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Determinacióndefactoresantinutritivostermorresistentesenleguminosas.I:Alcaloides

ARTICLE·JANUARY1993

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Mercedes.Muzquiz

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DETERMINACIÓN DE FACTORES ANTINUTRITIVOSTERMORRESISTENTES EN LEGUMINOSAS.

I: ALCALOIDES

M. MUZQUIZC. BURBANO

C. CUADRADOC. DE LA CUADRA

CIT-INIA,Apdo. 8111, Madrid

RESUMENSe han aislado y purificado, en forma cristalina, los alcaloides quinolizidínicos lupanina y lupinina

a partir de semillas de Lupinas albas y L. luteus con alto contenido en alcaloides. El alcaloide esparlei-na se obtuvo utilizando la técnica de cromatografía preparativa ultrarrápida en columna. Se han compa-rado dos métodos de extracción de alcaloides, cuantifícándose por cromatografía de gases y cromato-grafía líquida de alta resolución. Para la detección de los alcaloides se utilizó la técnica de cromatogra-fía en capa fina.

PALABRAS CLAVE: LupinasAlcaloides

ABREVIATURAS: CPUC = cromatografía preparativa ultrarrápida en columna; CCF = cromato-grafía en capa fina; CG - cromatografía de gases; CLAR = cromatografíalíquida de alta resolución.

INTRODUCCIÓN

Dentro de las leguminosas que tienen importancia desde el punto de vista ali-menticio por su alto contenido en proteína, existen diferentes factores tóxicos oantinutritivos que las pueden hacer poco aptas para el consumo humano y animal.Entre estos factores los alcaloides son compuestos termorresislentes que seencuentran principalmente en el género Lupinus. Las especies de Lupinus demayor interés desde el punto de vista de la alimentación humana y animal son:L. albus, L. angustifolius, L. consentiría, L. luteus, L. hispánicas y L. mutabilis.

Los alcaloides de las especies del género Lupinus son derivados de la quinoli-zidina de variable complejidad, aunque la mayoría son bicíclicos o tetracíclicos.Se encuentran como bases terciarias y como N-óxidos en concentraciones quevarían desde niveles indetectables en variedades dulces (genéticamente obtenidas)hasta un 3,8 p. 100 en algunas especies amargas de Lupinus albus y Lupinus muta-bilis. (Keeler, 1989; Muzquiz et al., 1989). Las bases terciarias son normalmentesolubles en agua y fuertemente básicas. Las proporciones relativas de alcaloides

Recibido: 8-1-93Aceptado para su publicación: 14-5-93Redactor asociado: J. L. García Martínez

Invcst. Agr.: Prod. Prol. veg. Vol. H (3), 1993

352 M. MI J/QUI/

en una especie determinada varían con el cultivar, la localidad y las condicionesclimatológicas.

Uno de los mayores impedimentos para una amplia aceptación del lupinocomo grano o forraje es, sin duda, la presencia de alcaloides. Los efectos tóxicosde los alcaloides del lupino no son acumulativos y los alcaloides son rápidamenteexcretados del cuerpo por el riñon. Por tanto se pueden ingerir grandes cantidadesde semillas de lupino siempre que la cantidad total de alcaloides presentes noexceda un determinado nivel. En dosis tóxicas, los alcaloides del lupino puedencausar daños en el sistema nervioso y el exceso puede producir también una seriede efectos que incluyen depresión respiratoria y fallo cardiaco (Culvenor et al.,1986). Es por tanto importante conocer la cantidad de alcaloides presentes y losniveles tóxicos de los alcaloides individuales.

Por otra parte, la ingestión de lupinos también puede producir intoxicaciónpor «lupinosis» originada por una hepatotoxina. Durante mucho tiempo se relacio-nó la lupinosis con el contenido de alcaloides en las plantas, aunque la lupinosistambién se presentaba después del pastoreo del lupino dulce. En realidad, la lupi-nosis es debida a las micotoxinas producidas por una contaminación secundaria dela planta por el hongo Phomopsis leptostromirformis (Culvenor et al., 1986).

Actualmente hay gran interés en encontrar nuevas variedades de Lupinus conbajo contenido en alcaloides. En este sentido, tanto el potencial del método analíti-co para discriminar entre diferentes tipos de alcaloides, como su sensibilidad paradetectar bajos niveles son importantes debido a la gran variedad de alcaloidesencontrados en las diferentes especies. (Trugo, Gross, 1989).

