Rev. lnvest. Clln. ( Méx.) 35: 149-154, 1983

' ('

CUANTIFICACION URINARIA DE 3-METOXI-4-HIDROXIFENILETILENGLICOL EN SUJETOS SANos+

Luz M. NAVARRO,* JuLrA MoRENo,* CARLos VALVERDE R .*

Y JUAN RAMÓN DE LA FUENTE**

Se describe un método para cuantificar Ja concentración urinaria de MHPG, que es el principal metabolito de la norepinefrina cerebral, utilizando la cromatografía líquido-gas con detector de captura de electrones.

Los resultados obtenidos en 27 sujetos sanos muestran un rango que oscila entre 1030 y 3066 µg/24 hs con un promedio ± E.E. de 2040 ± 113 µg/ 24 hs·. Los percentiles de los valores de referencia fueron: P5 == 1060 µg/24 hs P50 == 2015 µg/24 hs y P95 == 2820 µg/24 hs. Tanto la variación del método como los valores encontrados. son consistentes con los reportados en otros países.

Los autores discuten la importancia del desarrollo de esta y otras metodologías similares para algunas áreas de la investigación en neurociencias.

DETERMINATION OF URINARY 3-METHOXY-4-HYDROXIPHENILETHYLENGLICOL IN HEALTHY

SIUBJECTS

A gas-chromatographic method with electron capture detection for determining MHPG, the major metabolite of cerebral norepinephrine, is described.

Twenty-seven healthy subjects were studied. Their range of MHPG excretion was 1030 to 3066 µg/ 24 hr with a x ± SE'M of 2040 ± 112 µg/24 hr. Percenti'les for the reference values were as foUows: P5 == 1060 µg/24 hr, P50 == 202p µg/24 hr and .P95 == 2820 µg/24 hr. Intra and inter-assay variability for the described method were estimated to be 12% and 20% respectively. These results are consistent with those reported by other investigators. •

The authors discuss the importance of this and other similar technological tools to improve assesment of psychiatric patients anct to enhance research in neurosciences.

El 3-metoxi-4-hidmxif eniletilenglicol ( MHPG), es el metabolito primario de la noreprinefina (NE) en' el sis~ tema nervioso central (SNC) ( 1). De los primeros estudios que se efectuaron en relación a este metabo­lito se calculó, por métodos indirectos ( 2), que entre un 30 a un 50% del MHPG excretado en orina te­nfa su origen en el SNC. Sin embargo, el desarrollo de técnicas más .finas (3) ha permitido establecer que cerca d~l 60% del total de MHPG excretado por la orina tiene ese origen. Así, desde que el MHPG se aisló y se caracterizó como el principal metabolito de la

NE cerebral primero en orina ( 4) y posteriormente en otros fluidos corporales ( 5) , se despertó un gran interés por medir su concentración en pacientes con patología neuropsiquiátrica. Para su cuamtificación se han utilizado métodos diversos: la cromatografía en papel bidimensional ( 6-7) que es poco específica, la espectrofotometría y fluorometría (8-10) que son poco sensibles, y más recientemente la cromatografía llquido-gas, tanto con detectores de ionización de fla­ma (11-12) como d~ captura de electrones (13-16). La ventaja de estos últimos es que son más sensibles

* Departamento de Neuropsicoendocrinología, Instituto Nacional de la Nutrición Salvador Zubirán. México, D. F. ** Unidad de Estudios Especiales, Instituto Mexicano de Psiquiatría. + Trabajo subvencionado por el Instituto Mexicano de Psiquiatría, Proyecto UT-07 /03/8/ 82.

Correspondencia : Dr. luan Ramón de la Fuente. Unidad de Estudios Especiales. Instituto. Mexicano de Psiquiatría. Anti­guo camino a Xochimilco No. 101. Tlalpan 14370. México,. D. F.

Recibido el 21 de septiembre de 193:2. Aceptado para publicación el 12 de ngviembre de 19'82.

