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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

Y ECOLOGÍA APLICADA

INDUCCIÓN DE LACASAS Y CELULASAS PARA

UTILIZARSE EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL CELULÓSICO

Tesis

Para obtener el grado de

Doctor en Ciencias en Ecología y Biotecnología

QUE PRESENTA:

BIOL. CHRISTIAN ARTURO HERNÁNDEZ HERNÁNDEZ

DIRECTOR

Dr. Enrique Alarcón Gutiérrez

XALAPA, VER. MAYO 2016

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INDUCCIÓN DE LACASAS Y CELULASAS PARA

UTILIZARSE EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL CELULÓSICO

El presente trabajo se ha realizado dentro del Cuerpo Académico Estructura y

Funcionamiento de los Ecosistemas Forestales CA-UVER-324, línea de

generación y aplicación del conocimiento Ecología Microbiana e

interacciones biogeoquímicas planta-suelo-microorganismos, bajo la

dirección del Dr. Enrique Alarcón Gutiérrez y subvencionado por el proyecto

ECOS-NORD Mexique M13A02

Asímismo, el autor agradece al Centro de Biotecnologia, Escola de

Engenharia de Lorena de la Universidade de São Paulo; al Centro de Estudios

Multidisciplinarios en Biotecnología de la Universidad Michoacana de San

Nicolás de Hidalgo; al Institut Méditerranéen de Biodiversité et d’Ecologie

Marine et Continentale, y al Spectropole de la Aix Marseille Université; al

Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca, por contribuír al desarrollo

de la presente tesis.

Se agradece también al comité tutoral, integrado por el Dr. Enrique Alarcón

Gutiérrez, la Dra. Beatríz Gutiérrez Rivera, el Dr. Sergio Martínez

Hernández, y el Dr. Ángel Trigos Landa, por su consejo y revisión de la

presente tesis.

El autor agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México

(CONACyT), por la beca de manutención otorgada para realizar los estudios

doctorales. A la Red de Macrouniversidades de América Latina, al gupo

financiero Santander, al CONACyT y al Gobierno Francés, por las becas para

realizar estancias de investigación y movilidad internacional.

Atentamente

Christian A. Hernández Hernández

Xalapa Veracruz, 27 de mayo de 2016

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Este trabajo lo dedico para mis padres y hermano,

gracias por llenar mi vida de alegrías y compartir conmigo esta pasión por la ciencia

(porque yo sé que también la sienten)

Descubrir que lo extraordinario,

Lo monstruosamente anormal

Es esta breve cosa que llamamos… vida

(Jaime Sabines, Otros poemas sueltos)

4

Agradecimientos

Durante la realización de esta tesis, he contado con el apoyo sincero y desinteresado de

muchas personas, a las que quisiera agradecer, pues mucho de este logro, lo debo a

ustedes: Primeramente, a mi director el Dr. Enrique Alarcón, por guiar durante los últimos

7 años mi formación científica, por el ánimo, consejo, la confianza y las grandes

enseñanzas, por ser más que un tutor, un amigo; siempre te estaré agradecido. A mis

compañeros de generación, por los ánimos y las experiencias, gracias por dejarme

aprender de ustedes. A mis amigos, los ¡inbio power!, Leo, Lucho y Luis J. ustedes saben

por qué (jaja), a todo el equipo del CMEB-Morelia, por su apoyo durante mi estancia para

la identificación de mis cepas de hongos, especialmente al Dr. Gerardo, Dra Saila y a mi

amiga Heidi. A la Dra. Adriane Milagres por recibirme en su laboratorio en Brasil, a mis

compañeros de laboratorio y a mis roomies de la RepSemNome (Catra, Du e Lumbriga),

obrigado sempre!. Al equipo francés que me recibió en Marsella, a la Dra. Isabelle Gaime,

por tanta hospitalidad, a la Dra. Anne Marie Farnet y al Dr. Fabio Ziarelli por su apoyo, a

Carolina, Bubú, Mary, Quentin et Sonia, merci beaucoup!. Al equipo de Tierra Blanca,

especialmente a la Dra. Beatríz y a la técnico Lucero, por su apoyo con los análisis de

HPLC.

A mis compañeros de laboratorio que hicieron los días de trabajo tan amenos, a Darcy (la

capitana), Vico (por las pláticas eternas), Gera, Miriam, Marycruz (cuñis) y Evelin, y

especialmente a Gabi y a Norma, por apoyarme en mi etapa de experimentación. A Anahí,

por todo tu cariño y paciencia durante el cierre de esta etapa tan importante, gracias. A mis

amigas, las más creativas y artistas de todas, Isabela, Arely, Faby y Griss, que me han

acompañado durante este viaje. A Heidi.Co, Adri y Karla, por su amistad cuando apenas

iniciaba el doctorado; así como a César, Chucho, Yeye (del rock!), Angie, Clau, a Paulina y

Eli, Don Ale (brasileiro), Paty, Fer (Pollita) y Ricardo, por su constante y apreciable

amistad, y por los momentos compartidos.

A todos aquellos que han contribuído a esta historia… mis más sinceros agradecimientos,

sin ustedes, estos sería un cuento vacío.

Christian

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Índice

Resumen

Lista de publicaciones

Lista de asistencia a congresos

Lista de estancias de investigación

Lista de figuras

Lista de tablas

I. Introducción general

1.1 El bioetanol celulósico

1.2 El proceso de producción de bioetanol celulósico

1.3 El bagazo de caña de azúcar como materia prima para la producción de bioetanol

II. Estado del arte

2.1 Métodos de pretratamiento para lignocelulosa

2.1.1 Pretratamientos fisicoquímicos

2.1.2 Pretratamientos biológicos

2.1.3 Las lacasas

2.2 Las celulasas

2.2.1 Organismos productores de celulasas

2.2.2 Métodos de producción de celulasas

2.3 La hidrolisis y fermentación

2.3.1 La hidrólisis enzimática

2.3.2 Fermentación alcoholica

2.4 Planteamiento del problema

III. Preguntas de investigación

3.1 Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar

3.2 Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-sacarificación

simultánea

IV. Hipótesis

4.1 Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar

4.2 Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-sacarificación

simultánea

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V. Objetivos

5.1 Objetivo general

5.2 Inducción de lacasas

5.3 Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-sacarificación

simultánea

VI Metodología general

6.1 Etapas del proyecto

6.2 Etapa 1. Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar

6.2.1 Efecto de la exposición a luz sobre la producción de lacasa

6.2.2 Efecto del etanol, la fuente y concentración de nitrógeno sobre la producción de lacasa.

6.2.3 Evaluacion de colorantes fenólicos como inductores de actividad lacasa

6.3 Etapa 2. Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-

sacarificación simultánea

6.3.1 Bioprospección de cepas de hongos productoras de celulasas de mantillo de bosques

veracruzanos

6.3.2 Efecto de la interacción de diferentes cepas de hongos sobre el perfil de celulasas producido.

6.3.3 Bioprospección de hongos productores de celulasas del Parque Nacional Pico de Orizaba.

6.4 Etapa 3. Digestibilidad enzimática de BCA sometido a diferentes pretratamientos

VII. Resultados

7.1 Capítulo 1. Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar

7.1.1 Light-induced inhibition of laccase in Pycnoporus sanguineus

7.1.2 Ethanol induction of laccase depends on nitrogen conditions of Pycnoporus sanguineus

7.1.3 Laccase induction by synthetic dyes in Pycnoporus sanguineus (L.), and their use for sugar

cane bagasse delignification

7.2 Capítulo 2. Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-

sacarificación simultánea.

7.2.1 Cellulases and xylanases production with different fungi (Ascomycota) mixed cultures in

liquid media.

7.2.2 Cellulases produced from Pico de Orizaba’s cold-ecosystem fungi, hydrolyze at lower

temperature than cellulase from Trichoderma reesei?

7.3 Capítulo 3. Digestibilidad enzimática de BCA sometido a diferentes pretratamientos

7.3.1 Sugar cane bagasse pretreatments analysed through solid-state 13

C CPMAS NMR:

implications for enzymatic hydrolysis and fermentation

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VIII. Discusión general

IX. Conclusiones generales

X. Referencias

XI. Anexos

11.1 Curva de calibración para estimar actividad xilanasa

11.2 Curva de calibración para estimar actividad endoglucanase

11.3 Curva de calibración para estimar actividad exoglucanasa

11.4 Curva de calibración para estimar poteína total por el método de Bradford

11.5 Curva de calibración semilogaritmica para estimar peso molecular de isoformas proteicas en

gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

11.6 Protocolo para evaluar la concentración de azúcares reductores en solución

11.7 Protocolo para evaluar la actividad lacasa en cultivos liquidos

11.8 Protocolo para estimar la cantidad de proteína en solución por el método de Bradford (1969)

11.9 Modelos de regresión lineal para estimar la concentración de colorantes en solución líquida

11.10 Protocolo para extracción de ADN

11.11 Curvas de calibración utilizadas para el calculo de actividad celulasa por FPU

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Resumen

La búsqueda de nuevas fuentes energéticas, alternativas a los derivados de petróleo, ha señalado al

bioetanol como una opción viable en el corto y mediano plazo; este alcohol es producido a partir de la

fermentación de azúcares con levaduras o bacterias. Sin embargo, el uso de materias primas ricas en

almidones, como los cereales (maíz, trigo), o ricos en sacarosa (jugos o azúcar de caña) para la

producción de alcohol, puede no ser conveniente en economías en vías de desarrollo. Es por ello, que la

transformación de polímeros estructurales vegetales, como la celulosa o la hemicelulosa, hasta sus

monómeros de azúcar, podría suplir la demanda de azúcares necesarios para la producción de bioetanol.

Este biocombustible de segunda generación, llamado bioetanol celulósico, enfrenta diversas

problemáticas para que su producción pueda ser escalada a nivel industrial, debido a la recalcitrancia de

la lignocelulosa. Las dos principales son la de optimizar un pretratamiento que aumente la digestibilidad

de la lignocelulosa y la de diseñar un complejo de celulasa que cumpla los requerimientos necesarios

para lograr una hidrólisis completa de celulosa hasta glucosa. Su principal ventaja es que la materia

prima existe en abundancia y es de bajo costo; pues podrían utilizarse residuos de la agroindustria, como

el bagazo de caña de azúcar.

Para aumentar la digestibilidad de la lignocelulosa, el pretratamiento debe ser de bajo costo, debe

depolimerizar la mayor cantidad de lignina, disminuír el índice de cristalinidad de la celulosa y evitar la

formación de compuestos inhibitorios de celulasas u organismos fermentadores. Por otro lado, las

celulasas (y en algunos casos xilanasas) utilizadas para la hidrólisis de holocelulosa, deben ser de alta

capacidad catalítica, tener un balance entre actividades exo, endo y β-glucosidasa, y es deseable que el

complejo hidrolítico sea rico en isoformas, pues esto contribuye a una mejor hidrólisis del sustrato. Las

características intrínsecas de las enzimas, como su temperatura óptima de reacción y su actividad

específica son muy importantes cuando se les desea proponer para procesos de producción de bioetanol.

El presente proyecto, busca generar conocimiento en el campo de la inducción de enzimas estratégicas

para utilizarse en las fases de pretratamiento e hidrólisis del proceso de producción de bioetanol

celulósico.

El primer objetivo fue optimizar un pretratamiento biológico para bagazo de caña de azúcar, utilizando

el hongo Pycnoporus sanguineus; para esto, se evaluaron diversas variables fisicoquímicas para

aumentar la producción de la enzima lacasa en este hongo. La lacasa es la enzima responsable de

depolimerizar la lignina y contribuir en el conocimiento sobre la regulación de su producción es un paso

fundamental para poder utilizar hongos basidiomicetos para deslignificar material lignocelulósico.

Encontramos que la lacasa en P. sanguineus, puede regularse mediante señales lumínicas; la presencia

de luz blanca –en el espectro de luz visible- inhibe casi completamente la producción de esta enzima,

mientras que, en condiciones de oscuridad, es producida. Al fraccionar la luz blanca en luz azul, verde y

roja, encontramos que la inhibición es mayor cuando P. sanguineus está expuesto a longitudes de onda

corta, ya que longitudes de onda larga solo inhiben parcialmente su producción. En la sección de

Resultados 1.1, se discute esta inhibición lumínica de la producción de lacasa.

Además, probamos que la producción de lacasa en P. sanguineus responde al tipo y concentración de

nitrógeno en el medio; asimismo, esta regulación condiciona el efecto de inductores oxidantes, como el

etanol. Nuestros resultados indican que la presencia de fuentes de nitrógeno simples (i.e. urea) reprimen

la producción de lacasa, mientras que fuentes complejas (i.e. extracto de levadura) la inducen

(Resultados 1.2). Atribuímos este resultado al mecanismo de represión catabólica del nitrógeno. Se

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probó también el uso de azo-colorantes y colorantes antraquinónicos (ambos producidos y desechados

por la industria textil) como posibles inductores de lacasa en medio líquido. Encontramos que el ácido

carmínico y el amarillo de alizarina, pueden fungir como potentes inductores en medio líquido

(Resultados 1.3); además, esta inducción es acompañada por la degradación de colorantes, via oxidación

enzimática.

Las condiciones de oscuridad, fuente de nitrógeno orgánico y presencia de inductor antraquinónico, nos

permitieron obtener una hiperproducción de lacasa en medio líquido (700% más que en controles); por

lo que el siguiente paso, fue evaluar el efecto de dichas condiciones en cultivos sólidos de P. sanguineus,

utilizando bagazo de caña de azúcar como sustrato. Se observó que la inducción de lacasa persiste en

medio sólido, aunque en menor medida que en medio líquido; se observó también una ligera represión

en la producción de celulasas y biomasa fúngica, cuando el ácido carmínico es usado como inductor

(Resultados 1.3). La transformación de la lignocelulosa por el hongo fue seguida mediante Resonancia

Magética Nuclear en fase sólida del carbono 13 (13

C CPMAS NMR); y observamos que los tratamientos

con P. sanguineus remueven más del 50% de la lignina contenida en el bagazo, superando a tratamientos

con soluciones alcalinas de NaOH y Ca(OH)2 al 5%. Asímismo, P. sanguineus disminuyó un 40% el

banco de carbohidratos, pero incrementó significativamente la cantidad de proteína y lípidos en el

bagazo. El rendimiento de hidrólisis enzimática y la producción de glucosa del bagazo de caña

pretratado, tanto con P. sanguineus como con soluciones alcalinas, fue relacionado a la composición

química obtenida por los pretratamientos, mediante estadística multivariada. Encontramos que el

pretratamiento con P. sanguineus, tiene una producción de glucosa y un rendimiento de hidrólisis

mayores que los demás pretratamientos; además, el hidrolizado obtenido tiene mayor rendimiento de

producción de etanol que los hidrolizados obtenidos de bagazo pretratado con soluciones químicas. En

conclusión, las condiciones de inducción de lacasa en medio líquido y medio sólido, permiten utilizar a

P. sanguineus como pretratamiento biológico que deslignifique bagazo de caña de azúcar y lo enriquezca

de proteína y lípidos; lo que promovió un mayor rendimiento de hidrólisis y de producción de etanol

(Resultados 3.1).

El segundo objetivo fue la producción de celulasas, con características que las hicieran elegibles para ser

utilizadas en la etapa de hidrólisis de lignocelulosa. Para esto, se realizaron diversas prospecciones en

mantillo de bosques veracruzanos, obteniéndose diferentes cepas de hongos productores de celulasas; las

cuales fueron identificadas mediante secuenciación de la región ITS. Cuatro de estas cepas fueron

utilizadas para evaluar el efecto de utilizar cultivos mixtos sobre el perfil de celulasas (exo, endo y β-

glucosidasas), xilanasas e isoformas proteicas en medio líquido. Nuestros resultados señalan que, con

excepción del cocultivo Aspergillus niger-Fusarium oxysporum, el uso de cultivos mixtos tiende a

disminuir las actividades enzimáticas, afectando principalmente a las xilanasas. De la misma manera, se

observó una disminución en la producción de isoformas proteicas, por lo que concluímos que el uso de

cultivos mixtos, con las condiciones aquí descritas, generan estrés biótico a las cepas, lo que afecta

negativamente su producción enzimática (Resultados 2.1). Se realizaron diversas recomendaciones para

mejorar el sistema de producción enzimática.

Se realizó una segunda prospección en el volcán Pico de Orizaba, con el fin de aislar cepas adaptadas a

degradar lignocelulosa en temperaturas frías. La producción de endoglucanasas y β-glucosidasas se

evaluó con diferentes fuentes de carbono, y determinamos que la lactosa –un azúcar reductor- propició

mejor producción enzimática. Los extractos crudos fueron dializados y a la enzima concentrada se le

evaluó su temperatura óptima de reacción (TOR). Encontramos que las celulasas de hongos habitantes

del Pico de Orizaba, producen celulasas con TOR generalmente mesófila (cercana a 30° C), a diferencia

11

de cepas de Trichoderma, las cuales producen celulasas con TOR de 50° C. Las celulasas mesófilas,

producidas por una cepa que pertenece a la familia Pleosporaceae, podrían utilizarse en procesos de

fermentación-sacarificación simultánea, pues poseen alta actividad enzimática a la temperatura (30° C),

requerida para la fermentación (Resultados 2.2). En conclusión, el uso de prospecciones de hongos de

mantillo es una importante actividad para el descrubrimiento de nuevas cepas productoras de xilanasas y

celulasas, las cuales poseen características diferentes a las de Trichoderma o Aspergillus. Se requiere de

más esfuerzo en este campo, sobre todo en ecosistemas con condiciones extremas, puesto que son

fuentes potenciales de organismos extremófilos, que podrían aportar nuevas enzimas con aplicaciones

bitoecnológicas.

La producción de bioetanol celulósico es una importante alternativa para suplir las necesidades

energéticas actuales y futuras. Las enzimas microbianas (como lacasa, celulasa y xilanasa) tienen y

tendrán un rol primordial en el proceso de producción de bioetanol, por lo que entender los mecanismos

de regulación/expresión de estas enzimas, es de gran importancia científica.

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Lista de publicaciones

Articulos publicados

Hernández CA, Sandoval N, Mallerman J, García-Pérez JA, Farnet AM, Perraud-Gaime I, Alarcón E.

2015. Ethanol induction of laccase depends on nitrogen conditions of Pycnoporus sanguineus.

Electronic Journal of Biotechnology 18(2015): 327-332 http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbt.2015.05.008

Hernández CA, Perroni Y, García JA, Gutiérrez B, Alarcón E. 2015. Light-induced inhibition of

laccase in Pycnoporus sanguineus. Folia Microbiológica DOI 10.1007/s12223-015-0418-7

Christian Hernández, Anne-Marie Farnet Da Silva, Fabio Ziarelli , Isabelle Perraud-Gaime, Beatriz

Gutiérrez-Rivera, José Antonio García-Pérez, Enrique Alarcón. 2016. Laccase induction by synthetic

dyes in Pycnoporus sanguineus and their use for sugar cane bagasse delignification. Applied

Microbiology and Biotechnology (Aceptado).

Hernández C. 2012. Apuesta biotecnológica: etanol de segunda generación. La Ciencia y el Hombre

XXVI(1).

Articulos sometidos

Hernández C, Milagres A, Vázquez-Marrufo G, Alarcón E. 2016. Cellulase and xylanase production

from different Ascomycota in mixed cultures of liquid media. Enzyme and Microbial Technology

(Sometido el 26 de mayo de 2016).

Lista de participación en congresos

Internacionales

Hernández-Hernández CA, Alarcón-Gutiérrez E, Perroni Ventura Y. 2013. Laccase is inhibited by

white light in Pycnoporus sanguineus. 9 Congreso internacional de biotecnología vegetal, Ciego de

Ávila, Cuba. ORAL

Hernández C, Milagres A, Alarcón E, Gaime I, Farnet AM, Espinoza V, Gutiérrez B. 2014. Production

of fungal cellulases and xylanases in mixed cultures. XVI International biodeterioration and

biodegradation symposium, Lodz, Polonia. POSTER

Nacionales

Hernández C, Milagres A, Alarcón E. 2014. Prospección de hongos productores de celulasas en

mantillo de bosques veracruzanos. V Simposio: Ecología, manejo y conservación de los ecosistemas

de montaña en México, Xalapa, México. POSTER

13

Hernández C, Alarcón E. 2015. Uso de colorantes aromáticos para la inducción de lacasa en

Pycnoporus sanguineus. XI Congreso Nacional de Micología. Mérida, Mexico. ORAL

Hernández C, Ziarelli F, Farnet Da Silva AM, Gaime I, Alarcón E. 2015. Uso de resonancia magnética

nuclear (RMN 13

C CPMAS) para evaluar la deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar. II

Reunión de la Red Temática de Bioenergía. Ixtapa, México. POSTER

14

Lista de estancias de investigación

Lugar Periodo Fuente de financiamiento Investigador responsable

Universidade de São Paulo, Escola

de Engenharia de Lorena, Centro de

Biotecnología, Lorena, Brasil

Febrero – Junio 2014 Beca de grupo Santander y

RED MACRO

Beca Mixta CONACyT

Dra. Adriane Milagres

Universidad Michoacana de San

Nicolás de Hidalgo, Centro de

estudios multidisciplinarios en

Biotecnología, Morelia, México

Noviembre –

Diciembre 2014

Beca de doctorado

CONACyT

Dr. Gerardo Vázquez

Marrufo

Aix Marseille Université, Faculte ́

des Sciences et Techniques de

Saint-Jérôme, Spectropole y Equipe

Systèmes Microbiens

Septiembre –

Noviembre 2015

Proyecto ECOS-NORD

Mexique M13A02

Beca para realizar estancias

cortas en Francia de

CONACyT

Dra. Anne Marie Farnet Da

Silva

Dr. Fabio Ziarelli

Dra. Isabelle Gaime

Universidad Michoacana de San

Nicolás de Hidalgo, Centro de

estudios multidisciplinarios en

Biotecnología, Morelia, México

Abril – Mayo 2015

Beca de doctorado

CONACyT

Dr. Gerardo Vázquez

Marrufo

Instituto Tecnológico Superior de

Tierra Blanca

Abril – Mayo 2016

Beca de doctorado

CONACyT

Dra. Beatriz Gutiérrez

Rivera

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Lista de figuras

1. Relación entre la concentración de CO2 atmosférico y la temperatura de la superficie planetaria.

2. Producción de etanol mundial, en miles de barriles diarios.

3. Panorama futuro de producción de biocombustibles

4. Estructura de las fibras de celulosa

5. Ruta metabólica de fermentación alcohólica a partir de glucosa

6. Ruta metabólica común de transformación de xilosa a etanol

7. Bagazo de caña de azúcar del ingenio La Gloria, municipio de Úrsulo Galván, Veracruz

8. Interacción entre cadenas de celulosa y componentes de lignina

9. Deshidratación de xilosa hasta furfural

10. Oxidación de subunidades fenólicas de la lignina por lacasa

11. Modo de oxidación de compuestos no fenólicos de la lignina, utilizando un mediador

12. Modo de acción de celulasas de Trichoderma reesei

13. Representación de los diferentes factores que regulan la expresión de celulasas y xilanasas

14. Esquema general de la organización del proyecto de tesis

15. Cámaras de luz LED construidas para evaluar el efecto de exponer a diferentes longitudes de

onda de la luz al hongo P. sanguineus sobre su producción de lacasa

16. Medición de la actividad lacasa por espectrofotometría

17. Colorantes fenólicos evaluados como inductores de lacasa en cultivos de P. sanguineus

18. Cultivos liquidos de P. sanguineus

19. Prueba cuantitativa de producción de celulasas por tinción con rojo Congo

20. Cultivos liquidos de hongos filamentosos empleados para la producción de celulasas en

cocultivos y policultivos

21. Concentración de proteína mediante liofilización para la caracterización del perfil de isoformas

protéico

22. Sitios de muestreo en la cara nororiental del volcán Pico de Orizaba

23. Toma de muestras de mantillo en campo

24. Toma de muestras para determinación de actividad celulasa de cultivos de hongos

25. Concentración de proteína mediante diálisis en membrana tubular de celulosa

26. Mapa de la regulación de la producción de lacasa en P. sanguineus

16

Lista de tablas

1. Efecto del uso de diferentes agentes alcalinos sobre la composición estructural del bagazo de

caña de azúcar

2. Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar utilizando hongos de pudrición blanca

3. Estudios de bioprospección de organismos celulolíticos

4. Condiciones de hidrólisis de bagazo de caña de azúcar

5. Condiciones de fermentación de azúcares derivados de lignocelulosa

6. Combinaciones de cepas evaluadas para producir celulasas en cultivos liquidos

17

1. Introducción general

________________________________________

18

1.1 El bioetanol celulósico

El bioetanol (CH3CH2OH) o etil alcohol, es un líquido sin color, volátil y flamable con un peso

molecular de 46.07 g y una densidad de 789 kg/m3 a 294 K (Baeyens et al., 2015). Puede utilizarse

como combustible alterativo a la gasolina y es considerado de emisiones de carbono neutras debido

a que se produce a partir de la fermentación de azúcares simples (generalmente hexosas). Dichos

azúcares derivan del proceso de fotosíntesis que utiliza el CO2 ambiental para su producción, a

diferencia de los combustibles fósiles, los cuales utilizan carbón subterráneo que al quemarse se

libera a la atmósfera, y contribuye a un aumento del CO2 ambiental. Este aumento causa, entre otros

problemas, un aumento en la temperatura atmosférica llamado calentamiento global (Figura 1);

(Hausfather, 2009).

El bioetanol puede utilizarse de manera pura en motores de combustión interna; sin embargo, para

la mayoría de los automóviles se requieren adecuaciones para funcionar con bioetanol puro. Esto se

debe a que el etanol posee un octanaje mayor que la gasolina (i.e. 113 octanos para etanol, 87

octanos para gasolina Magna PEMEX), lo cual requiere modificación del sistema de carburación;

pero a la vez, mayor octanaje brinda mayor potencia al motor, gracias a que la capacidad de

compresión aumenta, disminuyendo con esto el uso de combustible.

El bioetanol también puede utilizarse como aditivo de gasolina hasta en una proporción de 30% sin

necesidad de modificaciones mecánicas. Las mezclas más comunes utilizadas son el E5, E10 y el

E85. El etanol, al ser una molécula oxidante, puede reemplazar el uso de Metil-terbutil éter (MTBE)

como oxigenante de gasolinas; el MTBE es una molécula contaminante que puede causar estragos

en la salud humana y al ecosistema (Peyster y Mihaich, 2014; Rakshit et al., 2013).

La demanda mundial de bioetanol y su respectiva producción ha aumentado significativamente los

últimos 20 años (Figura 2), siendo los principales productores Brasil, que lo produce a partir de jugo

de caña de azúcar, y Estados Unidos, que lo produce en su mayoría a partir de almidón de maíz.

Este tipo de etanol es conocido como bioetanol de primera generación, esta categoría engloba a la

producción de bioetanol que derivada de fuentes alimenticias para el ser humano (e.g. azúcar de

caña, maíz, remolacha azucarera) y, a pesar de haberse constituído como una industria millonaria y

en constante crecimiento, se recomienda que en economías en desarrollo se utilicen materias primas

no comestibles para la producción de este combustible (Baeyens et al., 2015); además, su balance

energético no arroja emisiones de carbono neutras, pues se requiere de energía fósil para producir

las plantas que terminan siendo materia prima para la industria.

19

Figura 1. Arriba: Medición mensual de CO2 atmosférico. Datos del observatorio Mauna Loa y del HadCRUt. Abajo:

Anomalías en la temperatura promedio planetaria, datos del HadCRUt 3 y 4.

Debido a esto, se ha sugerido el uso de otro tipo de biomasa para suplir la demanda de bioetanol; en

este contexto, los azúcares contenidos en los polímeros de celulosa y hemicelulosa son los

principales candidatos para fungir como materia prima para esta industria. Entre las ventajas de

utilizar fuentes celulósicas en lugar de almidones o sacarosa para la producción de bioetanol están

20

que la materia prima es de menor costo, pues se utilizan subproductos de la industria alimenticia

(e.g. bagazos, rastrojos), y estos materiales no representan una fuente de alimentación primaria para

el ser humano. Además, los desechos de la agroindustria, de naturaleza celulósica, son los más

abundantes del planeta y se encuentran en diversas formas; se estima que anualmente se generan 1.5

Pg (cuatrillones de gramo) de residuos lignocelulósicos disponibles para la producción de etanol,

cuyo potencial de producción es de 442 billones de litros, que representan el 32% del consumo

mundial de gasolina (Kim y Dale, 2004). Actualmente, estos residuos se aprovechan de manera

mínima, llegando en algunos casos a representar problemas ambientales debido a su cantidad, por lo

que son quemados a campo abierto sin ningún tipo de utilización.

Figura 2. Producción de etanol mundial en miles de barriles diarios. Tomado de IEA (2013).

Sin embargo, a pesar de las diversas ventajas señaladas y de que diversos países (e.g. Estados

Unidos de América) han incluido en sus agendas de desarrollo energético el aumento de la

producción de etanol celulósico para disminuír su dependencia de combustibles fósiles (Figura 3),

con las tecnologías actuales, no es factible la producción a gran escala.

Figura 3. Panorama futuro de producción de biocombustibles en Estados Unidos de América (Tomado de Schnepf y

Yacobucci, 2013).

21

Esto debido a la compleja estructura de la pared celular vegetal la cual se compone principalmente

de tres polímeros: la celulosa, la hemicelulosa y la lignina. La celulosa puede ser definida como un

conjunto de cadenas de β anhidroglucosa, que al formar dimeros constituyen celobiosa y

posteriormente cadenas de celulosa. Las cadenas de celulosa se unen entre sí de manera lateral

mediante puentes de hidrógeno, esta organización ordenada lleva por nombre celulosa cristalina

(Figura 4) (Chun et al., 2012). La celulosa cristalina es una estructura resistente e hidrófoba, la cual

forma microfibrillas de celulosa; que se asocian entre sí y se rodean de hemicelulosa. Al estar

constituída por hexosas (i.e. glucosa), la celulosa hidrolizada puede ser fácilmente fermentada a

etanol por organismos como Saccharomices cereviceae o Zymomonas mobilis (Figura 5).

La hemicelulosa, a diferencia de la celulosa, es un heteropolímero, el cual contiene como bloques

estructurales glucosa, arabinosa, manosa y principalmente xilosa; la cual forma el esqueleto de la

hemicelulosa llamado xilano. La xilosa, es una pentosa (azúcar de 5 carbonos) la cual no puede ser

metabolizada por Saccharomyces cereviceae a etanol, únicamente por levaduras (Candida shehatae,

Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis), bacterias (Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Bacteroides,

Clostridium, Erwinia, Klebsiella, Thermoanaerobacter) y hongos (Fusarium, Monilia, Mucor,

Neurospora, Paecilomyces, Polyporus, Rhizopus) que posean la ruta metabólica necesaria (Figura

Figura 4. Estructura de las fibras de celulosa.

En primer plano se muestra una fotografía de

nanofibras de celulosa por microscopía

electrónica. Abajo, un esquema de las dos

formas en las que puede encontrarse la

celulosa (amorfa o cristalina), en el tercer

plano se muestra el esqueleto de β-

anhidroglucosa y el dímero de celobiosa

(Tomado de Chun et al., 2012).

22

6).

Figura 5. Ruta metabólica de fermentación alcohólica a partir de glucosa (Tomado de Stal y Moezelaar, 1997).

La eficiente hidrólisis de ambas fracciones: celulosa y hemicelulosa, hasta sus monómeros

estructurales, representa el potencial de la biomasa para la producción de etanol. Sin embargo, el

tercer polímero estructural de la pared celular, la lignina, dificulta los procesos de hidrólisis,

principalmente los enzimáticos, por lo que su depolimerización debe ser considerada en cualquier

proceso de producción de bioetanol celulósico.

23

Figura 6. Ruta metabólica común de transformación de xilosa a etanol (Tomado de McMillan, 1993)

La lignina, es un heteropolímero de unidades alquil-fenolicas (Yoshikawa et al., 2013) cuya función

es proveer protección y rigidez a la pared celular vegetal. Generalmente, en procesos de producción

de etanol celulósico, la celulosa es hidrolizada mediante el uso de enzimas (celulasas); sin embargo,

el contenido de lignina disminuye la capacidad catalítica de las enzimas, tanto por impedimento

estérico como por adsorción. Es por ello que la remoción de este polímero es muy importante para

aumentar la producción de azúcares simples y posteriormente de etanol.

24

1.2 El proceso de producción de etanol celulósico

Para poder transformar la compleja estructura de la lignocelulosa a etanol, se utilizan generalmente

tres etapas bien identificadas: la primera es un pretratamiento a la biomasa, con el fin de disminuír

la cantidad de lignina, la cristalinidad de la celulosa e incluso de hemicelulosa (cuando no se

requiere para etapas de fermentación). El resultado de esta etapa debe ser una biomasa constituída

principalmente por celulosa en estado amorfo, que sea propicia para la hidrólisis enzimática.

Existen diversos métodos para pretratar biomasa lignocelulósica, que pueden ser físicos, químicos,

biológicos o una combinación de los anteriores. Entre las características que debe poseer un

pretratamiento para ser considerado viable se encuentran i) que sea de bajo costo, ii) que remueva la

mayor cantidad de lignina y/o hemicelulosa, iii) que disminuya la cristalinidad de la celulosa y iv)

que no decremente significativamente la cantidad de celulosa disponible para etapas subsecuentes.

La descripción de estos procesos de pretratamiento, también llamados procesos de deslignificación

se abordará a fondo en la sección de – estado del arte -.

Debido a la gran importancia de esta etapa, el presente proyecto de tesis dedidca su primer

capítulo a a la optimización de un sistema biológico de pretratamiento de bagazo de caña de azúcar

(BCA). Se optó por utilizar un sistema biológico debido a que podría disminuír los costos de esta

etapa del proceso.

La segunda etapa del proceso de producción es la hidrólisis o sacarificación de la biomasa. El

objetivo es producir la mayor cantidad posible de azúcares simples (principalmente glucosa) a partir

de la biomasa pretratada; esto se realiza generalmente utilizando enzimas (celulasas) que a partir de

la sinergia de tres enzimas i.e. endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa son capaces de

hidrolizar la celulosa hasta sus monómeros de glucosa.

La capacidad catalítica y el costo de las enzimas utilizadas en esta etapa es determinante para la

viabilidad total del proceso. Usualmente, en plantas piloto de producción de etanol celulósico, se

utilizan enzimas comerciales de Novozymes como celluclast®; sin embargo, estas enzimas

obtenidas a partir del hongo filamentoso Trichoderma reesei poseen ciertas limitantes, como poca

actividad β-glucosidasa y un temperatura óptima de reacción de 50°C, lo cual aumenta el costo

energético del proceso. Además, Celluclast tiene un costo aproximado de $1,695.00 por 1.5 L de

solución acuosa con ≥ 700 U.g (cotización de Sigma Aldrich, 2015), lo que representa un alto costo

para la producción de etanol. La optimización de procesos de producción de celulasas es crucial

para la viabilidad de los sistemas de transformación de lignocelulosa a etanol. Este proyecto de

tesis, en su segundo capítulo, tiene como objetivo el generar conocimiento en el campo de la

25

producción de celulasas a nivel de bioreactor; así como descubrir nuevas cepas productoras de este

tipo de enzimas con la realización de bioprospecciones.

La tercera etapa es la fermentación, aquí se utilizarán los azúcares simples generados en la etapa de

hidrólisis para ser transformados a etanol. Los azúcares pueden ser glucosa o una mezcla de hexosas

(e.g. glucosa, manosa) + pentosas (e.g. xilosa, arabinosa). En el primer caso, la glucosa es

fácilmente transformada a etanol utilizando Saccharomyces cereviceae o Zymomonas mobilis, así

como tecnologías convencionales. Cuando también se hidroliza la hemicelulosa y se enriquece la

mezcla de azúcares con pentosas, es necesario utilizar organismos (e.g. Pichia stipitis) que tengan la

maquinaria matabólica para transformar pentosas a etanol.

Una opción alternativa es realizar la etapa de hidrólisis (sacarificación) y la de fermentación de

manera simultánea, esto debido a que las celulasas inhiben su capacidad catalítica a altas

concentraciones de glucosa o celobiosa (inhibición por producto). Fermentar los azúcares liberados

por las enzimas de manera simultánea evita su acumulación, y con esto se evita la inhibición de las

celulasas.

Este proceso es conocido como – Fermentación-sacarificación simultánea (FSS) -, sin embargo,

diversos factores actúan como limitantes para que este proceso alcance altos rendimientos,

principalmente la diferencia de temperaturas entre las etapas de hidrólisis (50°C) y la de

fermentación (30°C). Por lo tanto, esta tesis (Capítulo 2.2) se enfocó en evaluar la producción de

celulasas con una temperatura óptima de reacción cercana a los 30°C (derivado de los procesos de

bioprospección).

El Capítulo 3 del proyecto de tesis fue dedicado a la evaluación de la producción de etanol a

partir de bagazo de caña de azúcar, pretratado con compuestos alcalinos (Ca(OH)2 y NaOH) y con

P. sanguineus, utilizando las mejores condiciones para la producción de lacasa, obtenidas en el

capítulo 1.

1.3. El bagazo de caña de azúcar como materia prima para la producción de

bioetanol

México es uno de los principales productores de azúcar de caña en el mundo, posee 54 ingenios, la

industria genera 450 000 empleos directos, de los cuales 164 000 están registrados como

productores; en 2012 la producción de caña de azúcar fue de 52 495 311 ton, de las cuales Veracruz

produjo el 37%, manteniendo el liderato nacional de producción de azúcar (SAGARPA, 2015).

El bagazo de caña de azúcar (Figura 7) representa entre el 25 y el 40% del total de la materia

procesada (Pernalete et al., 2008); el cúal tiene una composición aproximada de 50% de celulosa,

26

25% de hemicelulosa y 25% de lignina (Pandey et al., 2000); lo que lo hace una biomasa muy

atractiva la la industria del etanol celulósico, así como de otras con enfoque de biorefinería.

El bagazo de caña de azúcar puede utilizarse como combustible directo en las calderas de los

ingenios azucareros, lo que disminuye o elimina su dependencia de combustibles fósiles, y en los

ingenios más tecnificados, se genera electricidad a partir de su combustión. A pesar de este uso,

existe un excedente de aproximadamente el 50% en la producción de bagazo de caña de azúcar

(Edwards, 1991), este excedente puede destinarse a la producción de bioetanol celulósico.

Diversas investigaciones se han enfocado en estudiar el procesamiento de esta biomasa para la

producción de etanol (Cardona et al., 2010), lo cuál lo ha convertido en una biomasa modelo, tanto

para la industria del bioetanol como para las biorefinerías. En México, dadas las condiciones

geográficas (tierras idóneas para el cultivo de caña), económicas (México es el sexto productor

mundial de este cultivo) e históricas (el cultivo de caña de azúcar es la agroindustria más antigua

del país), la investigación para el uso de subproductos, como lo es el bagazo de caña de azúcar,

hacia su transformación a productos de valor agregado está plenamente justificada.

Es por esto que este proyecto utiliza como materia prima bagazo de caña de azúcar para la

producción de etanol celulósico, teniendo como objetivo primario el desarrollo de un protocolo de

producción de etanol a partir de bagazo de caña de azúcar regional (Mahuixtlan, Veracruz), que

solo utilice métodos biotecnológicos, con el fin de disminuir costos de producción.

Figura 7. Bagazo de caña de azúcar del ingenio La Gloria, municipio de Úrsulo Galván, Veracruz. Este ingenio utiliza

parte de su bagazo de caña de azúcar para quema directa en caldera, con lo que eliminó el uso de combustóleo.

Fotografía del periódico El Dictamen (http://eldictamen.mx/2015/03/boca-ver/ingenios-utilizan-bagazo-para-producir-

azucar-alcohol-y-abono-organico/)

27

2. Estado del arte

__________________________________

28

2.1 Métodos de pretratamiento para lignocelulosa

2.1.1 Pretratamientos fisicoquímicos

La lignocelulosa es una estructura estable y resistente a la hidrólisis, esto se debe principalmente al

entrecruzamiento entre polisacáridos (celulosa y hemicelulosa) con la lignina, mediante enlaces éster o

éter (Figura 8). Las fibras de celulosa y hemicelulosa son densamente cubiertas por capas de lignina, lo

que da protección contra hidrólisis enzimática (Verma et al., 2011).