El presente estudio examina el contenido total e individual de alcaloides endiferentes especies del lupino utilizando diferentes métodos de extracción y cuan-tificación.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material vegetal

Las semillas utilizadas para la realización de este trabajo fueron cultivares olíneas de las siguientes especies: L. albus, L. angustifolius, L. mutabihs, L. luteus yL. hispánicas, procedentes del SIA de Badajoz.

Los patrones de alcaloides utilizados fueron: perclorato de lupanina y 13-OHlupanina (Koch-Light, Ltd, Colnbrook, UK); esparteina y gramina (Sigma, StLouis, MO, USA); lupinina (Serva, Heidelberg, FRG). La angustifolina y la epilu-pinina fueron proporcionadas por el Dr. Wiewiorowski y el Dr. Jach (Polonia).

Extracción

Se han utilizado dos métodos de extracción:

(a) El primer método está basado en el de Muzquiz et al, (1989). A 2 g deharina molida se añadieron 32 mi de la mezcla éter etílico: cloroformo:hidróxido sódico 4 N (20:10:2). Se agitó durante 30 min y se dejó reposardurante la noche. Se filtró en ampollas de decantación y el residuo se lavódos veces con 20 mi de éter etílico. A los tres filtrados se añadió 3 x 10 mide ácido clorhídrico 0,3 N, los extractos ácidos se llevaron a pH 10 con

l-Afl'ORI-íi ANT1 NUTRITIVOS TI-HMOKKl-SIS'n-N'HiS IÍN UiíiUMINUSAS I i Vi 1

hidróxido sódico 4 N y se extrajeron con 3 x 10 mi de cloroformo. Losextractos clorofórmicos se evaporaron u sequedad (30 °C) y el residuo sedisolvió en 1 mi de metanol: 0,5 mi fueron usados para cromalogralía encapa fina y 0,5 mi para cromatografía de gases tras añadir 0,5 mi de unasolución de codeína en metanol (2 mg/ml) como estándar interno. Des-pués de filtrar la muestra (filtros Millipore 0,45 |¿m), se inyectaron alícuo-tas de 0,2 |il.

(b) El segundo método es una modificación del método de Harris, W i I son(1988). Se pesaron 0,5 g de harina y se homogeneizaron con 5 mi deácido tricloroacético al 5 p. 100 durante 1 min a temperatura amhiente. Lamezcla se centrifugó durante 5 min (700 g) y se decantó el sobrenadante.La extracción se repitió dos veces más y a los sobrenadantes se añadió1 mi de hidróxido sódico 10 M en una ampolla de decantación. Se extrajocon cloruro de metileno ( 3 x 5 mi) y los extractos se evaporaron a seque-dad (25 °C). El residuo se disolvió en 1 mi de metanol y se procediócomo en el método (a).

Aislamiento y purificación de lupanina y lupinina

La lupanina, se aisló de semillas de L. albus amargo en forma de perclorato.Para ello se utilizó 1 kg de harina y la extracción se llevó a cabo siguiendo elmétodo (a). La fase acuosa fue evaporada a 200 mi y basificada con hidróxidosódico 4 N a pH 10. Los alcaloides fueron extraídos con cloroformo (4 x 30 mi) ylos extractos evaporados a sequedad. El residuo se disolvió en 20 mi de metanol yse ajustó a pH 6-7 con una solución de ácido perclórico en metanol (1 :1 ) , ticacuerdo con Perkowska et al., (1979). Los cristales blancos obtenidos fueronrecristalizados varias veces con metanol.

La lupinina se aisló de semillas de L. luteus amargo (1 kg) utilizando elmismo proceso de extracción que para el perclorato de lupanina. La fase acuosafue evaporada a 200 mi y basificada con hidróxido sódico 4 N. Los alcaloides fue-ron extraídos con éter dietílico (4 x 30 mi) y los extractos evaporados a sequedad.Los cristales obtenidos fueron recristalizados con éter de petróleo para separar lalupinina de la esparteina (Cromwell, 1955).

Los cristales de perclorato de lupanina y lupinina se disolvieron en mclanol yla pureza se determinó por cromatografía de gases y espectrometría de masas(Hewlett Packard Mod. 5992 A).

