LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIAPENENTUAN AKTIVITAS ENZIM AMILASE DARAHBLOK DIGESTIVE

Kelompok 14Asisten :

Eka Wijaya Warmandana

G1A010112

Anggota :

Mutia Milidiah

G1A011003

Irma Nuraeni HidayatG1A011005

Isnila F Kelilauw

G1A011007

Lannida

G1A011008

Desvia Ira Restiana

G1A011012

Halimah ChairunnisaG1A011013

Stefanus Ariyanto WG1A011015

Rizak Tiara Yusan

G1A011016

Wedha Jati Tyas U

G1A007092

Arya Yunan PermaidiG1A009113

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU ILMU KESEHATAN

JURUSAN KEDOKTERAN2013LEMBAR PENGESAHAN

Kelompok 14Anggota :

Mutia Milidiah

G1A011003

Irma Nuraeni HidayatG1A011005

Isnila F Kelilauw

G1A011007

Lannida

G1A011008

Desvia Ira Restiana

G1A011012

Halimah ChairunnisaG1A011013

Stefanus Ariyanto WG1A011015

Rizak Tiara Yusan

G1A011016

Wedha Jati Tyas U

G1A007092

Arya Yunan PermaidiG1A009113Disusun untuk persyaratan nilai praktikum Biokimia

pada Jurusan Kedokteran

Universitas Jenderal Soedirman

Purwokerto

Diterima dan disahkan

Purwokerto, Mei 2013Asisten

Eka Wijaya Warmandana G1A010112I. PENDAHULUAN

A. Judul Praktikum

Penentuan Aktivitas Enzim Amilase Darah

B. Tanggal Praktikum

Kamis, 24 Juni 2010

C. Tujuan Praktikum

1. Mengukur kadar enzim amilase dalam darah.

2. Menjelaskan nilai normal enzim amilase dalam darah serta nilai patologis dari hasil praktikum.

3. Melakukan diagnosa dini penyakit apa saja yang ditandai oleh hasil aktivitas abnormal (patologis) melalui bantuan hasil praktikum yang dilakukan.II. TINJAUAN PUSTAKAA. Pengertian dan struktur amilase

Amilase adalah enzim yang mengaktalisis peristiwa hidrolisis zat tepung menjadi molekul yang lebih kecil. -Amilase dapat ditemukan pada hewan dan meliputi amilase liur dan amilase pankreas. -Amilase ditemukan pada tumbuhan tingkat tinggi (Dorland, 1998). -Amilase adalah enzim yang mengkatalisis internal hidrolisis -1,4-glikosida dalam pati pada produk dengan berat molekul rendah, seperti glukosa, maltosa, dan unit maltotriose (Souza, 2010). Amilase adalah suatu enzim pencernaan yang dalam keadaan normal bekerja ekstrasel untuk memecah kanji menjadi kelompok karbohidrat yang lebih kecil dan akhirnya menjadi monosakarida. Organ utama amialse adalah kelenjar liur dan pankreas. Amilase saliva dalam keadaan normal masuk ke mulut oleh sekresi melalui doktus salivarius (Sacher, 2004).

-Amilase dapat ditemukan pada mikroorganisme, tanaman, dan organisme tingkat tinggi. Merupakan famili dari endo-amilase yang dapat mengatalisis inisial hidrolisis dari pati menjadi oligosakarida melalui pembelaan ikatan -D-(1-4) glikosida. Residu terminal atau ikatan -1,6 dapat dipecah oleh -amilase. Produk akhir dari aktifitas -amilase adalah oligosakarida dengan berbagai ukuran panjang disertai dextrin (Souza, 2010).

Amilase memiliki struktur tiga dimensi yang mampu mengikat substrat dan, dengan aktifitas yang lebih spesifis mengkatalisis ikatan, serta mencetuskan pemecahan ikatan glikosida. -amilase pada manusia adalah enzim yang mengandung kalsium yang teridri atas 512 asam amino dengan ikatan oligosakarida tunggal, berat molekuk 57,6 kDa. Proteinnya mengandung 3domain, yaitu A, B dan C. Domain A adalah yang terbesar, berbentk seperti barel atau tong. Domain B berada di antara domain A dan C, dan melekat pada domain A dengan ikatan disulfida. Domain C memiliki bentuk sheet yang berikatan dengan domain A dengan ikatan polipeptida rantai tunggal, dan merupakan domain independen yang fungsinya belum diketahui. Sisi aktif (substrat-binding) -amilase berada di dalam lengkung panjang antara akhir karboksil dari domain A dan B. Kalsium berada di antara domain A dan B dan berperan dalam menstabilkan struktur tiga dimensi dan sebagai aktivator allosterik (Souza, 2010).

