Dr Nemanja Kuzmanović
Agrobacterium spp.
• Štapićaste (0.6–1.0 × 1.5–3.0 µm)
• Asporogene
• Gram negativne
• Pokretne, poseduju 1-4 peritrihe flagele
• Aerobne
• Produkuju extraćelijske polisaharide u vidu obilne sluzi na podlozi bogatoj ugljenim hidratima
• Optimalna temperatura 25-28oC
• Katalaza pozitivne
• Uglavnom oksidaza i ureaza pozitivne
Agrobacterium spp.
• Uobičajeni predstavnici zemljišne mikroflore • Oportunistički humani patogeni • Koriste se u genetičkom inženjeringu • Biljni patogeni
Agrobacterium spp. Prouzrokovači bakterioznog raka i kosmatosti korena
Kajsija Vinova loza Kruška Breskva
Orah Malina
Bakteriozni rak
Agrobacterium spp. Prouzrokovači bakterioznog raka i kosmatosti korena
Dud
Kosmatost korena
Krastavac – supstrat za propagaciju (presovane kocke)
Ekonomski značaj
• Redukuje porast, bujnost i prinos zaraženih biljaka
• U težim slučajevima izaziva delimično ili potpuno izumiranje zaraženih biljaka
• U pojedinim slučajevima nije utvrđena značajna razlika između obolelih i zdravih biljaka
Ekonomski značaj
• U SAD, godišnji gubici od Agrobacterium spp. procenjuju se na nekoliko desetina miliona dolara
• Do značajnih gubitaka dolazi naročito u rasadnicima gde biljke sa vidljivim simptomima gube svoju tržišnu vrednost i moraju biti odbačene
Agrobacterium spp. • Krug domaćina
A. tumefaciens kompleks vrsta R. rhizogenes
Širok krug domaćina
A. vitis vinova loza
A. rubi Rubus spp.
A. larrymoorei Ficus benjamina
A. tumefaciens, C58
Organizacija genetičkog materijala
• A. tumefaciens, A. rubi – 1 cirkularni i 1 linearni hromozom + plazmidi
• A. vitis – 2 cirkularna hromozoma + plazmidi
• R. rhizogenes – 1 cirkularni hromozom + 1 cirkularni megareplikon + plazmidi
Plazmidi nosioci patogenosti
Tumorogeni (tumor-inducing, Ti) i rizogeni (root-inducing, Ri) plazmid
“Replant disease” syndrome ?
Infekcioni proces
Agrios, 2005
Agrobacterium spp. Taksonomija
Taksonomska kategorija Ime
Domen Bacteria
Razdeo Proteobacteria
Klasa Alphaproteobacteria
Red Rhizobiales
Familija Rhizobiaceae
Rod Agrobacterium
Taksonomski položaj roda Agrobacterium
Agrobacterium spp. Taksonomija
• Nije definisana na adekvatan i opšteprihvaćen način i u procesu je revizije
• Poslednjih godina klasifikacija predstavnika ovog roda predmet je brojnih debata, s obzirom da na ovom planu i dalje postoje određeni sporni elementi i otvorena pitanja
• A. tumefaciens - prouzrokovač tumora na različitim biljnim delovima
• A. rhizogenes - prouzrokovač kosmatosti korena
• A. rubi – prouzrokovač tumora na Rubus spp.
• A. radiobacter – nepatogeni sojevi
Fitopatološka klasifikacija
Plazmid određuje patogenost!
klasifikacija na osnovu patogenih odlika sojeva nije održiva!
- mobilni genetički element
Agrobacterium spp. Taksonomija
Prirodna klasifikacija - fenotipske i genotipske odlike
Imena vrsta na osnovu prirodne klasifikacije Imena vrsta na osnovu patogenih karakteristika
Nakon Young i sar.,
(2001)
Nakon Holmes i Roberts
(1981); Bradbury (1986);
Holmes (1988); Moore i sar.
(2001)c
Nakon Keane i sar. (1970); Kerr i
Panagopoulos (1977); Panagopoulos i sar.
(1978)c
Nakon Kersters i De Ley
(1984)c
Nakon Allen i
Holding (1974);
Skerman i sar.
