dr nemanja kuzmanović - agrif.bg.ac.rs. agrobacterium spp... · plazmid određuje patogenost!...

Dr Nemanja Kuzmanović

Agrobacterium spp.

• Štapićaste (0.6–1.0 × 1.5–3.0 µm)

• Asporogene

• Gram negativne

• Pokretne, poseduju 1-4 peritrihe flagele

• Aerobne

• Produkuju extraćelijske polisaharide u vidu obilne sluzi na podlozi bogatoj ugljenim hidratima

• Optimalna temperatura 25-28oC

• Katalaza pozitivne

• Uglavnom oksidaza i ureaza pozitivne

Agrobacterium spp.

• Uobičajeni predstavnici zemljišne mikroflore • Oportunistički humani patogeni • Koriste se u genetičkom inženjeringu • Biljni patogeni

Agrobacterium spp. Prouzrokovači bakterioznog raka i kosmatosti korena

Kajsija Vinova loza Kruška Breskva

Orah Malina

Bakteriozni rak

Agrobacterium spp. Prouzrokovači bakterioznog raka i kosmatosti korena

Dud

Kosmatost korena

Krastavac – supstrat za propagaciju (presovane kocke)

Ekonomski značaj

• Redukuje porast, bujnost i prinos zaraženih biljaka

• U težim slučajevima izaziva delimično ili potpuno izumiranje zaraženih biljaka

• U pojedinim slučajevima nije utvrđena značajna razlika između obolelih i zdravih biljaka

Ekonomski značaj

• U SAD, godišnji gubici od Agrobacterium spp. procenjuju se na nekoliko desetina miliona dolara

• Do značajnih gubitaka dolazi naročito u rasadnicima gde biljke sa vidljivim simptomima gube svoju tržišnu vrednost i moraju biti odbačene

Agrobacterium spp. • Krug domaćina

A. tumefaciens kompleks vrsta R. rhizogenes

Širok krug domaćina

A. vitis vinova loza

A. rubi Rubus spp.

A. larrymoorei Ficus benjamina

A. tumefaciens, C58

Organizacija genetičkog materijala

• A. tumefaciens, A. rubi – 1 cirkularni i 1 linearni hromozom + plazmidi

• A. vitis – 2 cirkularna hromozoma + plazmidi

• R. rhizogenes – 1 cirkularni hromozom + 1 cirkularni megareplikon + plazmidi

Plazmidi nosioci patogenosti

Tumorogeni (tumor-inducing, Ti) i rizogeni (root-inducing, Ri) plazmid

“Replant disease” syndrome ?

Infekcioni proces

Agrios, 2005

Agrobacterium spp. Taksonomija

Taksonomska kategorija Ime

Domen Bacteria

Razdeo Proteobacteria

Klasa Alphaproteobacteria

Red Rhizobiales

Familija Rhizobiaceae

Rod Agrobacterium

Taksonomski položaj roda Agrobacterium


• Nije definisana na adekvatan i opšteprihvaćen način i u procesu je revizije

• Poslednjih godina klasifikacija predstavnika ovog roda predmet je brojnih debata, s obzirom da na ovom planu i dalje postoje određeni sporni elementi i otvorena pitanja

• A. tumefaciens - prouzrokovač tumora na različitim biljnim delovima

• A. rhizogenes - prouzrokovač kosmatosti korena

• A. rubi – prouzrokovač tumora na Rubus spp.

• A. radiobacter – nepatogeni sojevi

Fitopatološka klasifikacija

Plazmid određuje patogenost!

klasifikacija na osnovu patogenih odlika sojeva nije održiva!

- mobilni genetički element


Prirodna klasifikacija - fenotipske i genotipske odlike

Imena vrsta na osnovu prirodne klasifikacije Imena vrsta na osnovu patogenih karakteristika

Nakon Young i sar.,

(2001)

Nakon Holmes i Roberts

(1981); Bradbury (1986);

Holmes (1988); Moore i sar.

(2001)c

Nakon Keane i sar. (1970); Kerr i

Panagopoulos (1977); Panagopoulos i sar.

(1978)c

Nakon Kersters i De Ley

(1984)c

Nakon Allen i

Holding (1974);

Skerman i sar.

