Dott. Emanuele Minetti

LEISHMANIOSI:diagnosi di laboratorio LEISHMANIOSI:diagnosi di laboratorio

Come affrontare i problemi diagnostici nella pratica

quotidiana

Come affrontare i problemi diagnostici nella pratica

quotidiana

Traccia …Traccia …Tre cardini

diagnosticiDiagnosi??Esame delle urineSDS Age:

biomarker??

Ricorda …Ricorda …I risultati di un test si dividono in:

TN = “True Negative” – Veri Negativi

FN = “False Negative” – Falsi Negativi

TP = “True Positive” – Veri Positivi

FP = “False Positive” – Falsi Positivi

Se per esempio su 100 cani eseguo il test “X” vedo che ho i seguenti risultati:TN = “True Negative” – Veri Negativi 81FN = “False Negative” – Falsi Negativi 5TP = “True Positive” – Veri Positivi 12FP = “False Positive” – Falsi Positivi 2

Ricorda … la SensibilitàRicorda … la Sensibilità

Sensibilità = [TP ÷ (TP + FN) ] X 100

E’ la capacità di un test di identificare individui malatiE’ la frequenza di un risultato positivo o “anormale” quando una malattia è presenteE’ il limite % inferiore di indagine di un analita

Esempio: sui 100 test “X” ho ottenuto 12 TP e 5 FN

Sensibilità = [12 ÷ (12 + 5) ] X 100 = 70,58 %

Ricorda … la SpecificitàRicorda … la Specificità

Specificità : [TN ÷ (TN + FP) ] X 100

E’ la capacità di un test di laboratorio di identificare pazienti che non presentano una malattia in particolareE’ la frequenza di un risultato negativo o “normale” quando una malattia è assente

Esempio: sui 100 test “X” ho ottenuto 81 TN e 2 FP

Specificità = [81 ÷ (81 + 2) ] X 100 = 97,59 %

Ricorda …Ricorda …

Quando la sensibilità aumenta, la specificità diminuisceUn test di laboratorio è solo in alcuni casi altamente sensibile e altamente specificoI test di screening necessitano di alta sensibilità perché i risultati Falsi Positivi sono più accettabili dei risultati Falsi Negativi I test di screening sono usati per determinare la presenza di una malattia

Tre cardini diagnosticiTre cardini diagnostici

1)Ricerca del protozoo Leishmania2)Titolo anticorpale 3)Proteine totali e Elettroforesi

delle sieroproteine

Dal 1985, anno in cui presentai una relazione proprio qui a Milano,

nella pratica clinica poco è cambiato, se non alcune metodiche di laboratorio

di riferimento

Dal 1985, anno in cui presentai

una relazione proprio qui a Milano, nella pratica clinica poco è cambiato, se non alcune metodiche di laboratorio di riferimento

1) Alla ricerca del 1) Alla ricerca del protozooprotozoo1) Alla ricerca del 1) Alla ricerca del protozooprotozoo

Esame citologicoEsame istologicoEsame Polymerase Chain Reaction (PCR e RT-PCR)

Esame CitologicoEsame

CitologicoMidollo osseoLinfonodiCuteAltri organi

VANTAGGI: semplice, economico, rapido, specificoSVANTAGGI: sensibilità, deve eseguirlo un patologo di buona

esperienza, difficoltà nel campionamento (midollo, organi interni)

Un esame citologico negativo

NON esclude la diagnosi di leishmaniosi

Esame IstologicoEsame IstologicoLinfonodiCuteAltri organi

VANTAGGI: relativamente semplice, abbastanza economico, offre ulteriori dati al caso clinico, specifico

SVANTAGGI: sensibilità, da inviare a patologo veterinario esperto presso laboratorio di analisi, difficoltà nel campionamento, tempi di risposta di alcuni giorni

Un esame istologico negativo NON esclude la diagnosi di leishmaniosi

Esame PCR: Esame PCR: Reazione a Reazione a Catena della PolimerasiCatena della PolimerasiEsame PCR: Esame PCR: Reazione a Reazione a Catena della PolimerasiCatena della Polimerasi

La PCR (Polymerase Chain Reaction) consiste nella sintesi ciclica di DNA in vitroLa miscela di reazione contenente gli oligonucleotidi specifici (primers), i nucleotidi trifosfati, un tampone di reazione adatto all’enzima, l’enzima DNA polimerasi termostabile e il DNA bersaglio viene sottoposta alla reazione

La reazione, articolata in cicli successivi, comporta la duplicazione di ogni molecola di DNA bersaglio presente nel campione ad ogni successivo ciclo

PCR: “Golden PCR: “Golden Standard”?Standard”?