Aislamiento y purificación de alcaloides minoritarios por cromatografíapreparativa ultrarrápida en columna

El extracto crudo de alcaloides que quedó una vez cristalizado el alcaloidemayoritario, lupinina, se utilizó para aislar el alcaloide esparteina. El extractocrudo de alcaloides se disolvió en cloroformo y se cromatograí'ió en capa f ina(Silica gel 60 F 254, Merck) con cloroformo: ciclohexano: dielilamina (6:4:0,5).

La técnica utilizada fue la de cromatografía rápida en columna ( S t i l l vi til.,1978). Para ello se utilizó una columna de silicc (silicagel 60, 230-400 mesh) <k-7 cm de diámetro interno por 12 cm de altura. El extracto crudo de alcaloides encloroformo fue pasado a través de la columna utilizando aire como gas portador.Se recogieron fracciones de 100 mi, que fueron anali/.adas por CCi para determinar

Invi-sl. AHÍ.: l'mil, l'ml. vcg. Vul. X (.1), IW

354 M. MII/QUI/,

su pureza, en las condiciones descritas posteriormente en este trabajo, y pasadasde nuevo por columna hasta conseguir espártenla pura.

Cromatografía en capa fina

Alícuotas de 2 p,l se aplicaron en placas de silica gel 60 F254 (20 x 20 cm,250 (im, Merck), usándose como fase móvil cloroformo, ciclohexano y dietilami-na (6:4:1). Para el desarrollo de las placas se utilizó luz ultravioleta, reactivo deDragendorff y reactivo de Bouchardat.

Cromatografía de gases

Las muestras (0,2 fil) se analizaron usando un cromatógrafo de gases (PerkinElmer, Sigma IB) con detector de ionización de llama (FID) y columna capilar(Teknokroma) SPB-1 (30 m x 0,4 mm d.i.). Las temperaturas del inyector y deldetector fueron 240 y 300 °C respectivamente y la temperatura del horno fue pro-gramada de 150 °C a 235 °C a 5 °C por minuto, permaneciendo a esta temperatura15 min. El gas portador fue nitrógeno y el flujo 1,1 mi miir1.

Los alcaloides individuales se cuantificaron mediante curvas patrón.

Cromatografía líquida de alta resolución

La extracción utilizada fue la del método (b). La fase acuosa se evaporó asequedad y los alcaloides se disolvieron en 10 mi de metanol. 10 (il fueron dilui-dos en 3 mi de tampón fosfato.

El sistema cromatográfico usado fue un Beckman (System Gold) y la columnautilizada fue una Ultrasphere-ODS, 5 ¡im (25 x 0,46 cm).

La fase móvil descrita por Me Calley (1986) se usó como base para desarro-llar un nuevo solvente. Los eluyentes (acetonitrilo, tampón fosfato) fueron desga-sificados a vacío y filtrados a través de membrana Millipore HA (0,45 u.m). Elflujo fue de 1 mi min^1 y el eluyente se monitorizó a 210 nm con un detectorDiode Array utilizando una velocidad de carta de 1 cm

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A partir de semillas amargas de L. albus y L. luteus se aislaron y purificaronlos alcaloides lupanina y lupinina, respectivamente. La pureza obtenida fue de un97 p. 100 para ambos alcaloides. El espectro de masas de la lupanina se muestraen la Figura 1 y coincide exactamente con el obtenido por Wink et al., (1980). Enla Figura 2 se muestra el espectro de masas de la lupinina obtenida de semillas deL. luteus amargo, que fue exactamente igual al obtenido con un patrón de lupinina.

Para el aislamiento y purificación de esparteina, alcaloide que se encuentra enmenor proporción en la semilla, se utilizó la técnica de cromatografía preparativaultrarrápida en columna. El eluyente cloroformo: ciclohexano: dietilamina(6:4:0,5) fue el que permitió una mejor separación de los alcaloides. A partir delextracto crudo, y mediante sucesivas purificaciones, se aisló el alcaloide esparteina.Esta técnica nos ha permitido el aislamiento de alcaloides minoritarios con mayorfacilidad y rapidez que la cromatografía convencional.

l'M"IX)HI'.SANTINiniírr!V()STlllíMORIÍI'.SISri',NT1'.SI',NI.1'.(HIMINO,SAS, I

7.1-

50-

25-

l i, ll '̂,1, Jjp ,

LUPANINA

50 150 200 250 300

Fig. 1.-Espectro de masas de perclorato de lupanina aislado y purificad» u partirde semillas de L. albus

