ASOCIACIÓN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

INTERNADO DE ANIMALES MAYORES Y MENORES

BANCO DE SEMEN

“COLECCIÓN, EVOLUCIÓN  Y PROCESAMIENTO DEL  SEMEN DE TOROS”

NOMBRE: JUAN MANUEL

APELLIDO: MORALES VILCA

CICLO: X

2013

Página 1

“DEDICADO A DIOS Y A TODO LOS SERES QUERIDOS”

A mis padres Carlos David morales loza y Maria

Venedicta Vilca Cardenas; gracias por su apoyo

Y comprensión, por todos los sacrificios que

Han realizado a lo largo de mi vida para

Ayudarme a tratar de ser una mejor persona

Cada dia; y por el simple y sencillo hecho de

Ser mis padres.

Página 2

ÍNDICE:

I. Introducción Pág. 4, 5

II. Factores que afectan la calidad seminal Pag. 6, 7, 8

III. Colección Pag. 9, 10, 11

IV. Evaluación del semen Pag. 12, 13, 14, 15

V. Procesamiento del semen Pag. 16, 17, 18, 19

VI. Agentes crioprotectores y efectos de la congelación sobre las células espermáticas Pag. 20, 21

VII. Descongelación Pag. 22

VIII. Recomendaciones Pag. 23

IX. Anexos Pag. 24, 25

X. Resumen Pag. 26

XI. conclusiones Pag. 27, 28

XII. Bibliografía Pag. 29, 30

Página 3

I. INTRODUCCION:

La calidad seminal puede cambiar significativamente dependiendo de si un toro está pasando por, o recuperándose, de un proceso que afecta la espermatogénesis. El espermograma deberá interpretarse teniendo en cuenta el examen físico y la historia del toro.

Teniendo en cuenta que en una población coexisten individuos fértiles, infértiles, subfértiles y estériles, quienes han incorporado el análisis de semen a la evaluación de los toros, lo hacen con el objetivo de seleccionar para la reproducción únicamente animales fértiles.

Los toros según su calidad seminal en satisfactorios, cuestionables e insatisfactorios.

Considera satisfactorios a aquellos que tienen un mínimo de 60% de espermatozoides con motilidad progresiva y un 70% de ellos, con morfología normal.

La reproducción juega un papel preponderante. Machos y hembras deben tener características fenotípicas y genotípicas deseables, y además producir descendencia, proceso en el cual el macho tiene un gran impacto, bien sea utilizado en monta directa o inseminación artificial.

Dado que un solo macho se aparea con muchas vacas, de su calidad seminal depende que las vacas preñen y por consiguiente sea óptima la reproducción del hato.

Página 4

Este particular detalle hace que sea una necesidad la valoración de la calidad seminal en donde no solo se analiza, la concentración espermática, la motilidad, el volumen seminal, aspecto, color, Ph, sino que además sirve para evaluar la forma de los espermatozoides y establecer el porcentaje de espermatozoides vivos y muertos, mediante las técnicas de tinción también llamadas de morfología espermática. 

Para que se produzcan espermatozoides fértiles, los toros deben contar con una temperatura testicular de 2 a 6 grados centígrados menor que la temperatura corporal central y presentar en promedio temperatura de 35. 5, 34.6, 33.1 grados centígrados respectivamente en la cabeza, cuerpo y cola del epidídimo.

Los criadores frecuentemente solicitan evaluaciones reproductivas rutinarias de sus machos (examen andrológico) para confirmar su fertilidad antes de una compra ó de una venta, para controlar su producción espermática diaria (PED) especialmente en reproductores de alto costo, para valorar el potencial reproductor como donante de semen para inseminación artificial (IA) con semen congelado ó refrigerado, ó para una orientación en problemas de infertilidad aparente y/o anormalidades testiculares.

Tales evaluaciones reproductivas dependen de que se logre recolectar el semen apropiadamente y sobretodo de una precisa valoración del mismo.

La falta de éxito reproductivo frecuentemente se debe a más de un factor. Por lo tanto una evaluación de aptitud reproductiva (EAR), incluirá una prueba de libido o de capacidad de servicio, un examen de los genitales externos, una medición testicular, una palpación testicular y de los genitales internos, una evaluación seminal, así como ecografía de testí-culos y vesículas seminales y próstata en algunos casos.

Las pruebas para determinar enfermedades de transmisión sexual, especialmente brucelosis, Paratuberculosis, IBR, etc., son parte crucial de la EAR.

Página 5

II. FACTORES QUE AFECTAN LA CALIDAD SEMINAL

LA TEMPERATURA

Es uno de los factores ambientales más importantes que modifican la espermatogenesis. La temperatura corporal puede verse afectada por periodos de temperatura ambiental alta al igual que extremadamente bajas o por cuadros de pirexia ocasionado por enfermedades y/o heridas.