(1980)c

R. radiobacter (Ti)a A. tumefaciens (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 1) A. tumefaciens (biovar 1) A. tumefaciens

R. radiobacter (Ri) A. tumefaciens (rizogeni) A. radiobacter var. rhizogenes (biotip 1) A. rhizogenes (biovar 1) A. rhizogenes

R. radiobacter A. tumefaciens (nepatogeni) A. radiobacter var. radiobacter (biotip 1) A. radiobacter (biovar 1) A. radiobacter

R. rhizogenes (Ti) A. rhizogenes (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 2) A. tumefaciens (biovar 2) A. tumefaciens

R. rhizogenes (Ri) A. rhizogenes (rizogeni) A. radiobacter var. rhizogenes (biotip 2) A. rhizogenes (biovar 2) A. rhizogenes

R. rhizogenes A. rhizogenes (nepatogeni) A. radiobacter var. radiobacter (biotip 2) A. radiobacter (biovar 2) A. radiobacter

R. vitis (Ti) A. vitis (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 3) A. tumefaciens (biovar 3) NZ

R. vitis A. vitis (nepatogeni) NZ NZ NZ

R. rubib A. rubib A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 2) A. rubi A. rubi

R. larrymooreib A. larrymooreib NZ NZ NZ

R. skierniewicenseb NZ NZ NZ NZ

R. nepotumb NZ NZ NZ NZ

Tabela 2. Poređenje različitih nomenklatura korišćenih za Agrobacterium/Rhizobium kompleks vrsta

a patogene karakteristike naznačene su po potrebi u cilju pojašnjenja; b poznata je jedino tumorogena sposobnost ove vrste; c NZ, nije zabeleženo.

Agrobacterium

Table 4. Pojednostavljen metod za razlikovanje vrsta roda Agrobacterium

Diagnostic Test A. tumefaciens A. rhizogenes A. vitis

3-ketolactose production + - -

Acid-clearing on PDA plus

CaC03

- + -

Motility at pH 7.0 + + -

Pectolytic at pH 4.5 - - +

+, 80% or more strains positive; V, between 21-79% of strains positive; -, 80% or more strains negative.

Agrobacterium spp. • Taksonomija

Genomska vrsta

A. tumefaciens genomska vrsta G1

A. tumefaciens genomska vrsta G2 = R. pusense


A. tumefaciens genomska vrsta G4 = A. radiobacter




A. tumefaciens genomska vrsta G8 = A. fabrum



A. tumefaciens genomska vrsta G14 = R. nepotum

R. rhizogenes

A. vitis

A. rubi

A. larrymoorei

Agrobacterium sp. (strain NCPPB 1650)

R. skierniewicense

R. undicola

A. tu

mefa

ciens ko

mp

leks vrsta

Savremeni pristup u klasifikaciji bakterija i definicija genomske vrste

• DNK-DNK sličnost od 70% i više

• Razlika u temperaturi topljenja DNK jednakom ili manjom od 5°C

Novije metode

• 16S rRNK sekvenciona analiza

• AFLP (polimorfizam dužine amplifikovanih restrikcionih fragmenata)

• RAPD (metoda nasumičnog umnožavanja polimorfne DNK)

• Rep-PCR (umnožavanje na osnovu repetitivnih sekvenci)

• PFGE (restrikciona analiza i elektroforeza u pulsirajućem elektičnom polju)

• MLSA (analiza multilokusnih sekvenci)


A. tumefaciens genomska vrsta G2 = Rhizobium pusense


A. tumefaciens genomska vrsta G4 = Agrobacterium radiobacter




A. tumefaciens genomska vrsta G8 = ‘Agrobacterium fabrum’



A. tumefaciens genomska vrsta G14 = Rhizobium nepotum

A. tumefaciens kompleks vrsta Biovar 1

Rhizobium pusense (A. tumefaciens genomska vrsta G2)

• Opisana 2011. godine

• Pusa, Nju Delhi, Indija

• Zemljište iz rizosfere slanutka (Cicer arietinum L.)

