の経時変化の グラフ か らそれぞれ求め, 酸化開始時におけ

るグラ フ の 接線と, 第二 段階を通る直線の交差する時間をラグタイム , グラフが

極大値をとる時間を マ ッ クスタイム とした .

4) 血衆中の フルパス タチ ン, α トコ フ ェ ロー

ル濃度

血衆中の フ ルパ ス タチ ン濃度【1 1] および α トコ フ ェ ロー ル濃度【1 2] は高速液体ク

ロ マ トグラ フ ィー で既報に従 っ て 測定した .

5) 統計処理

デ ー

タは平均 ±標準誤差で 示 した(N = 6 - 1 2) . 正常群と高コ レス テ ロ ー ル食負荷 コ

ントロ-

ル群の2 群比較はSt u d e nt-

s t -t e st, 高コ レス テ ロ

ー ル食負荷コ ント ロ- ル群

における薬物 の作用 の 多群比較は一 元配置の 分散分析 によ っ て行 い , 有意差が認

められた場合はT u rk e y一 散 a m m e r

-

s t e s tある い は M a n n - W hit n e yt

s t e st に より検定した .

危険率が5 % 以下の 場合を有意差ありとした.

結果

1) 体重変化, 血中脂質含量

薬物の 投与は何れも こ れらの 動物の 体重変化 に大きな影響を与えなか っ た .

7

T a bl el - 1,1 - 2 に薬物投与開始前後の血衆中総コ レス テ ロ

ー ル 量, トリ グリセリ ド量

をそれぞれ示 した . 高コ レス テ ロー

ル食の負荷 により血衆中脂質含量は顕著な上

昇を示した . フルパス タチ ン, プラバスタチ ン投与群で は総コ レス テ ロー

ル , ト

リグリセリド含量力亨若干低下する傾向,α トコ フ ェ ロ

ー

ル投与群で は総コ レス テ

ロー ル含量が上昇する傾向を示 したが , 何れ も有意な作用で はなか っ た. どの薬

物投与群も, 正常コ ン トロー

ル群と比較して 明らかな高脂血症状態が維療されて

いた .

2) L D L の酸化抵抗性

薬物投与が高脂血症ウサギのL D L の酸化抵抗性に与え る影響をe x vi v o の鋼誘発

L D L 酸化実験で 解析した . Fig . 1 -1 に各群の L D L 酸化 の 典型的パ ター

ンを,T a bl e 1 - 3

にそれぞれ の グラフ か ら得たラグタイ ムおよび マ ックス タイ ム を示 した . フル パ

スタチン投与群で は,L D L の 酸化抵抗性が用量依存的に上昇して お り, その作用 は

3 m gn (g/d a y 投与群で有意で あ っ た . また, 陽性対照として 用 いた抗酸化物質の α

トコ フ ェ ロー

ル の 投与群で は, 顕著な ラグタイ ム , マ ック ス タイ ム の延長効果が

認められた .

一 方他の H . M G - C o A 還元酵素阻害薬で ある プラ バス タチ ンの 投与で は

有意な変化は認められなか っ た .

3) 血衆中 α トコ フ ェ ロー

ル含量

T a bl e 1 - 4 に血衆およびL D L 中の α トコ フ ェ ロー

ル含量牢示 した ･ フ ル パスタチ ン

およびプラバス タチ ン の 投与は共に血衆中 α トコ フ ェ ロー

ル含量に変化を与えな

か っ たが ,L D L 中の α トコ フ ェ ロ

ー ル含量に関して は有意で はな い もの の 増加させ

る傾向を示 した . 予想され る通り,α トコ フ ェ ロ

ー ル投与群で は血衆中,L D L 中

8

T a bl e 1 - 1 P l a s m a t o t al c h o el st e r ol l e v el s i n n o r m al a n d h i ghc h ol e st e r ol di et fe d r a b bit s t r e a t e d w ith t e s t c o m p o un d s

T r e at m e n t

Pla s m a t o t al ch ol e st e r ol ( m g/dl)

O w 4 w

N o 凪 al

C o n t r ol

Fl u v a s t a ti n (1 m g/k g)

Fl u v a s t a ti n (3 m g/ k g)

P r a v a s t a ti n (3 m g/k g)

α- T o c op b e r ol ( 15 0 m g/k g)

3 7 .8 ± 3 .0

4 8 1 . 0 ± 1 3 1 . 7

4 7 6 . 8 ± 1 44 . 0

4 7 7 .8 ± 13 2 .8

4 7 7 . 7 ± 14 1. 7

4 83 .3 ± 12 9 .7

1 6 .2 ± 1 .6

12 4 5 ･4 ± 9 5 .2

1 04 0 .2 ± 1 0 0 .5

9 1 2 .1 ± 6 5 .5

11 29 .3 ± 1 1 4 .0

1 6 2 1 .3 ± 3 0 5 .0

m e a n s ± S E .

T a ble l ･ 2 Pl a s m a t ri gl y c e rid e le v els i n n o r m al a n d hi ghc h ol e s t e r ol diet fe d r a b bit s t r e at e d w ith t e s t c o m p o u n d s

T r e at m e n t

Pl a s m a T rigly c e rid e ( m g/dl)

O w 4 w

N o 凪 al

C o n t r ol

Flu v a s t a ti n (1 m g/k g)

Fl u v a s t a ti n (3 m g/ k g)

P r a v a s t a ti n ( 3 m g/k g)

α- T o c op h e r ol( 15 0 m g/k g)

5 0 .7 ± l l . 0

3 0 ･ 1 ± 1 6 . 2

3 7 .5 ± 1 5 . 0

3 2 ･ 1 ± 18 . 5

28 .3 ± 8 .7

2 2 .0 ± 1 6 .6

4 4 . 6 ± 2 0 .6

1 03 - 7 ± 4 0 .6

93 . 6 ± 3 3 .7

9 8 .2 ± 5 2 .3

8 6 .9 ± 29 .7

7 7 .8 ＋ 36 .3

m e a n s ± S E .

9

育貞

寸rr)N

ヽヽ

_. /

4)U

莞oAh¢(刀

A

A

1

5

1 0 C o n t r ol

＋ F lu l m g此g .

i F lu 3 m en (g

～ p r a 3 m g n (g

＋ α ･ T o e 1 5 0 m g/k g

6 0 1 2 0 1 8 0

T i m e ( m i n)

F ig . 1 ･ 1 E ffe ct s o f n u v a s t ati n (F h l) , P r a V a St a ti n (P r a)I

a n d α -t o c o p h e r ol ( α ･ T o c) o n L D L o xidi z a bility

i n hi gh c h ol e st e r ol di et f e d r a b bit

L D L (5 0 LLg/ m l) is ol at e d fr o m e a ch pla s m a w a s i n c u b at e d

i n P B S (p H 7 ･4) at 3 7o

C w ith C u S O4 (5 LL M ) ･ G r ap h

s h o w s t h e r ep r e s e n t ati v e d at a .

T a bl e l ･3 E ff e ct s of fl u v a st a ti n , p r a v a s t a tin a n d α ･t o c o p h e r ol

o n tll e p a r a m et e r s O f L D L o xid a ti o n

T r e at m e n t N L ag ti m e ( m in) M a x . ti m e ( m i n)

C o ntr ol

Fl u v a s t a ti n ( 1 m g 瓜g)

F lu v a st ati n ( 3 m gn ( g)

P r a v a st ati n ( 3 m g 化g)

α- T o c o p h e r ol( 1 5 0 m g/k g)

l l

1 2

1 2

1 2

6 5 .6 ± 3 . 1

7 7 .5 ± 3 .8

86 . 2 ± 4 .3 *

6 7 .9 ± 6 .1

1 6 1 .7 ± 6 .8 *

15 5 .0 ± 7 .4

1 7 0 .0 ± 6 .5

18 0 .0 ± 5 .2*

16 0 .8 ± 5 .8

> 2 40 *

m e a n s ± S E･

*: p < 0 ･ 05 v s C o n t r ol ･

1 0

T a bl e 1 -4 α ･ T o c o p h e r ol le v els i n p l a s m a a n d L D L aft e r d n lg-t r e a t m e n t

T r e a t m e n t Pl a s m a (LLg/ m l) L D L (LLg/ m g p r o t ei n)

C o n tr ol

Flu v a s t ati n (1 m g/k g)

Fl u v a s t a ti n (3 m g/k g)

P r a v a s t a ti n (3 m g 収g)

α- T o c op b e r ol( 15 0 m g/k g)

2 0 .8 9 ＋ 1 .7 1

2 0 . 2 9 ± 1 .6 4

1 8 .7 8 ± 1 .7 8

1 9 .5 1 ± 1 .6 0

2 . 4 9 2 ± 0 .4 8

3 . 3 2 5 ± o .4 0

3 . 7 7 3 ± 0 .4 1

3 .3 7 3 ± 0 .4 1

1 5 2 . 53 ± 2 0 .55 * * 3 2.5 2 2 ± 1

.05 * *

m e a n s j = S E . ,

* *: p < 0 .0 1 v s C o n tr ol

1 1

の α トコ フ ェ ロー

ル含量は顕著に上昇して おり, コ ン トロー

ル群と比較してそれ

ぞれ約7倍,1 3 倍で あ っ た .

4) 血衆中フ ルパ ス 夕チ ン含量

フルパス 夕チン 3 m g化g/ d a y , 4 週間 投与群における最終投与終了3 0 分後の 血中フ

ルパス夕チ ン濃度を測定 したと ころ ,1 4 5 6 士 2 0 4 n g/ m l(3 .

3 6 ±0 .4 7 LL M) で あ っ た .

考察

本章で は, 臨床で報告されたフ ルバ スタチ ン の投与に よ るL D L 酸化抵抗性上昇作

用が, 動物モ デルにおい て も再現で きるか を, 高コ レステ ロ

ー

ル負荷ウサ ギを用

いて検討した .4 週間の フルパス タチン の投与はL D L 酸化 における ラ グタイム , マ

ックス タイム を有意に延長 し, 本薬物の 投与がL D L の酸化抵抗性 を上昇させる こ と

を, 動物モデル によ っ て も再現する こ とがで きた .

一 方, 他 のtI M G - C o A 還元酵素

阻害薬で あるプラバス タチ ン の 投与で は変化が認 められなか っ た こ とから, 本作

用はH M G - C o A 遭元酵素阻害薬に共通 に認められ る脂質代謝を介した作用 による も

のではなく, 別の 因子が 関与して い るも の と考えられた .

一

般にL D L の酸化抵抗性は L D L の 脂質組成や α トコ フ ェ ロー

ル等に代表される

L D L 中抗酸化物質量によ っ て変化する[1 3] . フルパ スタチ ン の作用メカ ニ ズム を解

析するた め, まず,L D L 中の 脂質組成を予備的に解析したが, 各群 の L D L 中脂質,

脂肪酸組成に薬物投与に よる変化は認められなか っ た . 次に抗酸化物質の代表と

して , 血中およびL D L 中の α トコ フ ェ ロー ル含量を比較 した . α トコ フ ェ ロ

ー

ル投

与群の 場合, 血中,L D L 中め α トコ フ ェ ロ

ー

ル含量は顕著 に上 昇して おり, これが

本群にお けるL D L の酸化抵抗性上昇作用 に直接寄与して い る こ とが考え られた.

一

方, フ ルパ スタテ ンや プラバス タチ ン の投与は α トコ フ ェ ロー ル含量 を有意に変

1 2

化させ なか っ た ･ 従 っ て , フルパ ス タチ ン投与によ っ て 引き起 こされ たL D L の 酸化

抵抗性上昇作用 は α トコ フ ェ ロー ルの 代謝等を介して起 こされた も の で はなく ,

それ以外の因子 , すなわち化合物の 直接的な抗酸化作用が寄与したもの と考えら

れた.

興味深い こと に, 高脂血症患者 にフル パス タチ ンを投与した際に認 められたL D L

酸化抵抗性上昇作用【8】は, ウサギを用いた今回の 実験で検出された作用 よりも明

らかに強力なもの で あ っ た(4 0 m g h o dy/ d a y ,2 4 週投与で ラグタイ ム2 ･5 倍 に延長) . こ

の原因を解明する ため, ウサギおよび ヒ トにおける フ ル パス タチ ン の 代謝物【1 5】の

比較を行っ たと こ ろ, 効力の 違い はウサギと ヒ トにお ける フルパス タチ ン の代謝

変化の種差に起因する もの と考えられた . すなわち, フルバス タチ ン はヒ トにお

いて は, 水酸化代謝物であるM 2,M 3 を生じ[1 5] ,

これらもi n vi v o で の抗酸化作用 に

大きな寄与をして い る と予想され るが , ウサ ギで はM 2,M 3 がほとん ど生じない た

め代謝物の抗酸化作用 へ の 寄与が小さくなる 結果, 総合的なin viv o で の抗酸化作用

が出にくく なる と考えられた . し■か しながら,

こ の ような動物モ デル にお いて も

フルパス タチ ン の 投与はL D L の酸化抵抗性を有意に上昇させ る こ とが 再現された .

1 3

小括

臨床で報告されたフ ル パス タチ ン投与によるL D L 酸化抵抗性上昇作用が , 動物モ

デルにおいて も再現され るかを, 高コ レステ ロ ー ル負荷ウサギを用 いて検討し

た. フルパス タチ ン3 m gn (g/d ay の4 週間授与は,L D L の酸化 における ラグタイ ム ,

マ ックスタイ ム を有意に延長し, 酸化抵抗性の 上昇作用は こ の ような動物モ デル

においても再現され る ことが明らか とな っ た .

陽性対照として 用い た天然抗酸化物質 α トコ フ ェ ロ ー ル の 投与は ,L D L の酸化抵

抗性の 上昇に結び つ い たが , 他の H M G - C o A 遭元酵素阻害薬プラバ ス タチ ン の投与

で は変化 は認められなか っ た . 従 っ て , フル パス タチ ン投与によ るi n viv o で の L D L

酸化抵抗性上昇作用は,H M G - C o A 遼元酵素阻害薬に共 通 の脂質代謝改善作用 とは

別の 因子が関与して おり ,これが化合物の直接的な抗酸化作用で ある こ とが示 唆

された【1 6,1 7】.

1 4

第二 章 ビタミ ンE 欠乏ハ ム ス タ ー における フ ルパ ス タテ ンの酸化ス ト

レス 上昇抑制作用

序論

第 一 章で は, フルパ ス タチ ンのi n viv o で の抗酸化作用を, 高脂血症状態に尊い た

ウサギの血中L D L の酸化抵抗性上昇作用で検討した .

本章で はフ ルパス タチ ン のi n vi v o で の抗酸化作用を更に詳細に検討するため, 酸

化ストレス の 先進モ デル である どタミ ンE 欠乏食負荷 ハ ム ス ター を用 いた検討を行

っ た【1 8] . そしてそ の評価法として は, 血 剰旨質め酸化抵抗性だけで なく , 酸化ス

トレスマー

カー として血中ペ ルオキシ ド【1 9

,2 0] ,

8 - e pi-

p r o st a gl a n di n F 2 α( 8 - epi-

P G F 2 α)[21] 等も利用し, 解析を進めた .

実験材料お よび方法･

1) 使用薬物

フルパス タチ ン(ナ トリウム塩) およびプラバス タチ ン(ナ トリ ウム塩) はサ ン ド(覗

ノバルティ ス フ ァー

マ ) より供与された. X yle n ol O r a n g e はシ グマ , 硫酸ア ンモ ニ

ウム鉄(JI) 六水和物はナカライテス ク,T r ol o x はアル ドリ ッ チか ら購入 した･ すべ

ての試薬は市販品の最高純度のもの を用いた .

2) 使用動物, 投与条件

日本S L C か ら購入 した雄性のS y ri a n 系 G old e n h a m st e r (8 週齢) を室温2 3 - 2 5 ℃ ,1 2

時間の 明暗周期下 で通常食にて1 週間安定化飼育後, 下記の よう に群分けした .A :

通常食群(N = 1 0) ,ち: ビタ ミ ンE 欠乏食コ ン トロ

- ル群( N = 1 0) ,C : ビタ ミ ンE 欠乏食十

フルパ スタチ ン(0 . 0 0 1 % 渥餌,0 .5 m g n (g 相当) 秤(N = 9) ,

D : ビタ ミ ンE 欠乏食十 フル

1 5

バスタチン(0 . 0 0 3 % 渥餌,1 ･5 m g a g 相当) 秤(N - 9),

E : ビタ ミ ンE 欠乏食十 プラバ ス

タチ ン(0 .0 0 3 % 渥餌,1 ･5 m gn ig 相当) 秤( N - 9) ,

F : ビタミ ンE 欠乏食＋ プロ ブコ- ル

(o .1 2 % 渥餌,6 0 m g k g 相当) 秤( N - 9) ･

A 群は通常食, 他の群は ビタ ミ ンE 欠乏食を2

カ月間前負荷した後, 薬物を上記の ようにそれぞれ1 カ月 間投与 した . なお通常食

としてはオリ エ ンタル酵母 の O Y C 改変A I N -9 3 M 飼料を用 い ,こ の 組成か らどタ ミ

ンE の みを除い たもの をビタミ ンE 欠乏食とした . 摂餌量は安定して おり,7 ･5

d d ay/b o dy で あっ た ･

投与終了後, エー

テル麻酔下 ヘ パ リ ン含有シ リン ジで全採血 し, 直ち に遠心し

た(1 50 0 Ⅹ g ,1 0 m i n) . 上層の 血衆は速やか に凍結保存した( - 8 0 ℃) i

3) 血衆中脂質,ビタミ ンE 含量の測定

血祭中脂質含量は下記の キ ッ トを用い , 酵素法で測定した . 総コ レス テ ロー ル

( コ レステザイムV 55 5, 栄研化学) , リ ン脂質(リ ン脂質C テス トワ コ

-

, 和光純薬) ,

トリグリセリ ド( トリ グリザイム , 栄研化学) . ビタミ ンE 含量の 測定はE P L C 法で 測

定した【1 2】.

4) 血衆酸化抵抗性の解析【2 2]

u v 用9 6 穴プレ ー トを0 .1 % T w e e n 2 0 に1 時間浸 した後, 乾燥した . 室温下P B S で

3 % に調製した血衆に硫酸銅(5 0 LL M) を添加 し, 酸化 を開始した . 酸化の 進行度は血

衆中の脂質過酸化により生ずる共役ジエ ン を2 3 4 n m の 吸光度で経時的に測定して

評価した . 吸光度変化か ら算出する/てラメ 一 夕 -

は, 酸化進行速度および酸化終I

了時間とし, 前者は酸化 の連鎖成長段階(第2 段階) を通る直線の傾きか ら求め , 後

者はこ の 直線と終了段階( 第3 段階) を通る接線の 交点か ら求めた.

1 6

5) 血衆中ペルオキシ ド含量[1 9 , 2 0】

w olf らの報告したF O X 法を改良して 用い た . すなわち,1 0 0 LL M X yl e n o1 O r an g e

,

25 0 LL M F ez( N H .)( S O .) 2 ,

1 m M T r ol o x･

,25 m M H 2S O . を精製水 で調製し,

こ れを試液

とした. 本試液(4 7 5 〟1) に血衆(2 5 〟1) を混合し, 室温で6 0 分間反応させた . 反応

液の濁りの 影響を除くため主波長5 6 0 n m の 他に副波長7 0 0 n m の 吸光度を測定し,

その差ス ペク トルか ら検体 の値を求め, 過酸化水素で 引いた検量線を利用 して定

量した.

6) 血衆中8 - e pi- P G F 2 α 含量【2 3]

血衆に0 . 05 % B H T を添加し, 測定暗まで - 8 0 ℃ で保存した . 内部標準物質(Ⅰ.S .)

【2

H 4] - 8 -

e pi- P G F 2 α の1 n g を試験管に添加 し, 血衆試料(3 5 0 /1 l) を加 え , 溶液をp H 3

にし, 活性化した エ ム ポエ ディ ス クカー

トリ ッ ジカラム C 1 8 S D オク夕デ シル

( ジ ー エ ルサイ エ ンス) にかけた. 1 m 如 H C 1 5 0 0 LL l ,へ ブタ ン 5 0 0 LL l で 洗浄後,

1 %

メタノ ー ル含有の酢酸 エ チル 1 m l で 溶出し, 窒素ガス で 濃縮乾閲した . 残査は

H P L C の初期移動相に溶解し, フ ィ ルタ ー

( 0 .4 5 LL m ) 波過後,L C/ M S 試料とした .

測定法はE S I(El e ctr o sp r a y i o ni z ati o n) - L C M S とし, 質量分析計には4 - セクタ ー

型 の

マ ス ステ ー シ ョ ンJ M S - 7 0 0 T (J E O L) を, 高速液体ク ロ マ トグラ フ ィー にはH P l l O O シ

ステム(H e w l ett P a ck a rd) を用 いた . 移動相には0 .1 % 酢酸およびアセ トニ トリル を用

い, 溶出条件は7:3 のイ ソクラティ ツ クで行 い

, 流速は0 .3 5 m l 血1i n とした . カラム

はS y m m etry C 8 4 . 0 Ⅹ 1 5 0 m m,5 〝 m ( W at e r s) を用 い , 温度は室温と した .

S I M 条件にl

おいて , 【M -

町 として m / z 3 5 3 .2 4 (8 - e pi- P G F 2 α) ,

班/ z 3 5 7 ･2 6 (Ⅰ･S ･) の イ オンをモ ニ

ター

した . ク ロ マ トグラム 上 の8 - e pi- P G F 2 α の ピ -

クとⅠ･S ･ ピ ー

ク との 面積比 を算

1 7

出し, 相対検量線より算出した ･

7) 統計処理

正常群とビタミ ンE 欠 乏食負荷コ ン トロ- ル群の2 群比較はS t u d e n t

'

s t -t e s t, ビタミ

ンE 欠乏食負荷群における薬物の作用 の 多群比較はD u n n ett-

s t e s t で 行い, p < 0 ･05 を

有意菱ありとした .

結果

1) 体重変化 , 血衆中ビタミ ンE, 脂質含量

正常群,ビタ ミ ンE 欠乏食負荷群とも, 期間中わずかな体重 増加を示 した . 各薬

物はいずれも摂餌量にほとん ど影響を与えず( 約7 .5 gn ) od y/d a y) , 体重推移もコ ン ト

ロー

ル群と同様で あっ た .Fig . 2 -1 に血衆中の脂質含量を示 した . 総 コ レス テ ロ

ー

ル, リ ン脂質に関 して は正常群,ビタミ ンE 欠乏食負荷コ ン トロ - ル群で差は認 め

られず, また , 薬物投与に よる影響もなか っ た . トリ グリセリ ドに 関して は どタ

ミ ンE 欠乏食負荷コ ン トロ-

ル群で有意な上昇(約1 ･5 倍) が認め られ , フ ルパ ス タ

チン投与群で は有意で はないが抑制傾向が認められ た.

一 方プラバ ス タチ ン, プ

ロブコ - ル の 投与群で は, 変化は認められなか っ た .Fi g . 2 - 2 に血衆ビタ ミ ンE 含量

を示した . 血衆ビタミ ンE 含量は ビタミ ンE 欠乏食負荷群で約1/1 0 ま で効果的に低

下して いた . 全般的に薬物投与により､ ビタミ ンE 含量はわずかなが らさ らに減少

する傾向を示 した . フ ルパス タチ ン投与群における作用 は有意で あ っ たが, 用量

依存性は認め られなか っ た .

2) 全血衆の 酸化抵抗性

1 8

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t rigl y c e rid e ( B) a n q p h o s p h olipid ( C) i n

V . E .- d eficie n t h a m st e r s

V alu e s a r e m e a n s ± S E (N = 9 - 1 0) .

N o m al g r o up ( m g/dl): ( A) 14 7 ±7 , (ち) 2 6 7 ±2 8 , (C ) 26 8 ±9 .

1 9

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p r o b u c ol (P r o b) o n pl a s m a α-t o c o p h e r ol le v el i n

V . E .