Argumenta que el mecanismo de daño por temperatura, es la hipoxia testicular, esto se debe a que los testículos operan normalmente en un punto muy cercano a la hipoxia y al ser activados los mecanismos de pérdida de calor, hay vaso dilatación y aumento de la actividad metabólica con una necesidad directa de incrementar el oxigeno, este incremento de oxigeno es una tasa mayor que la del flujo sanguíneo por tanto los testículos se tornan hipoxicos

El calentamiento de los testículos provoca que los espermatocitos en la fase meiotica sean destruidos y se den alteraciones en la transformación de espermatozoides a espermatozoides, principalmente cambios en la condensación de la cromatina nuclear, formación de la cola y desarrollo del casquete acrosómico de los espermatozoides.

Al igual se ve afectado el epidídimo y sus funciones normales absorbentes y secretoras que ocasionan cambios en la composición de los fluidos, e incrementan la tasa de paso espermático que conlleva a una prematura maduración espermática.

EL ESTRÉS

Aún cuando se tienen diferentes interpretaciones de estrés lo define como aquel estado generado por toda situación interna o externa que perturbe el equilibrio físico y aún social del animal, creando tensión y tendiendo a colocar los mecanismos de defensas del mismo en un estado de alerta y actividad que le permitan responder ante situaciones adversas.

El organismo responde, mediante la producción excesiva de cortisol por parte de las glándulas adrenales lo cual reduce la producción de LH. Por la pituitaria. Lo que conduce a una disminución en la producción de testosterona por las células de Leydig,

El estrés prolongado provoca cuadros de degeneración testicular, que pueden variar de ligera hasta aplasia completa del epitelio seminífero, según la intensidad y el tiempo de acción del estímulo. Se provoca un aumento de espermatozoides con anormalidades de cabeza, periforme, alongadas y estrechas. En casos severos podría provocar una azoospermia.

Página 6

LOS FACTORES NUTRICIONALES

La nutrición, tiene mayor impacto sobre las funciones endocrineas mas que las espermatogénicas. Debido a que el estrés nutricional provoca retardo en el crecimiento de los testículos y supresión de la actividad endocrínea lo que conduce a tener un mayor impacto en animales jóvenes en crecimiento ya que retarda la pubertad y deprime la producción y características del semen.

Los factores nutricionales mas comunes que afectan la calidad seminal incluyen la obesidad y sobrealimentación, las diferencias calóricos (raciones bajas en energía disminuyen la libido y la producción de testosterona), proteínicas (especialmente en machos jóvenes), vitaminas y de minerales (deficiencias de yodo, cobre, cobalto, zinc y magnesio afectan la producción de semen y la fertilidad, igualmente es causa de baja de libido) y agentes tóxicos (los estrógenos vegetales, además las tierras raras y radiaciones ionizantes.

Las dietas ricas en energía permiten a animales jóvenes de 12 meses una circunferencia escrotal mayor, pero por el contrario en animales mayores se ve transformado en grasa lo que conlleva a una mala termorregulación de los testículos. Además de anormalidades de aplomos y conformación que conducen a Laminitis y posibles epifitis. Las dietas ricas en energía, constituyen una de las causales de ruminitis y abscesos de hígado que conducen a vesiculitis y epididimitis.

EFECTO DE LA EDAD

La producción de espermatozoides está asociada en forma directa con la pubertad. Sostiene que la edad de pubertad depende de variaciones propias que hay entre las razas de leche y carne. Así se explica en general que las razas de tamaño adulto grande con altas ganancias de peso que las razas de tamaño adulto menor que poseen menores ganancias.

Y que las razas históricamente seleccionadas por su producción de leche, tiene un comienzo de la pubertad más temprano y un mayor desarrollo testicular a menor edad y madurez que las razas que producen poca cantidad de leche. Además, para el caso de razas de doble músculo poseen un comienzo de la pubertad más lento y poseen un tamaño testicular más pequeño a la pubertad y a la madurez.

Página 7

GENES RECESIVOS

Las razas bovinas al igual que cualquier especie tienen caracteres deseables e indeseables y en sus cromosomas hay genes recesivos indeseables, algunos letales ó altamente deletéreos que se encuentran en forma heterocigótica y que tienen mayor oportunidad de manifestarse en los casos de consanguinidad.

Defectos hereditarios el síndrome de cabeza plegada, cresta nuclear, cabezas gigantes, debilidad de la membrana, mitocondrias y separación de la membrana mitocondrial, estas últimas que ocasionan casos de espermatozoides decapitados, con defectos de pieza distal doblada y defecto dag. Los cuales fueron diagnosticados en animales Holstein, Jersey y Herefort.

MALFORMACIONES CONGÉNITAS

La producción y fertilidad de los espermatozoides, se ve afectada por malformaciones congénitas que van desde la ausencia del espitelio semifero y segmentos de los conductos wolffanes hasta el criptorquidio y testículos ectópicos, entre otros.

Hay malformaciones congénitas que conllevan a inhabilidades copulativas, como es el caso de la espondilosis lumbar, garrones débiles, músculo retractor del pene corto o pene corto, frenulos peneanos, desviación espiral del pene, etc.