Figura 8. Interacción entre cadenas de celulosa y componentes de lignina. Se observa los enlaces tipo éster y éter (Tomado de

Zhou et al., 2010).

Como se mencionó anteriormente, el objetivo de un pretratamiento es aumentar la digestibilidad

enzimática de la lignocelulosa por medio de: i) disminuír la cantidad de lignina, ii) disminuír la cantidad

de celulosa cristalina y aumentar su estado amorfo y iii) disminuír la cantidad de hemicelulosa (cuando

no se requiere para los procesos de hidrólisis y fermentación). Existen diversos métodos fisicoquímicos,

los cuales al ser utilizados como pretratamiento aumentan el rendimiento de hidrólisis enzimática de la

lignocelulosa, entre ellos se encuentran tratamientos alcalinos, ácidos, explosión con vapor, explosión

con dióxido de azufre, explosión de fibras con amonio, uso de liquidos ionicos, entre otros (Behera et al.,

2014).

Generalmente, los tratamientos con agentes alcalinos y ácidos conllevan el uso de altas temperaturas

(~120°C) y presión (~15 lb), lo cual permite obtener altos rendimientos de deslignificación y/o remoción

de hemicelulosa en cortos periodos de tiempo (5 a 30 min). Entre los agentes alcalinos más utilizados

para remover lignina, se encuentran el NaOH, el Ca(OH)2 y el KOH (Maryana et al., 2014), algunos de

29

los resultados reportados para estos álcali se resumen en la Tabla 1. El efecto deslignificador de los

agentes alcalinos se atribuye a su capacidad para saponificar los enlaces ester contenidos entre la

celulosa y la hemicelulosa con la lignina (Figura 8) (Sun y Cheng, 2002). Asimismo, se sabe que los

álcali reaccionan con las fibras de celulosa, y pueden generar celulosa alcalina, mediante intercambio

iónico (Bahar et al., 2009). La reacción simplificada se muestra a continuación:

Cellulosa-OH + NaOH → Cellulosa-O-Na+ + H2O

Esto puede afectar procesos subsecuentes como la hidrólisis o la fermentación.

Tabla 1. Efecto del uso de diferentes agentes alcalinos sobre la composición estructural del bagazo de caña de azúcar.

Agente químico Condiciones Resultado obtenido Referencia

NaOH 1 N 100 °C

12 L

Reducción de lignina

de 17.52 a 7.16%

Maryana et al. (2014)

NaOH 0.5 M 80 °C, 2 horas en

agitación

Reducción de lignina

de 25.03 a 8.26%

Liu et al. (2016)

KOH 2.5% 120 °C, 45 min Deslignificación del

70.7%

Irfan et al. (2011)

KOH 10% 121 °C, 35 min Deslignificación del

74%

Paixão et al. (2016)

Ca(OH)2 10% 120 °C, 60 min Deslignificación del

30%

Grimaldi et al. (2015)

NaOH 10 % +

Ca(OH)2 8% (w/w)

Temperatura

ambiente

156 h

Deslignificación

41.2%

Ahmadi et al. (2016)

Por otro lado, el uso de ácidos diluidos (concentración menor a 10%) contribuye a la remoción de la

hemicelulosa, lo cual es importante ya que las celulasas se inhiben en presencia de xilosa, xilano y xilo-

oligosacáridos (Negahdar et al., 2016). Los ácidos que mayormente han sido utilizados para hidrolizar

hemicelulosa son el ácido sulfúrico, el ácido clorhídrico, el ácido nítrico y el ácido fosfórico (Kumar et

al., 2015). Cuando la reacción ocurre a pH 2 o menor, únicamente importa la cantidad de protones (H+)

liberados, y no la naturaleza del ácido empleado (Kim et al., 2013). Asimismo, las cadenas laterales de la

hemicelulosa tienden a hidrolizarse más rápidamente que el esqueleto de xilano, esto debido a que las

unidades de arabinogalactano y galactoglucomanano se encuentran más accesibles que el xilano, y a que

en ellas predominan enlaces tipo α; más fácilmente hidrolizables que los enlaces β del xilano (Negahdar

et al., 2014). Entre las desventajas de utilizar ácidos diluidos, se encuentra que al interactuar con la

xilosa liberada de la hemicelulosa pueden producir furfurales e hidroximetil-fufurales (Yemis y Mazza,

2011), estos compuestos, junto con el ácido acético, son fuertes inhibidores de la fermentación con

30

levaduras (Palmqvist et al., 1999). Los furfurales se producen cuando las pentosas (principalmente la

xilosa) se deshidratan por la acción de ácidos a un intermediario (xilosa 2,5-anhidro) y, posteriormente,

una segunda deshidratación produce furfural por la perdida de 3 moléculas de agua (Antal et al., 1991;

NimLos et al., 2006; Yang et al., 2012), (Figura 9).

Figura 9. Deshidratación de xilosa hasta furfural (tomado de Yang et al., 2012)

La formación de furfurales puede evitarse disminuyendo la temperatura de reacción a un máximo de 90

°C; sin embargo, esto aumenta el tiempo de reacción hasta por 24 h (Negahdar et al., 2014). Tanto

tratamientos ácidos como alcalinos requieren una posterior neutralización de su pH, para propiciar las

condiciones de hidrólisis y/o fermentación. Esto, aunado al gasto energético, hace que su uso más allá de

escalas piloto se considere inviable, hasta la fecha.

De manera similar, las reacciónes de explosión con vapor, o explosiones de vapor-amonio, a pesar de ser

métodos altamente efectivos para romper la estructura de la lignocelulosa, conllevan un alto gasto

energético. Estos métodos consisten en elevar la temperatura hasta 220 °C por un corto periodo de

tiempo y posteriormente disminuírla súbitamente a temperatura ambiente, con esto se generan

condiciones de explosión, al interior de la lignocelulosa, que remueven lignina y hemicelulosa (Sun y

Cheng, 2002). Los métodos de explosión aumentan significativamente el rendimiento de hidrólisis

enzimática; sin embargo, generan compuestos inhibidores de la fermentación, por lo que se requiere de

lavados subsecuentes para eliminar dichos compuestos, lo que a su vez provoca la pérdida de

monosacáridos liberados de la hemicelulosa y celulosa (McMillan, 1994), además de contaminación de

agua.

31

2.1.2 Pretratamientos biológicos

A diferencia de los pretratamientos fisicoquímicos, los pretratamientos biológicos involucran el uso de

organismos vivos (hongos, bacterias) o sus derivados (enzimas) para modificar la estructura de la

lignocelulosa y aumentar su digestibilidad enzimática. Entre las características deseables de un

pretratamiento biológico se encuentran: i) que contribuya a disminuír la cantidad de lignina, ii) que

utilice condiciones de bajo costo económico, iii) que evite la pérdida de carbohidratos del sustrato y, iv)

que utilice tiempos de retención cortos.

Generalmente, el decremento en la cantidad de lignina se logra gracias a la exposición del sustrato a

diversas enzimas del grupo de las oxidoreductasas, las cuales oxidan los anillos aromáticos de la lignina

provocando el rompimiento de sus enlaces (Figura 10). Entre estas enzimas se encuentran la lacasa, la

Mn-peroxidasa y la ligninasa (Sindhu et al., 2016). Estas enzimas, pueden ser producidas en grandes

cantidades tanto por bacterias como por hongos; sin embargo, se considera que el grupo de los hongos de

pudrición blanca (pertenecientes a los Basidiomicetos) son los organismos más eficientes para producir

estos complejos enzimáticos y degradar lignina (Saha et al., 2016).

Diversos estudios se han enfocado en lograr la sobreproducción de estas enzimas (principalmente lacasa)

para poder utilizarlas en procesos de deslignificación biológica. Producto de estas investigaciones, se

conoce que las lacasas responden a diferentes estimulos ambientales, generalmente estímulos químicos,

entre ellos podemos enlistar la presencia de compuestos fenólicos o aromáticos (Kuhar y Papinutti,

2014), metales pesados (Lorenzo et al., 2006), algunos alcoholes como etanol (Meza et al., 2005),

diferentes fuentes de carbono y de nitrógeno (Stajić et al., 2006). Generalmente, las lacasas se inducen

cuando fuentes complejas de estos nutrientes se encuentran disponibles (e.g. bagazo de caña de azúcar,

extracto de levadura) en lugar de fuente de fácil asimilación (e.g. glucosa, nitrato de amonio) (Karp et

al., 2015).

Figura 10. Oxidación de subunidades fenólicas de la lignina por lacasa (Tomado de Archibald et al., 1997)

32

2.1.3 Las lacasas

La acción de la lacasa puede ser potencializada para que oxide compuestos no fenólicos mediante el uso

de mediadores, como el ABTS [2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)] (Figura 11). El

uso de mediadores fue utilizado inicialmente para el bio-blanqueado de la pulpa de madera; sin embargo,

actualmente su uso se está extendiendo para procesos de deslignificación para producción de bioetanol

(Madhavi y Lele, 2009).

Figura 11. Modelo de oxidación de compuestos no fenólicos de la lignina, utilizando un mediador (Tomado de Archibald et

al., 1997)

Además de propiciar las condiciones idóneas para la producción de lacasas u otras enzimas relacionadas

a la depolimerización de la lignina, es necesario seleccionar adecuadamente la especie y cepa de hongo

que se utilizará para pretratar un sustrato lignocelulósico. Los hongos de los géneros Trametes (Pal et al.,

1995), Pleurotus (Asgher et al., 2013) y Pycnoporus (Eugenio et al., 2009), entre otros, han sido

reconocidos como buenos productores de lacasas, y han sido utilizados para deslignificar bagazo de caña

de azúcar (Tabla 2).

Tabla 2. Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar utilizando hongos de pudrición blanca.

Hongo Tiempo de retención

(días)

Deslignificación

(%)

Referencia

Trametes versicolor 40 27.39 Pal et al., 1995

Flamulina velutipes 40 29.13 Pal et al., 1995

Pleurotus ostreatus 48 horas directamente

con enzimas

33.5 Asgher et al., 2013

Pleurotus ostreatus 84 85 Dong et al., 2013

Phanerochaete

chrysosporium

84 93 Dong et al., 2013

Pleurotus ostreatus 15 34.8 Karp et al., 2015

33

Pycnoporus sanguineus 14 días para alcanzar la

máxima producción de

lacasa en bagazo de caña

de azúcar

ND* Meza et al., 2005

* ND. No determinada

Como se observa en la Tabla 2, los tiempos de retención son sustancialmente mayores a los utilizados en

pretratamientos fisicoquímicos, por lo tanto, se requiere mayor investigación para lograr obtener altos

índices de deslignificación en el menor tiempo posible. Para esto, se deben optimizar las condiciones de

cultivo de acuerdo a la cepa que se desee emplear, manipulando las variables fisicoqúimicas que más

afecten la producción de lacasa u otras enzimas oxidoreductasas (e.g. fuente y concentración de

nitrógeno, temperatura, presencia de inductores, grado de exposición a luz, etc.).

El presente proyecto de tesis evalúa la deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar utilizando

al hongo Pycnoporus sanguineus, esto con base en reportes (Meza et al., 2005) que lo señalan como un

potencial productor de lacasas y a que podría ser utilizado para deslignificar selectivamente sustratos

lignocelulósicos.

2.2 Las celulasas

Las celulasas son un grupo de enzimas hidrolíticas capaces de degradar la celulosa hasta sus monómeros

de glucosa. Estas enzimas generalmente se clasifican de acuerdo a la actividad que presentan dentro de la

cadena de celulosa: las endoglucanasas cortan aleatoriamente en las regiones de celulosa amorfa

generando oligosacáridos (cadenas cortas de celulosa); las exoglucanasas actúan en las cadenas

terminales de las cadenas de celulosa (incluso en estado cristalino) y liberan celobiosa; por último, las β-

glucosidasas cortan la celobiosa y liberan dos moléculas de glucosa. La sinergia entre estas actividades

determina la eficiencia de hidrólisis de la celulosa (Igarashi, 2013); sin embargo, se conoce poco sobre la

manera en la que interactúan entre ellas, aunque se han propuesto algunos modelos (Figura 12).

34

Figura 12. Modo de acción de celulasas de Trichoderma reesei. a) las enzimas (Cel6A y Cel7A) se unen en lados opuestos a

las cadenas de celulosa cristalina. b) Mediante microscopía de fotolocalización fotoactivada se puede obtener un valor de

fluorescencia (Ω) ligado a la preferencia de áreas de hidrólisis de la cadena de celulosa, un valor alto de Ω corresponde a

afinidad por celulosa cristalina, un valor bajo a afinidad por celulosa amorfa (Tomado de Igarashi, 2013).

Actualmente estas enzimas son utilizadas en diversas industrias, como la textil, la de detergentes, la

papelera y en la alimenticia, y se estima que su valor supera los 2 billones de dólares anuales en ventas

(Bhat, 2000). Además, las celulasas son enzimas clave en el proceso de producción de etanol celulósico,

pues son las responsables de liberar la glucosa de la lignocelulosa pretratada; por esto, su producción y

propiedades han sido el centro de atención de diversas investigaciones pues se les considera un cuello de

botella para el escalamiento de la producción de este biocombustible (Garvey et al., 2013).

Las celulasas de Trichoderma reesei poseen un pH óptimo de reacción ligeramente ácido (~ 4.8; Ghose,

1987) y tienden a inhibirse por producto, generalmente por celobiosa (Zhou et al., 2008), lo que indica la

importancia de la β-glucosidasa en los cocteles celulolíticos. Asimismo, algunos iones metálicos pueden

inhibir o inducir la actividad de las celulasas; por ejemplo, iones metálicos divalentes tiene efectos

positivos o negativos en la capacidad catalítica de las celulasas. El Ca2+

y el Mn2+

aumentan la capacidad

catalítica de las celulasas, aunque en altas concentraciones el Ca2+

puede tener efectos inhibitorios; por

su parte el Cd2+

inhibe parcialmente, al igual que el Fe3+

y el Cu2+

(Wang et al., 2013), mientras que el

Pb2+

tiene efectos inhibitorios irreversibles (Zhai et al., 2015).

2.2.1 Organismos productores de celulasas

Las celulasas son producidas por diversos grupos de organismos, principalmente por bacterias

simbiontes de rumiantes (Bao et al., 2011) y habitantes del suelo, como Pseudomonas y Bacillus (Sethi

et al., 2013). Entre los generos bacterianos más interesantes para la producción de celulasas se encuentra

Clostridium, este genero produce celulasas sobre la superficie de su pared celular (celulosomas) y

degrada de manera muy eficiente la celulosa, e incluso puede contener enzimas que contribuyen a la

hidrólisis de la hemicelulosa (Thomas et al., 2014). Clostridium ha sido propuesto como un organismo

35

que puede ser utilizado en los procesos de transformación de lignocelulosa a etanol y butanol (Pfromm et

al., 2010).

A pesar del gran potencial de los grupos bacterianos para la producción de celulasas, son los hongos

filamentosos (Ascomycota) quienes dominan la producción industrial de celulasas. Esto debido a que

son organismos resistentes y con gran plasticidad para crecer en diferentes sustratos y adaptarse a

diversas condiciones ambientales. Entre los generos más utilizados para producir celulasas, se

encuentran Trichoderma (Callow et al., 2016) y Aspergillus (Bansal et al., 2012), pero otros generos

como Penicillium (dos Reis et al., 2013) y Fusarium (Yuan et al., 2012) también son considerados

buenos productores de celulasas.

Para que un hongo sea candidato para producir celulasas que puedan ser utilizadas a nivel industrial,

debe cumplir ciertas características, tanto fisiológicas (plasticidad, rápido crecimiento, alta producción

enzimática) como enzimáticas (enzimas con alta capacidad catalítica, resistentes a la desnaturalización).

Generalmente, las enzimas producidas por una sola especie de hongo, poseen ciertas carencias en alguno

de los requerimientos mencionados. Por ejemplo, las enzimas producidas por el género Trichoderma,

tienden a ser deficientes en actividad β-glucosidasa (Treebupachatsakul et al., 2016); además, poseen

una temperatura óptima de reacción de 50° C, lo cual tiende a ser una limitante en procesos de

fermentación-sacarificación simultánea (Ballesteros et al., 2004). A pesar de estas limitantes,

Trichoderma es el hongo más utilizado para la producción de celulasas, gracias a su gran producción

enzimática, su resistencia y plasticidad, y a su excelente producción de exoglucanasas (Esterbauer et al.,

1991).

Para suplir las deficiencias de las celulasas de Trichoderma, se han generado estrategias para aumentar el

rendimiento de hidrólisis de lignocelulosa; como: i) suplementar las enzimas de Trichoderma con β-

glucosidasas de Aspergillus (Fortes et al., 2010), ii) modificar genéticamente cepas de Trichoderma

(Chandra et al., 2009), iii) producir celulasas mediante consorcios de hongos. Generalmente, el binomio

Trichoderma-Aspergillus es el más utilizado para producir cocteles celulolíticos para la hidrólisis de

lignocelulosa (Ahamed y Vermette, 2008); sin embargo, existe una gran variedad de combinaciones

posibles que pueden ser evaluadas para producir una mezcla de celulasas con características deseadas.

Además de los organismos conocidos, existe una amplia diversidad de biota celulolítica con potencial

para ser utilizada como fuente de enzimas para la industria del bioetanol. Los estudios de

bioprospecciones contribuyen a conocer la diversidad de organismos y enzimas de interés industrial, sin

embargo, pocos estudios de este tipo se han realizado para descubrir nuevas fuentes de celulasas (Tabla

3).

36

Tabla 3. Estudios de bioprospección de organismos celulolíticos

Área muestreada Organismo aislado Características de las celulasas Referencia

Océano Atlántico sur, mar

profundo

Bacillis stratosphericus,

Bacillus aerophilus,

Bacillus pumilus

Celulasas con temperaturas

óptimas de reacción mesófilas

(28 °C)

Odisi et al., 2012

Distintas áreas geográficas

de India

Bacillus simplex,

Arthrobactercitreus,

Bacillus subtilis, Bacillus

endophyticus, Bacillus

amylololiquefaciens,

Bacillus megaterium

Celulasas con temperaturas

óptimas de reacción psicrofilas,

mesófilas y termófilas

Venkatachalam et al.,

2014

Odisha, India Bacterias halófilas Celulasas con potencial para ser

utilizadas en hidrólisis de

biomasa algal

Indira et al., 2014

Bosque tropical, Perú Aspergillus sp, Penicillium

sp

Celulasas alcalinas Vega et al., 2012

India Aspergillus terreus Sin características sobresalientes Saritha et al., 2015

2.2.2 Métodos de producción de celulasas

Las celulasas fúngicas pueden ser producidas por diversos métodos, los cuales se clasifican

generalmente en dos grandes grupos: fermentación sumergida y fermentación en estado sólido. La

primera se refiere, a aquellos cultivos en los cuales el hongo productor se encuentra totalmente inmerso

en el medio de cultivo, el cual es líquido. Este tipo de cultivos suelen llevarse a cabo en biorreactores, en

condiciones controladas. Entre los parámetros que se pueden controlar en la fermentación sumergida, se

encuentran el pH, la oxigenación, temperatura, agitación, cantidad de nutrientes (uso de medios

definidos), concentración de inductores (e.g. lactosa) y luminosidad; además, se facilita la recuperación

de las enzimas producidas. La desventaja que tiene el uso de este tipo de cultivos, es el grado de

tecnificación que se requiere, sobre todo cuando se desea una producción industrial, además dadas las

condiciones benéficas para el desarrollo de microorganismos, el riesgo de contaminación suele ser alto.

Por otro lado, la fermentación en estado sólido, asemeja las condiciones naturales en las cuales se

desarrollan la mayoría de los hongos filamentosos; i.e. humedad alta, ventilación, crecimiento directo

sobre sustrato. Este tipo de cultivos propician el desarrollo de los hongos sobre el de las bacterias,

requieren un nivel de tecnificación bajo y permite el uso de diversos residuos agroindustriales como

sustratos para la producción de celulasas (Subramaniyam y Vimala, 2012). No obstante, también posee

desventajas, entre las que se encuentran una menor interacción entre hongo-inductor (cuando se utiliza) y

una recuperación enzimática más costosa.

37

El método de producción enzimática debe ser cuidadosamente seleccionado, puesto que se conoce que

un mismo hongo (e.g. Aspergillus niger) puede variar su metabolismo dependiendo del tipo de cultivo

que se utilice (Maghsoodi y Yaghmaei, 2010). Aunque, independientemente del método a utilizar,

existen ciertas variables reconocidas que afectan la producción de celulasas.

Las celulasas son generalmente, enzimas controladas por la represión catabólica del carbono. De esta

manera, se acepta que cuando existen carbohidratos simples abundantemente, como la glucosa y la

celobiosa, en el medio de cultivo, la producción de las celulasas es reprimida (Aro et al., 2005). Esta

regulación tipo operón se ha localizado en diversos hongos filamentosos, los cuales producen de manera

constitutiva pequeñas cantidades de celulasas, las cuales liberan pequeñas cantidades de glúcidos de la

celulosa, mismos que activan la transcripción de celulasas. Empero, cuando la cantidad de glucosa se

encuentra en altas concentraciones la transcripción se inhibe mediante la acción de proteínas Cre (Aro et

al., 2005). Todo esto ocurre gracias a la presencia de receptores en la membrana celular de las hifas

(Figura 13).

Entre los disacáridos conocidos que más inducen la producción de celulasas se encuentran la soforosa y

la lactosa (Sternberg y Mandels, 1980; Lo et al., 2010), así como algunos derivados de la hemicelulosa.

Estos azúcares han sido utilizados ampliamente como inductores de celulasas, principalmente en

fermentación sumergida.

Figura 13. Representación de los diferentes factores que regulan la expresión de celulasas y xilanasas. CRE es el represor

catabólico del carbono, PacC el regulador asociado a pH, AreA es el regulador ligado a las condiciones de nitrógeno del

medio. Tomado de Aro et al. (2005).

38

El pH es otro importante factor que afecta la producción de celulasas, generalmente estas enzimas se

producen a pH ligeramente ácido; en cambio, pequeñas variaciones en el pH pueden afectar el tipo de

celulasa que se produce. En este sentido, se ha reportado que el pH óptimo para producir β-glucosidasas

con T. reesei es 6, mientras que esta misma especie puede producir altas concentraciones de

endoglucanasa y exoglucanasa en pH de 4 a 6 (Prasetyo et al., 2010). El efecto del pH puede ser especie-

específico o cepa-específico, puesto que Hendy et al., (1984) reportan que producir celulasas con T.

reesei a un pH mayor de 5 resulta en una pérdida de rendimiento. Se ha sugerido que cada componente

del complejo celulolítico de T. reesei posee un pH óptimo para ser producido, y que la sincronización de

los cambios en el pH del medio de cultivo con la fase de crecimiento del hongo puede aumentar los

rendimientos de producción enzimáticos (Li et al., 2013).

La fuente de nitrógeno per se no afecta la producción de celulasas, pero si puede alterar el pH

(Rodriguez-Gomez y Hobley, 2013); lo cual, como ya se enunció, tiene fuertes efectos en la producción

enzimática.

Cuando se utiliza fermentación en estado sólido para la producción de celulasas, el sustrato puede ser

pretratado para aumentar su colonización por parte de las hifas, y evitar los efectos negativos de la

lignina. Si bien, como se mencionó anteriormente, posterior a un pretratamiento químico, el pH debe ser

regulado para permitir la producción de celulasas (Li et al., 2013); y dependiendo el tipo de agente

químico utilizado, serán las características del sustrato obtenido. Se recomienda no utilizar ácido diluído

para remover la hemicelulosa, puesto que los derivados del xilano son potentes inductores de celulasas

(Sørensen et al., 2014); además, el uso de NaOH puede producir sustancias inhibitorias que disminuyen

el rendimiento de producción de celulasas (Xin y Geng, 2010).

Pretratamientos que aumenten el índice de cristalinidad de la celulasa, como el uso de NaOH, pueden

afectar la producción de celulasas, porque esto limita el acceso de las celulasas a la celulosa (Ojumu et

al., 2003). Asímismo, el tipo de álcali utilizado para pretratar la lignocelulosa puede ser determinante no

solo desde el punto de vista estructural, si no por el tipo de celulosa alcalina resultante (Bahar et al.,

2009). Por ejemplo, mientras que el NaOH puede provocar sustancias inhibitorias, el Ca(OH)2 podría

resultar benéfico puesto que el Ca2+

puede actuar como cofactor e inductor de endoglucanasas (Van

Lieshout et al., 2012; Eckert et al., 2002).

2.3 La hidrólisis y la fermentación

2.3.1 La hidrólisis enzimática

La hidrólisis enzimática de la lignocelulosa es el proceso por el cual se liberan los azúcares contenidos

en las fibras de celulosa (principalmente) y en la matriz de hemicelulosa. Entre las ventajas de la

39

hidrólisis enzimática se encuentran su potencial alto rendimiento, su alta especificidad, su bajo

requerimiento energético, y que no se requieren contenedores especiales como en el caso de la hidrólisis

química (Yang et al., 2011). Existen dos enfoques para realizar este proceso: i) un enfoque donde una

mezcla de celulasas y xilanasas se agregan para hidrolizar conjuntamente celulosa y xilano, y ii) donde

únicamente se agregan celulasas, pues se pretende obtener únicamente glucosa como producto de

hidrólisis.

La mezcla de enzimas que se utilizarán para el proceso de hidrólisis depende tanto de la naturaleza del

sustrato (contenido de celulosa, accesibilidad, grado de polimerización, grado de cristalinidad, contenido

de hemicelulosa) (Yang et al., 2011), como del producto que se desea obtener. Cuando se utiliza una

mezcla de celulasas y xilanasas, el producto obtenido será una mezcla de azúcares, tanto pentosas (D-

xilosa y L-arabinosa) como hexosas (D-glucosa, D-manosa y D-galactosa) (Cuervo et al., 2009). Esto es

muy importante ya que, dependiendo la concentración y el tipo de azúcares obtenidos, se elegirá una

estrategia de fermentación.

La hidrólisis de material lignocelulósico pretratado, suele llevarse a cabo en un biorreactor con

condiciones controladas. Las variables más importantes de este proceso son: la temperatura de hidrólisis,

la carga de sustrato, la cantidad de enzima (FPU, U.ml-1

o U.g-1

de sustrato), las características de la

enzima (e.g. actividad endo, exo y β-glucosidasa), el pH (tipo de buffer utilizado), tiempo de residencia

y la agitación (Tabla 4).

Tabla 4. Condiciones de hidrolisis de bagazo de caña de azúcar

Temperatura Carga de

sustrato

Cantidad de

enzima

Tipo de enzima pH Tiempo

de

residencia

(h)

Agitación Referencia

50° C - 10 FPU.g-1

cellulosa

Mezcla Cellubrix 4.8 - Si Ahi et al.,

2000

50° C

De 8 a 12 %

20 FPU.g-1

biomasa

Mezcal de enzimas de

Chrysoporthe cubensis y

Penicillium pinophilum.

5

96

220 rpm

Visser et al.,

2015

40 °C - - Enzimas de T. reesei,

mezcla CL de AB

Enzymes Company

4.5 45 No Pietrobon et

al., 2011

50° C 1 g de

biomasa en

25 ml de

buffer

40 U de

endoglucanasa y

exoglucanasa, y 20

U de β-glucosidasa

por g de biomasa

Enzimas de Aspergillus

niger

4 96 150 rpm Soni et al.,

2010

40

50° C 25 g.L-1 25 FPU.g-1

biomasa

Mezcla Multifect CX

(Genecor)

5 18 200 rpm Maeda et al.,

2011

50 °C 2 % 25 FPU.g-1

biomasa

Celluclast + Novozym

188

4.8 48 150 rpm Martín et al.,

2007

Se sabe que las celulasas son adsorbidas irreversiblemente por la lignina en procesos de hidrólisis,

disminuyendo el rendimiento (Tatsumoto et al., 1988). Este efecto puede disminuirse con la adición de

Albumina Serica Bobina (Yang y Wayman, 2006); en cambio, otros autores sugieren efectos poco

notorios de esta proteína (Maeda et al., 2011).

El rendimiento de hidrólisis (Hy) se calcula mediante la siguiente ecuación (Maeda et al., 2011):

𝐻𝑦 =𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎 (𝑔. 𝐿−1)

𝐶𝑠 𝑥 𝐶𝐶 𝑥 1.11𝑥 100

Donde:

CS = Contenido de sustrato (g.L-1

)

CC = Contenido de celulosa en el sustrato (g.g-1

)

1.11 = Es el factor de corrección derivado de la adición de moléculas de agua a los residuos de

anhidroglucosa.

Con las condiciones mostradas en la Tabla 4, se han logrado rendimientos superiores al 90% cuando se

hidroliza bagazo de caña de azúcar pretratado con diversos métodos fisicoquímicos. Sin embargo, este

tipo de pretratamientos, como se mencionó anteriormente, ocupan una gran cantidad de energía y poseen

requerimientos especiales. Además, el costo de las enzimas comerciales representa uno de los principales

cuellos de botella para el proceso de producción de bioetanol celulósico.

2.3.2 Fermentación alcohólica

La tercera etapa de producción de bioetanol es la fermentación, donde se transforman los azúcares

obtenidos en la etapa de hidrólisis en alcohol. El proceso puede ser llevado a cabo tanto por bacterias

(e.g. Zymomonas mobilis) como por levaduras (e.g. Saccharomyces cerevisae).

La diferencia entre el proceso de fermentación donde se utilizó almidón como materia prima de glucosa

(e.g. fermentación de azúcares obtenidos de cereales) con los procesos fermentativos de azúcares

derivados de la lignocelulosa es que, en el primer caso, únicamente se tiene glucosa como único azúcar

41

fermentable. Además, el proceso de hidrólisis de almidón mediante amilasas no genera compuestos que

puedan ser tóxicos para las levaduras.

Por otro lado, al hidrolizar lignocelulosa se obtiene una mezcla de azúcares (hexosas + pentosas) las

cuales pueden requerir de una mezcla de microorganismos para poder ser fermentados. Además, cuando

se utilizan pretratamientos con ácidos y elevadas temperaturas, se genera la aparición de furfurales,

hidroximetil furfurales y ácido acético que son potentes inhibidores de la fermentación (Palmqvist et al.,

1999).

En este contexto, se han propuesto diversas estrategias para lograr un alto rendimiento de producción de

etanol a partir de los azúcares simples obtenidos de la lignocelulosa. Entre ellas se encuentran i) Utilizar

una mezcla de levaduras que puedan metabolizar hexosas y pentosas a etanol, ii) Mejorar genéticamente

Saccharomyces cerevisiae para que pueda metabolizar pentosas, iii) Detoxificar la mezcla de hidrólisis

para evitar inhibición de las levaduras, iv) Transformar las pentosas en productos de valor agregado, v)

Realizar la hidrólisis y la fermentación en una sola etapa para evitar la acumulación de glucosa.

La eficiencia de la fermentación se calcula mediante la siguiente ecuación (Yadav et al., 2011):

𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑝𝑟á𝑐𝑡𝑖𝑐𝑜

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜𝑥 100

Donde: Rendimiento práctico = Etanol producido

Rendimiento teórico = 0.511 por gramo de azúcar consumido

La fermentación suele llevarse a cabo en biorreactores, donde se deposita el hidrolizado de lignocelulosa

enriquecido con alguna o varias fuentes de nitrógeno (e.g. extracto de levadura, peptona, nitrato de

amonio) y minerales (Fe, Mn, Mg, Ca, Zn) para el correcto metabolismo de las levaduras, sin los cuales

el rendimiento decae significativamente (Slininger et al., 2006; Yadav et al., 2011). Además, el uso de

vitaminas (e.g. biotina, ácido pantotéico) tiene efectos positivos sobre el rendimiento de etanol

producido por S. cerevisiae (Alfenore et al., 2002).

Entre los consorcios de levaduras más utilizados para fermentar una mezcla de pentosas y hexosas se

encuentra el binomio S. cerevisiae y Pichia stipitis (Yadav et al., 2011). Aunque algunos autores

sugieren que es preferible fermentar inicialmente la glucosa con S. cerevisiae o Zymomonas mobilis y

posteriormente fermentar las pentosas con P. stipitis o Candida shehatae, previa inactivación de S.

cerevisiae (Li, et al., 2011; Delgenes et al., 1996). Las condiciones de fermentación más utilizadas se

presentan en la tabla 5. Por otro lado, algunos estudios se han concentrado en modificar genéticamente a

S. cerevisiae para lograr que pueda fermentar tanto glucosa como xilosa adicionando un gen para que

42

pueda expresar xilosa isomerasa (EC 5.3.1.5) (Kuyper et al., 2004). Esta enzima habilita a S. cerevisiae a

producir etanol a partir de xilosa con rendimientos similares a los obtenidos con glucosa.

Cuando el hidrolizado proviene de un proceso de hidrólisis ácida o de un pretratamiento ácido, se

requiere de un proceso de detoxificiación para evitar la inhibición de las levaduras por furfurales. Entre

los procesos de detoxificación de hidrolizado se encuentra el uso de Ca(OH)2, el proceso involucra un

encalado hasta llevar el pH del hidrolizado a 10, posteriormente una centrifugación, filtrado, y reajuste

de pH a 6 mediante la adición de H2SO4. Posteriormente se agrega carbón activado y se repite el proceso

de centrifugación y filtrado (Yadav et al., 2011). Este proceso reduce la cantidad de furanos y

compuestos fenólicos; sin embargo, aumenta el costo y la tecnificación total del proceso.

Por otro lado, cuando se utiliza un pretratamiento biológico y una hidrólisis enzimática, no hay

necesidad de una detoxificación o de un ajuste de pH, pues el utilizado en procesos de hidrólisis

enzimática es muy similar al utilizado en procesos de fermentación (Tablas 4 y 5). Asimismo, las

pentosas pueden ser fermentadas a etanol con mezclas de levaduras (como se mencionó anteriormente),

o pueden ser transformadas en productos de alto valor agregado a posteriori del proceso de

fermentación.

Esta última opción ha llamado mucho la atención en los últimos años, debido al creciente interés por los

productos derivados de la xilosa y la arabinosa, los cuales podrían tener más valor que el etanol derivado

de pentosas. Lo cual, desde un punto de vista de biorefinería, aumentaría la viabilidad global del

proceso. Entre los productos que se pueden obtener a partir de la xilosa (posterior a la destilación

alcohólica) se encuentran los furfurales, los cuales como ya se enunció, se obtienen a partir de la

deshidratación de la xilosa en presencia de un ácido y a elevadas temperaturas (Yang et al., 2012; Figura

9).

Tabla 5. Condiciones de fermentación de azúcares derivados de lignocelulosa

Microorganismo

utilizado

Concentración de

inóculo

Temperatura

(°C)

Agitación

(rpm)

pH Referencia

Candida shehatae 3% (v/v) utilizando

inóculo crecido por

24 h

30 150 5.6 Delgenes et al.,

1996

Sacharomyces

cerevisiae

0.34 g.L-1

de

células secas

30 300 4.8 Li et al., 2011

Sacharomyces

cerevisiae + Pichia

stipitis

Inóculo con una

OD600 3

30 150 5.5 Yadav et al., 2011

Pichia stipitis - 25 150 6.5 Slininger et al.,

43

2006

Pichia stipitis 0.4 g.L-1

30 100 6 Chen et al., 2012

Saccharomyces

cerevisiae

- 30 400 4 Alfenore et al.,

2002

Los furfurales y sus derivados son utilizados en la industria de plásticos, farmacéutica y agroquímica.

Los productos obtenidos a partir de estos compuestos van desde solventes (e.g. di-hidropirano, metil-

tetra-hidrofurano, tetra-hidrofurano), fungicidas y nematicidas, aditivos de gasolinas, resinas,

lubricantes, mezclas de turbosina, insecticidas, bio-plásticos, potenciadores de sabor de alimentos y

bebidas, entre otros (Eseyin y Steele, 2015). Debido a sus diversas aplicaciones, la fermentación de

pentosas a etanol podría no ser conveniente desde un punto de vista económico e incluso ambiental, pues

la producción de furfurales de pentosas podría ser una opción para el desarrollo de productos químicos

sustentables.

Dadas las características de las pentosas, la producción de etanol debería derivar preferentamente de la

fermentación de hexosas, derivadas principalmente de la hidrólisis con celulasas. Como se mencionó

anteriormente, las celulasas se inhiben en presencia de altas concentraciones de celobiosa y glucosa

(Ballesteros et al., 2004), una estrategia que busca evitar este inconveniente es el uso de la fermentación

al mismo tiempo que ocurre la hidrólisis. En este proceso, las levaduras consumen los azúcares liberados

de la lignocelulosa por las celulasas, evitando así su acumulación y con ello, la inhibición de las

enzimas. Otra de las ventajas es que la presencia de etanol en el medio disminuye el riesgo de

contaminación por organismos indeseables (Ferreira et al., 2009).

Dentro de los inconvenientes de utilizar esta técnica se encuentran la diferencia de temperaturas entre el

proceso de hidrólisis con enzimas de T. reesei (50 °C) y fermentación con levaduras (30 °C) (Zhou et al.,

2008). Para sobrepasar esta limitante, se ha propuesto el uso de levaduras termotolerantes que sean

capaces de fermentar a 50 °C, como Blastobotrys adeninivorans, la cual obtuvo un rendimiento de 46.87

% de acuerdo al valor teórico (Antil et al., 2014), Kluyveromyces sp, con rendimiento de 8.14% (Narra et

al., 2015) e incluso algunas cepas de Saccharomyces cerevisiae (Huang et al., 2015). El uso de

organismos termotolerantes también ha sido utilizado para producir otros productos derivados de

azúcares de lignocelulosa, en fermentación-sacarificación simultánea, como el ácido láctico con una

cepa de Bacillus sp (Patel et al., 2005).

Por otro lado, el uso de enzimas celulasas con temperatura óptima de reacción mesófila ha sido menos

estudiado, a pesar de que diversos estudios de bioprospección (Tabla 3) han aportado organismos

capaces de producir celulasas con estas características. Optimizar un proceso de fermentación y

sacarificación simultánea a 30 °C podría resultar más eficiente que un proceso a 50 °C, desde un punto

44

de vista energético; por esto, el capítulo 2 de esta tesis tuvo como objetivo estudiar la producción de

celulasas que pudiesen ser utilizadas en procesos de fermentación y sacarificación simultánea, en

condiciones de temperatura mesófila.

2.4 Planteamiento del problema

Como se expuso anteriormente, las enzimas lacasas y celulasas son piezas clave en el el pretratamiento e

hidrólisis biológicos de la lignocelulosa. No obstante, a pesar del avance en el entendimiento de estos

procesos y en el rol que cumplen dichas enzimas en la depolimerización de la lignina y celulosa, aun se

requiere de investigación en el área de inducción de lacasas y celulasas en hongos. Esto con el propósito

de lograr una hiperproducción enzimática, en el caso de las lacasas, y para lograr una alta

deslignificación selectiva; y un complejo celulasa/xilanasa que cumpla los requerimientos necesarios

para realizar una hidrólisis completa de la celulosa/hemicelulosa hasta sus monómeros estructurales.

Aunado a esto, es necesaria la búsqueda de nuevas cepas de hongos con potencial productor de celulasas,

que posean características para ser utilizadas en procesos de hidrólisis y fermentación separada y/o

simultánea.

Es por ello que la presente tesis se enfoca en identificar el efecto de distintas variables fisicoquímicas en

la producción de lacasa en P. sanguineus, con el objetivo de generar una producción enzimática que

pueda utilizarse en el pretratamiento de bagazo de caña de azúcar. Asímismo, se estudió el efecto de la

producción de celulasas y xilanasas a partir de cepas de hongos aisladas de distintos bosques del estado

de Veracruz, tanto en monocultivos como en policultivos.