･ d eficie n t h a m st e r s

V al u e s a r e m e a n s ±S E ( N = 9 - 1 0) . N o r m al g r o up O L M ) : 4 4 ･1 ±1 ･ 8 ･

*: p < 0 ･ 05 v s C o n tr ol ･

2 0

w h ol e pla s m a o xidiz a bility m et b od を用 いて , ビタミ ンE 欠乏食負荷ハ ムス ター

の 血

衆中脂質の酸化抵抗性の 比較を行 っ た ･ Fig ･ 2 - 3 にそ の 結果 を示す･ ビタ ミ ンE 欠

乏食群で は正常群と比較 して血祭脂質が顕著に酸化され易くな っ て おり , 酸化進

行速度は約2 倍, 酸化終了まで の時間は約1/3 に な っ て いた . また , フ ル パス タチ ン

の投与は用量依存的に血衆の 脂質過酸化を抑制し, そ の効果 は高用 量群(0 ･0 0 3 %) で

陽性対照の プロ ブコ - ル(0 ･1 2 % ) 投与群とほぼ同等で あっ た .

一 方, 他の H M G - C o A

還元酵素阻害薬プ ラバ ス タチ ン の 投与群で は有意な作用 は認 められなか っ た ･

3) 血衆中ペ ルオキシ ド含量

ビタミ ンE 欠乏食負荷 ハ ム ス タ- の血衆中ペ ル オキ シ ド含量の 比較を行 っ た結果

をFig .2 - 4 に示す. ビタミ ンE 欠乏食負荷群で はペ ルオキ シ ド含量の有意な上昇(1 ･6

倍) が検出された . フルパ スタチ ン投与群で は強力な べル オキシ ド含量の低下が認

められ 特に高投与量群(0 .0 03 %) で はほぼ正常化 して い た . 陽性対照で あるプロ ブ

コ - ル(0 .1 2 %)投与群で も同様に強力な低下作用が認め られたが , 他 の H M G - C o A 遷

元酵素阻害薬プラバ ス タチ ンの 投与で は有意な変化 は認め られなか っ た .

4) 血衆中8 -

epi- P G F 2 α 含量

酸化ス トレス マー カ ー として 注目されて い る8 - e pi

- P G F 2 α の 血衆中含量をL C/ M S

を用い て測定した . 結果 をFig . 2 - 5 に示す. ビタミ ンE 欠乏食負荷群で は本 マー

カー

の 有意な上昇(1 .5 倍) が検出された . フルパス タチ ン投与群で は用量依存的な低下が

認められ 低用量群(0 .00 1 %) で も正常よりやや低い レベ ル まで低下 して い た ･ 陽性

対照であるプロ ブコ-

ル( 0 .1 2 %) および他のH M G - C o A 遼元酵素阻害薬プラバスタチ

ンの 投与も有意な作用 を示 したが , そ の作用はフルパ スタチ ン投与群における作

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p r o b u c ol (P r o b) o n w h ol e p l a s m a o xidiz a bilit y i n

V . E .- d e TI Cie n t h a m st e r s

( A) T y pi c al tr a ci n g s of th e e x p e ri m e n t s, (B) M a x ･ r at e o f o x id ati o n ,

( C) E n d tiヮe Of o xid ati o n

T h e i n c r e a s e of c o nj u g at ed di e n e f o r m ati o n w a s m e a s u r e d b y th e

ab s o rb a n c e at 2 3 4 n m . Pl a s m a (3 % ) w a s i c ub at e d i n P B S (p H 7 .4)

at 2 5o

C w ith 5 0 u M C u S O4

･ V al u e s a r e m e a n s ±S E 即 = 9 - 1 0) ･

N o r m al g r o u p : (追) 0 .1 2 ± 0 .0 1 , (C) 2 0 7 ±7 .

*: p < 0 .0 5 v s C o n tr ol .

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V . E .･ d eficie n t h a m st e r s

V al u e s a r e m e a n s ±S E ( N = 9 -1 0) .

N o 皿 al gr o u p ( n m ol/ m l): 3 . 1 ± 0 . 2,

*: p < 0 . 05 v s C o n tr ol .

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p r o b u c ol (P r o b) o n p l a s m a 8 - e pi- P G F 2 α l e v els i n

V . E.

- d efi cie n t h a m st e r s .

V al u e s a r e m e a n s ±S E (N = 9 - 1 0) . N o r m al g r o u p (p g/ m l): 8 1 .0 ± 4 . 4 .

*: p < 0 . 05 v s C o n t r ol .

2 3

用よりも弱い もの で あ っ た ･

考察

ビタミ ンE は体内で重要な脂溶性抗酸化物質 として ビタ ミ ン C, グルタチオ ン等

の水溶性抗酸化物質と相補的 に働 き, 体内を酸化 ス トレスか ら防御 して い る ･ ビ

タミンE は体内で は合成され ないた め, 食餌中の どタミ ンE を欠乏 させ る こ とによ

り, 実験的に容易 に欠乏状態に導く こ とがで き【2 4] , その長期欠乏は , 体内の 酸化

ストレス の 上昇, ラジカル反応による組織, 細胞障害, 代謝変動等 を引き起 こす

ことが知られて いる【2 4 ,2 5] . 本実験で はフ ルパ ス タチ ン の酸化ス トレス 上昇抑制

作用をさらに解析するため ,ハ ム スタ

ー の ビタミ ンE 欠乏食負荷モ デル を使用 し

た.

薬物のi n viv o で の抗酸化活性の 指標として は, 前章で は血衆中 のL D L を単離 し,

それぞれの 酸化抵抗性を比較する方法【1 0] を用 いた . 本法はe x vi v o の 実験法として

最も普及して い るが ,L D L の 調製の ために長時間の超遠心 操作が必要なた め､ 処理

中の ア ー ティ フ ァク トの 生成, 内因性抗酸化 物質 の 消失等が懸念され る ことがあ

っ た【13 ,2 2] . そ こ で本実験で は, こ の方法に変わ るア ッ セイ法として

, 全血衆脂

質の酸化抵抗性【2 2】を測定した . 本揺で は血衆中の 水溶性抗酸化物質 に対する影響

を含めて 評価で きる . また , 超遠心操作によ る抗酸化物質の 消費お よびアー

テ ィ

フ ァクトの生成を除外で きる利点がある . 本法で 測定した結果, ビタミ ンE 欠乏時

における血祭脂質 の酸化抵抗性の低下および , フ ル パス タチ ン投与に よる 改善効

果を検出する ことが で きた . また , 陽性対照として用 いた プロ ブコ-

ルの 投与群

ではフルバスタテ ン投与群と同様の血中脂質の 酸化抵抗性上昇が認め られたが,

他の H M G - C o A 遭元酵素阻害薬プラバ ス タテ ン の投与群で は, 作用 は認められ なか

2 4

っ た.

本章で は, 血祭脂質の 酸化抵抗性の 解析 に加えて , 血流中で実際に 生じて い る

脂質過酸化 の 進行度を示す指標として , 新規の酸化ス トレス マー

カ-

【2 6] で あ る8 -

e pi- P G F 2 α お よび血衆中の ペル オキシ ド含量の 測定も行 っ た ･ こ れ らの物質は共

に, 生体内の ラジカル反応によ っ て 生じる酸化生成物で あり , 体内の 酸化ス トレ

スに応じて血衆中の 含量が上昇する ことが知られ て い る【2 6] . 本実験にお いて も,

ビタミ ンE 欠乏食負荷群で は血衆中ペ ルオキシ ド含量,8 - e pi

- P G F 2 α 含量の 上昇が

検出さ れ 酸化ス トレス の 上昇が示唆された . また , フルパ ス タチ ンやプロ ブ

コ-

ルの 投与はこ れ らの パ ラメ - 夕 の 上昇を顕著に抑制したが, プラバ ス タテ ン

投与による作用は弱い も の であ っ た .

フルパス タチ ン の 投与は血衆の ビタミ ンE, トリグリセリ ド含量に若干影響を与

えたが,これ らの動きは酸化 ス トレス マ

ー

カー

の 変動と比較してそ れほ ど顕著な

もの で はなか っ た . 従 っ て フルパス タチ ン投与群に認め られた酸化ス トレス の 軽

減効果は, 脂質, ビタミ ンE の代謝等を介した二 次的な もの で はなく , 構造由来 の

直接的な抗酸化作用 による もので ある と考え られた .

各種評価系間 の 比較で は, フ ルバ ス タチ ン及 びプロ ブコ - ル の投与におい て 認

められた血衆中ペル オキシ ド含量 ,8 - e pi

- P G F Z α 含量の 強力な低下と比較して ,こ

れらの薬物投与によ る血衆脂質酸化抵抗性の 改善作用は弱いも の_

で あっ た . これ

は前者が生体内で既 に起 こ っ た酸化の 結果を示 して い る の に対 し[2 6】, 後者はラジ

カル反応に対する血衆単独の 酸化に対する抵抗性を比較して い る とし子う[2 2] , 測定

項目の意義的な違い に関係して い ると思われ る . 生体内で は酸化ス トレス に対し

血衆が孤立して働 いて い るわけで はなく, 血球, 臓器等を含めて , ラジカル, 抗

酸化物質の代謝, 再生が常に活発に行われ て い る こ と【2 4] を考慮する と, 実際に起

2 5

きた変化 を捉えて い る点で生理的な意義は前者の方が高い と考えられた .

2 6

小括

フルパス タテン投与によるin vi v o で の抗酸化効果 をより明確にする 目的で,

ビタ

ミンE 欠乏食負荷ハ ム ス ター にお ける フル パ ス タチ ン の 酸化ス トレス 上昇抑制作用

を検討した .

ビタミ ンE 欠乏食投与群で は, 血衆中ペ ル オキシ ド,8 -

epi- P G F 2 α 含量の 有意な

上昇および血衆の酸化抵抗性の低下が認め られ 体内で酸化ス トレス が上昇して

い ることが示唆され た. フルパス タチ ン , プロ ブコ-

ル投与群で は酸化ス トレス

マー カ ー が顕著に改善され 特にペルオキ シ ド,

8 -

epi- P G F 2 α 含量に関して は , ほ

ぼ正常化 して いた .

一 方プラバス タチ ン投与群にもパ ラメ ー タの改善傾向は認め

られたが, 全体と してそ の作用は弱か っ た .

本実験により フル パ ス タチ ン の 投与は体内の酸化 ス トレス の 軽減 に つ なが る可

能性鰯重く示唆された. そ して そ の効果は , 他の H M G - C o A 還元酵素阻害薬 プラバ

スタチ ンの 投与で は弱く , 抗酸化薬プロ ブコ-

ル の投与で認 められ た こ とか ら,

化合物の 抗酸化 特性 に主 に由来する もの と考 えられた【2 7] .

2 7

第三 章 フル パ ス タチ ン のin vitr o における銅誘発L D L 酸化抑制作用

序論

動脈硬化 初期病巣の進展 に は, 血中の 未変化L D L が関与して い る の で はなく ,

酸化変性したL D L が重要な役割を担 っ て い る と考えられて い る[1] ･ 酸化u ) L を取

り込むマ クロ フ ァー

ジの ス カベ ンジャー

レセ プタ-

は, 内部 の コ レス テ ロー

ル含

量によっ て制御される こ となく酸化L D L の 取 り込み を続ける ため ,マ ク ロ フ ァ

-

ジ

内に脂肪の 蓄積が起 こ り, 血管内皮下で の 泡沫化細胞の 形成, 動脈硬化初期病巣

の進展につ なが っ て いく と考えられて い る . また免疫組織学的検討 におい て は,

動脈硬化病巣に酸化L D L が存在して い る ことが証明されて い る【2 8,2 9] . さ らに,

抗酸化其の 投与が血中の L D L の酸化抵抗性を高め , それが動脈硬化病巣の 進展抑制

作用につ なが っ て い る こ とを示すデ ー タも報告されて い る こ とか ら【3,4] , 血中 の

L D L の酸化抵抗性を高める こ とは, 動脈硬化の危険を軽減する観点か ら重要と考え

られる .

フルパ スタチ ンは臨床で使用された初の 全合成のⅢ M G - C o A 遭元酵素阻害薬で あ

り, そ の基本骨格は, それ まで に開発された菌類の 代謝産物 由来のH M G - C o A 選元

酵素阻害薬 ( プラバス タチ ン, シ ンパ ス タチ ン等) とは大きく異な っ て い る【5]

(Fig . 3 -1) . 前者はメバ ロ ン酸類似の側鎖とフ ルオ ロ フ エ ニ ルイ ン ド ー

ル骨格か らな

っ て い るが, 後者はメバ ロ ン酸類似 の側鎖とハイ ドロ ナ フタ レン骨格を基本構造

に有して い る . 従 っ て フル パスタチ ンは主作用 で あるⅢM G - C o A 遼元酵素阻害作用

以外にも固有の 構造に由来する他の薬理学的特徴を有して い る可能性がある と思

われた .

本章で は, フ ルパ ス タチ ン の構造由来の抗酸化作用 の 解析 の第 1 段階として ,i n

2 8

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S i m v a s t ati n

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F ig . 3 - 1 S t r u ct u r e s o f H M G - C o A r e d tl Ct a S e i n hibit o r s

2 9

vitr o における銅誘発L D L 酸化抑制作用 を検討 した.

実験材料およ び方法

1) 使用薬物

フルパスタチ ン(ナ トリ ウム塩)および プラバ ス タテ ン( ナ トリウム 壌) はサ ン ド(覗

ノバルティ ス フ ァー

マ ) より供与された . フルパ ス タチ ン の 還元体は田辺製薬医薬

育成研究所で合成され た . B C A 蛋白定量試薬 はPi e r c e, α トコ フ ェ ロ

ー ル はナカ ラ

イテスク,2

,2

--

a z o bis( 2 -

a mi din op r op a n e) dih y d r o chlムri d e (A A P H) は和光純薬か ら購入

した. すべ て の 試薬は市販品 の最高純度の もの を用 いた .

2) L D L の採取

ヒトL D L ( 1 .0 1 9 < d < 1 .0 63 g/ m l) の 分離はH a v el らの 方法【9] に準 じて超遠心法で行

っ た. すなわち , 健常人ボラ ンテ ィ アか ら採血 を行い, 全血 に対して0 . 0 5 % E D T A

及び0 .0 5 % N a N 3 を添加し,1 5 0 0 Ⅹ g で1 0 分間遠心 して 上層 の血衆 を得た. 血衆に対

してベ ンザミ ジン(終濃度 1 m M) , ゲン夕 マイ シ ン( 終濃度1 0 LL g/ m l) を添加し, 塩化

ナトリウム を添加する こ と により , 比重をd = 1 .0 1 9 にし,1 5 0 0 0 0 Ⅹ g で2 0 時間超遠心

した( ペ ック マ ン,Ⅹし9 0) . 得られた浮遭層(d < 1 .0 1 9) は廃棄した . 続いて 下層部を

同様にd = 1 .0 6 3 に合わせ , さらに150 00 0 Ⅹ g で2 0 時間超遠心 し, 浮遊上層部(1 .01 9 < d

く1 ･06 3 g 血1) を得た.L D L は使用時まで( 数日以内) 4 ℃で 保存し, 使用の 際にはリ ン

駿緩衝生理食塩液(P B S, p H 7 . 4) で 透析 して用 いた . L D L のタ ン/てク量はB C A 蛋白定

量試薬を用 いて測定し,P B S b H 7 .4) で 蛋白量50 /1 g/ m l にして実験に用い た .

3) u ) L の 酸化

3 0

酸化の 開始5 分前に終濃度1 % 以下 の エ 夕 ノ -

ル に溶解した試験薬物 を添加 し,

酸化が終了す る6F寺間後まで3 7 ℃ でイ ンキ ュ- ベ - シ ョ ン した . 本濃度の エ タノ ー

ルが系に影響を与えない こ とは別途確認した . 酸化は終濃度1 LL M の C u S O . ある い

は30 0 /上 M の A A P H を添加する ことによっ て 開始した .

4) 酸化進行の 測定法

L D L の脂質酸化の 進行度は,L D L 中の 高度不飽和脂肪酸の酸化的崩壊 によ っ て 生

ずる共役ジエ ン構造を,2 3 4 n m の 吸光度で経時的に測定し求めた【1 0】. 吸光度は

D U -6 5 0 ス ペ クトルメ- 夕 -

( ペ ック マ ン) によ っ て1 0 分毎 に測定した . 試験薬物由来

の吸光度の影響を除く ため , 測定デー

タは試験薬物の2 3 4 n m にお ける 吸光度を差

し引いて プロ ッ トした . ラグ段階の 終了時間(ラグタイム) , 連鎖成長段階の酸化進

行速度は, 常法どお りプロ ッ トした吸光度 の経 時変化 の グラ フ か らそれぞれ求

め, 酸化開始時にお ける グラフ の 接線と, 第二 段階を通 る直線 の交差する時間を

ラグタイム , 第二 段階を通 る直線の 傾きを酸化進行速度とした .

5) 統計処理

デ ー

タは平均± 標準誤差 (N = 5) で示 した . 多群比較は一 元配置 の分散分析 によ

つ て行い, 有意差が認められた場合はD u n n ett

'

s t e s t により検定した . 危険率が5 % 以

下の 場合を有意差あり とした.

結果

1) フルパス タチ ンの 銅誘発L D L 酸化抑制作用

Fig ･ 3 - 2 に示したように , 本条件下でL D L の酸化は3 - 4 時間で終了段階まで進行

3 1

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0 60 1 2 0 18 0 2 4 0 3 00 3 60

Ti m e ( 山i n)

Fig . 3 ･2 E ff e c t o f fl u v a st a ti n ( Fl u) o n c o p p e r i o n ･i n d u c e d

o xid a ti o n o f h u m a n L D L

T h e i n c r e a s e of c o nj u g at ed die n e f o rm ati o n w a s m e a s u r ed b y

tb e a b s o rb a n c e a t 2 3 4 n m . H u m a n L D L (5 0 トLg p r ot e i n/ m l) i n

P B S (p H 7 ･4) w a s i n c u b at e d w ith C u S O4 (l u M ) at 3 7

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C ･

Fl u v a st a ti n w a s ad d e d at fi n al c o n c e n tr a ti o n s of 0,1

,1 0 a n d

3 0 トL M . V al u e s a r e m e a n s ± S E ( N = 5) .

*: p < 0 .0 5 v s c o n tr ol .

3 2

した. フルパ ス タチ ン(1 - 3 0 〝 M) は用量依存的に共役 ジエ ン生成を抑制し, そ の 作

用は最低濃度の1 J上 M か ら有意で あ っ た ･ こ の 作用がH M G - C o A 遼元酵素阻害薬に共

通の作用か, あるい はその 構造に由来するも の か を検討する ため , フ ルパス タチ

ンの作用をフルパ ス タチ ン の側鎖二 重結合遼元体およびプラバス タチ ン と比較し

た.Fig .

3 -3 に遭元体と作用 を比較した結果を示す. 興味深い こと に,

フ ル パス タ

チンは1 0 〝 M で有意な共役ジエ ン生成抑制作用 を示 したが , 本選元体は有意な作用

を示さなか っ た .Fi g . 3 - 4 にプラバス タチ ンと作用 を比較した結果 を示す. フルパ

スタチンは3 0 /上 M で 顕著なL D L 酸化抑制作用 を示 したが, プラバ ス タチ ンは全く作

用を示さなか っ た .

2) フルパ スタチ ン と α トコ フ ェ ロ-

ル の抗酸化特性比較

フルパ スタチ ン の抗酸化特性を解析する ため に, 代表的な天然抗酸化物質で あ

るどタミ ンE との作用比較を行 っ た . 結果をFig . 3 -5 およびT abl e 3 - 1 に示す . フルパ

スタチ ンおよび α トコ フ ェ ロ- ル(1 0 /上 M) は共に有意な共役ジエ ン生成抑制作用 を

示し, その 作用は後者の 方がやや強か っ た . α トコ フ ェ ロー

ル はラ グタイム の延

長作用に関して は フル パス タチ ン の 約3 倍の作用を示 して い たが, 酸化の進行速度

には全く影響を与えなか っ た .

一 方, フルパ ス タチ ンは, ラグタイム の 延長作用

だけでなく , 酸化の連鎖成長段階における酸化進行速度 に対 して も用量依存的な

抑制作用を示すこ とが明 らかとな っ た( T a ble 3 - 1) .

フルパスタテ ンと α トコ フ ェ ロー

ル の相互作用 につ いて検討した結果をFig . 3 - 6

に示す. フルパ スタチ ン(3 L L M) と α トコ フ ェ ロー

ル(10 LL M) は酸化開始前に同時に

添加することにより, そ れぞれ単独で用い た場合より も強 い酸化抑制作用 を示 し

た･ そこで本作用が相加的か , ある い は相乗 的か を解析するた めに,B e r e n b a u m ら

3 3

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6 0 12 0 18 0 2 4 0 300

Ti m e ( m i n)

Fig . 3 -3 C o m p a r a tiv e st u d y of th e e ff e ct o f fl u v a s t a tin (F l u)wi t h t h a t o f it s r e d u c e d d e riv ati v e ( A - F l u) o n

c o p p e r i o n -in d u･c e d L D I J O Xid ati o n

T h e i n c r e a s e of c o nj u g at e d die n e f o r m a ti o n w a s m e a s u r e d b y

th e ab s o rb a n c e a t 23 4 n m . H u m a n L D L ( 5 0 トLg P r ot ei n/ m l) i n

P B S (p H 7 ･4) w a s i n c u b at e d w ith C u S O

4 (1 u M ) at 3 7o

C ･

C o m p o u n d s w e r e ad d e d at fin al c o n c e n t r ati o n of l O い′M ･

V al u e s a r e m e a n s ±S E (N = 5) .

*: p < 0 .0 5 v s c o n tr ol .

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P r a 3 0 p M

60 1 2 0 1 8 0 2 40 3 00

Ti m e ( m i n)

F ig . 3 -4 C o m p a r a ti v e s t u d y o f t h e effe ct o f fl u v a st a ti n ( Fl u)wi t h t h a t o f p r a v a st a ti n (P T A) o n c o p p e r i o n ･i n d u c e d

L D L o xid a ti o n

T h e in c r e a s e of c o nj u g ate d die n e f o r m ati o n w a s m e a s u r ed b y

tb e ab s o rb a n c e at 2 3 4 n m . H u m a n L D L (5 0 トLg p r ot ei n/ m l) in

P B S ( p H 7 14) w a s i n c ub at e d w ith C u S O4 (1 LL M ) at 3 7

o

C ･

C o m p o u n d s w e r e ad d e d at fi n al c o n c e n tr a ti o n of l O い一M ･

V al u e s a r e m e a n s ±S E (N = 5) .

*: p < 0 . 0 5 v s c o n t r ol .

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6 0 1 20 1 8 0 24 0 3 0 0

Ti m e ( m i m)

Fig . 3 ･5 C o m p a r a ti v e st u d y o f th e effe ct o f n u v a st ati n (F h 1)wi t h th a t of α ･t o c o p h e r ol ( α - T o e) o n c o p p e r i o n

-i n d u c e d

L D L o xid a ti o n

T h e i n c r e a s e of c o nj u g ate d di e n e f o r m ati o n w a s m e a s u r e d b y

th e ab s o rb a n c e at 2 3 4 n m.H u m a n L D L (50 トLg p r otei n/ m l) i n

P B S (p H 7 ･ 4) w a s i n c u b at e d w it h C u S O4 (1 トL M ) at 3 7

o

C ･

C o m p o u n d s w e r e ad d e d at fin al cd n c e n t r ati o n of l O トL M .

V al u e s a r e m e a n s ±S E ( N = 5) .

*: p < 0 . 05 v s c o n tr ol .