Página 8

III. COLECCIÓN:

COLECCIÓN DE SEMEN

Existen diferentes métodos para la recolección de semen en los bovinos, entre los cuales tenemos:

1) La vagina artificial.2) Electro eyaculación.3) Masajes de las glándulas genitales accesorias.

Colección de semen con electro eyaculador

El electro eyaculador es un aparato eléctrico que provee una estimación rectal que desencadena la erección y eyaculación. Está formado esencialmente por: transformador, reóstato electrodo bipolar, voltímetro. Su manejo consiste en aumentar gradualmente el voltaje desde cero hasta 10-15 voltios, con incrementos de 2 voltios e intervalos de 5-10 segundos, volviendo a cero.

El electro eyaculador permite extraer semen a todos los toros sin previo acostumbramiento especialmente en animales indómitos, con libido pobre o ausente, con afecciones de los miembros posteriores que le impiden cubrir la hembra o en el caso de examen de infertilidad de varios animales.

Colección de semen por medio de masaje transrectal

Para realizar la técnica de masaje, el operador debe introducir su mano en el recto y luego de la exanimación de la glándulas accesorias y los anillos inguinales, se aplica un masaje longitudinal de atrás hacia adelante sobre las amputas, la próstata y la uretra. Cuando el músculo de la uretra comience las contracciones, el operador debe tratar de masajear en sincronía con ellas y continuar el masaje hasta producirse la eyaculación.

El masaje transrectal, es una técnica agotadora para la persona que realiza el masaje; que además incluye irritación de la mucosa rectal por la excesiva frotación manual y una falta de prolusión del pene.

Página 9

Colección de semen con vagina artificial (VA)

La vagina artificial es una construcción simple y simula la copula natural. La unidad proporciona temperatura adecuada, presión y fricción que favorece la eyaculación y se adosa a un tubo calibrado para la colecta de semen.

La recolección de semen con vagina artificial, permite que el volumen eyaculado sea igual al obtenido por monta natural. Además de permitir una adecuada excitación sexual del macho, lo que permite obtener semen de buen volumen y alta concentración espermática. Con intervalos cortos de 10-15 minutos se pueden obtener hasta 4 eyaculados.

El más comúnmente utilizado es la vagina artificial, por cuanto ofrece al macho, condiciones parecidas a la vagina de la hembra. 

Descripción de la vagina artificial 

Cuerpo de la vagina: consiste en un tubo cilíndrico, provisto de una válvula y una tapa, generalmente de caucho resistente, tienen 40 a 50 centímetros de largo y 7 a 10 centímetros de diámetro. 

Funda interna: goma elástica o de látex que se ubica en el interior del tubo cilíndrico y representa las paredes de la vagina, sus extremos se doblan sobre la parte externa del tubo y se fija con bandas de caucho. 

Cono de látex: se fija en uno de los extremos de la vagina cerca de la válvula para el agua. 

Tuvo colector de semen: se coloca en el otro extremo del cono; este tubo está protegido por una cubierta protectora, que generalmente es una jeringa plástica, cuya finalidad es proteger el semen de la luz y de los cambios de temperatura. (Fig. 1)

Página 10

Recolección de Semen 

Por una válvula ubicada en la vagina artificial se introduce agua a una temperatura de 50 a 60 grados centígrados, hasta llenar los dos tercios de su capacidad total 

En el momento de recoger el semen, la temperatura óptima en el interior de la vagina debe ser de 38 a 39°C. Sin embargo, existen toros que exigen una mayor temperatura para eyacular. 

Luego se procede a la toma del eyaculado, sujetando una hembra en celo u otro macho o un maniquí. El técnico encargado de la recolección se coloca a la derecha del toro y mantiene la vagina artificial en la mano derecha, con la abertura dirigida hacia el pene, mientras que con la mano izquierda colocada sobre el prepucio lo dirige hacia la abertura de la vagina. 

Debe evitarse tocar directamente el pene, ya que la erección puede ser inhibida y el toro negarse a montar. Es recomendable practicar la falsa monta, con la finalidad de que el toro alcance el máximo grado de erección y de esta manera obtener un semen de buena calidad.

Luego de practicar la falsa monta, se procede a efectuar la recolección, mediante la introducción del pene en la vagina artificial hasta lograr la eyaculación; después el operador retira la vagina artificial y el eyaculado o semen se deposita en el tubo colector. 

Página 11

IV. EVALUACIÓN DEL SEMEN:

Una vez realizada la recolección del eyaculado, debe conservarse en un recipiente con agua a 37°C para evitar los cambios de temperatura que afectan su calidad. 

La evaluación del semen se divide en dos partes: 

1) Examen macroscópico

Volumen: varía desde uno hasta ocho centímetros cúbicos. La mayoría de los toros proporcionan de 3 a 6 cc. 