Mass spectra of ¡apanine perchlorate ohtainedfrom L. albus secdx

100^

75-

50-

25-

50 100 150 200

Ki|>, 2.-Kspectn> de masas de lupinina aislada y purificada a partir de semillas di- /. luteusMus* \i>i't'ini iifliipiriini- ixolaU'd <iml ¡tiirififtlJhwi /,. liilciix xt-nix

Invt-sl. Api-.: 1'riHl. l'K

356 M.MUZQUIZcfu / .

Para la detección de alcaloides individuales se utilizó la cromatografía en capafina. Los resultados de ecotipos y cultivares de cinco especies de lupino (Fig. 3)muestran que la lupanina (b) fue el alcaloide más común en L. mutabilis, L. albus,y L. angusüfolius. La esparteina (a) aparece en L. mutabilis y L. luteus, y la angus-tifolina (d) en L. angustifolius. En las especies L. luteus y L. hispanicus, el alcaloidedominante fue la lupinina (e). La lupanina no se encontró en estas especies. Laesparteina se detectó en algunas variedades y ecotipos de L, luteus estudiadas.Solamente en L. hispanicus ssp bicolor se encontró epilupinina (f). Un alcaloidede naturaleza indólica, no quinolizidínica, la gramina (g) apareció en las dossubespecies del L. hispanicus (ssp hispanicus y ssp bicolor). Este alcaloide apare-ció en alguna muestra de L. luteus pero no se detectó en ninguna de las otras espe-cies estudiadas.

Para la determinación de alcaloides se han comparado dos métodos de extrac-ción usando dos especies diferentes de Lupinus: L. albus (LO 2423) y L. luteus(LO 2915), cuantificándose por cromatografía de gases. Los contenidos de losalcaloides mayoritarios de estas especies aparecen en la Tabla 1. Los dos métodosdieron resultados muy semejantes, mostrando ambos una alta reproducibilidad(coeficientes de variación inferiores al 5 p. 100) tanto para los alcaloides que pre-sentan tanto altas como bajas concentraciones. El método (b) es sin embargomucho menos complicado y con él pueden analizarse tres veces más muestras enun día que con el método (a). Con el método de extracción (b), y cromatografía degases, se han cuantificado los alcaloides de diferentes muestras dulces y amargasde lupino cuyos valores aparecen en la Tabla 2. Puede observarse que este métodopermite cuantificar alcaloides en muestras que presentan contenidos muy bajos delos mismos. Mediante esta técnica, además de los alcaloides cuantificados se handetectado otros alcaloides, como la albina, que no se ha podido cuantificar porfalta de patrones.

Debido a que en algunos casos es necesario analizar cantidades pequeñas demuestra se ensayó la técnica de CLAR. Existen pocos datos en la bibliografíasobre análisis de alcaloides del lupino mediante dicha técnica, por lo que sedesarrolló un nuevo método basado en los de Hermans-Lokkerbol et al., (1989) ySaito et al., (1989), este último utilizado en alcaloides lupinánicos de Thermopsislupinoides y T. chinenesis. Para ello se ensayaron diferentes sistemas cromatográ-

TABLA 1

CONTENIDO DE ALCALOIDES (mg/g de M.S. ± error típico)DE DOS MUESTRAS DE LUPINUS

Alkaloid contení (mg/g D.M. ± std. error) oftwo samples of Lupinus

Lupinus albus

Método aMétodo b

lupanina

21,0 + 0,8920,3 ± 0,90

13-OH-iupanina

0,9 + 0,020,8 ± 0,03

lupinina

3,5 ± 0,093,8 ±0,10

Lupinus luteus

esparteina

0,9 + 0,031,0 ±0,02

gramina

0,4 + 0,020,7 ± 0,03

La cuantificacíón se realizó por CG. Ver Material y Métodos para detalles experimentalesThe (fuautitalion wax carnea oul by GC. See Malcriáis and Melhodx SSCtionjor jwrther dciails

l:A("l'Olíi;S ANTINiri'KlTIVOS'niRMORItESISTÜN'l'HSlíN l . l í í I I I M I N O S A S .