149

REVISTA DE INVESTIGACION CLINICA

que los primeros, y además, cuando se combinan con la espectrometría de masas, se asegura la identificación del compuesto analizado ( 17) .

Por lo anterior, decidimos desarrollar y estandarizar el método de cromatografía líquido-gas con detector de captura de electrones ( CLG-CE) para cuantificar el MHPG en orina de 24 horas. En este trabajo se informan los .d:esultados obtenidos en una población de sujetos sanos, como parte de un programa más amplio de desarrollo de metodologías par.a ia investi­gación neuropsicoendócrina en nuestro medio.

MATERIAL

Orina. Se colectó orina de 24 horas en 27 sujetos sanos. Algunas de sus caracteríisticas se señalan en la Tabla l. Las instrucciones para la colección de la orina

TABLA 1

CARACTERlSTICAS DE LA MUESTRA (n == 27)

Edad Peso Talla Creatinina MHPG Sexo (años) (kf!.) (cm.) (l!/24hs) ( µf!!24hs)

F 22 49 160 .84 1.Ü'30 F 22 51 168 1.13 2.780 F 22 47 15.7 .70 2.217 F 23 52 165 1.09 2.418 F 24 54 166 .88 1.741 F 25 57 160 .70 1.480 F 25 42 150 .75 3.066 F 27 57 161 . 92 2.209 F 28 52 150 . 90 1.345 M 24 66 172 l. 21 1.480 M 26 64 174 1.57 2.689 M 26 68 173 1.93 1.848 M 26 84 180 1.52 1.897 M 26 64 161 1.59 1.407 M 26 70 168 1.34 1.717 M 27 73 175 1.58 1.275 M 27 74 175 l. 70 2.938 M 27 62 172 1.59 2.768 M 27 72 179 l. 76 2.714 M 27 69 178 1.58 2.399 M 28 70 170 1.54 1.110 M 28 82 180 1.54 2.049 M 28 75 184 1.90 2.234 M 28 75 182 1. 29 2.297 M 28 68 172 1.35 1.832 M 29 64 164 l. 22 1.561 M 30 64 170 1.41 2.487

se dieron cuidadosamente a cada uno de los sujetos, tanto de manera verbal como por escrito. Para validar lo adecuado de la colección, se descartaron aquellas muestras cuyos valores de creatinina fueran < O. 7 g/ 24 horas en mujeres, y < 1.2 g/24 horas en hombres. Estos vaJlores representan una desviación estándar por debajo de la media de 68 sujetos normales, cuya excreción de creatinin~ ha mostrado tener una distri­bución Gaussiana (datos de :nuestro laboratorio no pu­blícados) . Las orinas se colectaron en frascos de vidrio, utilizando 500 mg de metabisulfito de sodio como preservador. Una vez medidos los volúmenes totales,

150

VOL. 35, ABRIL-JUNIO, 1983

se separaron fracciones de 100 ml, y se congelaron a -20° c.

Reactivos. Se utilizó como estándar la sal de MHPG pjperazina la que, junto con el anhidrido heptafluoro­butírico ( AHFB) y · la glusulasa (combinación de B­glucouronidasa y aril-sulfatasa), se obtuvieron de Sigma Chemical Co. La sal disódica del ácido etilendiamino-., ·f

tetracético ( EDT A) se obtuvo de Eastman Kodak & Co., mientras que el bicarbonato de sodio, el ác:do acético, el acetato de sodio, el acetato de etilo y el sulfato de sodio anhidro se obtuvieron de J. T. Baker.

Equ.ipo. Se usó un cromatógrafo de gases (Modelo 5833A, Hewlett-Packard), equipado con un detector de captura de electrones. La separación cromatográ­fica se hizo en una columna de vidrio de 140 cm X 6 mm, y se empacó con OV-101 al 1 % y QF-1 al 3% en Chromosorb WHP 80/ 100. El gas acarreador utili­zado fue nitrógeno comprimido.