T a bl e 3 ･ 1 E ffe c t s o f th e c o m p o u n d s o n tll e l a g ti m e an d t h e r a t e o f

c o nJ u g a t e d die n e f o r m a ti o n■

T e s t c o m p d s . L ag Ti m e R ate

C o n t r oI

Fl u v a st ati n l トL M

I OトL M

3 0 p M

α - T o c o p h e r o1 1 0 トL M

1 0 0 1 0 0

1 2 0 8 4

1 3 9 7 7

2 0 3 5 4

2 0 2 1 0 0

% of c o n tr ol a v e r a g e

3 6

の方法【3 0 ,31] を用 い て 更な る検討 を加えた . Fig ･ 3 - 7 に フ ル パ ス タチ ンと α トコ フ

ェ ロー

ルを単独ある い は種々 の 濃度で 組み合わせて添加 した際の , ラグタイム の

延長効果を示す . グラフ 中の点線で 示される ように, 同程度の 作用を示すポイ ン

トは,2 種の薬物の 添加割合に関係なく直線に 並ぶ こ とが明 らか とな っ た･ 従 っ て

これらの薬物は既報【3 0,3 1】の定義により相加的に働く こ とが示 され た .

Fig . 3 - 8 にフル パスタチ ンある い は α トコ フ ェ ロー ル をラグタイ ム終了時に添加

した際の 挙動を比較した結果を示す. 興味深い こ とに, 酸化開始前に α トコ フ ェ

ロー

ル(1 0 LL M ) を添加し, ラグ段階が終了した時点で α トコ フ ェ ロ- ル(3 LL M) を再

添加したとこ ろ ,

r再添加した α トコ フ ェ ロ

ー

ル は酸化 を用量依存的に促進した ･

一 方, フルパ ス タチ ンは, ラグ段階終了時に添加した場合で も用 量依存的な酸化

抑制作用を示 した .

3) フルパス タチ ンのA A P H 誘発L D L 酸化抑制作用

これまで 認められた フル パ スタチ ンの L D L 酸化抑制作用が , 銅イオ ン によ っ て誘

発される場合 に限 られる 反応であるか を確認するた め, 非金 属で 水溶性の ラジカ

ル反応誘発薬であ るA A P H を用 いて 同様の検討 をした .Fig ･ 3 - 9 に示すよう に, フル

パスタテ ンは非金属の酸化誘発薬 によるL D L 酸化 に対して も, 用量依存的な共役ジ

エ ン生成抑制作用 を示 した .

考察

α トコ フ ェ ロー ル , ア ス コ ルビン酸 ,

ユ ビキノー ル等の 天然抗酸化 物質 , プロ

ブコ-

ル等の合成抗酸化物質は,L D L の酸化変性を抑制する ことが報告され て い る

【4] .in vi v o にお ける L D L 酸化の 詳細なメカ ニ ズム は不明で あるが , 遷移金属【3 礼

3 7

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α - T o c 叫M ＋ Fl Ⅶ 1 叫M

0 6 0 12 0 18 0 24 0 3 00 3 60

Ti m e ( m i n)

Fig . 3 ･6 E ffe ct o f t h e c o m bi n ati o n o f 伽 v a s t ati n (F l u) a n d

α ･t o c o p b .e r ol ( α - T o e) o n c o p p e r i o n ･i n d u c e d L D L o xid a ti o n

T h e i n c r e a s e of c o nj u g at e d di e n e f o r m ati o n w a s.

m e a s u r e d b y th e

●

ab s o rb a n c e a t 2 3 4 n m . H u m a n L D L (5 0 tLg P r ot ei n/ m l) i n P B S ( p H 7 ･ 4)w a s i n c u b at e d w ith C u S O

4 (1 p M) at 3 7o

C ･ C o m p o? n ds w e r e a d d e d 5

m in p ri o r t o th e o xid ati o n ･ V al u e s a r e m e a n s ± S E ( N = 5) ･

*: p < 0 ･0 5 v s c o n t r ol ･

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1 6 0 b o 3

1∴5∴9 ,

1∴3∴∴03

o 1 0 2 0 3 0

Fl u 如M )

Fig ･ 3 17 = s o b ol o g r a m s h o w l n g th e e ffe c t s o f c o m bi n a ti o n o f n u v a st a ti n●

(Fl u) a n d α ･t o c o p h e r ol ( α･ T o c) o n cb p p e r i o n ･i n d u c e d L D L

o xid a ti o n

v al u e s i n it ali c s r e p r e s e n t m e a n l a g ti m e o f L D L o xid ati o n ( % o f c o nt r ol

a v er ag e) w h e n e a ch c o中bi n ati o n of t h e s e c o m p o u n d s w a s a d d e d b e f o r e th e

s t a rt of o xid ati o n . P oi nts r e p r e s e n ti n g c o m bi n a ti o n s w ith e q u al effe cts li e

o n th e st r aig ht li n e ] o l n l n g t h e c o n c e n tr ati o n s of Fl u a n d α- T o c t h at a r e

● ■ ●

e q u a11y e 批 cti v e w h e n u s e d al o n e ( N = 5) ･

3 8

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α ･ T o c l OトL M- a ･ T o c 3トL M

＋ α ･ T o c l O p M ･ α ･ T o c lOLI M

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Ti m e ( m i n)

⊥

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3 00 3 6 0 42 0

O m i n 15 0 m i n

｡ ｡ n l r ｡1 ＋ ＋

a ･ T o c l OトL M･ c o n t r ol

α ･ T o c l OLL M ･ Fl u l O p M

a - T o e l OトL M - Fl u 3 0 p M

b)

o 6 0 1 2 0 1 8 0 24 0 30 0 3 60 42 0

Ti m e ( m i n)

Fig . 3 - 8 E ff e ct s o f ( a) α -t o c o p h e r ol ( α - T o e) a n d (b) fl u v a s t ati n

( Fl u) o n c o p p e r i o n ･i n d u c e d I J D L o xid a ti o n w h e n th e

c o m p o u n d s w e r e a d d e d at th e e n d p oi n t o f t h e l a g p h a s e

臥 m a n L D L (5 0 トLg p r ot ei n/ m l) i n P B S (p Ⅲ 7 ･4) w a s i n c u b at e d w ith

C u S O4 (1 LL M ) at 3 7

o

C ･ α- T o e (1 0 u M ) w a s ad d ed 5 mi n p ri o r t o th e

st a rt of o xid ati o n i n all e x p e ri m e n t s e x c e pt fわr c o n t r ol ･ A t th e e n d p oin t

of th e la g p h a s e (1 5 0 mi n) , ( a) α- T o c (0 ,

3,1 0 トL M ) an d (b) Fl u (0 , 1 0 , 3

0 トL M ) w e r e f u r th e r a d d ed t o t h e r e a c ti o n mi Ⅹt u r e ･

V al u e s a r e m e a n s ± S E (N = 5) .

3 9

1 .0

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日寸M

! o .6U自也

.上〕

志 o .4A

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＋ Fl u l OトL M

+ ト ー

F lu 30LI M

0 6 0 1 2 0 1 8 0 2 4 0 3 0 0

Ti m e ( m i n)

3 60

F ig . 3 ･9 E ff e c t o f fl u v a s t atin (Fl u) o n A A P H -i n d tl C e d o x id a ti o n o f

h u m a n L D L

T h e i n c r e a s e of c o nj u g at e d die n e f o rm ati o n w a s m e a s u r e d b y t h e

ab s o rb a n c e a t 2 3 4 n m . H ui n a n L D L (5 0 LLg P r ot ei n/ mi ) in P B S (p H 7 .4)

w a s i n c ub at e d w ith A A P H (3 0 0 トL M ) at 3 7o

C ･ C o m p o u n d w a s ad d e d 5

m i n p d o r t o th e o xid ati o n ･ V al u e s a r e m e a n s ±S E (N = 5) I

4 0

リポキシゲナー

ゼ【3 3】, ミ エ ロ ペルオキ シダ ー

ゼ【3 4] ,ペル オキシ ナイ トライ ト

【3 5 博 , 種々 の 因子が 関与して い ると考えられて い る . S m itb ら【3 2】は,L D L 酸化 に

充分な量の 遷移金属が ヒトの 動脈硬化部位に存在する ことを見出してお り, また

o-

L e a ry ら【3 6】は, 銅誘発酸化 に対するL D L の酸化抵抗性と動脈硬化の 進展には逆相

関関係がある こ とを示 した . 従っ て本章で はフルパ スタチ ン の 抗酸化作用 を最も

普及して い る方法で あ るi n vit r o の銅誘発L D L 酸化系【1 0] にて評価した .

フル パス タチ ンは用量依存的に銅誘発L D L 酸化 を抑制し, そ の 作用 は1 〟 M 以上

で有意で あ っ た . フ ルパ ス タチ ンは臨床の 投与量(0 . 5 6 m g k g ,6 d a y) で最高血中濃度

が1 〃 M 以上 に達する こと【1 4】, また生体内で のL D L 酸化は更 に緩やかな条件で ゆ

っ く りと進行する こと【3 7】を考慮すると,i n viv o の 投与におい て も, 化合物由来の

直接的な抗酸化 作用が寄与する可能性は高い と思われ る .

フルパス タチ ン の 側鎖 二 重結合の 遼元体がL D L 酸化に対し全く作用 を示 さなか っ

たこ とか ら, 運元された共役二 重結合は抗酸化作用 の発現にお いて 重要な役割 を

果たして い る こ とが示唆された,. 詳細な反応メカ ニ ズム は不明で あるがi 次の よ

うな過程が考 えられる . すなわち, 脂質ラジカルある い は脂質ペ ルオキシ ドラジ

カルが フ ルパス タチ ン を攻撃し, フルパス タチン ラジカル を生ずる . フル パス タ

チ ンラジカル は側鎖の 共役二 重結合等によっ て , 共鳴安定化 され る . そ して こ の･

共鳴安定化により , ラジカル の 脂質 へ の再攻撃が抑制され る とい うもの で あろ･

この ような抗酸化メカ ニ ズム はβカ ロ テン の抗酸化 メカ ニズム として も以前に報

告されて い る【3 8] .

フ ルパ スタチ ン の側鎖二 重結合の遼元体およびプラバ ス タチ ンがL D L の酸化抑制

作用 を全く示さ なか っ た こ とは, こ の作用がH M G - C o A 還元酵素阻害薬に共通 の も

ので はなく , その構造に由来するもの で ある こ とを強く示唆して い た ･

4 1

フルパス タチ ンの 効力を一 般化 する ため, 天然抗酸化物質 の α トコ フ ェ ロ ー ル

と比較を行 っ た . 興味深い ことに フ ル パス タチ ンは, α トコ フ ェ ロー

ル に代表さ

れる フ ェ ノ ー ル性水酸基を有する抗酸化物質とは異な る挙動 を示 した .

一 般に フ

ェ ノー ル性水酸基 を有する抗酸化物質はL D L 中で酸化の 開始ととも に先に消費さ

れ 脂質をラジカル の 攻撃か ら効果的に防御して い る【1 3】. そ して , はとんどす べ

ての 抗酸化物質が消費された段階で , 脂質の 酸化が開始され る . 従 っ て これ らの

薬物はL D L 酸化ゐラグタイム を効果的に延長するが , 次の 連鎖成長段階における酸

化の速度に ははとん ど影響を与えない . しか しなが らフル パ ス タチ ン はそ の 構造

にフ エ ノ-

ル性水酸基 を有さない ため, そ の 反応様式は前述したよう に α トコ フ

ェ ロー ル とは全く異な る と考えられ た. フ ル パス タチ ンは, 酸化 の 開始時か らラ

ジカル反応の 抑制に働い て い ると思われ るが, こ の 段階にお ける効力は α トコ フ

主ロ - ルよりも弱い. しかしなが ら, 他の フ ェ ノ ー ル性の抗酸化物質が消費され

つく したラグタイ ム以降にもフ ルパ ス タチ ンは効力 を発揮 して おり , 酸化 の連鎖

成長段階をも抑制した と考えられる .

フルパス タチ ン は α トコ フ ェ ロー

ル と相加的な作用 を示 した . こ の 知見は, フ

ルパスタチ ンが体内で 豊富に存在する α トコ フ ェ ロー

ル と共に, 生理的条件下で

効果的に抗酸化作用 を発揮する可能性を示して い る .

本実験で は,これまで に報告されて いない新たな手法として , ラグ段階終了時

に薬物を添加 した場合 のL D L 酸化の挙動を解析 した . L D L 酸化の ラグ段階はL D L 中

に存在する抗酸化物質が 消費されて いく段階であり, これ らの 内因性抗酸化物質

が消費され つ くした段階で急激な連鎖成長段階に入 る【1 3】. 従 っ て ラグ段階終了時

に検体を添加する こ とに よ っ て , 他の相補的な抗酸化物質が消費された状態で の

検体の作用を解析で きる と考えた . そ してそ の 結果, 本条件下で フルパス タチ ン

4 2

は用量依存的な抑制作用 を示すが ,

.α トコ フ ェ ロ

ー

ルは用 量依存的な酸化促進作

用を示すとい う興味深い知見 を得た . α トコ フ ェ ロー ルが条件によ っ て酸化促進

薬として 働く可能性がある ことは, 近年注目され ており , そ の メカ ニ ズム は次 の

ように考えられ て い る【3 9,4 0】. 通常, 相補的な抗酸化物質が存在す る場合には,

α トコ フ ェ ロ ー ル は1 分子 の脂質ラジカルある い は脂質ペル オキシ ラジカル と反応

し, α トコ フ ェ ロ キシ ラジカルを生成する . そ して , この ラジカルが さらに脂質

ペ ルオキシ ラジカル ある い は脂質ラジカルと反応するか , ある い はアス コ ル ピン

酸等の相補的な抗酸化物質 によ っ て速やかに α トコ フ ェ ロ ー ル に遼元され る こ と

によ っ て , ラジカル の 連鎖反応が終了する . しか しなが ら相補的な抗酸化物質か

ら隔離された条件下で は, 生成した α トコ フ ェ ロ キ シラジカルが遅元 されず比較

的長時間存在するため , 脂質ラジカルや脂質ペ ルオキシ ドラジカル を安定化する

だけで なく , これ自身が高級不飽和脂肪酸を直接攻撃し, 脂質酸化 を促進して し

まうと考え られて い る .

in v i v o で α トコ フ ェ ロー

ルが酸化促進薬として働く可能性 に つ い て は不明で ある

が, 通常の 相補的な抗酸化物質が存在する条件下 で は,α トコ フ ェ ロ

ー

ルは従来

の概念通り抗酸化薬として働 いて い ると考えられ る . しか しなが ら, 血管壁内な

どの血流中の抗酸化物質か ら隔離された部分で , 慢性的な酸化条件により相補的

な抗酸化物質が消費された場合,α トコ フ ェ ロ

ー

ル は酸化促進薬 となりうる . そ

して この こ とは動物モ デル におい て α トコ フ ェ ロ ー ル の投与が, 必ず しも動脈硬

化の進展を効果的には抑制せず, 条件によ っ て は用量依存的に悪化させ て しまう

という一

定しない 結果[4 ,4 1

,42] が出る

一

つ の 原因とも考え られ る . い ずれ にせ よ

フルパス タチ ンは,こ の様な条件下にお いて も共役ジエ ン生成を抑制し, α トコ

フ ェ ロー

ル とは異なる抗酸化特性を有する こ とが明らかとな っ た .

4 3

1 フルパスタテ ンは非金属の水溶性ラジカル反応誘発薬で あるA A P H によ る酸化で

も共役ジエ ン の 生成を抑制した . また , 予備的に行 っ たス ペ ク トル法【43,4 4】によ

る薬物の キレー ト作用の 評価にお いて も, 銅添加は本化合物 に固有のU V 吸収に全

く影響を与えなか っ た . 従 っ て , フ ルパ スタチ ン の L D L 酸化抑制作用 は鋼の キ レ ー

トによる 二次的なもの で はなく直接的なラジカル消去能力による も の と思われ

た.

4 4

小括

本章で は,フ ル パス タチ ンのi n vitr o における銅誘発L D L 酸化抑制作用 を解析し

た.L D L 酸化 の 進行は, 脂質の 酸化によ っ て 生ずる共役ジエ ン構造を2 3 4 n m の 吸光

度で経時的に測定し求めた .

フルパ ス タテ ン(1 - 3 0 〃 M) はL D L 酸化の 初期段階における ラグタイ ム を延長する

だけで なく , 酸化の第二 段階で ある連鎖成長段階の 酸化進行速度も用 量依存的に

抑制した . こ の酸化進行速度の 抑制作用 は α トコ フ ェ ロ - ル 等の フ ェ ノ ー ル性水

酸基に基づく抗酸化薬には認められない特徴的な もの で あ っ た .

フルパス タテ ンと α トコ フ ェ ロー

ルはL D L 酸化 の 開始前に共 に系に添加した場

令, 相加的な酸化抑制作用 を示 した . しかしなが ら,L D L 酸化 の ラグタイム の 終了

時に これ らの 化合物を添加したと ころ , フル パ スタチ ンは依然, 抗酸化作用を示

したの に対し,α トコ フ ェ ロ

- ルは酸化促進作用 を示 した . 従 っ て フ ルパス タチ

ンと α トコ フ ェ ロ - ル の抗酸化特性は こ の部分にお いて も異な る こ とが明らかと

な っ た .

本実験で は, フルパ スタチ ンの側鎖二 重結合を還元した検体お よびプラバスタ

チ ンにL D L 酸化抑制作用は全く認められ なか っ た . 従 っ て , フルパ スタチ ンに認め

られたL D L 酸化抑制作用 はH M G - C o A 遼元酵素阻害共に共通の もの で はなく , そ の

構造に起因するも の で ある ことが示唆された[4 5] ･

4 5

第四章 フ ルパ ス タチ ン の光学異性体お よび主要代謝物 のi n vitr o に お

ける銅誘発L D L 酸化抑制作用

序論

第三章の検計で フ ルパ ス タチ ンは構造由来 の銅誘発L D L 酸化抑制作用 を有する こ

とが明らかとなり, これが第 一 章, 第 二 章にお い て認められたi n viv o で の抗酸化作

用に寄与して い る こ とが考えられた .

フルパス タテ ンはそ の構造上3 位 と5 位 にキラル炭素を有して おり , 臨床で は

(3 R S,S S R) の ラセミ 体で 投与されて い る(Fig ･ 4 - 1)【5] . ( 3 R

,5 S) 体は(3 S ,

5 R) 体と比較

して3 0 倍強い H M G - C o A 還元酵素阻害活性を有して い る ため, 脂質低下 作用 はほと

んど(3 R,5 S)体 の みによ っ て 引き起こ されて い る と考え られて い る【4 6 ,

4 7】. 投与後

のi n vi v o で の L D L 酸化抑制作用とい う観点で は, (3 S,5 R) 体も同等 の寄与をする可

能性があると予 想されるが , そ の効力は不 明で ある . そ こで , 本章で は , フル パ

スタチ ン のそ れぞれ の光学異性体の鋼誘発L D L 酸化抑制作用 の 比較を行 っ た .

一

方, フルパスタ テン の投与後に現れる抗酸化作用 には , フ ルパス タテ ン の未

変化体の みで なく , 体内で 生成する代謝物も寄与して い る可能性が考 えられ る ･

そ こで軍要代謝物M 2,M 3

,M 4

,M 7 ( Fig ･

4 - 1)【1 5] に関して も銅誘発L D L 酸化抑制作用

を検討した .

実験材料およ び方法

1) 使用薬物

フル パ スタチ ン(ナ トリウム塩) の(3 R S,S S R) 体, (3 R ,

5 S) 体, (3 S ,5 R) 体はノバル

ティ ス フ ァ-

マ から供与された . M 2,M 3

,M 4

,M 7 は田辺製薬創薬研究所にて 合成

された . 硫酸銅 はナカ ライ テス クから購入 した . すべ て の試薬は市販品 の最高純

4 6

グ や

i

､

勺

. #N

Flu v a st ati n

H O*

O H O H

O H

F

グ 勺

I (ら

.! ク

､(

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顎

M 2

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M 4

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勺

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㍗や

M 3

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i顎

M 7

O H

O H

*

●

F ig ･ 4 ･1 C h e m i c al st r u ct u r e s o f n u v a s t a ti n an d it s m aj o r

m e t a b olit e s

* i n di c at e s c hir al c a rb o n .

4 7

度の もの を用 い た .

2) L D L の 採取

ヒトL D L ( 1 ･ 0 1 9 < d < 1 ･0 6 3 g/ m l) の 分離はH a v el らの 方法に準じて 超遠心法で行っ

た【9] . すなわち , 健常人ボランティ アか ら採血 を行い, 全血 に対 して0 .05 % E D T A

及び0 .05 % N a N, を添加し,

1 5 0 0 Ⅹ g で1 0 分間遠心して 上層の 血衆を得た . 血衆に対

して ベ ンザミ ジ ン(終濃度 1 m M ) , ゲンタマ イ シ ン(終濃度1 0 LL g/ m l) を添加し, 塩化

ナトリウム を添加する こ と により, 比重をd = 1 . 01 9 に し,1 5 00 0 0 Ⅹ g で 2 0 時間超遠心

( ペ ック マ ン,Ⅹし9 0) した . 得られた浮遊層(d < 1 ･0 1 9) は廃棄 した . 続い て 下層部を

同様にd = 1 . 0 6 3 に合わせ , さらに1 5 0 0 0 0 Ⅹ g で2 0 時間超遠心 し, 浮遊上層部(1 .0 1 9 < d

< 1 . 06 3 g/ m l) を得た . 得られたL D L は使用時まで(数日以内)4 ℃ で 保存し, 使用 の 際

にはリ ン酸緩衝生理食塩液(P B S, p H 7 . 4) で透析して 用い た .

L D L の タ ン/てク量は

B C A 蛋 白定量試薬 を用 いて 測定し,P B S ( p H 7 . 4) で蛋 白量5 0 LL g/ m l に して 実験 に用

いた.

3) L D L の酸化

L D L(5 0 LL g/ m l) に終濃度で1 % 以下の エタノー

ル に溶解した試験薬物を添加し, 酸

化が終了する3 時間後まで3 7 ℃ でインキ ュ- ベ - シ ョ ンした . 酸化は試験薬物添加

5 分後 に終濃度で5 jL M の C u S O . 添加して開始した . 本濃度の エ タノー

ルが系に影響

を与えない こ とは別途確認した .

L D L の脂質過酸化の進行度は, 共役ジ エ ン の生成に基づく2 34 n Ⅱl の 吸光度上昇

を,1 0 分毎にD U -6 5 0 ス ペ クトルメ

ー タ( ペ ック マ ン) で 測定して求めた【1 0] . 試験薬

物由来の 吸光度の 影響を除くため, 測定デ ー

タは試験薬物添加後の2 34 n m にお け

4 8

る吸光度を差し引い て プロ ッ トした . グラ フか ら算出するパ ラメー

タ はラグタイ

ム(L a g t lm e) , 最大酸化進行速度( M a x . r at e) , 極大値 をとる時間( M a x . ti m e) と し,

プロ ッ トした吸光度の 経時変化の グラフか らか ら常法通 り求めた.

それぞれ の 実験にお い て , L D L は別 々 の 健常人ボラ ンティ アか ら得た . 従 っ て 吸

光度上昇の 絶対値はそれぞれ の ボランテ ィ アの 血液 の脂質組成, 抗酸化物質量の

相違により, 実験毎に異な る . そ こで , それぞれの 実験に対応する コ ン トロー ル

を設定し, 対応する コ ン トロ - ル との 比較でそれぞれ評価した .

4) 統計処理

デ ー

タ は平均±標準誤差 ( N = 4 - 6) で示 した . 多群比較は一 元配置の 分散分析に

よっ て 行い, 有意差が認め られた場合はD u n n e 仕の方法 により検定 した . 危険率が

5 % 以下の場合を有意差ありとした.

