i encuentro bi-nacional - biotecnológico

Aplicación de biotecnología reproductiva

para el mejoramiento genético de la

ganadería en el país

Blgo. Jenin Víctor Cortez Polanco

Investigador - UNTRM

I ENCUENTRO BI-NACIONAL

BIOTECNOLÓGICOECUADOR - PERÚ

BIOTECNOLOGIAS REPRODUCTIVAS

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA

Importación de Núcleo Genético de Bovinos :Angus, Brahmán, Brangus, Simmental – Fleckvieh y Jersey

UNTRM – C. Cuarentena Lurín UNTRM - E.E.

11/09/2017

Bipartición Embrionaria

11/09/2017

Metodología M

anip

ula

ció

n

Res

tau

raci

ón

Tran

sfer

enci

a

a-b/Letras diferentes en sentido vertical, indican diferencias

estadísticamente significativas (P<0.05).

Investigación realizada

Manipulación embrionaria

La UNRTM el 2015 generó losprimer nacimiento de gemeloshomocigóticos (clones) porbipartición embrionaria en elPerú, con el desarrollo demedios especializados.

11/09/2017

Premios obtenidos por la invención

11/09/2017

Clonación por Transferencia

nuclear Somática

Wilmut et al. (1997), ovejas, Dolly

Stice et al. (1998), vacas

Yanaguimachi et al. (1998), ratones

Diamond et al. (1999), cabras

Woods et al. (2003), mulos

Polejaeva et al. (2000), cerdos

Damiani et al. (2001), gaur

Chesne et al., (2002), conejosWesthusin et al. (2002), gatos

Galli et al. (2003), caballos

Qi et al. (2003), ratas

Westhusin (2003), venados

Lee et al. (2005), perros

Li and Engelhardt (2006), hurones

Gómez et al. (2005) gatos salvajes

-

+Reconstrucción + Fusión

(método sandwich)

Citoplasto receptor

Embrión reconstruidoBlastocisto

Línea celular

Reconstruidos

os cultivados Clivaje

(%)

Blastocistos

Embriones

(%)

Reconstruidos

(%)

Fibroblastos de

de piel97

79.5 ± 5.1a

29.0 ± 8.4a 65.8 ± 6.8a

Células del

cumulus91

80.7 ± 5.4a

27.9 ± 10.1a 86.9 ± 7.9b

Cuadro 2. Desarrollo de los embriones mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) tras su

reconstrucción con dos líneas celulares en bovinos.

RESULTADOS

a,b Superíndices diferentes dentro de columnas indican diferencia estadística (p<0.05), se aplicó una prueba t de Student

Células usadas para la

reconstrucción

Embriones

transferidos (n)Receptoras

(n)

Permanencia

Día 28

(n)

Día 60

(n)

Día 75

(n)

Fibroblastos de piel3 2 2/2 1/2 1/2

Células del cumulus4 4 2/4 2/4 1/4

Cuadro 3. Gestaciones establecidas tras la transferencia de blastocistos clonados obtenidos mediante

transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) utilizando dos tipos de líneas celulares en bovinos.

RESULTADOS

(A)

(B)

RESULTADOS

APLICACIONES

Biotecnología y

Biomedicina

Nutracéuticos y Farmacéuticos

Erradicación de

enfermedades

Xenotransplante

Alotransplante

Producción animal

Programas de mejoramiento

genético

Preservación de especiesAnimales en extinción o extintos

(?)

Investigación básica

Estudio de fenómenos biológicos:

diferenciación celular, envejecimiento y

crecimiento celular.

Aplicaciones

de la clonación

Zita

La vaca Holstein de mayor rango en los Estados

Unidos

En 1997 produjo casi 40000 libras de leche

Once de los 46 Holstein más productivos de los

Estados Unidos son descendientes directos de Zita

En febrero de 2001 nacieron los primeros clones de

Zita

Clones bovinos en producción de leche

11/09/2017

11/09/2017

MOET FIV

Proceso N° Proceso N°

Colectas 6 Aspiraciones 48

Embriones colectados 30 Óvulos colectados 384

Embriones transferidos 30 Embriones transferidos 115

Terneros nacidos 12 Teneros nacidos 35

Vaca altamente productiva

Vacas clonadas

11/09/2017

PERSPECTIVAS A FUTURO

Clonación hetero-específica.

“Cavia tschudii”

Se logro generar embriones clonados de cuyes silvestres hetero-específica (Citoplasma bovino,

núcleo del cuy silvestre), UNTRM 2015

11/09/2017

PERSPECTIVAS A FUTURO

Clonación hetero-específica.

“Odocoileus virginianus”

Se logro generar embriones clonados de venado silvestres hetero-específica (Citoplasma

bovino, núcleo de venado silvestre), UECE, UNTRM, 2016

11/09/2017

VINCULADOS CON:

Agradecimientos Los autores agradecen a la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza deAmazonas y al Instituto de Investigación en Ganadería y Biotecnología por lasfacilidades prestadas para el desarrollo del estudio.

Biotecnología en acuicultura.

GRUPO MARINASOLYO VANI LU Z M I L A R O SA L ES M AC EDA .

T U M B ES – P E R Ú

2 0 1 7

El cultivo de Langostino en el Perú.

El cultivo de camarones peneidos se inició a fines de la década de ’80 cuando el IMARPE y el entonces Ministerio de Pesquería realizaron los primeros ensayos de cultivo en la zona de Tumbes, ulteriormente el cultivo fue desarrollado por empresas privadas.

0

5000

10000

15000

20000

25000

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015

Tm

Producción Anual de Langostinos.

Total Region Piura Region Tumbes

Grupo Marinasol

Centros de engordeCentro de Producción de larva

Semi Intensivos

Área: 1200 Ha

Cap. Prod.: 3Tn/Ha

Intensivos

Área: 65 Ha

Cap. Prod.: 48 Tn/Ha

PSI

ABC

PLC

CIDPL

Ha: 4 Ha

Plantas de Procesamiento

PC

El enfoque de mejorar la productividad del langostinoPrevención de enfermedades y Mejoramiento continuo del langostino.

Intensificación de sistemas de engorde

Obtener microorganismos que sean amigables con el medio ambiente, que favorezcan la producción y reduzcan los costos de producción.

Medio ambiente

Huésped Patógeno

Enfermedad

Enfermedades del LangostinoQue esta pasando

en mi producción.???

Que enfermedades puede tener el langostino.???

Quienes pueden afectar el cultivo del langostino???

•Virus: WSSV, IHHNV, BPV.•Bacterianas: NHP, Vibriosis, Pseudómomas.•Factores Fisicoquímicos: Temperatura, pH, OD, etc…

PRODUCCIÓN TRANSFERENCIA INVESTIGACIÓN

Problemas. Interrogantes.

Evaluación de problemática.

Información.

Investigación/ Tecnologías.

Validación.Aplicación.

FLUJO DE LA INFORMACION

Investigación/ Tecnologías.

Validación.Aplicación.

Prevención de enfermedades y mejoramiento genético del langostino Litopenaeus vannamei. 042-FINCyT-PITEI-2008

25

.5

11

.6

11

.9

17

.2

14

.8

2.6

6.2

4.6

16

.0

7.0

26

.6

15

.6

8.4 9.1

6.8

26

.4

25

.4

4.7

1.0 1.2

16

.6

6.5

11

.2

1.1 1.8

0.3 0.8

0.0 2

.3

1.2

0.8 2

.7

10

.2

10

.3

11

.6

3.2

0.3 0.6

0.2

0.0

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017

% D

E IN

CID

ENC

IA

HEMBRAS

% BPV % NHP %IHHNV %WSSV

27

.08

7.5

1

6.8

9

14

.97

10

.42

5.3

6

4.2

4

4.6

7

11

.19

2.3

1

9.7

2

18

.29

6.9

7

6.4

8

5.5

7

22

.85

16

.01

13

.51

0.0

0

0.0

0

0.0

0

0.0

0

9.9

1 13

.04

9.3

0

1.4

0

0.2

7

0.2

0

2.0

9

2.0

9

0

5

10

15

20

25

30

35

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45

50

2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017

% D

E IN

CID

ENC

IA

MACHOS

% BPV % NHP %WSSV

Selección de mejores piscinas comerciales

Selección fenotípica individual de pre reproductores

Aclimatación y traslado de pre reproductores

Ablación y despermatización de pre reproductores


Crecimiento

Fecundidad

Resistencia


Cruces dirigidos de animales de interés

Banco de reproductores

Desafío en campo Desafío experimental WSSV

Banco de sobrevivientes


257

AMARILLO

MZUL

245 NARANJA

SOBRE/

JAULA

371

AMARILLO

LP 323

369

AMARILLO

LP 323

491

PLOMO

LP 498

247

CELESTE

LP 498

70

AMARILLO

PARACAS

464

BLANCO

ECUADOR

242

AMARILLO

LP 38

263

VERDE

LP 38

138

ROJO

LP 149

978

CELESTE

LP 149

664

AMARILLO

LP 295

950

MARRON

LP 295

389

VERDE

LP 427

16

VERDE

LP 427

LP

618

?

950

MARRON

LP 295

664

AMARILLO

LP 295

24

NARANJA

LP 427

241

AMARILLO

MZUL

62

AMARILLO

MZUL

915

AMARILLO

LP 421

LP

616

?

81

VERDE

LP 427

489

VERDE

LP 427

LP

605

?

1090

VERDE

LP 421

942

VERDE

LP 421

LP

600

?

769

CELESTE

PARACAS

429

BLANCO

D RODAS

728

NARANJA

LP 398

1498

VERDE

LP 398

1078

AMARILLO

LP 323

141

AMARILLO

LP 323

LP

495

?

LP

703

?

LP

593

?

Domesticación de comunidades microbianas asociadas al cultivo del langostino para la reducción del alimento artificial, mejoramiento de la calidad de agua y prevención de bacteriosis.

0

5

10

15

20

25

25/02/2009 04/03/2009 11/03/2009 18/03/2009 25/03/2009 01/04/2009 08/04/2009 15/04/2009 22/04/2009 29/04/2009 06/05/2009 13/05/2009 20/05/2009

2.64.0

5.4 6.1

9.111,2 11,9

14,816,2

17,6 17,618,7

20.3

Pe

so (

g)

Fechas de Muestreo

Peso Promedio - Estanques: E3, E4 y E5

E3 (CONTROL) E4 (Geotextiles - Perifiton) E5 (Sacos - Perifiton)

Estanque Área Ha

Densidad de siembrapL/m2

Superficie de Periphitonm2

3 0.8 20 ---

5 0.8 20 0.875

4 0.8 400 0.6

CEPAS UTILIZADAS

Bacterias Microalgas Ciliados Nematodos

1A Shewanella sp. Diatomea 1 Uronema marina Nematodo 2

8A Shewanella sp. 98% Diatomea 3Paranophrys magna

15A Shewanella sp. 96% Amphipora sp. Euplotes crassus

17A Shewanella sp. 96% Cymbella sp.1

19A Shewanella sp. 96% Cymbella sp.221D Bacillus denitrificante 98%

Cymbella sp.3

76G Bacillus sp. 98% Cymbella sp. 4

Navicula sp. 4

Caracterización y domesticación de la flora microbiana del tracto digestivo del langostino Litopenaeus vannamei para la prevención de enfermedades bacterianas y el incremento de productividad. FINCYT-024-2009

Células digestivas

Bacterias transitorias o residentesen el tracto digestivo de Langostinosisvestre

Oportunistas

Probióticos

Patógenos

Disponer de un conjuntode microorganismosconstitutivos de la floramicrobiana nativa dellangostino L.vannamei

Equipamiento Científico-Tecnológico “Equipamiento de una unidad de cultivo celular del langostino Litopenaeus vannamei” No. 1663/OC-PE

Figura 4: Primocultivo de hemocitos en DEM después 12h (A), 18h (B) y 48h (C). Barra 20µm.

