Dr. Şule ŞengülAnkara Üniversitesi Tıp Fakültesi

Nefroloji Bilim Dalı

22.Ekim.2015 2

Kidney Res Clin Pract32(2013)52–61

22.Ekim.2015 3

AMR, geç dönem greftyetmezliğinin en önemli nedenidir (%60).

AMR’ nin en önemli nedeni yetersiz immunsupresyondur.

Posttransplant yeni DSA gelişimi, AMR ve kötü greft sağkalımı ile ilişkilidir.

1İlk gözlem Terasaki grubu tarafından yayımlandı. Bir izlem çalışmasında greftyetmezliğinin, anti-HLA antikor gelişiminden 6 ay-8 yıl sonra gerçekleştiği bildirildi.

2Persistan veya yeni DSA varlığının test edilmesi geç dönem greft kayıplarının hepsinin önleyebilir…◦ Maliyet??◦ Klinik olarak stabil hastada DSA’nın önemi?◦ DSA’ ya yönelik tedavi??◦ DSA titrasyonu????

22.Ekim.2015 4

1Lee PC, Transplantation 2002; 74:1192-11942Terasaki PI, AJT, 2003

22.Ekim.2015 5

Kompleman aktivasyonunun, biyopsi materyallerinde C4d’nin boyanmasıyla saptanması

Antikorların yüksek duyarlılık ve doğrulukla saptanmasını sağlayan solid faz immunoassayleringeliştirilmesi (SPI)

Curr Opin Organ Transplant 2013, 18:470–477

22.Ekim.2015 6

Retransplantasyon Transplantasyondan önce HLA antikor varlığı Tedavi uyumsuzluğu veya yetersiz immunsupresyon HLA-DRB1 ve HLA-DQ mismatchleri Kadavra verici Genç yaş (18-35 yaş arası alıcı) Pretransplant non-DSA varlığı Önceki klinik, subklinik rejeksiyon atakları İnflamasyon (viral infeksiyon gibi) Transplant nefrektomi Otoimmunite (AT1R antikor varlığı)

Curr Opin Organ Transplant 2013, 18:470–477

22.Ekim.2015 7

Antikor aracılı rejeksiyon riski taşıyan hastaları saptayabiliriz.

İdame immunsupressif tedavinin kişiselleştirilmesini sağlayabilir.

Antijen spesifik olanlar◦ Anti-HLA antikorları

CDC, Flowsitometri (FSM), ELISA, ve Solid faz immunoassayleri (SPI) HLA Ag’li boncuk+luminex platformu

Tarama testi

Single-antigen bead set (en spesifik test)

PRA set

◦ HLA-dışı antikorlar

Antijen spesifik olmayanlar◦ Nükleotid ATP ölçümü◦ CD30◦ Moleküler yöntemler

22.Ekim.2015 8

22.Ekim.2015 9

Transplantation 95 (1), 2013

• Teknik konular çalışma grubu• Pretransplant dönem çalışma grubu• Postransplant dönem çalışma grubu

22.Ekim.2015 10

Transplantation 95 (1), 2013

• Level 1..en kesin öneriler (kanıt düzeyi en yüksek)• Level 2..fayda beklenen öneriler (kanıt düzeyi düşük)• Level 3..fayda beklenen uzman görüşü (kanıt düzeyi en düşük)

CDC ve FSM: (hücresel hedefler kullanılır)◦ HLA-spesifik antikor taraması için kullanılırlar.

◦ CDC’ nin duyarlılığı düşüktür ancak HAR’ ye yol açan antikorları saptayabilir.

◦ FSM, hedef lenfositlere bağlanan antikorları daha sensitifbir metotla (flöresanla işaretli sekonder antikor kullanılarak ve FSM ile) gösterebilir.

◦ FSM-XM, transplantasyon için bir risk olmakla birlikte kontrendikasyon değildir.

◦ Ig alt gruplarının saptanması, B-lenfositlerin pronase ile inkübe edilmesi gibi uygulamalarla FSM uygulamasında zemindeki non-spesifik reaktiviteyi azaltabilir.