結果

1) フ ルパ ス夕チ ン の 光学異性体の銅誘発L D L 酸化抑制作用

フルパ ス 夕チ ンの(3 R,5 S) 体および(3 S

,5 R) 体の 銅誘発L D L 酸化抑制作用 を検討し

た .Fig . 4 - 2 に 吸光度変化の典型的/てタ ー ンを示 し,

T abl e 4 - 1 にそれぞれ の グラフ

から得た各パ ラメ-

夕の 値を示 した . 両鏡像体(1 0 LL'

M) は互 い に同等 の L D L 酸化抑

制作用を示 し, そ の効 力はいずれもラセ ミ体と同等で あ っ た二

2) 代謝物の L D L 酸化抑制作用

フルバ スタチ ン の ヒ トにおける主要代謝物( M 2,M 3

,M 4

,M 7; Fig ･ 4 - 1) の 銅誘発

L D L 酸化抑制作用を検討した .Fi g .

･

4 -3 にそ れぞれ1 0 〃. M で添加した際の典型 的な

4 9

1 . 2

育寸M

Ci o .8q J0

日d

, 良事J

宏 0.4

■丘

A

0

♯ C o n t r ol

～ R a c e m i c m i xt u r e

十 (3 R,5 S)

→ - -

(3 S ,5 R)

0 6 0 1 2 0 1 8 0

Ti m e ( m i n)

F ig ･ 4 - 2 T y pi c al t r a c l n g S Of th e eff e ct s o f eムch e n a n ti o m e r a n d●

r a c e m i c mi x t u r e o f n u v a s t a ti n o n c o p p e r i o n -i n d u c e d

o xid a ti o n o f h u m a n L I)I J

T h e in c r e a s e of c o n) u g ate d die n e f o rm a ti o n w a s m e a s u r e d b y th e

ab s o rb a n c e at 23 4 n m ･ H u m a n L D L (5 0 トLg P r ot ei n/ m l) i n P B S

(p H 7 ･4) w a s i n c u b at ed w ith C u S O4 (5 トL M ) at 37

o

C ･ T h e

c o m p o u n d s w e r e a d d e d at fi n al c o n c e n tr ati o n of l O トL M . G r ap h

sb o w s th e r e p r e s e nt ati v e d at a .

T a ble 4 ･ 1 E ffe ct s o f r a c e m i c m ix t u r e a n d e a c h e n a n ti o m e r o f

fL u v a s t a ti n りn C O P P e r i o n -i n d u c e d L I) L o xid a ti o n

(p M ) %g

iii

)

m e

濫)

ti m e

( A

M

A

a

b

X

{ x

a

l

t

S3/ mi n,

C o nt r ol 0

Flu v a s t ati n

(3 R S,5 S R) 10

(3 R,5 S) 10

(3 S , 5 R) 10

5 8 .6 ± 5 .9

8 1 .8 ± 9 .7

7 3 .8 ± 7 .8

7 9 .8 ± 1 1 . 6

1 4 0 . 0 ± 9 .1

19 0 . 0 ± 1 0 .0 *

1 9 0 .0 ± 1 0 .8*

1 9 5 . 0 ± 1 5 . 5*

5 .0 1 ± 0 . 5 5

3 .4 9 ± 0 .4 3

3 . 7 4 ± 0 .4 7

3 . 3 8 ± 0 .3 9

D at a a r e e x p r e s s e d a s t h e m e a n s ± S E (N = 4) .

*; p < 0 . 0 5 v s C o n tr ol ･

5 0

1 .2

育寸r r)

Si 0 .8

C )0

日也

宅o ･4

∽

A

A

C o nt r ol

Fl u v a st ati n

M 2

M 3

M 4

M 7

0 6 0 1 2 0

T i m e ( m i n)

1 8 0

Fig ･ 4 -3 T y pic al t r a c l n g S Of t h e eff e c ts o f th e m et a b olit e s●

o f n u v a st ati n o n c o p p e r i o n ･i n d u c e d o xid a ti o n

of h u m a n L D I ,

T h e in c r e a s e of c o nj u g at ed die n e f o r m ati o n w a s m e a s u r e d

b y t h e ab s o rb a n c e at 23 4 n m ･ H u m a n L D L (5 0 u g p r ot ei n/

m l) i n P 石S (p H 7 . 4) w a s i n c u b at e d w ith C u S O4 (5 トL M ) at

3 7o

C ･T h e c o m p o u n d s w e r e a dd e d at 缶n al c o n c e n tr a ti o n

of 10 LL M ･ G r ap h sh o w s th e r e p r e s e n t a ti v e d at a ･

5 1

/ てタ ー ンを示 した . 検討 した代謝物は全て酸化抑御傾向を示 したが,M 7 の作用は

弱か っ た . ヒ トの血 中で未変化体の 次に多く存在するM 4 は, フ ル パ ス 夕チン と同

程度の 抑制活性 を示 した . これ らの代謝物の 中で ,M 2 と M 3 は非常に強力なL D L 酸

化抑制作用を示 し, 本濃度(1 0 〝 M ) で共役ジエ ン生成を完全に抑制した . そ こ で,

M 2,M 3 に関して , 更に低い 濃度(0 . 0 3 -1 〟.

M ) で銅誘発L D L 酸化抑制作用 を検討 し

た.Fig . 4 - 4 とT a bl e 4 -2 にM 2 の 作用 を示 し

,Fig . 4 -5 とT abl e 4 - 3 に M 3 の作用 を示

す. これらの 代謝物は共 に0 .1 〟 M 以上 で有意なラグタイム 延長作用 を示 し, そ の

作用は用量依存的で あ っ た . 本検討か ら,M 2

,M 3 の 銅誘発L D L 酸化抑制作用 はフ

ルパス 夕チ ン本体の 約3 0 - 5 0 倍強力で ある こ とが 明らかとな っ た .

考察

フルパ ス タチ ン はその 構造に2 つ の キ ラル炭素を有して おり , 臨床で はラセ ミ体

(3 R S,5 S R) で 投与されて い る【5] . そ してそ の脂質低下作用はH M G - C o A 還元酵素阻

害活性の 違い か らほとん ど(3 R ,5 S)体 の みに よ っ て 引き起 こされて いる【4 6

,47] ･ し

かしなが ら今回 の検討で ,これらの 光学異性体(3 R , 5 S および3 S

,5 R) は , 銅誘発

L D L 酸化の抑制作用 に 関して は同等の 活性を示す こ とが 明らか とな っ た ･ 従 っ て ,

脂質低下作用 の 弱い(3 S,5 R)休もi n viv o における抗酸化作用 に関して は同レベ ルの

寄与をして いる と考えられる . また, 本結果は, フルパス タチ ン の抗酸化作用が

そ の H M G - C o A 還元酵素阻害活性とは独立の もの である という, 第三章の 考察を更

に裏付ける もの とな っ た .

今回検討 したフルパ ス タチ ンの主要代謝物( M 2,M 3

,M 4 ,

M 7)[ 15] はそ れぞれ銅誘

発L D L 酸化抑制作用 を示 した . そ の中で , フ エ ノ - ル性の 水酸基 を有する M 2 とM 3

はフ ルパ ス タチ ン の3 0 倍 - 5 0 倍という強力な抗酸化作用を有 して いた ･ フ エ ノ ー

5 2

0 .6

育A 0 .4r q)

q)0

日也

宅o .2帆

A

A

0

0 6 0 1 20

Ti m e ( m i m)

l器o

Fi g . 4 ･4 T y p i c al t r a c l n g S O f th e d o s e ･ d e p e n d e n t effe c t o f●

M 2 o n c o p p e r i o n ･i n d u c e d o xid a ti o n of h u m a n

L D L

T h e i n c r e a s e of c o nj u g at ed die n e f o rm ati o n w a s m e a s u r e d b y

th e ab s o rb a n c e at 23 4 n m . H u m a n L D L (5P トLg P r ot ei n/ m l) in

P B S (p H 7 ･4) w a s i n c u b at e d w ith C u S O

4 (5 い一M ) at 3 7o

C ･

Fl u v a st ati n (F lu) w a s a dd ed a s a s t a n d a rd . M 2 w a s ad d e d at

f in al c o n c e n tr ati o n s of 0 .0 3 , 0 . 1 , 0 .3 a n d 1 LI M,r e s p e c ti v ely ･

G r ap b s h o w s th e r ep r e s e n t ati v e d at a ･

T a bl e 4 ･2 E ff e ct of M 2 o n c o p p e r i o n -i n d u c e d L D L o x id a ti o n

L a g ti m e M a x ･ ti m e

(LI M ) ( m in) ( mi n) (%x

i s

r a

x

t

l

e

.3/ m i n)

C o ntr ol

M 2

F lu v a st ati n

0 3 8 .8 ± 2 .3

0 .0 3 4 0 .3 ± 1 .5

0 .1 4 3 . 7 ＋ 2 .4 *

0 . 3 5 2 . 9 ± 2 . 1* *

1 6 7 .3 ± 2 . 1 * *

3 4 2 .2 ± 1 .4

1 0 5 . 0 ± 4 .2

1 06 . 0 ± 2 .4

1 1 0 .0 ＋ 2 .2

1 1 9 .0 ＋ 3 .3 *

8 . 62 ± 0 .7 8

8 .7 5 ＋ 0 .7 0

8 .7 6 ＋ 0 .7 3

8 . 1 9 ＋ 0 .7 2

15 2 .0 ± 7 . 0* *

5 . 9 8 ＋ 0 .6 0* *

1 26 . 0 ± 5 .6 * *7 . 26 ± 0 .5 6 * *

D at a a r e e x p r e s s e d a s th e m e a n s ± S E (N = 6) ･

*: p < 0 ･0 5 ,

* *: p < 0 ･0 1 v s ･ C o n tr ol ･

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Fig ･ 4 -5 T y pi c al t r a c l n g S Of t h e d o s eJ d e p e n d e n t e ff e c t of●

M 3 o n c o p p e r i o n-i n d tl C e d o xid a ti o n o f h u m a n

･ L D L

T h e i n c r e a s e of c o nj u g at e d di e n e f o rm a ti o n w a s m e a s u r e d b y

th e ab s o rb a n c e at 2 3 4 n m . H u m a n L D L (5 0 トLg P r ot ei n/ mi ) i n

P B S (p H 7 ･4) w a s i n c u b at ed w ith C u S O4 (5 い･M ) at 3 7

oC ･

Fl u v a s t ati n (Fl u) w a s ad d e d a s a s t a n d a rd ･ M 3 w a s ad d ed at

fi n al c o n c e n t r a ti o n s of 0 .0 3 , 0 .1 , 0 . 3 a n d l い･M,r e sp e c ti v ely ･

G r ap b s h o w s t h e r e p r e s e nt ati v e d at a ･

T a bl e 4 ･3 E ff e ct of M 3 o n c o p p e r i o n -i n d u c e d L I) L o x id a ti o n

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o .1 4 8 .1 ＋ 5 .0 * 1 15 ･ 0 ± 1 1 ･0

o .3 5 5 .9 ± 6 .7 * * 1 2 6 ･ 7 ＋ 1 1 ･8 * *

1 7 8 .0 ± 8 .1 * * 15 5 . 0 ± 1 4 ･2 * *

1 4 2 .7 ± 4 .4 1 2 6 .7 ± 10 .9 * *

8 .7 1 ± 1 .3 9

8 . 9 2 ± 1 .4 1

8 . 6 8 ＋ 1 .3 4

8 .6 5 ＋ 1 .3 4

7 . 6 1 ＋ 1 . 17 * *

7 . 4 0 ± 1 . 3 0* *

D at a a r e e x p r e s s e d a s th e m e a n s ±S E (N = 6) I

*: p < 0 ･0 5

,

* *: p く 0 ･0 1 v s ･ C o n tr ol ･

5 4

ル性の 水酸基は一 般に抗酸化作用 を増強する作用が ある こ とが知られ て い る【4 8】･

これらの化合物は, フ ェ ノ ー ル性水酸基 から脂質 ラ ジカル ヘ 水素原子 を 放出 し,

自身は比較的安定なフ エ ノキシ ラジカルとなっ て連鎖反応 を終了させ る ･ 従 っ て

フルパス タチ ン の 水酸化体 へ の代謝変化は, フルパス タチ ンがも とも と有して い

た抗酸化的特徴 とは別 に, フ ェ ノ ー ル性の抗酸化薬として の特徴 を更に付加する

ことにつ なが っ た と思われる . M 2 とM 3 は主 に糞中に排推され, 血中で は未変化体

と比較して低濃度で 存在する【1 5】ことを考慮する と, こ れら の代謝物は主に肝臓内

でその抗酸化活性を発揮 しており , 肝臓か ら血流中に分泌される超低密度リボ蛋

白( V L D りの酸化抵抗性の 上昇を引き起 こして い る可能性がある ･

M 4 は M 2 や M 3 ほど強 い作用は示 さなか っ たが , フルパス タチ ン と同レベ ルの抗

酸化活性を示 して いた . フルパス タチ ン の経 口投与後の 血中で は, 未変化体に続

いt ,M 4 が最も多く存在する化合物で ある こ と【1 5] を考慮する と,

M 4 も未変化体

とともに血流中で脂質の酸化抑制に寄与して い ると考えられ る ･

今回の 結果は フルパ スタチ ンのi n vi v o で の抗酸化作用【8】が , 脂質低下作用 にお け

る活性体で ある(3 R,5 S) 体だけでなく , その 鏡像体(3 S

,5 R) 体や種々 の 代謝物の抗酸

化作用 の総和として 現れて い る可能性を強く示唆する もの で ある ･

5 5

小括

臨床で ラセ ミ体(3 R S,S S R) で投与されて い る フ ル パス 夕チ ン の脂質低下作用 は,

そのⅢ M G - C o A 還元酵素阻害活性の違いから, 主 に(3 R,5 S)体 によ っ て 引き起 こされ

て いる . しか しなが ら本章の検討で , 銅誘発L D L 酸化抑制作用 に関して は,これ ら

の光学異性体は同じ効力を示すことが明らかとな っ た . 従 っ て , 脂質低下作用の

ほとん どない(3 S ,5 R) 体もi n

.

vi v o の 抗酸化作用 に関して は(3 R,5 S)体と同等 の寄与を

すると考え られた .

フルパス 夕チ ン の ヒ トにおける主要代謝物( M 2,M 3

,M 4 , M 7) はす ベ て L D L 酸化抑

制作用 を示 した . その 中で フ ェ ノー

ル性の水酸基を有する代謝物M 2 とM 3 は非常に

強い抗酸化活性を示 し, その効力はフルパス 夕チ ン本体の約3 0 - 50 倍であ っ た ･

本章の 実験結果は, 第 一 章, 第二 章で 認められたフ ル パ ス 夕チ ン のi n viv o で の

抗酸化作用が , 脂質低下作用 における活性体だけで なく, そ の 鍍像体や種々 の 代

謝物の抗酸化活性の 総和として 現れて い る こ とを強く示唆する もの で ある[4 9] .

5 6

第五章 フ ルパ ス タテ ンおよ び他 のH M G - C o A 還元酵素阻害其 の

i n vitr o における へ ミ ン 一 過酸化水素誘発 u ) L 酸化抑制作用

序論

第三, 第四章の 検討で フルパ ス タチ ン には銅誘発L D L 酸化抑制作用がある こと を

示した .こ の作用 は構造由来で あり,

H M G -t o A 還元酵素阻害薬 に共通 の もの で は

ないと考えられ た . しかしなが ら, フ ルパ ス タチ ン以外の H M d - c o A 遼元酵素阻害

其の中 にもin vi v o で L D L の酸化抵抗性上昇作用が報告され て い る も の もある【5 0 - 5

4】. こ の作用機序は主 にH M G - C o A 遼元酵素阻害 に基づく脂質代謝改善作用 に関連

するも の と考え られ て おり, 例え ば酸化されやすい血流中 の老朽化L D L ( a g e d -

L D L) の肝臓へ の取り込み促進効果【5 0] や,L D L の 脂質組成の 改善効果[5 1 ,

53] な ど

で 説明されて きた . しか しなが ら, こ れらの ⅢM G - C o A 還元酵素阻害薬 の構造由来

の抗酸化作用 を比較解析 した例はなく, そ の 直接的な抗酸化作用 の 寄与につ いて

は不明で あ っ た . そ こ で本章で は, 臨床で用い られて い る H M G - C o A 還元酵素阻害

薬5 種[5 ,5 5 -5 8】(Fi g . 5 - 1) につ い て , そ の抗酸化活性を検討した ･ そ してそ の評価に

札 近年報告さ れ 銅誘発L D L 酸化系より も生理的な酸化メカ ニ ズム に近い と考え

られて い る ,へ 主 ン 過酸化水素誘発L D L 酸化系【5 9】を用 い た ･

実験材料および方法

1) 試薬

フ ルパス タチ ン(ナ トリウム塩) , プラバス タチ ン(ナ トリ ウム 塩) , シ ンパス タチ

ン( オー

プン アシ ッ ド体) はノバルティ ス フ ァ-

マ か ら供与され た ･M 2

,M 4

, セリ バ

スタチ ン, ア トルバ ス タチ ンは田辺製薬創薬研究所に て合成され た ･ へ ミ ンは シ

5 7

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5 8

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グマ か ら購入 した.2

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,6 -t rip y rid yl

- s-t ri a zi n e ( T P T Z) はナカライ テ ス クから購入 し

た. す べ て の 試薬は市販品 の最高純度の も の を用 いた .

2) L D L の採取

ヒトL D L (1 .0 1 9 < d < 1 . 0 63 g/ m l) の 分離はH a v el らの方法[9] に準じて超遠心法で行

っ た. すなわ ち, 健常人ボラ ンティ アか ら採血をお こな い , 全血 に対して0 ･0 5 %

E D T A 及び0 .0 5 % N a N 3 を添加し,1 5 0 0 Ⅹ g で1 0 分間遠心 して 上層の 血衆を得た ･ 血

衆に対して ベ ンザミ ジ ン(終濃度1 m M) , ゲンタ マイ シ ン(終濃度1 0 LL g/ m l) を添加

し, 塩化ナトリウム を添加する ことにより, 比重 をd - 1 ･ 0 1 9 にし,1 5 0 0 0 0 Ⅹ g で2 0 時

間超遠心した(ペ ッ ク マ ン ,Ⅹし9 0) . 得られた浮遊層(d < 1 ･ 01 9) は廃棄した ･ 続い て

下層部を同様 にd = 1 . 0 6 3 に合わせ , さらに1 5 0 0 00 Ⅹ g で2 0 時間超遠心 し, 浮遊上層部

(1 .0 1 9 < d < 1 .0 6 3 g 也l) を得た. 得 られたL D L は使用時まで(数日以 内)4 ℃ で保存

し, 使用 の 際にはリ ン酸緩衝生理食塩液(P B S, p Ⅲ 7 ･ 4) で 透析して 用 いた ･ L D L の 蛋

白量はB C A 蛋白定量試薬を用 いて 測定し,P B S ( p H 7 ･4) で蛋白量2 0 0 J上g/ m l に して 実

験に用 いた .

3) ヘ ミ ン 過酸化水素- L D L 系

検体の抗酸化作用 の評価はB all a ら【5 9] が近年報告した ヘ ミ ン 過酸化水蘇 L D L 系

で行 っ た . 本系で はL D L の酸化と ヘ ミ ンの 分解が同時に進行する こ とが報告され て

おり,へ ミ ン の分解速度が酸化進行の指標となる ･

採取したL D L (1 .0 1 9 < d < 1 .0 6 3) を1 5 0 m M N a Cl を含む1 0 m M H E P E S b u ff e r(p H

7 . 4) で2 0 0 JL g P r ot ei n/ m l の濃度に分散し, 検体存在下2 5 ℃ でイ ンキ ュ-

ベ- シ ョ ン

した. 検体は水ある い は終濃度1 % 以下の エ 夕ノ - ル に溶解 し酸化開始5 分前に添加

5 9

した. 上記H E P E S - N a Cl 緩衝液で調製した へ ミ ン(1 0 EL M ) および過酸化水素(5 0 LL

M) を添加して酸化を開始し, 酸化 の進行度は へ ミ ンに特徴的な4 0 5 n m の 吸光度 を

96 穴プレー トリ

ー ダ ー

( M ol e c ul a r D e vi c e) で経時的に測定し求めた . 脂質酸化の過程

はラグ段階, 連鎖成長段階, 酸化終了段階に分類で きる【1 0 ,1 3】.

へ ミ ンの分解 に

関して も, 脂質酸化と対応した分解/てタ ー ンが得られ る こ とか ら, 吸光度の 経時

的減少の グラフ を利用 して , 連鎖成長段階における酸化進行の 最高速度, および

酸化終了まで の 時間を求めた. 酸化の 最高速度は連鎖成長段階に おける直線の傾

きから求め, 酸化 の終了時間は連鎖成長段階および酸化終了段階を通る 2 直線の

交点か ら求めた .

4) 鉄キレー

ト作用 の評価

フ ルパス 夕チ ン の F e2 ･

,F e

3 '

の キレ ー

ト作用 の検討は一 般的なス ペ クトル法【4 3 ,

4 4]

を用 いた . 即ち,F e S O . あるい はF e Cl , 溶液(3 0 LL M) を上記H E P E S - N a Cl 緩衝液で調

製した フルパス夕チ ン溶液(3 0 〟 M) に添加し,5 分間のイ ンキュ

ー ベ-

シ ョ ン後 ,

フルパ ス夕チ ン固有の ス ペ クトル に生じる変化をス ペ ク トルメー

ター ( ペ ッ クマ ン)

で求めた. 陽性対照として はF e2 '

の キレ-

ト剤で あるT P T Z( 3 0 LL M ) を用 い た ･

結果

1) へ ミ ン ー

i& 酸化水素 - L D L 系におけるH M G - C o A 遭元酵素阻害薬5 種の 抗酸化作用 比

較

へ ミ ン 過酸化水素 - L P L 系で フルパスタチ ン , プラバスタチ ン , シ ンパ スタチ

ン, セリバス タチ ン, アトルバス タチ ンの 作用 を検討した ･

Fig ･ 5 - 2 a に吸光度変化

の典型 的/て夕- ン を,

Fi g ･5 - 2 b およびFig ･ 5 - 2 c に各グラフか ら求めた酸化の 最高速

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in hibit o r s o n h e mi n ･ h y d r o g e n p e r o xid e ･ LI) L sy s t e m

a) T y pi c al tr a ci n g s of th e e x p eri m e n t s ,b) t h e m a x r a t e of o xi d ati o n a n d

c) th e e n d ti m e of o xid ati o n

H u m a n L D L (20 0 f i g P r ot ei n/ m l) i n H E P E S I S Odi u m chlo rid e b uff e r

(p H 7 ･ 4) w a s i n c u b at ed w it h h e mi n (1 0 FL M ) a n d h y d r og e n p e r o xid e (5 0

〃M ) at 2 5｡

C ･ T h e a b s o rb a n c e.of h e m i n at th e w a v el e n gth of 4 0 5 n m

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s m o nit o r e d 払r 5 b r ･ T e s t c o m p o u n d s (3 0 〝M ) w e r e a d d e d 5 m i n

･pr l O r t O th e o xid ati o n ･ V al u e s a r e m e a n s ± S E ( Fig ･

5 - 2 b a n d c; N = 5) ･

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6 1

度および終了時間をそれぞれ示 した. そ の 結果H M G - C o A 遼元酵素阻害薬5 種の中

で, フルパス タチ ン の みが顕著な酸化抑制作用 を示 し, 酸化 の 最高速度の 減少,

酸化の終了時間の 延長を示した . シ ンパ ス タチ ンも酸化を若干抑制する傾向を示

したが , その 作用は有意で はなか っ た . 他の H M G - C o A 還元酵素阻害薬は, 全く作

用を示さなか っ た .