A B C

Colección de muestras de hemolinfa

Selección de medios de cultivo y estandarización de primo cultivos

Preparación de inóculos virales

Evaluación génica de NOS en primo cultivo de células de langostino. Derch. Células 3 horas post infección con WSSV, Centro: Celulas 48 horas post infección con wssv,Izq. Células 72 horas post

infección con WSSV

Evaluación de la expresión inmunitarias de células de langostino en el tiempo mediante técnicas de PCR en tiempo Real

Obtención, masificación y liofilización de protistas thraustochytridos nativos y/o modificados como fuente de ácidos grasos esenciales (PUFAS) alternativos y/o complementarios al aceite de pescado. 013-FINCYT-FIDECOM-PIPEA-2013

Especies aislados en Tumbes # Especies aislados en Piura #

Aurantiochytrium limacinum SL1101 88 Aurantiochytrium limacinum SL1101 16

Aurantiochytrium sp. BL1 4 Aurantiochytrium sp. LY-2012 5

Parietichytrium sarkarianum 3 Botryochytrium radiatum 4

Schizochytrium limacinum OUC168 4 Schizochytrium limacinum OUC166 1

Schizochytrium limacinum OUC174 1 Schizochytrium sp. ATCC 20888 2

Schizochytrium limacinum OUC192 1 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705763.1 1

Schizochytrium mangrovei 5 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705766.1 2

Schizochytrium sp. KR-5 1 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705771.1 3

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705761.1 1 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705781.1 6

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705763.1 21 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705784.1 2

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705766.1 48 Thraustochytriidae sp. MBIC11087 5

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705769.1 3 Thraustochytrium sp. ATCC 26185 1

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705771.1 21 Ulkenia sp. 1

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705772.1 2 Ulkenia visurgensis 2

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705774.1 2





Thraustochytriidae sp. MBIC11085 2

Thraustochytriidae sp MBIC11087 1

TOTAL 231 TOTAL 51

TOTAL DE ESPECIES AISLADAS 30

Caracterización molecular

Caracterización lipidica

Calidad de PUFAs N° de cepasDHA 28

DHA EPA 103

DHA EPA ARA 72

EPA 23

Ninguno 56

Total 232

CEPACódigo

internoEPA DHA

A. limacinum SL1101 A 123 0.64 39.31

A. limacinum SL1101 B* 214 0.68 38.31

A. limacinum SL1101 C 503 0.57 35.79

A. limacinum SL1101 D* b2pap 0.95 39.53

Aurantiochytrium sp. BL1 216 1.17 40.26

Aurantiochytrium sp. LY-2012* 517 1.09 40.93

Botryochytrium radiatum 541 1.48 35.74

dinoflagelado 320 0 26.2

Parietichytrium sarkarianum 120 4 17.98

S. limacinum OUC166 c4 1 36.8

S. mangrovei* 48 0.93 40.07

Schizochytrium limacinum OUC168* 85 0.7 42.66

Schizochytrium sp. KR-5 301 x x

Thraustochytriidae sp MBIC11087 75 0.67 36.96

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705763.1 304 1.33 40.44



Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705771.1* 124 0.62 40.94

Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705772.1* 222 0.81 42.02



Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705783.1 332 0.67 37


Thraustochytriidae sp. MBIC11085 307 1.19 39.33

Thraustochytrium sp. ATCC 26185 c1 2.88 37.53

Ulkenia sp. 543 0.67 37

Selección de las mejores

* Cepas seleccionadas para transformación genética.

Selección de langostinos multi-resistentes a virus mediante el uso de marcadores genéticos QTLs correspondientes al sistema de defensa antiviral ARN interferencia.

PIPEI-2-P-096-11

Alin

eam

ien

to d

e se

cuen

cias

Drosophila melanogaster

Bombyx mori

Drosophila teissieri

Drosophila santomea

Drosophila yakuba

Drosophila simulans

Tribolium castaneum

Aedes aegypti

Marsupenaeus japonicus

Penaeus monodon

Litopenaeus vannamei

Alineamiento de secuencias.

Dic

er 2

.A

rgo

nau

te 2

.

Análisis de eficiencia

Recolección de muestra

Extracción de ADN

Amplificación Electroforesis

Secuenciamiento

Primer Tm Tamaño

Dic

er 2 LvDcr2F1 60.6°

269pbLvDcr2R1 60.7°

Arg

on

aute

2

LvAgo2F3 60.1°

101pb

LvAgo2R3 60.2°

Primers seleccionados Comparación entre infección experimental y infección natural

Implementación de metodologías de “secado por pulverización sobre soporte fluidizado” (Fluidized bed spray drying) para la formulación en forma seca de microorganismos probióticos para el cultivo de langostinos

175-FINCYT-FIDECOM-PIPEA-2014

La demanda de uso de probioticos en acuicultura haciende a mas de 2 millones de dólares anuales sin contar gastos logísticos de distribución y fermentación.

Bio

ensayo

Larvicultu

raEn

gord

e

Proyecto: 2012-00018: Bacterias recombinantes

Bioensayo: ensayos de plásmidos individuales. Fecha: julio 2013 # individuos: 10 000 # tratamiento: 9 (3) Periodo de alimentación : 15 díasPeriodo de infección: 30 días. Dosis: 1ml/g.Concentración de wssv: 10E+08Inicio de mortalidad: 2DPI

Suministro de bacterias. Fecha: enero 2013 # individuos: 1000 # tratamiento: 6 (3) Periodo de alimentación : 5 días Periodo de infección: 14 días. Dosis: 1ml. Concentración de wssv: 10E+08 Inicio de mortalidad: 2DPI

SOBREVIVENCIA INFECCIÓN VIRAL

Mejora de la productividad de postlarvas de Litopenaeus vannamei mediante la selección de reproductores ligados a marcadores tipo SNP de tres caracteres genéticos de importancia comercial (Crecimiento, Fecundidad y Resistencia).

PIAP-2-P-514-14

Grafico N° 01.- Dispersión de Peso y talla de stock de reproductores de L. vannamei.

Corrida LP N°

Hembra Macho FECHA DE SIEMBRA

CANTIDAD SEMBRADA

N° anillo

color LP

Origen Lote de Origen

N° anillo

color LP

Origen Lote de Origen

N° 40

783 62 Naranja 641 32 558 Naranja 635 32 26/01/2016 52500 784 774 Naranja 645 32 1267 Naranja 645 32 26/01/2016 52500 785 172 Naranja 645 32 12 Amarillo 652 33 27/01/2016 50000 786 610 Naranja 635 32 833 Naranja 670 33 28/01/2016 67500 787 1262 Naranja 640 32 377 Verde 658 33 28/01/2016 45000 788 475 Naranja 645 32 619 Amarillo 665 33 29/01/2016 120000 789 1157 Naranja 644 32 486 Verde 647 32 29/01/2016 97500 790 1204 Celeste 643 32 607 Naranja 645 32 29/01/2016 45000 791 392 Celeste 627 31 1039 Naranja 641 32 29/01/2016 52500 792 356 Naranja 627 31 842 Naranja 643 32 30/01/2016 135000 793 1056 Verde 629 31 407 Naranja 641 32 30/01/2016 135000 794 1266 Naranja 633 31 716 Naranja 641 32 30/01/2016 120000 795 879 Naranja 629 31 1413 Naranja 644 32 30/01/2016 60000 796 443 Celeste 626 32 1421 Naranja 637 32 30/01/2016 200000 797 342 Blanco 627 32 1144 Naranja 641 32 30/01/2016 120000 798 32 Blanco 624 31 1282 Naranja 640 32 31/01/2016 150000 799 445 Blanco 647 32 527 Naranja 637 32 31/01/2016 180000 800 52 Blanco 626 31 1290 Naranja 644 32 31/01/2016 170000 801 1270 Celeste 627 31 624 Naranja 640 32 31/02/2016 200000 802 321 Blanco 644 32 558 Naranja 635 32 31/01/2016 200000 803 461 Blanco 627 31 1142 Naranja 641 32 31/01/2016 100000 804 157 Naranja 627 31 340 Marrón 641 32 01/02/2016 120000

Corrida LP N° Hembra Macho

Fecundación Fecha de siembra

Cantidad sembrada

N° anillo color N° anillo color

N° 41

805

807 Blanco

Natural 18/03/2016

75000

170 Blanco

563 Amarillo

806

807 Blanco

Natural 18/03/2016 65000 170 Blanco

563 Amarillo

1100 Amarillo

807

638 Blanco

Natural 19/03/2016 126000 496 Amarillo

768 Blanco

808

638 Blanco


325 Blanco

809

1351 Naranja

Natural 20/03/2016 120000

26 Verde

877 Amarillo

318 Celeste

293 Verde

810

1351 Naranja

Natural 20/03/2016

140000

26 Verde

877 Amarillo

318 Celeste

334 Blanco

811

1351 Naranja

Natural 20/03/2016 140000

26 Verde

877 Amarillo

318 Celeste

632 Amarillo

812

1100 Amarillo

Natural 21/03/2016 80000 419 Verde

145 Verde

813

275 Verde


145 Verde

814 1361 Celeste 1424 Amarillo I. Artificial 23/03/2016 130000

815 319 Blanco 7 Celeste I. Artificial 23/03/2016 42500

816 1020 Verde 654 Blanco I. Artificial 23/03/2016 40000

817 536 Rosado 771 Blanco I. Artificial 23/03/2016 60500

818 171 Naranja

Natural 23/03/2016 84000 293 Verde

819

694 Amarillo

Natural 23/03/2016 68500 293 Verde

900 Naranja

820 419 Verde 471 Rosado I. Artificial 24/03/2016 95000

821 394 Amarillo 633 Blanco I. Artificial 24/03/2016 40000


Domesticación, identificación molecular , reproducción y larviculturade corvina-cherela (cynoscion phoxocephalus) como una proyección hacia la maricultura de peces tropicales de alto valor comercial enel norte del Perú .

Selección y transporte de reproductores

Aclimatación yprofilaxis

AcondicionamientoReproducción

http://www.google.com.pe/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&docid=qZERHkoqSui5TM&tbnid=8DsgO_nBD4UnRM:&ved=0CAgQjRwwAA&url=http://rodolfoybarra.blogspot.com/2012/07/regreso-fujimontesinismo-al-imarpe.html&ei=afl7UfmWIorZ0wGew4HQDA&psig=AFQjCNFyUDFGoIbjsnpEZ670zMWh5hpNNA&ust=1367165673590417


http://www.google.com.pe/url?sa=i&rct=j&q=camposol&source=images&cd=&cad=rja&docid=lWqFsHtSDo9kBM&tbnid=KwUSvyNVBmgdhM:&ved=0CAUQjRw&url=http://sparperu.blogspot.com/2010/10/camposol-lidero-exportacion-de.html&ei=-fl7UazCJsrZ0wHfzoCACw&bvm=bv.45645796,d.dmQ&psig=AFQjCNHdoO1owjy2X1tNqnAMPmaMHFA-hQ&ust=1367165796647042


http://www.google.com.pe/url?sa=i&rct=j&q=logo+copeinca&source=images&cd=&cad=rja&docid=bpz9b2NuaMOZXM&tbnid=0ik7g_8Vm5GMLM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.na24.no/imarkedet/article2759432.ece&ei=NPp7UfGbN6m40AGMyYDYBQ&bvm=bv.45645796,d.dmQ&psig=AFQjCNEH4m6ITDA-kpkgE4ZoXo5XBDuJLw&ust=1367165862553511


Aplicación de técnicas para la reproducción , obtención de semillas y caracterización molecular de Atrina maura “concha pala” en hatchery como una nueva especie para la maricultura en el Perú .

Selección y acondicionamiento de

reproductores


Desove y cultivo larvario

cultivo de post larvasSemilla de 2 mm

http://www.google.com.pe/url?sa=i&rct=j&q=cultivo+de+conchas&source=images&cd=&cad=rja&docid=Zt7RWzUUDg-NnM&tbnid=Sg_E3wjA3LNboM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.connuestroperu.com/index.php?option=com_content&task=view&id=3477&ei=XtB-UZuFLunP0wHkmoHIAw&psig=AFQjCNEre8d3pfH_b1ROjGL22TJ-DnHFwA&ust=1367351401340855

http://www.google.com.pe/url?sa=i&rct=j&q=cultivo+de+conchas&source=images&cd=&cad=rja&docid=Zt7RWzUUDg-NnM&tbnid=Sg_E3wjA3LNboM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.connuestroperu.com/index.php?option=com_content&task=view&id=3477&ei=XtB-UZuFLunP0wHkmoHIAw&psig=AFQjCNEre8d3pfH_b1ROjGL22TJ-DnHFwA&ust=1367351401340855







http://www.google.com.pe/url?sa=i&rct=j&q=atrina+maura&source=images&cd=&cad=rja&docid=DZ8rHdV9NTrHxM&tbnid=vKARq1kNQPG19M:&ved=0CAUQjRw&url=http://rnislajuanvenado.blogspot.com/2008/09/moluscos.html&ei=f8x-UZPfOIe50gHx0oDQBQ&bvm=bv.45645796,d.dmQ&psig=AFQjCNFp1gOCLQCCmaACVQYpZV0meGCbYQ&ust=1367350777306407

http://www.google.com.pe/url?sa=i&rct=j&q=atrina+maura&source=images&cd=&cad=rja&docid=DZ8rHdV9NTrHxM&tbnid=vKARq1kNQPG19M:&ved=0CAUQjRw&url=http://rnislajuanvenado.blogspot.com/2008/09/moluscos.html&ei=f8x-UZPfOIe50gHx0oDQBQ&bvm=bv.45645796,d.dmQ&psig=AFQjCNFp1gOCLQCCmaACVQYpZV0meGCbYQ&ust=1367350777306407

2012-00020 Caracterización del gene de la GnRH del Paiche (Arapaima gigas) y evaluación del efecto de inyección de péptidos sintéticos o recombinantes. 2012-00021 Análisis proteómico de los constituyentes del plasma de Paiche(Arapaima gigas) en función del sexo y del edad.