22.Ekim.2015 11

Solid-Phase Immunoassays (SPI)◦ Ticari kitler mevcuttur.

◦ Solid bir matrikse eriyebilir HLA moleküllerinin bağlanması (mikro plak-ELISA veya polistren boncuklarsa-konvansiyonel FSM ya da Luminex) söz konusudur.

◦ ELISA sonuçları, antikor bağlanmasında yarı-kantitatif bir değerlendirmeyle, negatif kontrole göre OD oranı (optik yoğunluk) verilir.

22.Ekim.2015 12

Solid-Phase Immunoassays (SPI)◦ Boncuk bazlı assay’ler:

Polistiren boncuklar kullanılır.

Her bir boncuğun yaydığı flöresan sinyali kaydedilir.

Boncuklar, luminex platformunda yarı-kantitatif olarak analiz edilir.

HLA-spesifik antikor bağlanması mean fluorescence intensity (MFI) değeri olarak rapor edilir.

22.Ekim.2015 13

Solid-Phase Immunoassays (SPI): 3 tip panel kullanılır.

Antijen panel havuzu: Çok sayıda hücre dizininden elde edilmiş, HLA class I (A, B, C) ve HLA class II (DR, DQ ve DP) proteinleri ile kaplanmış 2 veya daha fazla boncuk populasyonununkullanılmasıyla yapılan ve HLA antikorlarının saptanması için tarama amaçlı kullanılan testtir.◦ Relatif olarak ucuzdur.◦ HLA class I ya da II antijenlerine karşı antikor varlığı test edilir. ◦ Spesifikliği yoktur ve tüm olası antijenler havuzda yer almayabilir.

Fenotip panelleri: Her bir boncuk populasyonu tek bir bireyden alınan hücre dizinindeki ya HLA class I ya da HLA class II proteinleriyle kaplıdır. ◦ Hücre bazlı assaylere benzer, sonuçları yorumlanırken dikkatli olunmalıdır.

Tek antijen boncukları (SAB): Her bir boncuk antikorun spesifitesini arttıracak şekilde tek bir HLA antijeni ile kaplıdır. ◦ En sensitif ve en spesifik yöntemdir.◦ Aşırı sensitize hastalarda antikorların en doğru şekilde saptanmasını

sağlar.

22.Ekim.2015 14

22.Ekim.2015 15

CDC:◦ Lenfositotoksik PRA saptanmasını ve donör XM testi ile HAR’ı

öngördürmesi avantajlarıdır, sensitivitesi düşüktür.

◦ Fazla sayıda canlı lenfosit varlığı gerektirir.

◦ Non-HLA antikor varlığında da pozitif sonuç verebilir.

◦ Standardizasyonu güçtür.

◦ Bekleme listesindeki antikorların değerlendirilmesi, panelin içeriğinden etkilenebilir.

◦ CDC taraması ile antikor saptanması için HLA tiplendirilmesiyapılmış çok sayıda donörden hazırlanmış büyük paneller ya da ticari dondurulmuş hücre dizileri kullanan merkezler vardır.

◦ Aşırı sensitize hastalarda CDC taraması yeterli ayırımı sağlayamaz.

22.Ekim.2015 16

FSM:◦ CDC’ den daha hassastır.◦ Non-HLA antikorlarla reaksiyon söz konusudur.◦ Düşük DSA düzeyleriyle AMR riski taşıyan hastaları

saptamada faydalıdır.◦ Sitometrelerdeki , florokromlardaki, kullanılan

solusyonlardaki ve hücre-serum oranındaki farklılıklar gibi nedenlerle standardizasyonu zordur.

◦ FSM-B hücre XM non-spesifik antikor reaksiyonuyla ilişkili olabilir, bu etki lenfositlerin pronase ile inkubasyonuylaazaltılabilir.

◦ Pronase ile inkubasyon HLA ekspresyonunu etkileyebilir, yalancı-pozitif T hücre XM’ ye yol açabilir.