45

3. Preguntas de investigación

Derivado de la revisión bibliográfica del estado del arte sobre producción de etanol celulósico, a partir de

bagazo de caña de azúcar, se estructuraron las siguientes preguntas de investigación, las cuales se

dividen en dos grupos:

3.1 Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar

En el conocimiento de que la enzima lacasa es una de las principales oxidoreductasas involucradas en la

depolimerización de la lignina y que su producción en hongos de pudrición blanca es afectada por

diversas variables fisicoquímicas ¿Qué condiciones de luminosidad, disponibilidad de nitrógeno y

presencia de inductores químicos aumentarán su producción en el hongo Pycnoporus sanguineus? ¿El

cultivo de P. sanguineus sobre bagazo de caña de azúcar en estado sólido, utilizando las mejores

condiciones para la producción de lacasa, realizará una deslignificación selectiva de la estructura

química del bagazo de caña de acuerdo a los requerimientos para la hidrólisis enzimática?

3.2 Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-sacarificación

simultánea

En el conocimiento de que el uso de celulasas puras de Trichoderma reesei posee limitaciones en la

etapa de hidrólisis de celulosa, entre las que se encuentran inhibición por producto, baja actividad β-

glucosidasa y alta temperatura óptima de reacción, y que estas limitantes pueden ser resueltas mediante

la combinación de diversas fuentes enzimáticas, ¿Cómo afectará la interacción resultante de policultivos

de hongos filamentosos (nativos del estado de Veracruz) el perfil de celulasas (endoglucanasa,

exoglucanasa, β-glucosidasa, cantidad de isoformas) y xilanasas producido?; y ¿Las celulasas producidas

por hongos habitantes de climas frios (Parque Nacional Pico de Orizaba) tendrán una temperatura óptima

de reacción mesófila, que las haga elejibles para procesos de fermentación-sacarificación simultánea?

46

4. Hipótesis

4.1 Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar

Si la enzima lacasa es la principal responsable de la deslignificación biológica llevada a cabo por

Pycnoporus sanguineus, entonces;

H0: Mejorar las condiciones de producción de esta enzima (i.e. fuente de nitrógeno, luminosidad,

presencia y cantidad de inductor) no permitirá deslignificar selectivamente bagazo de caña de azúcar con

este hongo.

H1: Mejorar las condiciones de producción de esta enzima (i.e. fuente de nitrógeno, luminosidad,

presencia y cantidad de inductor) permitirá deslignificar selectivamente bagazo de caña de azúcar con

este hongo.

4.2 Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-sacarificación

simultánea

Si la descomposición de la lignocelulosa es llevada a cabo de manera natural, por consorcios

microbianos, entonces;

H0: La interacción de diversas especies de hongos filamentosos en un bioreactor no promoverá la

producción de un pool enzimático de mayor actividad celulasa y mayor riqueza de isoformas que los

monocultivos.

H2: La interacción de diversas especies de hongos filamentosos en un bioreactor promoverá la

producción de un pool enzimático de mayor actividad celulasa y mayor riqueza de isoformas que los

monocultivos.

Si los organismos adaptan sus requerimientos metabólicos por medio de presiones ambientales

selectivas, entonces;

H0: Las celulasas producidas por hongos provenientes de climas fríos (Parque Nacional Pico de Orizaba)

no poseerán temperaturas óptimas de reacción más bajas que aquellas provenientes de hongos tropicales

(i.e. Trichoderma reesei), y no podrán ser utilizadas en procesos de fermentación-sacarificación

simultánea.

H3: Las celulasas producidas por hongos provenientes de climas fríos (Parque Nacional Pico de Orizaba)

poseerán temperaturas óptimas de reacción más bajas que aquellas provenientes de hongos tropicales

(i.e. Trichoderma reesei), y podrán ser utilizadas en procesos de fermentación-sacarificación simultánea.

47

5. Objetivos

5.1 Objetivo general

Desarrollar un proceso de producción de lacasas y celulasas, basado en conocimientos de ecología

microbiana, con el fin de utilizar dichas enzimas en el proceso de pretratamiento e hidrólisis de bagazo

de caña de azúcar, para la producción de bioetanol celulósico.

Específicos:

5.2 Inducción de lacasas

i) Optimizar las condiciones de luminosidad, fuente de nitrógeno y fuente de inductor de lacasa que

promuevan mayor actividad enzimática lacasa, para disminuír la cantidad de lignina y la cristalinidad de

la celulosa de bagazo de caña de azúcar, en cultivos solidos de Pycnoporus sanguineus; para obtener un

bagazo de caña de azúcar que sea más digerible para las celulasas.

5.3 Optimización de la producción de celulasas para procesos de hidrólisis e hidrólisis y

fermentación simultánea

i) Obtener a partir de cultivos mixtos de hongos filamentosos, un complejo celulasa con un balance entre

actividades endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa, y que posea riqueza de isoformas (robustez).

ii) Obtener al menos 1 cepa de hongo que produzca celulasas con temperatura óptima de reacción de

30°C (o cercada a ella), mediante la realización de una bioprospección en ecosistemas fríos (bosque de

coníferas y páramo de altura del Parque Nacional Pico de Orizaba).

48

6. Metodología general

___________________________________

49

6.1 Etapas del proyecto

El proyecto de tesis se estructuró en tres etapas, correspondientes a los tres capítulos del presente

documento (Figura 14), i) Inducción de lacasas, ii) Producción de celulasas y iii) Producción de etanol

utilizando bagazo pretratado con P. sanguineus.

Figura 14. Esquema general de la organización del proyecto de tesis. La etapa 1 y 2 se realizaron de manera independiente y

convergen en la etapa 3.

1. Inducción de lacasas

1. Optimización de la producción de lacasa en cultivos liquidos de P. sanguineus.

2. Las mejores condiciones de inducción de lacasa se utilizaron para realizar pretratamientos de BCA en cultivos en estado sólido.

2. Producción de celulasas

1. Bioprospección de hongos productores de celulasas en mantillo de bosques veracruzanos.

2. Caracterización de la producción de celulasas en monocultivos y policultivos para lograr producir xilanasas y un complejo celulasa con balance entre actividades endo, exo y β-glucosidasa.

3. Evaluación de la temperatura óptima de reacción de las celulasas producidas.

3. Producción de etanol

1. El bagazo sometido a distintos pretratamientos fue caracterizado por resonancia magnética nuclear y se comprobó la eficiencia del pretratamiento mediante hidrólisis enzimática en condiciones estándar, y su posterior fermentación a etanol

Producto de etapa:

BCA pretratado para

utilizarse en la

producción de

bioetanol

Producto de etapa:

Celulasas con

características adecuadas

para utilizarse en la

hidrólisis de BCA

Producto de etapa:

Etanol celulosico

50

6.2 Etapa 1. Inducción de lacasas

La etapa 1 se subdivide a su vez en tres etapas. Como se mencionó en secciones anteriores, la lacasa es

producida en mayor o menor cantidad dependiendo de las condiciones fisicoquímicas y biológicas a las

que esta expuesto el hongo productor. En este estudio, se seleccionaron las siguientes variables como

posibles agentes causales de inducción de esta enzima en P. sanguineus:

Longitudes de onda de la luz visible. Con base en los reportes previos del efecto de esta variable sobre la

producción de celulasas y ciertas oxidoreductasas.

Fuente y concentración de nitrógeno. Pues el N es un macronuriente que afecta tanto el metabolismo

primario como el metabolismo secundario de los hongos, y su interacción (tipo de suministro y cantidad)

con inductores químicos podría tener efectos sinérgicos sobre la producción de lacasa.

Inductores químicos. Principalmente colorantes con aplicaciones industriales, pues al ser descartados en

aguas residuales represenan una fuente constante de bajo costo de inductores para la producción de

lacasa. El efecto de estas variables sobre la producción de lacasa fue medido en cultivos liquidos del

hongo P. sanguineus. Este hongo fue colectado en 2012 en un cañal de Jalcomolco, Veracruz

(19°20’00’’N, 96°46’00’’W) e identificado por taxonomía clásica por F. Ramírez-Guillén y depositado

en el herbario XAL del INECOL A.C. con el nombre de F. Ramírez-Guillén 932.

Figura 14. Hongo Pycnoporus sanguineus utilizado para

experimentos de inducción de lacasa y deslignificacion

biológica de bagazo de caña de azúcar en estado sólido.

Una vez aislada la cepa, la identidad del hongo fue corroborada por secuenciación de la region ITS

rDNA (Internal Transcriptional Spacers) (Schoch et al., 2012). Para esto el ADN del micelio fue

extraido utilizando el método de extracción por fenol:cloroformo (Anexo 11.10), amplificado mediante

PCR de acuerdo a las condiciones descritas en White et al. (1990). El amplicon fue secuenciado en

Elimbiopharm (USA) y la secuencia obtenida se comparó con las secuencias depositadas en GenBank

mediante el algoritmo Blastn.

51

La cepa de P. sanguineus se mantuvo en refrigeracion a 4°C en medio Papa Dextrosa Agar (PDA) hasta

ser requerida para experimentacion. A continuación se describen los diseños de los experimentos

realizados para evaluar el efecto de: 1) exposición a diferentes longitudes de onda de la luz ; 2) el efecto

del etanol y de la fuente y concentración de nitrógeno y 3) el efecto de diferentes colorantes fenólicos

sobre la producción de lacasa en cultivos liquidos de P. sanguineus.

6.2.1 Efecto de la exposición a luz sobre la producción de lacasa

Para evaluar el efecto de la exposición de P. sanguineus a distintas longitudes de onda de la luz, sobre su

producción de lacasa, proteína extracelular y biomasa, se construyeron cámaras de luz LED (Light

emiting diodes) que ofrecieran un ambiente de luz controlada, constante y de 360° (Figura 15). Los

cultivos liquidos inoculados con un cuadro (0.25 cm2) de PDA con micelio reactivado (6 dias de

crecimiento) se depositaron dentro de las cámaras, se cubrieron con cartulina negra opaca para evitar

otras interferencias de luz y se depositaron dentro de una camara ambiental Binder con emperatura

controlada de 30°C.

Figura 15. Camaras de luz LED construidas para

evaluar el efecto de exponer a diferentes

longitudes de onda de luz al hongo P. sanguineus

sobre su producción de lacasa.

Cuatro diferentes longitudes de onda fueron evaluadas: luz blanca (combinación de 460 y 560 nm; 750

lx), luz verde (525 nm; 675 lx), luz azul (460 nm; 22.66 lx) y luz roja (660 nm; 183.5 lx) y como

controles se utilizaron cultivos en oscuridad. Los datos de longitud de onda fueron obtenidos del

fabricante y los de luminosidad mediante un luxómetro (Fisher Scientific).

Los cultivos liquidos consistieron en frascos de vidrio de 250 mL que contenían 150 mL de medio

mínimo (Kyi 2011), con la siguiente composición: 5 % de una solución base de sales compuesta de 6 g

de NaNO3, 0.52 g de KCl, 0.52 g de MgSO4, y 0.82 g de KH2PO4 por litro, y 0.02 % de una solución

Hutner de elementos traza compuesta de 0.22 g de ZnSO4, 0.11 g de H3BO3, 0.05 g de MnCl2, 0.05 g

de FeSO4, 0.016 g de CoCl2, 0.016 g de CuSO4, y 0.011 g de (NH4) 6MO7O24 por 100 ml y 1 g/L de

glucosa como fuente de carbono.

La actividad lacasa y la cantidad de glucosa consumida fueron cuantificadas cada 4 días en un periodo de

20 días. La actividad lacasa fue determinada de acuerdo a Criquet (1999) (Anexo 11.7), mientras que la

52

cantidad de glucosa consumida se estimó midiendo la cantidad de azúcares reductores, presentes en el

medio de cultivo, de acuerdo a Miller (1959) y modificado por Durán y Muñóz (2003) (Anexo 11.6). La

producción de biomasa se determinó al final del experimento mediante gravimetría de masa seca1.

Al término del experimento, para conocer si había diferencias entre los tratramientos, los datos fueron

analizados estadísticamente mediante análisis de varianza (ANDEVA) de una via, y cuando el

ANDEVA fue significativo (P < 0.05), se realizaron pruebas post hoc de Fisher LSD. Además, para

conocer si existió relación entre la producción de lacasa y la cantidad de luxes y/o la longitud de onda a

la que el hongo fue expuesto, se realizaron correlaciones múltiples de Pearson. Todos estos análisis se

realizaron en el programa estadístico STATISTICA 7 (StatSoft, 2004). Los resultados experimentales

arrojaron que la luz ejerce un efecto negativo en la producción de lacasa (Resultados, capítulo 1.1), por

lo que se seleccionó la oscuridad como ambiente para efectuar la deslignificación biológica de BCA.

6.2.2 Efecto del etanol, la fuente y concentración de nitrógeno sobre la producción de lacasa.

Una vez determinado el efecto de la exposición al efecto de luz visible sobre la producción de lacasa, se

procedió a evaluar el efecto de la fuente y concentración de nitrógeno, así como la adición o no de etanol

sobre la producción de esta enzima.

Como se mencionó en la revisión del estado del arte, la lacasa está regulada en algunos hongos por el

mecanismo llamado regulación catabólica del nitrógeno; por lo tanto, la disponibilidad de fuentes

orgánicas (polímeros complejos) o de fuentes minerales (simples) podría afectar la producción de lacasa.

Por su parte, algunos reportes previos indican que el etanol puede o no inducir la producción de lacasa;

con base en estos antecedentes, diseñamos un experimento trifactorial, tomando como variables

explicativas la presencia (3 g.L-1

) o ausencia de etanol (0 g.L-1

), el tipo de nitrógeno agregado al medio

de cultivo (mineral u orgánico), y la concentración de la fuente de nitrógeno en el medio (1, 2 y 3 g.L-1

).

Como fuente de nitrógeno orgánico se seleccionó el extracto de levadura, y como fuente de nitrógeno

mineral se seleccionó urea. Como variables de respuesta se midieron la actividad lacasa (Criquet, 1999)

(Figura 16), la cantidad de proteína extracelular de acuerdo a Bradford (1969) (Anexo 11.8) y la cantidad

de azúcares liberados (Miller, 1959) a partir del BCA utilizado como fuente de carbono. Para saber si

existían efectos combinados entre la concentración y la presencia y ausencia de etanol, en ambos tipos de

fuentes de nitrógeno (i.e. organico y mineral), los datos fueron analizados mediante modelos de

superficie de respuesta; a su vez, para conocer si existían efectos de las variables explicativas sobre las

de respuesta, se realizaron pruebas de ANDEVA. Los análisis de este experimento se realizaron en el

programa STATISTICA 7 (StatSoft, 2004) (Resultados, capítulo 1.2). 1 Las variables glucosa consumida y biomasa producida se midieron con el propósito de descartar efectos nocivos de la

exposición a diferentes fuentes lumínicas, sobre el crecimiento de P. sanguineus

53

Figura 16. Medición de actividad lacasa por espectrofotometría. Para la

realización de este experimento se contó con el apoyo de la estudiante Norma

Elia Sandoval López.

6.2.3 Evaluación de colorantes fenólicos como inductores de actividad lacasa

Una vez descartado el uso de etanol como inductor de lacasa, se procedió a realizar un experimento para

evaluar el posible uso de colorantes fenólicos para inducir esta enzima, con base en los antecedentes

reportados de la inducción de fenol-oxidasas con algunos colorantes y/o compuestos fenólicos. Cuatro

colorantes fueron evaluados para fungir como inductores en medio líquido: ácido carmínico, amarillo

alizarina, azul anilina y cristal violeta (Figura 17).

Figura 17. Colorantes fenólicos evaluados como inductores de lacasa en cultivos líquidos de P. sanguineus.

54

El experimento llevado a cabo tuvo un diseño bifactorial, donde se evaluaron el tipo de colorante y la

concentración de colorante en el medio (0, 0.01, 0.02 y 0.03 mM). Los cultivos se realizaron en

recipientes líquidos de 500 mL, que contenían 150 mL de medio líquido basal (Eggert, 1996) con la

siguiente composición por litro: 1 g de KH2PO4, 0.26 g de NaH2PO4, 0.317 g de (NH4)2SO4, 0.5 g de

MgSO4 7H2O, 0.5 mg de CuSO4, 74 mg de CaCl2, 6 mg de ZnSO4, 5 mg de FeSO4, 5 mg de MnSO4, 1

mg de CoCl2, suplementado con carboximetil celulosa (CMC, 2 %) y extracto de levadura (1 g.L-1

)

como fuente de nitrógeno. Como controles se utilizaron cultivos sin la adición de colorantes.

Los cultivos fueron colocados en una cámara ambiental (Binder) (Figura 18) y cada 3 días se realizaron

muestreos de actividad enzimática lacasa y se estimó el % de degradación de los colorantes mediante un

modelo de regresión lineal (Anexo 11.9), al finalizar el tiempo de incubación se cuantificó la cantidad de

biomasa producida mendiante gravimetría en base seca.

Figura 18. Cultivos líquidos de P. sanguineus expuestos

a diferentes colorantes fenólicos. Tiempo de incubación 9

días.

Para conocer si el tipo de colorante agregado al medio y su concentración tenían efecto sobre la

producción de lacasa, los datos obtenidos fueron analizados mediante ANDEVAS y pruebas posthoc de

Fisher LSD. Asimismo, el % de degradación y la biomasa producida fueron correlacionados con la

cantidad de lacasa producida mediante correlaciones múltiples de Pearson.

El colorante que más indujo la producción de lacasa (ácido carmínico, ver Resultados, capítulo 1.3), fue

seleccionado para fungir en inductor en la siguiente fase experimental: la deslignificación de BCA en

estado sólido. Para esta fase experimental, 50 g de bagazo de caña de azúcar secos fueron humedecidos

al 80% w/v con medio basal + extracto de levadura (1 g.L-1

) y diferentes concentraciónes de ácido

carmínico: 0.01, 0.006, 0.003 y 0 mM. Como variables de respuesta, se midieron la actividad enzimática

lacasa, la actividad endoglucanasa2, y se realizó un análisis químico del BCA mediante Resonancia

2 Debido a que se pretende inducir una deslignificación selectiva, por lo que la actividad celulasa no es deseable en esta fase

experimental

55

Magnética Nuclear (NMR) del 13

C en estado sólido, con Polarización cruzada (CP) y en ángulo mágico

(MA = 54.44°) en un espectrofotómetro Bruker Advance DSX 400 MHz. Esta técnica no destructiva, es

un poderoso método para conocer la proporción de compuestos orgánicos en biomasa, y se utilizó para

conocer la proporción de carboxilos (COOH), compuestos aromáticos, O-alquilos y alquilos; asimismo,

se evaluó la proporción de aromaticidad y el grado de cristalinidad de la celulosa, mediante la señal

diferencial del carbono 4 de las unidades de pirano glucosa, de acuerdo a Park et al (2010). Los datos

obtenidos de la 13

C CPMAS NMR se utilizaron como indicadores de éxito del proceso de

deslignificación de BCA. El análisis de los espectros de 13

C CPMAS NMR, y el cálculo de la integral

bajo la curva se realizó con los programas Dmfit 2011 (Massiot, 2002) y MestReNova 10.0.2 (Mestrelab

Research S.L.).

Los cultivos en estado sólido (fermentación en estado sólido, Figura 19) se realizaron en bolsas de

polipapel y se incubaron en oscuridad en una cámara ambiental (Binder) a 30°C. Cada 4 días se tomaron

tres bolsas para ser utilizadas como muestras sacrificables y se extrajo la proteína extracelular de acuerdo

a Criquet (1999) (Anexo 11.10). La proteína concentrada se utilizó para estimar la actividad lacasa y

endoglucanasa.

Para la actividad lacasa, la mezcla de reacción fue de la siguiente manera: 100 µL de extracto

enzimático, 880 µL de buffer de sodio-acetato pH 5 y 20 µL de siringaldazina 0.2 mM. La reacción se

realizó a 37°C con un baño maría y la cinética de oxidación de siringaldazina a quinona se leyó en un

espectrofotómetro UV-Vis durante 90 segundos; la pendiente de la cinética fue utilizada para calcular la

actividad enzimática, utilizando un coeficiente de extinción molar de 65000. La actividad enzimática fue

reportada como U por g de masa seca, por minuto de reacción (U.gDM-1

).

Figura 19. Micelio de P. sanguineus creciendo

sobre BCA en cultivo sólido. Los cultivos

utilizados como pretratamiento se realizaron en

bolsas de polipapel.

Por otro lado, la actividad endoglucanasa se determinó de acuerdo a Ghose (1987). La mezcla de

reacción fue de la siguiente manera: 250 µL de enzima concentrada se mezclaron con 250 µL de CMC al

2%, la mezcla se incubó durante 1 h a 50°C y al finalizar la reacción se detuvo con 1 mL de reactivo

56

DNS. La cantidad de azúcares reductores liberados de la CMC se calculó mediante el procedimiento de

Miller (1959), utilizando una curva patrón de glucosa (Anexo 11.3).

Los datos obtenidos de esta fase experimental (Resultados, capítulo 1.3) fueron analizados

mediante ANDEVAS y pruebas posthoc de Fisher LSD. Una vez conocida la composición química

estructural del BCA sometido a un pretratamiento biológico con P. sanguineus se procedió a evaluar su

digestibilidad enzimática, en comparación con BCA sometido a pretratamientos químicos.

6.3 Etapa 2. Optimización de la producción de celulasas para procesos de

fermentación-sacarificación simultánea

Como se mencionó en la sección – Estado del Arte – la fermentación-sacarificación simultánea (FSS) es

un proceso que hidroliza la lignocelulosa y en el mismo tiempo/espacio fermenta los azúcares liberados

por las enzimas a etanol; esto último puede realizarse tanto con levaduras como con bacterias. El

objetivo de este proceso es evitar la inhibición de las enzimas por su producto liberado i.e.

glucosa/celobiosa.

Sin embargo, la mayor limitante de este proceso es que las enzimas comercialmente disponibles,

producidas con el hongo T. reesei tiene una temperatura óptima de reacción de 50°C, mientras que la

temperatura de fermentación de las levaduras es de 30°C, además, las enzimas de este hongo poseen

deficiencia de β-glucosidasa lo que conlleva a una hidrólisis incompleta del sustrato. Para resolver esta

problemática, son necesarias estrategias de producción de enzimas que i) posean alta actividad catalítica

a 30°C, ii) tengan actividades endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa proporcionadas, para lograr

una hidrólisis eficiente.

Por lo tanto, el presente proyecto contribuye en optimizar la producción de celulasas para ser utilizadas

en procesos de FSS mediante el: i) Aislamiento de cepas de hongos que esten adaptadas a condiciones

climatológicas frías, y que sean capaces de producir celulasas que tengan mayor actividad catalítica a

30° C que las celulasas de T. reesei. y ii) Utilizar consorcios de hongos para la producción de complejos

celulasa que posean mayor actividad catalítica que las celulasas de monocultivos. Para lo cuál se

diseñaron los siguientes diseños experimentales:

6.3.1 Bioprospección de cepas de hongos productoras de celulasas de mantillo de bosques

veracruzanos

Uno de los objetivos de este proyecto de tesis fue la optimización de la producción de celulasas

utilizando hongos nativos de ecosistemas veracruzanos. La bioprospección de dichas cepas se realizó en

dos etapas, la primera buscó aislar hongos de bosque mesófilo de montaña (Santuario de bosque de

57

niebla, Coatepec Veracruz), de ecosistemas tropicales (plantación de Citrus sp) y de bosque de pino

(Parque Nacional Cofre de Perote).

En los sitios anteriormente mencionados, se recogieron muestras de mantillo durante el periodo octubre-

noviembre de 2013, se depositaron en bolsas plásticas y se llevaron al laboratorio. Posteriormente,

fragmentos de hojarasca fueron sembrados directamente en cajas Petri que contenían el medio selectivo

Czapek Dox Agar, suplementado con tetraciclina 50 mg.L-1

para inhibir el crecimiento de bacterias. Los

hongos que crecieron en el medio fueron resembrados secuencialmente hasta obtener cepas axénicas.

Antes de evaluar la producción de celulasas en cultivos líquidos, la presencia de celulasas se corroboró

en medio de Agar-CMC con micelio crecido por 6 días y tinción con rojo Congo al 0.1 % (Carder, 1986)

(Figura 19). Derivadas de esta bioprospección, 4 cepas fueron seleccionadas para evaluar el efecto de

utilizar cultivos mixtos para aumentar la producción de celulasas y obtener un complejo enzimático con

actividades endo, exo y β-glucosidasa proporcionadas (Resultados capítulo 2.1).

Figura 19. Prueba cuantitativa de producción de celulasas

por tinción con rojo congo (Carder, 1986). a) hongo

Aspergillus niger aislado de hojarasca de una plantación de

Citrus sp (Tuzamapan, Veracruz); b) tinción con rojo congo,

el área más clara indica degradación de la CMC por hidrólisis

enzimática.

Las cepas fueron identificadas mediante secuenciación de la region ITS rDNA (internal transcriptional

spacers) (Schoch et al., 2012) en las condiciones anteriormente señaladas, y se construyeron arboles

filogenéticos que soportan la identificación molecular de las cepas (Resultados capítulo 2.1).

6.3.2 Efecto de la interacción de diferentes cepas de hongos sobre el perfil de celulasas producido.

Para probar nuestra hipótesis de que, al utilizar policultivos de hongos filamentosos, es posible producir

un complejo enzimático de celulasas con actividades endo, exo y β-glucosidasa proporcionadas y con

mayor actividad que al utilizar monocultivos, se realizaron cultivos liquidos (medio basal, Eggert 1996)

utilizando todas las combinaciones posibles de las cepas obtenidas de la primera bioprospección (Tabla

6). 150 ml de medio de cultivo suplementado con BCA al 2%, contenido en matraces Erlenmeyer fueron

inoculados con cuadros de PDA (25 cm2) que contenían micelio reactivado (6 días de crecimiento) y se

incubaron en oscuridad sin agitación durante 20 días (Figura 22).

Cada 4 días se realizaron muestreos que consistieron en la toma de una alícuota para determinar las

58

actividades enzimáticas endoglucanasa, exoglucanasa, β-glucosidasa y xilanasa; la cual se midió pues es

una importante enzima involucrada en la hidrólisis de hemicelulosa. Las actividades enzimáticas se

calcularon de acuerdo a Ghose (1976), cuantificando la cantidad de azúcares reductores liberados a partir

de sustratos específicos i.e. CMC para endoglucanasa, Avicel (celulosa microcristalina) para

exoglucanasa, p-nitrofenil β-D glucopiranosido (PNG) para β-glucosidasa y xilano de birchwood para

xilanasa.

Tabla 6. Combinaciones de cepas evaluadas para producir celulasas en cultivos liquidos.

Código de

tratamiento

Tipo de

cultivo

Cepas

M1

Monocultivos

F. oxisporum

M2 Trich1

M3 Trich2

M4 Aspsp

C1

Cocultivos

F. oxisporum + Trich1

C2 F. oxisporum + Trich2

C3 F. oxisporum + Aspsp

C4 Trich1 + Trich2

C5 Trich1 + Aspsp

T1

Tricultivos

F. oxisporum + Trich1 + Trich2

T2 F. oxisporum + Trich1 + Aspsp

T3 F. oxisporum + Trich2 + Aspsp

T4 Trich1 + Trich2 + Aspsp

P1 Policultivos F. oxisporum + Aspsp + Trich1 + Trich2

Figura 20. Cultivos liquidos de hongos filamentosos empleados para la producción de celulasas en cocultivos y policultivos.

59

La actividad enzimática fue realizada a 50°C en un baño María por 1 hora, detenida con la adición de

reactivo DNS y procesada de acuerdo a la metodología para determinar azúcares reductores (Miller,

1959). Las reacciones fueron leidas en espectrofotómetro a 540 nm y las absorbancias transformadas a

U.mL-1

mediante curvas patrones (Anexos 11.1, 11.2 y 11.3).

Después de 20 días de incubación, los cultivos fueron filtrados para eliminar la biomasa y el BCA;

posteriormente 50 ml del extrato crudo fueron liofilizados para concentrar la proteína disuelta (Figura

23), la cual fue recuperada en 500 µL de agua destilada. Esta proteína se utilizó para la determinación de

isoformas proteicas mediante electroforésis en gel de poliacrilamida (gel de compactación al 5% y gel de

separación al 12%) en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Al finalizar el tiempo de incubación,

el gel fue teñido con una solución de Azul de Coomassie-metanol-ácido acético; el peso molecular de las

isoformas fue determinado mediante su coeficiente de migración Rf (Anexo 11.4) y comparados con un

marcador de peso molecular (14-97 kDa).

Figura 21. Concentración de proteína mediante liofilización para la caracterización del perfil de isoformas protéico.

Los datos de actividad enzimática observada fueron analizados mendiante un análisis de componentes

principales (ACP) a partir de una matriz de correlación de Pearson, para determinar si las distintas

combinaciones de cepas afectan el patrón de actividad enzimática observada. Los datos fueron

graficados en un triplot utilizando las cepas empleadas en los cultivos como variables complementarias

(Resultados, capítulo 2.1). Todos los análisis fueron realizados en el programa estadístico XLSTAT

2014.

6.3.3 Bioprospección de hongos productores de celulasas del Parque Nacional Pico de Orizaba.

Para poder realizar una eficiente fermentación-sacarificación simultánea (FSS) es necesario utilizar

60

celulasas que posean alta actividad catalítica a temperatura de fermentación (i.e. 30°C para

Saccharomyces cereviciae). Sin embargo, las celulasas disponibles de forma comercial producidas a

partir del hongo Trichoderma reesei poseen una temperatura óptima de reacción de 50° C, por lo tanto,

la búsqueda de nuevas cepas que produzcan celulasas con una temperatura óptima de reacción menor a

la de T. reesei y que puedan utilizarse en procesos de FSS se encuentra plenamente justificada. Como se

mencionó anteriormente, uno de los objetivos de la presente tesis fue aislar cepas de hongos con el

potencial productor de celulasas con estas características.

Los hongos, son organismos que poseen alta adaptabilidad al medio, por lo que, cepas de hongos

filamentosos que habiten ecosistemas de clima frío podrían poseer celulasas adaptadas a dichas

condiciones, que requieran menor temperatura para realizar su catálisis que las celulasas producidas por

hongos tropicales (e.g. Trichoderma sp). Siguiendo este razonamiento, se realizaron muestreos de

mantillo en un gradiente altitudinal en el Parque Nacional Pico de Orizaba (Veracruz, México),

muestreando a diversos pisos altutunidales de bosque de coníferas y páramo de altura (Figura 24).

Figura 22. Sitios de muestreo en la cara nororiental del volcán Pico de Orizaba. El muestreo se realizó en enero de 2015 en la

frontera entre los estados de Veracruz y Puebla.

La toma de muestras consistió en la ubicación de los sitios y el trazo de un transecto de 50 m por sitio,

donde cada 10 metros se tomó una muestra de hojarasca de un cuadro de 30 x 30 cm; la hojarasca se

colocó en una bolsa de plástico (Ziploc) y se guardó en una hielera para transportarla al laboratorio

(Figura 25).

61

Figura 23. Toma de muestras de mantillo en campo

Una vez en el laboratorio, fragmentos de hojarasca de cada muestra fueron sembrados directamente en

medio selectivo Czsapek Dox con CMC como única fuente de carbono. Las morfoespecies detectadas

fueron aisladas secuencialmente hasta obtener cultivos puros. Las cepas aisladas (11 cepas) fueron

posteriormente identificadas mediante secuenciación de su región ITS (Schoch et al., 2012) en las

condiciones anteriormente señaladas, y se construyeron arboles filogenéticos que soportan la

identificación molecular de las cepas. Para evaluar la producción de celulasas de las cepas aisladas, 6 de

ellas fueron cultivadas en medio basal (Eggert, 1996) con diferentes fuentes de carbono al 1% (i.e.

lactosa, CMC y BCA).

Los cultivos se realizaron en frascos de vidrio de 250 mL que contenían 100 mL de medio de cultivo

inoculado con dos cuadros de agar con micelio de 6 días de crecimiento, y se mantuvieron en

condiciones de oscuridad sin agitación por 12 días. Los muestreos para determinar las actividades

enzimáticas celulasas (endoglucanasa, β-glucosidasa) y la cantidad de proteína extracellular total se

realizaron cada 3 días (Figura 26).

Al término del tiempo de incubación, los cultivos fueron filtrados con una bomba de vacío y el extracto

crudo fue dializado por 24 horas para concentrar la proteína de acuerdo al método de Criquet (1999)

(Figura 27). La proteína concentrada se utilizó para evaluar la actividad enzimática celulasa

(endoglucanasa y β-glucosidasa) en un rango de temperatura de 30 a 40°C, utilizando como control

positivo celulasas comerciales de T. reesei y reacciones a 50° C.

62

Figura 24. Toma de muestras para determinación de actividad celulasa de cultivos de hongos. Para esta parte de la tesis se

contó con el apoyo de la estudiante de Ingeniería Bioquímica Gabriela Monserrat García.

Figura 25. Concentración de proteína mediante diálisis en membranas tubulares de celulosa. Como como agente

deshidratante se utilizó polietilenglicol 8000.

Las cepas que produjeron enzimas con mayor actividad celulasa (endoglucanasa y β-glucosidasa,

Resultados, capítulo 2.2) fueron seleccionadas como candidatas para procesos de FSS.

63

6.4 Etapa 3. Digestibilidad enzimática de BCA sometido a diferentes

pretratamientos

Una vez realizados los diferentes pretratamientos biológicos (Resultados, capítulo 3.1) y conocida la

estructura química del BCA obtenido después de un proceso de deslignificación en estado sólido, se

evaluó su digestibilidad enzimática (con celulasas comerciales de Aspergillus niger, marca USB) y se

comparó con la digestibilidad de BCA sometidos a pretratamientos químicos con NaOH y Ca(OH)2 al

5%.

Se realizó un experimento multifactorial, donde las variables explicativas fueron la proporción de

COOH, C-aromático, O-alquilos y alquilos, así como el índice de cristalinidad, la cantidad de

aminoácidos, ergosterol, quitina, y el C4 de la xilosa; del BCA pretratado con P. sanguineus, NaOH y

Ca(OH)2; estas variables fueron medidas mediante 13

C CPMAS NMR. Las variables de respuesta fueron

la cantidad de azúcares liberados i.e. glucosa, xilosa, arabinosa y celobiosa, en función del tiempo. La

actividad celulasa también fue evaluada y se reporta como FPU.mL-1

.

Las condiciones de hidrólisis enzimática utilizadas fueron aquellas definidas por Borges et al (2014), con

algunas modificaciones. La hidrólisis se realizó a un volumen de carga del 2%, en buffer acetato de

sodio 50 mM pH 4.8 (25 ml), con una carga de celulasas para obtener una actividad de 3.5 FPU.g de

BCA-1

, en agitación constante de 150 rpm (De Souza et al., 2014). Los muestreos se realizaron cada 24

horas durante 96 horas (Pereira et al., 2015; De Souza et al., 2014; Borges et al., 2014), mediante la toma

de alícuotas a las cuales se les determinaron las concentraciones de glucosa, xilosa, celobiosa y arabinosa

mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, Waters); a su vez, la actividad enzimática

celulasa total (FPU) fue estimada de acuerdo a Ghose (1987).

Para conocer la forma en que la estructura química del BCA resultante de distintos pretratamientos

(químicos y biológicos) afecta su hidrólisis con celulasas y la cantidad de productos de reacción, los

datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de componentes principales (ACP). Para conocer si

existieron diferencias entre los rendimientos de hidrólisis dependientes del material parental, se

realizaron ANDEVAS con pruebas posthoc de Fisher LSD. Estos análisis se realizaron en el programa

estadístico XLSTAT 2014 y Statistica 7 (StatSoft, 2004).

Posteriormente, los productos de hidrólisis fueron fermentados mediante la adición del equivalente a 0.4

g.l-1

de células secas de Saccharomyces cerevisae (Li et al., 2011). Los muestreos se realizaron cada 24

horas durante 96 horas (Pereira et al., 2015; De Souza et al., 2014; Borges et al., 2014), mediante la toma

de alícuotas a las cuales se les determinaron las concentraciones de glucosa, xilosa, celobiosa, ácido

acético, ácido láctico, arabinosa y etanol mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

64

La biomasa de Saccharomyces cerevisae fue estimada mediante conteo directo en cámara de Neubauer,

cada 20 h.

65

Resultados

Capítulo 1

Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar

__________________________________

66

1.1 Light-induced inhibition of laccase in Pycnoporus sanguineus

Artículo publicado en Folia Microbiológica (Springer)

Publicado en línea el 2 de agosto de 2015

El artículo reporta los resultados obtenidos del capítulo 1. Efecto de la luminosidad sobre la producción

de la enzima lacasa en Pycnoporus sanguineus.

______________________________________

67

DOI 10.1007/s12223-015-0418-7

Light-induced inhibition of laccase in Pycnoporus sanguineus

Christian A. Hernández 1

& Yareni Perroni 1

& José Antonio García Pérez2

&

Beatriz Gutiérrez Rivera3

& Enrique Alarcón1

Received: 22 April 2015 / Accepted: 15 July 2015 # Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i. 2015

Abstract The aim was to determine which specific regions of

the visible light spectrum were responsible for the induction or

inhibition of laccase in Pycnoporus sanguineus. Cultures were

exposed to various bandwidth lights: blue (460 nm), green

(525 nm), white (a combination of 460 and 560 nm), red

(660 nm), and darkness. The results indicate that short wave-

lengths strongly inhibit the production of laccase: green (3.76

±1.12 U/L), blue (1.94±0.36 U/L), and white (1.05±0.21 U/

L) in proportions of 85.8, 92.6, and 96.0 %, respectively;

whereas long wavelengths inhibit laccase production only par-

tially i.e., red light (14.05 ± 4.79 U/L) in a proportion of

46.8 %. Maximum activity was induced in absence of visible

light (30 °C, darkness), i.e., 30.76±4.0 U/L. It is concluded

that the production of laccase in P. sanguineus responds to

light stimuli [measured as wavelengths and lx] and that it does

so inversely. This can be explained as an ecological mecha-

nism of environmental recognition, given that P. sanguineus

develops inside lignocellulose structures in conditions of dark-

ness. The presence of short wavelength light (460–510 nm)

would indicate that the organism finds itself in an external

environment, unprovided of lignin, and that it is therefore

unnecessary to secrete laccase. This possible new regulation

in the laccase production in P. sanguineus has important bio-

technological implications, for it would be possible to control

the production of laccase using light stimuli.

Introduction

It is known that the production of some extracellular enzymes

* Enrique Alarcón

enalarcon@uv.mx

Christian A. Hernández

criss_hdez@live.com

Yareni Perroni

yperroni@uv.mx

José Antonio García Pérez

antoniogarcia01@uv.mx

Beatriz Gutiérrez Rivera beatriz.gutierrez@itstb.edu.mx

1 Institute of Biotechnology and Applied Ecology (INBIOTECA),

Universidad Veracruzana, Av. Culturas Veracruzanas 101, Col.

Emiliano Zapata, Xalapa, Veracruz 91090, Mexico

2 Faculty of Biology, Universidad Veracruzana, Cto. Gonzalo Aguirre

Beltrán s/n, Col. Emiliano Zapata, Xalapa, Veracruz 91090, Mexico

3 Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca, Av. Veracruz S/N

Esq. Héroes de Puebla, Colonia Pemex, Tierra

Blanca, Veracruz 95180, Mexico

involved in the degradation of lignocellulose by certain fungi

is differentially affected by the various wavelengths of the

visible light spectrum (Schmoll et al. 2005; 2012). However,

in spite of the fact that light has been associated to the regu-

latory processes in the production of exoenzymes, little is

known about the mechanisms of the perception of light and

the transduction of signals ( Rodríguez-Romero et al. 2010).