9 406 803 1200 1597 1994

Mass (m/z)

79.0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - PLACA DE BAJO PESO III 07-06-12; Run #27; Label B6 Prec = 1888.9814

1251.91(R6015,S40)

1246.13(R11760,S36)93.93(R3241,S33)

121.66(R4060,S30)

72.63(R3600,S26) 1254.24(R11156,S26)823.27(R9731,S26)650.83(R8683,S26)1284.11(R7639,S26)

1797.84(R13700,S21)11.67(R1354,S21) 1597.22(R12980,S20)684.02(R9023,S18) 1286.35(R12267,S17)

205.99(R5373,S14)637.72(R7832,S12) 1268.40(R12040,S14)

850.28(R9993,S12)1240.16(R12299,S11)96.99(R3720,S10) 646.67(R9125,S10) 1766.68(R14216,S10)1522.10(R12736,S10)

324.04(R6558,S8) 958.23(R10438,S7)654.46(R8861,S7) 1704.81(R13480,S7)1295.04(R12555,S7)

Todos colaboramos para la mejorar la productividad

peruana del langostino!!!…

Grupo Marinasol

Genómica aplicada al

mejoramiento genético en

alpacas

Dr. Jorge Rodriguez Bailon

Unidad de Biotecnología Molecular

Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID)

Alpaca

Alpaca recurso de importancia

socioeconómica

Selección y Mejora Genética

Marcadores genéticos (SSR

[100], SNPs [0], ADNmt [173;

43]), 5 genomas

Conocimiento y conservación

de la biodiversidad

Investigación básica y aplicada

Generación de herramientas para selección y registro

Genómica de alpacas: Identificación de genes

expresados y marcadores genéticos asociados a

productividad de fibra fina en alpacas

Generación de núcleos de alpacas reproductoras de alta

productividad basados en la selección asistida con

marcadores genéticos

Una aproximación genómica de poblaciones aplicada a

la filogenia y mapeo de rasgos productivos en alpacas

Prueba de parentesco e identidad y su aplicación en la

validación de libros de pedigrí en alpacas de alta

productividad

Prueba de parentesco niveles de confiabilidad ~ 100%

Aceptada internacionalmente (publicación)

Laboratorio afiliado a la ISAG (International Society of

Animal Genetics)

Participación en el Panel Internacional para

determinación de pruebas de parentesco en alpacas

Prueba validada en diferentes centros

de producción de alpacas

Desarrollo y validación de libros de registro y pedigri

Software Alpaca IdGen versión 1.0, aplicaciones para

registro productivo, reproductivo y sanitario de alpacas,

plus registro de genotipificación por ADN que permite

calcular identidad, índices de filiación, endogamia,

heterocigosidad, etc.

En desarrollo la versión 1.1 y en plataforma web

Bases de datos para investigación

genética (fenotipos y genotipos)

Identificación y Estructuración de Familias de

referencia

Base de datos de registros productivos

Base de datos de productividad en abuelos, padres y crías de alpaca

Filiación comprobada con análisis de ADN

Certificación

Certificación de identidad, parentesco (paternidad y maternidad) y origen

Certificado de Identidad por ADN infalsificable

Certificado de filiación infalsificable

Certificado de origen

Análisis de consanguinidad

Reporte de los niveles de consanguinidad

Análisis de variabilidad genética

Sexaje molecular

Amplificación gen ZF

(Zinc finger protein)

238

127

M ♀ ♀ ♀ ♀ ♂

Genes expresados y características productivas

Órganos clave: Piel y Tejido linfoide

Genes expresados

Marcadores moleculares dentro de genes expresados

Asociación con características fenotípicas

Conservación y Diversidad

Caracterización de la diversidad genética en alpacas (Vicugna

pacos) como herramienta para conservación de su germplasma y

búsqueda de marcadores para la identificación de razas Suri y

Huacaya.

Generación de marcadores genéticos tipo SNPs en genes codantes

de proteínas componentes de la fibra y su uso en selección

genética y filogenia de la alpaca.

Identificación del Polimorfismo Genético de Nramp-1, TLR2 y TLR4

y su asociación con resistencia a enfermedades en alpacas

(Vicugna pacos), para incrementar la ventaja competitiva de la

industria alpaquera local

MARCADORES MICROSATÉLITES PULBLICADOS DE AMPLIFICACION EN MULTIPLES ESPECIES (GenBank)

MARCADORES MICROSATÉLITES GENOTECA SUSTRACTIVA DE cDNA DE PIEL DE ALPACA (Lab UBM-UPCH)

MARCADORES MICROSATÉLITES BIBLIOTECA GENOMICA DE ALPACA (Reeds et al 2008)

MARCADORES MICROSATÉLITES A PARTIR DE EST DE ALPACA (GenBank)

MARCADORES SNP A PARTIR DE GENOTECA SUSTRACTIVA DE PIEL DE ALPACA (Lab UBM-UPCH)

Generación de marcadores genéticos en alpacas

Variabilidad genética y estructura poblacional en alpacas peruanas

(Vicugna pacos)

ADN nuclear: 12 microsatélitesADN mitocondrial: Región control

N= 446

12 localidades distribuidas en 6 departamentos

Tabla. Número promedio de alelos, heterocigosidad observada (HO),

heterocigosidad esperada (HE) e índice de Garza-Williamson (G-W) y FIS en 6

poblaciones de alpacas mediante el análisis de 12 microsatélites.

Departamento Nº Nº promedio

de alelosHO HE G-W FIS

Huancavelica59

11.5 0.7915 0.8144 0.7069 0.0280

Junin 34 10.5 0.8000 0.8100 0.6614 0.0120

Apurimac 30 10.5 0.8133 0.8110 0.6945 -0.00301

Arequipa 20 9.8 0.7650 0.8009 0.6767 0.0460

Cusco 66 12.3 0.8030 0.8070 0.7731 0.0050

Puno 237 14.7 0.7962 0.8139 0.8169 0.0220

1 Valores negativos de FIS indican exceso de genotipos heterocigotos.

38 sitios polimórficos + 1 inserción de timina

32 haplotipos identificados

Diversidad haplotípica = 0.905

Diversidad nucleotídica = 0.01746

Variabilidad genética en alpacas (ADN mitocondrial)

Figura. Análisis factorial de 2 dimensiones realizado con la matriz de genotipos microsatelites

utilizando el programa Genetix. Nótese la presencia de dos grupos genéticos claramente definidos.

Variabilidad genética en alpacas (Genes nucleares)

Raza Nº Nº promedio

de alelos HO HE PIC PE FIS

Huacaya 375 16.2 0.7939 0.819 0.7967 0.999992 0.0306

Suri 71 12.4 0.8113 0.810 0.7809 0.999984 -0.0014

Variabilidad genética en TLR 2

Detección de alelos de riesgo – Ojo Sarco

Defecto genético hereditario

Microsatélites KIT (3) permiten detectar alelos

de riesgo en alpacas reproductoras

Selección para eliminación del defecto

Fotografía: Conopa.org

Genoma y asociación genética

Genomas completos (3 alpacas y 1 llama) - 49.6 a 50.9 Gb

Elevada nivel de cobertura y resolución (aprox. 95%, 22X)

Estudios de genómica evolutiva, asociación genética

(GWAS, gen candidato), mapa de LD.

Estudios iniciales de asociación genética en KRTAP1-2,

KRTAP6-1, KRTAP9-2, KRTAP11-1 y KRTAP13-1

(Foppiano, 2016), Tricohialina (Delgado de la Flor, 2016).

Identificación de SNPs en gen KRTAP 13.1 cercano a

genes bajo fuerte presión de selección (Veliz, 2017)

Identificación de polimorfismos tipo SNPs para elaboración

de DNA microarray

Plataforma de microarreglos ADN para alpacasTranscriptoma y Genotipificacion en paralelo

Caracterización del transcriptoma de las células de la piel de la alpaca

2,280 clonas: 1,075 transcritos.

347 secuencias de consenso y 728 singletons.

Caracterización del transcriptoma de los glóbulos blancos de la alpaca

PacoChip, microarreglo para determinación de identidad y filiación en alpacas (llamas, vicuñas)

Unidad de Biotecnología Molecular

Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID)

Ph D. José R. Espinoza

Ph D. Patricia Herrera Velit

Dr. Jorge Rodriguez Bailón

MSc. Teresa Barreto Gaviria

MSc. Juan Agapito Panta

MSc. Irene Delgado de la Flor

MSc. Diego Veliz Otani

MSc. Lissete Delgado Aquije

Dr. Jorge Rodriguez Bailon

Facultad de Ciencias y Filosofía

Universidad Peruana Cayetano Heredia

[email protected]

mailto:[email protected]

Carlos Condemarín Montealegre Manuel Saucedo Bazalar

BIOTECNOLOGÍA DE LA UVA

Nematodos agalladores de la raíz, Meloidogyne javanica

Abad….Annu. Rev. Phytopathol. 2013. 51:203–20 Raíces de uva variedad patrón Freedom con infección severa de M. javanica

HOSPEDERONEMATODOS

METAGENOMICS

Microbiota of nematode pathogens

METAGENOMICS

Microbial community associated with root infection caused

by nematodes

METAGENOMICS

Cultivated and pristine soil

CONTROL BIOLÓGICO

PROTEOMICS

Effector proteins identification from M.

javanica.

PROTEOMICS

Mass imaging from root gall formation

PROTEOMICS

Mass imaging of Meloidogyne

Desarrollar un producto biológico controlador del nematodo fitopatógeno de la vid, Meloidogyne javanica, basado en la

domesticación de microorganismos nativos patógenos del nematodo, dentro de los viñedos de la empresa ECOSAC

OMICAS

HOSPEDERO

NEMATODO CONTROL BIOLÓGICO

BACTERIA

Bacillus, Pseudomonas, Pasteuria

FUNGI

Trichoderma, Paecilomyces

ROOT-KNOT NEMATODE

Meloidogyne

RESISTENTSUSCEPTIBLE

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

Mass (m/z)

4.7E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - IB12-5-17 MICROALGAS; Run #14; Label P5

832.2596(R5474,S538)

1776.7977(R11362,S472)

1198.6287(R9799,S418)

854.9813(R8073,S165)

2273.0439(R16478,S259)870.9521(R8679,S130)

2162.9463(R18006,S183)1704.6576(R15113,S120)

860.9901(R9576,S69)1515.6688(R13166,S70)2192.8945(R15172,S97)

3165.4958(R17640,S101)2550.1199(R12847,S53)

Figura 1: Se muestran los precursores M/Z de los aminoácidos que identificaron lasproteínas efectoras mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF extraídas a partirdel cuarto estadio de M. javanica

IDENTIFICACION POR ESPECTROMETRIA DE DOBLE MASA MALDI

TOF/TOF DE TIPO SHOUTGUN PROTEOMICS DE PROTEINAS DE

VARIOS ESTADIOS DEL NEMATODO, Meloidogyne javanica, DE

EFECTORES INVOLUCRADOS EN LA INFECCION DE RAICES.

Tesista: Stalyn Córdova

HOSPEDERO


BACTERIA


FUNGI


ROOT-KNOT NEMATODE

Meloidogyne


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Hembra M. javanica Huevo M. javanica M. javanica en Nodulos Aporcelaimellus sp Tylencholaimus parvus Suelo cultivado con uva Suelo cultivado conpimiento

Suelo Pristino

Especies de Bacterias presentes en Nematodos y Suelos de Uva por Analisis de Metagenomica Otros (<1%)Pseudomonas poaeSphingomonas spp.Ensifer sinorhizobium terangaeExiguobacterium panipatensisPontibacter korlensisBacillus viretiAcinetobacter spp.Comamonadaceae spp.Massilia timonaeAcinetobacter radioresistensAcinetobacter johnsoniiAcinetobacter baumanniiBalneimonas spp.Burkholderia ambifariaHylemonella spp.Burkholderia ubonensisAcinetobacter calcoaceticusBurkholderia thailandensisGeobacillus thermoglucosidasius tr2Acinetobacter rhizosphaeraeAeromonas veroniiHydrogenophaga spp.Chromobacterium violaceumPseudomonas oryzihabitansRheinheimera texanaPseudomonas jinjuensisAzorhizophilus azotobacter tropicalisCupriavidus taiwanensisRheinheimera sp._chandigarhAeromonas enteropelogenesPaludimonas paludibacterium yongneupenseEnsifer melilotiPseudomonas alcaligenesVariovorax spp.Pseudomonas resinovoransPseudomonas mendocinaPseudomonas pseudoalcaligenesPseudomonas veroniiBacillus polygonumiCorynebacterium diphtheriaeComamonas testosteroni sb4Sphingobium yanoikuyaeMethylobacterium fujisawaenseSphingomonas yabuuchiaeAcidimicrobiales spp.Acinetobacter genomosp. 3Streptococcus sanguinisNeisseria siccaAcinetobacter juniiChryseobacterium pallidumHerbaspirillum rubrisubalbicansSteroidobacter spp.Stenotrophomonas maltophiliaMethylobacterium radiotoleransHaloferula spp.Pedobacter steyniiRalstonia pickettiiMethylobacterium tardumPseudomonas putida

Diversidad de especies de nematodos fitopatógenos y de vida libre, así como la

diversidad bacteriana en los suelos cultivado de uva, pimiento y suelo prístino

mediante el uso de herramientas moleculares de nueva generación de secuenciamiento por metagenómica

dirigida al gen 16S DNAr

HOSPEDERO


BACTERIA


FUNGI


ROOT-KNOT NEMATODE

Meloidogyne


Detección de esporas de Pasteuria

penetrans adheridas a la cutícula

de juveniles de Meloidogyne

javanica

HOSPEDERO


BACTERIA


FUNGI


ROOT-KNOT NEMATODE

Meloidogyne


Colecta de hembras adultas de

Meloidogyne infectados con Pasteuria sp.