/,. allms L. angustifolius

&O O O Oo o o O c=>

o o o

'•» c» o o O c

o o ° £>OOOOO

t> a, o o °

O O o O O

O O ü O OO O O O "

1 2 3 4 5 6 7 8

L. mutabilis L. luteus

O O O O O

o oC, o

o o

<±> CÍo o

O

8

2 3 4 5 6

o o o O

O o

1 2 3 4 5 6 7 H «)

L. hispanicus

OQoflOoflflOOOúOOoW

Fig. 3.-Cromatografía en capa fina de extractos de aloiltiides de diferentes cultivares de /..L. angustifolius, L. mutabilis, I,. Luteus y L. hispanicus

Diagramatic represí'nttilion o/Tl.C ojalkaloui extracmjront ¡iiffi'ri'ni L tilhitx. I,, (in^uxlifnl/,. niiittihilix, L. Inicua, /,. fii.\i>finifii.\

¡t: cspurli-inu. sfHítl,-iii,•; b: It ipjimiui, liii>iiniiiá\1: H Olí l u p m i í i m . M Olí ln¡><uiiin'; d: n i i p i i s l i l i i l i i m .ftilim1; v: l i i p i í i m . lut'ininr. f: r p i l u p i i i i i i i t , c/ii/ií/nw/wc. (¡: pnimiim. xraminr

Invcsl , A>-i l 'nul l 'inl vi-0. Vul . H t I ) , l'J'H

JM. Mll/Ql]]/ f l a l .

TABLA 2

< :ONTENIDO DE ALCALOIDES (mg/g de M.S. ± error típico)I'.N D1FKRKNTES ESPECIES DE LUPINUS CUANTIFICADO POR CG

AI ka I oíd contení (mg/g DM. + std. error) in different species of Lupinasquantified by GC

Especies

¿.a//wisL01584A../,.<rf&HsL023947A.L albas N 903L fl/ími N 906L iuteus 304L. angusiifolius 201 ..

13-OH lupanina

. 0,30 ±0,01

. 0,60 ±0,02

. 1,90 + 0,04

lupanina

16,00 ±0,3030,00 + 0,400 20 + 0,010,50 + 0,02

70,00 ±0,59

angustifolina gramina

-

1,30 ±0,05

esparteina

-

1 50 + 0 09

lupinina

-

5 90 + 0 08

(-) No detectadoSe utilizó el método (b) de extracción y purificación

fieos en los que se varió el pH y las proporciones de los solventes. En la Tabla 3Aaparecen los tiempos de retención de distintos alcaloides del lupino con estos sis-temas cromatográficos, en donde se puede observar un aumento en los tiempos deretención a medida que aumenta el pH. Por el contrario según aumenta la faseorgánica del solvente (acetonitrilo: tampón fosfato) se acortan los tiempos deretención. El mejor sistema de solvente fue un gradiente (curva convexa) de aceto-nitrilo: tampón fosfato pH 3,5, cambiando de 20:80 a 10:90 durante 20 min, ymanteniendo las condiciones finales 10 min más. Usando este sistema se consigueuna mejor resolución de los alcaloides que salen en primer lugar sin retrasar eltiempo total de análisis (Tabla 3B). Estas condiciones fueron usadas para la deter-minación cuantitativa de alcaloides en diferentes especies de lupino utilizandopara la extracción el método (b) (Tabla 4). Las curvas de calibrado para los cincoalcaloides cuantificados mostraron que la respuesta fue lineal para un rango deconcentración de 1-600 |¿g mh1, con un coeficiente de correlación de 0,99, excep-to para la esparteina.

Los resultados obtenidos (Tabla 4) muestran que los alcaloides detectados(13-hidroxilupanina, lupanina, angustifolina y gramina), aparecen en concentra-ciones similares a las encontradas por Muzquiz et al., (1989), mediante CG. Nofue posible determinar el nivel de esparteina, o detectar lupinina y epilupinina.Este método podría ser útil en programas de mejora de L. albus, donde la lupaninaes el alcaloide mayoritario y el que interesa detectar, para comprobar si se estánobteniendo variedades dulces.

CONCLUSIONES

El método de extracción (b) propuesto en este trabajo es un método rápidoque permite analizar alcaloides en el laboratorio en un gran número de muestras.Con este método las semillas son destruidas, por lo que habría que conseguirmétodos no destructivos de cuantificación de alcaloides, además de los ya exis-tentes (papel Dragendorff y test de fluorescencia), que ayudaran a genéticos ymejoradores en sus programas de mejora. Actualmente se están llevando a cabo

l 'AMom-s ANTINIITR1TIVOSTERMORRBailTBNTBS BN I Hi l iMlNosAS i

TABLAS

TIEMPO DE RETENCIÓN (min) M! ALCALOIDES DLL L U P I N OKN CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DK ALTA RESOLUCIÓN