B. Ciri-ciri dan faktor yang mempengaruhi kerja amilase

Karakteristik amilase diantaranya yaitu:

a. Kinerja dipengaruhi suhu

Temperatur optimum kinerja enzim amilase yaitu 30oC (Dutta, 2006). Temperatur optimum bagi aktivitas amilase yaitu 60oC pada interval waktu 10 menit (Amutha, 2011).

b. Kinerja dipengaruhi oleh pH

PH optimum enzim ini yaitu 6,0. Amilase mempertahankan 50% aktivitasnya pada pH antara 4,6 dan 6,8. Lebih dari 50% aktivitas sisa enzim ini diperoleh pada suhu antara 4,7 dan 9,0. Enzim ini tidak stabil pada pH kurang dari 3, dan lebih dari 10,0 (Dutta, 2006).

c. Toleransi terhadap garam

Amilase stabil pada larutan NaCl dan mencapai 80% dan 50% aktivitasnya pada larutan NaCl dengan konsenrasi 2M dan 5M, setelah inkubasi 2 jam pada suhu 4oC. sementara pada inkubasi selama 24 jam dengan suhu yang sama, amilase yang berada pada larutan NaCl 2M dan 5M hanya mencapai 60% dan kurang dari 10% aktivitas aslinya (Dutta, 2006).

d. Dipengaruhi oleh ion metal

Ion metal seperti Hg2+ dan Li2+ akan menghambat aktivitas amilase, sementara Cu2+, Mg2+, dan Pb2+ menurunkan aktivitas sebesar 5%. Namun ion metal seperti Fe2+, Ba2+, Co2+, Ag2+, dan Mn2+ justru meningkatkan aktivitas amilase hingga 130%-200%, sedangkan K+ dan Sn2+ menyebabkan peningkatan yang tidak berarti (Dutta, 2006).

C. Jenis-jenis amilase

Tipe amilase yang dihasilkan di dalam tubuh manusia ada 2, diantaranya P-type amilase dari pankreas dan S-type amilase dari glandula salivarius. (Abraham, 2009)

S-type amilase yang disekresikan oleh glandula salivarius yang diantaranya kelenjar mayor sublingual, kelenjar submandibula, dan kelenjar parotis yang terletak di rongga mulut dan menyalurkan air liur melalui duktus-duktus pendek ke dalam mulut. Selain itu, terdapat kelenjar liur minor yang diantaranya kelenjar bukal di lapisan mukosa pipi (Sherwood, 2001).

Ada 2 jenis isoenzim amilase, tipe P dan S. Peningkatan tipe P sering terjadi pada pankreatitis akut. Peningkatan tipe S dapat disebabkan oleh tumor ovarium dan tumor bronkogenik. Kadar amilase urin berguna dalam menentukan nilai normal atau meningkatnya amilase serum, terutama bila klien mempunyai gejala-gejala pankreatitis. Amilase urin dapat bertahan selama lebih dari 2 minggu setelah pankreatitis akut ( Sacher, 2004).

Amilase termasuk enzim kelas hidrolase yang mempunyai 2 jenis di alam, yakni -amilase dan -amilase. -amilase biasanya terdapat pada tumbuh-tumbuhan tingkat tinggi, sedangkan - amilase ditemukan pada bakteri dan getah-getah cairan yang dihasilkan oleh manusia (saliva, darah, urin). -amilase adalah enzim utama dalam pencernaan karbohidrat. Dengan bekerja pada lokasi rantai yang acak, -amilase dapat memotong rantai panjang karbohidrat, terutama hasil maltotriosa dan maltosa dari amilosa, atau maltosa, glukosa, dan dekstrin terbatas dari amilopektin (K.S. Prashanth, 2008).