Endosporas de Pasteruria sp.

adheridas a la cutícula de J2.

Infección de J2 en plantas de

tomate

Endosporas de Pasteuria sp.

Cada hembra

adulta contiene

más de 2

millones de

endoporas

Infección

artificial

Desarrollo de endosporas en vez de

huevos

HOSPEDERO


BACTERIA


FUNGI


ROOT-KNOT NEMATODE

Meloidogyne


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Pasteuria Meloidogyne

Po

rcen

taje

ab

un

dan

cia

< 0.01%

Opitutus

Enterobacter

Burkholderia

Flavobacterium

Dongia

Sphingobium

Acinetobacter

Rhizobium

Brevundimonas

Bacillus

Variibacter

Sphingomonas

Acidibacter

Pseudoxanthomonas

Hydrogenophaga

Cloacibacterium

Pseudolabrys

Variovorax

Streptomyces

Pseudomonas

Pasteuria

Paenibacillus

ANÁLISIS TAXONÓMICO Y FUNCIONAL DE

LA MICROBIOTA DE HEMBRAS DEL

NEMATODO AGALLADOR DE LA RAÍZ,

Meloidogyne javanica, EN RELACIÓN CON

LA INFECCIÓN POR Pasteuria penetrans

Tesista: David Lindo

Identificación por Metaproteómica de la diversidad de bacterias relacionadas a las semillas de pimiento piquillo

980 996 1012 1028 1044 1060

Mass (m/z)

7.7E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - cacao 5-09-16 2642; Run #8; Label E14

1007.4515(R6529,S897)1045.5770(R7461,S904)

1009.4497(R9027,S339)

990.4201(R9930,S327)

1039.4320(R9878,S200)989.4313(R10938,S139) 1030.5414(R11241,S150)

1005.4192(R10689,S76)1019.4435(R10484,S74)1033.4570(R9523,S70)1043.5551(R11413,S52)

Análisis metagenómico comparativo de las comunidades fúngicas y

bacterianas asociadas al proceso de desarrollo de las enfermedades del

tronco de la vid (Vitis vinifera L.) en Piura, e identificación de hongos por

espectrometría de masas MALDI TOF/TOF shotgun proteomics

M. Saucedo-Bazalar, C. Santos, P. Masías, P. Duarte, G. León, P. Dorresteins, I. Fournier, M. Salzet,

V. Cedeño and E. Mialhe

La uva de mesa es uno de los principales productos de exportación en el departamento de Piura.

Perú es el tercer exportador de uvas de mesa a nivel mundial

Introducción

En Perú, Piura tiene una superficie cultivada de aproximadamente 9 000 ha con, tendencia a seguir creciendo en los próximos años

1,032.00 US$ Mill

La vid (Vitis vinifera L.) es uno de los cultivos frutales más ampliamente cultivado y económicamente importante a nivel mundial

Grapevine Trunk Diseases (GTD): complex and still poorly understood

C. Bertsch, M. Ramírez-Suero, M. Magnin-Robert, P. Larignon, J. Chong, E. Abou-Mansour, A. Spagnolo, C. Clément and F. Fontaine (2013)Patologías de la vid

Nematode infestationsMeloydogine javanica

Taken and modified from:

Grapevine Pathogenic Microorganisms:

Understanding Infection Strategies and Host

Response ScenariosGrace Armijo, Rudolf Schlechter, Mario Agurto, Daniela Muñoz, Constanza

Nuñez and Patricio Arce Johnson (2016)

Grapevine Trunk Diseases (GTD):

Botryosphaeria dieback

Esca disease

Eutypa dieback Complejo fúngico

Introducción

Esca disease

Phaeomoniella chlamidospora

Phaeoacremonium aleophilum

P. viticola

P. parasitucum

Fomitiporia punctata

F. mediterranea

Eutypa dieback

Eutypa lata

Eutypa leptoplaca

Cryptovalsa ampelina

Diatrypella sp.

Diatrype stigma

Diatrype whitemanensis

Cryptosphaeria pullmanensis

Eutypella sp.


Especies de la familia Botryosphaeriaceae

En Piura, Lasiodiplodia theobromae

(= Botryodiplodia theobromae) sin embargo…

L. viticola

L. iraniensis

L. pseudotheobromae

Dothiorella viticola (=B. viticola)

Botryosphaeria dothidea

Diplodia seriata (=B. obtusa)

Neofusicoccum parvum (=B. parva)

Neofusicoccum luteum (=B. lutea)

Macrophomina phaseolina

Black foot disease

Ilyonectria spp. (= Cylindrocarpon)

Campylocarpon spp.,

Black foot disease

Plant Pathology Journal

Grapevine Trunk Diseases (GTD): complex and still poorly understood

C. Bertsch, M. Ramírez-Suero, M. Magnin-Robert, P. Larignon, J. Chong, E. Abou-Mansour, A. Spagnolo, C. Clément and F. Fontaine (2013)Patologías de la vid

Nematode infestationsMeloydogine javanica

Taken and modified from:

Grapevine Pathogenic Microorganisms:

Understanding Infection Strategies and Host

Response ScenariosGrace Armijo, Rudolf Schlechter, Mario Agurto, Daniela Muñoz, Constanza

Nuñez and Patricio Arce Johnson (2016)

Grapevine Trunk Diseases (GTD):


Esca disease

Eutypa dieback Complejo fúngico

Introducción

Black foot disease

Plant Pathology Journal

Front Microbiol

Bacteria in a wood fungal disease: characterization of bacterial communities in woodtissues of esca–foliar symptomatic and asymptomatic grapevinesE. Bruez, R. Haidar, M. T. Alou, J. Vallance, C. Bertsch, F. Mazet, M. Fermaud, A. Deschamps, L. Guerin-Dubrana, S. Compant and P. Rey (2015)

The role of bacterial microbiome in the grapevine

Phyllosphere

Carposphere

Anthosphere

Caulosphere

Rhizosphere

¿Es posible la

existencia de

bacterias que

participen o estén

relacionadas a los

hongos que causan

GTD?

Objetivos

1. Análisis metagenómico de las comunidades fúngicas y bacterianas asociadas a platas de vid sanas y con GTD

2. Identificación de hongos asociados a GTD mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF shotgun proteomics

3. Análisis metabolómico de Bacillus sp. contra Lasiodiplodia theobromae mediante espectrometría de masas MALDI-TOF

4. Análisis metabolómico de Bacillus sp. contra Lasiodiplodia theobromae mediante MS IMAGING

Zona de estudio

Materiales y Métodos

La zona de estudio fueron los viñedos de la empresa ECOSAC AGRICOLA

SAC (1200 ha) ubicada en el centro poblado de Chapairá, distrito de Castilla,departamento de Piura (5°07’06.6’’ LS y 80°35’52.3” LO).

Síntomas de GTD fueron detectados en todas las zonas muestreadas

Plantas de vid muertas con necrosis vascular del tronco

Muerte regresiva afectando los racimos

de uva

Síntomas de marchitez severa de ramas enteras

Síntomas de clorosis y

necrosis foliar

Necrosis en la superficie de las ramas

Presencia de picnidios en la superficie de las ramas

Necrosis en zona de poda

Presencia de picnidios en la superficie de las ramas

Las muestras fueron tomadas a partir de plantas de vid (vr. Red Globe) de 5 años de edad. Tres tipos de plantas de vid fueron muestreadas: Vid sana (VS), Vid

sana, a partir de un área con plantas de vid con síntomas de GTD (VR) y vid con síntomas de GTD (VE).

Evaluación en campo y muestreo

VS

VS VR




VRVS VE

Cada una de ellas fueron podadas, luego las muestras de ramas, tronco y cuello fueron procesadas en el laboratorio para el análisis microbiológico y metagenómico




Next Generation

Sequencing

(ITS and 16S rRNA)

Maceración en nitrógeno líquidoProcesamiento de muestra


1. Análisis metagenómico de las comunidades fúngicas y bacterianas asociadas a platas de vid sanas y con GTD

Corte de tejidos

1 2

3

Análisis pipeline

3

4

Extracción de AND metagenómico

5

AND

metagenómico

67

ANALISIS METAGENOMICO DE HONGOS (433 OTUs)

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10%

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100%

VS VR VE

%P

orc

enta

je d

e ab

un

dan

cia

Otros géneros < 1%

Rhizophagus

Wallemia

Bartalinia

Acremonium

Aspergillus

Aureobasidium

Cladosporium

Fusarium

Deniquelata

Lasiodiplodia

Alternaria

Peniophora

0%

10%

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VS VR VE

%P

oce

nta

je d

e ab

un

dan

cia

Glomeromycota

Ascomycota

Basidiomycota

A B

C

Resultados y Discusión

Análisis metagenómico de hongos basado en la secuenciación del ADNr ITS. A) Composición taxonómica y porcentaje de abundancia a nivel de Phylum con VS(G=1.2%; A=97.6% y B=1.2%); VR (G=0.1%; A=99.2% y B=0.7%) y VE (G=0.0%; A=41.2% y B=58.8%).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

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VS VR VE

%P

orc

enta

je d

e ab

un

dan

cia

Otros géneros < 1%

Rhizophagus

Wallemia

Bartalinia

Acremonium

Aspergillus

Aureobasidium

Cladosporium

Fusarium

Deniquelata

Lasiodiplodia

Alternaria

Peniophora

0%

10%

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50%

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VS VR VE

%P

oce

nta

je d

e ab

un

dan

cia

Glomeromycota

Ascomycota

Basidiomycota

A B

C


B) Composición taxonómica y porcentaje de abundancia (>1%) a nivel de género para cada tipo de muestra. Aspergillus (A. penicillioides) resaltó como especiemarcadora en un 93.2% y Lasiodiplodia con 4.3% en VS; por otro lado, aparecen Alternaria con 33.0%, Aureobasidium (Aureobasidium sp.) como especie marcadora con23.9%, Cladosporium con 13.4%, Aspergillus con 12.3%, Acremonium con 8.4% y Bartalinia con 6.0% en VR; finalmente aparece Peniophora (P. aurantiaca) como especiemarcadora con 57.9%, Alternaria con 15.9%, Lasiodiplodia con 11.9%, Deniquelata con 6.3% y Fusarium (F. oxysporum) como especie marcadora con 3.3% en VE.


0%

10%

20%

30%

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VS VR VE

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enta

je d

e ab

un

dan

cia

Otros géneros < 1%

Rhizophagus

Wallemia

Bartalinia

Acremonium

Aspergillus

Aureobasidium

Cladosporium

Fusarium

Deniquelata

Lasiodiplodia

Alternaria

Peniophora

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10%

20%

30%

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VS VR VE

%P

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e ab

un

dan

cia

Glomeromycota

Ascomycota

Basidiomycota

A B

C


C) Representación gráfica de Venn mostrando el número de especies únicas y comunes en los tipos de plantas evaluadas. VS y VR compartieron 7 especies; VR y VEcompartieron 12 especies; VS y VE compartieron 3 especies y finalmente, VS, VR y VE compartieron 3 especies de los géneros Aspergillus, Alternaria y Lasiodiplodia.


VS

VR

VE

A

B


ANALISIS METAGENOMICO DE BACTERIAS (512 OTUs)

Análisis metagenómico de bacterias basado en el secuenciamiento del ADNr 16S. A) La curva de rarefacción muestra la diferencia en la diversidad de OTUs en las tresmuestras donde VE muestra una mayor diversidad de OTUs.

VS

VR

VE

A

B



B) Representación gráfica de Venn mostrando el número de especies únicas y comunes en los tipos de plantas evaluadas. VS y VR compartieron 53 especies; VR y VEcompartieron 58 especies; VS y VE compartieron 82 especies y finalmente, VS, VR y VE compartieron 51 especies.

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10%

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VS VR VE

%P

orc

enta

je d

e ab

un

dan

cia Otros Phylum < 1%

Firmicutes

Actinobacteria

Deinococcus Thermus

Proteobacteria

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VS VR VE

%P

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un

dan

cia

Otras especies < 1%

Proteus sp.

Pseudomonas mendocina

Bacillus weihenstephanensis

Serratia marcescens

Curtobacterium sp.

Enterococcus sp.

Staphylococcus sp.

Bacillus spp.

Proteus mirabilis

Proteus spp.