La calidad del semen varía según las especies, el estado fisiológico, individuo, raza, edad, tamaño, número de saltos, métodos de recolección, factores alimentarios, sanitarios y medio ambientales. La eyaculación media es de 4 a 6 centímetros cúbicos y varía entre 1-12 cm3; los toros jóvenes pueden suministrar de 1 a 3 centímetros cúbicos de semen, mientras que los adultos pueden eyacular de 10 a 15 cm3.

Color: depende de la cantidad de espermatozoides; cuando el semen es de buena calidad, presenta una coloración blanco lechosa o cremosa y cuando es de baja calidad su color es similar a leche aguada. 

Posee una coloración blanquecina o ligeramente amarillenta y su opacidad se halla en función de la concentración espermática.

Los eyaculados muy buenos tienen apariencia granulosa con una concentración de 750 a 1.000 millones o más de espermatozoides por mililitro Buenos, semen opaco, lechoso con 400 a 750 millones de espermatozoides por ml.

Regular, semen con leche aguada con 250 a 400 millones de espermatozoides por ml. Malo, semen translúcido y acuoso con menos de 250 millones de espermatozoides por ml.

Página 12

Olor: el semen en buenas condiciones presenta un olor similar a la leche fresca. El olor a orina nos indica que el semen está contaminado con ésta. Cuando el olor es muy desagradable, se sospecha alguna enfermedad en los testículos o en otra parte del aparato reproductivo.

Aspecto: depende de la concentración de espermatozoides y se mide por el mayor o menor grado de opacidad que presenta la muestra de semen. 

El eyaculado como tal, es un líquido denso, cremoso, ligeramente amarillento, que contiene una suspensión de espermatozoides en un medio llamado plasma seminal.

pH: se determina mediante el empleo de una cinta colorimétrica, su valor varía entre 6,4 a 6,9; valores por encima de 6,9 son indicativos de semen de baja calidad. 

2) Examen microscópico 

Mortalidad masal: 

Es el resultado de la concentración espermática, el porcentaje de células con movimiento progresivo y velocidad de movimiento de los espermatozoides. Lo cual provoca movimientos de flujo y la existencia de verdaderas “olas” de zoospermios, que al estas disminuidos o en baja concentración provocan disminución. La observación se hace sobre una gota de semen de 5 a 10 mm de diámetro, colocada sobre un porta objetos tibio y sin cubre objetos. La observación se realiza, con semen sin diluir y bajo un campo luminoso y con un aumento de 40-125 x observando varios campos microscópicos. (Tabla. 1)

Luego se observa al microscopio con pequeño aumento. En toda la gota de semen se observa la presencia de ondas y remolinos y éste se puede clasificar atendiendo a las características de las ondas en:

Semen muy bueno: presenta ondas oscuras marcadas en rápido movimiento.

Semen bueno: se observan ondas menos oscuras que el anterior, marcadas con movimiento moderado.

Semen regular: presenta ondas claras con movimiento muy ligero. Semen malo: no hay ondas, se observan los espermatozoides inmóviles.

Página 13

Motilidad individual: 

Es el resultado de la evaluación del movimiento progresivo de los espermatozoides y de los cambios en su motilidad. Este seguimiento se hace en una superficie de 1 mm2 y una altura de 0.1 mm., lo cual se consigue al colocar en un porta objetos perfectamente limpio y tibio una gota de 3 a 4 mm de semen diluido y colocando una laminilla encima.

Igualmente, la motilidad progresiva, debe ser observada en un aumento de 200 x - 500 x, preferentemente bajo contraste de fase, y los resultados se expresan en porcentaje o en una escala de 1 a 5. La clasificación se muestra bajo parámetros que se muestran en la (Tabla 2.)

Debe evaluarse colocando sobre el portaobjetos una gota de semen diluido con suero fisiológico o citrato de sodio. Luego se coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio con mayor aumento. De acuerdo al movimiento individual, el semen se clasifica de la siguiente manera: 

Semen muy bueno: igual o mayor de 70% de motilidad individual. 

Semen bueno: 50-69% de motilidad individual. 

Semen regular: 30-49% de motilidad individual. 

Semen malo: menor de 29% de motilidad individual. 

Morfología: se determina mediante la observación al microscopio de un frotis de semen coloreado con tinciones especiales; generalmente, se utiliza la tinta china. Las anormalidades observadas se clasifican en primarias y secundarias. Para las primeras se aceptan un valor entre 2 a 5% y para las segundas un

valor de 10 a 14% 

La morfología espermática es un factor determinante en la capacidad de fertilización del semen, ya que existe una correlación entre defectos espermáticos e infertilidad.

Los espermatozoides son traslucidos y virtualmente invisibles al microscopio de luz directa. Se requiere el uso de colorantes que provean de un fondo oscuro para visualizarlos.

Lo más recomendable es la técnica en un solo paso, (en donde se mezcla el colorante con el espermatozoide sobre el porta objetos), porque todo lo que se encuentra en el semen puede ser observado, Alguna de estas funciones son cosa de bengala, tinta china, la tinción de eosina - nigrosina o llamada vital. (Vivos - muertos).