D. Proses kerja amilase darah

Amilase (-amylase) terdapat di saliva yang diproduksi olek kelenjar saliva dan juga disekresi oleh pankreas. Amilase berfungsi untuk memecah karbohidrat polimer menjadi oligosakarida. Amilase bekerja dengan cara menghidrolisis ikatan glikosidat 1(4 pada karbohidrat polimer seperti amilum dan glikogen. Hidrolisis ini akan melepaskan maltosa, maltotriosa, dan campuran oligosakarida lain. Oligasakarida tersebut kemudian akan dihidrolisis oleh glikosidase yang terdapat di permukaan epitel usus menjadi glukosa dan galaktosa. Selanjutnya, glukosa dan galaktosa selalunjutnya akan diserap oleh enterosit melalui meluli transport aktif sekeunder dengan Na+ sebagai kotransport dan juga melalui transport pasif di usus (Koolman, 2005).

Amilase juga dapat dilepasakan ke dalam sirkulasi sebagai hasil kerusakan pada jaringan yang berisi kadar amylase yang tinggi atau lolos dari traktus gastrointestinalis. Peningkatan kadar amylase serum ini biasanya terlihat pada pancreatitis, kolesistitis, dan inflamasi pada glandula saliva serta trauma limpa dan traktus gastrointestinal (Kumar et al, 2012).III. ALAT, BAHAN DAN CARA KERJA

A. Alat Dan BahanAlat1. Spuit 3cc

2. Torniquet 1 buah

3. Tabung Reaksi

4. Rak Tabung reaksi 1 buah

5. Mikropipet 10-100 l 1 buah

6. Mikropipet 100-1000 l 1 buah

7. Blue tip 1 buah

8. Yellow tip 1 buah

9. Kuvet 1 buah

10. Spektrofotometer

11. Sentrifugator

Bahan

1. Working reagen 1 cc

2. Serum Darah 20 l

3. Alkohol 70%

B. Cara Kerja

1. Persiapan sampel:

a. Darah diambil menggunakan spuit kira-kira sebanyak 3cc.

b. Darah dimasukkan ke dalam tabung yang sudah dicampur dengan EDTA dan disentrifuge dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit, kemudian diambil serumnya untuk sampel.

2. 1 cc working reagen dimasukan ke dalam kuvet.

3. Dimasukkan 20 l serum kedalam kuvet hingga tercampur.

4. Kadar enzim amylase dibaca dengan spektrofotometer.

C. Nilai Normal

Kadar normal amylase darah =< 100 U/LIV. HASIL DAN PEMBAHASANA. Hasil

Probandus

: Isnila F KelilauwJenis kelamin

: PerempuanUmur

: 20 tahun

Hasil Pemeriksaan: Kadar amilase darah 2173 U/L

B. PembahasanPada praktikum kali ini, didapatkan bahwa enzim amylase darah meningkat cukup tinggi. Hal ini mengindikasikan bahwa penghasil enzim amylase darah, pancreas dalam keadaan melebihi batas normal. Karena apabila terjadi kenaikan, maka akan dikhawatirkan terjadi adanya hipersekresi enzim-enzim yang ada pada pancreas. Namun pada probandus sendiri tidak tampak riwayat gejala gejala sebagai manifestasi peningkatan serum amilase seperti pankreatitis. Jadi kemungkinan terdapat kesalahan teknis maupun prosedural dalam pemeriksaan.