MÉTODO Y VALIDACLÓN DE LA TÉCNICA

Se utilizó con modificaciones mínimas el procedi­miento descrito por Dekirmen jian y Maas ( 14) . El método cÓnsiste básicamente en: 1 ) la hidrólisis enzi­mática y extracción del MHPG urinario; 2) fa forma­ción de un derivado fluorado y su caracterización cromatográfica; y 3) la cuantificación de concentra­c:ón de MHPG y control de calidad del método .

1) Condiciones de hidrólisis y extracción de MHPG

El MHPG se excreta en la orina en forma de glu­c::uronatos y de sulfatos ( 14) . Para obtenerlo en forma Hbre, es necesario someterlo a hidrólisis enzimática. Con este objeto, se empleó la combinación de enzimas ( B-glucouronidasa-aril-sulfatasa) denominada glusulasa en concentraciones diversas, observándose (Fig. 1) que 50 ,µ,l de la misma son suficientes para una hidró­lisis completa. El MHPG se extrajo de la orina con 3 porciones de 1 ml de acetato de r etilo después de la in­cubación con la glusulasa.

A B e o • 1

• ~-

o E .. . u

s 2

Fm. 1. Trazos cromatográficos de MHPG con concentra­ciones diversas de .~Iusulasa: A___: 20 µl, B == 50 µJ. C == 75 µ1, D == 100 µl,

CUANTIFICAJCION URINARIA

2) Formación del derivado

La reacción del MHPG con el AHFB da como resultado la formación de un derivado fluorado al­tGimente volátil, necesario para su detección (Fig. 2) .

. CFs-Cf,'i -' CFz-CO-..... . CF5'-C'fz-CFz-CO,.....o

AHFB

OH

OR 1 •

QCH - CH2-9R .

+ 3 CF5 -CF2 -CF2 -COOH

OCH5

o 1 R

.MHPG DERIVADO

Fm. 2. Formación del derivado MHP y G + AHFB

Para establecer las condiciones óptimas de esa reacción, se corrieron tres ensayos por duplicado manteniendo constante la concentración de MHPG (10 µg/ml) y variando la cantidad de AHFB. Se observó que con 8.5 ,µ.l de AHFB se lograba, a juzgar por la altura de 18 señal o "pico" cromatográfico, un rendimiento ade­cuado en la formación del derivado ( Fig. 3) .

8

7

6

E 5 <.>

4

3

2

A B e

Fm. 3. Trazos cromatográficos de MHPG con concentracio­nes diversas de AHFB: A== 6.5 µl, B == 8.5 µl. C '== 10.5 µl.

3) Técnica) cuantificación y control de calidad del método

En la Tabla 2 se resumen ias condiciones bajo las cuales se realiza la hidrólisis, así como las concentra­ciones de MHPG agregado (adiciones patrón) a una muestra problema. Todo el procedimiento se efectúa en tubos de ensayo de 13 X 100 mm. Obsérvese que

Luz M. Navarro y cols.

para cada muestra de orina se trabajan tres tubos gue corresponden a: tubo 1, la concentración endóge­na de MHPG; y tubos 2 y 3, a esa concentración en­dógena más concentraciones conocidas del metabolito.

La hidrólisis se efectúa dejando los tubos en incuba­ción a 37ºC en baño de agua durante 18 horas. Se hacen tres extracciones del MHPG con la cantidad de acetato de etilo ya '''mencionado. En cada una, la fase orgánica se extrae con pipeta pasteur y se colecta en tubos de ensayo. Posteriormente se lava con 150 .ul de KHCOa 0.05 M con el fin de purificar la muestra de elementos urinarios residuales, y se seca con 200 mg de suiffato de sodio anhidro. El acetato de etilo se evapora en baño de agua de 40° e bajo corriente de nitrógeno. Para la derivación, e'l residuo se di­suelve en 42 ,µ.l de acetato de eti'lo y se le agregan 8.5 ,µ.l de AHFB. Los tubos se ágitan durante 1 minuto y posteriormente se dejan reposar 1 hora a temperatura ambiente. El exceso de AHFB se evapora con corriente de nitrógeno. El residuo se disuelve en 1 ml de ace­tato de etilo, y se inyecta 1 ,µ.l al cromatógrafo bajo las siguientes condiciones: fase estacionaria: OV-101 + QF - 1; temperatura de la columna: 158°; tempera­tura del inyector: 190 º ; tempera tura del detector: 200°; gas acarreador: nitrógeno comprimido; y velo­cidad de flujo: 58 ml/min.