2) フルパス タチ ン の用 量依存性

顕著な作用 を示 した フ ルパ ス タチ ン に関して , 本系にお ける用量依存性を3 - 3 0 LL

M の 濃度で検討した .Fig . 5 - 3 a に吸光度変化 の典型 的/てタ

ー ン を,Fig ･ 5 -3 b および

Fig . 5 - 3 c に各グラフか ら求めた酸化の最高速度および終了時間をそ れぞれ示 した ･

フルパス タテ ン は用量依存的に酸化速度の 抑手札 酸化終了時間の 延長 を示 し, 酸

化の速度は1 0 〟. M 以上で , 酸化 の 終了時間に関して は3 0 〟 M で有意で あ っ た･ 次

に, 本条件下 で へ ミ ン の 分解とL D L 酸化の 進行を直接比較した .Fig ･ 5 - 4 にそ の 典

型的^o

タ ー

ン を示す. 本系におい て これ らは同時に進行して い る ことが確認さ

れ, またフ ルパ スタテ ンが両者 の酸化的崩壊を抑制して い る こ とが明らか とな っ

た.

3) フ ルパ スタチ ンと抗酸化ビタミ ンの効力比較

フルパ スタチ ンの本系における抗酸化効力を標準化するため , 代表的な天然抗

酸化物である アス コル ピン酸お よび α トコ フ ェ ロー ル との 効力比較を行 っ た ･ Fig ･

5 -5 a に吸光度変化の典型的/てタ ー

ンを,Fig ･ 5 -5 b およびFig ･ 5 -5 c に各グラ フから求

l

めた酸化の 最高速度および終了時間をそれぞれ を示 した ･ フルパ ス タチ ン は酸化

の速度の 抑制お よび終了時間の延長を示 したが , ア ス コ ル ピン酸および α トコ フ

6 2

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Fig ･ 5 - 3 E ff e ct of fl u v a st ati n o n h e m i n ･ h y d r o g e n p e r o xid e ･ L I) L sy st e m

a) T y pic al tr a ci n g s of th e e xp e ri m e n t s , b) th e m a x r at e of o xid atio n a n d c) th e

e n d ti m e o f o xid atio n .H u m a n L D L (2 0 0 トLg P r ot ei n/ mi ) in H E P E S - s odi u m

c hlo rid e b uffe r (p H 7 .4) w a s i n c ub at e d w it h h e m i n (1 0 p M ) a n d h y d r o g e n

p e r o xid e (5 0 LL M ) at 2 5o

C .T h e ab s o rb a n c e o f h e m i n at th e w a v el e n gt h of 4 0 5

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W aS m O nit o r e d f o r 5 h r ･ Fl u v a st ati n (3 ,1 0 a n d 3 0 p M ) w a s ad d e d 5 mi n

p rl O r t O t h e - o Xid ati o n . V al u e s a r e m e a n s ±S E (Fig ･ 5 - 3 b a n d c; N = 5) ･

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L D L a n d h e m i n d e g r a d a ti o n

H u m a n L D L (2 0 0 トLg P r ot ei n/ m l) i n H E P E S - s o di u m chl o rid e

b u ff e r (p H 7 .4) w a s i n c ub at e d w ith h e mi n (1 0 トL M ) a n d h y d r o g e n

p e r o xid e (5 0 LL M ) at 2 5o

C i n th e p r e s e n c e o r ab s e n c e of

n u v a s t a ti n (3 0 LL M ) . T h e d e s t ru c ti o n of h e mi n ( at t h e w a v el e n gth

of 4 O 5 n m ) a n d th e c o nj u g ate d die n e f o r m ati o n ( at t h e w a v el e n gth

of 23 4 n m ) w e r e m o nit o r e d si m ult a n e o u sly f o r 5 h r ･

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a cid a n d α -t o c o p h e r ol o n h e mi n - h y d r o g e n p e r o xid e ･ L I) L

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a) T y pi c al t r a ci n g s of th e e xp e ri m e n t s,b) t h e m a x r at e of o xid ati o n a n d c)

t b e e n d ti m e of o xid ati o n

H u m a n L D L (20 0 fig P r ot ei n/ m l) i n H E P E S - s oditl m C hl o ri d e b uffe r(p H

7 . 4) w a s i n c u b at e d w it h h e mi n (1 0 FL M ) a n d h y d r o g e n p e r o xid e(5 0 FL M )at 2 5

o

C . T h e ab s o rb a n c e of h e m i n at th e w a v el e n gth of 4 0 5 n m w a s

m o nit o r e d f o r 5 b r . T e s t c o m p o u n d s (3 0 /J M ) w e r e ad d ed 5 m i n pri o r t o

t b e o xid ati o n ･

.V al u e s a r e m e a n s 土 S E ( Fig ･ 5 - 5 b a n d c; N = 5) ･

* *: p < 0 ･ 01

v s c o n t r ol .

6 5

エ ロ- ルは酸化 の速度 に は影響を与えず, 酸化の 終了時間の み を延長 した. 酸化

終了時間の 延長効果 で 比較した場合, フル パス タチ ンは これ らの 対照薬 と同等以

上の作用 を示 して いた .

4) フルパ ス タチン の 主要代謝物の作用

フルパ ス タチ ン のi n vi v o で の 抗酸化作用 を考える上 で , そ の 代謝物の活性評価 も

重要と思われ る ･ そ こで , フル パスタチ ン の ヒ トにお ける主要代謝物M 2 およびM 4

(Fig ･ 5 - 6) に つ い て も, 本系にお ける作用 の 比較を行っ た .T a bl e 5 -1 に示 したよう

に, 両者はともに銅誘発酸化 の 場合と同様に本系におい て もL D L の酸化を効果 的

に抑制した.M 4 の 作用 はフル パス タチ ンよりもやや弱か っ たが,

M 2 はフ ルパ ス タ

テン の3 - 1 0 倍強い抗酸化作用 を示 し,3 0 〝 M の 濃度で は酸化 を完全 に 阻害した .

5) フ ルパ ス タチ ンの鉄キ レー

ト作用

フ ルパス タチ ン の抗酸化メカ ニ ズム を考察する ため, 鉄の キ レー

ト作用を検討

した .Fig . 5 - 7 a にF e

2 十

あ るい はF e3 十

を3 0 〟 M 添加した際の フ ルパス タチ ンの ス ペ ク

トルを示 した . フル パスタチンは2 3 5 および3 00 n m に固有の 吸収を有するが,F e

2 '

およびF e3 十

の添加は これ らの 吸収にほとん ど影響を与えなか っ た .

一 方,Fig . 5 - 7b

に示すよう に, 陽性対照として用い たT P T Z の ス ペ クトル はF e2 十

の添加により顕著に

変化した .

考察

臨床で 用 い られて い るH M G - C o A 遼元酵素阻害薬5 種【5 , 5 5- 5 8】につ い て , そ の抗

酸化作用 をへ ミ ン 一 過酸化水素 - L D L 系【5 9] で 比較した. これ らの H M G - C o A 遼元酵素

6 6

T a b l e 5 -1 E ff e c ts o f M 2 a n d M 4 o n h e m i n -h y d r o g e n p e r o xid e ･ L D L s y s t e m

C o n °. M a x . r at e of o xid ati o n

(LL M ) ( - △m A b s 仙)

E n d ti m e o f o xid ati o n

( m i n)C o n tr ol 0

M 2 3

1 0

30

M 4 3 0

Fl u v a s t ati n 3 0

0 .3 3 ±0 .0 5

0 .2 8 ±0 .0 7

0 .1 3 ±0 .0 4 * *

N

0 . 2 6 ±0 .0 7

0 .0 7 ±0 .0 2 * *

9 9 ±5

1 3 8 ±1 1

41 5 ±3 6 * *

N

1 4 1 ±2 8

2 3 6 ±3 7 * *

D at a w e r e c al c ul at e d u s l n g e a c h tr a c l n g Of th e e xp e ri m e n ts a s d e s c rib e d i n th e M at e ri al s

a nd M et h o d s ･ H u m a n L D L (2 0 0 LLg Pr ot ei n/ m l) i n H E P E S - s o di u m c hl o rid e b u ffe r (p H 7 .4)

γas ip c u b at e d w ith h e mi n (1 0 u M ) a n d h y dr o g e n p e r o xid e (5 0 LL M ) at 2 5o

C . T h e

ab s o rb a n c e of h e mi n at th e w a v el e n gth of 4 0 5 n m w a s m o nit o r e d f o r 5 h r .

(0 - 3 0 トL M ) w e r e ad d e d 5 mi n p rio r t o t h e o xid atio n .

V al u e s a r e m e a n s ± S E (N = 5) .

* *: p < 0 . 0 1 v s c o n tr ol .

,N : N ot o xidiz e d

♂

A. < ク A

0 甘

Fl u v a st ati n

0 Ⅲ

0

O H

メ-

J # AO H

O H

0H ＼

o E

M 20 日 M 4

H O

T e st c o m p o u n d s

Fig . 5 1 6 C h e m i c al st ru ct u r e s of fl u v a s t a ti n a n d it s m aj o r m et a b olit e s

●

6 7

0 .8

a)

呂0 ･6

也AlJ

pe o ･4

A

0 .2

0

0 .8

8 0 ･6

EjCC

i o ..

帆

A

A

0 .2

0

a)

/. y

/芸1

e

u

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v

O

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tFn

l u v a st ati n

. /F e C13 ' Fl u v a st ati n

＋

2 4 0

1 .2

4 )U

F]

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A0 .4

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呂 0 ･8

也■i ⊃h(〇【乃

葛 o .4

0

b)

T Pfz

T P T Z '

iF eS O 4

F eS O4

一 卜 T P T Z ＋ F e C13

T P T Z

F e C13

l I

2 8 0 3 2 0 3 6 0 4 0 0 n m 2 4 0 3 2 0 4 0 0 4 80 5 6 0 6 4 0 n m

F ig . 5 ･7 I r o n c h el a ti o n st u d y of fl tl V a S t ati n

S p e ct r a of t h e t e st c o m p o u n d (3 0 トL M ) i n th e p r e s e n c e o r

ab s e n c e of F e S O4

0 r F e C13

at t h e c o n c e n tr ati o n o f 3 0 u M

w e r e d et e r m i n ed . ( a) fl u v a st a ti n , (b) T F r Z.

6 8

阻害薬の中で , フルパ スタチ ンが唯 一 有意な抗酸化作用 を示 し,L D L 酸化 の 過程を

顕著に抑制した .

L D L のi n vi v o で の酸化メカ ニ ズムは複雑であり, 完全には解明され て いな いが ,

原因の一

つ として遷移金屑の 関与が考えられ て い る[4] .S mi th らは【3 2] ヒ トの動脈

硬化巣に鉄や銅が付着して い る こ とを証明し, これ らの金属の L D L 酸化 へ の 関与を

示唆した . そ して ,この報告は

一

般的に最も普及 して い る銅誘発L D L 酸化実験法

【1 0] の一

つ の根拠とな っ て い る . しかしながら近年にな っ て , 通常の血祭あるい は

細胞液中に は遊離 の鉄, 銅が ほとん ど存在しない ことが指摘され る ようになり,i n

vi v o にお ける L D L 酸化時の, 遷移金属の 供給源が注目される よう にな っ た[5 9】.

B alla らは ヘ ミ ンが血液中に大量に存在する こと に着目 し,こ れが動脈硬化初期

病巣の 進展過程における金属 の 供給源とな っ て い る可能性を示 した【5 9] ･ さ らに

1 99 9 年にK lip st ei n- G r o b u s c h らは食事から の 高用量の ヘ ム 鉄の 吸収が ヒ トの 心筋梗塞

の危険率を高める こ とを報告した【6 0】. 従 っ て へ ミ ン 過酸化水素 - L D L 系は生理 的

な金属供給源 を用 いて いる点で , 遊離の銅 を用 い る系よりも生理 的酸化条件に近

く有用 と考え られ るよう にな っ た .

へ ミ ン 一 過酸化水素 - L D L 系における酸化メカニ ズム には ,へ ミ ン に含まれ る鉄 と

各種ラジカル ( ヒ ドロ キシラジカル等) の 関与が考えられる . 従 っ て 本系で は純

粋な抗酸化薬だけで なく , デフ エ ロ キサ ミ ン等の鉄キレー ト薬 も作用を示す こと

が分か っ て い る【5 9】. しかしなが らフルパ ス タチ ンが , ス ペ ク トル法による検討で

鉄のキレ ー ト作用をほとんど示さなか っ た こ とを考慮する と, 本作用は鉄の キ

レ ー ト作用 による も の で はなく ,むしろラジカル消去作用 に主 に由来する もの と

考えられた .

フルパス タチ ンの 本系にお ける酸化抑制作用の効力は対照に用 いたアス コ ル ビ

6 9

ン酸および α トコ フ ェ ロー ル と同等以上 の もの で あ っ た . しか しなが ら, そ の酸

化進行/てター ン に与え る影響は大きく異な っ て い た . すなわち , α トコ フ ェ ロ

ー

ルは本系におい て も酸化の連鎖成長段階の速度に影響を与えなか っ たが , フルパ

ス夕チ ンは効果的な抑制を示 した. 第三章で も述 べ たように こ の ようなパ タ-

ン

の違い は2 種 の化合物 の抗酸化メカ ニ ズム の違い に基 づく も の と思われ る .

本系で 認め られた フルパス 夕チ ン の有効濃度(10 〃 M) は臨床の 投与後に検出され

る血中濃度【1 4】と比較して若干高か っ た . しかしなが ら生体内のL D L 酸化はより緩

徐な条件下で ゆっ くりと進行する ことを考慮する と【3 7] ,in vi v o の 条件下で も効果

を示す可能性は十分ある と思われた .

本章の 実験で も, フルパス 夕チ ン の水酸化代謝物( M 2) へ の変化 はそ の 抗酸化活

性の 増強に つ ながる こ とが示された . 他 の H M G - C o A 遼元酵素阻害薬 の代謝物に関

する検討は行 っ て い ない の で , それ らの 抗酸化活性につ い て は不明で あるが , 薬

物本体に抗酸化活性がなく て も, 同様の 代謝変化に よりある程度 の抗酸化活性が

出てく る可能性はあ ると思わ れ 実際, ア トル バ ス タチ ンの 本体 に抗酸化活性は

ないが, そ の代謝物 の 中に抗酸化活性を有する もの が ある こ とが近年報告され た

[61] .

H M G - C o A 還元酵素阻害薬の 投与がin vi v o で L DI , の酸化抵抗性を上昇させた とい

う報告が近年増加して い る[8 ,5 0 - 5 4】. そ してそ の メカ ニ ズム は酸化されやすい

ag ed - L D L の肝臓 ヘ の 取り込み促進効果【5 0】やL D L の脂質組成の改善効果【51 ,5 3 博 で

主に説明されて きた . 今回の実験で , フルパス夕チ ン のi n vi v o で のL D L 酸化抵抗性

上昇作用 にはⅢM G - C o A 達元酵素阻害薬が共通 に有する 上記メカ ニ ズム に加えて ,

､

構造に由来する直接的な抗酸化作用が関与して い る こ とが示唆された .

一

方, 他

の H M G - C o A 遼元酵素阻害薬は顕著な抗酸化作用 を示 さなか っ た こ とか ら, 代謝物

7 0

が抗酸化作用 にある程度の 寄与をして い る可能性はある もの の , これ らの薬物のi n

vi v o で の L D L 酸化抵抗性上昇作用 は主 に脂質代謝改善作用 に基づい たもの で ある と

考えられた .

7 1

小括

へ ミ ン 一 過酸化水素- L D L 系で H M G - C o A 遭元酵素阻害薬5 種( フ ルパ ス タチ ン , プ

ラバス タチ ン , シ ンパ スタチ ン, セリバス タチ ン, アトルバスタチ ン) の L D L 酸化

抑制作用を検討した ところ , フルパ ス タチ ン の み に有意な作用が認めら れ そ の

効力は代表的な抗酸化 ピタ主ンで ある アス コ ル ピン酸,α

- トコ フ ェ ロ- ル と同等

以上の強いもの であ っ た .

フルパス タチ ンお よび他のH M G - C o A 還元酵素阻害薬がin vi v o で L D L の酸化を抑

制するとい う報告が近年増加して い る . そしてそ の 抗酸化メカ ニ ズム は これ ま

で , 酸化されやすいa g e d - L D L の肝臓へ の 取り込 み促進効果やL D L の脂質組成の 改

善効果等, 主作用で ある脂質代謝改善作用 との 関連で考えられ て きた ･ しかしな

が ら今回の 実験で , フ ルパ スタチ ン には こ れらの薬物が共通 に有す る上記メカ ニ

ズム に加えて , 直接的な抗酸化作用が寄与して い る可能性が示された ･

一 方, 他

の H M G - C o A 還元酵素阻害薬につ いて は構造由来の抗酸化作用 の寄与は少な いと思

われた【62] .

7 2

窮六章 フ ル パ ス タ チ ンおよび代謝物の ヒ ドロ キ シ ラジ カ ル消去作用

序論

これ まで の 検討で フ ル パ ス タチ ンおよびそ の 代謝物はin vitr o にお けるL D L 酸化抑

制作用 を有する こ とが 明らかとな っ た . しか しなが ら高脂血症下で進行する血管

内皮細胞, 臓器等 の酸化的障害は, 酸化L D L の みに よ っ て 引 き起こ され るわ けで は

なく, ヒ ドロ キシ ラジカル等, 活性酸素種 による脂質, 蛋白 へ の攻撃も大きな原

因 にな っ て い る と考え られて い る【3 2】. 従 っ て フル パス タテ ンがL D L 酸化抑制作用

だけで なく,こ れ らの ラ ジカル種に対して も消去作用 を有して い た場合, 動脈硬

化部位 における 血管内皮保護の観点か ら有用 と考えられた . そ こ で 本章で は , フ

ル パス タチ ンおよび代謝物の ヒ ドロ キシ ラジカル 消去活性を検討 した .

実験材料お よび方法

1) 使用薬物

フルパ ス タテ ン( ナ トリウム塩) , プラバ スタテ ン(ナ トリウム塩) , シ ンパ ス タテ

ン( オー プンアシ ッ ド体) はノバルテ ィ ス フ ァ

- マ か ら供与された ･M 2

,M 3

,M 4 ,

M 7

は田辺製薬創薬研究所にて 合成された . す べ て の 試薬 は市販品の 最高純度の も の

を用い た .

2) ヒ ドロ キシ ラジカル消去活性

ヒ ドロキシ ラジカル消去作用 は, メチルオ レン ジ一酸化亜鉛系を用 い て検討した

【6 3] . すなわち,5 m M ホ ウ酸緩衝液(p H 9 ･2) で 終濃度4 0 LL M の メチルオ レン ジおよ

び6 m M の酸化亜鉛(Z n O) を添加し懸濁液 と した ･ 試験薬物は終濃度 で0 ･ 1 % の ジメ

7 3

チルフ ォ ル ム アミ ドに溶解し添加 した . 本渡度の ジメチル フ ォル ム ア ミ ドは系に

影響を与えなか っ た. 上記混合液 に, 室温下2 0 c m の 高さか ら1 0 0 w の 光を2 時間照

射した . 反応終了後溶液を1 5 0 0 Ⅹ g で5 分間遠心し,上滑の4 65 n m の 吸光度を測定

した . 検体 によ っ て 消去されなか っ た ヒ ドロ キシ ラジカル の 量は , 光を照射しな

い ブランク溶液の 吸光度か ら光照射後の各サ ンプル の 吸光度を差し引い て求め

た . それぞれ の 図は検体によっ て消去されなか っ た ヒ ドロキ シ ラジカル 量を,コ

ント ロー

ル を1 0 0 % として 示 した .

3) 統計処理

デ ー タは平均±標準誤差(N - 4) で示 した . 多群比較は一 元配置 の 分散分析 によ っ

て行い , 有意差が認め られた場合はFisb e r のP L S D 法により検定 した ･ 危険率が5 %

以下の場合を有意差ありとした .

結果

Fig . 6 -1 にフ ルパス タチ ン , プラバ スタチ ン ,シ ンパス タチ ン の ヒ ドロ キ シラジ

カル消去作用 を示 した . フルバス タチ ン(3 - 3 0 JI M) は用量依存的で 強力な ヒ ドロ キ

シ ラジカル消去作用を示 した .

一 方 プラバス タチ ン, シ ンパス タチ ンは30 〃 M の濃

度におい て も作用を示 さなか っ た ･

フル パ スタチ ン の ヒ ドロ キ シラジカル消去作用 を標準化す るため に , そ の効力

を代表的なヒ ドロキ シ ラジカルス カ ベ ンジャー で ある ジメチルチ オウレア

J

(D M T U)【6 4] および抗酸化 ビタミ ンの α トコ フ ェ ロ-

ル と比較 した ･Fi g ･ 6 -2 に示す

ように, フルバスタチ ン の ヒドロキ シ ラジカル消去活性は これ らの 化合物と同等

の強力なもの であ っ た .

7 4

0 .0 4

′‾

＼

∽

守. . . 3)

【乃-

也リ

4 ～

3 o ･o 2

h

-

礼粥¢

烏 o . o l礼

E]

C 3 10 3 0 3 0 3 0 (LL M )

Fl u P r a Si n

F ig ･ 6 ･ 1 E ffe ct s o f Ⅱ M G ･ C o A r e d u ct a s e i n hibit o r s o n h y d r o x yl

r a di c als

T h e s c a v e n gin g a cti viti e s of fl u v a st ati n (Fl u) , p r a v a s t ati n (P r a) an d

?i m v a st a ti n (Si m ) o n h y dr o x yl r adic al s w e r e d et e mi n e d

,a s d e s c rib ed

l n th e t e x t ･ D at a a r e e x p r e s s e d a s th e m e a n s ± S E (N = 4) .

*: p < 0 .0 5 v s

c o n tr ol .

1 00

( 乃p ～

也U

'

W

蒼空50

首里

0

1 1 0

C o n c e n t r a ti o n (u M )

10 0

F ig .6 - 2 C o m p a ris o n o f fl u v a st a ti n w ith α ･t o c o p h e r ol a n d

●

D M T U f o r h y d r o x yl r a di c al s c a v e n g l n g a c ti vity

T h e a c ti vitie s of申u v a st atin ( ○) , α -t o c o p h e r ol( ロ) a n d

D M T U (Jd ) t o s c a v e n g e h y d r o x yl r adic als w a s d et e mi n ed a s

d e s c rib e d i n th e te x t . D a t a a r e e xp r e s s ed a s th e m e a n s ±S E

(N = 4) .

7 5

Fig . 6 - 3 に主要代謝物M 2,M 3

,M 4

,M 7 の ヒ ドロ キ シラジカル消去作用 を,

Fig ･ 6 - 4 に

それぞれ の構造を示 した . すべ て の 代謝物は作用 を示したが,M 7 の作用 は弱か っ

た.こ れ らの 化合物の中でイ ン ド

-

)t' 骨格に フ ェ ノ- ル性 の水酸基を有するM 2 と

M 3 は強い ヒドロ キシラ ジカル消去活性を示し, そ の効力はフルパ ス タチ ン本体の

約3 倍で あっ た .

考察

本章で はフ ル バス タチ ンお よび代謝物の ヒ ドロ キシラ ジカル消去活性を検討 し

た . フルパス タチ ンは α トコ フ ェ ロー

ルやD M m と同等の 強い ヒドロ キシ ラジカル

消去作用 を示 したが, 他の H M G - C o A 遼元酵素阻害薬プラバス タテ ン,

シ ンパス タ

チ ンは作用 を示 さなか っ た. こ の こ とは フルバ ス タチ ンの 抗酸化作用がH M G - C o A

還元酵素阻害共に共通 の もの で はなく, その 構造に由来する とい う こ れまで の知

見と 一 致する も ので あ っ た.

検討 したす べ て の代謝物が と･ドロ キシ ラジカル消去作用 を示 した こ と, および

フ ェ ノー

ル性水酸基 を有する M 2,

M 3 が さら に強い活性を示 した こ とは,ヒドロ キ

シ ラジカルの 消去活性発現には構造上側鎖の 共役二 重結合だけで なく , フルオ ロ

フ エ ニ ルイ ン ド ー

ル骨格そ の もの が重要であり, また, フ ェ ノー ル性の水酸基が

そ の効力を更に高めて い る こと を示 して いた . イ ンド - ル化合物 の 中には抗酸化

作用を有する もの が多くあり【65 ,6 6] , また, フ ェ ノ

ー

ル性の 水酸基が抗酸化活性

を増強する とい う報告もなされて い る こ とか ら【4 8L 今回 の結果はそれ らの知見 と

一 致す るも の であ っ た.