From the adaptive viewpoint, changes in the detection of light

furnishes fungi with information on orientation as well as

exposition to external environments (Herrera-Estrella and

Horwitz 2007; Corrochano 2011), allowing them to adjust

their metabolism to the prevailing conditions for optimal use

of the resources at hand. Pycnoporus sanguineus

(Polyporaceae) is a basidiomycete fungus that, as a saprobe,

produces extracellular enzymes that allow it to decompose

organic polymers and consume its monomers. These fungi

are of special interest because they produce enzymes of the

laccase group that decompose mainly lignin. Laccases are

enzymes with a wide specificity of substratum involved in

68

the white decay of wood (lignin oxidation), and the biotech-

nological knowledge of their production mechanisms has im-

portant industrial and environmental applications. Some of

their applications are the pretreatment of wood for biofuel

production and the recycling or transformation of toxic waste

and other pollutants such as polycyclic aromatic hydrocar-

bons, pesticides, and industrial dyes (Kunamneni et al. 2007;

Jong-Rok and Yoon-Seok 2013; Meng-Juan et al. 2013). It is

known that the production of laccases is affected by chemical

signals; for example, a high abundance of simple carbonated

forms (mainly glucose) leads to a genetic transcriptional inhi-

bition of laccase. This is attributed to the carbon catabolic

repression transcription factors (CreaA; Janusz et al.

2012), which respond to an epigenetic regulation via

G/AMPc/proteins kinase, regulating gene clusters related to

secondary metabolism. Such transcription regulators have

been characterized in the laccase gene (LAC1)- promoting

region of basidiomycete fungi (Janusz et al. 2013; Xiao et

al. 2006).

However, in spite of the fact that light has been associ- ated

with regulation in the production of exoenzymes and with

various bioprocesses in fungi such as sporulation and

regulation of circadian rhythms (Saha et al. 2008), practi-

cally nothing is known of its effects on the regulation in the

laccase production of P. sanguineus. This study sets out to

identify a possible regulation in the production of laccase by

stimuli from changes in the visible light spectrum sur-

rounding P. sanguineus. We therefore set out to find evi-

dence of enzymatic regulation, measured as inhibition,

resulting from wavelength changes within the visible light

spectrum. This may open up new avenues for a better un-

derstanding of the interaction processes between organisms

and their environment, as well as those regulation mecha-

nisms of extracellular enzymes that are mediated by visible

light.

Materials and methods

Strain and inoculum

The strain of P. sanguineus used was isolated from a wild

mushroom found in the cane fields of Jalcomulco,

Veracruz, México (19°20′00″N, 96°46′00″W), registered as

F. Ramírez-Guillén 932 in the Herbarium Xal

(INECOL, A.C.) and identified by ITS 1, 4 amplification

(GenBank accession KR013138). The strain was preserved

in a potato dextrose agar medium (PDA) at 4 °C and

reactivated in Petri dishes with PDA at 30 °C for 7 days

prior to the experiment. As inoculum, during the experi-

mental phase, agar squares 0.25 cm2

in size with reactivated

mycelium were used.

Experimental design

A single-factor design was used to determine the effect of

exposition to different types of visible light on the production

of laccase in P. sanguineus. The mushroom was exposed to

different light wavelengths within the visible light spectrum:

blue (460 nm), green (525 nm), white (combination of 460

and 560 nm), and red (660 nm), using light-emitting diodes

(LEDs). As a means of control, cultivars kept in conditions of

darkness were used. Illuminance (lux=lm/m2) of each treat-

ment, replicated four times, was measured with a lux meter

(Fisher Scientific), corresponding to 22.66 lx (for blue light),

183.5 lx (red), 675 lx (green), and 750 lx (white). In order to

rule out a possible adverse effect of light on the growth of

P. sanguineus, which might affect the production of laccase,

the glucose consumption kinetics and the final biomass pro-

duction were also quantified. Samples for the determination of

laccase and glucose were taken periodically over 20 days.

At the end of the experiment, the significant effects of the

treatments were determined by the one-way variance analysis

protocol [ANOVA; (Zar 1999)] and the Fisher LSD (Least

significant difference) post hoc test. Also, in order to know if

the laccase activity was affected by light wavelength (nm),

and its correspondent lx values, correlations and linear regres-

sion analysis were done. The analyses were carried out on the

STATISTICA 7 software (StatSoft 2004).

Cultivar medium and conditions

The experimental units consisted of glass containers with

150 mL of minimal medium (Kyi 2011), which was composed

of 5 % of a salt solution base composed of 6 g of NaNO3,

0.52 g of KCl, 0.52 g of MgSO4, and 0.82 g of KH2PO4 per

liter, and 0.02 % of a Hutner solution of trace elements com-

posed of 0.22 g of ZnSO4, 0.11g of H3BO3, 0.05 g of MnCl2,

0.05 g of FeSO4, 0.016 g of CoCl2, 0.016 g of CuSO4, and

0.011 g of (NH4) 6MO7O24 per 100 mL and 1 g/L of glucose

as a source of carbon. Cultivars were kept steady and under

constant temperature conditions (30 °C) in an environmental

chamber (Binder, Germany).

Analytic methods

Laccase activities were estimated using syringaldazine as a

substrate, according to Leonowicz and Grzywnowicz (1981)

and modified by Criquet (1999). To 990 μL of cultivar sam-

ple, 10 μL of a solution of syringaldazine at 5 mM were

added. The oxidation kinetics from syringaldazine to quinone

was followed at 525 nm (ε=65,000 M–1

cm–1

) at 37 °C. The

activity was expressed as μmol of quinone formed from

syringaldazine per min (U) per one L of cultivar (U.L–1

).

The consumption of sugars was determined through the spec-

trophotometric method of dinitrosalicylic acid (DNS; Miller,

69

1959); 500 μL of sample was mixed with 500 μL of DNS

reagent, boiled for 5 min, and cooled in an ice bath for 10 min.

Table 1 Fungal biomass produced, glucose consumption, and laccase

activity

Results

ANOVA linear model indicated that the variable wavelength

had significant effects (P=0.027) on laccase activity.

The control treatments (darkness) showed the maximum

laccase activity (30.76±4.00 U/L) while the treatments ex-

posed to different wavelengths of the visible light spectrum

inhibited the laccase enzyme as follows: moderately (red light,

183.5 lx; 660 nm) and strongly (green and blue 525–460 nm; 675 and 22.66 lx, respectively) (P<0.001; F=17.89). Average

values ð-xÞ and standard errors (SE) showed that red, green,

blue, and white light wavelengths gradually inhibited laccase

activity at 46.8, 85.8, 92.6, and 96.0 %, respectively (red=

14.05 ± 4.79 U/L; green = 3.76 ± 1.12 U/L; blue = 1.94 ±

0.36 U/L; and white=1.05±0.21 U/L; Fig. 1). The treatment

in darkness was used as a reference (laccase activity=30.76±

4.00 U/L), taken as 100 % of enzyme activity. According to

the Fisher LSD test, control and red light treatments were

different to all the others (P<0.006 and P<0.01, respectively),

while green, blue, and white treatments did not show signifi-

cant differences among them (P>0.05; see Fig. 1 and Table 1).

The glucose consumption (Fig. 2) and the final biomass

production did not show significant differences from treat-

ment to treatment (P=0.97, F=0.108; P=0.86, F=0.316, re-

spectively; Table 1). Likewise, positive and significant

Fig. 1 Laccase kinetics of P. sanguineus measured during the

experiment. The activity is expressed as μmol of quinone formed from

syringaldazine per min (U) per one L of cultivar (U/L). The points indi-

cate the mean and bar the standard error of three replicates

Significant differences (Fisher LDS): *P>0.01;** P>0.001

correlations (r=0.88; P<0.05) were observed between laccase

activity with light wavelength (Fig. 3a), while negative and

significant correlations (r=−0.56; P<0.05) were observed be-

tween laccase activity and illuminance (Fig. 3b).

Discussion

Given that glucose consumption and total biomass production

were not different from treatment to treatment, the inhibition

of mycelia growth or the capacity to take glucose from the

environment in P. Sanguineus as a result to exposure to visible

light spectrum is ruled out. The production of laccase obtained

in the experiment can thus be attributed to wavelength chang-

es (related to lux values of each treatment) within the visible

light spectrum, as ANOVA’s results indicated, and not to

changes in the mushroom’s growth or a decrease in the con-

sumption of glucose.

Due to the blue light showing the second lowest laccase

activity, we thought that the inhibition of laccase is ascribed

mainly to the effect of wavelength recognition, as was

Fig. 2 Kinetics uptake of glucose dissolved in the culture medium and

recorded during the experiment. The data show approximations of

glucose uptake by spectrophotometer absorbance of the colorimetric

reaction sugars with dinitrosalicylic acid. The points indicate the mean

and bar the standard error of three replicates

Subsequently, the mixture was diluted with 4 mL of distilled

H2O and quantified at 540 nm in a spectrophotometer. The Treatment

(light)

Wavelength

(nm)

Biomass

(mg)

Glucose

consumption (%)

Laccase

activity (U/L)

absorbance was transformed to glucose (g/L) through calibra- tion according to a wave pattern. The final biomass produced

Dark 0 10.0±1.3 34.12 30.76±4.00**

at the end of the experiment was recovered by vacuum filtra- Red

660 8.0±2.2 33.80 14.05±4.79*

tion, dried at 60 °C for 48 h, and gravimetrically quantified. Green

525 9.4±2.5 29.17 3.76±1.12

Blue 460 8.6±4.1 27.72 1.94±0.36

White 460 y 560 9.9±1.5 36.35 1.05±0.21

70

reported for cellulase enzymes (Schmoll et al. 2012; Gyalai-

Korpos et al. 2010). In plants, illuminance has important ef-

fects on the production of some enzymes, mainly those in-

volved in the metabolism of active oxygen species derived

from photosynthetic activity [i.e., superoxide dismutase,

ascorbate dismutase, and monodehydroascorbate reductase

(Mishra et al. 1993)], but there are not studies that report the

influence of this light property on the production of extracel-

lular enzymes of fungi.

Extracellular enzymes of fungi that modify their production at

different light wavelengths are known, like the induction of

glucoamylase production at blue light exposure (Aspergillus

niger, Zhu and Wang 2005) and cellulase at the same visible

light spectrum (Herrera-Estrella and Horwitz, 2007). In this

study, we report that laccase, the main lignin-degrading en-

zyme in basiodiomycetes, is also light-regulated in

P. sanguineus.

Our results showed a greater laccase inhibition with short

wavelengths (blue light, 460 nm, 22.66 lx) than with long

ones (red light, 660 nm, 183.5 lx). This suggests that

extracellular laccase production could be regulated by the

photosystem WC (white collar system) present in ascomy-

cetes, zygomicetes, and basidiomycetes ( Rodríguez-

Romero et al. 2010). The WC detects blue light and par-

ticipates in the regulation of genetic expression in fungi

(e.g., cellulases) through DNA binding proteins (zinc fin-

gers proteins; Ballario et al. 1996; Ballario and Macino

1997). Moreover, it has been reported that blue light in-

hibits the production of some intracellular oxidoreductases

such as isoamyl alcohol oxidase and thioredoxin peroxi-

dase ( Rosales-Saavedra et al. 2006), which could suggest on

the influence of this system in the regulation of laccase in P.

sanguineus, given the strong inhibition of this en- zyme

(92.6 %) with blue light (460 nm, 22.66 lx) in this study.

Green light also significantly inhibited laccase production (85.8

%). This kind of light has been associated to important

implications in fungi metabolism e.g., pigment and biomass

inhibition (Velmurugan et al. 2010) and reduction in the germi-

nation of spores in phytopathogenic fungi (Stevenson and

Pennypacker 1988; Buck et al. 2010). However, as far as we

know, this is the first report on inhibition of extracellular

enzymatic activity by green light in a basidiomycete fun-

gus. Besides, contrary to what the literature reports

(Velmurugan et al. 2010), in this study, no adverse effects

were observed on biomass production or glucose con-

sumption when P. sanguineus was exposed to this wave-

length (green light, 525 nm).

Though studies on the physiological effects of green light on

fungi are many, the detection mechanisms of these organ-

isms have not been fully understood and nothing is known

about the presence of a specific photoreceptor for this wave-

length (525 nm). It has been suggested that opsins could act as

such photoreceptors (Biezke et al. 1999; Rodríguez-Romero et

al. 2010); however, this hypothesis needs testing.

Red light partially inhibited laccase production. In

Aspergillus fungi, this wavelength (red to distant red) is de-

tected by FphA phytochromes, which intervene in physiolog-

ical processes such as inhibition of spore germination (Röhrig

et al. 2013) and the repression of sexual development

(Blumenstein et al. 2005) in Aspergillus nidulans. However,

red light has not been associated to the induction/inhibition of

enzymes involved in degradation of lignocellulose. Further

studies will allow us to prove whether the partial inhibition

of laccase observed here is carried out by the FphA

phytochrome.

The results lead to a conclusion that inhibition of laccase

production within the visible light spectrum responds to an

illuminance gradient where low illuminance states [long

wavelengths; red (660 nm; 183.5 lx)] partially inhibit enzyme

Fig. 3 Correlations between laccase activities (U/L) and wavelength (a), and between laccase activities and illuminance (b). Each point represents the

laccase activity (U/L) of each of the three replicates

71

production, whereas high illuminance states [short wave-

lengths; green (525 nm) and blue (460 nm), corresponding

to 675 lx and 22.66 lx, respectively] strongly inhibit it.

Likewise, white light (a combination of 460 and 560 nm, cor-

responding to 750 lx) almost completely inhibits laccase ac-

tivity, whereas the highest activity values were obtained under

conditions of darkness (0 lx).

The ecological implications of this finding contribute to the

understanding of the relationship between fungi and their en-

vironment. Due to the fact that P. sanguineus is a fungus

whose mycelium develops within the lignocellulose (e.g.,

decaying wood) and that it forms its reproductive structures

externally, it can be said that the presence or absence of light is

an important source of information for an energy-saving met-

abolic regulation, as has been proposed before (Tisch and

Schmoll 2010). Following this avenue of thought, we can hy-

pothesize that within the lignocellulose structure (in conditions

of darkness), the fungus must produce laccases in order to

degrade lignin and be able to obtain energy from polymers such

as cellulose and hemicellulose. The presence of light would

indicate that the fungus finds itself in an external environment,

unprovided of lignocellulose, and therefore interprets it as a

regulation signal that laccase production is unnecessary.

The inhibition of laccase production, specifically in the

presence of blue light, could result from the fact that lignin

(a natural laccase substrate) absorbs short light wavelengths,

mainly between 200 and 230 nm and 260 to 280 nm, corre-

sponding to ultraviolet (UV) light (Jahan and Mun 2007), and

that the absorbance of products derived from the oxidation of

lignocellulose (furans, pyrans) is close to the visible light

spectrum (blue, 320 nm). Therefore, the absence of these

wavelengths, due to their absorption by organic polymers, in

combination with the known chemical inductors (phenolic),

would indicate P. sanguineus’ location in a potentially lignin-

rich place, and that laccase production would bring a positive

trade-off, since it would mean access to energy-rich polymers

(cellulose, hemicellulose). Conversely, the presence of short

wavelengths would indicate that there is no need to produce

laccase.

Further molecular studies on the expression of the gen LAC in

real time in cultivars exposed to different wavelengths of the

visible light spectrum could bring suitable information that

enrich the data showed here. We think it is important to exper-

iment with the inhibition of specialized trans-membrane pho-

toreceptors in photonic detection (rhodopsins, opsins, etc.) so

as to identify those that are involved in the transduction of

inhibitory signals in laccase production in P. sanguineus and

other basidiomycetes.

We conclude that extracellular laccase production in

P. sanguineus responds to light stimuli, whereby short wave-

lengths within the visible light spectrum (460–525 nm) are

strongly inhibited; long wavelengths (660 nm) are inhibited

only partially, and darkness activates it.

Acknowledgments The authors are grateful to the National Council of

Science and Technology (Conacyt) of Mexico, for the doctoral scholar-

ship (261027) of Hernández Christian, to the PROMEP program of the

National Education Secretary (SEP), and to ECOS-ANUIES-CONACYT

Program through the ECOS project M13A02, for financial support. The

authors are grateful to Biologist Ramírez-Guillén F., from INECOL A.C.,

Xalapa, Mexico, for the taxonomical identification of the fungus. The

authors are also grateful to the Institute of Biotechnology and Applied

Ecology (INBIOTECA), and to the UVCA324 research group from

Universidad Veracruzana, Mexico, for facilities support.

Conflict of interest The authors declare that they have no competing

interests.

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73

1.2 Ethanol induction of laccase depends on nitrogen conditions of Pycnoporus sanguineus

Artículo publicado en Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier).

Publicado en línea el 27 de junio de 2015

El artículo reporta los resultados obtenidos del capítulo 1. Efecto de diversas fuentes de nitrógeno y de

la presencia/ausencia de etanol en la producción de la enzima lacasa en Pycnoporus sanguineus.

______________________________________

74

Electronic Journal of Biotechnology 18 (2015) 327–332

Ethanol induction of laccase depends on nitrogen conditions of

Pycnoporus sanguineus

Christian A. Hernández a, Norma Sandoval a, Julieta Mallerman b, José Antonio García-Pérez c,

Anne-Marie Farnet d, Isabelle Perraud-Gaime e, Enrique Alarcón a,⁎ a Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz, Mexico b Universidad de Buenos Aires (UBA), Buenos Aires, Argentina c Facultad de Biología, Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz, Mexico d Equipe Systèmes Microbiens IMBE, UMR CNRS 7263, IRD 237, Faculté des Sciences Techniques de St. Jérôme, Aix Marseille Université, Marseille, France e Equipe Ecotechnologies et Bioremediation, IMBE, UMR CNRS 7263, IRD 237, Faculté des Sciences et Techniques de St. Jérôme, Aix Marseille Université, Marseille, France

a r t i c l e i n f o Article history:

Received 30 December 2014

Accepted 2 May 2015

Available online 27 June 2015

Keywords:

Enzyme production

Fungal metabolism

Phenoloxidases Urea

Yeast extract

a b s t r a c t

Background: Ethanol has been pointed out as a laccase inducer. However, there are controversial reports about its

efficiency with some fungi. In this study, we hypothesized that ethanol laccase induced in Pycnoporus sanguineus

depends on nitrogen nutriment conditions. To prove this, we assessed laccase production in submerged cultures of

P. sanguineus, with different nitrogen concentrations and with, or without ethanol added in a factorial designed

experiment.

Results: In order to analyze the effects of factors on the response variables, a factorial ANOVA, and response-

surface models were performed. It was found that the nitrogen source was the main factor that affected

laccase production in P. sanguineus. The treatments with yeast extract (2 g/L) and ethanol (3 g/L) induced the

highest laccase activity (31.01 ± 4.9 U/L), while the treatments with urea reached the lowest activity (less

than 1.6 U/L). Ethanol had positive and synergic effects on laccase production, in accordance with the surface

response model, as long as simple nitrogen sources (urea) were not available.

Conclusions: We suggest that laccase in P. sanguineus is regulated by a catabolic nitrogen repression mechanism;

laccase activity is strongly inhibited by urea used as nitrogen source and it decreases when the amount of urea

increases; contrarily, a synergic positive effect was observed between yeast extract and ethanol on laccase

production.

© 2015 Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Production and hosting by Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction

It is well known that nitrogen is one of the main nutrients for microbial metabolism because it is an essential component of proteins and nucleic acids, as well as carbon. Its concentration in the medium and type of

source (e.g. mineral or organic) can affect enzyme production in

submerged fungal cultures [1,2,3]. In fungi, the nitrogen catabolite repression, homologous to the economic theory of microbial metabolism

for carbon sets that, simple sources of nitrogen (e.g. ammonium) are

preferred and consumed before complex sources (e.g. organic complex

sources, such as yeast extract), with the objective of saving resources. For some enzymes linked to secondary metabolism,

e.g. proteases, L-asparaginase and laccase, it is well known that this

mechanism drives their extracellular production [4,5,6,7]; thus, for

fungal laccases, for example, some studies pointed that this enzyme is

* Corresponding author.

E-mail address: enalarcon@uv.mx (E. Alarcón).

Peer review under responsibility of Pontificia Universidad Católica de Valparaíso.

regulated by the nitrogen catabolite repression system [8] and besides,

their production, it responds differentially to diverse nitrogen sources

in the culture medium. Thus, it is assumed that fungal laccases are

activated when carbon and nitrogen are limited [9,10]. Thereby, it has

been observed that laccase production in submerged cultures is

performed in the presence of nitrogen as a simple mineral source (such

as ammonium nitrate and ammonium sulfate [11]), or complex organic

supplies (e.g. a mixture of amino acids, peptone, and yeast extract,

[12,13,14]). In this sense, high laccase yields have been reported, when

complex organic nitrogen was added to the medium,

in contrast with a simple mineral nitrogen source, for Agaricus bisporius

[15], Pleurotus ostreatus [3], Trametes hirsuta [16] and

Trametes pubescens [17]. Besides, the effect of the nitrogen source could

be species and strain specific and varies with culture conditions (e.g.

carbon source, C/N ratio, micro-nutriments content, presence of inducers). Hence, not only the source, but also the concentration of nitrogen in the medium, influences laccase production [10,18].

Other factors also affect laccase production, like the type of inducer:

metal ions (e.g. copper and manganese) [19,20,21]; phenolic

http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbt.2015.05.008

0717-3458/© 2015 Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Production and hosting by Elsevier B.V. All rights reserved.

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Electronic Journal of Biotechnology

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328 C.A. Hernández et al. / Electronic Journal of Biotechnology 18 (2015) 327–332

Table 1

Levels of factors evaluated.

Nitrogen supply N concentration

(g/L)

Ethanol concentration

(g/L)

Code

Yeast extract 1 0 Y1E−

Yeast extract 2 0 Y2E−

Yeast extract 3 0 Y3E−

Yeast extract 1 3 Y1E+

Yeast extract 2 3 Y2E+

Yeast extract 3 3 Y3E+

Urea 1 0 U1E−

Urea 2 0 U2E−

Urea 3 0 U3E−

Urea 1 3 U1E+

Urea 2 3 U2E+

Urea 3 3 U3E+

compounds; some organic molecules, like tannic acids [22], and ethanol

[23,24,25] in white-rot fungi. It has been reported that these inducers

increase the production rate of fungal laccases, both in solid state

fermentation and submerged fermentation. Ethanol has been pointed

out as cheap and less toxic inducer for laccase production [26];

nevertheless, little is known about its induction mode. Some have

speculated that ethanol could cause oxidative stress via membrane

disruption, and/or by the segregation of intracellular Ca+, which acts as a

secondary messenger and induces the laccase genes [27]. Some

authors had recommended the use of ethanol to increase laccase

production, meanwhile other studies have not reported positive effects of

using this alcohol as an inducer; even negative effects were observed in

some cases [23,24]. The effectiveness of ethanol as an inducer of

laccase could be related to other relevant culture conditions, e.g. the

concentration and source of nitrogen. However, little is known in this

field about P. sanguineus. It has been reported that 2,5-xylidine and

cooper sulfate had a synergic and positive effect on laccase production

when combined with organic nitrogen sources [16,17], but there are no

results with ethanol. With this in mind, we hypothesized that the

different results reported so far about the inductive effect of ethanol on

fungal laccase could be due to the differences in nitrogen availability.

Thus, this study was conducted to evaluate the effectiveness of ethanol

as a laccase inducer, in the tropical white-rot fungus Pycnoporus

sanguineus, using different and contrasting nitrogen nutriment

conditions (various sources and concentrations).

2. Materials and methods

2.1. Strain and inoculum

The strain of P. sanguineus used was isolated from a wild mushroom

found in the sugar cane fields of Jalcomulco, Veracruz, Mexico (19°20′

00″N, 96°46′00″W) and preserved in a potato-dextrose-agar medium (PDA) at 4°C. The collected fungus was identified by Ramírez-Guillén F., a classical taxonomy expert, and deposited at XAL Herbarium (INECOL A.C., Xalapa, Mexico) as F. Ramírez-Guillén 932. The fungus strain was

also identified by sequencing the ITS 1 and ITS 4 regions, compared

with sequences in GenBank and the DNA sequence obtained was

deposited in GenBank under the accession number KR013138.

The fungus was reactivated in Petri dishes with PDA at 30°C for seven d prior to the experiment. As inoculum during the experimental

phase, agar squares of 0.25 cm2 in size with the reactivated mycelium of

P. sanguineus were used.

2.2. Experimental design

To determine the response of laccase production in P. sanguineus

under different culture conditions (Table 1) a factorial design was

used, where the independent variables were: i) source of nitrogen

with two levels, yeast extract and urea; ii) concentration of nitrogen

in the source with three levels, 1, 2 and 3 g/L; and iii) ethanol as

laccase inducer with two levels, 0 and 3 g/L. The dependent variables

measured were: i) laccase activity (U/L), ii) extracellular protein

(mg/mL), and iii) simple sugars released from the substrate (g/L). Each

treatment was replicated four times. Samples for the determination of

laccase activity, protein production and simple sugars released were

taken each 4 d for a 20 d period.

2.3. Culture conditions The experimental units were glass containers with 150 mL of basal

medium [11] with the following composition per liter: 1 g of KH2PO4;

0.26 g of NaH2PO4; 0.317 g of (NH4)2SO4; 0.5 g of MgSO4 × 7H2O; 0.5 mg of CuSO4; 74 mg of CaCl2; 6 mg of ZnSO4; 5 mg of FeSO4; 5 mg of

MnSO4; and 1 mg of CoCl2 supplemented with sugar cane bagasse as a

carbon source (2%). The experimental units were incubated in darkness at 30°C in an environmental chamber (Binder, GmbH), without agitation.

2.4. Statistical analysis

To identify if the independent variables have significant effects on

laccase production, a factorial ANOVA was carried out (α = 0.05). The

combined effect of nitrogen concentration in the source and the

ethanol concentration in the medium was analyzed by response

surface methodology [28]. The analysis was carried out using Statistica

7 (Statsoft, Inc.) and GraphPad PRISM (GraphPad Software, Inc.)

software.

2.5. Analytical methods Lacasse activity was estimated using syringaldazine as a substrate,

according to Leonowicz and Grzywnowicz [29]. 10 μL of a solution

of syringaldazine at 5 mM in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 4.5,

were added to 990 μL of culture sample, according to Criquet [30]. The

oxidation kinetics from syringaldazine to quinone was followed at

Table 2

ANOVA effect of all measured parameters on laccase activity, i.e. N source (yeast extract/

urea), N concentration (1, 2, 3 g/L), ethanol concentration (0, 3 g/L) and their

interactions. Significant effects are showed in bold.

Day Effect Df MS F value P

4 N source 1 2.04 7.28 0.01

N concentration 2 0.22 0.80 0.24

Ethanol concentration 1 0.69 2.46 0.12

Ethanol concentration ∗ N concentration 2 0.02 0.08 0.91

Ethanol ∗ N source 1 0.29 1.04 0.31

N concentration ∗ N source 2 0.33 1.20 0.31

Ethanol ∗ N concentration ∗ N source 2 0.10 0.35 0.70

8 N source 1 601.98 59.08 b 0.001

N concentration 2 56.53 5.54 0.007

Ethanol concentration 1 14.63 1.43 0.23

Ethanol concentration ∗ N concentration 2 52.95 5.19 0.01

Ethanol ∗ N source 1 14.90 1.46 0.23

N concentration ∗ N source 2 57.26 5.61 0.007

Ethanol ∗ N concentration ∗ N source 2 53.18 5.22 0.01

12 N source 1 1584.39 282.12 b 0.001

N concentration 2 404.55 72.03 b 0.001

Ethanol concentration 1 240.51 42.82 b 0.001

Ethanol concentration ∗ N concentration 2 369.76 65.84 b 0.001

Ethanol ∗ N source 1 240.41 42.80 b 0.001

N concentration ∗ N source 2 404.59 72.04 b 0.001

Ethanol ∗ N concentration ∗ N source 2 369.80 65.84 b 0.001

16 N source 1 222.70 11.15 0.001

N concentration 2 44.51 2.22 0.12

Ethanol concentration 1 34.25 1.71 0.19

Ethanol concentration ∗ N concentration 2 65.02 3.25 0.05

Ethanol ∗ N source 1 35.19 1.76 0.19

N concentration ∗ N source 2 45.49 2.27 0.11

Ethanol ∗ N concentration ∗ N source 2 64.58 3.23 0.05

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C.A. Hernández et al. / Electronic Journal of Biotechnology 18 (2015) 327–332 329

Fig. 1. Laccase activity observed during 16 d of culture with (a) yeast extract, and (b) urea, as nitrogen source; and with 3 g/L (+) or 0 g/L (−) of ethanol. Bars indicate the mean of the data, and

whiskers the standard error, n = 3. The subscripts numbers indicate concentration in g/L. Note the differences on the ordinate scale (Y axis).

525 nm (ε = 65,000 M−1 cm−1) for 90 sec. The activity was expressed

as μmol of quinone formed from syringaldazine per min (U) per one

liter of culture (U/L).

The releasing of simple sugars was determined by the

spectrophotometric method of 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS), according to

Miller [31]. 500 μL of the sample was mixed with 500 μL of DNS

reagent and boiled for 5 min; later the reaction mixture was cooled for

10 min in icy water. Subsequently, the reaction mixture was diluted

with 5 mL of dH2O and quantified at 540 nm. The absorbance was

transformed into glucose (g/L) through calibration according to a

standard curve. The total of extracellular protein was determined

according to the Bradford method [32]. 500 μL of the sample were

mixed with 500 μL of Bradford reagent (Sigma, USA), the mixture was

left standing for 5 min and quantified spectrophotometrically at 595

nm. The absorbance was transformed into protein (mg/mL) using a

standard curve of bovine serum albumin (BSA).

.

Fig. 2. Influence of yeast extract and ethanol concentrations on laccase produced by P. sanguineus after (a) 4 d; (b) 8 d; (c) 12 d, and (d) 16 d. Changes in color patterns indicate changes on the bserved laccase activity. The response surface graph follows a linear fit of the data; the proposed model is showed

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330 C.A. Hernández et al. / Electronic Journal of Biotechnology 18 (2015) 327–332

3. Results

Laccase production was highly dependent on nitrogen supply conditions (P b 0.05, Table 2). In cultures with yeast extract as

nitrogen supply (Fig. 1a), the highest activity was observed (31.01 ±

4.9 U/L) after 12 d in a culture treated with 2 g/L of yeast extract as a

nitrogen source and 3 g/L of ethanol (Y2E+). Meanwhile, in all

treatments with urea as nitrogen supply (Fig. 1b) laccase activity was

lower than 1.6 U/L.

Nitrogen concentration and ethanol had significant effects on laccase production only at certain moments. Nitrogen concentration

had significant effects after 8 d (F = 5.54; P = 0.007) and 12 d

(F = 72.03; P b 0.001) of culture (when laccase expressed high activity), and ethanol concentration had significant effects only at d 12 (F = 42.82; P b 0.001). Combined effects of ethanol and

nitrogen supply/nitrogen concentration were found at d 8 and 12, and

as well as between nitrogen supply and nitrogen concentration

(Table 2). The surface response analysis showed combined effects of

ethanol and nitrogen concentration on laccase production when yeast

extract was supplied (Fig. 2); ethanol showed positive effects after 8

(m = 0.73; Fig. 2b), 12 (m = 3.07 Fig. 2c) and 16 d (m = 1.13). At d 4,

non-synergic effects were observed between ethanol and nitrogen

concentrations (nitrogen concentration did not show effect, Fig. 2a).

However, at d 8 and 12 the highest laccase activities were observed in

treatments with 3 g/L of ethanol and low nitrogen concentration (Fig.

2b, Fig. 2c).

In cultures with urea, non-effects were observed when ethanol was

added (Fig. 3), and urea concentration only showed an effect after 16 d

of culture (Fig. 3d). When urea was used, the highest laccase activities

were observed at d 16 on treatments with 1 g/L (Fig. 3d).

Extracellular protein production was slightly higher in treatments with

yeast extract than those with urea (Fig. 4a and Fig. 4b). However, no

effects of ethanol addition or nitrogen concentration were observed.

The sugar content in cultures with urea was slightly higher than those

with yeast extract (Fig. 5), but no significant effect was observed.

4. Discussion

In accordance with previous reports for other fungi [3] such as P.

ostreatus, our ANOVA results indicate that the source of nitrogen is the

most significant source of variation in laccase activity, and that the yeast extract (an organic complex source) promotes more laccase production in a submerged culture than urea (a mineral simple source).

Some studies have reported better laccase production with mineral

sources of nitrogen than with organic ones [21], for several species of

Pleurotus. However, it is accepted that inorganic sources lead to lower

laccase yields than organic sources, although both of them promote

good fungal (biomass) development [33]. However, the source of

nitrogen added to the medium and its consequent effect on laccase

activity is species and strain specific, as determined by Mikiashvili et

al. [3]. In this study, we observed that P. sanguineus preferred a

Fig. 3. Influence of urea and ethanol concentrations on laccase produced by P. sanguineus (a) after 4 d; (b) 8 d; (c) 12 d, and (d) 16 d. Changes in color patterns indicate changes on the

observed laccase activity. The response surface graph follows a linear fit of the data; the proposed model is showed.

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Fig. 4. Extracellular protein kinetics produced during 16 d of culture with (a) yeast extract, and (b) urea, as nitrogen source; and with 3 g/L (+) or 0 g/L (−) of ethanol. Bars indicate the

mean of the data, and whiskers the standard error, n = 3. The subscripts numbers indicate concentration in g/L.

medium with an organic nitrogen source for the production of laccase,

as reported previously. Eugenio et al. [23] stated that asparagine is the

best nitrogen source (even better than yeast extract) for laccase

production using P. sanguineus.

According to our results, the nitrogen source concentration used showed significant effects. When yeast extract (at d 8 and 12) and urea (at d 16) concentrations were significant, the highest laccase activities were registered. It suggests that nitrogen concentration has a strong effect on laccase production during the late stages of development of fungi, when secondary metabolism is active [34]. Negative correlations between concentrations of an inorganic nitrogen source (ammonium tartrate) and laccase production were reported for P. sanguineus by Pointing et al. [35]. That study also reported that the highest laccase production was reached when low carbon (glucose) and low nitrogen (ammonium tartrate) sources were added to the medium. Laccase repression occurred at high nutriment (carbon/inorganic nitrogen) conditions. Our surface response results tend to the same conclusion of Pointing et al. [35]: the amount of inorganic nitrogen source – urea, in our case – affects the production of laccase negatively in P. sanguineus. In our study, the highest laccase activity was observed in the treatments with the lowest urea concentrations (1 g/L). The

preference of an organic nitrogen source and the negative correlation between urea concentration and laccase activity may suggest that l

accase production in P. sanguineus could be subjected to a nitrogen

catabolic repression; a mechanism for saving resources that was reported for laccase production in other basidiomycetes, like

Cryptococcus neoformans [8]. It has also been suggested that

Phanerochaete chrysosporium (wild-type) has a regulatory system for

laccase that inhibits its production under sufficient carbon and nitrogen conditions; this can be deregulated in mutant strains [36].

The catabolic nitrogen repression states that in the presence of simple

nitrogen sources the expression of genes for more complex nitrogen

sources (like genes of protease, γ-glutamyl transpeptidase, L-

asparaginase, and permease) is repressed [37]. In this study we

suggest that this regulatory mechanism operates and regulates laccase

production in P. sanguineus; however, more research must be done to

prove that. Nevertheless, the effect of the nitrogen source added to

medium on laccase activity is evident.

In this study, we evaluated submerged cultures of P. sanguineus, but

other studies have reported that in solid-state fermentation, an increment of urea concentration accompanied an increment of laccase

production for P. ostreatus, Lentinula edodes, and Agaricus blazei [10].

This shows how the response of laccase to nitrogen supplies and culture conditions could change accordingly for fungi species.

According to our results, ethanol had a significant effect on laccase

activity at d 12 and showed combined effects with nitrogen conditions at

d 8 and 12. As we previously hypothesized, the effect of ethanol as an

inducer of laccase is linked to other factors. We observed that ethanol

induces laccase production when simple nitrogen sources (urea) are

not available. In previous reports, Eugenio et al. [23] and Barreto et

al. [24] have established that the effect of adding ethanol to the

medium was null or negative on laccase production. Eugenio et al. [23]

used ammonium tartrate (Kirk's medium) to produce laccase with P.

sanguineus. Barreto et al. [24] used glutamine (Trametes defined

medium), a simple organic source of nitrogen to produce laccase with

T. versicolor. In both cases, the nitrogen source of the medium

corresponded to simple sources, one inorganic and one organic. When

more complex mediums were used, ethanol addition had a positive

effect as a laccase inductor. Valeriano et al. [26] used malt extract

medium for the production of laccase, Alves et al. [25] used a

mixture of yeast extract and ammonium sulfate as nitrogen

Fig. 5. Sugar content kinetics in the culture medium during 16 d of culture with (a) yeast extract, and (b) urea, as nitrogen source; and with 3 g/L (+) or 0 g/L

(−) of ethanol. Bars indicate the mean of the data, and whiskers the standard error, n = 3. The subscript numbers indicate concentration in g/L.

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332 C.A. Hernández et al. / Electronic Journal of Biotechnology 18 (2015) 327–332

sources, and Lomascolo et al. [27] used yeast extract; all those studies

suggested that the ethanol is a good laccase-inducer. Following this line

of knowledge, and supported by our results, we conclude that ethanol

can act as a weak inducer of laccase only in the presence of complex

nitrogen sources. Moreover, we hypothesize that this works only when

nitrogen catabolite repression is not operating.

Our study contributes to a better understanding of the use of ethanol as an

inducer of laccase in P. sanguineus, and our results showed that its

functioning as an inducer is dependent on nitrogen nutriment conditions.

5. Conclusion

In accordance with our results, we conclude that: i) laccase production in

P. sanguineus is strongly dependent on the type of nitrogen source

added to medium in submerged cultures; urea inhibits its production

(simple mineral source) and yeast extract (organic complex source)

promotes it. We hypothesize that these results suggest the presence of

a mechanism of nitrogen catabolite repression for P. sanguineus;

however, genomic studies are required to assert it. ii) Ethanol only

functions as a laccase inducer when simple nitrogen sources are not

available in the culture medium; in the presence of complex nitrogen

sources, such as yeast extract, ethanol showed positive synergic effects

on laccase production.

Conflict of interest statement

The authors declare that there are no conflict of interest.

Financial support

We thank to CONACYT (Mexico), for C. Hernández Ph.D. scholarship, and to

ECOS-ANUIES-CONACYT Program for the ECOS Project M13A02.

Acknowledgments

The authors would like to thank the anonymous reviewers of this paper,

as well as the Universidad Veracruzana for its support and the academic

group Structure and Functioning of Forestall Ecosystems (CAUVER-324),

and also to the biologist F. Ramírez-Guillén, from INECOL A.C., Xalapa,

Mexico, for the taxonomical identification of the fungus.

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80

1.3 Laccase induction by synthetic dyes in Pycnoporus sanguineus (L.), and their use

for sugar cane bagasse delignification

Artículo aceptado en Applied Microbiology and Biotechnology (Springer).

Sometido el 03 de mayo de 2016

El artículo reporta los resultados obtenidos del capítulo 1. Evaluación de colorantes fenólicos

como inductores de actividad lacasa en cultivos líquidos y su posterior uso para deslignificar

bagazo de caña de azúcar.

81

Applied Microbiology and Biotechnology

Laccase induction by synthetic dyes in Pycnoporus sanguineus, and their

use for sugar cane bagasse delignification --Manuscript Draft--

Manuscript Number:

Full Title: Laccase induction by synthetic dyes in Pycnoporus sanguineus, and their use for sugar cane

bagasse delignification

Article Type: Original Article

Section/Category: Biotechnologically relevant enzymes and proteins

Corresponding Author: Enrique Alarcón, Ph. D.

Universidad Veracruzana

Xalapa, Veracruz MEXICO

Corresponding Author Secondary

Information:

Corresponding Author's Institution: Universidad Veracruzana

Corresponding Author's Secondary

Institution:

First Author: Enrique Alarcón, Ph. D.

First Author Secondary Information:

Order of Authors: Enrique Alarcón, Ph. D.

Anne-Marie Farnet Da Silva, Ph. D.

Fabio Ziarelli, Ph. D

Isabelle Perraud-Gaime, Ph. D.

Beatriz Gutiérrez-Rivera, Ph. D.

Christian Hernández, B.s.