22.Ekim.2015 17

SPI:◦ ELISA, CDC’ den daha sensitiftir.

◦ Luminex boncuk teknolojisi hem CDC’ den hem de FSM’ den daha sensitiftir.

◦ Düşük düzeyde HLA-spesifik antikorları saptayabilir.

◦ SPI sonuçları yarı kantitatiftir.

ELISA’da OD değerine, FSM’de MCF değerine ve Luminex’deMFI değerine göre düşük, orta ve yüksek miktarda DSA düzeyleri sınıflandırılır.

22.Ekim.2015 18

22.Ekim.2015 19

Metot Posttx Kullanım Yorum

CDC/Modifiye CDC -/+ Donor hücresi gerekir

FSM/Modifiye FSM + Donor hücresi gerekir

ELISA Generik -/+ Hasta non-sensitize ise işe yarar

ELISA Spesifik ++ Sensitivitesi düşüktür

LUM generik -/+ Antikor tipi ve düzeyini saptar

LUM fenotip ++ Sensitivitesi düşüktür

LUM SAB +++ Detaylı lokus/allel spesifikasyonuyapar

SPI’ ler özellikle SAB assayi solid organ alıcılarında pretransplant HLA antikorlarının saptanmasında kullanılmalıdır (L-1 öneri).

SPI’ ye ek olarak, hücre bazlı yöntemlerle pozitif-XM varlığı test edilmeli (L-1 öneri).

Test sonuçları yorumlanırken, teknik faktörlerin (boncuklar üzerindeki antijen yoğunluğundaki farklılıklar, antijenin denatüre olabileceği..) gözönüne alınmalıdır (L-1 öneri).

Sensitizasyon öyküsü (önceki nakil, transfüzyon ve gebelik öyküsü) sonuçlar yorumlanırken dikkate alınmalıdır (L-1 öneri).

Doğru antikor değerlendirilmesi için hem alıcıda hem de vericide yüksek rezolüsyonlu HLA tiplendirilmesi yapılmalıdır (L-1 öneri).

Laboratuvar yöntemlerinin standardizasyonu ve kalite kontrolü sonuçlardaki varyasyonları minimuma indirmek için gereklidir (L-1 öneri).

22.Ekim.2015 20

Posttransplant ilk 1 yıl ve sonrası olarak öneriler gruplandırılmış.

Hastaları 4 risk gruba ayrılmış:◦ Düşük riskli hasta: (Nonsensitize, ilk transplantasyon)◦ Orta riskli hasta: (CDC ve /veya SPI ile saptanmış donor

antijenlerine karşı sensitizasyon öyküsü mevcut ve fakat güncel sonuçları negatif hasta veya geçmişte en az 1 HLA antikor testi pozitif saptanmış hasta)

◦ Yüksek riskli hasta: (DSA pozitif fakat XM negatif hasta)◦ Çok yüksek riskli hasta: (XM pozitif desensitizasyon

yapılmış hasta)Tüm gruplar için ortak öneri (L-1)

«TRANSPLANTASYON ÖNCESİ, VERİCİDEN DNA, ALICIDAN SERUM SAKLA»

22.Ekim.2015 21

Düşük riskli hasta: ◦ DSA taraması 3-12 ay sonra en az 1 kez yapılmalı (L-2).◦ Aşağıdakilerden bir ya da birkaçı gerçekleşirse yapılmalı:

İdame immunsupressif tedavide önemli bir değişiklik (minimizasyon, kesilme veya konversiyon) yapılacaksa (L-2)

Tedavi uyumu ile ilgili şüphe varsa (L-2) Greft disfonksiyonu geliştiyse (L-2) Hasta başka bir merkezin izlemine girecekse (L-3)

Eğer DSA saptanmazsa, ilk yıl boyunca testin tekrarlanmasına gerek yok (L-2).

DSA saptanırsa, biyopsi yapılmalı (L-2) ve AMR saptanırsa tedavi edilmeli (L-2). Greft fonksiyonu iyiye gider, antikor düzeyleri düşerse tedavi etkindir.