Página 14

La coloración vital (eosina, azul de anilina, o eosina - nigrosina) es la más comúnmente usada en la examinación morfológica de esperma, el azul de anilina y nigrosina proveen un fondo oscuro, sobre el cual resaltan los espermatozoides, la eosina por su pare tiñe las células, penetrando la membrana de las células dañadas, tiñendo las lesiones y espermatozoides no viables o muertas de rosa.

Para la preparación del extendido se coloca una gota de 5 - 6 mm de diámetro de tinción eosina nigrosina en un extremo de porta objetos tibio, y seguido se coloca una gotica de semen de 3 a 5 mm de diámetro cerca de la tintura, luego de haber mezclado la tintura con el semen, y dejar actuar un minuto, la mezcla es extendida de un lado hasta el otro con otro portaobjetos tibio, formando una película delgada en la cual después de seca se puede hacer la evaluación con un objeto de inmersión de aceite a 1000 - 1250 aumentos.

Aumentos menores no revelan la mayoría de los defectos que existen. Cuando hay pocas anormalidades es suficiente contar 100 espermatozoides y cuando encontramos gran cantidad de anormalidades es recomendado contar 300 o más.

Concentración: el número de espermatozoides por mm3 se determina diluyendo 0,1 cc de semen en 7.9 cc de citrato de sodio. Luego con la ayuda de un aparato denominado Spectronic, se obtiene una lectura que se compara con una tabla para obtener la concentración de espermatozoides. Generalmente, la concentración varía de 1000000 a 1200000 espermatozoides/mm3

Para la determinación se usan métodos tales como: cámara de Newbauer, la nefelometría, la espermio-densi-metría y la espectofotometría. Figura 8.

Cámara de Newbauer utilizada para determinar el número de espermatozoide por ml.

El recuento se realiza con cámara de Newbauer contando las cabezas de los espermatozoides (EPZ) y observados en 5 cuadros tomados en diagonal, del cuadro central grande y se aplica la siguiente fórmula:

 EPZ/ml = n x 200 x 10 x 5000

Donde,

n = Numero de células contadas200 = Factor de dilución en la pipeta10 = Por ser la altura de la cámara de 0.15 000 = Cuadros pequeños contados en mm3

Página 15

V. PROCESAMIENTO DEL SEMEN 

Los propósitos del procesamiento del semen son los siguientes: aumentar el volumen del eyaculado para inseminar mayor número posible de hembras. Proteger los espermatozoides para mantenerlos fértiles el mayor tiempo posible.

El procesamiento del semen comprende las siguientes fases: Dilución: para diluir el semen se utilizan diferentes dilutores, entre los más conocidos tenemos citrato-yema, fosfato-yema y dilutores a base de leche. A estos dilutores se les agrega antibióticos, con el propósito de frenar el desarrollo de gérmenes que pudieran estar presentes en el eyaculado. 

Para el procesamiento del semen se utiliza el dilutor a base de citrato-yema, en la siguiente proporción: 

Citrato de sodio 74 partes Yema de huevo 25 partes Glucosa 1 parte Penicilina 1000 UI/cc Estreptomicina 500 mg/cc

Diluyentes Utilizados para la Congelación del Semen Bovino

Un diluyente seminal debe reunir una serie de propiedades básicas relacionadas con su pH, capacidad tampón, osmolaridad, y fuerza iónica.

Además debe aportar una fuente de energía, no debe deteriorarse durante el almacenamiento previo a su uso, debe proteger a los espermatozoides durante el enfriamiento, congelación y descongelación, y finalmente, debe ser resistente al crecimiento bacteriano.

Ningún diluyente cumple todos estos requisitos, y además, cada especie requiere unas condiciones específicas.

No obstante, los diluyentes utilizados para la congelación del semen de la mayoría de las especies domésticas, invariablemente incluyen los siguientes ingredientes:

Página 16

1. agua bidestilada o ultrapura, como disolvente para el resto de los componentes.

2. sustancias iónicas y no iónicas para mantener la osmolaridad y amortiguar el pH del medio.

3. materiales orgánicos, generalmente yema de huevo o leche, con capacidad para prevenir o atenuar el shock por frío

4. agentes crioprotectores, normalmente el glicerol

5. azúcares simples como fuente de energía, o di- y trisacáridos como crioprotectores adicionales.

6. antibióticos para controlar el crecimiento bacteriano (Salisbury y col., 1978).

7. y opcionalmente, otros aditivos, como enzimas, detergentes o aminoácidos que puedan mejorar la fertilidad

CONSERVACIÒN A TIEMPO CORTO

• Conservación a mas de 4º o 5º C (4 a 5 días)

• Conservación a temperatura ambiente (20º C) por 2 o 3 semanas (agua de coco)

CONSERVACIÓN A TIEMPO LARGO.

• Congelación en nitrógeno liquido (Congelación en nitrógeno liquido (-196 ºC)

El grado de dilución del semen depende de la concentración espermática y de la técnica de conservación. 