Order of Authors Secondary

Information:

Funding Information: Mexican Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)

B.s. Christian Hernández

ANUIES-CONACyT-ECOS-NORD (M13A02) Dr. Enrique Alarcón

82

1.3 Laccase induction by synthetic dyes in Pycnoporus sanguineus (L.), and their use

for sugar cane bagasse delignification

Hernández C.1, Farnet AM.

3, Ziarelli F.

4, Perraud-Gaime I.

2, Gutierrez-Rivera B

5, Alarcón E.

1*

1Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana, Xalapa Veracruz, México.

2Equipe Ecotechnologies et Bioremediation, IMBE, UMR CNRS 7263, IRD 237, Aix Marseille Université, Avignon

Université, Campus de l’Etoile, Site de St. Jérôme, Marseille, France 3Equipe Systèmes Microbiens, IMBE, UMR CNRS 7263, IRD 237, Aix Marseille Université, Avignon Université, Campus

de l’Etoile, Site de St. Jérôme, Marseille, France 4Aix Marseille Université, Faculte ́ des Sciences et Techniques de Saint-Jérôme, Spectropole, PO box 512, Avenue Escadrille

Normandie Nie ́men, 13397 Marseille cedex 20, France 5Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca (ITSTB), Tierra Blanca Veracruz, México.

*Correspondence author: enalarcon@uv.mx

Keywords: Alizarin yellow, Carminic acid, Endoglucanase, 13

C CPMAS solid-state NMR, Cellulose crystallinity

Abstract

The use of synthetic dyes for laccase induction in vivo has been few explored. Here, we aimed to characterize the effect of

adding different synthetic dyes to liquid cultures of the white-rot fungus Pycnoporus sanguineus on laccase production. From

the dyes tested, we found that carminic acid (CA) can induce 722% and alizarin yellow 317% more laccase than control

values, and promote better fungal biomass development, meanwhile aniline blue and crystal violet did not show such positive

effects. In addition, CA and alizarin yellow were degraded during P. sanguineus culturing (12 days) up to 95%. With this

basis, CA was selected as the best inducer and induction of laccase was proved in solid-state fermentation (SSF), using

sugarcane bagasse (SCB) as substrate, in an attempt to reach selective delignification. We found that laccase induction

occurred in SSF, and a slightly inhibition of cellulase production was observed when CA was added to substrate; also,

transformation of SCB under SSF was followed with 13

C CPMAS solid-state NMR technique. Our results showed that P.

sanguineus can selectively delignify SCB, decreasing Aromatic C compounds 32.67% in 16 days, meanwhile O-alkyl C

region (polysaccharides) was degraded less than 2%; however, delignification values were not correlated with laccase

activities values. Cellulose-crystallinity index was increased 27.24% in absence of carminic acid, and 15.94% when 0.01 mM

of CA was added to SCB; this dye also inhibit the production of fungal biomass (measured as alkyl C gain). We conclude that

CA is a good inducer of laccase in liquid media, and that P. sanguineus is a fungi with high potential for biomass

delignification.

83

Introduction

Laccases (benzenediol: oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) are enzymes with the capacity to degrade

lignin and other phenolic compounds, like mono-, di- and polyphenols, aminophenols, methoxyphenols,

aromatic amines and ascorbic acid (Ding et al., 2014). Recently, laccases have been proposed as

biocatalyst for many industrial and bioremediation processes, including biobleaching (Zheng et al.,

2012; Monteiro and De Carvalho, 1998), azo-dyes degradation for wastewater treatment (Chhabra et al.,

2015; Kanagaraj et al., 2015), herbicide degradation (Pizzul et al., 2009; Jolivalt et al., 1999),

petroleum-derivate phenols degradation (Vargas and Ramírez, 2002) and biomass delignification (Rico

et al., 2015; Ryu et al., 2013).

Obtaining large amount of laccase is essential for various industrial applications (Songulashvili et

al., 2015); thus, many studies have focused in enhance the production of this enzyme with different

organisms. Laccase are produced by bacteria (Dhiman and Shirkot, 2015; Galai et al., 2009),

filamentous fungi (Cázares-García et al., 2013) and brown-rot fungi (An et al., 2015); however, white-

rot fungi are the prefer producers for the high yields obtained, and the high catalytic laccases produced

(Viswanath et al., 2014). The production of laccase by culturing white-rot fungi, can be done in liquid

media (Songulashvili et al., 2015; Songulashvili et al., 2006) as well in solid-state fermentation (Karp et

al., 2012); and in both systems, the use of inducers can enhance the production of laccase (Hernández et

al., 2015, Khammuang et al., 2013; Meza et al., 2005).

Inducer compounds must have certain characteristics for been used at large scale, two of them

are: exist abundantly and not be expensive; industrial waste meet these assumptions. Many metals (e.g.

Cu+, Mn

+, Cd

+), phenolic compounds (Mann et al., 2015) and synthetic dyes can induce laccase

production in fungi (Kuhar and Papinutti, 2014), and much of them are discarded in wastewaters.

Phenolic dyes are of special interest due to textile industries generate a large amount of wastewater (120

m3/Ton fiber produced) enriched with synthetic dyes (1,100 – 1,300 Hazen units; Anjaneyulu et al.,

2005), which generate environmental problems, e.g. when the azo-dyes are degraded in anaerobic

conditions, can generate carcinogenic aromatic amines (Arslan et al., 2013).

Besides degradation of many phenolic dyes have been proved via laccase catalysis (Kanagaraj et

al., 2015; Younes et al., 2011; Bayramoglu et al., 2010), there are few studies that evaluate the in vivo

induction of laccase by synthetic dyes (Table 1). Phenolic and aromatic dyes can induce laccase

production in fungi, in the knowledge that have been reported that many phenolic and aromatic

compounds do it (Cambria et al., 2011). Also, induce high laccase production in vivo by synthetic dyes

can be very useful for lignocellulose pretreatment, in order to enhance lignin decay, and indirectly,

decrease the cellulose crystallinity index (CI). Achieving the reduction of lignin and CI, cellulose and

84

hemicellulose are more easily hydrolyzed by enzymes (Yu et al., 2014; Yoshida et al., 2008), which is

very important for bioethanol production.

Table 1. Phenolic dyes used for laccase induction or for decoloration test in vivo with fungi

Dye Type Fungi

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dye

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Malachite green Triphenylmethane-

dye

Pycnoporus sanguineus Pointing and Vrijmoed,

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Violet crystal Triphenylmethane-

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Remazol brilliant blue

reactive

Anthraquinonic-dye Trametes villosa Hernández-Luna et al.,

2008

Thus, this work aimed to test the degree of induction of laccase of four synthetic/phenolic dyes:

Carminic acid, Alizarin yellow, Aniline blue and Violet crystal (Figure 1) at different concentrations in

liquid media; and subsequently, utilize the best inducer for enhance the production of laccase in solid-

state fermentation (SSF). Substrate (sugar cane bagasse) modifications were evaluated by 13

C cross

polarization magic angle spinning (CPMAS) nuclear magnetic resonance (NMR), in order to determine

if the addition of dyes to lignocellulose promotes a decay in lignin amount and CI values.

Materials and methods

Strain and inoculum

Pycnoporus sanguineus strain was isolated from the sugarcane fields of Jalcomulco, Veracruz, México

(19°20’00’’N, 96°46’00’’W), cultured on a potato-dextrose-agar medium (PDA), stored at 4 °C and

85

reactivated in Petri dishes with PDA medium at 30 ºC for seven days prior to the experiment. The

collected fungus was identified by Ramírez-Guillén F., a classical taxonomy expert, and deposited at

XAL Herbarium (INECOL A.C., Xalapa, Mexico) as F. Ramírez-Guillén 932. This fungal strain was

identified by sequencing ITS 1 region, compared with sequences in GenBank, and the DNA sequence

obtained was deposited in GenBank under the accession number KR013138.

Experimental design and culture conditions for liquid cultures

In order to determine whether the different aromatic dyes induced laccase production in P. sanguineus, a

bifactorial experiment was designed. Different synthetic dyes were tested to induce laccase production in

liquid cultures of P. sanguineus: Carminic acid, Alizarin yellow, Aniline blue and Violet crystal (Figure

1). The dyes were added at three different concentrations (0, 0.01, 0.02 and 0.03 mM) to 150 ml of

culture medium (basal medium; Eggert, 1996) with the following composition (per litre): 1 g of

KH2PO4, 0.26 g of NaH2PO4, 0.317 g of (NH4)2SO4, 0.5 g of MgSO4 7H2O, 0.5 mg of CuSO4, 74 mg of

CaCl2, 6 mg of ZnSO4, 5 mg of FeSO4, 5 mg of MnSO4, 1 mg of CoCl2, supplemented with carboxy

methyl cellulose as carbon source (2 %) and yeast extract (1 g.L-1

) as nutrient source; pH was adjusted to

6.

86

Figure 1. Phenolic dyes used for laccase induction. a) Azo-dye alizarin yellow; b) Carminic acid, an

anthraquinonic dye with a glycosidic bond with one glucose molecule; c) trisulfonate dye aniline blue; d)

triarylmethane dye crystal violet.

The cultures were performed in quadruplicate, in plastic containers of 500 ml. Each experimental

replicate was inoculated with two plugs of agar-containing mycelium (six days old) and were incubated

in darkness at 30° C in an environmental chamber (Binder, GmbH). Samplings were performed each 3

days for 12 days of incubation to test laccase activity (U.L-1

), meanwhile biomass production (mg.DM-1

)

and dye degradation (%) were determined at the end of the incubation time.

Analytical methods for liquid cultures

Laccase activity in liquid cultures was estimated according to Criquet (1999). 20 μL of a solution of 5

mM syringaldazine were added to 980 μL of culture sample. The oxidation kinetics from syringaldazine

to quinone was followed at 525 nm (ε= 65 000 M-1

cm-1

) at 37 °C for 90 s. The activity was expressed as

μmoles of quinone formed from syringaldazine per minute (U) per one liter of culture (U.L-1

).

Fungal biomass from liquid cultures was calculated at the end of the experiment: cultures were

filtered at vacuum and recovered biomass was dried at 60°C by 48h. Biomass weight was estimated by

gravimetric method, and was reported as milligrams of dry mass (mg.DM-1

). Aromatic dye degradation

was estimated according to linear models obtained from known concentrations (0 to 0.03 mM) and the

absorbance measured at the wavelength of the main peaks (nm) in the visible light-spectrum (Aniline

blue: 595, 610 nm; Violet crystal: 588, 592 nm; Carminic acid 494 nm; Alizarine yellow: 358, 363 nm).

Absorbance was quantified with a UV spectrophotometer and transformed into mM according to linear

models (Table 2).

Table 2. Models utilized for phenolic dyes degradation

Model equation R2

[Aniline blue, peak 595 nm] = (γ 595 nm + 0.46)/1.93 0.82

[Aniline blue, peak 610 nm] = (γ 610 nm + 0.643)/2.22 0.90

[Violet crystal, peak 588 nm] = (γ 588 nm – 2.813)/1.75 0.85

[Violet crystal, peak 592 nm] = (γ 592 nm – 2.19)/1.98 0.90

[Alizarin yellow, peak 358 nm] = (γ 358 nm – 0.913)/1.24 0.93

[Alizarin yellow, peak 363 nm] = (γ 358 nm – 0.94)/1.105 0.92

[Carminic acid, peak 494 nm] = (γ 494 nm – 0.176)/0.81 0.99

Experimental design and culture conditions for solid-state fermentation

The conditions that induced the highest laccase activity were used for the second experimental phase.

87

Different concentrations of carminic acid were tested in solid-state fermentation (SSF): 0.00 mM, 0.003

mM, 0.006 mM and 0.01 mM; a volume of basal medium enriched with yeast extract and carminic acid

was added to 50 g of pre-dried sugar cane bagasse (SCB) until a final humidity of 80% v/w. The wet

SCB was deposited into poly-paper plastic bags and sterilized by autoclaving (120°C:1.5 atm) for 20

min. After cooling, three-agar squares 0.25 cm2 in size with reactivated mycelium (7 days of culture)

were used as inoculum. The mesocom were incubated in darkness at 30°C in an environmental chamber

(Binder, GmbH). Each treatment was replicated four times, and samplings for determine laccase and

endoglucanase activities were done each four days during 16 days from expendable replicates;

consequently, a total of 80 mesocosms (4 replicates x 4 carminic acid concentrations x 5 sampling dates)

were set up. SCB samples were analyzed by 13

C CPMAS NMR methodology, in order to determine the

substrate modification by P. sanguineus.

Analytical methods for SSF phase

Enzymatic activities were calculated from concentrated protein extracts, obtained according to Criquet

(1999): 5 g of SSB (fresh weight) were added to 100 ml of 0.2 M CaCl2 buffer added with Tween 80

0.05 % and 6 g of polyvinylpyrrolidone (PVP), stirred per 1 h at ~ 220 rpm and then filtered with 0.2 µm

cellulose filters. 50 ml of the crude extract was dialyzed within cellulose tubular membranes (Sigma-

Aldrich, USA) and Polyethylene glycol (PEG-8000) overnight at 4° C; concentrated proteins were

recovery in one volume of 0.2 M sodium phosphate buffer pH 6 and used for enzymatic determinations.

Reaction mixture for laccase determination was as follows: 100 µl of protein extract, 880 µl of 0.2 M

sodium phosphate buffer pH 6 and 20 µl of syringaldazine 5 mM. Endoglucanase activity was estimated

according to Ghose (1987), measuring simple sugars released from carboxymethyl cellulose (CMC, 2%),

by the method of dinitrosalicilic acid (DNS). Reaction mixture for endoglucanase estimation was as

follows: 250 µl of protein extract was mixed with 250 µl of CMC, 2%, the reaction was incubated in a

water-bath at 50°C for 1 h. The reaction was stopped with 500 µl of DNS reagent, boiled for 5 min and

immediately cooled in icy water for 10 min. The reaction mixture was diluted with 5 ml of dH2O prior

spectrophotometer quantification (540 nm). Absorbance was transform into g.per liter-1

of glucose by

comparison with a standard glucose curve (g.L-1

). Both enzymatic activities were reported as U per g of

dry mass (U.gDM-1

) of SCB.

Substrate modifications

Changes in chemical composition of SCB were followed via 13

C CPMAS NMR in a Bruker Advance

DSX 400 MHz spectrometer (Bruker, Madison, WI, USA). 100 mg of dried and ground SCB were

placed in a zirconium rotor and spun at the Magic angle (54.44°) at 10 KHz. The 13

C CPMAS NMR

technique was performed with a ramped 1H pulse during a contact time of 3 ms and with

1H decoupling

88

during the acquisition time to improve the resolution. Recording 4 K transients with a recycling delay of

2 s represented standard conditions to obtain a good signal-to-noise ratio.

Deconvolution of NMR spectra was performed using the DmFit software (Massiot, 2002).

Specifically regions of NMR spectra were utilized as indicators of chemical shifts in SCB: alkyl C (0-45

ppm) and Carboxyl C (160-190 ppm) were related to fungal biomass production since they can be

assigned to membrane phospholipids and since only very weak signals were observed in the sugar cane

bagasse. Polysaccharides content were estimated measuring the O-alkyl C signal (45-110 ppm), and the

content in aromatic C compounds measuring the signal between 110 – 160 ppm. Cellulose crystallinity

index was calculated according to Park et al (2010), by separating the C4 region of the spectrum into

crystalline and amorphous peaks, and calculated by dividing the total area of the crystalline peak (87 to

93 ppm) by the total area assigned to the C4 peak (80 – 93 ppm). In addition, changes in Aromatic C

region were evaluated according to Hallac et al (2009), measuring the decrease of p-hydroxyphenyl (162

– 157 ppm), aromatic quaternary C (160 – 123 ppm), and aromatic tertiary C (123-103 ppm) signals.

Statistical analysis

Data of laccase activity and biomass production were analyzed by two-way ANOVA (α = 0.05), in order

to identify if the different dyes added to medium or their concentrations had significant effects on these

variables; when ANOVA was significant, a post hoc Fisher LSD analysis were made. In addition,

Pearson correlations between laccase activity, biomass production and percentage of dyes degradation

were done. All the analysis were done in the software STATISTICA 7 (Statsoft, 2004).

Results

Effect of aromatic dyes on laccase production in liquid cultures

According to our ANOVA results, the addition of different aromatic dyes to culture medium of P.

sanguineus, affects its laccase production (F = 79.07; P < 0.001), meanwhile the concentration was not

significant (F = 2.28; P = 0.11) as well as the interaction between the type of dye and dye concentration

(F = 1.31; P = 0.27). Cultures with carminic acid showed the highest laccase activities (0.01 mM =

273.65 ± 90.72 U.L-1

; 0.02 mM = 251.43 ± 102.32 U.L-1

; 0.03 mM = 237.69 ± 49.08 U.L-1

), followed by

alizarin yellow (0.01 mM = 120.85 ± 81.51 U.L-1

; 0.02 mM = 53.90 ± 31.76 U.L-1

; 0.03 mM = 104.85 ±

75.81 U.L-1

), control (37.8 ± 12.25 U.L-1

) and cultures with aniline blue (0.01 mM = 34.46 ± 10.16 U.L-

1; 0.02 mM = 19.13 ± 11.84 U.L

-1; 0.03 mM = 15.07 ± 7.87 U.L

-1). No laccase activity nor-fungal

development were observed in cultures with Violet crystal (Figure 2).

89

Figure 2. Laccase activity (U.L-1

) kinetics of liquid cultures with different dyes addition, in

concentration from 0 to 0.01 mM. Middle points indicate the mean and whiskers the standard error.

Biomass production in liquid media

Two-way ANOVA showed that the type of dye added to liquid media affects the amount of biomass

produced (F2 = 6.10; P = 0.006); meanwhile dye concentration had not significant effects (F2 = 1.29; P =

0.29), but the interaction between dye type and dye concentration was significant (F4 = 4.31; P = 0.007).

Treatments with aniline blue (whatever the concentration), alizarin yellow (0.01 mM) and carminic acid

(0.03 mM) were those that produced more fungal biomass (Figure 3). More precisely, the production of

biomass increased with carminic acid concentrations while an inhibiting effect was found for alzarine

yellow concentrations of 0.02 and 0.03 mM. Moreover, fungal biomass production was positively

correlated with laccase production only in cultures with carminic acid (r = 0.66; P = 0.001) (Figure 4).

90

Figure 3. Biomass production in liquid media enriched with phenolic dyes at different concentrations.

Bars indicate the mean and whiskers the standard error.

Figure 4. Correlations between laccase activity,

biomass production and dye degradation (%). a)

Laccase activity was positive correlated with

carminic acid degradation, and biomass production;

b) laccase activity was negatively correlated with

biomass production, and no dye degradation was

observed; c) positive relations were observed

between laccase activity, alizarin yellow

degradation and biomass production.

91

Dye degradation

Only carminic acid and alizarin yellow were degraded in P. sanguineus liquid cultures (Table 2).

Carminic acid was degraded above of 92% in all concentrations tested, and alizarin yellow 97% in

cultures with an initial concentration of 0.01 mM, 48% in cultures with 0.02 mM and 60% in cultures

with 0.03 mM. This is consistent with the fact that laccase activity was weaker for alizarin yellow

concentrations of 0.02 and 0.03 mM. Dye degradation was indeed positively correlated with laccase

activity (Carminic acid r = 0.91 P < 0.0001; alizarin yellow r = 0.64 P = 0.02 Figure 4).

Enzyme production in SSF

Enzyme activities in SSF showed maximum values after 12 days for endoglucanase (Figure 5a), and

after 8 days for laccase (Figure 5b). ANOVA results indicate that endoglucanase activity decreased with

the amount of carminic acid added to SCB (F3 = 10.96; P = 0.004). According to Fisher LSD posthoc

test, cultures without carminic acid had the highest endoglucanase activity (1116.45 ± 127.12 U.gDM-1

),

meanwhile, cultures with 0.003 mM showed 584.98 ± 171.24 U.gDM-1

, with 0.01 mM , 520.90 ± 109.21

U.gDM-1

and with 0.006 mM 351.58 ± 68.86 U.gDM-1

. After 12 days, all cultures with carminic acid

showed lower values of endoglucanase activity than control cultures. On the other hand, laccase activity

was detected after 4 and 8 days and increased when carminic acid was added. Treatments with carminic

acid showed higher laccase activity than controls 0.75 ± 0.31 U.gDM-1

with an average of 1.09 ± 0.40

U.gDM- 1

whatever the concentrations of carminic acid.

Figure 5. Enzymatic activities observed in SSF phase. a) Endoglucanase activity, highest activity was

registered in treatments without carminic acid at day 12. b) Laccase activity was only registered after 4

92

and 8 days. Middle points indicate the mean and whiskers the standard error.

NMR chemical shifts in SSF

13C CPMAS NMR results showed that, variations in the chemical composition of sugarcane bagasse

under biological pretreatment with P. sanguineus and different concentrations of carminic acid, were

observed over time (after 16 days under SSF) (Figure 6). Cellulose crystallinity index (CI) was increased

in all the treatments; SCB had an initial CI ratio of 0.34, and increased 27.34% in control. When

carminic acid was added the increment in CI was lower (Table 4).

Carboxylic C and Alkyl C regions of the spectra were related to fungal biomass development

(membrane phospholipid production); the increase in those regions were lower when carminic acid was

added to SCB, compared to control (Table 4), which indicated negative effects of carminic acid in

biomass production, in SSF. On the other hand, polysaccharide content (O-alkyl C), was almost

unchanged in all treatments (decreased less than 2%) and no differential effects were observed in

treatments with and without carminic acid.

Changes in the chemical composition of SCB were mainly observed for the Aromatic C region,

which indicates changes in SCB lignin fraction. However, the reduction of these values was higher in

control and when 0.003 mM of carminic acid was added, reaching a reduction in aromatic C signals of

32.67 and 30.65%, respectively. Treatments with 0.006 mM of carminic acid showed a decrease of

16.33%, meanwhile when 0.01 mM were added, aromatic region only decreased 1.95%; however,

aromatic quaternary C diminish its signal 17.60%. 13

C CPMAS NMR analysis also showed that SCB’s

lignin had very little p-hydroxyphenyl (162 – 157 ppm) radicals, and that the peaks obtained for

aromatic C region, corresponded mainly to aromatic quaternary C (160 – 123 ppm) and aromatic tertiary

C (123-103 ppm) (Table 4).

Table 4. Chemical shifts in SCB after 16 days of culturing. Data are given in percentage of increment or

decrement. NC = No changes Treatment Cellulose

crystallinity ratio

COOH

(organic acids)

Alkyl C

(lipids)

O-alkyl C

(Polysaccharides)

Aromatic

C

Aromatic

quaternary C

Aromatic

tertiary C

Control +27.24 % +572.79% +2035.98% NC -32.67% -25.89% -7.05%

Carminic acid

0.003 mM

+18.74% +400.89% +1489.33% -1.94% -30.65% -34.82% -7.05%

Carminic acid

0.006 mM

+15.94% +470.64% +1696.49% -0.94% -16.33% -27.00% -5.18%

Carminic acid

0.01 mM

+15.94% +214.04% +936.99% -1.35% -1.95% -17.60% -5.57%

93

94

Figure 6. Specters obtained from

13C CPMAS NMR analysis; A) cultures without carminic acid; C)

cultures with 0.003 mM of carminic acid; B) cultures with 0.006 mM of carminic acid and D) cultures

with 0.01 mM of carminic acid. Signals of different carbon functional groups are indicated in the basis

of the specters, and the square maximize the aromatic C region. Note that C4 has two signal peaks,

which corresponds to crystalline and amorphous forms.

95

Discussion

Liquid cultures

We observed that carminic acid and alizarin yellow can enhance laccase production 722 and 317% more

than control, respectively. Carminic acid is an anthraquinone-dye with natural occurring in the cochineal

insect Dactylopius coccus (Eisner et al., 1980), and has been used since prehispanic time as a textile and

ceramic dye in México. On the other hand, alizarin yellow is a common azo-dye used in textile industry

(Narayanasamy and Murugesan, 2013), and as other azo-dyes, is potentially hazardous for environment,

because they are toxic (Bae et al., 2006), mutagenic (Freeman et al., 1996) and carcinogenic

(Hildenbrand et al., 1999).

However, both carminic acid and alizarin yellow were successfully degraded in liquid cultures of

P. sanguineus, and this decolourization was positive correlated with laccase production. In addition,

alizarin yellow degradation in cultures of P. sanguineus reached values up to 95% (with an initial

concentration of 0.01 mM), similar to other technological methods, e.g. laser-induced photocatalytic

degradation (Hayat et al., 2010) or hybrid processes like iron-carbon microelectrolysis combined to

aerobic bio-contact oxidation (Liang et al., 2012). The other tested dyes (Aniline blue and Crystal

Violet) were not degraded in liquid cultures, and no-laccase production was registered.

Laccase-mediated dye degradation has been previously reported for carminic acid in agar-plates

and with purified enzymes from Pleutorus ostreatus, Kuehneromyces mutabilis, Trametes versicolor and

Cerrena unicolor (Cho et al., 2007, Cho et al., 1999). Here, we report that P. sanguineus is able to

discolor carminic acid up to 95.97% in liquid cultures, and this is highly correlated with laccase activity

increment. P. sanguineus does not produce either Mn peroxidase (MnP) or lignin peroxidase (LiP)

(Pointing and Vrijmoed, 2000; Eggert et al., 1997), but it is considered as a good laccase producer

(Pointing et al., 2000); thus, the discolor capacity is probably related to the laccase production observed.

Even if the induction mechanism is not clear, some anthraquinone-derived compounds could be involved

in the induction of phenol-oxidases. In an early report Korniłłowicz-Kowalska and Rybczyńska (2014),

indeed indicated that carminic acid can induce the production of other phenoloxidases in Bjerkandera

adusta CCBAS 930, like Mn-peroxidase and horseradish peroxidase, and that the production of these

enzymes its accompanied with a degradation of carminic acid and Poly R-478. Thus, there are evidences

supporting that anthraquinone dyes can be degraded by different lignin-decay enzymes; and, that

anthaquinone dyes could function as inducers of phenol-oxidases in solid and liquid cultures.

Alizarin yellow was also efficiently degraded in P. sanguineus liquid cultures. This azo-dye has

been degraded in vitro by chloroperoxidases of Caldariomyces fumago (Li et al., 2013), but we did not

find previous reports of laccase-mediated decolourization of alizarin yellow. However, in this study we

96

found high correlation with alizarin yellow decolourization and laccase production in vivo. Laccase has

been utilized in many studies for azo-dyes degradation in vitro (Abadulla et al., 2000; Pointing and

Vrijmoed, 2000; Rodriguez et al., 1999), this study increases the knowledge in this field, proving that

alizarin yellow can induce laccase production and that azo-dyes and anthraquinonic dyes can be

degraded in liquid cultures of P. sanguineus. Also, we are in accordance with Rodriguez et al (1999)

who stated that laccase is an enzyme of major importance for industrial dyes degradation.

Biomass production was also modified by the addition of dyes into culture medium: aniline blue

(all concentrations), carminic acid (0.03 mM) and alizarin yellow (0.01 mM) enhanced the production of

biomass in liquid cultures of P. sanguineus. The increased biomass production in cultures with these

dyes, could indicate that P. sanguineus can use them as nutrient sources, i.e. alizarin yellow and aniline

blue can function as nitrogen and sulfur sources (Dave et al., 2015), however the nutrimental role of

carminic acid is still unclear. Biomass production was positive correlated with alizarin yellow and

carminic acid degradation, and with laccase production.

Thus, carminic acid was the stronger laccase inducer tested here in liquid cultures of P.

sanguineus: it promoted higher laccase and biomass production than the other dyes and was degraded

more than 95% at the end of incubation time (12 days). For these reasons, this anthraquinone dye was

selected for being utilized in solid-state fermentation, in an attempt to induce laccase activity and

consequently depolymerize the lignin faction of sugar cane bagasse (SCB).

Solid-state fermentation

Biomass pretreatments for bioethanol production, aimed to reduce the lignin fraction and the cellulose

crystallinity index, while preserving the carbohydrate fraction (Ramos, 2003). Generally, when fungi are

used, these characteristics can be achieved with high phenol-oxidase activities (e.g. laccase), and low

cellulase activities, in order to reach a selective delignification (Dorado et al., 2001). Some authors

considered that Pycnoporus sanguineus is capable of selective delignification (Gupta et al., 2011;

Lomascolo et al., 2011), and it has been reported that this fungi, can produce its own redox-mediator

which enhances lignin decay in the presence of laccase i.e. 3-Hydroxyanthranilic acid (3-HAA; Eggert et

al., 1996). This fungal metabolite can mediates the degradation of non-phenolic lignin structures by

laccase (Eggert et al., 1996). We found that, as well as in liquid cultures, carminic acid was able to

enhance laccase production in SSF, compared to control treatments; though induction was lower. In

addition, when carminic acid was added to sugarcane bagasse, cellulase activity decreased, which is

positive as an attempt to reach selective delignification (Ramos, 2003).

Many studies reported the induction of laccase in SSF using white-rot fungi, and most of them

tested the effect of different carbon sources, nitrogen sources, use of surfactants (e.g. Tween) and metal

or organic inducers, like cooper and xylidine (El-Batal et al., 2015; Karp et al., 2015; Boran and

97

Yeşilada, 2011). However, only few have evaluated the effect of dye absorbed onto lignocelluloses as a

substrate for ligninolytic enzymes production. Usha et al (2014) reported that bioabsorption of synthetic

dyes such as Remazol Brilliant Blue and Remazol Brilliant Violet 5R, onto lignocellulose (wheat bran

and rice bran), and its further use for laccase and lignin peroxidase production was possible, using

Stereum ostrea. Other studies reported that malachite green absorbed onto wheat bran could be used as

solid substrate to produce lignin peroxidase from Fomes sclerodermeus (Papinutti et al., 2006). Remazol

brilliant blue and Remazol brilliant violet 5R are anthraquinone dyes, as well as carminic acid; thus, this

work along with these previous reports showed evidence that anthraquinone dyes can be added onto

lignocellulosic material, and this substrate can enhance phenol-oxidases production.

The enzymatic responses in SSF with or without carminic acid had to be considered together with

chemical shifts in SCB composition measured by 13

C CPMAS NMR. We found that the main structural

shifts in SSF are occurring in Aromatic C region. Other studies that used 13

C CPMAS NMR to evaluate

lignocellulosic transformation (sorghum and wheat wastes), in solid-state cultures of white-rot fungi,

concluded that the growth of such type of fungi mainly led to a decrease in Aromatic C amount (Akin et

al., 1996), which is similar to our observations.

The delignification yields obtained here are interesting when comparing with other studies, which

used white-rot fungi in SSF. Delignification yields of 33% have been reported in SSF using Pleurotus

ostreatus and a combination of ferulic acid and cooper sulfate as laccase inducers (Karp et al., 2015).

Also, our results are similar to those obtained by Masayuki et al (2005) using rice straw inoculated with

either Pleurotus ostreatus (41%), Phanerochaete chrysosporium (21%) or Trametes versicolor (37%).

However, it should be noted that the incubation time in these experiments was longer (about 60 days)

than that used here (16 days). Even if carminic acid induced more laccase production in SSF, we did not

find higher delignification rates; indeed, surprinsingly, when carminic acid was added less Aromatic C

region was degraded. This result could be related to the fact that less biomass was produced and this has

probably affected lignin decay potential. Indeed, conversely to what was observed in liquid cultures,

NMR showed that Alkyl C and Carboxyl C regions, which corresponds to phospholipids (biomass

fungal indicators) were negatively affected when carminic acid was added to SCB. Less biomass

production could have affected other fungal functions, as the production of 3-HAA, and indirectly,

laccase performance in lignin decay. As it was mentioned above, 3-HAA is an important redox mediator

of P. sanguineus between laccase and non-phenolic lignin decay (Eggert et al., 1996) and is also

involved in biomass pigment formation (e.g. cinnabarin; Eggert et al., 1996). Thus, the reduction of

biomass in SSF by adding carminic acid could decrease the amount of available 3-HAA, and affected the

laccase-decay of lignin. However, this hypothesis needs to be tested in further studies, measuring the 3-

HAA production in cultures of P. sanguineus exposed to different carminic acid concentrations.

98

In addition, we observed that O-alkyl C region, which corresponds to polysaccharides, was fewly

affected over time, and decreased less than 2% in all treatments. This result is in accordance to Gupta et

al (2011) and Lomascolo et al (2011), which suggested that P. sanguineus is a fungus with a selective

action on lignin. Selectively delignification of SCB by P. sanguineus could be an efficient way of

pretreatment, in order to enhance enzymatic hydrolysis in second-generation bioethanol production. This

mainly because can diminish 32.67% of lignin, with less than 2% of carbohydrate losses.

Crystallinity index (CI) is another important issue to account in biomass pretreatments. Here, we

observed that solid-state fermentation with P. sanguineus increases 27.24% the CI after 16 days, mainly

when carminic acid was absence. The CI value indicates the relation between the amount of crystalline

cellulose and amorphous cellulose (Park et al., 2010); when the aim is to hydrolyze cellulose with

cellulases, it is desired to have low CI values, because amorphous cellulose is more easily degraded by

cellulases (Yu et al., 2014; Yoshida et al., 2008). When fungi degrade lignocellulose, generally the CI

value increases (Howell et al., 2009), as we observed with P. sanguineus; however, when carminic acid

was added, the increment of CI was lower than controls. According to our results, the addition of

carminic acid at low concentrations (0.003 mM) in combination with P. sanguineus, offers several

advantages for SCB pretreatment i.e. induce the production of laccase, diminish 30.65% of aromatic

compounds, the increment of CI was lower in this treatments (18.79%) than control (27.24%) and

partially avoid the biomass production.

In the basis of the results obtained, we can recommended the use of P. sanguineus for SCB

selective delignification, although increased its CI value; also, carminic acid is a good inducer of laccase

both in liquid cultures and in SSF, however, its use for enhance delignification could be limited because

affects biomass production. Further experiments could be design to avoid this limiting.

Conclusion

This study showed that the use of carminic acid and alizarin yellow, two important textile and industrial

dyes strongly enhance the production of laccase, in cultures of P. sanguineus, both in liquid cultures and

in SSF (carminic acid). Also, the use of P. sanguineus for SCB delignification could bring many

advantages, as a rapid and efficient lignin decay with very few polysaccharides losses, even in the

absence of inducers. Finally, we found that higher laccase amount do not necessary entails to higher

delignification yields, biomass and redox mediators could have important roles in this process.

Acknowledgments

We thanks to Mexican Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) for the PhD scholarship

of Hernández C, to ECOS-NORD Mexique M13A02 and French government for financial, to

Universidad Veracruzana (INBIOTECA) and to Aix Marseille Université (IMBE, IRD and Spectropole)

99

for technical support and to anonymous reviewers of this manuscript.

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105

Capítulo 2

Optimización de la producción de celulasas para procesos de

fermentación-sacarificación simultánea

__________________________________

106

2.1 Cellulase and xylanase production from fungal polycultures in liquid media

Artículo sometido a Enzyme and Microbial Technology (Elsevier)

El artículo reporta los resultados obtenidos del capítulo 2. Producción de celulasas y xilanasas en

cultivos mixtos de hongos filamentosos, aislados de bosques veracruzanos.

107

Elsevier Editorial System(tm) for Enzyme and Microbial Technology Manuscript

Draft

Title: Cellulase and xylanase production from different Ascomycota in

mixed cultures of liquid media

Article Type: Research Paper

Keywords: endoglucanase; β-glucosidase; exoglucanase; SDSPAGE;

Trichoderma; Fusarium.

Corresponding Author: Dr. Enrique Alarcón, Ph.D. Corresponding

Author's Institution: Universidad Veracruzana First Author:

Christian Hernández, PhD

Order of Authors: Christian Hernández, PhD; Adriane Milagres , Ph.D.;

Gerardo Vázquez-Marrufo, Ph.D.; Enrique Alarcón, Ph.D.

Manuscript Region of Origin: MEXICO

Abstract: Efficient hydrolysis of holocellulose depends on a proper balance

between cellulase (endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase) and xylanase

activities. A strategy that seeks to produce hydrolytic complexes with these

features is the use of cocultures of filamentous fungi, which produces

different enzyme isoforms, resulting in an enzymatic complex of different

characteristics to those produced with monocultures. The present study aimed

to explore the production of cellulases and xylanases in mixed cultures (one,

two, three and four fungal strains on the same bioreactor) of wild strains of

filamentous fungi from the genus Trichoderma, Aspergillus and Fusarium, in

liquid media. Endoglucanase, exoglucansae, β-glucosidase and xylanase

activities and the profile of extracellular protein isoforms (SDS-PAGE)

produced by different fungal combinations (N = 14) are reported. Pearson´s

correlation matrix and Principal Component Analysis (PCA) were used to analize

data. According to our results, relationships of competition were stablished

in mixed cultures, which produce spositive (endoglucanase and β-glucosidase

productions), negative (number of extracellular protein isoforms and xylanases

productions) or neutral (exoglucanase production) effects in the variables

tested. We conclude that the coculture of Aspergillus niger-Fusarium oxysporum

contributes to increase 19.02% endoglucanase and 6.35% β-glucosidase, compared

with monocultures. The use of tricultures and polycultures (more than three

different strains) trends to diminish the amount of enzymes produced, and the

extracellular protein isoforms, due to the competition relationships

(stressful conditions) between fungal strains.

108

Cellulase and xylanase production from fungal polycultures in liquid media

Hernández C.1, Milagres A.M.F.

2, Vázquez- Marrufo G

3, Alarcón E.

1*

1Universidad Veracruzana, Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA) México

2Universidade de São Paulo, Escola de Engenharia de Lorena (EEL) Departamento de Biotecnología, Brasil

3Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Centro

Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología (CMEB) México

*enalarcon@uv.mx

Keywords: endoglucanase, β-glucosidase, exoglucanase, SDS-PAGE, Trichoderma, Aspergillus,

Fusarium.

Abstract

Efficient hydrolysis of holocellulose depends on a proper balance between cellulase (endoglucanase,

exoglucanase, β-glucosidase) and xylanase activities. A strategy that seeks to produce hydrolytic

complexes with these features is the use of cocultures of filamentous fungi, which produces different

enzyme isoforms, resulting in an enzymatic complex of different characteristics to those produced with

monocultures. The present study aimed to explore the production of cellulases and xylanases in mixed

cultures (one, two, three and four fungal strains on the same bioreactor) of wild strains of filamentous

fungi from the genus Trichoderma, Aspergillus and Fusarium, in liquid media. Endoglucanase,

exoglucansae, β-glucosidase and xylanase activities and the profile of extracellular protein isoforms

(SDS-PAGE) produced by different fungal combinations (N = 14) are reported. Pearson´s correlation

matrix and Principal Component Analysis (PCA) were used to analize data. According to our results,

relationships of competition were stablished in mixed cultures, which produce positive (endoglucanase

and β-glucosidase productions), negative (number of extracellular protein isoforms and xylanases

productions) or neutral (exoglucanase production) effects in the variables tested. We conclude that the

coculture of Aspergillus niger-Fusarium oxysporum contributes to increase 19.02% endoglucanase and

6.35% β-glucosidase, compared with monocultures. The use of tricultures and polycultures (more than

three different strains) trends to diminish the amount of enzymes produced, and the extracellular protein

isoforms, due to the competition relationships (stressful conditions) between fungal strains.

109

Introduction

Cellulases are specialized enzymes in the degradation of cellulose produced in high quantities by

filamentous fungi (mainly Ascomycota), which have been particularly studied in species of the genus

Trichoderma [1, 2]. Cellulase activity [FPU; 3], results of three enzymatic activities: exoglucanase (1, 4-

β-D-glucan-cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), endoglucanase (endo-1, 4-β-D-glucanase, EC 3.2.1.4) and

β-glucosidase (β-D-glucoside glucanohydrolase, cellobiase, EC 3.2.1.21); the synergy of those three

activities is able to degrade cellulose into glucose [4]. Trichoderma spp. are well known for producing

high amounts of endo- and exo-glucanases, but are generally poor producers of β-glucosidase [5]; thus,

for biotechnology purposes, the addition of this enzyme is needed for an effective hydrolysis of cellulose

[6]. Other fungi genera capable to produce cellulase in high amounts are Aspergillus [7], Penicillium [8,

9], and Fusarium [10, 11].