Curtobacterium pusillum

Pseudomonas oryzihabitans

Proteus vulgaris

A B



A) Composición taxonómica y porcentaje de abundancia a nivel de Phylum Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes y Deinococcus-Thermus con VS (P=10.7%; A=86.5%;F=0% y D-T=0%); VR (P=3.0%; A=96.4%; F=0% y D-T=0%) y VE (P=74.1%; A=2.2%; F=1% y D-T=9.6%).

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VS VR VE

%P

orc

enta

je d

e ab

un

dan

cia Otros Phylum < 1%

Firmicutes

Actinobacteria

Deinococcus Thermus

Proteobacteria

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10%

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70%

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100%

VS VR VE

%P

orc

enta

je d

e ab

un

dan

cia

Otras especies < 1%

Proteus sp.

Pseudomonas mendocina

Bacillus weihenstephanensis

Serratia marcescens

Curtobacterium sp.

Enterococcus sp.

Staphylococcus sp.

Bacillus spp.

Proteus mirabilis

Proteus spp.

Curtobacterium pusillum

Pseudomonas oryzihabitans

Proteus vulgaris

A B



B) Composición taxonómica y porcentaje de abundancia (>1%) a nivel de especie para cada tipo de muestra. los microorganismos bacterianos reportados en VS y VRfueron Proteus vulgaris con 61.1% y 62.4%; Bacillus spp. con 5.5% y 3.8%; Serratia marcens con 1.7% y 1.9% respectivamente, mientras que en VE se encontraron bacteriasmarcadoras como Pseudomonas oryzihabitans con 10.9%, Curtobacterium pusillun con 7.6% y Curtobacterium sp. con 1.6%

Árbol filogenético basado en el método Neighbor-Joining, quemuestra la diversidad de la comunidad bacteriana.


Cultivo de hongos

Extracción y migración de proteínas

Análisis MALDI TOF/TOF MS

Extracción de ADN y

Amplificación por

PCRAislamiento de hongos y bacterias

Procesamiento de muestra

Previamente


2. Identificación de hongos asociados a GTD mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF shotgun proteomics

Maceración de los hongos

12 3

4

5

1

2

3

4

5

Se aislaron 48 cepas fúngicas. Se identificaron a nivel molecular 27 cepas fúngicas.


Cepa Accesión Especie Ident Caráct. patogénico Procedencia Estado

2AMS KX146504 Chaetomium brasiliense 98% No patógeno Rama Sana

3AMS KR709026 Lasiodiplodia theobromae 100% Patógeno Rama Sana

5AMS FJ882040 Peniophora laxitexa 94% Patógeno Rama Sana

14AMS HQ315840 Botryosphaeria rhodina 100% Patógeno Rama Sana

15AMS KX401428 Lasiodiplodia theobromae 100% Patógeno Rama Sana

18AMS KX499521 Alternaria longipes 100% Patógeno Rama Sana

21AMS KX443224 Aspergillus sp. 98% No patógeno Rama Sana

24AMS AF099008 Trichoderma virens 99% No patógeno Rama Sana

25AMS KX816009 Trichoderma sp. 99% No patógeno Tronco Sana

28AMS EF567981 Aspergillus niger 99% No patógeno Rama Sana

29AMS KX443224 Aspergillus sp. 98% No patógeno Rama Sana

4AMS KJ832022 Peniophora sp. 95% Patógeno Rama Enferma

6AMS JF502430 Peniophora sp. 93% Patógeno Tronco Enferma

7AMS KU507487 Lasiodiplodia laeliocattleyae 99% Patógeno Rama Enferma

10AMS KY473068 Lasiodiplodia theobromae 99% Patógeno Rama Enferma

11AMS MF480345 Lasiodiplodia theobromae 100% Patógeno Rama Enferma

12AMS KY655212 Lasiodiplodia brasiliensis 99% Patógeno Rama Enferma

16AMS KY473061 Lasiodiplodia theobromae 99% Patógeno Tronco Enferma

17AMS KY473068 Lasiodiplodia theobromae 99% Patógeno Rama Enferma

19AMS MF136589 Diplodia sp. 99% Patógeno Rama Enferma

20AMS KM508494 Lasiodiplodia theobromae 99% Patógeno Rama Enferma

22AMS KJ941006 Phaeoacremonium sp. 100% Patógeno Tronco Enferma

23AMS KF179094 Phaeoacremonium minimun 99% Patógeno Cuello Enferma

26AMS KX394413 Neofusicoccum parvum 99% Patógeno Tronco Enferma

27AMS KF179094 Phaeoacremonium minimun 99% Patógeno Cuello Enferma

30AMS KY680345 Macrophomina phaseolina 100% Patógeno Cuello Enferma

31AMS KX394413 Neofusicoccum parvum 99% Patógeno Rama Enferma

Tabla 1. Hongos identificados molecularmente y caracterizados según su carácter patogénico, procedencia y estado de la planta

Identificación molecular (ITS) de algunas cepas fúngicas aisladas en este estudio. 1) Alternaria sp., 2) Peniophora sp. 3) Diplodia seriata, 4) Macrophominaphaseolina, 5) Phaeoacremonium sp. 6) Phaeoacremonium minimun, 7) Neofusicoccum parvum, 8) Lasiodiplodia brasiliensis, 9) L. theobromae, 10) Conidiasmaduras e inmaduras de L. theobromae (40X).

1

109876

5432


Se aislaron 107 cepas bacterianas (28 endófitas y 79 epifitas). Se identificaron a nivel molecular 62 cepas bacterianas.


Cepa Accesión Especie Ident Caráct. residente Procedencia Estado

1IIB NR_024640 Enterobacter asburiae 98% Epífita Rama Sana

1IID(1) NR_126208 Enterobacter xiangfangensis 99% Epífita Rama Sana

1IIC NR_104933 Leclercia adecarboxylata 96% Epífita Rama Sana

1IIA NR_116797 Pantoea dispersa 91% Epífita Rama Sana

1ID NR_042349 Enterobacter ludwigii 97% Epífita Rama Sana

1IIIC NR_042349 Enterobacter ludwigii 94% Epífita Rama Sana

1IA NR_126208 Enterobacter xiangfangensis 95% Epífita Rama Sana

1IVC NR_042349 Enterobacter ludwigii 96% Epífita Rama Sana

1IID(2) NR_041715 Pseudomonas stutzeri 95% Epífita Rama Sana

1IB NR_116755 Pantoea dispersa 98% Epífita Rama Sana

1BM NR_104839 Curtobacterium oceanosedimentum 99% Epífita Rama Sana


4BM NR_028983 Roseomonas ludipueritiae 99% Epífita Rama Sana

5BM NR_042315 Curtobacterium pusillum 93% Epífita Rama Sana

8BM NR_025922 Staphylococcus warneri 98% Endófita Rama Sana


11BM NR_134084 Microbacterium hydrothermale 93% Epífita Rama Sana



17BM NR_114215 Pseudomonas luteola 99% Epífita Rama Sana


3SP6 NR_104749 Bacillus subterraneus 97% Epífita Rama Sana

3SP7 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 93% Epífita Rama Sana

3SN1 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Endófita Rama Sana



4SP3 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Epífita Tronco Sana



Tabla 2. Bacterias identificadas molecularmente y caracterizadas según su carácter patogénico, procedencia y estado de la planta

4SP6 NR_104749 Bacillus subterraneus 86% Epífita Tronco Sana




4SN1 NR_043334 Bacillus niabensis 98% Endófita Rama Sana

2IIIB NR_121761 Bacillus toyonensis 91% Epífita Rama Sana

2IIB KT591342 Bacillus thuringiensis 86% Epífita Tronco Sana

2IB NR_044546 Bacillus nealsonii 94% Epífita Tronco Sana

2IVA GU584975 Bacillus cereus 89% Epífita Rama Sana

2VB NR_104873 Bacillus subtilis 94% Endófita Rama Sana

3IID NR_042349 Enterobacter ludwigii 95% Epífita Rama Enferma

3IIC NR_118011 Enterobacter sp. 99% Epífita Rama Enferma

3IVA NR_111998 Pantoea agglomerans 97% Epífita Rama Enferma

3IB NR_024662 Pseudomona plecoglossicida 95% Epífita Cuello Enferma

3IA NR_042349 Enterobacter ludwigii 97% Epífita Cuello Enferma

3IIA NR_024662 Pseudomona plecoglossicida 99% Epífita Rama Enferma

3IIIA NR_024662 Pseudomona plecoglossicida 98% Epífita Rama Enferma

3IC NR_024662 Pseudomona plecoglossicida 99% Epífita Rama Enferma

3IIIC NR_042349 Enterobacter ludwigii 99% Epífita Rama Enferma

3IIB NR_042349 Enterobacter ludwigii 99% Epífita Cuello Enferma

3BM NR_042315 Curtobacterium pusillum 98% Endófita Rama Enferma

6BM NR_042315 Curtobacterium pusillum 95% Epífita Rama Enferma

7BM NR_026156 Curtobacterium citreum 99% Epífita Rama Enferma

10BM NR_104839 Curtobacterium oceanosedimentum 97% Endófita Rama Enferma

13BM NR_026156 Curtobacterium citreum 98% Epífita Rama Enferma

14BM NR_042315 Curtobacterium pusillum 99% Epífita Rama Enferma

16BM NR_025922 Staphylococcus warneri 99% Endófita Tronco Enferma

18BM NR_104839 Curtobacterium oceanosedimentum 99% Epífita Rama Enferma

20BM NR_114215 Pseudomonas luteola 93% Epífita Rama Enferma

21BM NR_025922 Staphylococcus warneri 91% Epífita Rama Enferma

3EP1 NR_117946 Bacillus amyloliquefaciens 97% Epífita Rama Enferma

4EP1 NR_118950 Bacillus subtilis 88% Epífita Rama Enferma

4EP3 NR_025122 Bacillus endophyticus 99% Epífita Rama Enferma

Prec MW Prec m/z Best Sequence Protein Specie Identified by Ident Accession

1673.6967 1674.704 LVSWYDNEWGYSR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2SSH4

2151.8887 2152.896 GILGYTEDDIVSSDLNGDNR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2SSH4

818.4304 819.4377 VGINGFGR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase OS Macrophomina phaseolina Protein Pilot 13.90% K2SSH4

2368.0466 2369.054 SAVDETLPNYGGVYAGDGSNAGVR Thiamine pyrophosphate enzyme TPP-binding protein Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2QQI7

1053.5096 1054.517 FVELYMPR Thiamine pyrophosphate enzyme TPP-binding protein Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2QQI7

969.4402 970.4475 YSEYPGVR Thiamine pyrophosphate enzyme TPP-binding protein Macrophomina phaseolina Protein Pilot 32.40% K2QQI7

1051.4617 1052.469 DLWWNYR FAD linked oxidase Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2RK68

975.5063 976.5136 VWLQQFR FAD linked oxidase Macrophomina phaseolina Protein Pilot 0.70% K2RK68

1656.7286 1657.736 YPEGDNIHVNWTGR 6-phosphogluconate dehydrogenase decarboxylating Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2S8M9

1143.5726 1144.58 SSLGPSDAVLAK hypothetical protein MPH_09945 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG12953.1

1673.6987 1674.706 RSTLPDAVACGIATSR hypothetical protein MPH_06777 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG16082.1

1646.7107 1647.718 ANTNCTVAEGIDRAR hypothetical protein MPH_06175 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG16594.1

2058.9197 2059.927 TTGMAASAYTTNMERNSPR hypothetical protein MPH_01866 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG20832.1

2192.1206 2193.128 AGEEAAADAALGLVLLLDQVPR hypothetical protein MPH_09564 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG13282.1

1695.6497 1696.657 RPSCAVDMQHAPRR Glycoside hydrolase Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG13172.1

2025.0046 2026.012 QNLEETGMGFDAEVQMVK Putative TIM-barrel signal transduction protein Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG17264.1

2951.2017 2952.209 LPMWEKMQAPDIAIDYWKMPEGNR Alternative oxidase Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG17769.1

2210.0476 2211.055 FVDTSAQEAAAAAWQDVFQR SNF2-related protein Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG15835.1

1862.9547 1863.962 KGAQVIYDVVTSTGAAAGR Short-chain dehydrogenase/reductase SDR Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG13230.1

2883.2146 2884.222 QHIASWWPSWNMEPRAPRWEFR protein of unknown function Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG14295.1

2253.9036 2254.911 MNFSHGSYEYHQSVIDNAR Pyruvate kinase Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GDV7

1834.8607 1835.868 TEWLSQLNTEYRPAK Pyruvate kinase Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GDV7

1053.5117 1054.519 FVELYMPR Putative pyruvate decarboxylase protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1EZ71

1307.5427 1308.55 SDFNTTGFTYR Putative pyruvate decarboxylase protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 98.90% R1EZ71

1518.6687 1519.676 DSFAAGWGVMVSHR Putative enolase protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GXH7

1708.8707 1709.878 VIVVAYHPSNNELVR 40S ribosomal protein S8 Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GA90

1195.5256 1196.533 WSYEDVEIR Putative 40s ribosomal protein S5 Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GEL1


Tabla 3. Secuencias peptídicas obtenidas del análisis MALDI-TOF7TOF MS, las cuales correspondieron a proteínas de seis hongos asociados a las GTD.