ヒ ドロ キ シ ラジカル の 消去作用 はメチルオ レンジ 一 酸化亜鉛系【6 3] を用 い て検討

した. 本系は酸化亜鉛が触媒と して働き , 溶液中にヒドロ キシ ラジカル を発生さ

7 6

1 0 0

帆■一 ■

cdU

'

W

昔遷50

首里

0

1 10 1 0 0

C o n c e n t r a ti o n (u M )

F ig ･ 6 - 3 C o m p a ri s o n o f fl u v a st ati n wi t h it s h u m a n m et a b olit e s

f o r h y d r o x yl r a di c al s c a v e n g l n g'a c ti vity

●

T h e abilit y of n u v a st ati n (○) , M - 2 ( △) , M - 3 ( A ) ,M - 4 ( □) a n d M - 7

( 観) t o s c a v e n g e h y d r o xy l r adic al s w a s d ete r m i n e d a s d e s c rib ed in th e

te x t . D at a a r e e x p r e s s e d a s th 色 m e a n ± S E (N = 4) ･

O H

Fl u v a st ati n

0

M 2

A

一.♂

H O

H O

O H

H

O H

O H

0

O E

.<ク

O H

O H

H

任IM 4

Li

M 3 0 H M 7

●

F ig ･ 6 - 4 C h e m i c al st r u ct u r e s of n u v a st ati n a n d it s m aj o r

m et a b olit e s i n h u m a n

7 7

せる系である . 従っ て用 い る反応条件に応じて ラジカル発生量は微妙に変化し,

それに応じて薬物の 有効濃度も変化 して しまう . そ こで フ ルパス タチ ンの ラ ジカ

ル消去作用を標準化するた めに, 代表的な ヒドロ キシ ラジカル スカ ベ ンジャー で

あるD M T U および天然抗酸化物質 α トコ フ ェ ロ-

ル との効力比較 を行 い , フルパ ス

タチ ンが これらの対照薬と同等の強力なヒ ドロ キ シ ラジカル消去活性を有する こ

とを明らか にした . D M T U, α トコ フ ェ ロ ー ル がラジカル反応に よ っ て引き起こさ

れる細胞, 組織障害を抑制す る こ とは既に報告されて い る【4,6 4】･ 従 っ て ,

これ ら

と同等の ヒドロ キシ ラジカル消去活性を示 すフ ルパスタチ ンも, 本ラジカル によ

っ て媒介される細胞の 酸化的障害【3 2】を阻止する可能性がある と思 われた ･

本実験で は反応はアル カリ性の 条件下(p H 9 ･2) で行われ た ･ 従 っ て , 生理 的な条

件で ある中性下(p H 7 . 4) で は これ らの化合物は違 っ た挙動 を示す可能性もある ･ し

か しながら, 既に第五章で述べ たように,これ らの 化合物株p H 7 ･4 で 行う ヘ ミ ン 一

過酸化水素誘発L D L 酸化反応におい て も, 効果的な抑制活性 を示 して おり【6 2】, こ

の 酸化反応 には ヒ ドロ キシ ラジカル等, 各種ラジカル の 関与も考えられる こ とか

ら,これ らの化合物は生理的p H におい て も同様 の抗酸化作用 , ラジカル消去作用

を示すと考えられた .

7 8

小括

フ ル パス タチ ンは天然抗酸化物質の α トコ フ ェ ロー

ル , 代表的ヒ ドロ キシ ラジ

カルス カベ ンジ ャー の D M m と同等以上の 強力な ヒドロ キシ ラジカル消去作用 を示

した .

一 方, 他の H M G - C o A 還元酵素阻害薬には作用は認め られなか っ た こ とか

ら,L D L 酸化抑制作用 と同様に

, ラジカル消去作用 も本化合物の 構造に由来する も

の で ある ことが示唆された .

検討したす べ て の代謝物が ヒドロ キシ ラジカル消去作用 を示 し, フ ェ ノー

ル性

水酸基を有する M 2 と M 3 はさらに強い活性を示 した/ 本結果はフル パ ス タテ ンの ヒ

ドロキ シ ラジカル消去活性発現に は構造上側鎖の 共役二 重 結合だけで なく , フル

オロ フ ェ ニ ルイ ン ド ー ル骨格そ の もの が重要とな っ て おり, また, 代謝物 におけ

る フ ェ ノ ー ル性 の水酸基は, そ の抗酸化効力の 増強に大きな寄与をして い る こ と

を京して い た【6 7】.

7 9

節七草 フ ル パ ス 夕チ ン および代謝物の スー ′ ト オキ シ ドア ニ オ ン消

去作用

序論

血管内皮細胞,マ ク ロ フ ァ

ー ジある いは好中球の 存在下引き起 こされるL D L の酸

化お よび内皮 の 障害 には, 細胞壁の N A D P H o xid a s e によ っ て媒介され るス-

/ ト オ

キシ ドア ニ オ ン の産生が大きな寄与をして い る と考え られて い る【6 8,6 9】･ 従 っ て

N A D P H o xid a s e によ っ て 生成するス一 汁 - オキシ ドアニ オン をラジカル の連鎖反応

が始まる前に直接消去する ことは, 細胞を酸化的障害から防御する 上で 有用 と思

われ る .

フ ルパ ス 夕チ ンお よびそ の 代謝物が ヒ ドロ キシ ラジカル の 消去活性を示す こ と

は既に第六章で述 べ た ･ しかしなが ら, これ らの化合物 の スー パ ー オキ シ ドア ニ

ォ ンに対する消去作用 は明らかとな っ て い ない ･ 抗酸化其 の ラジカル消去活性

は, 反応するラジカル種に よ っ て全く異なり, 例えば前章で陽性対照として用い

た ラジカルス カ ベ ンジ ャ-

の D M T U は,ヒ ドロ キシ ラジカル を効果的に消去する

が , ス - / 卜 オキ シ ドア ニ オ ン に対して は作用 を示さない こ とが分か っ て い る

【64] . 従 っ て , 活性酸素種 に対する消去作用は独立した系でそ れぞれ確認する必要

が ある .

本章で は, フルパ ス夕チ ンおよび代謝物の ス-

′ ト オキ シ ドアニ オ ン消去作用

を, 化学反応 による ス- パ ー オキシドアニ オン発生系および好中球 を用い た生物

学的な ス-

/て-

オキ シ ドア ニ オ ン発生系の 両 系を用 いて 解析した ･

実験材料および方法

8 0

1) 使用薬物

フルパス タチ ン(ナ トリウム塩如まノ バルティ ス フ ァ-

マ か ら供与された ･M 2

,

M 3,M 4

,M 7 は田辺製薬創薬研究所にて 合成された ･ ル シ フ ェ リ ン誘導体( C L A ,

2 -

m et h yl- 6 -

p h e n yl- 3

,7 - dih y d r oi mi d a z o

-【1 ,2 - a】p y ra zi n 3 -

o n e) は東京化 成か ら,T r ol o x はア

ルドリ ッ チか ら,Fi c oll - P a q u e は フ ァル マ シア A B か ら購入 した ･ すべ て の試薬は市

販品の 最高純度の もの を用 いた ･

2) N A D fI/ P h e n a zi n e m et h o s ulf at e (P M S)r Nit r o blu e t etr a z oliu m ( N E T) 系

N A D 即 M S 仰 B T 系を化学的なス-

/ ト オキ シ ドア ニ オ ン発生, 検出系として 用

い た【7 0,71] . すなわち ,

1 6 0 p M N A D H,4 0 u M N B T

,8 H M P M S を含むリ ン酸緩衝

生理食塩液(P B S, p H 7 ･ 4) 中で発生する ス

-

′ ト オキシ ドアニ オ ン に よ っ て ,N B T が

遼元され る こ とを利用 した ･ 検体存在下N B T の還元 に起因する5 6 0 n m の 吸光度の

上昇を2 分間測定し, 反応が直線的に進む区間の 吸光度上昇率を得た ･ 検体は終濃

度で0 .7 % 以下 の ジメチル スル フ ォ キシ ド( D M S O) に溶解 して 系に添加した ･ 本濃度

の D M S O が系に影響を与えない こ とは別途確認した ･

3) P oly m o rp b o n u cl e a r l e u k o c yte s ( P M N)/ C L A 釆

P M N / C L A 系を細胞系の ス ー パ ー オキシ ドア ニ オ ン発生, 検出系と して用 いた

【7 2] . 本系で はス-

′ 卜 オキシ ドアニ オ ンは生理的条件下 と同じよう に活性化 され

た好中球のN A D P H o xid a s e を介して産生する ･P M N は健常人ボランテ ィ アの 末梢血

か らFi c oll - P a cq u e を用い た遠心分離 によ っ て 常法通り得た ･ 混入する 赤血球は低張

液によ っ て溶血 させ排除し, 使用時まで0 ℃ の H a n k st

b al a n c ed s alt s ol uti o n ( H B S S)中

で 保存した(1- 2 時間以内) I

1 06P M N/ m l

,1 EL M C L A

,1 0 0 JI M di eth yle n e

- h i a mi n e-

p e n t a a c eti c a cid ( D T P A) を2 m l の H B S S 中に添加し, 検体存在下,3 7 ℃ で5 分間イ ンキ

8 1

ユー ベ - シ ョ ン した .

P M N からの ス ー パ ー オキ シ ドア ニ オ ン の産生は1 0 n M

p h o rb ol m y ri st at e a c et at e (P M A) 刺激に よ っ て 開始した ･C L A はス

-

/ ト オキ シ ドア

ニ オン の 高度選択的な発光検出試薬で ある ことが知られて い る ･ 検体 によ っ て 消

去されなか っ たス-

/ ト オキ シ ドアニ オ ン畳は発光検出器( Al ok a) に よ っ て C L A の

発光として検出した . 検体の ラジカル消去能力は検体を含まな い コ ン トロ- ル と

の最大発光強度の 比較で評価した . 検体に よっ て細胞死が起 こ っ て い ない こ と

は, 検体と2 0 分間イ ンキ ュ- ベ シ ョ ンしたP M N をT ri p a n blロe に よ っ て染色して確認

した .

3) 統計処理

デ ー

タは平均 ±標準誤差 ( N - 3 - 4) で 示した ･ 多群比較は 一 元配置の分散分析に

ょっ て行 い, 有意善が認め られた場合はFis b e r の P L S D 法に より検定した ･ 危険率が

5 % 以下の 場合を有意差ありとした ･

結果

1) N A D H n,M S m B T 法にお けるス -

′ ト オキシドア ニ オ ン消去活性

フルパス タチ ンおよび代謝物のN A D 町P M S 仰 B T 系におけるス -

/ ト オキシ ドア

ニ オ ン消去活性を検討した ･ Fig ･ 7 -1 にフルパス タチ ン の 作用 を示 した ･ 本系にお

いて ス 一 汁 -

オキシ ドジス ム タ- ゼ(S O D) は効果的にN B T による 吸光度上昇を抑制

した こ とか ら, 本系がス ー パ - オキシ ドア ニ オン の発生 を検出して い る ことが確

認された . フルパス タチ ン(0 ･3 -1 0 EL M ) は用量依存的な吸光度上 昇抑制作用を示 し

た . そ こ で , 本化合物の ス-

J ト オキシドア ニオ ン消去活性を 一 般化するため

に,α トコ フ ェ ロ

- ルの 水溶性誘導体で ある T r ol o x t の効力比較を行 っ た ･ Fig ･7 -2

8 2

2

帆

ゴ帆

0

*

*

C 0 .3 1 3 10 10 0 0

F l u v a st a ti n s o I)

(LL M ) ( U / m l)

F ig ･ 7 -1 S u p e r o xid e a ni o n s c a v e n g l n g effe c t o f n u v a st a ti n●

i n th e N A I) H 付 M S/ N B T sy st e m

T b e s u p e r o xid e a ni o n s c a v e n g l n g a cti vit y of 伽 v ast ati n w a s

d et e r m i n e d a s d e s c rib e d i n th e t e x t . D a t a a r e e x p r e s s e d a s t h e

m e a n s ±S E (N = 4) .

*: p < 0 .0 5 v s c o n tr ol ･

1 0 0

帆

臼O

■

畠青

竜葛50

鼻蔓

0

1 10 1 0 0

C o n c e n t r ati o n ( u M)

F ig ･ 7 - 2 C o m p a ri s o n o f t h e e ff e c t s of fl u v a s t ati n a n d t r ol o x

i n t h e N A I) H 伊 M S 爪rB T s y s t e m

T h e a c ti vitie s of fl u v a s t ati n ( 0 ) a n d tr ol o x (＋) w e r e d et e mi n ed a s

d e s c rib e d i n th e t e x t . D at a a r e e x p r e s s ed a s th e m e a n s ±S E (N = 4) I

(B a r s a r e s m alle r th a n s y m b ol s ･)

8 3

に示 したように , フルパ ス 夕チ ンの ス ー パ ー オキシ ドア ニ オ ン消去作用 はT r ol o x と

同等で あっ た .

フルパス 夕チ ンの 主要代謝物( M 2,M 3

,M 4

,M 7) につ い て も, 同様 にス ー パ ー オキ

シ ドア ニ オ ン消去活性を検討した . Fig . 7 - 3 にそれぞれ の 構造を,Fig . 7 -4 にそ の 結

果を示す. 全て の代謝物はスー パ ー

オキシ ドアニ オ ン の 消去作用 を示 したが, そ

＼

の 中で M 4 の 作用 は, フルパ ス夕チ ン本体より も弱か っ た . フルパ ス 夕チ ン のイ ン

ド -

ル骨格における5 位ある い は6位 に水酸基 を有する M 2,M 3 の 作用 は強力で あ

り , フルパス 夕チ ンの 約3 倍のス - パ ー オキシ ドアニ オ ン消去活性 を有して い た .

2) P M N / C L A 系にお けるスー パ ー

オキ シ ドア ニ オ ン消去活性

フ ルパス タチ ンおよび強い作用 を示 した代謝物M 2,M 3 に 関して は, さらにP M A

に よ っ て 誘発される好中球の ス ー パ ー

オキシ ド産生系で の 評価 も行 っ た .Fig ･ 7 - 5

にフル パスタチ ン ,M 2

,M 3 の 本系にお けるス

ー パ ー

オキシ ド消去活性を示 した ･

フ ル パス タチ ン(1 -1 0 /1 M ) は用量依存的にC L A の 発光強度を低下させた ･ 本系にお

い て は, フ ル パス タチ ン の発光抑制効力はM 2 ,M 3 と同等で あ っ た ･

考察

フルパ ス 夕チ ンお よびそ の 代謝物がin vi 加 におけるL D L 酸化抑制作用,.

ヒドロ キ

シ ラ ジカル消去作用を示す ことは, 既に述べ て きた . 本章で は こ れ らの化合物の

ス- パ ー オキシ ドアニ オン消去作用を検討した .

前章におい て , ヒ.ドロ キシ ラジカル消去活性にはフ ルパス夕チ ンの フルオロ フ

ェ ニ ルイ ンドー ル骨格そ の もの が重要である こと, 代謝変化によ っ て生ずる フ ェ

ノ ー ル性水酸基がそ の活性を上昇させ る ことを述 べ た. 本章の N A D H 作 M S 仰 B T 系

8 4

0 Ⅰ‡

Fl u v a st ati n

.♂

O H

AJ #

H O

H O

O H

0

0

O E

H

M 2C E

M 4

『O H

H しi

O H

O H

M 3 0 H M 7

F ig ･ 7 ･3 C h e m ic al st ru c ttl r e S Of fl u v a st ati n a n d it s

m aJ O r m et a b olit e s●

10 0

帆

白

･

昌富q) 自

習毒5 0

q'

p . 演戸

＼ ー

こ乃

0

0 .1 1 1 0 10 0

C o n c e n t r ati o n ( p M)

Fig ･ 7 ･4 C o m p a ris o n of t h e e ff e ct s o f fl u v a st a ti n a n d it s

m e t a b olit e s i n th e N A D IIIP M S/ N B T s y st e m

T h e a c ti vitie s of 且u v a st ati n (○) , M 2 (△) , M 3 ( ▲) , M 4 ( □)l

a n d M 7 (旬) w e r e d ete mi n e d a s d e s c rib ed i n th e t e x t ･ D a t a

a r e e x p r e s s e d a s th e m e a n s 士S E ( N = 4) ･

8 5

′ ､-

Oh.

貞一〇U

･喜::CC れ

網芸名

謁'

3)

10 0

5 0

0c 1 3 1 0 1 0 10 ( p M )

Fl u v a s t a ti n M 2 M 3

Fig . 7 - 5 T h e E ff e ct s of n u v a st a ti n , M 2 a n d M 3 o n t h e

a m o u n t o f s u p e r o xid e a ni o n s i n t h e P M N / C L A

s y st e m

T h e effe cts of fl u v a st ati n,M 2 a n d M 3 o n t h e a m o u n t of

s u p e r o xid e a ni o n w e r e d et e 皿 i n ed a s d e s c rib e d i n th e t e x t .

D a t a a r e e xp r e s s ed a s th e m占an s ±s E ( n = 3) .

*: p < 0 . 0 5 v s

c o n tr ol .

8 6

における検討で も,フルパス 夕チ ンおよび検討 したす べ て の 代謝物は作用を示

し, また, フ エ ノ- ル性の 水酸基 を有する M 2

,M 3 が未変化体よりも強 い 活性を示

した こ とか ら, こ の概念 はス -

/ ト オキ シ ドア ニ オ ンの 消去作用 にも概ね適応可

能で ある と思われた ･ しかしなが ら,M 4 と M 7 に 関して は , ス

ー パー

オキ シドアニ

ォ ン消去活性とヒ ドロ キシラジカル消去活性の 間に相違が認められた ･ 前章の ヒ

ドロ キ シラ ジカル消去活性の検討で はM 4 はフ ルパ ス夕チ ン本体と同等の 活性を示

し,M 7 は これ らの 代謝物の中で 最も弱い作用 を示 して い た(Fig ･

6 - 3) ･ しか しなが

ら, ス-

/ ト オキシ ドア ニ オンに 関して は,M 7 は M

.4 よりも強い消去活性を示 し

た . 詳細なメカ ニ ズム は不明で あるが , こ の現象は フルパ ス 夕チ ン の 各部分構造

が , 反応する ラジカル種によ っ て , それぞれ異な る レベ ル の 寄与をして い る こと

を示唆して い る .

本章の 目的はH M G - C o A 遼元酵素阻害作用 を介さない , 検体 の直接的な ス-

/ 汁

ォキシ ドア ニ オ ン消去活性を調 べ る ことに あ っ た ･ 従っ て そ の検 鮒 ま他の要素の

入り にくい化学的なス -

′卜 オキシ ドア ニ オ ン発生系( N A D H G M S 仰 B T)[7 0 , 7 1] を

中心に進めた . しか しなが ら, 脂質低下薬が動脈硬化 の危険を軽減する ために臨

床で用い られてお り, また , 細胞壁か らの N A D P H o xid a s e を介した ス -

/ ト オキシ

ドア ニ オン の 産生が, 動脈硬化部位における酸化 的細胞障害に 深く関与して い る

こ と【68 ,6 9] を考慮する と, 生理的な意義は細胞系で あるP M Ⅳ C L A 系【7 2] の 方が大

きい と思われ る .

好中球,マ ク ロ フ ァ

ー

ジ, 血管内皮細胞は , 細胞壁 におけるN A D P H o xi d a s e を介

して ス - /て - オキシ ドア ニオンを産生するが【7 3] , そ の過程に は低分子畳G T 帽 合

蛋白の修飾過程が含まれて い る【7 4] ･コ レス テ ロ ー ル合成系(メバ ロ ン経路) の下流

で生成される長鎖イ ソプレノイ ドがG T P 結合蛋 白を修飾 し, それが 恥 D P H o xid a s e

8 7

の 活性化 に つ ながる こ とが知られて い る[7 5] ･ 従 っ て ,H M G - C o A 還元酵素阻害作

用を有する コ ン ^o

クチ ン ,ロ バ スタチ ン, シ ン パ スタチ ン等を細胞と数日イ ンキ

ュ-

べ- シ ョ ンする とN A D P H o xid a s e を介する ス

-

′ 卜 オ キシ ドの 産生は抑制され

てくる ことが報告されて い る【7 6,7 7] . また本抑制はメバ ロ ン酸 を添加する こ とに

ょり回復する こ とか ら, 検体の H M G - C o A 遅元酵素阻害活性に基 づい たもの で ある

こ とが証明された . フルパ ス夕チ ンもまた, 他 の スタチ ン系薬物と同様にH M G -

c o A 遼元酵素阻害作用 に基づくス- 八 一

オキシ ドア ニ オ ン産生抑制作用 を有して い

ると思 われ た . そ こで 今回 の検討で は, ラジカル消去作用 を検出す るために , 読

験薬物をP M N 刺激 の直前に添加し,H M G - C o A 還元酵素の 阻害を介した産生抑制作

刷7 6,7 7】が関与しにく い条件に設定した ･ そ して こ の こ とは, 本実験にお いて 見

出されたフ ルパ ス 夕チ ン の 発光抑制作用 がメバ ロ ン酸添加によ っ て 影響を受けな

いと いう予備的な検討結果によ っ て も裏付けられた ･

フルパ ス 夕チ ンはN A D ⅣP M S 仰 B T 系にお い て M 2 や M 3 よりも弱い作用を示 し

た .こ の序列はフルパ ス夕チ ン関連化合物 の抗酸化作用に関す る他章の検討結果

とも一 致して いる . しかしなが ら,

P M N/ C L A 系におい て の み, フルパス夕チ ンは

M 2 や M 3 と同等の 作用を示 した ･ 従 っ て , フルパ ス夕チ ンは ,N A D P H o xid a s e によ

っ て 媒介される ス - ′ ト オキ シ ドアニ オ ン の産生【7 2] にお い て ,M 2 や M 3 が有さな

い 直接的な産生抑制作用, 例えば, 本産生系で 重要な役割を果 た して い るp r ot ei n

ki n a s e C【7 8 博 の 直接阻害作用等を有して い る可能性があると思 われた ･

体内で 生ずるL D L 酸化や動脈硬化部位にお ける細胞障害の進行メカ ニ ズム に関し

て は不明な部分も多いが , ス-

′lo

- オキシ ドアニ オン【7 9 ,80] や ヒ ドロ キシ ラジカ

ル【3 2 博 の 活性酸素種が こ れらの 過程に大きく関与して い る こ とが示唆されて い

る . 血管内皮や中膜か らの ス- パ ー オキシ ドア ニ オ ン の 産生はN A D P H o xi d a s e[6 8] ,

8 8

c y cl o o x y g e n a s e【8 1 いip o x y g e n a s e【81】,n it d c o xid e s y nt b a s e【8 2】等様々 な酵素から生ずる

と考 えられて い る . 近年 , 血管内皮によ るL D L の酸化が , 過剰発現させ たS O D に よ

っ て抑制され る こ とが報告されており〔7 9] , また , 血管内皮 におけるス-

/ ト オキ

シ ドア ニ オ ンの産生が . 動脈硬化部位に おける血管機能の損傷を引き起 こ して い

る という ことも報告されて い る【80] . また ヒドロ キシ ラジカル に 関して も, 動脈硬

化部位で 細胞障害を引き起こす可能性が示されて い る【3 2】･ 従 っ て抗酸化酵素ある

い は抗酸化物質に よ っ て これらの 活性酸素種を適度 に消去する こ とは,L D L の酸化

を抑制する だけでなく , 血管細胞障害の 進行を抑制する こ とに も結び つ くと考え

られ る . そ して ,こ れら の実験で 活性酸素の直接的な消去作用 を有する こ とも明

らか とな っ た フ ルパス タチ ンは, 主作用 の 脂質低下作用以外 の面か らも, 動脈硬

化 の危険を軽減する上 で有用と考えられた･

8 9

小括

フルパ ス タチ ンお よび代謝物の ス ー パ ー オキシ ドア ニ オン消去作用 を検討し

た . フルパ ス タチ ンはN A D 町P M S 仰 B T 系にお いて 用量依存的な作用 を示 し, そ の

効力は α トコ フ ェ ロー ル の水溶性誘導体で あるT rol o x と同等で あ っ た . また, 検討

した全て の 代謝物( M 2,M 3

,M 4

,M 7) も本系におい て用量依存的な消去作用 を示 した

が , そ の 中で フ ェ ノー

ル性の 水酸基を有するM 2,M 3 は フルパス タチ ン の 約3 倍強い

作用 を示 した . さ らに フ ルパスタチ ン,M 2

,M 3 につ いて は, 好中球を用 いたス ー

パ ー オキシ ドアニ オ ン産生系に対する消去作用も検討したと こ ろ, す べ て の 化合

物が本系にお いて も有意な消去作用 を示 した .