Aspergillus is a genus known for the production of β-glucosidase [12], and these enzymes added

to those produced by Trichoderma can contribute to the construction of efficient cellulase complexes [5].

However, a mix of those enzymes added a posteriori of the production process is not the only strategy to

generate cellulase complexes more efficient than those produced in monocultures. The use of cocultures

of species belonging to to different genera of filamentous fungi seeks to induce the production of

cellulase enzymes with a balance between exo, endo and β-glucosidase activities, more favorable than

those produced by monocultures [13]. Several studies have been conducted in this field [e.g. 14, 15, 16],

mainly in solid state fermentation. This area of research has been increased in last years in response to

the growing demand for cellulases, because of their great importance in various industries that use

lignocellulose as feedstock, like the production of second generation bioethanol [17].

In natural ecosystems, like forest or dessert soils [18], as well as in agricultural residues, like the

piles of sugar cane (Saccharum officinarum L.) baggase produced by sugar industry [19], the

lignocellulose is degraded through the combined action of many microorganisms. The synergistically

degradation of lignocellulose observed by the action of different fungal or bacterial species, is due to the

secretion of different degrading enzymes, like cellulases, xylanases and accessory enzymes [20, 21].

This offers the possibility of the use of fungi consorcium to produce enzymatic complexes with great

potential to enhance lignocellulose degrading performance [5], or for some specific aims, like the

production of thermotolerant enzymes [19]. The use of cocultures of different fungal strains, or fungi-

bacteria combinations [22], are good attemps to desing enzymatic complexes with better features than

those produced in monocultures; however, more research is needed to understand how the production of

lignocellulose degrading enzymes is affected by the interactions of more than two microorganisms.

The increase of Filter Paper Unit (FPU) activity in Trichoderma-Aspergillus cocultures has been

attributed to an increase in β-glucosidase; but also has been hypothesized that an increase in the number

110

of isoforms of cellulases in these cultures are occurring [23], contributing to a better procesing of the

substrate by the enzyme complex (synergistic effects). However, lower cellulase activity of the

Trichoderma reesei – Aspergillus terreus cocultures than those of monocultures has also been reported

[24]. The isoforms of cellulase produced in soil could change according to different management

systems [18], and this modifies the Km of the cellulase system. However, it is unknown that the use of

cocultures, or cultures of more than two strains of fungi, could cause positive or negative effects in the

pattern of enzyme isoforms that were produced.

On the other hand, xylanases are another group of enzymes that are involved in the degradation

of lignocellulose [25]. Xylanase activity represents a group of enzymes that act together to degrade

xylan, the main structural component of the hemicellulose. Just as cellulases, filamentous fungi also

produce xylanases, but there is a scarcity of knowledge about their production in mixed cultures.

Although, in natural ecosystems the same substrate (lignocellulose) can be simultaneously degraded by a

whole community of microorganisms [26, 27], few attemps have been made to describe the production

of cellulase and xylanases in liquid-media polycultures (more than three strains).

With this in mind, the first objective of the present study was to isolate and identify wild strains

of filamentous fungi able to produce cellulases (exoglucanases, endoglucanases, β-glucosidases) and

xylanases. The second aim was to characterize the production of these enzymes’ activities in

monocultures and mixed cultures (2, 3 and 4 strains at the same reactor) of the isolated strains. Finally,

we seek to characterize the profile of extracellular proteins produced for each type of fungal

combination. According to the background, we expected an increase in cellulase and xylanase activities

in mixed cultures, as well as an increase in the number of isoforms in polycultures, compared with those

found in monocultures.

Materials and methods

Strains isolation and identification

The strains here studied were isolated directly from litter of Pinus patula at the Cofre de Perote National

Park, (19°30' N: 97° 9' O; Veracruz, México) and litter of a Citrus sp. plantation at Tuzamapan town

(19°24' N: 96°52' O; Veracruz, México). For strain isolation the selective medium Czapek-Dox (Agar-

carboxy methyl cellulose) was added with tetracicline (50 mg.l-1

) to avoid bacterial contamination [28].

A qualitative analysis for the presence of cellulases by direct Congo red staining was done [29]. Four of

the isolated strains were used to produce cellulases and xylanases in mixed cultures, these strains were

identified by amplification and analysis of the ITS rDNA region [30]. DNA of the selected strains was

isolated using the Fastprep (MP Biomedicals, LLC, USA) a kit for fungal DNA isolation, as described

by the supplier. PCR reactions of the ITS region were conducted with the primers (ITS1/ITS4) and

111

conditions described by White et al., [31]. Amplicons were sequenced at Elimbiopharm (Hayward CA,

USA) and the sequences obtained were subjected to Blastn search in Genbank. Those sequences of

Genbank with maximum identity with amplicons obtained were retrieved and used for phylogenetic

analysis. Additional ITS sequences of the same genus obtained in Blastn search were selected and

retrieved from Genbank in order to make a more robust phylogenetic analysis of each studied strain. The

sequences were aligned by ClustalW and edited by hand. Genetic distances were calculated by the

Kimura- 2 parameters and then the phylogenetic reconstruction was conducted by using the Maximum

Likelihood criteria with 1000 bootstrap replicates. Maximum Parsimony (MP) trees were also generated

using same genetic distances. All these steps for phylogenetic analysis were conducted in Mega 6 [32].

Obtained sequences were deposited in Genbank with the accession numbers KX253665 (strain PS1-

G06), KX253666 (strain PS3), KX253667 (strain Asp 546), KX253668 (strain C02-E06). See strains

code below.

Table 1. Different strain combinations used for cellulase and xylanase production in liquid media

Treatment code Culture type Strains

M1

Monocultures

F. oxisporum

M2 T. harzianum (1)

M3 T. harzianum (2)

M4 A. niger

C1

Cocultures

F. oxisporum + T. harzianum (1)

C2 F. oxisporum + T. harzianum (2)

C3 F. oxisporum + A. niger

C4 T. harzianum (1) + T. harzianum (2)

C5 T. harzianum (1) + A. niger

T1

Tricultures

F. oxisporum + T. harzianum (1) + T. harzianum (2)

T2 F. oxisporum + T. harzianum (1) + A. niger

T3 F. oxisporum + T. harzianum (2) + A. niger

T4 T. harzianum (1) + T. harzianum (2) + A. niger

P1 Polycultures F. oxisporum + A. niger + T. harzianum (1) + T. harzianum

(2)

Experimental design

To evaluate the effect of growing different strains of filamentous fungi together on the production of

cellulases and xylanases, a monofactorial design was performed, where the factor was the type of

combination, i.e. monoculture, coculture, triculture or polyculture (Table 1). The response variables were

the activities of exoglucanase, endoglucanase, β-glucosidase and xylanase, and the profile of

112

extracellular proteins produced.

As an experimental unit, Erlenmeyer 250 ml flasks were used which contained 150 ml of basal medium

[33], with the following composition (per liter): 1 g of KH2PO4, 0.26 g of NaH2PO4, 0.317 g of

(NH4)2SO4, 0.5 g of MgSO4 7H2O, 0.5 mg of CuSO4, 74 mg of CaCl2, 6 mg of ZnSO4, 5 mg of FeSO4, 5

mg of MnSO4, 1 mg of CoCl2, supplemented with sugarcane bagasse as carbon source (2 % w/v). The

flasks were inoculated with 1 square (0.25 cm2) of agar-malt medium, colonized with mycelium of 6

days of culture. Each treatment had three experimental replicates. The cultures were kept in darkness at

30° C without agitation and sampling was performed every 4 days for 20 days.

Analytical methods

The exoglucanase, endoglucanase and xylanase activities were evaluated according to Ghose [34],

quantifying the reducing sugars released from specific substrates [i.e avicel (cellulose microcristalline),

carboxymethyl cellulose and birchwood xylan, respectively] by the method of dinitrosalicylic acid

[DNS; 35]. The enzymatic reaction was performed at 50 ° C in a water bath, stopped with DNS reagent,

read in a spectrophotometer at 540 nm and converted to μM•ml-1

by comparing with a standard curve of

glucose; enzyme activity was reported as U•ml-1

(μM•min-1

•ml-1

).

β-glucosidase activity was evaluated by quantifying the amount of p-nitro phenol liberated from a

solution of p-nitro phenyl-β-D-glucopyranoside, 0.1 mM spectrophotometrically at 412 nm [36]. The

activity was reported as U•ml-1

.

The profile of extracellular proteins was evaluated by electrophoresis in polyacrylamide gel (5%

stacking gel, 12% separating gel) under denaturing conditions (SDS-PAGE) [37, 38]. For this, 50 ml of

culture medium were concentrated 100-fold by lyophilization and resuspended in 500 µl of dH2O.

Electrophoresis was performed with the concentrated protein, at the end, the gel was stained with a

solution of Coomassie blue-methanol-acetic acid, the molecular weight of the detected isoforms was

determined by its coefficient of migration (Rf) and compared with a low molecular weight marker (14-

97 kDa).

Statistical analysis

In order to identify if the presence/absence of the strains cultured at different combinations had relation

(positive or negative) with the enzymatic production, a correlation analysis (Pearson α = 0.05) and

Principal Component Analysis (PCA) was done. The PCA was carried out from a correlation matrix

(Pearson) between different culture combinations (treatments) and response variables; they were also

113

plotted in a triplot together with the different strains as complementary variables. A second PCA was

done using a matrix of presence/absence of protein isoforms categorized by its molecular weight, and the

matrix of enzymatic activity; in order to identify if the activity of the different strains and combinations

had any relation with specific isoforms. Analyses were made in the software XLSTAT v2014.

Results

Phylogenetic analysis of the fungal isolates

Blastn search of amplicons obtained from fungal isolates PS1-G06 and PS3 show maximal identity with

sequences of Trichoderma lixii (Hypocrea lixii)/Trichoderma harzianum complex, whereas isolates

Asp546, and C02-E06 shows maximal identity with Aspergillus niger, and Fusarium oxysporum ITS

sequences, respectively. Phylogenetic reconstruction of the ITS region from strains PS1-G06 and PS3

groups with its corresponding sequences of the H. lixii/T. harzianum complex with a bootstrap value of

95%, clearly separated from all other species within the genus (Figure 1a). The strain C02-E06 grouped

with a bootstrap value of 99% in the clade of Fusarium oxysporum and its teleomorph Gibberella

moniliformis (Figure 1b). The strain Asp546 was grouped with a bootstrap value of 100% in the clade of

Aspergillus niger, Aspergillus tubingensis and Aspergillus awamori (Figure 1c).

Enzymes production in monocultures

The four fungal strains used in this study showed different enzymatic production profiles (Figure 2).

Aspergillus niger produced the highest amount of cellulase and xylanase activities for all monocultures

tested, being 6.36 ± 1.33 U•ml-1

for endoglucanase, 5.98 ± 0.20 U•ml-1

for β-glucosidase, and 2.33 ±

0.06 U•ml-1

for xylanase after 8 days of culture; and 1.6 ± 0.06 U•l-1

for exoglucanase after 20 days of

culture. Trichoderma strain 1 (PS1-G06) showed nearly a half of endoglucanase activity reached by A.

niger (5.58 ± 1.22 U•ml-1

at day12), similar exoglucanase activity (1.40 ± 0.17 U•l-1

at day 16) and was

deficient in β-glucosidase (0.41 ± 0.35 U•ml-1

at day 4) and xylanase activity (0.78 ± 0.03 U•ml-1

at day

20). Trichoderma strain 2 (PS3) was similar to Trichoderma strain 1, producing 3.10 ± 1.68 U•ml-1

of

endoglucanase (at day 8), 0.70 ± 0.02 U•l-1

of exoglucanase (at day 16), 1.89 ± 0.14 U•ml-1

of β-

glucosidase (at day 4), and 0.69 ± 0.01 U•ml-1

of xylanase (at day 20). On the other hand, Fusarium

oxysporum had the lowest values of enzymatic activities of monocultures, its highest enzymatic activities

were: endoglucanase (0.42 ± 0.19 U•ml-1

at day 12), exoglucanase (0.80 ± 0.09 U•l-1

at day 16), β-

glucosidase (0.75 ± 0.31 U•ml-1

at day 12) and xylanase (0.04 ± 0.005 U•ml-1

at day 4).

114

Figure 1. Phylogenetic trees of the isolated strains. 1a) Strains PS1-G06 and PS3 groups with its

corresponding sequences of the H. lixii/T. harzianum complex; 1b) Strain C02-E06 grouped with a

bootstrap value of 99% in the clade of Fusarium oxysporum and its teleomorph Gibberella moniliformis;

1c) Strain Asp546 was grouped with a bootstrap value of 100% in the clade of Aspergillus niger,

Aspergillus tubingensis and Aspergillus awamori.

115

Figure 2. Enzymatic activities produced by the four fungal strains in monocultures

Enzyme production in polycultures

The use of more than one fungal strain affects the activity of the enzymatic complex produced in the

cultures (Table 2). Endoglucanase (7.57 ± 0.98 U•ml-1

at day 8) and β-glucosidase (6.36 ± 0•46 U.ml-1

at

day 16) showed higher activity values in the coculture C3 (A. niger + F. oxysporum) than in the A.

niger’s monoculture. In the same way, coculture C5 [A. niger + Trichoderma strain (1)] showed higher

endoglucanase activity (6.12 ± 1.21 U•ml-1

) in a shorter time (day 4) than monocultures. Mixed cultures

with A. niger mantained high β-glucosidase production (Table 2); however, xylanase production was

severely affected when A. niger was cultured with other fungal strains. In general, exoglucanase was not

affected when fungal combinations were used.

The PCA, constructed from Pearson correlation matrix, using enzymatic activities as variables, fungal

strains as complementary variables and data of whole sampling time as observations, indicates a relation

between the fungal combination used and the enzyme activity observed. Axis F1 (counted for 49.49% of

explained variability) was significatively (P < 0.05) related with endoglucanase (r = 0.84), xylanase (r =

0.86), and β-glucosidase (r = 0.68); and close related with A. niger (r = 0.51). All other fungal strains

were negative correlated with this axis. Meanwhile, F2 (counted for 27.74% of the explained variability)

was related with exoglucanase (r = 0.90), and weakly correlated with Trichoderma strainstrains (r = 0.02

116

and r = 0.06; Figure 3a). These two axes (biplot) condense the 77.23% of the explained variability

(Figure 3b).

PCA showed (Pearson correlation; Figure 3c) that the presence of A. niger in the cultures was

positive correlated with xylanase (r = 0.35), endoglucanase (r = 0.19) and strongly correlated with β-

glucosidase (r = 0.82) activities. The other fungal strains had negative correlations with enzymatic

activities, except for F. oxysporum who was positive correlated with β-glucosidase (r = 0.10); however,

this value was not significant (P > 0.05).

A distance biplot indicates that the treatment M2 (monoculture of Trichoderma strain 1) was

related to exoglucanase production, mainly after 16 days of culture (Figure 3a, Black arrow). On the

other hand, M4 (monoculture of A. niger) was related to xylanase and endoglucanase production, since 8

to 16 days of culture (Figure 3a, Green arrow). Finally, coculture C3 (A. niger + F. oxysporum) and

triculture T3 (F. oxisporum + Trichoderma strain (2) + A. niger) were related to β-glucosidase

production (Figure 3a, Blue arrows).

Table 2. Maximum values of enzymatic activity recorded for the different treatments. The three highest values are

distinguished by *

Endoglucanase Exoglucanase β-glucosidase Xylanase

Treatment U.ml-1

Day U.l-1

Day U.ml-1

Day U.ml-1

Day

Monocultures

M1 0.426 12 0.8 16 0.754 12 0.043 4

M2 5.581 12 1.40** 16 0.414 4 0.787* 20

M3 3.108 8 0.7 16 1.898 4 0.698 20

M4 6.365** 16 1.60*** 20 5.987** 8 2.334*** 8

Cocultures

C1 2.619 4 0.4 8 0.246 16 0.355 20

C2 1.464 4 0.6 8 1.190 4 0.209 16

C3 7.579*** 8 0.6 4 6.366*** 16 0.798** 4

C4 2.919 16 0.8* 20 1.150 4 0.654 20

C5 6.120* 4 0.7 4 4.456 8 0.580 20

Tricultures

T1 2.031 8 1.10** 20 0.484 12 0.285 16

T2 3.018 12 0.7 12 4.659 16 0.381 12

T3 2.614 8 0.6 20 4.192 16 0.466 20

T4 3.300 8 0.7 16 5.304* 16 0.459 20

Polyculture P1 1.684 8 0.4 12 4.454 16 0.428 20

117

Figure 3. a) PCA showing the realtion

between enzimatic activities and fungal

combinations. Strains presence are showed

with blue lines, as complementary variables.

b) Accumulated variability and eigenvalues

by components. c) Table of correlations

between enzymatic acivities and strain

presence.

118

Protein profile produced by polycultures

The A. niger monoculture produced the highest amount of extracellular proteins isoforms of all

treatments tested (Table 3). Both Trichoderma strains produced an equal protein profile, and by its side,

F. oxysporum produced the lowest amount of protein isoforms of monocultures (Figure 4b). A reduction

in the number of isoforms produced was observed when more than one strain was cultured in the same

bioreactor (i.e. cocultures, tricultures, polycultures). Values of molecular weight of the produced

proteins are shown in Table 3.

Tabla 3. Molecular weights of the isoforms of extracellular protein produced by the different fungal combinations tested

(KDa)

Monocultures Cocultures Tricultures Polyculture

Num.

Isoform

M1 M2 M3 M4 C1 C2 C3 C4 C5 T1 T2 T3 T4 P1

1 63.15 123.28 123.28 184.37 72.72 123.28 142.97 38.29 112.19 38.29 38.29 129.35 53.27 53.27

2 55.52 101.18 101.18 142.97 57.89 101.18 89.87 20.39 38.29 20.76 22.79 53.27 43.26 43.26

3 37.42 72.72 72.72 115.08 42.68 72.72 66.10 16.49 22.35 18.40 20.76 46.20 23.70 23.70

4 21.20 60.42 60.42 84.99 20.75 51.25 53.32 13.39 13.39 13.74 18.40 35.19 21.96 21.96

5 - 49.32 49.32 66.10 - 41,26 28.87 - - - 13.74 32.51 14.11 14.11

6 - 41.26 41.26 53.32 - 36.27 22.14 - - - - 22.14 - -

7 - 36.27 36.27 28.13 - 23.16 19.50 - - - - 13.92 - -

8 - 20.75 20.75 24.83 - 20.75 13.85 - - - - - - -

9 - 12.80 12.80 22.14 - 12.80 - - - - - - - -

10 - - - 19.11 - - - - - - - - - -

11 - - - 13.85 - - - - - - - - - -

A second PCA (from Pearson correlations) was constructed with the data of the 8 culture days

(maximum enzymatic activity) incorporating the data of the molecular weight of the isoforms detected

on SDS-PAGE (Figure 4b). Axis F1 (counted for 37.95 % of the explained variability) was related to

xylanase (r = 0.91), β-glucosidase (r = 0.74) and endoglucanase (r = 0.74) activities; to A. niger strain (r

= 0.59); and to isoforms of 10-20 kDa (r = 0.54), 20-30 kDa (r = 0.79), 50-60 kDa (r = 0.34), 80-90 kDa

(r = 0.93), 140-150 kDa (r = 0.93) and 180-190 kDa (r = 0.78). Axis F2 (17.97 % of the explained

variability) was related to exoglucanase (r = 0.35) but neither strain showed positive correlation with this

axis; however, positives correlations were observed between F2 and isoforms 40-50 kDa (r = 0.70), 60-

70 kDa (r = 0.57), 70-80 kDa (r = 0.74), 110-120 kDa (r = 0.79) and 120-130 kDa (r = 0.76). Both axes

condense 55.92 % of the explained variability (Figure 4c).

119

Biplot showed that monocultures M2 and M3 (Trichoderma strains), and coculture C2 [F. oxisporum +

Trichoderma strain (2)] were close related to the production of protein isoforms of 40-50 and 70-80 kDa,

and with exoglucanase activity (Figure 4a). Isoforms of 70-80 kDa were correlated with exoglucanase

activity (r = 0.27), thus, Trichoderma strains could be a producer of exoglucanase of 72.72 kDa,

according to molecular-weight isoforms data (Table 3). On the other hand, β-glucosidase activity was

closely related to C3 and A. niger, and correlated with isoforms of 80-90 kDa (r = 0.58; Figure 4a,d).

Thus, it could be possible to assume that the isoform of 84.99 kDa is a β-glucosidase subunit produced

by A. niger.

Xylanase activity was correlated with isoforms of low molecular weight (10-20 and 20-30 kDa),

and significant correlations were found too between xylanases and these isoforms (r = 0.42 and r = 0.72;

respectively). Also, in the biplot of the PCA, this enzyme was related to A. niger (M4) and to isoforms of

80-90 and 140-150 kDa. We observed that the strip of 24.84 kDa is repeated in the treatments M4, C3

and T3 (Figure 4b), and that this is related with the cultures with the highest xylanase activity, and with

A. niger presence.

A second PCA (from Pearson correlations) was constructed with the data of the 8 culture days

(maximum enzymatic activity) incorporating the data of the molecular weight of the isoforms detected

on SDS-PAGE (Figure 4b). Axis F1 (counted for 37.95 % of the explained variability) was related to

xylanase (r = 0.91), β-glucosidase (r = 0.74) and endoglucanase (r = 0.74) activities; to A. niger strain (r

= 0.59); and to isoforms of 10-20 kDa (r = 0.54), 20-30 kDa (r = 0.79), 50-60 kDa (r = 0.34), 80-90 kDa

(r = 0.93), 140-150 kDa (r = 0.93) and 180-190 kDa (r = 0.78). Axis F2 (17.97 % of the explained

variability) was related to exoglucanase (r = 0.35) but neither strain showed positive correlation with this

axis; however, positives correlations were observed between F2 and isoforms 40-50 kDa (r = 0.70), 60-

70 kDa (r = 0.57), 70-80 kDa (r = 0.74), 110-120 kDa (r = 0.79) and 120-130 kDa (r = 0.76). Both axes

condense 55.92 % of the explained variability (Figure 4c).

Biplot showed that monocultures M2 and M3 (T. harzianum), and coculture C2 [F. oxisporum +

T. harzianum (2)] were close related to the production of protein isoforms of 40-50 and 70-80 kDa, and

with exoglucanase activity (Figure 4a). Isoforms of 70-80 kDa were correlated with exoglucanase

activity (r = 0.27), thus, T. harzianum could be a producer of exoglucanase of 72.72 kDa, according to

molecular-weight isoforms data (Table 3). On the other hand, β-glucosidase activity was closely related

to C3 and A. niger, and correlated with isoforms of 80-90 kDa (r = 0.58; Figure 4a,d). Thus, it could be

possible to assume that the isoform of 84.99 kDa is a β-glucosidase subunit produced by A. niger.

120

121

Xylanase activity was correlated with isoforms of low molecular weight (10-20 and 20-30 kDa), and

significant correlations were found too between xylanases and these isoforms (r = 0.42 and r = 0.72;

respectively). Also, in the biplot of the PCA, this enzyme was related to A. niger (M4) and to isoforms of

80-90 and 140-150 kDa. We observed that the strip of 24.84 kDa is repeated in the treatments M4, C3

and 3 (Figure 4b), and that this is related with the cultures with the highest xylanase activity, and with A.

niger presence.

Discussion

A phylogenetic analysis of the studied isolates was conducted in order to clarify its taxonomic identity.

The ITS region of the Nuclear Ribosomal Unit has been identified as the best DNA region for barcoding

in fungi [30]; thus, we use such genetic marker to identify studied isolates for which we have no

previous taxonomic knowledge. All isolates here studied show to be closely related with taxonomic

groups within Ascomycota which are species complex with uncertain affinities.

Phylogenetic analysis shows that PS1-G06 and PS3 isolates belongs to the T. lixii (H. lixii) /T.

harzianum complex [39]. Isolate Asp546 grouped in a clade that includes Aspergillus niger, Aspergillus

tubingensis and Aspergillus awamori. These are considered to belong to the A. niger aggregate/complex

[40], but some of them are not considered as new species, particularly A. awamori [41]. Finally, isolate

C02-E06 grouped with the anamorph Fusarium oxysporum and its teleomorph Gibberella moniliformis.

This is a complex of more than 80 formae species, each specific of a particular plant host [42, 43].

Because all isolates studied in this work are associated with species complexes, it is necessary in the

future to conduct a more detailed phylogenetic analysis using other genetic regions in order to clarify its

position within such complexes, something that is beyond the scope of present work. Thus, with the

phylogenetic evidence here generated, it could be stated PS1-G06 and PS3 isolates could be assigned to

T. lixii (H. lixii) /T. harzianum complex, isolate Asp546 belongs to the A. niger complex, and isolate

C02-E06 is a member of the F. oxysporum/G. moniliformis complex.

In this work we hipothetized that the use of polycultures (i) would lead to an increase in the cellulase

activity, (ii) would produce cellulolytic complexes with a major balance between exoglucanase,

endoglucanase and β-glucosidase activities; and (iii) could enrich the enzyme isoforms in the culture

medium with respect to those observed in monocultures.

Results here obtained showed that the use of different combinations of fungal strains will produce

cellulolytic complex with different enzymatic activities when compared with those observed in

monocultures, and that this phenomenon is highly dependent on the strains used. On the other hand,

PCA analysis showed a high relation between A. niger and the production of β-glucosidase,

endoglucanase and xylanase activities, in accordance with previous reports [44, 45, 46]. The PCA

122

analysis also showed a high relation between Trichoderma strains and exoglucanase production, but non-

significant correlation was observed; however, it is known that species in the genus Trichoderma are

good producers of exoglucanase [47, 48].

Only the coculture between A. niger and F. oxysporum increased the production of β-glucosidase

and endoglucanase with respect to A. niger monocultures; however, in general, the use of cocultures and

cultures with more than two strains lead to a decrease in the enzymatic activities, when compared with

A. niger monoculture values. This is in accordance with the results obtained by Taha et al. [49], who

observed that some fungal cocultures will lead to an increase in the saccharification capacity of the

enzymatic complex produced; whereas, cultures with three fungal strains lead to a decrease in their

saccharification capacity. In this study, we did not observe a significant higher enzymatic production by

utilizing cocultures, neither A. niger-Trichoderma strains nor with Trichoderma strains-F. oxysporum

strains, in constrast with results obtained in similar studies using liquid media [49, 50].

The decrement in the enzymatic activities observed in mixed cultures, could be atributed to the

limiting nutrient conditions of the culture system utilized, since it was suggested that nutriment

enrichment in cocultures (Trichoderma-Aspergillus) lead to an increase in cellulase activities. However,

most of these studies were carried out in a solid state fermentation [13, 51, 52]. Thus, it can be

hypothetized that non synergistic, but competitive interactions are prevailing in the cultures here studied,

affecting the enzymatic complex produced, as discussed below.

Xylanase production was particularly negative affected by all combinations of fungal strains here

used. This probably may due to the fact that, in stressful situations, filamentous fungi could change their

preferential consumption of sugars, leading to hexoses, which have higher energy content than pentoses.

This preference has been reported for other microorganisms such as yeasts [53], and it is attributed to

carbon catabolite repression (CCR). Filamentous fungi could decrease their production of xylan-

degrading enzymes for major hexoses consumption. This might represent an interesting strategy when

the goal is to degrade cellulose but non-hemicelulose (e.g. production of xylan), since xylan by-products

are of great industrial interest [54, 55, 56], or for producing xylanase-free cellulases. Our culture

conditions were similar to those used by García-Kirchner [57], i.e. Aspergillus terreus-Penicillium sp.

coculture, using sugar cane baggase as carbon source and similar volume of mineral medium. In contrast

to this previous report, we did not observed an increase in xylanase production in our cocultures. This

discrepancy could be atributed to the absece of agitation in our cultures, which can cause an oxygen

limitation. Gutierrez-Correa and Tengerdy [13], also reported higher xylanase production in cocultures

(Trichoderma-Aspergillus) than in monocultures, reaching to activities of 5.9 U.ml-1

; however, solid-

state fermentation was used in that report.

123

All cultures which include A. niger, mantained high β-glucosidase activity; this is a biotechnological

important issue because this is a key enzyme in the process of degradation of cellulose into glucose,

being necessary for prevent endoglucanase and exoglucanase inhibition by cellobiose [46, 50]. Similar to

xylanases results, no increase of β-glucosidase production (excepting coculture A. niger-F. oxysporum)

was observed by utilizing mixed cultures, contrasting with that reported by [5]; but also, there was no

significant decrease in the production observed in mixed cultures when A. niger was used. The coculture

A. niger-F. oxysporum was previously reported as an efficient consortium for cellulase production in

solid-state fermentation [51], here we observed that coculture C3 (A. niger-F. oxysporum) increased β-

glucosidase and endoglucanase production in a liquid culture.

The use of cultures with more than one strain did not affect the exoglucanase production in the

conditions used in this study. It is worthy mentioning that only when A. niger was present in any

combination, the enzymatic activity reached high values. Thus, the other fungal strains (e.g. F.

oxysporum) cultured with A. niger, which is the main enzyme strain producer, can be considered only as

a “helper strain” [13]. The presence of some strains had negative effects on enzymatic production in

mixed cultures. By instance, F. oxysporum had the lowest cellulase, xylanase and extracellular protein

isoforms production in monoculture and, that according to the PCA analysis, had negative relations with

the enzymatic production. It has been reported that F. oxysporum is a good producer of cellulases [10,

11]; however, in this study non-positive effect were observed when F. oxysporum was used in mixed

cultures with Trichoderma strains or alone, only when the coculture A. niger-F. oxysporum was used

(see Figure 3).

Some authors reported that the hydrolytic activity of different cellulases/xylanases acting

together was superior to the hydrolitic activity of single enzymes [49]. In this study the extracellular

protein profile of mixed cultures had a lower number of protein isoforms than in the A. niger and

Trichoderma strains monocultures, and also a lower capacity for degrading the substrates here tested

(Avicel, carboxymetil-cellulose, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside), in accordance with Massadeh et

al. [24]. Thus, the decrease in the number of isoforms is correlated with a decrease in the

cellulase/xylanase activity, likewise Khalili et al. [18] showed for soil cellulases, associating the highest

cellulase activities in soil samples with sharp cellulase bands of zymographic gels. In this study, PCA

that involved molecular weigth data of the isoforms detected, allowed us to hypothesize that

Trichoderma strains produce an exoglucanase isoform of 72.72 kDa. Previous studies using this fungi

have reported that they produce a β-1,3-exoglucanase of 110 kDa [58], an exoglucanase (CBH1) of 61

kDa [59] and 66 kDa [60]; meanwhile, an exoglucanase II (CBHII) from T. reesei has a molecular

weight of 58 kDa [61]. Thus, this could be a novel exoglucanase isoform for Trichoderma strains here

studied.

124

On the other hand, according to PCA, we hypothesized that A. niger produced an endoglucanase

isoform of 28.13 kDa. This is in accordance with the literature, where there are reported endoglucanases

of 40 kDa [62], 36 kDa [63] and 30 kDa [64, 65] for A. niger. Our results suggest that xylanase activity

is due to the presence of an isoform of 24.83 kDa. Xylanases are a heterogeneous group of enzymes

which have the capacity to degrade xylan [66]. Different kinds of Aspergillus spp. xylanases have been

described, with molecular weights ranging from 21 kDa (xylanase I), 24 kDa (xylanase II; [67]), 34 kDa

(encoded by xlnC; [68]) until 110 kDa (β-xylosidase; [69]). Thus, could be hypothetized that the

xylanase activity recorded in this study, is a xylanase II of A. niger, and that this isoform is highly

affected by the use of mixed cultures.

It is known that β-glucosidase subunits from Aspergillus fumigatus have a molecular weigt of 90

and 45 kDa [70], and that their native form for A. niger and A. wentii could have 240 kDa [71] and 170

kDa [72], respectively. Few β-glucosidases with low molecular weight have been reported, mainly for

bacteria like the 50 kDa protein of Agrobacterium sp [72]; thus, according to the correlation results, PCA

and PAGE, it could be possible to assume that the isoform of 85 kDa is a β-glucosidase subunit. Further

studies are required to test this hypothesis.

We attribute the decrease in the number of isoforms in mixed cultures to the stressful conditions

of the media used, which could cause a restrictive production of extracellular enzymes (or proteins), in

order to save resources. Nonetheless, it was reported that the transcription of endoglucanase, xylanase

and β-glucosidase genes of Magnaporthe oryzae are induced in different stresful conditions, including

carbon or nitrogen limitation [73]. Here we assume that the main restrictive variables were both oxygen

deprivation generated by static cultures, as well as space limitation due to low work volume used (150

ml). Thus, further research is needed to evaluate the effect of these variables on extracellular cellulase

and xylanase isoforms produced in mixed cultures; this might be important in order to promote the

production of cellulolytic complexes enriched by different isoforms in liquid media.

Althougth in this study it was not observed a higher cellulase and xylanase production, as well as

non-isoform gain in the protein profiles in mixed cultures, we think that the use of fungi consortia could

bring some benefits to the enzyme production field. We observed that culturing two or three fungal

strains together showed a balance between the enzymatic activities; thus, in order to improve the results

here obtained, stirring submerged-fermentations or solid-state fermentations must be tested, to promote

synergistic relationships between the fungal strains, and to avoid competition for nutrients or space, that

could cause adverse outcomes.

125

Conclusion

In first instance, for the conditions evaluated here (static liquid-media), the use of A. niger in mixed

cultures is highly recommended in order to produce high amounts of β-glucosidases, no matter the

combination used (i.e. with Trichoderma strainsand F. oxysporum strains). Secondly, the use of mixed

cultures could cause adverse effects in the amount of enzymes produced (mainly xylanase II) and a

decrease in extracellular proteins isoforms; this may be due to stressful conditions including

physicochemical (oxygen and space limitation) and biological (competition relationships) variables.

Thirdly, according to PCA, the characteristics of the enzymatic complex produced in mixed cultures will

be highly dependent of the cellulase/xylanase pattern production showed in monocultures by the fungal

strains employed. Finaly, the combination of A.niger and F. oxysporum could be interesting for cellulase

(endoglucanase and β-glucosidase) production.

Acknowledgments

To the Santander group and REDMACRO for the finantial support, as well as CONACyT for the

doctoral scholarship of Hernández C.; to the Universidade de Sao Paulo (EEL), Universidad

Veracruzana (INBIOTECA) and Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (CMEB) for the

technical support. The authors would like to thank the anonymous reviewers of this paper.

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http://www.biomedcentral.com/1471

132

2.2 Cellulases produced from Pico de Orizaba’s cold-ecosystem fungi. Does

hydrolyze at lower temperature than cellulases from Trichoderma reesei does?

Manuscrito finalizado

El artículo reporta los resultados obtenidos del capítulo 2.2 Bioprospección de hongos

productores de celulasas del volcán Pico de Orizaba: las celulasas producidas por dichos hongos

son de naturaleza mesófila, por lo que podrían ser utilizadas en procesos de fermentación-

sacarificación simultánea.

133

Cellulases produced from Pico de Orizaba’s cold-ecosystem fungi. Does hydrolyze

at lower temperature than cellulases from Trichoderma reesei does?

Hernández C1, García G

1, Vázquez-Marrufo G

2, Alarcón E

1*.

1Universidad Veracruzana. Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Av. de las

culturas veracruzanas #101 col. Emiliano Zapata CP. 91090, Xalapa Veracruz, México. 2Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Facultad de Veterinaria, Centro Multidisciplinario

de Estudios en Biotecnología, Morelia, Michoacán.

*Correspondence author

enalarcon@uv.mx

Abstract

The use of bioprospections for isolate and discover novel strains capables to produce cellulases with

specific characteristics is very heplful. In this work, we aimed to isolate different fungal strains in a

altitudinal gradient in the Pico de Orizaba volcano (The mexican highest mountain), searching for

mesophilic cellulase-producing fungi, and we compared their yields agains cellulases from Trichoderma

reesei (a tropical fungi) in a temperature gradient. From the isolated strains, on CMC-Czapek Dox Agar,

we selected six strains to produce cellulases in liquid media with different carbon sources. We found that

lactose was the best carbon source for cellulase production (endoglucanase and β-glucosidase) for all

strains. The cellulase activities of the concentrated protein were evaluated in a temperature gradient from

30 to 50 °C, using cellulases from T. reesei as control. Results indicate that fungal strains from Pico de

Orizaba produce mainly mesophilic cellulases, projecting a strain belonging to the family Pleosporaceae

(optimal reaction temperature of 30 and 33°C). This could be understood as an adaptation to cold-

climate of the mountain.

Keywords: endoglucanase, β-glucosidase, fungal bioprospection, Trichoderma reesei, Pleosporaceae.

134

Introduction

Cellulases are important industrial enzymes produced mainly from Ascomycota. Nowdays they are used

as detergent additives, for improving the production process of beer and wine, for production of purees,

for biostoning of jeans, among others (Kuhad et al., 2011). They have the potential for being used for

wood-biopulping, and in large-scale production of second generation bioethanol. Cellulase is a group of

hydrolytic enzymes with different molecular weight and, generally, one of the following activities: β-

1,4-endoglucanase (E.C.3.2.1.4), exoglucanase (cellobiohydrolase; E.C.3.2.1.176) or β-glucosidase

(cellobiase; E.C. 3.2.1.21).

Actually, Trichoderma reesei is the principal source of industrial cellulases, mainly because produce a

large amount of enzymes, its plasticity and its excellent production of exoglucanses (Esterbauer et al.,

1991). Trichoderma’s cellulases (like any enzymes) have specific requirements for catalysis, pH (4.8)

and temperature (50 °C) are some important ones (Ghose, 1987; Ballesteros et al., 2004). Also, they

trend to have low β-glucosidase activity, that is why the mixes with exogenous β-glucosidase are

common for improve their hydrolysis potential (Fortes et al., 2010).

These characteristics are important in industry, because limits the conditions in where they can be used.

In order to diversify the field of applications of cellulases, many efforts have been made to modify their

structure, by mutagenesis or protein engeenering; enhancing their thermostability, thermophilicity,

alkalophilicity (St-Pierre et al., 2012) or the production of β-glucosidase (Jung et al., 2012). However,

despite of the advances in this field, other organisms would exist that produce cellulases with different

catalystic requirements that those produced with Trichoderma reesei, and that could be used for specific

industrial processes. Psycrophilic cellulases were produced from bacterial strains from Indian soils

(Venkatachalam et al., 2014) and mesophilic cellulases from bacterial strains from deep Atlantic Ocean

(Odisi et al., 2012). Likewise, alkaline cellulases were produced from Aspergillus sp and Penicillium sp

strains from soil of the rainforest of Perú (Indira et al., 2014), and cellulases that endure halophytes

conditions were produced from bacterial strains of Odisha region, in India (Vega et al., 2012).

Thermophilic cellulases have attracted the attention of many studies, because their high yields under

extreme operational conditions (Acharya and Chaudhary, 2012). However, for some processes, like

simultaneous fermentation and saccharification of biomass, the use of cellulases with high yields at

mesophilic temperatures (30 °C) could be preferable. This because Saccharomyces cerevisiae can not

survive at thermophilic conditions required for enzymatic hydrolysis of T. reesei cellulases (50 °C).

The use of bioprospections for isolate and discover novel strains capables to produce cellulases with

specific characteristics could be very heplful. In this work, we aimed to isolate different fungal strains in

a altitudinal gradient in the Pico de Orizaba volcano (mexican highest mountain), searching for

mesophilic cellulase-producing fungi, and we compared their yield agains cellulases from T. reesei (a

135

tropical fungi) in a temperature gradient. This in the basis that in Pico de Orizaba prevail cold

temperatures, and fungi that habit their ecosystems could have some adaptations at enzymatic level.

Materials and Methods

Sampling method and fungi isolation

Soil samples of nororiental face of Pico de Orizaba volcano (between Puebla and Veracruz states,

México) were taken in four different altitudinal points: pine-oak forest (3200 msnm), abies forest (3500

msnm), arboreal limit (4000 msnm) and paramo (4300 msnm) (Figure 1.)