(1980)c
R. radiobacter (Ti)a A. tumefaciens (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 1) A. tumefaciens (biovar 1) A. tumefaciens
R. radiobacter (Ri) A. tumefaciens (rizogeni) A. radiobacter var. rhizogenes (biotip 1) A. rhizogenes (biovar 1) A. rhizogenes
R. radiobacter A. tumefaciens (nepatogeni) A. radiobacter var. radiobacter (biotip 1) A. radiobacter (biovar 1) A. radiobacter
R. rhizogenes (Ti) A. rhizogenes (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 2) A. tumefaciens (biovar 2) A. tumefaciens
R. rhizogenes (Ri) A. rhizogenes (rizogeni) A. radiobacter var. rhizogenes (biotip 2) A. rhizogenes (biovar 2) A. rhizogenes
R. rhizogenes A. rhizogenes (nepatogeni) A. radiobacter var. radiobacter (biotip 2) A. radiobacter (biovar 2) A. radiobacter
R. vitis (Ti) A. vitis (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 3) A. tumefaciens (biovar 3) NZ
R. vitis A. vitis (nepatogeni) NZ NZ NZ
R. rubib A. rubib A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 2) A. rubi A. rubi
R. larrymooreib A. larrymooreib NZ NZ NZ
R. skierniewicenseb NZ NZ NZ NZ
R. nepotumb NZ NZ NZ NZ
Tabela 2. Poređenje različitih nomenklatura korišćenih za Agrobacterium/Rhizobium kompleks vrsta
a patogene karakteristike naznačene su po potrebi u cilju pojašnjenja; b poznata je jedino tumorogena sposobnost ove vrste; c NZ, nije zabeleženo.
Agrobacterium
Table 4. Pojednostavljen metod za razlikovanje vrsta roda Agrobacterium
Diagnostic Test A. tumefaciens A. rhizogenes A. vitis
3-ketolactose production + - -
Acid-clearing on PDA plus
CaC03
- + -
Motility at pH 7.0 + + -
Pectolytic at pH 4.5 - - +
+, 80% or more strains positive; V, between 21-79% of strains positive; -, 80% or more strains negative.
Agrobacterium spp. • Taksonomija
Genomska vrsta
A. tumefaciens genomska vrsta G1
A. tumefaciens genomska vrsta G2 = R. pusense
A. tumefaciens genomska vrsta G3
A. tumefaciens genomska vrsta G4 = A. radiobacter
A. tumefaciens genomska vrsta G5
A. tumefaciens genomska vrsta G6
A. tumefaciens genomska vrsta G7
A. tumefaciens genomska vrsta G8 = A. fabrum
A. tumefaciens genomska vrsta G9
A. tumefaciens genomska vrsta G13
A. tumefaciens genomska vrsta G14 = R. nepotum
R. rhizogenes
A. vitis
A. rubi
A. larrymoorei
Agrobacterium sp. (strain NCPPB 1650)
R. skierniewicense
R. undicola
A. tu
mefa
ciens ko
mp
leks vrsta
Savremeni pristup u klasifikaciji bakterija i definicija genomske vrste
• DNK-DNK sličnost od 70% i više
• Razlika u temperaturi topljenja DNK jednakom ili manjom od 5°C
Novije metode
• 16S rRNK sekvenciona analiza
• AFLP (polimorfizam dužine amplifikovanih restrikcionih fragmenata)
• RAPD (metoda nasumičnog umnožavanja polimorfne DNK)
• Rep-PCR (umnožavanje na osnovu repetitivnih sekvenci)
• PFGE (restrikciona analiza i elektroforeza u pulsirajućem elektičnom polju)
• MLSA (analiza multilokusnih sekvenci)
A. tumefaciens genomska vrsta G1
A. tumefaciens genomska vrsta G2 = Rhizobium pusense
A. tumefaciens genomska vrsta G3
A. tumefaciens genomska vrsta G4 = Agrobacterium radiobacter
A. tumefaciens genomska vrsta G5
A. tumefaciens genomska vrsta G6
A. tumefaciens genomska vrsta G7
A. tumefaciens genomska vrsta G8 = ‘Agrobacterium fabrum’
A. tumefaciens genomska vrsta G9
A. tumefaciens genomska vrsta G13
A. tumefaciens genomska vrsta G14 = Rhizobium nepotum
A. tumefaciens kompleks vrsta Biovar 1
Rhizobium pusense (A. tumefaciens genomska vrsta G2)
• Opisana 2011. godine
• Pusa, Nju Delhi, Indija
• Zemljište iz rizosfere slanutka (Cicer arietinum L.)