フ ルパス タチ ン 関連化合物が他の 活性酸素種で ある ヒ ドロ キ シ ラジカルの 消去､

作用 も有する こ とは第六章で既 に述べ てお り, これ らの 化合物は活性酸素種に よ

っ て 引き起 こ され る細胞障害に対 し保護効果 を示す可能性が ある と思われた【8 3] ･

9 0

総括

近年, 動脈硬化 の 進展 に はマ ク ロ フ ァー ジ へ の酸化L D L の取り込み過程が, 大

きな役割 を担 っ て い る こ とが 明らか にされて きた. 酸化L D L の 取り込みはス カ ベ ン

ジ ャー レセ プタ - を介 して行われ るが,

マ ク ロ フ ァー

ジ内の コ レス テ ロー ル含量

が上昇して も こ の 取り込みは抑制されない . 従 っ て酸化L D L の 取 り込みは無秩序 に

続き, 血管内皮下で 泡沫イヒ抑胞を形成して い くとされ て い る ･ この ような背暴か

ら, 高脂血症患者の 治療にお いて 血中のL D L 含量を低下 させ る だけで なく , そ の酸

化変性過程 を抑制する こ とがで きれば, 動脈硬化初期病巣の 進展抑制とい う点で

臨床上有用 と考え られて い る .

本研究で はH M G - C o A 還元酵素阻害作用に基づく高脂血症治療薬で ある フルバ ス

タチ ンの 患者 へ の 投与が ,L D L の酸化抵抗性を上昇させ る 可能性がある という知見

を研究の発端とし, 動物モデル を用い たi n vi v o で の抗酸化作用 の 検討 , お よびi n

vit r o の 実験 による抗酸化 メカニ ズム の解析を進めた ･

第 一 章では臨床で 報告されたフ ルパス タチ ン投与に よるL D I 腰 化抵抗性上昇作用

が , ヒ ト以外の 動物モ デル にお い て も再現で きる かを検討する ため, 高コ レス テ

ロー ル食負荷ウサ ギを用 い た検討を行 っ た ･ フ ルパス タチ ン の 連続投与ほL D L の酸

化抵抗性を有意に上昇させ , 上記作用が こ の ような動物モ デル にお いて も再現さ

れる ことが明らか とな っ た . 本実験におい て 比較対照として用いた プラバス タチ

ン は作用を示 さなか っ た こ とか ら, フルパス タテ ン投与によるL D L 酸化抵抗性上昇

作用にはH M G - C o A 還元酵素阻害薬が共通に有する脂質代謝改善作用とは別の因子

が関与して い る もの と考え られた ･

第二 章で は, フルパ スタチ ンのi n vi v o で の抗酸化効果をより明確にする目的で ,

酸化ス トレス の 上昇モ デル で ある ビタミ ンE 欠乏食負荷ハ ムス タ ー を用 いた検討 を

9 1

進めた . ビタミ ンE が欠乏して い るハ ム ス ター で は, 血中酸化ス トレス マ

ー

カ-

の

顕著な上昇お よび血衆脂質の酸化抵抗性の低下が認 められ 体内で酸化ス トレス

が上昇して い る こ とが明らかとな っ た . フルパ ス 夕チ ンお よび陽性対照として用

いた抗酸化薬プロ ブコ-

ル の投与は, 酸化ス トレス マー カ ー を強力に正常化 した

が , 他の H M G - C o A 達元酵素阻害薬プラバ スタチ ン の 投与で は同様 の 作用は認めら

れなか っ た . 従 っ て フ ルパス夕テ ンの 投与はL D L の酸化抵抗性 の 上昇だけでなく ,

体内の 酸化 ス トレスー 般の 軽減につ なが る可能性が示唆され そ の効果 は化合物

が有する抗酸化作用 に起因するもの と考え られた .

第三章で は フル パ ス 夕チン のi n vitr o の抗酸化作用 の詳細な解析 の第 一 段階とし

て , 銅誘発L D L 酸化抑制作用 を検射した . フルパス 夕テ ンはL D L 酸化 に対し用量依

存的な抑制作用 を示 し, その 作用様式はフ ェ ノー

ル性 の抗酸化物質である α トコ

フ ェ ロー

ル とは異な る特徴的な もの で あ っ た . 本実験系におい て , フルパ ス 夕チ

ンの 側鎖 二 重結合考還元 した検体, および プラバス タチ ン にはin vitr o の L D L 酸化抑

制作用 が全く認 められなか っ た こ とから, フルパス 夕チ ン の抗酸化作用 はH M G -

c o A 遅元酵素阻害共に共通の もの で はなく , そ の構造に由来する もので ある こ とが

示された .

第四 章で はフ ルパ ス 夕チ ン の 関連化合物 に関してi n vi 加 の 銅誘発L D L 酸化抑耕作

用 の検討 を進めた . 通常ラセミ体(3 R S,S S R) で投与され る フ ル パス 夕チ ンの 脂質低

下作用 は, ほとん ど(3 R,5 S) 体の みによっ て 引き起 こ され る こ とが知られて い る

が , 本章の検討により ,L D L の 酸化抑制活性に関して は, (3 S ,

5 R)体も(3 R,5 S)体と

同等の能力を有する こ とが明らか とな っ た . また , フルパ ス夕チ ンの ヒ トにお け

る主要代謝物( M 2 ,M 3

,M 4

,M 7) はすベ て L D L 酸化抑制作用 を示 したが, そ の 中で も

フ ェ ノー ル性の 水酸基を有するM 2

,M 3 は未変化体の 約3 0 倍か ら5 0 倍の 非常に強い

9 2

抗酸化活性を示 した . 従 っ て , フル パスタチ ン投与後の 体内で の 酸化ス トレス 軽

減作用 には, (3 S,5 R)体や, 種々 の 代謝物 の抗酸化作用 が総合的に寄与して い る も

のと考え られた .

第玉 章の実験で は, 銅誘発L D L 酸化系よりも生体内のL D L 酸化メカニ ズム に近 い

系と して近年注目され て い る へ ミ ン 一 過酸化水素誘発L D L 酸化系を用 い, 臨床で使

用 されて い る H M G - C o A 還元酵素阻害薬5 種( フルパスタチ ン , プラバ スタチ ン, シ

ンバ スタチ ン , セリバス タチ ン, アトロ バスタチ ン) の L D L 酸化抑制作用 を解析し

た . そ の 結果 フ ル バス タチ ン の みに顕著な作用が認められ , 本作用 はス タチ ン系

薬物の 中で フルパス タチ ンが有する特徴で ある こ とが明 らか とな っ た.

第六章, 第七章で は更にフルパス タチ ンお よび代謝物 の活性酸素 ( ヒ ドロ キシ

ラ ジカル, ス ー パ ー オキ シドアニ オン) 消去作用 を検討 した . フルパス タチ ンは

用量依存的な活性酸素種の 消去作用を示 し, そ の効力は天然の抗酸化薬である α

トコ フ ェ ロ-

ルやそ の水溶性誘導体T r ol o x と同等であ っ た . また , 検討した全て の

代謝物( M 2 , M 3,M 4

,M 7) も用量依存的な ラジカル消去作用 を示 し,

M 2,M 3 は これ

らの検討にお い て も特に強力な作用を示 した . 従 っ て , フ ル パ ス タチ ンお よびそ

の 代謝物はL D L の酸化抵抗性の 上昇だけでなく ,これら の活性酸素種によ っ て 引き

起 こ される 内皮細胞等の 酸化的障害に対して も保護効果を発揮する 可能性が ある

と考えられた .

以 上の 実験か ら, フル パ スタチ ンは脂質低下作用以外に , 抗酸化作用 とい う構

造由来の 特徴 を有して い る ことが明らか とな っ た . 高脂血症治療薬は動脈硬化の

進展 を抑制する目的で臨床で 用い られて い る . 動脈硬化の進展にL D L の酸化の過程1

およびラジカル反応による血管内皮障害の過程が深く 関与して い る ことを考慮す

る と, 本結果は臨床的にも意義のある知見と思 われた.

9 3

謝辞

本論文の 作製にあたり , 終始 ご懇切なる御指導を賜り ました千葉大学薬学部教

授 渡辺和夫博士に深く感謝致します. また, 御指導および激励を頂きました千

葉大学大学院薬学研究科教授 矢野 展吾博士 , 同案学研究科助手 中村智徳博士

に心か ら御礼申し上げます.

本研究は田辺製薬株式会社にて行われました. 本研究 の 機会を与えて いただき

ました 田中登志於社長な らびに中島昭英研究開発本部長 に厚く御礼申し上げま

す. また, 多く の励ましと ご指導をい ただ きました松本和男博士 , 本間靖博士 ,

岩崎為雄博士 , 小松原 三郎博士, 村田栄博士, 石塚徹博士 に厚 く御礼申し上 げま

す.

本研究を進める に あたり , 常に適切なる御指導と御坪捷 を賜 りました鈴木利 一

博士 , 成田寛博士 , 安原三紀子博士 に深く感謝申し上げます . 最後 に本研究を行

う に あたり多大なる御協力を頂きました . 小 田原 昭男博士 , 田中敬子研究員 , 岡

幸蔵研究員, 吉川正美博士 , 大橋徳子博士, 医薬事業本部お よび関係部門におけ

る ロー

コー

ル担当の 皆様, な らびに他の 諸兄に心 より感謝いた します .

9 4

参考文献

1) G old st ei n J L,H o Y K

,B a s u S K a n d B r o w n M S : B i n di n g sit e o n m a c r o p h ag e s t h at

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c h ol e st e r ol d e p o siti o n . P r o c . N atl . A c a d . S °i . U . S . A . 7 6,3 3 3 -3 3 7 (1 9 7 9) ･

2) B e rli n e r J A a n d H ei n e ck e J W : T h e r ol e of o xidi z e d lip o p r ot ei n s in at h e r o g e n e sis ･ F r e e ･

R a d . Bi ol . M e d ･ 2 0,7 0 7 -7 2 7 (1 9 9 6) ･

3) C a r e w T E,S ch w e n k e D C a n d S t ei n b e rg D : An ti ath e r o g e ni c eff ec t of p r o b u c ol u n r el at e d

t o it s h y p o ch ol e s t e r ol e mi c eff e c t ･ E vid e n c e t h at･a n ti o xid a nt s i n vi v o t a n s el e cti v ely in hibit

l o w d e n sity lip op r ot ei n d e g r a d ati o n i n m a c r o p h a g e - ri c h fatty str e a k s a n d sl o w th e

p r o g r e s si o n o f atb e r o s cl e r o si s i n t h e W at a n a b e h e rit able by p e rlipid e m i c r a b bit ･ P r o c･ N a tl ･

A c ad . S °i . U . S . A .8 4

,7 7 2 5 - 7 7 2 9 (1 9 8 7) .

4) D a u g h e rty A a n d R o s el a a r S E : Lip o p r ot ei n o xid atio n a s a m e diato r of at h e r o g e n e sis :

i n si gh ts f r o m p h a rm a c ol o gi c al st u di e s ･ C a rdio v a s c ･ R e s ･ 29,

29 7 -31 1 (1 9 9 5) ･

5) Pl o sk e r G L a n d W ag st aff A J : Fl u v a st a ti n - a r e vi e w of its p h a rT n a C O l o g y an d u s e i n th e

m a n a g e m e n t of b y p e r cb ol e s t e r ol a e m i a ･ D m g s 5 1,4 3 3 - 4 5 9 ( 1 99 6) ･

6) B r o w n W V : A s y m p o si u m ･ H yd r o x y m eth ylglut a r yl c o e n z y m e A r ed u ct a s e i n hibiti o n ･

F l u v a s t a t in ,a cli n i c ali n v e s tig at o r s

'

u p d ate. Am . J ･ C a rdi ol ･ 7 3

,1 D -6 1 D (1 9 9 4) I

7) L a n gt ry H D an d M a rk h a m A : Fl u v a st ati n-

a r e vi e w o fit s u s e i n li pid dis o rd e rs ･ D r u g s

5 7,5 8 3 - 6 0 6 (1 9 9 9) ･

8) A vi r a m M,H u s s ei n 0

,R o s e n blat M

,S c hl e zi n g e r S

,H ay e k T a nd K eid a r S : I n t e r a cti o n s

of pl at el et s,

m a c r o p b ag e s)

a n d lip op r ot ei n s i n Ⅱy p e r c b ol e s t e r o18 m i a ･ A n ti at h e r o g e ni c

eff e ct s of H M G - C o A r e d u ct a s e in hibit o r th e r ap y ･ J ･ C a rdio v a s c ･ P h a r m a c ol ･ 3 1,3 9 - 4 5

( 1 9 9 8) ･

9 5

9) H a v el R J,E d e r H A a n d B r ag d o n J H : T h e dist rib uti o n a n d ch e mi c al c o m p o sitio n of

ultr a c e n t ri fu g ally s e p a r a t e d lip o pr ot e in s i n h u m a n s e r u m . J . Clin . I n v e s t ･ 3 4 ,1 3 4 5 -1 3 5 3

( 1 9 5 5) .

1 0) P u hl H,W a e g G a n d E st e rb a u e r E : M eth o d s t o d et e r mi n at e o xid ati o n of l o w - d e n sity

lip op r ot ei n s ･ M e th o d ･ E n zy m ol ･ 2 3 3,4 2 5 -4 4 1 (1 9 9 4) ･

l l) T s e F L S,S m ith H T

,B all a r d F H a n d N i c ol ettti ∫: D isp o siti o n of 加 v a st atin

,a n i n bibit o r

of H M G - C o A r e d u ct a s e,1 n m o u s e

,r a t

,d o g ,

a n d m o n k e y . Bi op b a m ･ D m g ･ D is p o s ･ l l,

5 19 - 5 3 1 (1 9 9 0) ･

1 2) Fi n ck h B,K o n t u s h A

,C o m m e n t z J

,H B b n e r C

,B u rd el ski M a n d K o hls ch Btt e r A :

M o nit o ri n g of u biq uin o ト1 0)u bi q u l n O n e -1 0

,c a r o t e n oid s

,a n d t o c o p b e r ol s i n n e o n a t al

pla s m a m i c r o s a m ple s u s i n g hig h-

p e rf o rm a n c e li q uid ch r o m at o g r ap h y wi th c ol o m et ri c

el e c tr o cb e m i c al d et e cti o n . A n al . Bi o cb e m . 2 3 2,2 1 0 - 2 1 6 (1 9 95) ･

1 3) E st e rb a u e r H,P u hl H

,D i e b e r - R o th e n e d e r M

,W a eg G a n d R abl H : Effe ct of

a n ti o xid a nts o n o xid ativ e m o difi c ati o n of L D L . Am . M e d . 2 3,5 7 3 -5 8 1 ( 1 9 9 1) ･

1 4) T s e FI .S

,J a ff e J M an d T r o e n dl e A : P h a r m a c o ki n eti c s of fl u v a s t a t in aft e r si n gl e a n d

m u ltiple d o s e s i n n o 皿 al v ol u nt e e r s ･ J ･ Cli n ･ P 九a - a c ol ･ 3 2,6 3 0 - 6 3 8 (1 9 9 2) I

1 5) D ai n J G,F u E

,G o r ski J

,N i c ol eti J a n d S c all e n T J: Bi otr a n sf o rm a ti o n of n u v a st a ti n

s o di u m i n b u m a n s . D m g . M et a b . D i sp o s ･2 1

,5 6 7 -5 7 2 (19 9 3) I

1 6) Y a s u h a r a M ,S u z u m u r a K

,T a n ak a K ,

H a s hi m u r a Y,T a k ah a shi M

,H a r a d a T

,A o ki S

,

o d a w a r a A,S u z u ki T : Fl u v a st atin in hibits o xid ati v e m o difi c ati o n of lo w d e n sity lip op r ot ei n

b oth i n vitr o a n d i n vi v o . I n t e rn a ti o n al S y m p o si u m o n D ru g s A ffe cti n g Lipid M et a b olis m

XIIl,55 (1 9 9 8) ･

1 7) Y a s u h a r a M,S u z u m u r a K , T a n ak a K

,T ak a h a s hi M ,

A o ki S,O d a w a r a A

,N a rit a H ,

9 6

S u z u ki T: Fl u v a s t ati n,a n H M G - C o A r e d u c t a s e i n hibit o r

, p r ot e ct s L D L fr o m o xid ati v e

m o dific ati o n i n b yp e r c b ol e st e r ol e m i c r ab bit s . Bi ol . P b a m . B ull .(in p r e s s) I

1 8) T o k u m a ru S ,O gin o R

,S hir o m ot o A

,Ig u chi H a n d K oj o S : I n c r e a s e o f lipid

h yd r op e r o xid e s i n tis s u e s of vit a m i n E - d e B ci e n t r at s . F r e e . R a d ･ R e s ･ 2 6,1 6 9 -1 7 4 (1 9 9 7) ･

1 9) W olff S P : F e r r o u s i o n o xid ati o n i n p r e s e n c e of f e rri c i o n i n dic at o r x yl e n ol o r a n g e f o r

m e a s u r e m e n t of h y d r o p e r o xid e s . M e th o d s E n zy m ol ･ 2 33,1 82 -1 8 8 (1 9 94) ･

2 0) Jia n g Z - Y,H u n t J V a n d W olff S P : F er r o u s i o n o xid ati o n i n t h e p r e s e n c e of x yl e n ol

o r a n g e f o r d et e cti o n of lipid h y d r o p e r o xid e i n l o w d e n sity lip o pr otei n ･ An al ･ B i o ch e m ･ 2 0 2,

3 8 4 - 3 8 9 (1 9 9 2) ･

2 1) P atic o D,T a n gi r al a R K

,R a d er D J ,

R ok a ch J a n d Fit z G e r ald G A : V it a mi n E s u p p r e s s e s

is o p r o s t a n e g e n e r a ti o n i n vi v q a n d r e d u c e s a th e r o s cl e r o sis i n a p o E - d efi ci e n t mi c e･ N at u r e

M e d . 4,1 18 9 - 1 1 9 2 (1 9 9 8) ･

2 2) K o n

.t u s h A

,S p r a n g e r T

,R ei ch A

,Dj ah a n s o u zi S

,K a rt e n B

,B r a e s e n J H

,Fi n ck h B

,

K o hls ch Btt e r A a n d B eisi e g el U : W h ol e pla s m a o xid ati o n a s s a y a s a m e a s u r e of lip o p r ot ei n

o xidi z a bility . Bi o F a ct o r s 6,9 9 - 1 0 9(1 99 7) I

2 3) 大橋 徳子, 吉川 正美: 第 4 7 回質量分析総合討論会(大阪) 要旨集 3 4 4 - 3 45

( 1 9 9 9) I

2 4) 真杉文紀, 中村哲也: ビタミ ン E 欠乏動物の代謝変軌 栄養と食糧 2 9,3 6 1 - 3 6 8

(1 9 76) ･

2 5) 美濃展: ビタミ ンE の歴史･ ビタミ ン7 2,5 3 1 - 5 3 3 (1 9 9 8) ･

2 6) Z w a rt L L,M e e rm a n J E N

,C o m m a nd e u r J N M a n d V e rm e ul e n N P E : Bi o m a rk e r s of fr e e

r adi c al d a m ag e - A p pli c ati o n s i n e x p e ri m e nt al a ni m als a nd i n h u m a n s ･ F r e e ･ R ad ･ Bi ol ･

M e d . 2 6,2 02 - 22 6 (1 9 9 9) ･

9 7

27) 鈴村邦治, 大橋徳子, 小田原昭男 , 岡事蔵, 安原三紀子, 成 田寛 : ビタミ ンE

欠乏食負荷ハ ム ス ター にお ける フルパ ス夕チ ン の 酸化ス トレス 上昇抑制作用 ,

日本薬学会第1 2 0 年会要旨集(印刷中) .

2 8) H a b erl a n d M E,P o n g D a n d C h e n g L : M al o n di ald e h yd e - alt e r e d p r ot ei n o c c u r s i n

ath e r o rn a of W at ah a b e h e ri t able h y p e rlipid e m i c r ab bits . S ci e n c e 2 4 1,2 1 5 - 21 8(1 9 8 8) ･

29) Y la - H e rtt u al a S,P ali n ski W

,R o s e nf el d M E

,P a r th a s a r a th y S

,C a r e w T E

,B utle r S

,

w itzt u m J L a n d St ei n b e rg D : E vid e n c e f o r th e p r e s e n c e o f o xid ativ ely m o difi e d l o w d e n sity

lip o pr ot ei n i n ath e r o s cl e r o ti c l e si o n s of r a b bit a n d m a n ･ J ･ Cli n ･ I n v e s t ･ 8 4,1 0 8 6 - 1 0 95

( 1 9 8 9) .

3 0) B er e nb a u m M C : A m eth o d f o r t e s ti n g f o r sy n e rg y wi th a n y n u m b e r of ag e n t s ･ J ･ I n f e ct ･

D is . 1 3 7,1 2 2 -1 3 0 (1 9 7 8) .

3 1) B e r e nb a u m M C : S y n e rg y ,a d ditivis m a n d a n t ag o ni s m i n i m m u n o s u p p r e s si o h ･ Cli n ･

E x p . I m m u n ol . 2 8,1 - 1 8 (1 9 7 7) ･

3 2) S m it h C,M it chi ns o n M J

,A r u o m a O I a n d H alli w ell B : Sti m ul ati o n of lipi d p e r o xid ati o n

a n d h yd r o x yl-

r adi c al g e n e r ati o n b y th e c o n t e nt s of h u m a n a th e r o s cl e r o ti c l e si o n s ･ Bi o ch e m ･

∫. 2 8 6,9 0 1 -9 0 5 (1 9 9 2) ･

3 3) Y L 畠- H er tt u al a S,R o s e n f eld M E

,P a r th a s a r a th y S

,G la s s C K

, Sig a 鴨 W it zt u m J L a n d

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,6 9 5 9 -6 9 6 3 (1 9 9 0) ･

3 4) D a u g h e rt y A,D u n n J L

,R at e ri D L a n d H ei n e ck e J W : M y el o p e r o xi d a s e

,a c a taly st fo r

lip o p r ot ei n o xid ati o n)1 S e x p r e s s e d in h u m a n a th e r o s cl e r o ti c l e si o n s ･ J ･ Cli n ･ I rl V e S t ･ 9 4

,

4 3 7 - 4 4 4 (1 9 9 4) ･

9 8

3 5) G r ah a m A,H o g g N

,K aly a n a r a m a n B

,O

t

L e a ry V,D a rl e y

- U s m a r V a n d M o n c ad a S :

p e r o x y nitrit e m o dific ati o n of l o w- d e n sit y lip o p r o t ei n l e a d s t o r e c o g n iti o n b y th e

m a c r o p h a g e s c a v e n g e r r e c e pt o r ･ F E B S l ett ･ 3 3 0,1 8 1 - 1 8 5 (1 9 9 3) ･

3 6) 0-l e a ry V J

,Tilli n g L

,Fl e et w o od G

,St o n e D a n d D a rl e y

- U s m a r V : T h e r e sist an c e of

l o w d e n sity lip o pr ot ei n t o o xid ati o n p r o m ot e d b y c o p p e r a n d its u s e a s a n d i n d e x of

a n ti o xi d a nt th e r a p y . A th e r o s cl e r o sis 1 19,1 6 9 -1 79 (1 9 96) ･

3 7) W alz e m R L,W atki n s S

,F r a n k el E N ,

H a n s e n R J a n d G e 皿 a n J B : O ld e r pla s m a

lip o p r ot ei n s a r e m o r e s u s c e ptibl e t o o xi d ati o n - A li n ki n g m e ch a n i s m fわr th e lipida n d

o x id atio n th e o d e s o f atb e r o s cl e r oti c c a r di o v a s c u l a r dis e a s e ･ P r o c ･ N atl ･ A c a d ･ S ci ･ U ･ S ･ A ･

9 2,7 4 6 0 - 7 4 6 4 (1 9 9 5) ･

3 8) B u rto n G W a n d l n g old K U :β- C a r o t e n e : An u n u s u al t yp e of lipid a n ti o xid a nt ･ S ci e n c e

2 2 4,5 6 9 - 5 7 3 ( 1 9 8 4) ･

3 9) D o w ry V W a n d St o ck e r R : T o c o ph er ol -

m e di at e d p e r o xid ati o n ･ T h e p r o o xi d a nt eff e c t of

v it a m i n E o n th e r a di c a トin iti at e d o xid ati o n of h u m a n l o w - d e n sity lip op r ot ei n ･ J ･ A m ･

c h e m . S o c . 1 1 5,6 0 2 9 - 6 0 4 4 (1 9 9 3) .