Conservación a 5°C: cuando el semen se va a mantener a temperatura de 5oC, el grado de dilución que se realiza es menor, en comparación con la técnica de la congelación. Bajo estas condiciones el semen conserva su poder fecundante por un periodo de cuatro a cinco días. 

Conservación mediante congelación: el grado de dilución que se realiza es mayor que el anterior y una vez congelado en nitrógeno líquido, el semen se conserva por un tiempo indefinido. Proceso de congelación en nitrógeno líquido Una vez determinada la concentración espermática se procede a determinar la cantidad de dilutar que se puede agregar al semen, en base a la siguiente fórmula

Página 17

N° de pajuelas = V x Ml x C(ml)

N° de espermetazoide/pajuelas

Donde: 

 V = volumen del semen en mL MI = motilidad individual en porcentaje  C = concentración espermática expresada en ml 

Después de determinar el número de pajuelas se procede a calcular el volumen del dilutor de la siguiente manera: 

Volumen dilutor = NP x 0,5 - V

Donde: 

NP = número de pajuelas 0,5 = corresponde al volumen de las pajuelas medianas V = volumen del semen en ml

El dilutor a base de citrato-yema, se divide en dos fracciones: la fracción A que no contiene glicerol y la fracción B a la cual se le agrega glicerol en la proporción del 14%. 

Seguido de la recolección del semen y después de calcular el volumen del dilutor, se agrega la fracción A para conservarlo. El semen diluido en la fracción A, se lleva hasta una temperatura de 5oC. Una vez que alcanza esta temperatura se le agrega la fracción B. 

Luego de agregar la fracción B es necesario esperar un período de tiempo de tres a seis horas, que se llama período de estabilización, antes de empezar a congelar. Con el propósito de ganar tiempo, antes del período de estabilización, se procede al llenado y sellado de las pajuelas.

Página 18

El llenado se efectúa corrientemente utilizando una bomba de vacío y el sellado de la pajuela se realiza con el polvo sellador a base de polietileno.

Después del llenado y sellado de las pajuelas y una vez que se ha alcanzado el período de estabilización se procede a la congelación en nitrógeno líquido. Primeramente se colocan las pajuelas en un termo con vapores de nitrógeno hasta alcanzar la temperatura de 120°C en 10 minutos. Este proceso se llama precongelación.

Inmediatamente las pajuelas se introducen directamente en el nitrógeno líquido para alcanzar una temperatura de 196°c, este proceso recibe el nombre de congelación.

Página 19

VI. AGENTES CRIOPROTECTORES Y EFECTOS DE LA CONGELACIÓN SOBRE LAS CÉLULAS ESPERMÁTICAS

Eventos que ocurren durante la Congelación y Descongelación

En el proceso de criopreservación espermática, cuando la temperatura desciende por debajo del punto de congelación del medio extracelular, comienza la formación de hielo.

El agua pura cristaliza dejando a los solutos en mayor concentración en el agua que permanece en estado líquido. Las membranas celulares impiden la extensión de los cristales de hielo hacia el interior de la célula y por lo tanto el contenido intracelular se encuentra superenfriado, permaneciendo líquido por debajo del punto de congelación, con lo cual se establece una diferencia en el potencial químico del agua intra y extracelular, creándose una tendencia a que el agua salga de la célula a favor del gradiente osmótico.

A partir de este momento pueden ocurrir dos cosas: si la velocidad de enfriamiento es lo suficientemente lenta, el agua sale de la célula y ésta se deshidrata progresivamente.

Pero si la velocidad de enfriamiento es demasiado alta, el agua no puede moverse de la célula lo suficientemente rápido y hay un incremento en el grado de superenfriamiento hasta que ocurre la congelación intracelular para restaurar el equilibrio.

La velocidad de enfriamiento óptima varía considerablemente entre tipos celulares desde menos de 1ºC/min para embriones, hasta 2000-3000ºC/min para glóbulos rojos.

El óptimo puede ser alterado por la presencia de agentes crioprotectores, y además, la mayoría de los tipos celulares no sobreviven a la congelación en ausencia de algún crioprotector. Para las células espermáticas, la tasa óptima de enfriamiento oscila entre 10-100ºC/min. Velocidades más rápidas o más lentas resultarán en menor supervivencia

Causas de Muerte Celular por Congelación

A velocidades de enfriamiento superiores a la óptima, la formación de cristales de hielo intracelulares es el factor letal, mientras que a velocidades más bajas que la óptima, los “efectos solución” son los responsables de la pérdida de viabilidad.

Página 20

No hay discusión en cuanto a la idea de que la muerte celular está asociada con la presencia de gran cantidad de cristales de hielo intracelulares, pero algunos estudios han demostrado que pequeñas cantidades de hielo intracelular, no necesariamente son incompatibles con la supervivencia.

La cantidad de hielo intracelular y el tamaño de los cristales son lo que determina la supervivencia. Las células congeladas rápidamente (conteniendo cristales de hielo intracelulares), sobrevivirán sólo si son descongeladas rápidamente. El recalentamiento lento da tiempo para la recristalización, proceso de crecimiento de los cristales durante la descongelación, que es perjudicial.