Biyopsi negatif sonuçlanırsa, ilk 1 yıl içinde DSA testi tekrarlanmalı (L-3). Bu hastada immunsupressif dozu azaltılmamalı (L-3).

22.Ekim.2015 22

Orta riskli hasta:

◦ İlk 1 ay içinde antikor taraması yapılmalı (L-2).

◦ Sonraki izlem düşük riskli hastalarla aynı şekilde yapılmalı.

22.Ekim.2015 23

Yüksek riskli hasta: ◦ Hem DSA taraması hem de protokol biyopsi ilk

3 ayda yapılmalı (L-1).◦ Tedavi endikasyonları düşük riskli

hastalardakiyle aynıdır.◦ Tek fark hızlı artan DSA düzeyi saptandığında

renal biyopsi negatif sonuçlansa bile tedavi endikasyonu olabilir (L-3).◦ Bu hastalarda inflamatuar bir olay gerçekleşirse

ek DSA taraması önerilir (L-2).

22.Ekim.2015 24

Çok yüksek riskli hasta:

◦ Aynı yol önerilmektedir.

◦ Klinik veya subklinik AMR kanıtı saptanırsa tedavi edilmelidir (L-2).

22.Ekim.2015 25

Öneriler tüm risk grupları için ortaktır. Her yıl en az 1 serum örneği saklanmalıdır (L-3). DSA taraması, en son serum örneğinde herhangi

bir sorun gelişirse yapılmalıdır. Eğer DSA saptanmazsa ek teste gerek yoktur (L-2).

Eğer serumda DSA saptanırsa, biyopsi önerilir (L-2), immunsupresyon azaltılmamalı (L-3).

Biyopside rejeksiyon saptanmazsa, greftfonksiyonunun izlenmesi ve DSA takibi önerilmektedir (L-3).

Biyopside rejeksiyon saptanırsa tedavi edilmelidir (L-2).

22.Ekim.2015 26

C4d fikse eden antikorlar SPI ile saptanması

C1q bağlayan HLA-DSA’ ların SPI ile saptanması◦ C1q-DSA Luminex

HLA-DQ ve DP antikorları:◦ HLA-DQ antikoru pozitif olanlarda greft sağkalımı

negatif olanlara göre daha kötüdür.

◦ DQ-MM varlığı de novo DSA gelişim riskini arttırmaktadır.

Non-HLA antikorlar◦ AT1 reseptör antikoru

22.Ekim.2015 27

J of Immunology Research, 2014; 1-5BMB, 2014; 110:23-34.NEJM, 2013; 369:1215-1226Curr Opin Organ Transplant 2014, 19:33-40

Gösterilebilir bir donor spesifik anti-HLA antikoru olmadan veya HLA identik transplantasyonlarda hem akut hem de kronik rejeksiyon gelişebilir.

Böbrek Naklinde non-HLA Antikorlar:◦ Protein kinaz C zeta◦ AGT ve speedy homologue A◦ MICA◦ PRKRIP1◦ MIG (CXCL9), ITAC (CXCL11), IFN-gama, glial-derived

nörotropik faktör◦ Angiotensin II tip 1 reseptör◦ Peroksizomal-trans-2enoyl-coA redüktaz◦ Anti-endoteliyal cell (AECAs)

22.Ekim.2015 28

Human Immunology, 2013 (74): 1486-1490

Transplantasyon sonrası, greft disfonksiyonugelişmeden seri izlemlerle yeni DSA gelişiminin saptanması

DSA gelişiminin ilk saptandığı anda protokol biyopsisi yapılarak antikor varlığı ile biyopsi bulgularının korelasyonunun araştırılması

Kompleman fikse edici DSA’ ların klinik öneminin aydınlatılması

Anti humoral tedavilerden sonra DSA monitorizasyonu ve patolojik yanıtın kontrol edilerek bunların uzun dönem greft fonksiyonu üzerine etkisinin araştırılması

DSA gelişimini önleyecek yaklaşımların araştırılması

22.Ekim.2015 29