4 0) K o nt u sh A,Fi n ck h B

,K a rt e n B

,K o hls ch Btt e r A a n d B eisi e g el U : An ti o xid a n t a n d

p r o o xid a n t a c tivi t y of α一t O C OP h e r ol i n h u m a n p la s m a a n d l o w d e n sity lip o p r ot ei n ･ J ･ L pid ･

R e s . 37 , 1 4 3 6- 1 4 48 ( 1 9 9 6) ･

4 1) G odfrie d S L,C o m b s G F Jr

,S a r ok a J M a n d D illi n gh a m L A : P ot e n ti ati o n o f

atb e r o s cl e r oti c l e si o n s i n r a b bits by big b di et a ry le v el of vit a m i n E ･ B r ･ J ･ N u t r ･ 6 1I6 07 -6 1 7

( 1 9 8 9) I

4 2) W 6 cicki J,R 6

Te w i ck a L

,B a r c e w - W i s z n i e w sk a B

,S a m o ch o w i e c L

･J u z

'

wi ak S ,

K adl u b o w sk a D,T u s t an o w ski S an d J u z y s z y n Z : E ff e c t of s el e n i u m a n d vit a m i n E o n t h e

9 9

d e v el o p m e n t of e x p e ri m e n t al atb e r o s cl e r o sis i n r ab bits ･ A t b e r o s cl e r o sis 8 7,9 - 1 6 (1 9 9 1) I

4 3) B r a u g bl e r J M,B u rt o n P S

,C h a s e R L

,P r e g e n z e r J F

,J a c o b s e n E J

,V a n D o o 皿ik FJ

,

T u sti n J M,A y e r D E an d B u n dy G L : N o v el m e m b r a n e l o c ali z e d ir o n c h el at o r s a s i n hibit o r s

of ir o n - d e p e n d e n t lipid p e r o xid ati o n . Bi o ch e m ･ P h a rm a c ol ･ 3 7,3 85 3 - 3 8 6 0 (1 9 8 8) A

4 4) K o F N,Li a o C H

,K u o Y H a n d LI N Y L : An ti o xid a nt p r o p e r ti e s of

d e m e th yldiis o e u g e n ol,Bi o chi m . Bi op h y s ･ A ct a ･ 1 2 5 8

,14 5 - 1 5 2 (1 9 95) ･

4 5) S u z u m u r a K , Y a s u h a r a M,T a n ak a K

,S u z u ki T :

'

P r o t e c ti v e eff e ct of flu v a st a ti n s o di u m

( x u - 6 2 -3 2 0) ,a 3 -h y dr o x y

-3 - m et h ylgl u t a r yl C o e n zy m e A ( H 山G I C o A) r e d u ct a s e i n hibit o r ,

o n o xi d ativ e m o difi c ati o n of h u m a n l o w - d e n sit y lip o p r o t ei n i n vi t r o ･ Bi o ch e m ･ P h a r m a c ol ･

5 7,6 9 7 - 7 0 3 (1 9 9 9) ･

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R el ati o n ship b e t w e e n m e v al o n at e p ath w a y a n d a rt e ri al m y o cyt e p r olif e r a ti o n- in vi tr o

s t u di e s w ith i n bibit o r s of Ⅲ M G - C o A r ed u ct a s e.A t h e r o s cl e r o si s 1 01

,1 1 7

-

1 2 5 (1 9 9 3) ･

4 8) R ic e - E v a n s C A,M ill er N J a n d P ag a ng a G : St n l C t u r e - a n ti o xid a nt a c ti vity r el ati o n shi p

of fla v o n oid s a n d p h e n oli c a cid . F r e e . R a d ･ B i ol ･ M e d ･ 2 0,9 3 3 - 95 6 (1 9 9 6) ･

4 9) S uz u m u r a K ,O d a w a r a A

,Y a s u h a r a M

,T a n a k a K

,N a rit a H

,S u z u ki T : I n vi tr o

i n bibit o ry e 批 cts of th e o pti c al is o m e r s a n d m e t ab olit e s of 加 v ast ati n o n c o p p e r i o n -

i n d u c e d L D L o xid ati o n . Bi ol . P b a r m . B ull . 2 2,9 7 1 - 9 7 4 (1 9 9 9) I

5 0) A vir a m M : I nt e r a cti o n of o xidi z ed l o w d e n sity lip o p r ot ei n wi th m a c r o p h a g e s i n

L

at b e r o s cl e r o sis,

a n d t h e a n ti atb e r o g e ni city of a nti o xid a nt s ･ E u r ･ J ･ Cli n ･ C b e m ･ Cli n ･

Bi o c b e m . 3 4 5 99 - 6 0 8 (1 9 9 6) I

5 1) K l e i n v eld 江A,D e m a ck e r P N M , D e F a an A FJ a n d St al e n h o ef A F H : D e c r e a s e d i n vitr o

l O 0

o xidi z abilit y of l o w -d e n sit y lip o p r ot ei n i n h y p e r ch ol e s t e r ol a e m i c p ati e nts t r e at e d wi th 3 -

hy d r o x y-3 -

m etb ylgl ut a ry トC o A r e d u c ta s e i n bibit o r s ･ E u r ･ J ･ Cli n ･ I n v e s t ･ 2 3,2 8 9 - 2 9 5

( 19 9 3) .

5 2) L e o n h a r dt W,K u rkts chi e v T

,M ei s s n e r D

,L attk e P

,A bl et sh a u s e r C; w ei di n g e r G

,

J a c r o s s W a n d H a n e f eld M : Effe ct s of fl u v a st a ti n th e r ap y o n lipid s,

an ti o xid a nt slO Xid ati o n

of lo w d e n sity lip o p r ot ei n s a n d tr a c e m et al s ･ E u r ･ J ･ Clin ･ P h a r m a c ol ･ 5 3,6 5 - 69 (19 9 7) ･

5 3) S alo n e n R,N y y s s 6 n e n K ,

P o rk k al a - S a r a t ah o E a n d S al o n e n J T : T h e K u o pi o

at h e r o s cl er o si s p r e v e n ti o n st u dy ( K A P S) - Eff e ct of p r a v a s t ati n tr e a t m e n t o n lipid s,

o xid ati o n r e si st a n c e of lip o pr ot ei n s,a n d at b e r o s cl e r o ti c p r o g r e s si o n ･ A m ･ J ･ C a rdi ol ･ 7 6

,

3 4 C -3 9 C (1 9 9 5) ･

5 4) H u s s e in 0,S chl e zi n g e r S

,R o s e n blat M

,K eid e r S a n d A vi r am M : R e d u c e d

s u s c e ptibilit y of l o w d e n sity lip o p r ot ei n (L D L) t o lipid p e r o xi d ati o n a 鮎 r 伽 v ast ati n

th e r ap y lS a s s o ci at e d w ith t h e b y p o c b ol e st e r ol e m i c e 触 ct of th e d r u g a n d it s bi n din g t o t h e●

L D L . A th e r o s cl e r o * 1 2 8 ,l l - 1 8 (1 9 9 7) ･

55) M c T a vi s h D a n d S o rki n E M･

･ P r a v a st a ti n ･ A r e vi e w of it s p h a r m a c ol o gi c al p r o p e rti e s

a n d th e r ap e u ti c p ot e n ti al i n h y p e r ch ol e s t e r ol a e mi a ･ D ru g s 42 ,65 - 8 9 (1 9 9 1) ･

5 6) T o d d P A a n d G o a K L : S i m v a s t a ti n ･ A r e vi e w of its p h a r m a c ol o gi c al p r o pe rti e s a n d

th e r ap e u ti c p ot e n ti al i n b y p e r cb ol e st e r ol a e m i a ･ D n lg S 4 0,5 8 3 - 6 0 7 ( 1 9 9 0) ･

5 7) Le a A P a n d M c T a vis h D : A t o rv a s t ati n ･ A r e vi e w ofits p h a r m a c ol o g y a n d t h e r a p e u ti c

p ot e n ti al i n t h e m a n a g e m e n t of h y p e rlipid e m i a s ･ D ru g s 5 3,8 2 8 - 84 7 (1 9 9 7) A

5 8) M c Cl ell a n X J,W i s e m a n L R a n d M c T a vis h D ‥C e ri v a st ati n

,D r u g s 5 5

,41 5 - 4 2 2 (1 99 8) I

5 9) B alla G,J a c ob H S

,B at o n J W

,B el cb e r J D a n d V e r c ell otti G M : H e m i n ･ A p o s sibl e

p h y si olo gi c al m e di at o r of l o w d e n sity lip op r ot ei n o xid atio n a n d e n d oth eli al i nj u ry ･

1 0 1

A rt e ri o s cl e r ｡ T b r o m b . l l,1 7 0 0 - 1 7 1 1 (1 99 1) .

6 0) K lip st ei n - G r o b u s ch K ,G r o b b e e D E

,D e n B r e eiji e n J H

,B o ei n g H , H of m a n A a n d

W itte m a n J C M : D i et a ry Ir o n a n d ri sk of m y o c a rdi al i nfa r c ti o n i n th e R ott e rd a m st u d y ･ Am.

∫. E pid e m i ol . 14 9,4 2 1 - 4 28 (1 9 99) .

61) A vir a m M,R o s e n bl at M

,Bis g ai e r C L a n d N e w t o n R S : A t o r v a s t ati n a n d g e m 丘b r o zil

m et a b olite s,b u t n o t p a r e n t d r u g s

,a r e p ote n t a nti o xid a n ts a g ai n s t lip o p r ot ei n o xid ati o n ･

A t b e r o s cl e r o sis 1 3 8,2 7 1 - 28 0 (1 99 8) .

6 2) 鈴村邦治, 田中敬子, 安原三紀子, 成田寛 : H M G - C o A 遼元酵素阻害剤フル パ

ス夕チ ンおよび主要代謝物の へ ミ ン 一 過酸化水素誘発L D L 酸化抑制作用 , 動脈硬化

2 7 (s u p pl ･) ,1 32 (1 9 9 9) I

6 3) R u s s el J,N e s s J

,C h o p r a M

,M c m u r r a y J a n d S mi t h W E : T h e a s s e s s m e n t of th e

h y d r o x yl r a dic al s c a v e n g i n g a c ti o n of th e r ap e u ti c a g e n ts ･ J ･ P h a r m ･ B i o m e d ･ An al ･ 1 2)

●

8 6 3 - 8 6 6 (1 9 9 4) ･

6 4) F o x R B : P r e v e ptio n of g r a n ul o cyt e - m e di at e d o xid a nt l u n g in]'

u r y i n r at s b y a h y d r o x yl

r a dic al s c a v e n g e r ,di m etb yltbi o u r e a . ∫. Cli n ･ I n v e s t ･ 7 4

,1 4 5 6 -1 4 64 (1 9 84) ･

6 5) K a g a n V E,T s u chiy a M

,S e rbi n o v a E

,P a ck e r L a n d Si c s H : I nt e r a c ti o n of t h e

p y ri d oi n d ol e s t o b adin e wi th pe r o x yl ,s u pe r o xid e a n d ch r o m a n o x yl r a dic al s ･ B i o ch e m ･

P b a m a c ol . 4 5,3 9 3 - 4 0 0 ( 1 9 9 3) .

6 6) S t e e nk e n S,S u n d q uist A R

,J o v a n o vi c S V , C r o ck ett R a n d Si c s H : An ti o xid an t a c tivi t y

of t h e p y rid oi n d ol e st o b a di n e ･ P ul s e r adi olyti c ch a r a ct e ri z ati o n of o n e - el e c tr o n o xidi z e d

st o b a di n e a n d q u e n c hi n g of si n gl et m ol e c ul a r o x y g e n ･ C h e m ･ R e s ･ T o xi c ol ･ 5,3 55 -3 6 0

( 1 9 9 2) ･

6 7) S u z u m u r a K,Y a s u h a r a M

,T a n ak a K

,O d a w a r a A

,N a rit a H

,S u z u ki T : An i n vit r o st u d y

1 0 2

of t h e b y d r o x yl r a di c al s c a v e n g l n g p r op e r ty Of 且u v a s t a ti n , a n H M G - C o A r e d u ct a s e

i n bibit o r ･ C b e m ･ P 九a - ･ B ull ･ 4 7,1 01 0 -1 0 1 2 ( 1 9 9 9) .

6 8) M o h a z z ab H - K M,K a mi n ski P M a n d W oli n M S : N A D fr o xid o r ed u ct a s e i s a m a3

'

o r

s o u r c e of s u p e r o xid e a ni o n i n b o vi n e c o r o n a ry e n d oth eli u m ･ Am ･ J ･ P h y si ol ･ 26 6,H 2 5 6 8 -

H 2 5 7 2 (1 9 9 4) .

6 9) M ti n z el T,S a y eg h H

,F r e e m a n B A

,T a rp ey M M an d H a r ris o n D G : E vid e n c e f o r

e n h a n c e d v a s c ul a r s u p e r o xid e a n i o n p r o d u c ti o n i n nitr at e t ol e r a n c e . A n o v el m e c h a ni s m

u n d e rlyi n g t ol e r a n c e a n d c r o s s t ol er a n c e ･ J ･ Cli n ･ I n v e s t . 9 5,1 8 7 - 1 9 4 ( 1 9 9 5) .

7 0) P ay a M,F e r r a n di z M L

,M ir alle s F ,

M o n t e si n o s C; U b e d a A a n d A I c a r a z M J : E ff e ct o f

c o u m a ri n d e ri v ati v e s o n s u pe r o xid e a ni o n g e n e r a ti o n . A r z n ei m .

- F o r s ch . のr g R e s . 4 3,6 5 5 -

65 8 (1 9 9 3) ･

7 1) P o nti V,D ia n z a ni M U

,C h e e s e m a n K a n d Sl at e r T F : S t u di e s o n th e r e d u cti o n of

n it r o bl u e t et r a z oli u m chl o ri d e m e diat e d th r o u gh th e a c ti o n of N A D H a n d p h e n a zi n e

m e th o s ulp h at e ･ C b e m i c o - B i ol ･ I n t e r a ct ･ 2 3,2 8 ト2 91 (1 97 8) ･

7 2) T ak a h a s hi S,Y o s hik a w a T

,N ait o Y

,T a ni g a w a T

,Y o s hid a N an d K o n d o M : R ol e of

pl at el et -

a c ti v a ti n g f a ct o r (P A F) i n s u p e r o xid e p r od u cti o n b y h u m a n p oly m o rp h o n u cl e a r

l e u k o c yte s ･ Li pid s 2 6,1 2 2 7 -1 2 3 0 (1 9 91) .

7 3) Cl a rk R A : T h e h u m a n n e ut r op hil r e spir at o ry b u r st o xid a s e ･ J ･ I n f e c ･ D is ･ 1 61,1 1 4 0 -

1 1 4 7 (1 99 0) I

7 4) Q ui n n M T,P a rk o s C A

,W alk e r L

,O rki n S H

, D i n a u e r M C a n d J e s aitis A J: As s o ci ati o n

of a R a s-

r el a t e d p r ot ei n w ith c yt o c h r o m e b of h u m a n n e u t r op hils ･ N a t u r e ( L o n d o n) ,3 4 2

,

1 9 8 - 2 0 0 (1 9 8 9) .

7 5) H all A : T h e c ell ul a r f u n c ti o n s of s m al l G T P - bi n d in g p r ot ei n s ･ S ci e n c e 2 4 9,63 5 - 6 4 0

(1 9 9 0) ･

1 0 3

7 6) B o k o c h G M,P r o s s n it z V : I s o p r e n oid m et ab olis m is r e q uir e d f o r sti m ul ati o n of t h e

r e s pir at o ry b u r st o xid a s e of H L - 6 0 c e11s ･ J ･ Cli n ･ I n v e st ･ 89,4 0 2 - 4 0 8 (1 9 9 2) ･

7 7) G ir o u x L M,D a vig n o n J

,N a ru s z e w i c z M : S i m v a st ati n i n hibit s t h e o xid ati o n of lo w -

d e n sity lip op r ot ei n s b y a cti v at e d h u m a n m o n o c yt e - d e 血v e d m a c r o p b a g e s ･ B i o c hi m ･

Bi op b y s . A ct a 11 65,3 3 5 -3 3 8 (1 9 9 3) ･

7 8) U ts u m i T,m o st e rg a a rd J

,A ki m a ru K

,E d a shi g e K

,S at o E F an d U t s u m i K : M o d ulati o n

of T N F - α一

P r l m l n g a n d sti m ul atio n -d e p e n d e n t s u p e r o xid e g e n e r ati o n i n h u m a n n e u tr o p hils

b y p r ot ei n ki n a s e i n hibit o r s ･ A r ch ･ Bi o c h e m ･ Bi o p h y･s ･ 2 4 9

,2 7 1 - 2 7 8 ( 1 9 9 2) ･

79) F a n g X,W ei ntr a u b N L

,Ri o s C D

,C b ap p ell D A

,Z w a ck a R M

,E n g elh a rdt J F ,

O v e rl e y

L W,Y a m T

,H eist ad D D a n d S p e ct o r A A : O v e r e x p r e s?i o n of h u m a n s u p e r o xi d e dis m u t a s e

i n hibits o xid ati o n of l o w - d e n sity lip op r o t ei n by e n d ot b elial c e11s ･ Ci r c ･ R e s ･,82

,1 2 8 9 -1 2 9 7

(1 9 9 8) ,

80) M ille r F J Jr .

,G u tt e r m a n D D

,Ri o s C D

,H eist ad D D a n d D a vid s o n B L : S u p e r o xid e

p r o d u c ti o n i n v a s c ul a r s m o o th m u s cl e c o n t d b ut e s t o o xid ati v e s tr e s s a n d i m p ai r e d

r el a x ati o n i n at b e r o s cl e r o si s . Ci r c . R e s . 8 2,1 2 9 8 - 1 3 0 5 ( 1 9 9 8) ･

81) K u 虹 ej a R C,K o n t o s H A

,tl e s s M L a n d Ellis E F : P G H s y nth a s e an d lip o jEy g e n a S e

g e n e r at e s u p e r o xid e iふt h e p r e s e n c e of N A D H o r N A D P H ･ Ci r c ･ R e s ･ 5 9 ,61 2 - 6 1 9 (1 9 8 6) ･

82) P rit ch a rd K A J r .

,G r o s z ek L

,S m al l e y D M

,S e s s a W C

,W u M

,V ill al o n P

,W oli n M S

a n d St e m e Ⅲn a n M B : N ati v e l o w- d e n sity lip op r ot ei n i n c r e a s e s e n d oth eli al c ell n it ri c o xid e

s y nt h a s e g e n e r ati o n of s u p e r o xid e a n i o n ･Ci r c ･ R e s t 7 7

,5 1 0 - 5 1 8 (1 9 9 5) ･

8 3) S u z u m u r a K,Y a s u h a r a M

,N ari t a H : S up e r o xid e a ni o n s c a v e n gin g p r o p e rti e s of

f 山v a st ati n a n d its m e t ab olit e s . C b e m . P b a m . B ull . 4 7,1 47 7 -1 4 8 0 (1 9 9 9) I

1 0 4

主論文目録

本学位論文内容は下記の発表論文による .

1) K u nih a ru S u z u m u r a,M ikik o Y a s u h a r a

,K eik o T a n a k a

,T o s hik a z u S u z u ki : P r o t e c ti v e

eff e c t of fl u v a s t ati n s o di u m (ⅩU - 6 2 - 3 2 0) ,a 3 - h y d r o x y

- 3 -

m et h ylgl ut a ryl C o e n z y m e A

( H M G - C o A) r e d u ct a s e i n hibit o r,o n o xid ati v e m o dific ati o n of h u m a n l o w - d e n sity

lip op r ot ei n i n vitr o ･ B i o cb e m ･ P 九a - a c ol ･ 5 7 ,6 9 7 - 7 03 (1 9 9 9) I

2) K u nih a ru S u z n m u r a,A kio O d a w a r a

,M ikik o Y a s u h a r a

,K eik o T a n a k a

,H ir o s hi N a rit a

,

T o shik a z u S u z u ki : I n vit r o i n hibit o ry eff e ct s of th e op tic al is o m e r s a n d m 占t a b olit e s of

fl u v a st ati n o n c op p e r i o n-i n d u c e d L D L o妄id ati o n . Bi ol . P h a r m . B ull . 2 2 , 9 7 1

- 9 7 4 (1 9 9 9) .

3) K u nih a ru S u z u m u r a,M ikik o Y a s u h a r a

,K eik o T a n ak a

,A 出o O d a w a r a

,Hi r o s hi N a ri t a

,

●

T o shik a z u S u z u ki: An i n vi t r o s t u d y of t h e h y dr o x yl r a di c al s c a v e n g i n g P r o p e r ty Of

fl u v a s t ati n,a n H M G - C o A r ed u ct a s e i n hibit o r .

C h e m . P h a r m ･ B ull ･ 4 7,1 0 1 0 - 1 0 1 2 (1 9 99) ･

4) K u nih a ru S u z u m u r a , M iki k o Y a s u h a r a,H ir o s hi N ari t a : S u p e r o xid e a ni o n s c a v e n gi n g

p r op e rti e s of 且u v a st ati n a n d its m e t ab olit e s ･ C b e m ･ P 九a - ･ B ull ･ 4 7,1 4 7 7 - 1 4 80 (1 9 9 9) ･

5) M ikik o Y a s u h a r a , K u nih a ru S u z u m u r a,K eik o T a n a k a

,M a s ak ats u T a k ah a s hi

,S h oi c hi

A o ki,A ki o O d a w a r a

,H ir o s hi N ari t a , T o shik a z u S u z u ki: Fl u v a st a ti n

,a n H M G - C o A

r e d u ct a s e i n hibit o r, p r ot e c ts L D L fr o m o xid ati v e m o difi c ati o n i n h y p e r c h ol e st e r ol e mi c

r ab bit s . Bi ol . P h a r m . B ull .(i n p r e s s) .

1 0 5

主査 , 副査名

本学位論文の 審査 は千葉大学大学院薬学研究科で指名され た下記 の審査委員によ

り行われた .

主査 千葉大学薬学部教授

副査 千葉大学大学院薬学研究科教授

千葉大学薬学部教授

千葉大学大学院薬学研究科教授

千葉大学薬学部教授

薬学博士 渡辺 和夫

薬学博士 矢野 鼻膏

薬学博士 千葉 寛

医学博士 上田 志朗

薬学博士 小林 弘

1 0 6