VII. DESCONGELACIÓN

Página 21

Para alcanzar una óptima supervivencia espermática se requiere que la velocidad de descongelación sea acorde con la velocidad de congelación. Sin embargo, varios estudios llevados a cabo con semen bovino obtuvieron resultados que ponen en entredicho esta teoría. La velocidad de congelación no afectaba a la motilidad o a la integridad acrosómica postdescongelación.

Siempre que el semen se descongelase rápidamente. Observaron que si la congelación del semen era lenta la supervivencia espermática era peor, independientemente de la velocidad de descongelación.

Existen gran variedad de estudios en los que se evaluaron diferentes velocidades de descongelación para el semen bovino.

En general, la mayoría de los trabajos publicados concluyeron que si la velocidad de descongelación es rápida se obtiene un mayor porcentaje de espermatozoides móviles y mayor integridad acrosómica.

En ausencia de especificaciones concretas para la descongelación del semen bovino, independientemente del tipo de diluyente utilizado y de la velocidad de congelación empleada, actualmente se recomienda descongelar las pajuelas a 33-35ºC durante 30-40 segundos.

Sin embargo, algunos estudios demostraron que la descongelación en un baño de agua a 75ºC durante 6,5 segundos permitía obtener mejores porcentajes de motilidad y de integridad acrosómica postdescongelación

Encontraron que descongelando a 36ºC-45ºC obtenían mayores porcentajes de integridad acrosómica.

VIII. RECOMENDACIONES:

Página 22

Los toros son sensibles a cambios espermáticos, por lo cual se deben hacer evaluaciones de la calidad seminal antes de ser establecidos en un programa de servicio a campo.

Se debe establecer programas de alimentación y suplementación que permita obtener una condición corporal de 3.5 - 4.0 y cumplir con sus necesidades de minerales (Zn, Cu, Mg, I, P, Se), vitaminas A y E, fundamentales para un buen proceso espermatogénico.

Se deben establecer en los programas ganaderos, chequeos periódicos que permitan diagnosticar y tratar procesos inflamatorios, realizar tratamientos de heridas y evaluar libido y capacidad de monta.

En los programas de reposición de toros, se recomienda para minimizar el efecto de la reubicación sobre la subsecuente fertilidad: Comprar los toros lo más cerca posible; Traer toros desde grandes distancias solo si las condiciones son las mejores. (Esto significa la estación seca temprana, cuando las pasturas son buenas y la actividad de los virus está declinando).

Introducir los toros gradualmente a su nuevo ambiente alimentándolos sobre poca superficie, liberándoles luego a pequeños potreros bajo constante supervisión; Comprar toros de un año, para que tengan tiempo de adaptarse al ambiente antes de la madurez.

Precauciones para mantener una fertilidad del semen pos semen pos-congelación:

El proceso de enfriamiento debe hacerse lentamente para reducir la muerte celular. Se utiliza glicerina que protege durante la congelación y descongelación en el proceso de descongelación mueren del 20 al 50% de los espermatozoides.

Antes de la dilución el eyaculado debe tener mínimo el 70% de los espermatozoides vivos. Después de la congelación los buenos eyaculados contienen del 50 a 65% de los espermatozoides vivos, sin embargo un semen con el 30% de células vivas después de la congelación tienen capacidad suficiente de fertilizar.

IX. ANEXOS:

Página 23

Fig. 1. Partes de la vagina artificial

Tabla 1. Escala basada en el porcentaje de células móviles 

Tabla 2. Escala basada en el porcentaje de células móviles

Página 24

Figura 2. Recuento de espermatozoides utilizando la cámara de Neubauer.

Fig. 3 Planillas de evaluación de la calidad seminal

Página 25

X. RESUMEN:

Factores que afectan la calidad seminal

La temperatura: Es uno de los factores ambientales más importantes que modifican la espermatogenesis. La temperatura corporal puede verse afectada por periodos de temperatura ambiental alta al igual que extremadamente bajas o por cuadros de pirexia ocasionado por enfermedades y/o heridas.

El estrés: Aún cuando se tienen diferentes interpretaciones de estrés lo define como aquel estado generado por toda situación interna o externa que perturbe el equilibrio físico y aún social del animal, creando tensión y tendiendo a colocar los mecanismos de defensas del mismo en un estado de alerta y actividad que le permitan responder ante situaciones adversas.

Colección de semen: Existen diferentes métodos para la recolección de semen en los bovinos, entre los cuales tenemos:

1) La vagina artificial.2) Electro eyaculación.3) Masajes de las glándulas genitales accesorias.

Recolección de Semen: Por una válvula ubicada en la vagina artificial se introduce agua a una temperatura de 50 a 60 grados centígrados, hasta llenar los dos tercios de su capacidad total 

En el momento de recoger el semen, la temperatura óptima en el interior de la vagina debe ser de 38 a 39°C. Sin embargo, existen toros que exigen una mayor temperatura para eyacular. 