At each point, a transect of 50 m was charted and at each 10 m, the litter (400 cm2) was collected in

plastic bags. The litter samples (20 in total) were placed into a cooler and transported to laboratory. We

chose sampling litter because it is the principal habitat of cellulose-degrading fungi (Voříšková and

Baldrian, 2013). Sampling was done at the end of winter, 2015.

For fungi isolation, litter fragments were placed in Czapek-Dox Agar with carboxy-methyl cellulose as

unique carbon source, and 50 mg.L-1

of tetraciclin to avoid bacterial growth. Fungal morphospecies were

sequencially isolated until obtain pure strains. From the strains isolated, the six that had faster growth

were selected to produce cellulases in liquid cultures. The strains were named as follows: POF1 (Pine

oak forest 1), AF1 (Abies forest 1), AF2 (Abies forest 2), AL1 (Arboreal limit 1), P1 (Paramo 1) and P2

(Paramo 2).

Figure 1. Distribution of the sampling sites in Pico de Orizaba volcano. Sampling sites cover an antitudinal gradient from

3200 (a), 3500 (b), 4000 (c) to 4300 (d). Image from Google Maps server®.

136

Cellulase production in liquid cultures

For cellulase production assessment, strains were inoculated in 150 mL of Mandels and Weber medium

(1969) with the following composition per litre: yeast extract 1 g, peptone 4 g, KH2PO4 4 g, (NH4)2SO4

2.8 g, MgSO4 x 7 H2O 0.6 g, CaCl2 x 2 H2O 0.8 g. The medium was enriched with trace elements (mg.L-

1): FeSO4 5.0 mg, ZnSO4 x 7H2O 1.4 mg, CoCl2 2.0 mg.

Because the cellulase producing fungi corresponded to new isolations, a monofactorial desing using

three different carbon sources was used to induce cellulase production: lactose, carboxy methyl cellulose

and sugarcane bagasse; all the carbon sources were added to culture medium at 2%. All treatments were

done in triplicate; thus, a total of 54 experimental inits (Crystal flask, 250 ml) with 150 mL of culture

medium were prepared, inoculated and incubated in a environmental chamber Bunker GmbH at 28° C,

without agitation thought 11 days.

Samples to measure cellulase activities: endoglucanase and β-glucosidase, were taken each 48 hours.

Extracellular protein amount was quantificated in order to determine the specific activities of cellulases.

Effect of temperature on cellulase activity

At the end of incubation time, the culture medium was filtered using a kitasato matrass and a vaccum

pump thought Whatmann paper. After that, the crude extract was dialysated using a tubular-cellulose

membrane, and poly-ethylen glycol as dehydrating agent by 18 h at 4 °C. The concentrated protein was

used to determine the cellulase activities in a temperature gradient.

Endoglucanase and β-glucosidase specific activities were evaluated at mesophilic temperatures: 30, 33,

36 and 39 °C, and the termophilic temperature of 50 °C. As control, comercial cellulases of Trichoderma

reesei (Sigma, USA) were evaluated in the same temperature gradient. The strains that produced

cellulases that hydrolyze at mesophilic temperatures were molecular identified.

Fungal identification

Three strains were identified by amplification and analysis of the ITS rDNA region (Schoch et al.,

2012). DNA of the selected strains was isolated using the Fastprep (MP Biomedicals, LLC, USA) a kit

for fungal DNA isolation, as described by the supplier. PCR reactions of the ITS region were conducted

with the primers and conditions described by White et al., (1990). Amplicons were sequenced at

Elimbiopharm (USA) and the sequences obtained were subjected to Blastn search in Genbank. Those

sequences of Genbank with maximum identity with amplicons obtained were retrieved and used for

phylogenetic analysis. Additional ITS sequences of the same genus obtained in Blastn search were

selected and retrieved from Genbank in order to make more robust the phylogenetic analysis of each

studied strain. The sequences were aligned by ClustalW and edited by hand. Genetic distances were

137

calculated by the Kimura- 2 parameters and then the phylogenetic reconstruction was conducted by

using the Maximum Likelihood criteria with 1000 bootstrap replicates. Maximum Parsimony (MO) trees

were also generated using same genetic distances. All these steps for phylogenetic analysis were

conducted in Mega 6 (Tamura et al., 2013).

Analytical methods

Relative activity of β-glucosidase activity was evaluated by quantifying the amount of p-nitro phenol

liberated from a solution of p-nitro phenyl-β-D-glucopyranoside, 0.1 mM spectrophotometrically at 412

nm (Eivazi and Tabatabai, 1988). The activity was reported as U•ml-1

. Relative activity of

endoglucanase was determined according to Ghose (1969), quantifying the reducing sugars released

from carboxymethyl cellulose by the method of dinitrosalicylic acid (DNS; Miller, 1954). The enzymatic

reaction was performed at 50 ° C in a water bath, stopped with DNS reagent, read in a

spectrophotometer at 540 nm and converted to μM•ml-1

by comparing with a standard curve of glucose;

enzyme activity was reported as U•ml-1

(μM•min-1

•ml-1

).

Extracellular protein amount was calculated by the colorimetric method of coomassie blue at 595 nm

according to Bradford (1976). The values of relative activities of cellulases and the protein amount were

used to calculate the specific activities of endoglucanase and β-glucosidase (U.mg protein-1

).

Results

Effect of carbon source in cellulase production

The use of different carbon sources to induce cellulase production affects the production of

endoglucanase and β-glucosidase (Figures 2 and 3). The strains AL1, P1 and POF1 produced the highest

amount of β-glucosidase when lactose (AL1 = 36.67 and POF1 = 4.52 after 11 days of culture, and P1 =

22.66 ± 2.42 U.mg protein -1

after 9 days of culture) or CMC (AL1 = 28.90 and P1 = 31.42 after 11 days

of culture, and POF1 = 43.65 ± 6.37 U.mg protein -1

after 9 days of culture) were used as carbon source;

meanwhile, when SCB was used the activities decreased (AL1 = 18.94; POF1 = 5.32 and P1 =19.36 U.mg

protein -1

after 11 days of culture).

On the other hand, lactose was the prefer carbon source for the production of endoglucanase (Figure 3).

And in the same way that β-glucosidase, the strains P1 (after 9 days of culture) and POF1 (after 4 days of

culture) produced the highest amount of endoglucanase (30.41 ± 9.22; 38.60 ± 10.28 U.mg protein -1

,

respectively). At the end of the incubation time, the enzymes of all strains, produced with lactose, were

concentrated and the effect of temperature on its activities was evaluated.

138

Figure 2. β-glucosidase activity in cultures of fungi isolated from Pico de Orizaba volcano, using three different carbon

sources: a) lactose, b) carboxymethyl cellulose c) sugarcane bagasse. Middle points indicate the mean and bars the standard

error, n = 3.

139

Figure 3. Endoglucanase activity in cultures of fungi isolated from Pico de Orizaba volcano, using three different carbon

sources: a) lactose, b) carboxymethyl cellulose c) sugarcane bagasse. Middle points indicate the mean and bars the standard

error, n = 3.

140

Figure 4. Cellulases activities of concentrated proteins of the different fungi isolated from Pico de Orizaba volcano in a

temperatura gradient. Fit = weighted least square.

141

Effect of temperature on cellulase activities

Cellulases produced in liquid media with fungi from cold ecosystems of Pico de Orizaba volcano

showed different optimal reaction temperature (ORT) (Figure 4). Specific endoglucanase activities of the

strains isolated from pine-oak forest and Abies forest (POF1, AF1 and AF2) showed highest activities

between 33 to 39 °C, decreasing at 50 °C. The strain AL1, isolated at 4000 m over sea level in the

arboreal limit, showed its highest activity at 33 °C (452.10 U.mg protein-1

), and decreased when

temperature increased. Contrary, endoglucanase from T. reesei showed its highest endoglucanase activity

at 50 °C (233.98 U.mg protein-1

), and decreased when temperature decreased, until 35.35 U.mg protein-1

at 30 °C.

Specific β-glucosidase activities of AL1, and AF2 showed its highest activities at 30 and 33 °C,

respectively. Thus, the enzymes produced by those strains could be considered as mesophilic β-

glucosidases. Contrary, β-glucosidases of POF1, AF1 and P1 had high activity at 39 °C, and P2 at 50°C

(Figure 4).

Our results inducate that cellulases produced with different fungal strains from forestal areas of Pico de

Orizaba, hydrolyze at temperatures from 30 to 39 °C, better than at 50 °C. Strains from Paramo

produced cellulases that hydrolyze better at 39 to 50 °C, in the same way that cellulases from T. reesei.

Phylogenetic analysis of the fungal isolates

We selected AL1 as a strain with potential to produce mesophilic cellulases, but the strains POF1 and P1,

which had high cellulase production were also identified. Blastn search of amplicons obtained from

fungal isolates P1 and POF1 show maximal identity with sequences of Trichoderma harzianum complex,

whereas isolates AL1 shows maximal identity with Pleosporaceae species (genus Alternaria and

Ulocladium). Phylogenetic reconstruction of the ITS region from strains P1 and POF1 groups with its

corresponding sequences T. harzianum complex with a bootstrap value of 100%, clearly separated from

all other species within the genus (Figure 5). Strain AL1 grouped with genus Alternaria and Ulocladium,

both genus are polyphyletic and paraphyletic related taxa of the Pleosporaceae family, and phylogenetic

between those two genus are commonly not-resolved (Xue and Zhang, 2007; Runa et al., 2009) (Figure

5).

142

Figure 5. Phylogenetic reconstruction (Maximum parsimony) of the three cellulase most-producing fungi, isolated from Pico

de Orizaba cold ecosystems.

143

Discussion

Bioprospection, is a key way to find new organisms with potential biotechnological uses. In this work,

we aimed to find evidence that litter fungi of cold mountain ecosystems have cellulase adapted to

hydrolyze at lower temperatures (mesophilic cellulases) than cellulases of the tropical fungi T. reesei

(thermophilic cellulases: 50 °C). Several studies reported that themophilic bacteria produce

thermotolerant cellulases, which can be used for many industrial processes (Arora et al., 2015;

Norashirene et al., 2014); however, mesophilic cellulases have recibed less attention in the

bioprospection field, in spite of they could be used for simultaneous saccharification and fermentation

processes, insted of cellulases of T. reesei or themotolerant yeast (Kádár et al., 2004).

In order to evaluate the production of cellulase from the fungal strains isolated on CMC-Czapek Dox

agar, we performed liquid media with three different carbon sources, i.e. lactose, CMC and SCB, and

spite of all carbon sources induced cellulase production, the best results were obtained with lactose.

Lactose is considered a good inducer or cellulases, even if the mechanism of induction is not complety

understood (Karaffa et al., 2006; Porciuncula et al., 2013); our results point that lactose and Mendel-

Weber medium, could be useful for the production of cellulases with novel fungal strains.

Of the isolated strains, all produced endoglucanases with mesophilic ORT (33-39 °C) with exception of

P1 wich had an optimal reaction temperature (ORT) of 50 °C (thermophilic). The same was observed for

β-glucosidase, all strains produced mesophilic β-glucosidases with exception of P2. We consider this as a

evolutival characteristic of the fungi that lives in cold ecosystems, in the same way that tropical or

thermophilic organisms have their cellulases adapted to catalyze at high temperatures.

Strains P1 and P2, were isolated at the highest sampling point (4300 m above sea level; Paramo), the ITS

phylogeny revealed that belong to Trichoderma harzianum (P1) and Phoma herbarum (P2, tree don’t

shown). T. harzianum are known to produce cellulase with ORT between 37 to 40 °C (Thrane et al.,

1997); meanwhile, P. herbarum, a pathogenous fungi of plants and salmonids, have attracted the

attention for its capacity to produce xylanases/cellulases, among other chemicals (Alvarez-Navarrete et

al., 2015). However, few is known about the characteristics of their cellulases. In this work we found

that P. herbarum could be a source of thermophilic (50 °C) β-glucosidases, however its production was

very low.

Themophilic cellulases are characterized by hydrophobic protein core and polarity at the surface;

compact structure with lesser internal voids; higher content of proline and leseer content of asparagines,

glutamine, methionine and cysteine; increased level of H-bonding, isoelectric points and salt bridges

(Arora et al., 2015; Taylor and Vaisman, 2010; Li et al., 2011). On the other hand, exist cold-active

cellulases, produced by psychrophilic or psychrotolerant organisms (e.g. from polar regions or marine

sediments). Those cellulases have been propossed for the production of algae-derivated bioethanol

144

(Wang et al., 2015); and are considered important for specific industrial uses (Gerday et al., 2000).

Cold-active cellulases from Pseudoalteromonas sp. (isolated from Antartic region) have their ORT at 30

°C (Wang et al., 2015), as well as the cellulases produced with our strain AL1 who belong to

Pleosporaceae family (isolated in the arboreal limit, at 4000 m above sea level). The optimization to low

temperature is reached via destabilization of the structures bearing the active site, this improves the

dynamic of the active site in the cold (Ferrer, 2013). Phylogeny based on ITS sequence did not clarify

the identity at specie level of the strain AL1; however, pointed that the strain belong to genus Alternaria

or Ulocladium (family Pleosporaceae). Some authors have reported that there is not a clear difference

between those related taxa, and in spite of the efforts, the phylogeny still unresolved (Xue and Zhang,

2007; Runa et al., 2009).

Both, Alternaria and Ulocladium species are commonly leaf phytopathogens and saprotrophic, and their

production of cellulases have been proved. It has been reported that the temperature of incubation for

Alternaria species (A. alternata and A. citri), affects their cellulase production, and that at 30 °C the

production of cellulases was optimal (El-Said et al., 2014). Here, we observed that AL1 has its ORT at

these temperature; however, other studies from Pakistan region (where predominates warm climate),

indicates that cellulase from Alternaria sp have an ORT of 45 °C for β-glucosidase and 50 °C for

endoglucanase (Sohail et al., 2011).

On the other hand, Ulocladium is a potent mycotoxin-free cellulase-producer (Pedersen et al., 2009), but

reports pointed that its cellulases (U. botrytis, endoglucanases) have its maximal activity at 60 °C (Abo-

Elmagd and Housseiny, 2012), contrary to our AL1 cellulases. These previous data, could suggest that

AL1 strain of Pico de Orizaba volcano, belonging to Pleosporaceae family, have developed a cellulase

adapted to function at lower temperatures than other strains of Alternaria or Ulocladium, and that its a

potential source of mesophilic cellulases. However, structural studies of their cellulases are required to

proved this hypothesis.

Further studies using the cellulases obtained from AL1 for simultaneous fermentation and

saccharification, or other biotechnological processes at mesophilic temperatures, shed light on the

suitability of their use compared with cellulases from other more-used fungi, like T. reesei or A. niger.

Conclusion

Fungi isolated from Pico de Orizaba volcano produce mainly mesophilic cellulases (endoglucanases and

β-glucosidases), with exception to those belonging to Trichoderma or Phoma genus. This could be

understood as an adaptation to cold-climate of the mountain.

Among all strains, AL1, who belong to Pleosporaceae family, had high cellulase production when lactose

was used as carbon source. Also, its cellulases have an ORT between 30 and 33 °C, which makes them

145

good candidates for biotechnological uses, developed at mesophilic temperatures.

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148

Capítulo 3

Digestibilidad enzimática de BCA sometido a diferentes

pretratamientos

__________________________________

149

3.1 Sugar cane bagasse pretreatments analysed through 13

C CPMAS NMR:

implications for enzymatic hydrolysis and fermentation

Manuscrito finalizado

El artículo reporta los resultados obtenidos del capítulo 3.1. Evaluación de distitnos

pretratamientos sobre la composición química del bagazo de caña de azúcar, y su posterior efecto

en el rendimiento de hidrolisis y fermentación.

150

Sugar cane bagasse pretreatments analysed through 13

C CPMAS NMR:

implications for enzymatic hydrolysis and fermentation

Hernandez C1, Ziarelli F

4, Gaime I

2, Farnet AM

3, García G

1, Alarcon E

1*

1Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana, Xalapa Veracruz, México.

2Equipe Ecotechnologies et Bioremediation, IMBE, UMR CNRS 7263, IRD 237, Faculté des Sciences et Techniques de St.

Jérôme, Aix Marseille Université, Marseille, France

3Equipe Systèmes Microbiens IMBE, UMR CNRS 7263, IRD 237, Faculté des Sciences Techniques de St. Jérôme, Aix

Marseille Université, Marseille, France

4Aix Marseille Université, Faculte ́ des Sciences et Techniques de Saint-Jérôme, Spectropole, PO box 512, Avenue Escadrille

Normandie Nie ́men, 13397 Marseille cedex 20, France

*Correspondence author

enalarcon@uv.mx

Abstract

Alkalin and biological pretreatments to lignocellulose are commonly used for enhance enzymatic hydrolysis, and

enhance ethanol production. It is known that those pretreatments change the fiber composition of lignocellulose

(e.g. decreases lignin content); nonetheless, few attemps have been done to detail the chemical changes that occur

when different pretreatments are used. In this study, we used 13

C CPMAS NMR technology to describe changes in

sugarcane bagasse (SCB) pretreated with NaOH and Ca(OH)2 solutions; and with Pycnoporus sanguineus

(Polyporaceae). We found changes in alkyl C, Carboxyl C, Aromatic C (tertiary, quaternary and p-hydroxyphenyl

C), O-alkyl C, aminoacids, ergosterol and chitin contents, and cellulose crystallinity index (CI); when SCB was

submitted to different pretreatments. Changes in the chemical composition of SCB, was after related to enzymatic

hydrolysis by Principal Component Analysis. We found that P. sanguineus promotes better lignin decay, glucose

release and hydrolysis yields than the others pretreatments; also, P. sanguineus increases the amount of

aminoacids and ergosterol in SCB; meanwhile, NaOH increases cellulose crystallinity index. The hydrolizates

were fermented with Saccharomyces cerevisiae by 96 h, and analized by HPLC. The initial composition of the

hydrolyzates, i.e. glucose and saccharose contents (mg.ml-1

), and the biomass production (cells.ml-1

) were then

related to the ethanol production and fermentation yields. We found that ethanol production and fermentation

yield were negatively correlated with biomass production, but positively correlated with glucose comsumption and

with P. sanguineus pretreatment. We conclude, that a biological pretreatment, using P. sanguineus in the

conditions here decribed, is a good way to increase ethanol productivity.

Keywords: Pycnoporus sanguineus, ethanol, cellulose crystallinity, alkaline pretreatments

151

Introduction

Sugar cane bagasse (SCB) is a promising source of prime matter for cellulosic bioethanol production

(Cardona et al., 2010); however, lignin and hemicellulose content, and cellulose crystallinity index

represent an obstacle for enzymatic hydrolysis. Lignin can adsorb cellulases and the crystallinity of

cellulose difficults the enzymatic hydrolysis (Hall et al., 2010; Mussato et al., 2008). Thus, for an

efficient lignocellulose hydrolysis it is necessary a pretreatment process for decreasing lignin,

hemicellulose content and the cellulose-crystallinity index.

Some of the most widely used pretreatments includes alkali agents, like NaOH, Ca(OH)2 and

KOH (Maryana et al., 2014). Alkali attacks lignin via ester-linkages saponification, between cellulose

and hemicellulose with lignin (Sun and Cheng, 2002); however, can generate alkalin-cellulose by ion

exchange (Bahar et al., 2009). In addition, the use of alkali agents for biomass delignification, generally

do not generate nocive compounds for microorganisms, contrary when acids are used (Yemis and Maza,

2011).

In the other hand, biological pretreatments using living fungi have been probed that contribute to

enhance enzymatic hydrolysis (Nazarpour et al., 2013). Fungi (mainly white-root fungi), can oxidize

lignin via phenoloxidase enzymes (i.e. laccases, Mn-peroxidases, lignin peroxidases), but also produce

cellulases and hemicellulases (e.g. xylanases), decreasing the polysaccharides stock and the bioethanol

production potential. Also, fungi transform some lignocellulose material into fungal biomass, changing

the whole feedstock material. The structural characterization of SCB fibers, pretreated with living fungi,

is necessary in order to understand how fungal enzymes affects the fibers composition, and how this

structural composition affects the hydrolysis/fermentation downstream processes. Classical methods for

fibers analysis based in subsequent detergent hydrolysis (e.g. Van Soest and Wine, 1964) are not enough

for explain the complex modifications of lignocellulose fibers by fungi or chemical pretreatments, at cell

wall level. Thus the use of other techniques like near infrared spectroscopy FTIR and 13

C solid-state

nuclear magnetic resonance (NMR) are preferred for lignocellulose characterization.

13C CPMAS NMR spectroscopy is a powerful technique of analysis, successfully used for soil

litter (Alarcón-Gutiérrez et al., 2009), lignification process (Terashima et al., 1997) and the extent of

condensation in lignin (Liitiä et al., 2002) characterization; and can be used for evaluate changes in

fungal biomass (Friĉová and Koval’aková, 2013). Solid-state NMR provide a way to do chemical

analysis in a native state, and is a remarkable choice for samples with restricted solubility, as residuals

lignins, or when the physical structure of cellulose is studied (Maunu, 2002). So, this study was

conducted in order to characterize SCB fibers after a biological pretreatment using the fungi Pycnoporus

sanguineus, and two alkaline pretreatments, using NaOH and Ca(OH)2 by 13

C CPMAS NMR

spectroscopy. After that, pretreated SCB was hydrolized with Aspergillus niger cellulases and fermented

152

with Saccharomyces cerevisiae, and the yields of both steps were related to its structural composition,

using multivariate statistical methods.

Materials and methods

Sugarcane bagasse pretreatments

SCB from the sugarmill of Mahuixtlán, Veracruz, México; was subjected to two kind of delignification

pretreatments. The first one using an alkalin solution (with NaOH or Ca(OH)2) at 5 % w/v, and

autoclaving by 15 min at 120° C and 15 lb of preasure. Delignified SCB was washed three times with

dH2O, in order to remove sodium or calcium salts, after that, was dried at 60° C by 24 h and ground

prior to 13

C CP MAS NMR analysis, and cellulase hydrolysis.

The other pretreatment was biological. A volume of basal medium (Eggert, 1996) with the

following composition (per litre): 1 g of KH2PO4, 0.26 g of NaH2PO4, 0.317 g of (NH4)2SO4, 0.5 g of

MgSO4 7H2O, 0.5 mg of CuSO4, 74 mg of CaCl2, 6 mg of ZnSO4, 5 mg of FeSO4, 5 mg of MnSO4, 1

mg of CoCl2, supplemented with yeast extract (1 g.L-1

) as nutrient source and pH adjusted to 6 was

added to 50 g of pre-dried sugar cane bagasse (SCB) until a final humidity of 80% v/w. The wet SCB

was deposited into poly-paper plastic bags and sterilized by autoclaving (120°C:15 lb of presure) for 20

min. After cooling, three-agar squares 0.25 cm2 in size with reactivated mycelium (7 days of culture)

were used as inoculum. The mesocom were incubated in darkness at 30°C in an environmental chamber

(Binder, GmbH). SCB samples were analyzed by 13

C CPMAS NMR methodology, in order to determine

the substrate modification by P. sanguineus. Each pretreatment: NaOH 5%, Ca(OH)2 5% and

Pycnoporus sanguineus (solid-state fermentation) were replicated three times.

13C CP MAS NMR analysis

Changes in chemical composition of SCB were followed via 13

C CPMAS NMR in a Bruker Advance

DSX 400 MHz spectrometer (Bruker, Madison, WI, USA). 100 mg of dried and ground SCB were

placed in a zirconium rotor and spun at the Magic angle (54.44°) at 10 KHz. The 13

C CPMAS NMR

technique was performed with a ramped 1H pulse during a contact time of 3 ms and with

1H decoupling

during the acquisition time to improve the resolution. Recording 4 K transients with a recycling delay of

2 s represented standard conditions to obtain a good signal-to-noise ratio.

Analysis of NMR spectra was performed using the MestReNova v10.0.2 software (Mestre Lab

Research S. L 2015). Specific regions of NMR spectra were utilized as indicators of chemical shifts in

SCB (Table 1), those regions allowed us to evaluate changes in SCB polysaccharides content, cellulose

crystallinity, xylane and lignin contents; and in fungal biomass production (i.e. aminoacids, ergosterol,

quitin).

153

Enzymatic hydrolysis

Pretreated SBC was ground, and 0.5 g was disposed in 25 ml (2 % w/v) of sodium-acetate buffer pH 4.8.

Aspergillus niger cellulases (USB Affimetrix, USA) were added at a concentration of 160 mg.ml-1

, in

order to achieve 3.5 FPU.ml-1

(previous enzyme characterization). The reaction mixture was incubated in

crystal flasks (250 ml) in an environmental chamber (Binder GmbH) at 50° C and 150 rpm. Enzymatic

hydrolysis had a duration of 96 h, and each 24 hours a sample was taken for determining: cellulase

activity (FPU), total reducing sugars; and glucose, xylose, arabinose, and mannose contents.

After 96 hours, the hydrolysis yield (Hy) was calculated according to the following ecuation (Maeda et

Table 1. Regions of 13

C CPMAS NMR spectra utilized for assess chemical shifts in SCB

Component Position Reference

Alquil-C region 0-45 ppm

Aminoacids carbon γ 16.1-24.7 ppm Straus et al., (1997)

Aminoacids carbon β 28-37.6 ppm Straus et al., (1997)

CH3 of quitin 23.32 ppm Van de Velde and Kiekens (2004)

Ergosterol and derivates C4,

C24, C20, C13, C10

37.05-42.85 ppm Yue et al., 2001; Wang et al., 2008; Toh

Choon et al., 2012

O-alquil C Region 45-110 ppm

Cellulose crystallinity Is calculated by dividing the

total area of the crystalline

peak (87 to 93 ppm) by the

total area assigned to the C4

peak (80 – 93 ppm).

Park et al., (2010)

Aminoacids carbón α 53.5-61.3 ppm Straus et al., (1997)

Aminoacids carbon δ 47.5-49.2 Straus et al., (1997)

Xylane C4 81.2 – 81.7 ppm Wickholm et al., (1998)

Hult et al., (2000)

Aromatic C Region 110 – 160 ppm

Aromatic tertiary C 110-123 ppm Hallac et al., (2009)

Aromatic quaternary C 123-160 ppm Hallac et al., (2009)

p-hydroxyphenyl 157-162 ppm Hallac et al., (2009)

Carboxil-C Region 160-190 ppm

Quitin C=O 173.7 ppm Van de Velde y Kiekens (2004)

Carbon of COOH from

aminoacids

170.9-174.5 ppm Straus et al., (1997)

154

al., 2011):

𝐻𝑦 =𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑟𝑒𝑙𝑒𝑎𝑠𝑒𝑑 (𝑚𝑔/𝑚𝑙)

𝑆𝐶 × 𝐶𝐶 × 1.1

Where:

SC = substrate content (mg.ml-1

)

CC = holocellulose content in substratum (g.g-1

)

1.11 = Is the correction factor derivated of the addition of water molecules into anhidroglucose residues

Fermentation

After enzymatic hydrolysis, the volume was diluted with dH2O (1:4) and 0.34 mg.ml-1

of dry cells of

Saccharomyces cerevisiae were used as inoculum, according to Li et al (2011). The crystal flasks were

incubated at 30 °C and 150 rpm by 96 hours. Each 24 hours a sample was taken for determining the

glucose, xylose, mannose, arabinose and ethanol content; biomass was estimated by direct counting with

a Neubauer chamber. Finalizing the incubation time, the fermentation effiency was calculated by the

following ecuation (Yadav et al., 2011):

𝐹𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑒𝑓𝑖𝑒𝑛𝑐𝑦 = 𝑃𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑐𝑎𝑙 𝑦𝑖𝑒𝑙𝑑

𝑡ℎ𝑒𝑜𝑟𝑒𝑡𝑖𝑐𝑎𝑙 𝑦𝑖𝑒𝑙𝑑 𝑥 100

Where:

Practical yield = ethanol produced

Theoretical yield = 0.511 per gram of glucose consumed

Analytical methods

Cellulase activity was measured calculating the Filter Paper Units of 0.5 ml of solution, according to

Ghose (1987). For this, the glucose equivalents released by diferent enzyme dilutions from a strip of 6 x

1 cm (50 mg) of filter paper (Whatman No. 1) were determining by the method of dinitrosalicilic acid

(DNS; Miller, 1959), and used to estimate the enzyme needed to release 2.0 mg of glucose in 60 min, at

50°C. The reaction mixture employed was as follows: 0.5 ml of enzyme dilution + 1 ml of sodium-

acetate buffer pH 4.8 + strip of filter paper. After the incubation time, the reaction was stoped with 3 ml

of DNS reagent, boiled for 5 min and cooled in an ice bath by 20 min. 200 µl of the reaction mixture

were diluted in 2.5 ml of dH2O and read at 540 nm. With those data FPU.ml was calculated following

the next ecuation:

155

𝐹𝑃𝑈 = 0.37

𝐸𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑡𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑒𝑎𝑠𝑒 2.0 𝑚𝑔 𝑜𝑓 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒𝑢𝑛𝑖𝑡𝑠. 𝑚𝑙

Monomeric sugars, i.e. glucose, xylose, arabinose, mannose and ethanol, were quantified using High

Performance Liquid Chromatography (Aliance Waters e2695), with a column HPX-87H Aminex

BioRad, at 40° C and with a flux of 0.8 ml.min-1

.

Statistical analysis

The data matrix of chemical composition of the different SCB submitted to the different pretreatments

used, was analysed with the data of the hydrolysis products and yield, and with the data of the

fermentation products; using a Canonical Correspondence Analysis (CCA), where the qualitative

variables were the different pretreatments used. This analysis allowed us to found relations between the

chemical composition of SCB obtained from 13

C CPMAS NMR, and the products obtained in the

downstream process.

Results

Chemical shifts in SCB submitted to different pretreatments

The chemical composition of the SCB changed after chemical and biological pretreatments. O-alkyl C

signal, corresponds to the carbohydrate (i.e. holocellulose) content of SCB; this signal indicates, that the

original composition of SCB have 79.76% of holocellulose, and after an alkalin pretreatment with NaOH

the proportion increases to 88.86%, and to 84.13% when Ca(OH)2 was used. Contrary, the biological

pretreatment decreases the amount of holocellulose to 50.65%. Aromatic C region, which corresponds to

lignin, had an original proportion of 12.87%, and the pretreatments decreses this value as follows:

Ca(OH)2 to 10.26%, NaOH to 7.03% and P. sanguineus to 6.53%. The value of the regions Carboxyl C

and Alkyl C, are associated with proteins and lipids (Table 1), and these values were very low in the

original composition of SCB: 3.57% and 2.45%, respectively. Alkalin pretreatments disminish the

amount of Carboxyl C to 1.48% (NaOH) and 1.60% (Ca(OH)2), and in general, did not affected Alkyl C

region. In the other hand, the pretreatment with P. sanguineus strongly increases both regions, Carboxyl

C increases until 9.31%, and Alkyl C until 33.49% (Figure 1a).

Signals corresponding to Cα, Cβ and Cδ of aminoacids, increased in the treatments with P.

sanguineus from 5.61% to 18.38%, as well as signals from chitin and Cγ of aminoacids, from 3.47% to

8.49%; alkalin treatments diminish or did not changed those signals (Figure 1b). Ergosterol signal was

156

near to 0 in the original composition of SCB, and remained in the same way after alkalin pretreatments.

However, when P. sanguineus was employed, ergosterol increased from 0.24% to 4.33%.

The proportion of amorphous cellulose and crystalline cellulose, estimated by the signal position of the

C4 of pyrano-glucose (Figure 1c), indicates that SCB has an original crystallinity index (CI) of 0.29.

This value, changed a little according to the pretreatments employed: SCB pretreated with NaOH

increased its CI to 0.32; decreased to 0.27 when Ca(OH)2 was used, and remained unchanged in P.

sanguineus pretreatment. Finally, the signals of aromaric carbons decreased in all treatments, been P.

sanguineus the treatment that reached the highest decrease of aromatic carbons, near followed by SCB

pretreated with NaOH, and third, the SCB pretreated with Ca(OH)2.

157

Figure 1. Chemical composition of SCB after an alkalin or biological pretreatment. a) Major components of NMR spectra, related to the

presence of organic macromolecules (i.e. lipids, proteins, carbohydrates and aromatic compounds). b) changes in signals associated to the

development of the fungal biomass, i.e. aminoacids, chitin and ergosterol. c) Changes in C4 of glucose and xylose, which can be associated

to an increase or decrease of crystalline/amorphous cellulose, and xylene. d) Changes in the carbon composition of lignin.

Hydrolysis step

Cellulase activity decreases rapidly in the first 24 hours, in all treatments; meanwhile, total sugars

content increases in these 24 hours, and after that remained almost unchanged (Figure 2). The area under

the curve of the FPU activities, showed that when SCB pretreated with P. sanguineus (99.21 FPU in 96

h) and NaOH (115 total FPU in 96 h) were hydrolized, the enzymatic stability was higher. Contrary, less

FPU activity was registred in treatments with SCB pretreated with Ca(OH)2 (56.91 total FPU in 96 h)

and SCB no-treated (57.33 total FPU in 96 hours).

Figure 2. Cellulase (FPU.ml-1) kinetics in 96 h SCB hydrolysis (right Y axis). In color, kinetics of reducing sugars content (mg.ml-1) (Left

Y axis). Middle points indicates average values, and bars the standard error, n = 3.

Figure 3. Glucose (mg.ml-1) kinetics production during enzymatic hydrolysis (96 h). Middle points indicates average values, and bars the

158

standard error, n = 3.

Similar to total reducing sugars release, glucose production was faster in the first 24 h of hydrolysis.

SCB pretreated with P. sanguineus produced the highest amount of glucose (29.76 ± 2.2 mg.ml-1

),

followed by SCB pretreated with Ca(OH)2 (28.19 ± 0.45 mg.ml-1

), NaOH (23.84 ± 2.0 mg.ml-1

), and

finally, the no-treated SCB (9.95 ± 15.93 mg.ml-1

) (Figure 3). Saccharose content, decreases slightly

during the SCB hydrolysis in all treatments (Figure 4); reaching a final concentration of 4.38 ± 0.36

mg.ml-1

, 4.26 ± 0.4 mg.ml-1

, 3.66 ± 0.3 mg.ml-1

and 1.48 ± 2.4 mg.ml-1

; when SCB pretreated with

Ca(OH)2, P. sanguineus, NaOH and no-treated were used, respectively (Figure 4).

Figure 4. Saccharose (mg.ml-1) content during enzymatic hydrolysis (96 h). Middle points indicates average values, and bars the standard

error, n = 3.

With data of glucose production, and the holocellulose initial content, we estimated the hydrolysis yield.

Thus, the highest hydrolysis yield was achieved in the treatments when SCB pretreated with P.

sanguineus, followed by the SCB pretreated with Ca(OH)2, NaOH and finally, the no-treated SCB.

Fermentation step

In the fermentation step, the hydrolyzate was diluted 1:6 with dH2O, the differences in the hydrolysis

yield provoked differences in the initial glucose content of the fermentation cultures (Figure 5). Glucose

decreased near to 0 mg.ml-1

in all treatments, after 48 h of culturing with S. cerevisiae; menwhile,

saccharose was metabolized slower (Figure 6). On the other hand, S. cerevisiae biomass (Figure 8) and

ethanol, increased until 96 h, the hydrolizate of SCB pretreated with NaOH (3.26 ± 0.3 mg-ml-1

) and P.

sanguineus (2.99 ± 0.2 mg.ml-1

), were those who produced more ethanol; followed by no-treated (2.11 ±

0.8 mg.ml-1

) and Ca(OH)2 (1.50 ± 0.3 mg.ml-1

) (Figure 7).

159

The highest fermentation yield was attained from the hydrolizate of SCB pretreated with P. sanguineus,

followed by no-treated SCB, NaOH, and finally, Ca(OH)2.

Figure 5. Glucose (mg.ml-1) content during fermentation (96 h). Middle points indicates average values, and bars the standard error, n = 3.

Figure 6. Saccharose (mg.ml-1) content during fermentation (96 h). Middle points indicates average values, and bars the standard error, n

= 3.

160

Figure 7. Ethanol (mg.ml-1) content during fermentation (96 h). Middle points indicates average values and bars the standard error, n = 3.

Figure 8. Cells of Saccharomyces cerevisiae (cells.ml-1) content during fermentation (96 h). Middle points indicates average values,

and bars the standard error, n = 3.

Multivariate analysis

Chemical composition of SCB pretreated with P. sanguineus or alkali solutions, affected the hydrolysis

yield and the hydrolysis products obtained. Glucose released was positive correlated with Alkyl C,

Carboxyl C, aminoácids content, chitin and ergosterol; these variables positive affected the hydrolysis

yield too (Table 2).

161

Table 2. Pearson correlations (r) between chemical components of pretreated SCB and hydrolysis products/enzymatic activity.

Compounds Cellulase stabillity Glucose released Hydrolysis yield Saccharose final content

Alkyl C -0.592 0.746 0.923 0.435

Carboxyl C -0.500 0.545 0.786 0.158

Aromatic C 0.117 -0.653 -0.668 -0.739

O-alkyl C 0.597 -0.634 -0.847 -0.254

aaƴ+chitin -0.478 0.489 0.742 0.087

aaCβδα -0.675 0.797 0.950 0.483

Ergosterol -0.599 0.762 0.932 0.459

Xylane C4 0.497 -0.593 -0.823 -0.232

Cellulose crystallinity 0.793 -0.311 -0.268 -0.036

Tertiary aromatic C 0.257 -0.757 -0.740 -0.833

Quaternary aromatic C 0.057 -0.604 -0.632 -0.694

p-hydroxyphenyl aromatic C 0.247 -0.736 -0.633 -0.908

Meanwhile, cellulose crystallinity, Aromatic C, and tertiary, quaternary and p-hydroxyphenyl aromatic

C, negatively affected glucose release and hydrolysis yield. Cellulase stability was positive correlated

with O-alkyl C, Xylane C4 and Cellulose crystallinity; and negative correlated with Alkyl C, Carboxyl

C, carbon aminoacids, chitin and ergosterol. Saccharose was positive correlated with the variables

associated to the presence of fungal biomass, and negatively correlated with lignin compounds (aromatic

carbons) (Table 2).

PCA Biplot, showed, that the treatment which promotes more glucose and hydrolysis yield was P.

sanguineus. Pretreatment with NaOH and Ca(OH)2 (less effect), increases cellulose crystallinity, but

increases O-alkyl region and the cellulase stability. No-treated SCB had the highest amounts of liginin

compounds, and was negatively associated with glucose release and hydrolysis yield (Figure 9).

162

Figure 9. PCA biplot showed the relation between chemical composition of SCB and hydrolysis variables (red lines), with the

pretreatments used (yellow circles).

In the same way, hydrolizates composition affected the fermentation yield and the ethanol production.

Biomass production was positive correlated with glucose consumed, but negative related to fermentation

yield and ethanol production (Table 3). It was not observed strong relations of the variables measured

with the ethanol production and fermentation yields. Nevertheless, PCA biplot indicates that the

hydolyzed composition that comes from SCB pretreated with P. sanguineus, reached the best ethanol

and fermentations yields (Figure 10). Contrary, the worst hydrolysate composition for ethanol

production was which used SCB pretreated with Ca(OH)2.

Obs1

Obs2

Obs3

Obs4

Pretreatment-NaOH

Pretreatment-Ca(OH)2

Pretreatment-P. sanguineus

Pretreatment-Control

Alkyl C

Carboxyl C

Aromatic C

O-alkyl C

aaƴ+chitin

aaCβδα

Ergosterol

Xylane C4

Cellulose crystallinity

Tertiary aromatic C Quaternary aromatic C

p-hydroxyphenyl aromatic C

Cellulase stabillity

Glucose released

Hydrolysis yield

Saccharose final content

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

-3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

F2 (

23

.14

%)

F1 (64.95 %)

Biplot (ejes F1 y F2: 88.09 %)

Activas Centroides variables activas

163

Table 3. Pearson correlations (r) between hydrolizates composition and fermentation products.

Variables Glucose consumed Fermentation yield Ethanol production Biomass production

Cellulase stabillity -0.165 0.025 0.373 0.076

Glucose released 0.221 0.129 0.061 -0.118

Hydrolysis yield -0.064 0.333 0.204 -0.370

Saccharose final content 0.510 -0.053 0.104 0.172

Biomass production 0.77 -0.65 -0.33 1

Figure 10. PCA biplot showed the relation between hydrolysate composition and fermentation variables (red lines), with the pretreatments

used (yellow circles).