• Klinički sojevi
• Fitopatogenost
Agrobacterium radiobacter (A. tumefaciens genomska vrsta G4)
Agrobacterium tumefaciens B6T
Agrobacterium radiobacter ATCC 19358T
recA
Agrobacterium fabrum (A. tumefaciens genomska vrsta G8)
G1, G8 i G4 u istom zemljištu
G1 u rizosferi kukuruza
G8 u rizosferi deteline
Agrobacterium genomske vrste ekološke vrste
Ekološka adaptacija
Ferulična kiselina
Rhizobium nepotum (A. tumefaciens genomska vrsta G14)
• Opisana 2012. godine
• Sojevi poreklom iz Poljske i Mađarske izolovani u periodu 1976-2008.
• Džanarika, vinova loza, malina, Colt podloga, trešnja
• Fitopatogenost
Rhizobium rhizogenes
recA
Agrobacterium rubi
• Rubus spp.
• Vaccinium corymbosum
Rhizobium larrymoorei
• Opisana 2001. godine
• Ficus benjamina
• Florida, 1995.
• Italija, Holandija
Rhizobium skierniewicense
• Opisana 2012. godine
• Hrizantema, džanarika
• Poljska
• Srodna vrsti A. rubi
• Agrobacterium tumefaciens kompleks vrsta
• Rhizobium rhizogenes
Širok krug domaćina
Agrobacterium vitis (Ophel i Kerr, 1990)
Krug domaćina ograničen na vinovu lozu
Prouzrokovač bakterioznog raka vinove loze
• 1853. Prvi pisani podatak o bakterioznom raku vinove loze
Fabre, E. i Dunal, F. (1853): Observations sur les maladies regantes de la vigne. Bull. Soc. Cent. Agric. Dep. Herault. 40, 46.
• 1897. F. Cavara je identifikovao bakteriju, koju je nazvao Bacillus
ampelopsorae, kao prouzrokovača bakterioznog raka vinove loze
Cavara, F. (1897) Tubercolosi della vite. Intorno alla eziologia de alcune malattie di piante coltivate. Stazoni Sperimentali Agrarie Italiane 30, 483–487.
• 1962. Bakteriozni rak vinove loze prvi put je uočen u Srbiji, na području trsteničkog vinogorja, na sorti Kardinal uveženoj iz Italije
Panić, M. (1977): O bakterioznom raku vinove loze. Savjetovanje o ekskoriozi i virusnim bolestima vinove loze. Mostar, 16-18. novembar, 1977. Zbornik radova, IRC – Hepok, 185-211.
• 1974. Iz biljaka vinove loze sa simptomima bakterioznog raka izolovana je bakterija koja je identifikovana kao A. tumefaciens
Arsenijević, M., Stojić, J., Panić, M. (1974): Prilog proučavanju bakterioznog raka (Agrobacterium tumefaciens) vinove loze u Jugoslaviji. Zaštita bilja, br. 128-129.
Prof. Fridiano Cavara
Istorijat
Prof. Momčilo Arsenijević
Ekonomski značaj
Redukuje rast i prinos vinove loze.
U težim slučajevima može prouzrokovati delimično ili potpuno izumiranje zaraženih biljaka.
Veliki gubici naročito u rasadnicima.
http://ookaboo.com/o/pictures/noindex/picture.original/20907036/Grapevine_Nursery_at_the_largest_vineyar
Proliferacija tkiva - tumori
Simptomi
(Burr i sar., 1998)
Nekroza i propadanje korena
Kalusno tkivo
Burr i sar., 1998
Ciklus bolesti
Rasprostranjenost
Fruškogorsko vinogorje
Mihajlovačko vinogorje
Podgorsko vinogorje
Tamnavsko vinogorje
Rajačko vinogorje
Matejevačkovinogorje
Župsko vinogorje
Levačko vinogorje
Vršačko vinogorje
Smederevsko vinogorje
Vrtogoško vinogorje
2010-2012. godine
Starost vinograda: 2-4 godine
Sortiment: Merlot, Chardonnay, Cabernet Sauvignon, Sauvignon Blanc
Isključivo je tumorogeni A. vitis identifikovan kao prouzrokovač bakterioznog raka vinove loze u
Srbiji!