Página 26

XI. CONCLUSIONES:

Este trabajo permitió observar como la calidad seminal de un toro puede cambiar bastante y rápidamente, dependiendo de si el toro está pasando o recuperándose de un proceso que afecte la espermatogenesis o la espermiogenesis. Al se comprueba importancia de evaluar la calidad seminal antes de ingresar los toros al servicio o para que se eliminen del mismo.

Analizar el semen a través de las pruebas de laboratorio es muy importante ya que permite evaluar alteraciones de su calidad luego de los procesos de congelación y descongelación.

Los toros de alta fertilidad pueden compensar a los de baja fertilidad. Sin embargo, a medida que los sistemas de producción se intensifican y se utilizan períodos de servicio cortos, con bajas relaciones toro vaca, la inclusión del análisis de semen en la evaluación del reproductor puede significar una medida acertada.

La transferencia de semen entre termos de nitrógeno durante un lapso prolongado (más de 10 segundos) o el almacenamiento en termos con bajos niveles de nitrógeno líquido, puede alterar la viabilidad del mismo.

Los resultados obtenidos permiten conocer si el semen evaluado cumple con las condiciones mínimas para ser utilizado en Inseminación Artificial.

Página 27

La evaluación microbiológica y el aislamiento de virus en semen permiten determinar la presencia de patógenos específicos o gérmenes de contaminación.

Valores mínimos aceptados para un semen post-descongelación:

a) 25% de células mótiles a velocidad 3.

b) 50% de acrosomas intactos.

c) 70% de espermatozoides normales.

d) 10 millones de células mótiles x dosis de semen descongelado.

e) Sin desarrollo de bacterias patógenas específicas y hasta 500 VFC por ml. de bacteria banales.

f) Sin aislamiento viral.

Página 28

XII. BIBLIOGRAFÍA:

1. Olivares R., Argentina, 1985, inia, COLECCIÓN, EVOLUCIÓN  Y PROCESAMIENTO DEL SEMEN DE TOROS

(15/setiembre/2013 – 6:00 PM)

http://sian.inia.gob.ve/repositorio/revistas_tec/FonaiapDivulga/fd17/texto/coleccion.htm

2. Molina M., Colombia, 1998, books, evaluación del semen bovino

(10/setiembre/2013 – 7:00 PM)

http://books.google.com.pe/books?id=97rPdZOFzdgC&pg=PA8&lpg=PA8&dq=evaluacion+del+semen+del+toro&source=bl&ots=IIUkw1f8a0&sig=IUM6RMlkdjv0DMmIF0

3. Hidalgo C., Argentina, 2001, serida, ANALISIS DEL SEMEN BOVINO

(20/setiembre/2013 – 9:00 PM)

http://www.serida.org/pdfs/1495.pdf

4. Catena M., Argentina, 1999, producción, EVALUACIÓN DE SEMEN BOVINO CONGELADO

(22/setiembre/2013 – 9:00 PM)

http://www.produccion- animal.com.ar/informacion_tecnica/inseminacion_artificial/05-evaluacion_de_semen_bovino_congelado.pdf

5. Mihura H., Argentina, 2010, vetunicen, EVALUACIÓN DE SEMEN FRESCO

(15/setiembre/2013 – 7:00 PM)

http://www.vet.unicen.edu.ar/html/sitio%20EdCont/entornovirtual/Ano%20I/2013/7%C2%BA%20jornada/4-%20Evaluacion%20de%20semen%20fresco.%20Cabodevila,%20Callejas,%20Catalano-20%20copias.pdf

Página 29

6. Cione J., Irán, 2013, lab9dejulio, EVALUACIÓN DEL SEMEN CONGELADO

(9/setiembre/2013 – 1:00 PM)

http://www.lab9dejulio.com.ar/informacion-tecnica/evaluacion-del-semen-congelado_a253

7. Hansec G., Argentina, 2010, argentinalivestolk, FACTORES QUEINFLUYEN EN LA CONGELACIÓN DEL SEMEN

(10/setiembre/2013 – 5:00 PM)

http://www.argentinalivestock.com.ar/factores-que-influyen-en-la-congelacion-del-semen-de-toros

8. Ortiz A., Peru, 2011, buenastareas, EVALUACIÓN DE SEMEN – EVALUACIÓN DE SEMEN CONGELADO DE TORO

(8/setiembre/2013 – 7:00 PM)

http://www.buenastareas.com/ensayos/Evaluaci%C3%B3n-De-Semen-Evaluaci%C3%B3n-De/4177430.htm

9. Escobar C., España, 2009, docentes, Técnicas de congelación y sexado del semen bovino y su importancia en reproducción bovina(30/setiembre/2013 – 4:00 PM)

http://www.docentes.unal.edu.co/cjimeneze/docs/8209.pdf

10. Nebel R., Mexico, 2010, select, SEMEN CONGELADO MANEJO

(29/setiembre/2013 – 7:00 PM)

http://www.selectsires.com/dairy/SpanResources/handling_frozen_spanish.pdf

Página 30