En la figura 4 se ilustra la manera de calcular la concentración de MHPG, usando la técnica de adicio­nes patrón. La recta se establece con base en la can­tidad de MHPG añadido a la orina (tubos 2 y 3) y la altura del "pico" cromatográfico. El valor absoluto de la intercepción de la recta con el eje horizontal corresponde a la cantidad de MHPG presente en la orina que se está estudiando (tubo 1 ) . Para obtener el valor de la excreción total en 24 horas, este dato se multiplica por el volumen total de orina excretado durante las 24 horas.

La variación intra-ensayo se calculó procesando siete veces un estándar de MHPG con una concentración de 6.6 ,µ.g/ml en un mismo ensayo, obteniéndose un coeficiente de variación del 12.2%. La variación inter­ensayo se calculó procesando siete muestras de orina en cinco ensayos diferentes, obteniéndose un coeficiente ae variación promedio de 19.9%.

TABLA 2 ~

VOLUMENES Y CARACTERISTICAS DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS PARA LA HIDROLISIS DEL MHPG URINARIO. EN LA ULTIMÁ COLUMNA

SE INDICAN LAS CONCENTRACIONES DE MHPG AGREGADAS

Tubo No

1 2 3

Orina ( µl)

250 250 250

Buffer ( µ,[) (acetato,

JM, PH 6)

83 83 83

EDTA al 2% {µ,l)

42 42 42

MHPG {µ!} Glusulasa ( µ,!} 01.m.f!/ml

50 50 8 50 16

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REVISTA DR INVESTIGACION CLINICA

8 ¡:

CONCENTRAcloÑ--o A890LUTA DE Mff PG EN

LA OIU~A

3. 6.4

M.HPG (jJo/ml ) AÑADIDO

Fm. 4. Determinación urinaria de MHPG por la técnica de adiciones patrón.

RESULTADOS

Como puede observarse en la TabLa 1, los valores encontrados de MHPG urinario en sujetos sanos varían considerablemente dentro de un raingo que oscila entre 1030 y 3066 ,µ.g/24 horas. En la figura 5 se observa que la dispersión de los valores, tanto en hombres como en mujeres, no disminuye si se calculan en fun­ción de La excreción de creatinina, la superficie corpo­ral o el volumen de orina. Más aún, los coeficientes de variación encontrados para cada una de ·estas formas de analizar los datos fueron 45%, 34% y 34%, res­pectivamente, mientras que el coeficiente de variación de los valores totales (ff.g/24 horas) fue de 29%.

(.!)

a. I ~

4500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

o MUJERES

•HOMBRES

1 g

' §

f 8 .

•:

. ~

. . .. ,J

'i . .. ...

4 ...

~ i . :-~ li

500~~~~~~~~~~~------------~

)JQlg.CREAT. µgtm2 s.c. }JOll.ORINA µqt24 hs.

Fm. 5. Distribución de MHPG en orina de su.ietos sanos (n == 27).

152

VOL, 35, ABRIL-JVNIO, 1983

En la figura 6 se muestra un histograma con la distribución de las frecuencias de los valores de MHPG. La inspección del mismo sugiere la presencia de dos modas que pudieran corresponder 'ª dos subgrupos de sujetos: uno de excretores bajos de MHPG y otro de excretores altos de MHPG. A!l graficar los da:tos en una escala de probabilidad, también se observó que las frecuencias total~s no tenían una distribución Gaussiana. Sin embargo, no puede exduirse que esta bimodalidad desaparezca al aumentar el tamaño de la muestra.