UTILIZANDO DIFERENTES SISTHMAS DE SOLVL'NTKS

Ketcníion lime (min) of alkaloids of lupia in 11 TLC nxitig tlifferenlaolvent svsicms

Solvente

acetonitrilo:lampón 13-hidroxilupanina lupaninafosfato

A)pH2,5

pH3,5

pH4,0

B)

pH3,5

(15:85)(20:80)

(12:88)(15:85)(20:80)

(15:85)

(20:80)a

(10:90)

3,243,09

3,293,333,03

3,51

3,82

3,943,10

4,034,103,03

4,44

4,95

Alcaloides

angustifolina graminu csparteina

5i583,72

5,675,843,04

6,67

6,15

9,716,06

9,51 11,711 1 . 1 1 10,714,56 6,02

11,81

8,33 9,55

lupininu v¡) i l i i | ) Í i i ini i

[1,9012,60

-25,787,% B.32

-

-

(-) No detectado

TABLA 4

CONCENTRACIÓN DE ALCALOIDES (mg/g de M.S. + error Ifpico)EN DIFERENTES ESPECIES DE LUPINUS

Concentraron of alkaloids (mg/g D.M. ± sld. error) in different speciesofLupinm

Especies

..albus 4080.. Iuteus Irycl, lulcus X408,. angustifoliiiK llnicrop ....,. angusuTolius AN 4K58A ..

,. liispiiniciiN ssp bicolor ....

13-OH lupanina

0,41 ± 0,02

2,W)±0,130,91 ±0,01

lupanina angustifolina graminu

074±0 1220,26 + 0 27

0 H(> i 0 04

3,45 ±0 ,1 3 1,X7±0,051 2.KO ± 0 54

2,63:1 0,1')

•sptirl i'lnu

-

-

-

l.as i l i ' lo r i l i t iu t i ' i iHi i - s si- iv i iM/ i i i im r i K - d i m i l o uom;iUif' .r;ih;i l i q u i d a ikl ; i l | : i resol lie ¡(StlTin- dtttftntnOtÍQRÍ HT;C inutif h\ ('

I n v r M A ) > i l ' nu l !'...! v.-n Vul H l

irahajos, en colaboración con el «Centre de Recherches Agronomiqucs» de Bél-gica, en análisis de alcaloides con técnicas de NIRS dentro de un ProgramaIÍCLA1R (AGRE -CT 90-0048) de la CE.

En la última Conferencia Internacional del Lupino se acordó que la cromato-grafía de gases con columnas capilares sea aceptada como método oficial a la horade hacer trabajos en colaboración entre distintos laboratorios del mundo (Harris,1991; Trugo et al., 1989). Esta técnica es, sin duda, la mejor para cuantificar losalcaloides, ya que no es necesario derivatizar las muestras y en las condicionespropuestas se pueden cuantificar todos los alcaloides del lupino.

Debido a que existen muy pocos alcaloides comerciales del lupino, la purifi-cación y extracción de estos es muy importante. La CPUC es una técnica de granayuda para separar principalmente alcaloides que se presentan en las distintasespecies en menor proporción y poder así usarlos posteriormente como patrones.

El método de cromatografía líquida de alta resolución no es el idóneo a lahora de cuantificar los alcaloides de todas las especies del lupino, pero sí podríaser muy útil en programas de mejora del L. albus.

La cromatografía en capa fina es un método de gran ayuda a la hora de cono-cer qué alcaloides tenemos que cuantificar en cada especie.

AGRADECIMIENTOS

Parte de este trabajo ha sido financiado por el INIA (Proyecto n.e 8202) y por la CICYT (ProyectoALI91-1092-C02-02).

Queremos agradecer al Dr. Serafín Valverde, Director del Instituto de Química Orgánica del CSIC,su experta colaboración en las técnicas de CPUC.

SUMMARY

Determination of thermoresistant antinutritional factors in legumes.I: Alkaloids

Quinolizidine alkaloids lupanine and lupinine were isolated and purified from L. albus andL. luteus seeds with high alkaloid contení. The sparteina alkaloid was obtained using flash chromato-graphy. Two methods of alkaloid extraction were compared. Thin layer chromatography was used foralkaloid detection and the quantitation was made using gas liquid chromatography and high performan-ce liquid chromatography techniques.

KE\ LupinasAlkaloids

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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