PCR: “Golden PCR: “Golden Standard”?Standard”?

Midollo osseoSangue interoLinfonodiMix

VANTAGGI: sensibilità, specificità SVANTAGGI: metodiche di campionamento non

di routine, test fortemente condizionato dalla natura del campione inviato al laboratorio e dalla tecnica utilizzata nell’estrazione del DNA, tempi di risposta, costi

Al momento non può essere ancora considerato esame di routine per le difficoltà pre-

analitiche

2) Il titolo anticorpale: 2) Il titolo anticorpale: IFIIFI

2) Il titolo anticorpale: 2) Il titolo anticorpale: IFIIFI

La sierologia consente di determinare anticorpi specifici nei confronti del parassita

La metodica in immunofluorescenza IFI è ancora oggi ritenuta il “Golden Standard” nella diagnosi della leishmaniosi canina

Tale metodo è insostituibile negli studi epidemiologici, nella pratica clinica e nel follow-up del paziente

Un titolo positivo di 1:160/1:200 ha specificità dal 98% al 99%

Altre metodiche Altre metodiche anticorpali? vantaggi e anticorpali? vantaggi e

svantaggisvantaggi

Altre metodiche Altre metodiche anticorpali? vantaggi e anticorpali? vantaggi e

svantaggisvantaggi

Emoagglutinazione IHAT: antigene Leishmania Donovani, specifico ma poco sensibile (< 60%)

Test di agglutinazione (commerciale): non più usato a causa delle molte reazioni crociate con altre malattie parassitarie ed infettive

Test ELISA (commerciali): in genere da antigene totale, non sufficientemente specifici, poco sensibili, reazioni crociate possibili

Test di Immunomigrazione (commerciali): molti e con diverse sensibilità e specificità, non buona riproducibilità e costanza nei risultati, reazioni crociate possibili

Altre metodiche Altre metodiche anticorpali? Canticorpali? Considerazioni onsiderazioni

pratichepraticheNessun test commerciale è attualmente paragonabile all’IFI per sensibilità e specificità Sensibilità e specificità variabili ne sconsigliano l’uso negli studi epidemiologici, nella pratica clinica, nel follow-upCreano “confusione diagnostica” e l’attesa del clinico è fortemente influenzata dai messaggi commerciali e dal vantaggio economico immediatoApparente servizio al cliente ma ad alto rischio di “Missing Diagnosis” o falsa diagnosi di malattiaTroppo spesso usati per escludere la leishmaniosi canina dal diagnostico differenziale

Un test negativo o positivo NON

esclude o include la diagnosi di leishmaniosi

3) Leishmaniosi e P.T. con 3) Leishmaniosi e P.T. con elettroforesi delle elettroforesi delle

sieroproteinesieroproteine

3) Leishmaniosi e P.T. con 3) Leishmaniosi e P.T. con elettroforesi delle elettroforesi delle

sieroproteinesieroproteineProteine totali sieriche P.T. al di sopra dell’intervallo di riferimentoAumento delle frazioni beta-1, beta-2 e gammaglobuline, ponti beta-gammaInversione rapporto albumine/globuline

Diagnosi ??Diagnosi ??Diagnosi ??Diagnosi ??

Nessuno dei test menzionati consente “da solo” di emettere diagnosi di leishmaniosi canina, di effettuare studi epidemiologici, di realizzare il follow-up del canePositività anticorpale non è uguale a cane malatoOgni paziente “è un protocollo diagnostico”È necessario approfondire gli aspetti epidemiologici e clinici della malattia nel Nord Italia

Diagnosi ??Diagnosi ??Diagnosi ??Diagnosi ??