Las características distributivas de los resultados ob­tenidos en esta muestra de sujetos estudiados hace conveniente que los valores de referencia se estimen por pe!lcentiles (P), ya que éstos consideran la va­riación de una distribución de frecuencias independien­temente de la forma de la distribución. Así tenemos que para nuestros valores: P5 = 1060

1µ.g/24 horas,

P50 - 2025 1µ.g/24 horas: y P95 ·= 2820 µ.g/214 horas.

en

~--wr---:>C\J

~11 wc o-

<!-

20

10

1000 2000

M H P G

( µ g / 24 hs )

3000

Fm. 6. Distribución de frecuencias de MHPG en suietos sanos.

DrscusrÓN

Los resultados aquí descritos constituyen, hasta donde sabemos, el primer reporte sobre la concentración de MHPG urinaria en sujetos sanos publicado en nuestro país. Nuestros límites de referencia estableci­dos por percentiles ( 1060-2820 ,µg/24 horas), son si­milares a los reportados por autores de otros países

TABLA 3

CONCENTRACION URINARIA DE MHPG ~ml!/24 hs) DETERMINADA POR CROMATOGRAFIA

LIQUIDO-GAS CON DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES

(X+E.E.==media± error estandar)

Autor Referencia Resultados (X+E.E.) N

Bond et al. 21 2.41 ±.19 13 T oseph et al. 22 2. 74 ± .15 13 Sharpless et al. 23 2.11 ± .26 11 Kim et al. 24 2.34 ± .21 6 Este estudio 2.04 ± .11 27

CUANTIFICAICION URINARIA

( 18-20) y más aún, en la T1abla 3 se muestra cómo el promedio de los valores de nuestro estudio es muy parecido a otros previamente reportados, en los que se utilizó el mismo método (21-24).

Hol:lister y cols. ( 19) fueron los primeros en estudiar sistemáticamente el rango de excreción de MHPG uri­naria de sujetos normales en condiciones de vida "habi­tua:les". Nuestros datos también son similares a los de ellos, en tanto que no parece haber una relación constante entre la concentración de MHPG y el sexo, e1 volumen dei orina o la excreción de creaitinina. No obstante, la determinación de esta última es útil para validar lo adecuado de la recolección de la orina. La variación inter-individual encontrada en este estudio también es consistente con la reportada por ese mismo grupo de investigadores ( 19), quienes además han establecido la existencia de un~ variación intra-indivi­dua:l, a;l estudiar al mismo grupo de sujetos durante diversos períodos de tiempo. Estas variaciones normales ínter e intraindividuales parecen estar en función del tipo de ailimentación (25), el ejercicio físico (26) y los estados de tensión sostenidos conocidos como stress (27)'.

La posibfüdad de cuantificar metabolitos de cate­colaminas en fluidos corporales constituye un avance tecnológico importante para la investigación en neu­rociencias. La técnica aquí descrita y los valores repor­tados abren nuevas posibilidades paira el desarrollo de futuras investigaciones en nuestro medio, particu­larmente en el campo de la psiquiatría. De hecho, la metodología referida nos ha permitido iniciar la eva­luación bioquímica y neuraendócrina de algunos pacien­tes deprimidos ( 28) . Estudios de esta naturaleza han hecho posible que exista en la actua:lidad una clasifi­cación bioquímica de los trastornos de la afectividad ( 18, 29-32) .

En tanto que el MHPG es el principa:l metabolito de la NE cerebral, su mesurabilidad permite el des­arrollo de estudios in vivo del metabolismo de este nieurotransmisor, en contraste con otros met:abolitos ( metanefrina, normetanefrina, ácido vanil:li1mandélico) cuyo origen es fundamentalmente periférico (glándulas suprarrenales y sistema nervioso simpático) ( 33). De ahí que el conocimiento de la metodología y el análisis de nuestros datos puedan ser de utilidad, no solamente para los investigadores en el campo de la psiquiatría, sino también para otros que trabajen en r_;:unas conexas de las neurociencias.

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen al Q. B. P. A. Loría, del Departa­mento de Control de Calidad del INNSZ, sus sugerencias y colaibotación.

Luz M. Navarro y cols.

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