1256.6947 1257.702 LGSVLVQCILR Putative phosphate transporter protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1G8S4

1244.4907 1245.498 YGEDWEKYR Putative delta-sterol reductase protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1EL76

1272.6387 1273.646 AVSLTWPNETR putative trna processing endoribonuclease protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007587580.1

1607.7966 1608.804 DGSIAMAVLGVRFTR putative polyketide synthase protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007588609.1

2951.3357 2952.343 FHGSATWNIEICGANFKPLPMYLNR putative rna-dependent rna polymerase protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007589444.1

1481.7167 1482.724 DRRDKPEGNMHK putative inositol monophosphatase protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007583401.1

2247.0427 2248.05 TSSHSESNSLYEAKPVLGQGR putative integral membrane protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007584725.1

1350.6107 1351.618 EYAAEAIQGSRR putative cercosporin toxin biosynthesis protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007585443.1

1053.5096 1054.517 FVELYMPR Putative pyruvate decarboxylase Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A0G2GHC2

1350.6107 1351.618 QPIDVAEYLFR Putative pyruvate decarboxylase Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A0G2GHC2

2265.0518 2266.059 ENDIVITETGTANFGIWETR Putative pyruvate decarboxylase Diplodia seriata Protein Pilot 89.40% A0A0G2GHC2

1779.9507 1780.958 ALENPQRPFVAILGGAK Phosphoglycetare kinase Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A0G2EPE0

1440.7556 1441.763 ATDGQIVLLENLR Phosphoglycerate kinase Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A1S8BL31

1790.8947 1791.902 LEKGASYDEIKETIR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP86720.1

1524.6127 1525.62 HYGMTPDDYTAVR Putative thiamine biosynthesis protein Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A0G2F1L8

1868.8436 1869.851 IEEELGSQAVYAGKNFR putative phosphopyruvate hydratase Diplodia seriata Protein BLAST 100% XP_020127401.1

2090.9397 2091.947 AQAEQALWKWVGEWHPR Aldehyde reductase 2 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP84324.1

1394.5747 1395.582 YYPAEDEQQPR putative 60s ribosomal protein l6 Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY22334.1

1006.3928 1007.4 AGATAQMGAGR hypothetical protein BK809_0004048 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP85378.1

2367.0156 2368.023 ANQANHWNIDYRAVLQIWR putative 6-phosphogluconate dehydrogenase Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY14827.1

1389.6766 1390.684 EGTNGSTQPAYGAR GTP-binding protein rhoC Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP86342.1

1705.7537 1706.761 AGIPKESIFDEELMK Chromatin-remodeling complexes subunit NGG1 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP82564.1

1481.7167 1482.724 GAPGSMGPPQRPADK putative transcription initiation factor tfiid component taf4 Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY13456.1

2020.8997 2021.907 LSAQFQNGFHDSNADQSR putative ccch zinc finger and rrm domain-containing protein Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY23048.1

2673.2666 2674.274 NTAAFLVEPIQGEAGIVVPDDSYLR putative l-ornithine aminotransferase Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY17893.1

1834.8937 1835.901 GTVIAEYVWIDGSNGVR putative glutamine synthetase Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY14390.1

2934.2397 2935.247 AGCYAPTLHEHNTPGRCYSYHCQR Rho1 guanine nucleotide exchange factor 3 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP83955.1

2951.2507 2952.258 HYELHKNTVLPFIPLDDDGEEDINK Serine/threonine-protein kinase ATG1 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP85750.1

2151.8887 2152.896 DGEETGYPIGMTPKQSRNR ATP-dependent DNA helicase mph1 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP87502.1

1193.5616 1194.569 AVNMPGNYVGR Pumilio-like protein 1 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP86744.1

1673.7136 1674.721 LVSWYDNEWGYSR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Diplodia corticola Protein Pilot 99% A0A1J9R8I0

1053.5096 1054.517 FVELYMPR Pyruvate decarboxylase Diplodia corticola Protein Pilot 99% A0A1J9R1X2

2306.1357 2307.143 KPYVLPVPFQNVLNGGSHAGGR enolase Diplodia corticola Protein Pilot 99% A0A1J9RUF2

1382.7677 1383.775 ATGGQIVLLENLR Phosphoglycerate kinase Diplodia corticola Protein Pilot 99% A0A1J9RAW6

1601.8247 1602.832 ARARAATTELDSNAR epidermal growth factor receptor substrate 15-like Diplodia corticola Protein BLAST 100% XP_020129707.1

2367.0437 2368.051 DGVKVYDFLPMQTVVNATVVR conidiation-specific protein (con-13) protein Diplodia corticola Protein BLAST 100% XP_020128865.1

1655.6816 1656.689 RSSDPSSPPQSPEER hypothetical protein BKCO1_300072 Diplodia corticola Protein BLAST 100% XP_020134487.1

1440.7556 1441.763 SDRVSVDPAKVIR 10-deacetylbaccatin III-10-O acetyltransferase Lasiodiplodia theobromae Protein Pilot 99% A0A0D4BT92

1440.7556 1441.763 LSESDIRPDRIR LasS1 (Lasiodiplodin) Lasiodiplodia theobromae Protein Pilot 99% X4YI58

1382.7677 1383.775 LTIGNPGLLDTLR LasS1 (Lasiodiplodin) Lasiodiplodia theobromae Protein Pilot 0.20% X4YI58

1382.7677 1383.775 LDDALRDGDSIR LasS1 (Lasiodiplodin) Lasiodiplodia theobromae Protein BLAST 100% AHV78245.1

1351.6857 1352.693 EFKPVNQKPRR LasS2 (Lasiodiplodin) Lasiodiplodia theobromae Protein BLAST 100% AHV78247.1

1382.7677 1383.775 QDNGGVVLLENLR Phosphoglycerate kinase Togninia minima Protein Pilot 99% R8BAM1

1647.7806 1648.788 LGDVYINDAFGTAHR Phosphoglycerate kinase Togninia minima Protein Pilot 94.50% R8BAM1

1673.7136 1674.721 LVSWYDNEWGYSR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Togninia minima Protein Pilot 97.30% R8BM12

1456.7496 1457.757 VPTSNVSVVDLTAR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Togninia minima Protein Pilot 80.90% R8BM12

1101.5797 1102.587 GQKLADNSNR Putative Zn 2cys6 transcription factor protein Togninia minima Protein Pilot 99% R8BE84

1354.6866 1355.694 RYQAQELGENM Putative cortical actin cytoskeleton protein asp1 protein Togninia minima Protein Pilot 99% R8BHX7

1868.8436 1869.851 QLEEQQAAYYVRQSR putative phosphorus acquisition-controlling protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007914704.1

1440.7556 1441.763 LAISKETIAINLR putative cleavage and polyadenylylation specificity protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007916345.1

1501.7777 1502.785 RYTLDVVQQPKR putative developmental regulator protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007914683.1

1790.8947 1791.902 LSTSQEEEEPITLSTK putative surfeit locus protein 6 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007913292.1

2151.8887 2152.896 GDVMIRDLRLWHAGMPNR putative phytanoyl- dioxygenase protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007919464.1

2400.0896 2401.097 AEMEAFLTKYSQSYFGNDKR putative vps52 sac2 family protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007918651.1

2673.2666 2674.274 EIPEFTNNIAMESIKMATDPEHR putative short chain dehydrogenase protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007916810.1

2414.0818 2415.089 EAPPEQMVFYEAANDSAMEER putative serine threonine protein kinase protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007918280.1

2367.0437 2368.051 RKDVWNLLTAMSEYLICVR putative upf0171 domain protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007918350.1

1779.9797 1780.987 KGPGSTTNSDKNMSAER putative fibronectin type III domain-containing protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007916911.1

2400.1157 2401.123 TESAIRLTHIPSGTVVSMQDSR putative peptide chain release factor 1 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007912665.1

1518.6277 1519.635 MMEGFARDVMER putative dna-binding protein smubp-2 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007916178.1

2934.1746 2935.182 IMTDAVTGQSRGYGFVRFAEEGDQQR putative trna selenocysteine-associated protein 1 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007911032.1

1481.7537 1482.761 SQKWGQPHCQAR putative dipeptidyl-peptidase 3 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007913215.1

1318.6997 1319.707 IQDSQDELQSR putative rho-gtpase-activating protein 8 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007917645.1

1300 1440 1580 1720 1860 2000

Mass (m/z)

3.9E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - I.B 30-05-17 USO COMUN; Run #3; Label A21

1869.8512(R12128,S373)

1836.9015(R11737,S338)

1648.7639(R11858,S292)

1441.7632(R10351,S265) 1773.8778(R12713,S245)

1767.9629(R13238,S208)1542.7542(R9729,S169)

1674.7146(R13569,S138)1544.7465(R11848,S64) 1756.8530(R16619,S112)

1855.8507(R14012,S106)

1541.7761(R11781,S97)1631.7657(R12218,S60)

1909.9163(R15491,S52)1821.8560(R15644,S56)1390.6731(R11577,S58) 1690.8185(R10993,S55)

LSESDIRPDRIR

A

1600 1700 1800 1900 2000 2100

Mass (m/z)

3.3E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - I.B 30-05-17 USO COMUN; Run #3; Label B7

1780.9872(R11900,S518)1648.7882(R11107,S468)

1707.8331(R14004,S290)1836.9091(R14089,S183)

1722.8956(R14358,S155)1835.9014(R13722,S146)

1674.7335(R13503,S93)2027.9769(R18624,S72)1773.8929(R13138,S79)

Los espectros de masas muestran los picos de intensidad detectados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF A) El pico 1441.7632 (m/z) representa la secuencia que

corresponde a LasS1, una enzima relacionada a la biosíntesis de la fitotoxina lasiodiplodin de Lasiodiplodia theobromae. B) El pico 1780.9872 (m/z) representa la secuencia quecorresponde a una putative fibronectin type III de Phaeoacremonium minimum.

KGPGSTTNSDKNMSAER

m/z

m/z

B

Lasiodiplodia theobromae

Phaeoacremonium minimum


699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0

Mass (m/z)

6.4E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - 0262; Run #3; Label A10

1674.7042(R11992,S1559)

1791.8805(R18077,S602)

742.3502(R7975,S379)1525.6201(R15961,S411)

819.4377(R8034,S285)1812.8606(R19722,S301)

1457.7451(R15589,S244)2193.0203(R20415,S301)795.4138(R8445,S162) 2952.2087(R19630,S543)

1478.6599(R16730,S128)892.9924(R9070,S92) 2211.0059(R22640,S114)1808.8740(R20638,S54)

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

Mass (m/z)

2.8E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - I.B 30-05-17 USO COMUN; Run #3; Label A20

1054.5167(R8043,S302)

2110.9746(R13364,S168)

2369.0544(R14882,S368)

1351.6179(R8684,S207)

1368.6460(R7818,S152) 2266.0593(R15469,S229)

970.4475(R8124,S114)2211.0598(R16318,S135)877.0206(R9624,S92)

2071.0396(R16568,S117)1070.5060(R8606,S71)2415.1741(R22230,S125)1738.8594(R13056,S84)

1674.7378(R11208,S64) 2814.3533(R16658,S121)

EYAAEAIQGSRR

B

A

LVSWYDNEWGYSR

LEKGASYDEIKQTI

m/z

m/z

Botryosphaeria parva

Macrophomina phaseolina


Los espectros de masas muestran los picos de intensidad detectados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF A) El pico 1351.6179 (m/z) representa la secuencia que

corresponde a la enzima relacionada a la síntesis Cercosporin de Botryosphaeria parva B) El pico 1674.7042 (m/z) representa la secuencia que corresponde a una enzimaGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase de Macrophomina phaseolina.


Actividad Glicolítica

21%

Actividad Catalítica

10%

Actividad Oxido-

Reductasa

10%

Trasducción de Señal

5%

Traducción

5%

Transcripción

5%

Proceso Co-enzimatico

3%

Unión a ATP

3%

Unión a ADN

2%

Unión a ARN

2%

Transportador

Transmembrana

2%

Otras funciones (< 1%)

17%

No determinada

15%

Gráfico que representa la clasificación de las proteínas fúngicas de acuerdo a su proceso biológico y/o función molecular, mostrando diferencias en porcentajes.