Gli esami di laboratorio devono essere completi profili ematologici e biochimici per stadiare correttamente il pazienteLa stadiazione del cane leishmaniotico deve essere eseguita sempre anche tramite un profilo delle urine completo chimico-fisico, rapporto PU/CU, SDS Age proteine urinarie per peso molecolare

Esame delle urineEsame delle urineEsame delle urineEsame delle urineIl solo esame chimico-fisico delle urine non permette di stabilire se il cane è proteinuricoIl solo rapporto Proteine Urinarie/ Creatinina Urinaria PU/CU non permette di stabilire se il cane è sicuramente proteinurico L’unico esame che attualmente permette lo studio della proteinuria nel cane è la elettroforesi modificata per peso molecolare su Sodio Dodecil Solfato Agar Gel SDS-Age

Analisi quali-quantitativa per peso molecolare delle

proteine urinarie

Analisi quali-quantitativa per peso molecolare delle

proteine urinarieSDS Age ProteinurieSDS Age Proteinurie

PROTEINE TUBULARI < 70 KdABeta2microglobuline 12 kDaLisozima 15 kDaRBP 21 kDaMonomeri K/L 25 kDaAlfa1microproteine 33 kDaDimeri K/L 50 kDa

Albumine/Prealbumine 70 kDaAlbumine/Prealbumine 70 kDaTransferrina 80 kDa

IgG 160 kDaIgA 165 kDa

AproglobulineAlfa2macroglobuline

PROTEINE GLOMERULARI > 70 KdAPUNTO DI APPLICAZIONE

SDS Age Proteinurie SDS Age Proteinurie Ogni SDS viene eseguito inserendo un pool proteine di riferimento a composizione e peso molecolare noto in posizione 3

1 banda a P.M. 160 kDa2 banda a P.M. 70 kDa3 banda a P.M. 27 kDa4 banda a P.M. 15 kDa

1 2 3 4P.M. 1 2 3 4

Le corse dei campioni vengono confrontate ciascuna con il

riferimento noto

Esempio di refertazione Esempio di refertazione per SDS Ageper SDS Age

Esempio di refertazione Esempio di refertazione per SDS Ageper SDS Age

Tipi di proteinuriaTipi di proteinuria

Assente: il test non mostra alcuna banda di deposizioneSemplice Glomerulare: presenza di proteine glomerulari con P.M. fra 900 e 70 kDaSemplice Tubulare: presenza di proteine tubulari con P.M. fra 70 e 12 kDaMista Tubulare - Glomerulare: presenza di bande di proteine sia tubulari sia glomerulari

Assente: il test non mostra alcuna banda di deposizioneAssente: il test non mostra

alcuna banda di deposizione

Assenza di proteinuriaDanno renale assente o di lieve entitàPrognosi buonaRipetere il test durante il trattamento con antimoniali per valutare eventuale comparsa di bande tubulari in zona monomeri K/L-FLC (danno renale da farmaco?)

Corsa n. 5

Nessuna deposizione di bande proteiche

Semplice Glomerulare: presenza di proteine glomerulari con P.M.

fra 900 e 70 kDa

Semplice Glomerulare: presenza di proteine glomerulari con P.M.

fra 900 e 70 kDaDanno renale presente anche se gli altri esami biochimici apparentemente sono negli intervalli di riferimentoDiagnostica per immagini: ecografia renale, Rx apparato urinario con contrastoEsecuzione biopsia renale eco-assistita

Corsa n. 3

Bande proteiche a 70 e 80 kDa

Semplice Tubulare: presenza di proteine tubulari con P.M. fra 70

e 12 kDa

Semplice Tubulare: presenza di proteine tubulari con P.M. fra 70

e 12 kDaDanno renale presente o malattia neoplastica (mieloma multiplo) o infiammatoriaIndagini collaterali complete (ecografia, Rx, TAC, RMN ecc)Condizione rara quasi sempre con banda fra 25 e 20 kDa da riferirsi a monomeri K/L o Free Light Chains-FLC (o Catene Libere Leggere) … possono essere anche identificate come proteine di Bence-Jones

Corsa n. 4

Banda a 70 kDa (albumine) e banda a 25 kDa (FLC)

Esempio di FLC proteinuria

Esempio di FLC proteinuria

Immunofissazioni per FLC o monomeri K/L con anticorpi

anticane

Mista Tubulare-Glomerulare: presenza di bande di proteine

sia tubulari sia glomerulariDanno renale gravePrognosi da seria ad infaustaPossibile end-stage