Proizvodnja zdravog sadnog materijala
Razmnožavanje iz vrhova lastara Termoterapija
Kontrola
Mikropropagacija Makropropagacija
Osetljivost pojedinih sorti i podloga na bakteriozni rak
Zemlja Osetljive Otporne
Sorte
South Africa Muscat d’Alexandrie Chardonnay, Simillon, Riesling, Carignan, Blanca
ovoide
Chile Pumard, Pais, Pedro Jimenez Totontel, Moscatel negra Regina
Italy Merlot, Lambrusco, Albana, Muscat Hambourg, Cardinal,
Italia, Perla
Israel Muscat d’Alexandrie, Dabouki, other local varieties
U.S. Chardonnay, Merlot, Riesling, Cabernet Sauvignon, Grenache,
and other vinifera
Several V. labursca cultivars and some hybrid,
Podloge
South Africa 110-Richter, 99-Richter, Jacques, Ramsey Paulsen 775, Freedom, Couderc 3309, 101-14
Mgt, Kober 5BB
Spain 161-49
Italy Teleki 5C, 17-37, Paulsen 775, Kober 5BB, 420 A
Hungary Kober 5BB, Teleki 5C, Teleki 8B, Paulsen 775, 287C Riparia Gloire, 101-14 Mgt
Israel Ruggeri 140 1103 Paulsen
U.S. 110-Richter, Teleki 5C Couderc 3309, Riparia Gloire 101-14 Mgt
Sadnja sorti i podloga otpornih na bakteriozni rak i niske temperature
Kontrola
A. rhizogenes, soj K84
Biološka kontrola
A. rhizogenes, soj K1026
Kontrola
Sojevi bakterija testirani u kontroli bakterioznog raka vinove loze
Kontrola
Biološka kontrola
Bakterijska vrsta Soj Poreklo Literatura
Agrobacterium vitis (n.t.) F2/5 Grapevine, South Africa Staphorst et al., 1985
Agrobacterium tumefaciens (n.t.) HLB2 Hop, China Xiaoying et al., 1986
Agrobacterium tumefaciens (n.t.) J73 Plum, South Africa Webster et al., 1986
Agrobacterium vitis (n.t.) E26 Grapevine, China Yajie et al., 1990; Wang et al., 2003
Agrobacterium spp. (n.t.) Various, Romania Kupferberg et al., 1991
Agrobacterium rhizogenes (n.t. derivatives)
Soil, Russia Khmel et al., 1991
Agrobacterium tumefaciens (n.t.) MI15 Grapevine, China Xie et al., 1993
Pseudomonas corrugata Grapevine, Canada Bell et al., 1995
Pseudomonas fluorescens CR330D Grapevine rhizosphere, Moldavia Khmel et al., 1998
Pseudomonas spp. 1100-6 Apple, U.S.A/Canada Eastwell et al., 2006
Agrobacterium vitis (n.t.) VAR03-1 Grapevine, Japan Kawaguchi et al., 2007
Bacillus subtilis BS-F4 Italy Biondi et al., 2009
Pseudomonas fluorescens IPV-BO G19 Apple, Italy Biondi et al., 2009
Kontrola
Kontrola Praćenje i provera zdravstvenog stanja
Izolacija bakterija
Tumori
Kalusno tkivo
Ksilemski sok
- Sok dobijen prilikom suzenja
- Ekstrakt prikupljen pomoću vakuum pumpe
RS podloga YMA podloga
Kontrola
PCR
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
Praćenje i provera zdravstvenog stanja
• Bojenje po Gramu
• Aktivnost oksidaze
• Fluorescentnost na King B podlozi
• Razvoj pri 35°C
• Razvoj u 2% NaCl
• 3-ketolaktozni test
• Formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3
• Razvoj i pigmentacija u podlozi sa feri
amonijum citratom
• Korišćenje citrata
• Stvaranje kiseline iz saharoze
• Stvaranje kiseline iz eritritola
• Stvaranje kiseline iz melezitoze
• Stvaranje baze iz tartarata
paradajz
vinova loza
Kontrola
Test patogenosti Biohemijsko-fiziološki testovi
Praćenje i provera zdravstvenog stanja
Kontrola
Elektronski nos (E-nose)
Praćenje i provera zdravstvenog stanja
Aktuelni problemi i perspektive
• A. vitis nije karantinski patogen u Srbiji, niti u EU.
• Neophodno je uvesti adekvatne fitosanitarne mere u rasadnicima i prilikom uvoza sadnog materijala.
• Prisustvo oboljenja u mladim vinogradima ukazuje da je patogen mogao biti raširen putem zaraženih loznih kalemova.
• Razvoj i standardizacija procedura i protokola za uzorkovanje i analizu.
Hvala na pažnji...