Análisis mediante MALDI-TOF MS

Análisis de lipopéptidos antifúngicos

Cultivo dual

L. theobromae – Bacillus

sp. M1 strain

3 y 4. Análisis metabolómico de Bacillus sp. contra Lasiodiplodia theobromae por espectrometría de masas MALDI-TOF y MS IMAGING


1

23

4

1

2

B

A

1040 1054 1068 1082 1096 1110

Mass (m/z)

2810.5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - lasiodiplodia-IB-24-01-17; Run #8; Label C11

1081.4435(R10803,S578)

1095.4564(R10670,S323)

1043.4814(R9836,S228)

1065.4725(R11335,S181)

1057.4961(R9625,S110) 1093.4923(R11127,S94)1071.5104(R9940,S89)1079.4830(R10837,S83)

1400 1432 1464 1496 1528 1560

Mass (m/z)

6745.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - lasiodiplodia-IB-24-01-17; Run #12; Label D17

1501.7832(R10688,S1091)

1463.8053(R10500,S727)

1487.7798(R10337,S493)

1515.8024(R10902,S487)

1449.7898(R10916,S304) 1529.8131(R11119,S378)1477.8159(R11442,S305)

1491.8278(R10701,S237)1473.7651(R9612,S191)

1435.7766(R12026,S136)1499.8138(R11928,S140)1471.7955(R10862,S123)

1457.7777(R10691,S55)

m/z

Cultivo dual mostrando la

inhibición de L. theobromae

por Bacillus sp. M1

Confirmación del gen

Fengyncin por PCR

M1 M1* M2 M2* A1 A1*

M1 M1* M2 M2* A1 A1*

Confirmación del gen Iturin por

PCR

A) Los picos 1463.8053 (m/z) y 1529.831 (m/z) representan la m/z de los lipopéptidos antifúngicos que corresponden a Fengycin (fleche roja) y Mycobacillin (fleche azul),

respectivamente. B) Las flechas rojas representan las masas de isoformas de Iturin de la cepa de Bacillus sp. M1.


m/z

A) Distribución especial de Mycobacillin (m/z = 1529.64) presente en un medio solo

con la cepa de Bacillus sp. M1 como control (izquierda); distribución especial de

Mycobacillin (m/z = 1529.64) presente en la interacción de Lasiodiplodia theobromae -

Bacillus sp. M1 mostrando una mayor intensidad. B) Distribución especial de Fengycin

(m/z = 1463.91), los resultados son similares a los de Mycobacillin.

Visualización de los metabolitos de la zona de inhibición mediante

MS IMAGING

B

A

Zona de inhibición

Análisis Metabolómico mediante MS IMAGING


Cultivo dual mostrando la inhibición de L.

theobromae por Bacillussp. M1

Conclusiones

1. Este estudio, ha podido revelar la presencia de las GTD en las condiciones de Piura. Botryosphaeria dieback y Petri

disease (young Esca) han sido confirmadas en este estudio como establecidas en los viñedos piuranos afectando de

manera seria y con amenaza de propagarse rápidamente si no se toman medidas urgentes.

2. Por primera vez fue revelada la comunidad microbiana asociada a los tejidos de la madera de vid mediante

metagenómica. Las comunidades bacterianas están interactuando con los hongos asociados a las GTD, algunas de ellas

son marcadoras de plantas sanas y enfermas, lo cual permitiría responder a las cuestiones de cuál es el rol de las bacterias

en una enfermedad que ha sido considerada por mucho tiempo netamente fúngica. Sin embargo queda mucho por

investigar.

3. Este trabajo, reporta por primera vez, 4 nuevas especies de hongos patógenos asociados a GTD en Piura, Peniophora

sp., por secuenciamiento ITS y Macrophomina phaseolina, Diplodia corticola y Diplodia seriata por espectrometría de

masas MALDI-TOF/TOF, con esto la espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF es una tecnica potente, rápida y confiable

para la identificación de hongos patógenos de la vid.

4. Se analizaron aislamientos bacterianos candidatos para su uso en control biológico de las GTD como una cepa de

Bacillus sp. M1. MALDI-TOF/TOF y MS IMAGING han permitido analizar e identificar moléculas de interés e importancia

antifúngica, los cuales podrían tener utilidad a gran escala en la prevención de enfermedades fúngicas de la vid y otros

cultivos de importancia económica en el Perú.

Agradecimientos

A través del financiamiento de CIENCIACTIVA del CONCYTEC, se pudo presentar estos resultados en el

10th International Workshop on Grapevine Trunk Diseases en Reims, Francia.

Agradecimientos

the Dorrestein Lab.The Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences

The Departments of Pharmacology, Chemistry and Biochemistry

10th

INTERNATIONAL WORKSHOP ON GRAPEVINE TRUNK DISEASES

¡Muchas Gracias!

I EBP-E

Biotecnología del Limón Citrus aurantifolia

Ing° James Leigh / M.Sc. Aimi Nouchi

SOMATITO EIRL INCABIOTEC SAC

Producción de limón en Sudamérica(2014)

Otros14% Loreto

4%

Tumbes7%

Lambayeque19%

Piura56%

Producción de limón a nivel nacional

(2013)

5°Chile

134 161 Ton.

4°Colombia

142 859 Ton.

1°Argentina

1 402 011 Ton.

2°Brasil

1 101 799 Ton.

3°Perú

275 520 Ton.

FAOSTAT (2014)

¿Qué aplicaciones biotecnológicas se desarrollan actualmente en el cultivo de limón?

Sci. Rep. 2014

Characterization of limes (Citrus aurantifolia) grown in Butan andIndonesia using high-troughput secuencing.Penior T, Mimura T, Matsumoto R, Nagano Y.

Methods Mol. Biol. 2015

Citrus transformation using juvenile tissue explants.Orbovic V, Grosser JW.

BMC Microbiol. 2011

Identification of genes differentially expressed during interaction ofMexican lime tree infected with "Candidatus Phytoplasma aurantifolia".Zamharir MG1, Mardi M, Alavi SM, Hasanzadeh N, Nekouei MK, Zamanizadeh HR,Alizadeh A, Salekdeh GH.

Phytopathology. 2017

In Silico probe-based detection of citrus viruses in NGS data.Jooste TL, Visser M, Cook G, Burger JT, Maree HJ.

Biotecnología enfocada al diagnóstico y detección de enfermedades

ELISA (Enzyme-Linkend ImnunoSorbent Assay)

PCR (Polymerase Chain Reaction)

RT-PCR

qPCR

Multiplex PCR

IC-PCR

Técnicas Blot

Northen Blot

Western Blot

Mass Spectrometry

MALDI-TOF/TOF MS

Br. Estefanía Aimi Nouchi Moromizato M sc(c). Maestría en Biotecnología Molecular

Extracción de ARN total

Extracción de proteínasDigestión enzimáticaAnálisis espectrométricaMALDI TOF TOF

Muestras

Electroforesis de agarosa

RT-PCR

499.0 1101.4 1703.8 2306.2 2908.6 3511.0

Mass (m/z)

8.1E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - 0262; Run #3; Label A5

1465.6611(R9446,S5224)

2169.8206(R15270,S3145)

898.3604(R9091,S2025)

1964.7795(R16241,S1597)

1275.5463(R12884,S1004)665.9846(R7437,S854)

1451.5264(R13256,S442) 3050.2285(R12866,S1224)914.3456(R9398,S352) 2279.0032(R15794,S415)506.1404(R5679,S237) 1497.5999(R12846,S130) 3066.2346(R12018,S107)

Metodología:

Detección de principales strains del virus de la tristeza de los cítricos en principales regiones productoras. (A) La Peña, Lineas: 1, strain B165; 2,strain VT; 3, strain T30, 4, strain T3; 5, strain B36 (B) Cabuyal, Lineas: 1, strain T36; 2, strain T3; 3, strain T30, 4, strain VT; 5, strain B165 (C)Matapalo, Lineas: 1, strain T36; 2, strain T3; 3, strain T30, 4, strain VT; 5, strain B165; (D) Canoas de Punta Sal Lineas: 1, strain T36; 2, strain T30; 3,strain T3, 4, strain VT; 5, strain B165.

Tabla 2. Detección de cepas por zonas productoras de limón en el

departamento de Tumbes. Provincia Distrito Sector Cepas

T36 T3 T30 VT B165

Cont. Villar Canoas de Punta Sal

+ + + + +

Tumbes Pampas de Hospital

San Jacinto

Cabuyal

La Peña

+

+

+ +

+

+ Zarumilla Matapalo

+ + + + Predominancia de genotipos VT y T3, relacionadas al

síntoma de acanaladura de la madera.

Genotipaje de cepas de CTV en árboles de limón sutil (Citrus aurantifolia) por RT-PCR.

Detección general de CTV en diferentes árboles

colectadas aleatoriamente en los sectores

productores de limón. Línea: 1, árbol 1; 2, árbol 2;

3, árbol 3; 4, árbol 4; 5, árbol 5.

Resultados:

Especificidad de infección

Replicación y encapsidación

viral

Resultados:

Se detectaron un total de 83 secuencias peptídicas, 41 correspondientes a 10 proteínas virales.Espectros de masas. Masas obtenidas a partir de análisis Maldi ToF, mostrando masas de péptidos detectados.

Implementación de la técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para detección viral en C. aurantifolia y T. citricida.


Espectros de masas. Masas obtenidas a partir de análisis Maldi ToF, mostrando masas de péptidos detectados.


ResistenteSusceptible

Resultados:


Silenciamiento de mecanismo de

defensa de la planta

699.0 1261.4 1823.8 2386.2 2948.6 3511.0

Mass (m/z)

4.2E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - 0262; Run #15; Label P9

1465.7288(R11392,S5040)

804.2806(R6595,S3188)

2169.9402(R16160,S1673)

1187.6431(R11030,S1398)1516.8369(R13730,S1268)

2279.1404(R14701,S840)1964.8845(R16802,S715)898.3961(R8969,S828)1275.6064(R12351,S830)3050.4275(R12189,S1226)776.2522(R7684,S544)

1546.7429(R14047,S419)1121.5824(R10758,S399) 2007.8822(R15605,S250)826.2641(R8214,S242) 2409.1440(R15228,S152)1291.6958(R10456,S140) 2892.3279(R15838,S108)

Resultados:


Fijación de partícula viral en el conducto

alimenticio del vector:

699.0 1261.4 1823.8 2386.2 2948.6 3511.0

Mass (m/z)

5419.6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - 0262; Run #15; Label O23

892.4473(R10014,S730)1687.8527(R15194,S577)

1323.6538(R12435,S572)1878.8807(R15407,S567)

1295.5205(R11938,S404)

2415.1541(R15777,S485)804.2709(R8761,S399)

1718.8400(R13539,S295)

2329.9666(R16202,S327)

1791.8627(R14752,S85)948.4609(R10136,S214) 2409.1521(R17876,S250)1181.5975(R11578,S140) 1955.8577(R16724,S147)1612.7444(R14099,S112)

2334.0420(R11920,S72)855.0306(R9308,S103) 1907.8889(R16263,S77)1579.7468(R14379,S61)1229.5784(R11564,S55)719.9170(R7455,S62)

2742.2144(R16302,S77)

Resultados:

Gráfico representativo basado en la funcionalidad de las proteínas detectadas mediante secuencias

peptídicas por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF en plantas de limón sutil.

Análisis de secuencias peptídicas correspondientes a proteínas vegetales.

22 secuencias peptídicas propias de C. aurantifolia fueron detectadas

correspondiendo a 12 posibles proteínas.

Implementación de la técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para detección viral en C. aurantifolia.

Resultados:

Secuencias peptídicas identificadas por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF en

C. aurantifolia y sus respectivos procesos biológicos.

Implementación de la técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para detección viral en T. citricida.

Resultados:

Se detectaron 22 secuencias, correspondientes a 19 proteínas, encontrándose 3 proteínas putativas (AAV31409.1, AAU84947.1, AAU84936.1) reconocidas en T. citricida.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/54287924?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=1&RID=M6JT8MS8015

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/52630967?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=4&RID=M6JTPTJH014

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/52630945?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=1&RID=M6JU7KN0014

Aplicación para determinación de genotipos virales.

Base de Datos: UniProt

Base de Datos: NCBI Nucleotide

Resultados:

Aplicación para determinación de especies de insecto vector.

Resultados:

Se detectaron 22 secuencias, correspondientes a 19 proteínas, encontrándose 3 proteínas putativas (AAV31409.1, AAU84947.1, AAU84936.1) reconocidas en el mismo insecto

analizado (T. citricida)

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/54287924?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=1&RID=M6JT8MS8015

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/52630967?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=4&RID=M6JTPTJH014

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/52630945?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=1&RID=M6JU7KN0014

OBTENCIÓN DE PLANTONES DE LIMÓN EXENTOS DE PATÓGENOS Y

COLONIZADOS POR MICROORGANISMOS NATIVOS

BÉNEFICOS DE LA RIZÓSFERA.

PIMEN-12-P-237-039-16/ GANADOR

COMPONENTE 1 COMPONENTE 2

Estandarización de técnicas moleculares de detección. Estudio y Aislamiento de microrganismos nativos de la rizósfera de limón.

COMPONENTE 3 COMPONENTE 4

Evaluación de propiedades benéficas de microorganismos aislados. Obtención de plantones sanos y colonizados por microorganismos benéficos.

GRACIAS

Laboratorio de Micología y BiotecnologíaUniversidad Nacional Agraria La Molina, Perú

Primer Encuentro Binacional

Biotecnológico

La Biotecnología en el Perú

“Lo nuevo y lo desconocido son el motivo de la investigación y de la ciencia;

el científico no teme a lo nuevo y a lo desconocido, lo enfrenta, lo clarifica, lo

explica, abre camino”

Los primeros pasos…

Marcel Gutiérrez Correa (1952-2017)

1984 Primer Curso Nacional de

Biotecnología y publicación del libro

“Principios de Biotecnología”.