Pankreas merupakan kelenjar memanjang yang terletak di belakang dan di bawah lambung, di atas lengkung pertama duodenum. Pankreas merupakan kelenjar campuran yang mengandung bagian eksokrin dan endokrin. Bagian endokrin yang lebih kecil terdiri dari pulau-pulau jaringan endokrin terisolasi, pulau-pulau Langerhans yang tersebar di seluruh pankreas. Hormon terpenting yang disekresikan oleh sel-sel pulau Langerhans adalah insulin dan glukagon. Bagian eksokrin yang predominan terdiri dari kelompok-kelompok sel sekretorik seperti anggur yang membentuk kantung-kantung atau asinus yang berhubungn dengan duktus yang akhirnya bermuara ke duodenum. Pankreas eksokrin mengeluarkan getah pankreas yang terdiri dari dua komponen yaitu sekresi enzimatik poten dan sekresi alkali encer yang kaya akan natrium bikarbonat (NaHCO3). Enzim-enzim pankreas secara aktif disekresi oleh sel asinus. Komponen NaHCO3 encer di sekresikan secara aktif oleh duktus yang melapisi bagian awal duktus pankreatikus dan kemudian mengalami modifikasi sewaktu melewati duktus. Enzim yang disekresi pankreas adalah enzim-enzim proteolitik, amilase pankreas, dan lipase pankreas. Seperti amilase liur, amilase pankreas berperan penting dalam pencernaan karbohidrat dengan mengubah polisakarida menjadi disakarida. Amilase disekresikan melalui getah pankreas dalam bentuk aktif karena amilase tidak membahayakan sel-sel sekretorik (Sherwood, 2011).Amilase merupakan enzim digesti yang secara normal bekerja secara ekstraseluler untuk memecah pati menjadi kelompok karbohidrat sederhana dan pada akhirnya monosakarida dengan hidrolisis ikatan internal alpha-1,4-glikosida yang mana akan menghasilkan maltosa and oligosakarida. Berdasarkan hasil elektroforesisnya serum amilase terdiri dari P-type amilase dan S-type amilase. P-type berasal dari pankreas dan S-type dari saliva (Cinat M et al, 2009).

Amilase merupakan suatu enzim yang menguraikan polisakarida menjadi maltosa. Enzim ini dihasilkan oleh glandula saliva yang ada di mulut yaitu amilase saliva dan pankreas sendiri yaitu amilase pankreas. Amilase pankreas disekresikan dalam bentuk aktif (Sherwood, 2011).

Amilase menyederhanakan pati dan glikogen. Bekerja dengan memecah molekul pati yang dimiliki getah pankreas terjadi akibat enzim -amilase pankreas. Kerja enzim ini serupa dengan kerja enzim amilase liur, menghidrolisis pati dan glikogen menjadi maltosa, maltotriosa (tiga residu -glukosa yang dihubungkan melalui ikatan ) dan campuran senyawa oligosakarida tak bercabang, serta beberapa glukosa (Murray, 2003).

Hipersekresi enzim pada pancreas akan mengakibatkan enzim-enzim yang ada pada saluran pencernaan akan terserap lebih ke dalam aliran darah dan menyebabkan terdeteksinya enzim ini dalam keadaan yang tinggi.

Banyak kondisi yang dikaitkan dengan terjadinya hyperamilasemia. Walaupun hiperamilasemia secara umum diasumsikan karena pelepasa amilase ke dalam serum oleh organ yang terganggu, hubungan yang jelas antara hiperamilasemia kondisi pengaruhnya belum jelas. Hiperamilasemia biasanya merupakan hasil dari (Cinat M et al, 2009). :

1. Pankreatitis orparotitis2. Penurunan metabolisme pembersihan amilase di hepar

3. Pelepasan amilase dari organ terkaitPemeriksaan enzim amilase salah satu marker dari pankreatitis, karena apabila terjadi hipersekresi pankreas, dikhawatirkan sedang terjadi pancreatitis akut. Hal ini sangat penting, karena pada pankreatits akut, enzim-enzim yang dikeluarkan oleh pancreas menjadi banyak dan ditakutkan akan terjadi autodigesti pada organ tubuh yang lainnya. Oleh karena itu pada pancreatitis akut merupakan salah satu penyakit akut abdomen.

Hal yang dapat mempengaruhi terjadinya kerancuan dari praktikum ini adalah kesalahan inkubasi, karena jika inkubasi kurang sempurna, maka working reagen yang dipakai juga kurang berfungsi secara maksimal. Selain itu juga dari faktor pengambilan cairan plasma yang kurang akan membuat pembacaan hasil pada spektrofotometri akan menjadi rendah palsu. Selain itu, dari faktor spektrofotometri , pada pembacaan, idealnya dilakukan pencucian ulang, hal ini bisa menjadikan hasil menjadi tinggi palsu, karena pada spektrofotometri bisa saja masih tertinggal sisa dari cairan yang diuji sebelumnya dengan blanko yang sama.