• Klinički sojevi

• Fitopatogenost

Agrobacterium radiobacter (A. tumefaciens genomska vrsta G4)

Agrobacterium tumefaciens B6T

Agrobacterium radiobacter ATCC 19358T

recA

Agrobacterium fabrum (A. tumefaciens genomska vrsta G8)

G1, G8 i G4 u istom zemljištu

G1 u rizosferi kukuruza

G8 u rizosferi deteline

Agrobacterium genomske vrste ekološke vrste

Ekološka adaptacija

Ferulična kiselina

Rhizobium nepotum (A. tumefaciens genomska vrsta G14)


• Sojevi poreklom iz Poljske i Mađarske izolovani u periodu 1976-2008.

• Džanarika, vinova loza, malina, Colt podloga, trešnja

• Fitopatogenost

Rhizobium rhizogenes

recA

Agrobacterium rubi

• Rubus spp.

• Vaccinium corymbosum

Rhizobium larrymoorei


• Ficus benjamina

• Florida, 1995.

• Italija, Holandija

Rhizobium skierniewicense


• Hrizantema, džanarika

• Poljska

• Srodna vrsti A. rubi

• Agrobacterium tumefaciens kompleks vrsta

• Rhizobium rhizogenes

Širok krug domaćina

Agrobacterium vitis (Ophel i Kerr, 1990)

Krug domaćina ograničen na vinovu lozu

Prouzrokovač bakterioznog raka vinove loze

• 1853. Prvi pisani podatak o bakterioznom raku vinove loze

Fabre, E. i Dunal, F. (1853): Observations sur les maladies regantes de la vigne. Bull. Soc. Cent. Agric. Dep. Herault. 40, 46.

• 1897. F. Cavara je identifikovao bakteriju, koju je nazvao Bacillus

ampelopsorae, kao prouzrokovača bakterioznog raka vinove loze

Cavara, F. (1897) Tubercolosi della vite. Intorno alla eziologia de alcune malattie di piante coltivate. Stazoni Sperimentali Agrarie Italiane 30, 483–487.

• 1962. Bakteriozni rak vinove loze prvi put je uočen u Srbiji, na području trsteničkog vinogorja, na sorti Kardinal uveženoj iz Italije

Panić, M. (1977): O bakterioznom raku vinove loze. Savjetovanje o ekskoriozi i virusnim bolestima vinove loze. Mostar, 16-18. novembar, 1977. Zbornik radova, IRC – Hepok, 185-211.

• 1974. Iz biljaka vinove loze sa simptomima bakterioznog raka izolovana je bakterija koja je identifikovana kao A. tumefaciens

Arsenijević, M., Stojić, J., Panić, M. (1974): Prilog proučavanju bakterioznog raka (Agrobacterium tumefaciens) vinove loze u Jugoslaviji. Zaštita bilja, br. 128-129.

Prof. Fridiano Cavara

Istorijat

Prof. Momčilo Arsenijević

Ekonomski značaj

Redukuje rast i prinos vinove loze.

U težim slučajevima može prouzrokovati delimično ili potpuno izumiranje zaraženih biljaka.

Veliki gubici naročito u rasadnicima.

http://ookaboo.com/o/pictures/noindex/picture.original/20907036/Grapevine_Nursery_at_the_largest_vineyar

Proliferacija tkiva - tumori

Simptomi

(Burr i sar., 1998)

Nekroza i propadanje korena

Kalusno tkivo

Burr i sar., 1998

Ciklus bolesti

Rasprostranjenost

Fruškogorsko vinogorje

Mihajlovačko vinogorje

Podgorsko vinogorje

Tamnavsko vinogorje

Rajačko vinogorje

Matejevačkovinogorje

Župsko vinogorje

Levačko vinogorje

Vršačko vinogorje

Smederevsko vinogorje

Vrtogoško vinogorje

2010-2012. godine

Starost vinograda: 2-4 godine

Sortiment: Merlot, Chardonnay, Cabernet Sauvignon, Sauvignon Blanc

Isključivo je tumorogeni A. vitis identifikovan kao prouzrokovač bakterioznog raka vinove loze u

Srbiji!