Eventuali ulteriori indagini diagnostiche (ecografia, Rx, TAC, RMN, ecc)

Corse n. 1 e n. 2

Bande fra 900 e 15 kDa

SDS Age: biomarker?SDS Age: biomarker?SDS Age: biomarker?SDS Age: biomarker?La valutazione qualitativa della proteinuria nel cane è sicuramente un nuovo ed importante ausilio diagnostico soprattutto nei cani senza apparenti segni clinici di Leishmaniosi ma positivi ai test di ricerca del protozoo e/o anticorpaliAvere a disposizione un test predittivo per la valutazione della funzionalità renale consente di avere più dati nell’iter clinico che porta alla decisione sempre critica del trattamento o meno dei soggetti asintomatici o paucisintomatici

Si apre un capitolo Si apre un capitolo nuovonuovo

Si apre un capitolo Si apre un capitolo nuovonuovo

Lo studio della proteinuria nel cane è un nuovo capitolo che si è appena aperto e, sulla scorta dell’importanza che ha assunto nella patologia clinica dell’uomo, potrà diventare uno strumento fondamentale nelle mani del Medico VeterinarioLa complessità della materia non consente oggi di valutarne appieno le opportunità diagnosticheSono in corso di pubblicazione lavori scientifici che consentiranno di applicare l’analisi delle proteine urinarie in corso di Leishmaniosi nella pratica clinica

Bibliografia …Bibliografia …Bibliografia …Bibliografia …

LATIMER K.S., MAHAFFEY E.A. , PRASSE K.W.: “VETERINARY LABORATORY MEDICINE , CLINICAL PATHOLOGY” – DUNCAN&PRASSE’S 4TH ED. 2003WILLARD M.D. , TVEDTEN H.: “SMALL ANIMAL CLINICAL DIAGNOSIS BY LABORATORY METHODS” – SAUNDERS 4TH ED. 2004POLI G.: “PRINCIPI E APPLICAZIONI DELL’INGEGNERIA GENETICA”- UTET 1997POLI G., COCILOVO A.: “MICROBIOLOGIA E IMMUNOLOGIA VETERINARIA” – UTET 1996LE CARRER D. ,BOUCRAUT J.: “ URINE PROTEIN ELECTROPHORESIS END IMMUNOFIXATION, ILLUSTRATED INTERPRETATIONS” –LAB. SEBIA 1999ZATELLI A., BONFANTI U.: “QUALITATIVE DETERMINATION OF PROTEINURIA BY SDS-AGE IN THE HEALTHY DOG” J VET INT MED 2002;3:389A. ZATELLI - E. ZINI - U. BONFANTI - R. SANTILLI - M. BORGARELLI: ”CORRELATION BETWEEN QUALITATIVE PROTEINURIA ASSESSED WITH SDS-AGE AND RENAL HISTOPATHOLOGIC FINDINGS IN DOGS”A. ZATELLI ET ALII: “GLOMERULAR LESIONS IN DOGS INFECTED WITH LEISHMANIA ORGANISM” AM J VET RES,2003 MAY;64(5):558-61ZINI E., BONFANTI U. ZATELLI A.: “WISHES TO CLARIFY SUBJECT OF CANINE MULTIPLE MYELOMA” J AM VET MED ASSOC. 2004 JAN 15;224(2);196; 196-7

RingrazioRingrazioRingrazioRingrazio

La Bayer e il CVM per l’opportunità concessami I colleghi Andrea Zatelli, Ugo Bonfanti, Eric Zini e tutti gli altri con i quali in questi ultimi quasi tre anni ho avuto l’onore di condividere una serie di ricerche difficili e complesse che ha portato alla pubblicazione, tutt’ora in corso, di prestigiosi articoli scientifici sulle più importanti riviste internazionaliLo staff scientifico e tecnico della BiEsseA Laboratorio Analisi Veterinarie di Milano senza il quale il mio lavoro non esisterebbeUn ringraziamento particolare alla Dottoressa Sabrina Giussani che ha avuto la pazienza di sopportarmi e di “aggiustare” questa presentazione