Discussion

We observed, that the pretreatments evaluated, changed the chemical composition of SCB, comparing

with control. All treatments were able to decrease the aromatic C content, but the highest lignin decay

was achieved with P. sanguineus; this treatment, enriched the aminoacid, ergosterol and chitin amount

of SCB, but decreased the carbohydrate proportion. Thus, P. sanguineus transformed a portion of the

SCB into fungal biomass, as was hypothesized at beginning; however, this fungal biomass gain does not

interfer with the enzymatic hydrolysis. In fact, the highest hydrolysis yield was obtained with SCB

Obs1

Obs2

Obs3

Obs4

Obs5

Obs6

Obs7

Obs8

Obs9

Obs10

Obs11 Obs12

Pretreatment-NaOH

Pretreatment-Ca(OH)2

Pretreatment-P. sanguineus

Pretreatment-Control

Cellulase stabillity Glucose released

Hydrolysis yield

Saccharose final content

Glucosa consumida

Fermentation yield

Ethanol production

Biomass production

-3

-2

-1

0

1

2

3

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

F2 (

36

.96

%)

F1 (43.29 %)

Biplot (ejes F1 y F2: 80.25 %)

Activas Centroides variables activas

164

pretreated with P. sanguineus.

The effect of proteins or lipids on cellulase catalysis is not well documented, but it is known that some

lipids can act like surfactans, and avoid the absortion of cellulases by cellulose, increasing the hydrolysis

yield (Helle et al., 1993; Eriksson et al., 2002). The same rol can be performed by some proteins, like

bovine serum albumin (Yang and Wyman, 2006). Thus, the enrichment of proteins and ergosterol by P.

sanguineus pretreatment, could be decreasing the cellulase absortion in SCB fibers, and improving the

enzymatic hydrolysis. The decay in aromatic C and O-alkyl C regions in P. sanguineus pretreatments,

are mainly due to the production of laccase and cellulases (data not showed); many authors suggest that

this fungi is a good productor of laccase (Pointing et al., 2000; Vikineswary et al., 2006), and a

remarkable choice for delignification processes (Lomascolo et al., 2011).

According to our PCA analysis, the hydrolysis yield was mainly affected by the aromatic C and xylene

C4 content, which corresponds to lignin and hemicellulose content; this was previously reported (Hall et

al., 2010). Cellulose crystallinity index (CI), was negative related to hydrolysis yield, according to

Mussato et al., (2008); the pretreatment with NaOH increases CI, which is related to their lower

hydrolysis, compared with SCB pretreated with P. sanguineus.

Fermentation performance of the hyzdrolyzates was affected by the SCB pretreatment, and in the same

way that enzymatic hydrolysis, SCB pretreated with P. sanguineus had the highest fermentation yield,

and the second highest production of ethanol. We found a negative relation between Saccharomyces

cerevisiae biomass, and ethanol production; since hydrolizates of SCB pretreated with Ca(OH)2

produced the highest biomass content, but low ethanol production.

The negative effect of the hydrolyzates pretreated with P. sanguineus over S. cerevisiae biomass, could

be related to some secondary metabolite produced by the fungi in the pretreatment. Cinnabarin and

poliporin, produced by P. sanguineus, have antimicrobial properties (Smânia et al., 1997; Rosa et al.,

2003); however, non-antifungal metabolites have been reported from this fungus. In fact, the hydrolized

of SCB pretreated with P. sanguineus do not completely inhibit the S. cerevisiae growth, but induce the

cumpling of the cells. This interesting phenomenum should be further studied.

Thus, examining the effect of alkalin and biological pretreatments on the downstream process, we

conclude, that the use of P. sanguineus is preferable to the use of NaOH or Ca(OH)2 when the aim is to

produce ethanol, because provoke a higher hydrolysis and fermentations yields than alkali treatments.

Further studies will focus on the effect of ergosterol and fungal proteins on cellulase catalysis, and the

use of other fungi for SCB pretreatment.

165

Conclusion

Alkali and biological pretreatments were able to decrease aromatic C, but biological pretreatment

converted a portion of O-alkyl C into fungal biomass (alkyl C and Carboxyl C). The ergosterol and

protein gained in SCB fibers by P. sanguineus pretreatment, could be a positive factor to enhance

hydrolysis yield. The hydrolyzates of SCB pretreated with fungi, have better fermentation yield that

hydrolyzates from SCB pretreated with alkali.

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168

Discusión general

169

Inducción de lacasas para deslignificación biológica de lignina

Debido a la compleja estructura de la pared celular vegetal, se requieren de distintos pretratamientos que

faciliten el acceso de enzimas hidrolíticas a los polímeros de celulosa y hemicelulosa. De acuerdo a la

revisión de la literatura, se identificó que el contenido de lignina y el grado de cristalinidad de la celulosa

son los principales factores que limitan la hidrólisis enzimática de los polisacáridos contenidos en el

bagazo de caña de azúcar (BCA). Por lo tanto, uno de los objetivos propuestos fue diseñar un

pretratamiento biológico utilizando el hongo de pudrición blanca Pycnoporus sanguineus; esto debido a

que este hongo ha sido reportado como un productor de lacasas, enzimas involucradas en la oxidación y

depolimerización de la lignina; e incluso ha sido propuesto para procesos de deslignificación selectiva

(Pointing et al., 2000).

Se eligió trabajar con un pretratamiento biológico, debido a que el uso de pretratamientos químicos a

gran escala ha sido cuestionado, tanto por la cantidad de energía que requieren para trabajar a altas

temperaturas y presiones, como por el uso de agentes peligrosos (ácidos, bases) y de dificil disposición

final. Además, su uso puede provocar la formación de compuestos tóxicos para etapas subsecuentes en el

proceso de producción de bioetanol, como los furfurales (Palmqvist et al., 1999). Sin embargo, para que

un pretratamiento biológico pueda considerarse eficiente, debe disminuir la cantidad de lignina, utilizar

condiciones de bajo costo económico, evitar la pérdida de carbohidratos (celulosa y hemicelulosa) y

utilizar tiempos de retención cortos.

La lignina, al ser un heteropolímero de unidades alquil-fenólicas (Yoshikawa et al., 2013), puede ser

degradada por enzimas del grupo de las polifenol oxidasas, como la lacasa, la Mn-peroxidasa y la lignin-

peroxidasa. Debido a que P. sanguineus no produce Mn-peroxidasas y solo bajas cantidades de lignin-

peroxidasa, el presente estudio se enfocó en estudiar los patrones ecológicos y el uso de inductores para

potencializar la producción de esta enzima, con el objetivo de ser utilizada en procesos eficientes de

deslignificación de BCA.

Las enzimas involucradas en la degradación de la materia orgánica (e.g. celulasas, fosfatasas, proteasas),

son objeto de diversos mecanismos de regulación, de naturaleza fisicoquímica y biológica. Uno de los

estímulos físicos más importantes para los organismos es la luz; este factor, específicamente la luz azul,

se ha asociado con cambios en la producción de enzimas en hongos (Schmoll et al. 2005; 2012). Es por

ello, que el primer factor estudiado en la presente tesis como posible inductor/represor de la producción

de lacasas fue la longitud de onda y la intensidad de la luz. Los resultados obtenidos muestran que P.

sanguineus (cepa nativa de Jalcomulco, Veracruz), cambia su producción de lacasa de acuerdo a

patrones de luminosidad. Encontramos que la luz produce inhibición de la producción de lacasa en este

hongo, y lo hace de acuerdo a un gradiente energético; donde longitudes de onda cortas (de alta energía),

170

que corresponden a la luz azul, inhiben casi completamente la producción de lacasa.

Por otro lado, longitudes de energía media (como luz verde) y en menor medida de baja energía (luz

roja), inhiben solo parcialmente su producción. Es decir, de acuerdo a nuestros resultados, la luz es una

importante fuente de información que reprime la producción de la enzima lacasa en P. sanguineus.

Dentro de nuestro conocimiento, este fue el primer reporte de regulación de esta enzima por luz; sin

embargo, en enero de 2016, un reporte de Janusz et al. (2016), con un diseño experimental muy similar

al aquí utilizado, reportan resultados contrarios, e indican que la luz azul induce la producción de lacasa

en P. sanguineus. La explicación dada por Janusz et al. (2016), es que la inducción de lacasa se debe a

una co-regulación de esta enzima con las enzimas celulasas, las cuales se inducen por un aumento de

AMPc producido por una cascada de señalización dependiente del “White collar system”. Sin embargo,

Janusz y colaboradores no prueban esta hipótesis, y al probar las condiciones de luminosidad en Cerrena

unicolor y Phlebia lindtrien, obtuvieron resultados incongruentes.

La posible regulación de lacasa por el sistema de fotoreceptores asociados al “White collar

system” también es sugerida en este trabajo (Resultados 1.1), ya que los genes de dichos fotoreceptores

para luz azul han sido reportados en diversos grupos de hongos (Rodríguez-Romero et al. 2010) y son

los responsables de la regulación por luz de las celulasas. Sin embargo, creemos que la forma de

regulación por luz de la lacasa, no se encuentra ligada directamente a la producción de celulasas. A

diferencia de Janusz y colaboradores, nuestra hipótesis sugiere que P. sanguineus utiliza la luz azul

como una señal medioambiental que podría indicarle su exposición a ambientes externos, donde no

requiere la producción de lacasa debido a que no existe lignina. Esta conclusión se refuerza con los datos

observados que indican una correlación negativa entre la luminosidad (lx) y la producción de lacasa, y la

inhibición de casi el 100% de su producción en presencia de luz blanca. Además, otros reportes indican

que los compuestos fenólicos de la lignina, poseen una absorbancia entre el ultravioleta y la luz azul

(Jahan y Mun 2007), por lo tanto, sugerimos que la presencia de lignina en la lignocelulosa generaría un

ambiente desprovisto de señales lumínicas de longitud de onda corta y, por lo tanto, la producción de

lacasa es inducida. Contrariamente, cuando el hongo detecta estas longitudes de onda significaría la

ausencia de compuestos que la absorban (lignina), por lo que la producción de lacasa sería inhibida.

Para comprobar esta hipótesis, una de nuestras sugerencias, es probar el efecto de la exposición a luz

sobre los niveles de expresión del gen LAC en diversas especies de hongos por RTq-PCR. De esta

manera, se tendrán más elementos para esclarecer el efecto la luz sobre la producción de esta importante

poli-fenol oxidasa. Es probable que la disparidad de resultados entre el estudio de Janusz y el presente

estudio, se deba a factores metodológicos (medio de cultivo, fuente de luz empleada) o a diferencias

entre las cepas utilizadas (cepa mexicana vs cepa europea); pero para los fines de la presente tesis, la luz

es un inhibidor de la producción de lacasa, por lo que condiciones de oscuridad fueron utilizadas en los

171

pasos subsecuentes de producción de lacasa.

Además de las condiciones físicas como temperatura, luminosidad y humedad, las condiciones químicas

como tipo y cantidad de nutrientes, y/o presencia de algunos xenobióticos puede afectar la producción de

lacasa. De entre estas variables, encontramos que el tipo de nitrógeno disponible posee un rol relevante

en la regulación de esta enzima. Nuestros resultados indican (Resultados 1.2), que cuando una fuente de

nitrógeno simple se encuentra disponible (i.e. urea) la producción de lacasa es reprimida, y al contrario,

una fuente compleja (i.e. extracto de levadura) promueve la producción de lacasa, en P. sanguineus, en

concordancia con lo reportado en Pointing et al, (2000). Cabe mencionar, que ambas fuentes de

nitrógeno (así como ocurrió cuando P. sanguineus fue expuesto a distintas condiciones de luz), producen

la misma cantidad de biomasa, proteína extracelular y similar consumo de glucosa. Estas similitudes

indican que el desarrollo de P. sanguineus en fase micelial no es afectado por alguna condición lumínica

o por el tipo de nitrógeno adicionado al medio. Sin embargo, estas variables si condicionan la

producción de lacasa.

El efecto inductivo del extracto de levadura en P. sanguineus, es atribuido a su cantidad de aminoácidos

(Eugenio et al., 2010), mientras que el efecto represor de la urea se atribuye al mecanismo de represión

catabólica del nitrógeno, el cual dicta que fuentes de nitrógeno simples son consumidas sin la necesidad

de producción de enzimas extracelulares (Lee et al., 2011); de esta manera, existe un ahorro de recursos.

La mayor producción de lacasa observada en presencia de extracto de levadura, y la relación negativa

entre la concentración de urea en el medio y la producción de lacasa, concuerda con lo observado para

otras especies de hongos, como Cryptococcus neoformans (Jiang et al., 2009) y Phaenerochaete

chrysosporium (Qiu et al., 2012), así como cepas de P. sanguineus (Pointing et al., 2000).

Sin embargo, el efecto del tipo y concentración de nitrógeno en el medio puede variar dependiendo el

tipo de cultivo empleado, sea cultivos líquidos (como el aquí utilizado), o cultivos en estado sólido. Se

ha reportado para Pleurotus ostreatus, Lentinula edodes y Agaricus bisporius un incremento en la

producción de lacasa, en estado sólido, cuando urea fue adicionada (D’Agostini et al., 2011). Sin

embargo, este efecto positivo de la urea en cultivos en estado sólido puede atribuirse a otra fuerza

reguladora, la regulación catabólica por carbono. Este tipo de regulación, dicta que cuando fuentes

simples de carbono (e.g. glucosa) se encuentran ausentes, la producción de enzimas extracelulares es

inducida. La lacasa es una enzima involucrada en la degradación de fuentes carbonadas, por lo tanto, la

urea en cultivos en estado sólido no fungiría como un represor, si no como una fuente nutrimental

importante para la producción de enzimas destinadas a degradar la lignocelulosa y obtener fuentes de

carbono.

Observamos también, que la composición de nitrógeno en el medio de cultivo, puede condicionar el

172

efecto de otros inductores, tal es el caso del etanol. El etanol es una molécula oxidante, y ha sido

asociado con la producción de lacasa vía estrés oxidativo en la membrana celular, lo que puede provocar

la segregación de iones Ca+ intracelulares que actúan como segundos mensajeros que inducen la

transcripción de genes de lacasa (Lomascolo et al., 2003). Sin embargo, existe disparidad entre los

reportes que señalan al etanol como un inductor de lacasa, pues algunos autores no encontraron efectos

positivos de este alcohol.

Nosotros encontramos que el efecto del etanol como inductor puede estar condicionado por el tipo y

concentración de nitrógeno en el medio. Observamos que, en presencia del extracto de levadura, el

etanol actúa como inductor y se establece un efecto sinérgico de inducción entre el extracto de levadura

y el alcohol. Empero, cuando P. sanguineus se cultiva en presencia de urea, este efecto no existe. Al

analizar el medio de cultivo utilizado en los reportes que indican que el etanol es un inductor de lacasa,

encontramos que utilizaron fuentes de nitrógeno orgánicas (Valeriano et al., 2009; Alves et al., 2004;

Lomascolo et al., 2003), y por el contrario, cuando no se encontraron efectos positivos, se utilizaron

fuentes de nitrógeno minerales (Eugenio et al., 2010; Barreto et al., 2007). Esto nos lleva a concluir, que

el tipo y concentración de nitrógeno en el medio ejercen una fuerte regulación sobre la producción de

lacasa en P. sanguineus, por lo que seleccionamos al extracto de levadura como fuente de nitrógeno para

obtener mayor producción de lacasa.

Una vez determinados los efectos de la luminosidad y del tipo y concentración de nitrógeno, se evaluó el

uso de colorantes fenólicos sobre la producción de lacasa. Encontramos que, el uso de ácido carmínico

(antraquinonico) y amarillo de alizarina (azo-colorante), aumentan en 722 y 317% la producción de

lacasa observada en condiciones de oscuridad y con extracto de levadura (Resultados 1.3). Se evaluaron

también los colorantes azul anilina y cristal violeta; sin embargo, el primero no afectó la producción de

lacasa, y el segundo tuvo efectos letales sobre P. sanguineus.

Además, la inducción de lacasa fue acompañada por la degradación de ambos colorantes, por arriba del

95%. Estos resultados concuerdan con lo observado para otros hongos, como Pleurotus ostreatus,

Kuehneromyces mutabilitis, Trametes versicolor y Cerrena unicolor (Cho et al., 2007; Cho et al., 1999),

los cuales aumentaron su producción de lacasa con ácido carmínico, y degradaron el colorante.

Asimismo, nuestros resultados aportan evidencia de que compuestos antraquinonicos inducen la

producción de lacasa, así como otras enzimas poli-fenol oxidasas (Kornillowicz-Kowalska y

Rybczyńska, 2014).

Desde el punto de vista ambiental, el uso de ácido carminico y/o amarillo de alizarina como inductores

de lacasa, los cuales son utilizados y desechados por la industria textil, supone un doble beneficio:

primeramente, las aguas residuales textiles son una fuente abundante y de bajo costo para la producción

de lacasa, y en segundo lugar, la producción de esta enzima conlleva la destoxificación del agua residual,

173

al remover los colorantes presentes en ella. Esto es de gran importancia, puesto que los azo-colorantes,

como el amarillo de alizarina, pueden generar aminas cancerígenas si no son adecuadamente oxidados

(Arslan et al., 2013). A pesar de que se ha reportado el uso de cloroperoxidasas para la degradación de

amarillo alizarina (Li et al., 2013), este es el primer reporte que asocia su degradación con la producción

de lacasas. Además de aumentar la producción enzimática, los colorantes (con excepción de cristal

violeta) aumentaron la producción de biomasa fúngica, la cual estuvo positivamente relacionada a la

degradación de los colorantes.

Por lo tanto, ya que el ácido carminico indujo la hiperproducción de lacasa (+700%), este compuesto fue

seleccionado para ser evaluado como potenciador de la deslignificación en estado sólido del BCA, en

conjunto con el extracto de levadura e incubación en condiciones de oscuridad. Además, esta última

parte del estudio de la inducción de lacasa nos permitió reconstruir un mapa de la regulación de la

producción de esta enzima en P. sanguineus (Figura 28).

Recordando la primera pregunta de investigación del capítulo 1: ¿Qué condiciones de luminosidad,

disponibilidad de nitrógeno y presencia de inductores químicos aumentarán la producción de lacasa en el

hongo Pycnoporus sanguineus? Y la hipótesis asociada. Podemos responder, que la luz es un inhibidor

de la producción de lacasa y se requieren condiciones de oscuridad para su producción, que el uso de

fuentes de nitrógeno orgánico/complejo son preferibles para inducirla, que el uso de moléculas oxidantes

como el etanol tiene efectos inductores moderados, y compuestos antraquinónicos y azo-derivados

inducen su hiperproducción en P. sanguineus (Figura 28).

Habiendo identificado las variables que afectan la producción de lacasa con P. sanguineus en medios

líquidos, el siguiente paso fue probar dichas condiciones en cultivos en estado sólido. Para lo cual, se

realizaron mesocosmos de BCA humedecido al 80% con medio basal, el cual contenía extracto de

levadura al 1% y ácido carmínico en distintas concentraciones. El efecto del cultivo de P. sanguineus

sobre la composición química de BCA fue evaluado mediante 13

C CPMAS NMR (Resultados 1.3).

Encontramos que P. sanguineus fue capaz de disminuir la cantidad de compuestos aromáticos,

relacionados con la cantidad de lignina, en un 32.67%, en 16 días. Este resultado, es similar a lo

alcanzado por otros hongos como Pleurotus ostreatus (41%), Phanerochaete chrysosporium (21%) o

Trametes versicolor (37%) (Masayuki et al., 2005). Sin embargo, el tiempo de retención en el presente

estudio fue mucho menor al del estudio de Masayuki et al, (tiempo de 60 días). El efecto deslignificador

fue atribuído a la producción de lacasa, sin embargo, su inducción fue menor a la observada en medio

líquido. El uso de ácido carmínico, tuvo un efecto positivo en la actividad lacasa registrada, y un efecto

negativo en la producción de celulasas. Este resultado es benéfico para los objetivos planeados, pues una

alta producción de lacasa y una baja producción de celulasas, generan las condiciones necesarias para

una deslignificación selectiva (Ramos et al., 2003). Aunado a esto, la inducción de lacasa observada en

174

cultivos en estado sólido con ácido carmínico, concuerda con lo reportado para otros colorantes

antraquinonicos (Usha et al., 2004). Sin embargo, el ácido carmínico también disminuyó la cantidad de

C-carboxilo y C-alquilo, regiones relacionadas con la cantidad de biomasa, lo que en ultima instáncia

afectó la degradación de lignina. Esto se atribuyó a la posible disminución de la producción de ácido 3-

hidroxiantranílico, un mediador de lacasa producido por P. sanguineus, que utiliza para oxidar

componentes no fenólicos (Eggert et al., 1996).

175

Figura 28. Mapa de la regulación de la producción de lacasa en P. sanguineus.

176

Encontramos que la cantidad de compuestos O-alquilo C, correspondientes a la cantidad de

carbohidratos presentes en el BCA, disminuyó aproximadamente 40% después de un pretratamiento con

P. sanguineus. Esta disminución es acompañada con un incremento en la cantidad de proteína, ergosterol

y quitina en el bagazo de caña (Resultados 3.1). Al comparar estos valores con los resultados de

pretratamientos químicos deslignificantes, observamos que P. sanguineus es más eficiente que el NaOH

y el Ca(OH)2 al 5% para eliminar lignina, pues diminuye de 12.87% a 6.56% (cerca del 50% de

remoción), mientras que el NaOH y el Ca(OH)2 alcanzan proporciones finales de 7.06 y 10.26%. La

cristalinidad de la celulosa es afectada levemente en los tres tratamientos.

Recordando nuestra segunda pregunta de investigación del capítulo: ¿El cultivo de P. sanguineus sobre

bagazo de caña de azúcar en estado sólido, utilizando las mejores condiciones para la producción de

lacasa, modificará la estructura química del bagazo de caña de acuerdo a los requerimientos para la

hidrólisis enzimática?, podemos responder, que lo hizo en cuanto a la disminución de la cantidad de

lignina, pues alcanzó remociones mayores a las de pretratamientos químicos. Sin embargo, consumió un

40% de los carbohidratos disponibles y no disminuyó la cristalinidad de la celulosa. Así, tenemos

evidencia suficiente para rechazar la hipótesis H0: Mejorar las condiciones de producción de esta enzima

(i.e. fuente de nitrógeno, luminosidad, presencia y cantidad de inductor) no permitirá deslignificar

selectivamente bagazo de caña de azúcar con este hongo. Aunado a esto, produjo gran cantidad de

proteína, ergosterol y quitina, lo cual podría afectar la hidrólisis enzimática y la fermentación, positiva o

negativamente. Es por ello, que se comparó el rendimiento de hidrólisis y fermentación de sustratos

pretratados con P. sanguineus, NaOH y Ca(OH)2, como se discute a continuación.

Nuestros resultados de análisis multivariados, indican que la presencia de proteína y ergosterol en el

bagazo de caña pretratado con P. sanguineus, aumenta el rendimiento de hidrólisis y la liberación de

glucosa, siendo mayor que cuando el bagazo se pretrató con soluciones alcalinas. Este efecto podría

deberse a una acción surfactante por parte de los lípidos (Helle et al., 1993; Eriksson et al., 2002), así

como de las proteínas (Yang y Wayman, 2006); los cuales evitarían la absorción de las celulasas a las

fibras de bagazo de caña. Los hidrolizados de bagazo de caña pretratado con NaOH, Ca(OH)2 y P.

sanguineus, mostraron diferencias en la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, etanol y

rendimiento de fermentación.

El rendimiento de fermentación más alto fue observado con los hidrolizados de bagazo de caña

pretratado con P. sanguineus, mientras que la producción de etanol más alta fue observada con los

hidrolizados de bagazo de caña pretratada con NaOH y P. sanguineus. Se observó también un efecto

inhibitorio parcial del hidrolizado de bagazo de caña pretratado con P. sanguineus, sobre la biomasa de

S. cerevisiae; además, se observó un aglutinamiento celular cuando este hidrolizado fue fermentado. No

se encontraron reportes que indiquen efectos antifúngicos de extractos de P. sanguineus, aunque si se

177

conoce que la cinabarina y la poliporina son metabolitos antimicrobianos producidos por este hongo

(Smânia et al., 1997; Rosa et al., 2003).

Con estos resultados, podemos afirmar que las condiciones de inducción de lacasa reportadas en la

sección de resultados 1.1, 1.2 y 1.3, pueden ser utilizadas como un pretratamiento en estado sólido, de

bagazo de caña de azúcar. El cual, modificará su composición química, haciéndolo más digerible para

celulasas; además, los hidrolizados obtenidos promoverán un rendimiento de fermentación mayor al

obtenido utilizando pretratamientos alcalinos.

Inducción de celulasas

Como se dijo anteriormente, las celulasas son las enzimas responsables de la degradación de la celulosa

hasta sus monómeros de glucosa. Actualmente, las enzimas comerciales disponibles, producidas de

monocultivos de Trichoderma spp. o Aspergillus niger, poseen diversas limitantes como lo son

deficiencia en alguna actividad celulasa, o bajos rendimientos de reacción en temperaturas mesófilas. Es

por eso, que el presente trabajo utilizó bioprospecciones para aislar nuevas cepas de hongos

filamentosos, productores de celulasas, con el fin de encontrar alguna cepa que pudiese producir

celulasas con características adecuadas para el proceso de producción de bioetanol.

En un proceso de bioprospección, se realizan muestreos en hábitats que sean similares al proceso que se

desea emular; en el caso de la producción de bioetanol celulósico, se requiere hidrolizar celulosa hasta

glucosa, para después poderla fermentar. Dado que el mayor reciclaje de celulosa en el mundo, se realiza

en el horizonte 0 y en el horizonte A del suelo, se decidió buscar hongos que habiten mantillos de

bosques veracruzanos, y aislarlos directamente en medio sólido Czapek-Dox-CMC (Abildgren et al.,

1987). Nuestros resultados indican que este hábitat es un reservorio importante de hongos celulolíticos;

además, este medio de cultivo, en combinación con pruebas colorimétricas (Carder, 1986), es adecuado

para el aislamiento de cepas productoras de celulasas.

Se ha probado que el uso de cocultivos de Trichoderma-Aspergillus, puede aumentar la producción de

celulasas; sin embargo, se desconoce el efecto de cultivar más de dos cepas de hongos en un mismo

biorreactor con el afán de producir celulasas. En ecosistemas naturales, la hidrólisis completa de la

lignocelulosa se logra gracias a la acción sinérgica de diversas enzimas, i.e. exoglucanasas,

endoglucanasas, β-glucosidasas, xilanasas, lacasas, etc. (Khalili et al., 2011) Y de diversas isoformas de

cada tipo de enzima. Estas isoformas, provienen de distintas especies de hongos y bacterias; es por ello,

que es preferible un complejo celulasa formado por diversas isoformas de varias especies de hongos, que

el de un monocultivo. Bajo esta premisa, el presente estudio tuvo como objetivo determinar la

producción de celulasas (i.e. exo, endo y β-glucosidasas), xilanasas, y el perfil de isoformas proteicas,

producido por 14 combinaciones de hongos filamentosos celulolíticos, aislados de mantillo de bosques

178

veracruzanos.

Las cepas aisladas pertenecen a los géneros Trichoderma, Aspergillus y Fusarium. La cepa de

Aspergillus niger produjo una alta cantidad de celulasas y xilanasas, lo cual coincide con reportes

previos (Ghareib and Nour, 1992; Kim et al., 1997, Sørensen et al., 2014); de manera similar, las cepas

de Trichoderma produjeron alta actividad exoglucanasa (Fang and Xia, 2013; Zhong et al., 2008).

Encontramos, que el uso de cultivos mixtos genera un decremento en la producción enzimática,

principalmente en la actividad xilanasa, y en la cantidad de isoformas producidas. Únicamente la

combinación (Aspergillus niger-Fusarium oxysporum) aumenta su producción de endoglucanasa y β-

glucosidasa. Esta combinación ya había sido identificada con anterioridad por Taha et al. (2015). El

decremento en la producción de xilanasas puede deberse a que, en condiciones estresantes, los

microorganismos cambian su preferencia de consumo de azúcares, prefieriendo hexosas (por su

contenido energético) a pentosas (Kim et al. 2008). Nuestros resultados sugieren este tipo de regulación

en hongos filamentosos.

El decremento en la actividad celulasa fue acompañado por el decremento en la cantidad de isoformas

proteicas, por lo tanto, el uso de cultivos mixtos en cultivos líquidos, sin agitación, no es una buena

estrategia cuando el objetivo es incrementar la producción de celulasas/xilanasas, y sus respectivas

isoformas. Así, no contamos con evidencia suficiente para rechazar la hipótesis H0: La interacción de

diversas especies de hongos filamentosos en un bioreactor no promoverá la producción de un pool

enzimático de mayor actividad celulasa y mayor riqueza de isoformas que los monocultivos.

Sin embargo, podría ser interesante cuando se require producir celulasas e inhibir la producción de

xilanasas. Se recomienda probar la producción de celulasas y xilanasas, en cultivos mixtos utilizando

fermentación en estado sólido, pues diversos reports de cocultivos indican que este tipo de cultivo, es

más adecuado por emular las condiciones naturales del hábitat de los hongos.

Por otro lado, la segunda bioprospección (realizada en el volcán Pico de Orizaba), nos permitió aislar 6

cepas productoras de celulasas, las cuales fueron cultivadas en medio líquido con diferentes fuentes de

carbono. Encontramos que la lactosa es la mejor fuente de carbono para inducir la producción de

celulasas, con concordancia con reportes previos (Porciuncula et al., 2013; Karaffa et al., 2006). La

característica más interesante de estas enzimas, fue su temperatura óptima de reacción, la cual se

encontraba (en la mayoría) entre 30 y 36° C; estas temperaturas, son similares a las utilizadas en la etapa

de fermentación, por lo que es candidata para optimizar procesos de fermentación y sacarificación

simultánea (FSS). De acuerdo a lo anterior, contamos con evidencia suficiente para rechazar la hipótesis

“H0: Las celulasas producidas por hongos provenientes de climas fríos (Parque Nacional Pico de

Orizaba) no poseerán temperaturas óptimas de reacción más bajas que aquellas provenientes de hongos

tropicales (i.e. Trichoderma reesei), y no podrán ser utilizadas en procesos de fermentación-

179

sacarificación simultánea”.

La FSS, es un proceso donde se mezclan celulasas y levaduras en el mismo reactor, para que la glucosa

producida sea inmediatamente transformada a etanol, y evitar la inhibición de las celulasas por producto.

Empero, las enzimas comerciales disponibles, poseen TOR de 50 °C, por lo que su eficiencia en

procesos de FSS no son los óptimos. Las enzimas producidas por la cepa de la familia Pleorosporaceae,

aislada en el presente trabajo, poseen mayor eficiencia de hidrólisis (de carboximetil celulosa) en

temperaturas mesofilas, son necesarias futuras investigaciones, que comprueben esta hipótesis.

180

Conclusiones generales

El presente trabajo concluye que las enzimas lacasas y celulasas son reguladas por las siguientes

variables, que al manipularlas, podemos generar las condiciones para la producción de estas enzimas con

hongos basidiomicetos y ascomicetos; y utilizarlas en el proceso de producción de bioethanol celulósico:

1. La lacasa es inhibida por señales lumínicas, que obedecen un gradiente energético, donde

longitudes de onda corta inhiben fuertemente la producción de lacasa, y longitudes de onda larga,

inhiben parcialmente su producción. Esto es atribuído a un Sistema de reconocimiento ambiental,

que indicaría al hongo su exposición a ambientes abiertos, desprovistos de lignina.

2. La producción de lacasa está asociada a la represión catabólica de nitrógeno, por lo que fuentes

simples de nitrógeno (e.g. urea) reprimen su producción, mientras que fuentes complejas la

inducen. Las condiciones de nitrógeno en el medio, pueden condicionar el efecto inductor de

otras moléculas, como inductores oxidantes (etanol).

3. El ácido carmínico y el amarillo de alizarina (compuestos antraquinónicos y azo-derivado), son

excelentes inductores de lacasa en medio líquido; la inducción en medio sólido ocurre, pero en

menor medida.

4. Cultivos en estado sólido de P. sanguineus sobre bagazo de caña de azúcar, en condiciones que

promuevan la producción de lacasa, permiten disminuír la cantidad de lignina más del 50%, e

incrementar significativamente la cantidad de proteína y lípidos (e.g. ergosterol) en las fibras;

esto aumenta el rendimiento de hidrólisis enzimática y de fermentación con respecto a

pretratamientos alcalinos

5. La realización de bioprospecciones de hongos celulolíticos en mantillo de ecosistemas forestales,

permite el aislamiento de hongos productores de celulasas con características diferentes a las

disponibles de manera comercial. Estas enzimas, pueden adaptarse al proceso de producción de

bioetanol.

6. El uso de cultivos mixtos tiende a decrementar la producción de celulasas, y aun más de

xilanasas, así como de sus respectivas isoformas en medio líquido.

7. Las celulasas producidas por cepas habitantes de ecosistemas fríos, como los bosques del Pico de

Orizaba, son candidatas para procesos de fermentación y sacarificación simultánea.

181

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195

11. Anexos

11.1 Curva de calibración para estimar actividad xilanasa

La curva fue realizada con sustrato de xilanasa (xilano de birchwood disuelto en buffer de acetato de

sodio pH 4.8) y adición de concentraciones conocidas de glucosa; tratada como si fuese reacción para

actividad endoglucanasa y cuantificada por espectrofotometría UV-Vis a 540 nm.

y = 0.6141x - 0.1031 R² = 0.9958

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Ab

sorb

anci

a

Xilosa micromol.mL

196

11.2 Curva de calibración para estimar actividad exoglucanasa

La curva fue realizada con sustrato de exoglucanasa [Avicel (celulosa microcristalina) disuelta en buffer

de acetato de sodio pH 4.8] y adición de concentraciones conocidas de glucosa; tratada como si fuese

reacción para actividad exoglucanasa y cuantificada por espectrofotometría UV-Vis a 540 nm.

y = 5.6359x - 0.3035 R² = 0.8859

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Ab

sorb

anci

a

glucosa micromol.mL

197

11.3 Curva de calibración para estimar actividad endoglucanasa

La curva fue realizada con sustrato de endoglucanasa (Carboxymetil celulosa disuelta en buffer de

acetato de sodio pH 4.8) y adición de concentraciones conocidas de glucosa; tratada como si fuese

reacción para actividad endoglucanasa y cuantificada por espectrofotometría UV-Vis a 540 nm.

y = 30.106x + 0.0118 R² = 0.9852

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1

Ab

sorb

anci

a

Glucose g.L

198

11.4 Curva de calibración para estimar proteína total por método de Bradford

La curva fue realizada con Albumina Serica Bovina (BSA) disuelta en dH2O, y tratada como reacción de

determinación de proteína de acuerdo al método de Bradford (1976).

y = 0.002x + 0.0495 R² = 0.9266

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Ab

sorb

anci

a

BSA microgramos.mL

199

11.5 Curva de calibración semilogaritmica para estimar peso molecular de isoformas

proteicas en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

Curva realizada a partir del patrón de migración de proteínas de peso molecular conocido (marcador

molecular) en gel de poliacrilamida.

y = 10.636x-1.484 R² = 0.9838

1

10

100

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000

KD

a

Rf

200

11.6 Protocolo para evaluar la concentración de azúcares reductores en solución

Tomar 500 µl de la solución problema y agregar 500 µl de una solución de reactivo DNS, preparado de

la siguiente manera: X g de ácido dinitrosalicilico, X g de NaOH, X g de tartrato de sodio y potasio, X g

de dH2O.

La mezcla de reacción se homogeiniza en vortex y posteriormente se hierve durante 5 minutos (Figura

X), transcurridos los 5 minutos la mezcla se deja enfriar en agua helada por 10 minutos. Posteriormente

la mezcla es diluída 1:5 con dH2O3 y se lee en espectrofotómetro a 540 nm (Miller, 1959).

Como control de utiliza una mezcla de 500 µl de buffer acetato de sodio pH 5 + 500 µl de reactivo DNS,

al cual se le realiza todo el proceso. Las absorbancias obtenidas del control son restadas de las

absorbancias de la muestra problema y la diferencia es transformada a g.ml-1

mediante un modelo de

regresión lineal.

Reacción para cuantificación de azúcares reductores totales. Izquierda: solución problema + reactivo DNS antes de ebullición,

Derecha: solución problema + reactivo DNS después de ebullición. El color rojizo indica la presencia de azúcares reductores.

3 Puede aumentar en casos de que existe mucha concentración de azúcares reductores en la solución

201

11.7 Protocolo para evaluar la actividad lacasa en cultivos liquidos

Para conocer la actividad lacasa contenida en una muestra líquida, 980 µl deben incubarse en baño maría

hasta que alcancen una temperatura de 37° C, posteriormente, se les agregan 20 µl de una solución de

siringaldazina:metanol (1 mg.ml-1

) e inmediatamente se leen a 525 nm en un espectrofotómetro.

La lectura de absorbancia se deberá realizar de manera constante durante 90 segundos. Pasado este

tiempo, si existe lacasa en la solución la siringaldazina amarilla será oxidada a quinona, de color morado

(Figura X). Como control se utilzará una mezcla que contenga solución desnaturalizada por choque

térmico (10 minutos en ebullición + 10 minutos en agua helada). La cinética de oxidación se calculará

mediante el cálculo de la pendiente m, un coeficiente de extinción molar ɛ = 65000 y el tiempo de

reacción en minutos, mediante la siguiente ecuación:

U.ml-1

= (1000 * m) / 65000 * 1.5 (min)

Diferentes reacciones de lacasa, el color morado indica una mayor actividad enzimática.

202

11.8 Protocolo para estimar la cantidad de proteína en solución por el método de Bradford

(1976)

Para conocer la cantidad de proteína que contiene una solución acuosa, se toman 250 µl de la solución

problema y se le agregan 250 µl de reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich), se dejan reaccionar por 5

minutos (el reactivo de Bradford café se pone azul en presencia de proteína; Figura X) y posteriormente

se diluyen 1:2 con dH2O. La mezcla es leída en espectrofotómetro a 590 nm.

Como control se utiliza una mezcla de 250 µl de buffer acetato de sodio pH 5 + 250 µl de reactivo de

Bradford y se sigue el mismo procedimiento. Posteriormente las absorbancias obtenidas son

transformadas a g.ml-1

de proteína mediante un modelo de regresión lineal, obtenido de concentraciones

estándar de albumina sérica bovina (BSA).

Reacción de Bradford. Izquierda: reacción sin proteína (control), derecha: reacción en presencia de proteína.

203

11.9 Modelos de regresión lineal para estimar la concentración de colorantes en solución

líquida

Modelos realizados mediante la adición de concentraciones conocidas de colorantes sintéticos (mM)

disueltos en medio de cultivo basal (Eggert, 1996), utilizada por el cultivo y producción de lacasas con

Pycnoporus sanguineus.

204

11.11 Curvas de calibración para estimar la actividad celulasa por FPU

y = 0.0145x - 0.007 R² = 0.9895

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 5 10 15 20 25 30

Ab

sorb

anci

a 5

40

nm

mg/ml glucosa

Curva de calibración glucosa Curva estándar de glucosa

utilizada para estimar la

cantidad de azúcar liberada por

las enzimas a partir de papel

filtro.

Curva semilogaritmica utilizada

para estimar la dilución de

enzima necesaria para liberar

2.0 mg.ml de glucosa

205

y = 180.19ln(x) - 13.27

1

10

100

1000

0 2 4 6 8 10 12 14

mg.

ml E

nzi

ma

mg. ml de glucosa liberada

Actividad celulasa Aspergillus USB

y = 0.0301x - 1.2491 R² = 0.8735

-2

0

2

4

6

8

10

0 50 100 150 200 250 300 350

FPU

Dilución mg.ml enzima

FPU.ml Curva que muestra la actividad

FPU obtenida con distintas

diluciones de enzima