Proizvodnja zdravog sadnog materijala

Razmnožavanje iz vrhova lastara Termoterapija

Kontrola

Mikropropagacija Makropropagacija

Osetljivost pojedinih sorti i podloga na bakteriozni rak

Zemlja Osetljive Otporne

Sorte

South Africa Muscat d’Alexandrie Chardonnay, Simillon, Riesling, Carignan, Blanca

ovoide

Chile Pumard, Pais, Pedro Jimenez Totontel, Moscatel negra Regina

Italy Merlot, Lambrusco, Albana, Muscat Hambourg, Cardinal,

Italia, Perla

Israel Muscat d’Alexandrie, Dabouki, other local varieties

U.S. Chardonnay, Merlot, Riesling, Cabernet Sauvignon, Grenache,

and other vinifera

Several V. labursca cultivars and some hybrid,

Podloge

South Africa 110-Richter, 99-Richter, Jacques, Ramsey Paulsen 775, Freedom, Couderc 3309, 101-14

Mgt, Kober 5BB

Spain 161-49

Italy Teleki 5C, 17-37, Paulsen 775, Kober 5BB, 420 A

Hungary Kober 5BB, Teleki 5C, Teleki 8B, Paulsen 775, 287C Riparia Gloire, 101-14 Mgt

Israel Ruggeri 140 1103 Paulsen

U.S. 110-Richter, Teleki 5C Couderc 3309, Riparia Gloire 101-14 Mgt

Sadnja sorti i podloga otpornih na bakteriozni rak i niske temperature

Kontrola

A. rhizogenes, soj K84

Biološka kontrola

A. rhizogenes, soj K1026

Kontrola

Sojevi bakterija testirani u kontroli bakterioznog raka vinove loze

Kontrola

Biološka kontrola

Bakterijska vrsta Soj Poreklo Literatura

Agrobacterium vitis (n.t.) F2/5 Grapevine, South Africa Staphorst et al., 1985

Agrobacterium tumefaciens (n.t.) HLB2 Hop, China Xiaoying et al., 1986

Agrobacterium tumefaciens (n.t.) J73 Plum, South Africa Webster et al., 1986

Agrobacterium vitis (n.t.) E26 Grapevine, China Yajie et al., 1990; Wang et al., 2003

Agrobacterium spp. (n.t.) Various, Romania Kupferberg et al., 1991

Agrobacterium rhizogenes (n.t. derivatives)

Soil, Russia Khmel et al., 1991

Agrobacterium tumefaciens (n.t.) MI15 Grapevine, China Xie et al., 1993

Pseudomonas corrugata Grapevine, Canada Bell et al., 1995

Pseudomonas fluorescens CR330D Grapevine rhizosphere, Moldavia Khmel et al., 1998

Pseudomonas spp. 1100-6 Apple, U.S.A/Canada Eastwell et al., 2006

Agrobacterium vitis (n.t.) VAR03-1 Grapevine, Japan Kawaguchi et al., 2007

Bacillus subtilis BS-F4 Italy Biondi et al., 2009

Pseudomonas fluorescens IPV-BO G19 Apple, Italy Biondi et al., 2009

Kontrola

Kontrola Praćenje i provera zdravstvenog stanja

Izolacija bakterija

Tumori

Kalusno tkivo

Ksilemski sok

- Sok dobijen prilikom suzenja

- Ekstrakt prikupljen pomoću vakuum pumpe

RS podloga YMA podloga

Kontrola

PCR

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

Praćenje i provera zdravstvenog stanja

• Bojenje po Gramu

• Aktivnost oksidaze

• Fluorescentnost na King B podlozi

• Razvoj pri 35°C

• Razvoj u 2% NaCl

• 3-ketolaktozni test

• Formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3

• Razvoj i pigmentacija u podlozi sa feri

amonijum citratom

• Korišćenje citrata

• Stvaranje kiseline iz saharoze

• Stvaranje kiseline iz eritritola

• Stvaranje kiseline iz melezitoze

• Stvaranje baze iz tartarata

paradajz

vinova loza

Kontrola

Test patogenosti Biohemijsko-fiziološki testovi


Kontrola

Elektronski nos (E-nose)


Aktuelni problemi i perspektive

• A. vitis nije karantinski patogen u Srbiji, niti u EU.

• Neophodno je uvesti adekvatne fitosanitarne mere u rasadnicima i prilikom uvoza sadnog materijala.

• Prisustvo oboljenja u mladim vinogradima ukazuje da je patogen mogao biti raširen putem zaraženih loznih kalemova.

• Razvoj i standardizacija procedura i protokola za uzorkovanje i analizu.

Hvala na pažnji...

dr nemanja kuzmanović - agrif.bg.ac.rs. agrobacterium spp... · plazmid određuje patogenost!...

Documents