Oleh karena itu, walaupun hasilnya meningkat sangat tinggi, tetap perlu adanya pemeriksaan ulang dengan lebih teliti menghindari faktor pembias hasil, karena pemeriksaan penting, mengingat aplikasi klinis dari pemeriksaan ini merupakan penyakit gawat darurat pankreatits akut. C. Aplikasi Klinis1. Kanker Pankreas

Tumor pankreas berasal dari jaringan eksokrin dan jaringan endokrin pankreas, serta jaringan penyangganya. Pada umumnya, tumor eksokrin pankreas berasal dari sel duktus dan sel asiner (Padmomartono, 2007).

Kanker pankreas banyak menyerang usia yang lebih tua dari pada usia muda. Penyebab kanker pankreas masih belum jelas. Beberapa faktor lingkungan dilibatkan sebagai faktor penyebab kanker pankreas terutama penggunaan rokok. Faktor risiko kanker pankreas akibat rokok meningkat 2,5-3,6% tetapi pekokok pasif lebih berisiko daripada perokok aktif (Hidalgo, 2010).

Gejala yang timbul akibat kanker pancreas tergantung dari lokasi tumor sampai ke kelenjar sesuai dengan stadiu penyakit. Mayoritas tumor berkembang di daerah caput pancreas dan dapat menyebabkan kolestasis. Ketidaknyaman di abdomen dan nausea sering dirasakan. Tumor pancreas mungkin juga dapat menyebabkan obsturksi pada duodenal atau perdarahan gastrointestinal. Kanker pancreas sering menyebabkan nyeri tumpul yang dalam pada bagian atas abdomen yang lebar yang menandakan lokasi dari tumor (Hidalgo, 2010).

Kelainan laboratorium pada pasien kanker pancreas biasanya tidak spesifik. Pada pasien kanker pancreas terdapat kenaikan serum lipase, amylase dan glukosa. Anemia dan hipoalbuminemia yang timbul sering disebabkan karena penyakit kankernya dan nutrisi yang kurang (Padmomartono, 2007).

2. Pankreatitis Akut

Merupakan reaksi peradangan pankreas, secara klinis ditandai nyeri perut akut dengan kenaikan enzim amilase dalam darah dan urin. Perjalanan penyakit dari ringan self limited sampai berat yang disertai renjatan gangguan ginjal dan paru-paru yang bisa berakibat fatal. Ditandai gagal organ dengan adanya renjatan, insufisiensi paru (PaO 60 mmHg), gangguan ginjal (kreatinin >2 mg/dL) dan perdarahan saluran cerna atas (>500 mL/hari). Adanya nekrosis, pseudokista atau abses juga berperan dalam beratnya pankreatitis (Robin kumar, 2007)

Pankreatitis dapat merupakan episode tunggal atau berulang. Tergantung beratnya peradangan dan luasnya nekrosis parenkim, dibedakan menjadi:

a. Pankreatitis Akut Interstisial adalah terdapat nekrosis lemak di tepi pankreas dan edema interstisial; biasanya ringan dan self limited

b. Pankreatits Akut Nekrosis. Bisa setempat atau difus, terdapat korelasi antara derajat nekrosis pankreas dan beratnya serangan serta manifestasi sistemik.

Faktor yang menentukan beratnya pankreatitis akut sebagian masih belum diketahui. Pada 80% kasus pankreatitis akut, jaringan yang meradang masih hidup (pankreatitis interstisial), sisanya 20% mengalami nekrosis pankreas atau nekrosis peripankreas yang merupakan komplikasi berat dan mengancam jiwa. Nekrosis peripankreas diduga akibat aktivitas lipase pankreas pada jaringan lemak peripankreas; sedang penyebab nekrosis pankreas adalah multifaktor (kerusakan mikrosirkulasi dan efek langsung enzim pankreas pada parenkim pankreas) (Robin kumar, 2007)

Pada pankreatitis interstisial dapat menunjukkan toksisitas sistemik yang jelas (gagal napas), umumnya self limited bila tidak terdapat nekrosis pankreas. Bila terdapat nekrosis pankreas, kerusakan bersifat permanen, karena adanya enzim pankreas, toksin, dan timbulnya infeksi sekunder (Robin kumar, 2007)

Pada pankreatitis berat, enzim pankreas, bahan vasoaktif dan toksik keluar dari saluran pankreas dan masuk ke dalam ruang pararenal anterior, pararenal posterior, lesser sac, dan peritoneum. Bahan ini mengakibatkan iritasi kimiawi yang bisa menimbulkan penyulit seperti kehilangan cairan berprotein, hipovolemia, dan hipotensi. Bahan tersebut masuk melalui sirkulasi umum (jalur getah bening retroperitoneal dan jalur vena) mengakibatkan penyulit sistemik (gagal napas, gagal ginjal, dan kolaps kardiovaskular) (Robin kumar, 2007).

DAFTAR PUSTAKAAmutha K., Priya KJ. 2011. Effect of pH, Temperature and Metal Ions on Amylase Activity rom Bacillus subtilis KCX 006. International Journal of Pharma and Bio Sciences. Departement of Biotecnolovy, Prince Shri Venkateshwara Arts and Science College, Goerivakkam, Tamil Nadu.

Corwin, Elizabeth J. 2009. Buku Saku Patofisiologi. Jakarta : EGC.

Dutta TK., Jana M., Paari PR., Bhattacharya T. 2006. The Effect of Temperature, pH, and Salt on Amylase in Heliodiaptomus viduus (Gurney). University of Nebraska Medical Center

Hidalgo, Manuel. 2010. Pancreatic Cancer. Diunduh dar http://content.nejm.org/cgi/content/full/362/17/1605 pada 25 Juni 2011K.S. Prashanth, et all. 2008. Effect of 50Hz Electromagnetic Fields on Alpha Amilase Activity. Romanian J. Biophys. Vol. 18, No. 3, P. 255263.Koolman, Jan et Klaus-Heinrich Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry 2nd. Stutgart: Thieme. Hal. 268

Kumar, Subodh; Sushma Sagar, Arulselvi Subramanian, Venencia Albert, Ravindra Mohan Pandey, et Nitika Kapoor. 2012. Evaluation of amylase and lipase levels in blunt trauma abdomen patients. J Emerg Trauma Shock. 5(2): 135-142Leuchs, Erhard Friedrich. 2006. "Wirkung des Speichels auf Starke". Poggendorff's Annalen der Physik und Chemie. Annalen der Physik. Vol. 98

Malinoski DJ, Hadjizacharia P, Salim A, Kim H, Dolich MO, Cinat M . Elevated serum pancreatic enzyme levels after hemorrhagic shock predict organ failure and death.J Trauma. Sep 2009;67(3):445-9.Nurman. 2011. Pankreatitis Akut dalam Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta : EGC

Padmomartono, F Soemanto. 2007. Tumor Pankreas. Dalam: Buku Ajar penyakit Dalam. Jilid I. Edisi IV. Jakarta: FKUI.Robert K. Murray. 2003. Biokimia Harper. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.

Sacher, Ronald A, Richard A Mcpherson. 2004. Tinjauan Klinia Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta: EGC. Hal 353-355.Sherwood, Lauralee. 2011. Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.Souza PM., 2010. Application of Microbaial -Amylase in Industry. Brazilian Journal of Microbiology 41:850-856. Universidade de Brasilia.

Mathew, Abraham. 2009. Hiperamylasemia. Diunduh dari: http://emedicine.medscape.com/article/186389-overview. Pada tanggal 30 Mei 2013Sherwood, Lauralee. 2001. Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem Edisi 2. Jakarta: EGC.

Suhardjono; Made Sukahatya; imam Parsoedi A. 2011. Gagal Ginjal Akut dalam Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta : EGC.Gambar 1. Struktrur -amilase. Domain A diberi warna merah, domain B kuning, domain C ungu. Pada pusat katalitik, kalsium ditunjukkandengan warna biru safir, dan klorid bewarna kuning safir. Yang bewarna hijau berikatan pada sisi aktif dan binding-site permukaan

Ambil darah probandus dengan spuit 3cc

Masukkan darah pada vaccum med, inkubasi 10 menit

Sentrifuge 4000 RPM selama 10 menit

+

Working reagent 1 cc

Plasma 20 l

Diperiksa pada spektrofotometer