1986 Presidente de la Primera Comisión

Nacional de Biotecnología, creada por

CONCYTEC-

1987 Primer Plan Nacional de

Biotecnología.

M. Gutiérrez-Correa, Perú Económico, Enero 2007.

Economía basada en la biotecnología que

usa materias primas renovables,

particularmente biomasa y recursos

genéticos para producir alimentos,

productos y energía al menor costo

ambiental y con la mayor rentabilidad.

La inserción de la biotecnología en la economía mundial ha

dado lugar a La Bioeconomía, en la que los genes y los

procesos de base biológica son los elementos

fundamentales.

Materia prima agrícola convencional Biomasa

Procesos

químicos y

termoquímicos

Combustibles Plásticos (Bio)químicos BiomaterialesAlimentos

Los hongos filamentosos

como sistemas productivos

Biotecnología Industrial

ácidos orgánicos, proteínas,enzimas, metabolitossecundarios

Biotecnología

Médicacompuestos bioactivos,

biofármacos

Ventajas:

•Versatilidad metabólica

•Sistemas robustos

•Alta capacidad de secreción

•Fuentes de nuevos genes

Biotecnología

Agrícola compuestos bioactivos,

biofármacos

Biotecnología

AmbientalEnzimas, degradación de

xenobióticos

Prioridades de investigación

Crecimiento, diferenciación y expresión génica, asociadas a

productividad.

Uso de tecnologías de alto impacto para prospección, tamizado y

clonamiento.

Uso de herramientas de biología sintética y edición génica para

manipulación y re diseño de genomas de hongos.

Desarrollo de cepas mejoradas en producción y secreción de

proteínas.

Obtención de cepas inocuas mediante optimización de genomas.

Entendimiento de patogénesis en diferentes hospederos y

grupos filogéneticos incluyendo el establecimiento de modelos de

infección.

Desarrollo de estrategias para obtención de nuevos compuestos

antifúngicos.

Formulación

Formulación

Bioprospección

Genómica

Funcional

Biología

Sintética

Ingeniería

Genómica

Aislamiento de genes para enzimas y vías

metabólicas a partir de metagenomas y de

especies

Análisis transcriptómico y proteómico global –

Expresión diferencial de genes – Análisis de

vías metabólicas

Diseño y construcción de factorías celulares

para etanol celulósico, enzimas y proteínas

recombinantes

Sistemas de Adhesión a Superficies

Optimización de

bioprocesos

Desarrollo de

Bioprocesos

Ingeniería

Biológica

Producción y uso de enzimas – Modelamiento

matemático – Diseño de biorreactores

Uso de herramientas genómicas en

optimización – Estrategias de respuestas de

superficie

Producción de etanol y otros metabolitos –

Sistemas de muy alta gravedad (VHG)

Líneas Áreas Temas

Líneas de Investigación del Laboratorio de Micología y Biotecnología

al 2021

Bioprospección celular de hongos con capacidades

metabólicas específicas

Ambiente Aislamiento Tamizado

cualitativo

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500

pH4.8 pH7.4 pH8.4 pH9.4

Endoglucanasa

Cultivo y

cuantificación de

actividad (enzimas

o metabolitos)

Secuenciamiento de genomas de cepas con

distintas capacidades enzimáticas

• Aspergillus fumigatus LMB-35Aa, Accession PRJNA298653, native

• Talaromyces wortmannii LMB-HP14, Accession PRJNA300345, native

• Aspergillus niger ATCC 10864, Accession PRJNA300350, culture collection.

C

BL

CB

M

CB

X

A heat map of some selected genes expressed in

different media grown Biofilms

Identification of different CAZymes family in

different media

AA= Auxiliary

Activities

GH= glycoside

hydrolases

CE= carbohydrate

esterases

PL= polysaccharide

lyases

GT=

glycosyltransferases

CBM= carbohydrate-

binding modules

Optimización de procesos asistida por herramientas de

genómica funcional: Transcriptómica de biopelículas

IEFSDS

PAGE

Mr

2D-PAGE and MS-Tof

analysis of Aspergillus

niger biofilms – Villena

et al. (2009) RPB 16(1):

101-108.

Differential expression of Genes in different media grown biofilms during Oxidative phosphorylation

Diseño de reactores de biopelículas simples y mixtas

Biofilm

Búsqueda de celulasas alcalinas para procesos de acabado textil:

Electroforesis en gel de agarosa 1% de productos de PCR

purificados para 18S e ITS. Carril 1, marcador Lambda

HindIII; 2, cepa LMHP32 para 18S; 3, cepa LM-HP33 para

18S; 5, LM-HP37 para 18S; 7, cepa LMHP32 para ITS, 8,

cepa LMHP33 para ITS; 9, cepa LMHP37 para ITS.

Identificación molecular (18S e

ITS)

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

Act.

En

do

glu

can

asa

(U/m

l)

Cepas

pH4.8

pH7.4

pH8.4

pH9.4

Genome characteristics of alkaline cellulase producing Ascomycota strains

LMB-35A isolated from soils of the Peruvian Amazonian Forest

Characteristic Aspergillus fumigatus LMB-35Aa

Place of isolation Tingo Maria Forest (Peru)

Contigs Generated 234 (19)

Maximum Contig Length (MB) 2.52

Assembled Genome Size (MB) 27.56 (29.4)

N50 value 0.726

Total Predicted Proteins 8,660 (9,926)Total Annotated Proteins 8,617 (6,638)Total Unannotated Proteins 43 (3,288)

Secondary metabolism gene clusters

33 (26)

Secondary metabolism genes 57 (36)

CAZymes genes 173

Accession (Bioproject, NCBI) PRJNA 298653

Data in yellow is from the clinical strain Aspergillus fumigatus

Af293 (Nature 438, 1151-1156, 2005).

0.00

1.00

2.00

3.00

40 50 60 70

En

zym

e a

cti

vit

y (

U/m

l)

Temperature (ºC)

Endoglucanase at pH 9.4

Important for the textile industry

Sample Total

number of

raw reads

Total

processed

reads

LMB-35A 2*13799222

(27.59

Million)

2*13299739

(26.59 Million)

Búsqueda de hongos decoloradores de tintes azoicos reactivos:

Ascomicetos

Tamizado en microplacas

:LA: levafix amarillo

ST: Sinosol turquesaSA: Sinosol amarillo

LR: levafix rojoRN: remazol negroAB: azul brillanteRR: remasol rojo

RP: rojo profundo

Análisis molecular (PCR)

de la diversidad

metabólica (lacasas) para

decoloración de tintes

azoicos

Bioreactor paratratamiento de efluentes textiles con

Trametes polyZona LM-TM5

Biofilm 0 h

96 hPreapring

Bioprospección molecular para búsqueda de genes

de enzimas

Diversidad microbiana

Transformación

Aislamiento del metagenoma

Vector de ligamiento

ADN Metagenomico

Transformantes

Bam HI Sau 3 A

Tamizado de recombinantes

Secuenciamiento

0

1

2

3

4

5

BG EG CBH EX

B¿usqueda de genes de celulasas y xilanasas

BG: beta 1-4 endoglucanasa

EG : endoglucanasa

CBH: celobiohidrolasa

EX: endo beta 1-4 xilanasa

0

1

2

3

4

5

6

7

8

EX endo beta xilanasa

xys A beta 1, 4 xilanasa

CBH II celobiohidrolasa

xyn A xilanasa

xyn B xilanasa

xyn D xilanasa

CBH I celobiohidrolasa

endo 1 endoglucanasa

eg1 endoglucanasa

Endoxyl xilanasa termoestable

Fuentes

termales

Suelos de

bosque

b

.

a

.

c

.

d

.

Clones

recombinantes

(E.coli) con genes de

celulasas y xilanasas

Construcción de factorías celulares de levadura para

etanol usando biología sintética

eglA

eglB

eglC

cbhB

cbhA

bgl1

Factoría celular LMB-Cel (7 genes)

Promoter-based gene assembly and simultaneous overexpression (PGASO)

xynA xynB zeoxynD

XIII ku7

0

Saccharomyces cerevisiae

Factoría celular LMB-Xyl (8 genes)

Cel

Xyl

LMB

Cel/Xyl

Barajado

genómico

Celulosa Hemicelulosa

ETANOL

Xilanasas

(15 genes)

Plataforma Proceso Método Producto(s)

Aspergillus fumigatus

LMB-35Aa

Edición genómica –

knockout de genes

toxinas

Transcriptómica

CRISPR/Cas9 Celulasas

Alcalinas

Poceso

optimizado

Trametes polyzona

LMB-TM5


inserción de genes

CRISPR/Cas9 Lacasas

Talaromyces

wortmannii LMB-

HP14


knockout de genes

toxinas

CRISPR/Cas9 Celulasas

Alcalinas

Saccaromyces

cerevisiae


knockout e inserción de

genes

CRISPR/Cas9 Lacasas y

Celulasas

Alcalinas

Saccaromyces

cerevisiae

Ingeniería metabólica Biología sintética -

PGASO

Etanol

T. polyzona-T.reesei-

A.niger

Biopulpeo y

Fermentación en

estado sólido

Trancriptomica

Proteómica –

Optimización

genómica

Celulasas

Algunas investigaciones sobre ingeniería genómica en el

Laboratorio de Micología y Biotecnología (UNALM)

Equipos e infraestructura

Proteómica y metabolómica:

1 HPLC Infinity 1260 (Agilent) – IR

1 UHPLC Bioinert (Agielnt) – DAD con colector de fracciones

y acoplable a detector MS-TOF

1CE (electroforesis capilar) – DAD – TOF (Agilent)

1 Sistema de enfoque isoeléctrico y 2D PAGE

1 Sistema de ultrafiltración tangencial

1 Ultracentrífuga 250,000g

1 Liofilizador de 6L

1 Cuarto frío a 4ºC

Genómica Estructural, Transcriptómica y Metagenómica:

1 Secuenciador Illumina MiSeq

1 Bioanalizador (Bioanalyzer, Agilent)

1 Termocicladores de tiempo real (BioRad)

3 Termocicladores (BioRad)

2 Sistemas de electroforesis PAGE

3 Sistemas de electroforesis horizontal

1 Sistema DGGE

1 Analizador de imágenes ChemiDoc (BioRad)

3 Microcentrífugas refrigeradas

Bioinformática:

1 Servidor Supermicro de 384 GB de RAM (ampliable a 1

TB), Tarjeta GPU Tesla K40, Tarjeta Nvidia K4200 y 28 TB de

almacenaje.

Fermentaciones

5 biorreactores de tanque agitado

1 biorreactor air-lift

1 biorreactor de película de discos giratorios

5 Baños agitados

1 Incubador walk-in

Microscopía:

1 Microscopio Laser Confocal de Barrido (Olympus)

1 Microscopio de fluorescencia

1 Microscopio Confocal RAMAN acoplado a Fuerza Atómica

Gretty K. Viilena, Ph.D.

[email protected]

Ilanit Salmolski Klein, Ph.D.

[email protected]



Desarrollo de la

biotecnología

microbianaDra. María Valderrama Valencia

Universidad Nacional de San Agustín

INICIO

Universidades;

Curso: Microbiología, en diferentes carreras

Sociedad Micobiológica 2007 SPC-PENI. Salud

Enfermedades Infecciosas,

microbiología de alimentos y medio ambiente (salud).

Qué permite el desarrollo

Necesidades

Conocimientos

Teóricos

Tecnológicos

Asociación entre diferentes especialistas: Multidiciplinariedad

Políticas Nacionales, Regionales

Hacia donde se apunta

Academia

DIAGNÓSTICO

VACUNAS PROTEOMICA PROBIOTICOS

METABOLICA

BIORREMEDIACIÓN

BIOCOMBUSTIBLES

BIOMATERIALES

Empresa

San Fernando 2008

FARVEST tramite

Cayetano

Hersil

Pesquera diamante

ECOSAC AGRICOLA

Somatito SAC

INCABIOTEC

CITBM

Futuras empresas

Laive

Gloria

Alcoholicas: Vinos, cerveza, productos energizantes

Detergentes

Producción de Vitaminas y complementos

Nuevos antibioticos

Academia

Solubilización del Fosforo

Cualitativa

Cuantitativa

Siembra en agar SRSM Cepas solubilizadoras

de fosforo

Siembra en medio

Pikouskaya

Medición del halo de

solubilización

𝑯𝑯𝑯 = 𝑯- 𝑯

Halo de Solubilización

del Fósforo.

Producción del Acido Indol Acético (AIA).

Cualitativa

Cuantitativa

y = 0.0166x + 0.0162R² = 0.992

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 20 40 60

Abso

rvancia

530 n

m

Concentración de AIA (ug/ml)

Curva de calibración para cuantificar la producción de AIA.

El reactivo de

Salkowsky vira a un

rojo grosella

Cepas que evidencian la

producción de AIA

Cepas creciendo en el

caldo BCuantificación de la

producción de AIA.

Capacidad antagónica frente a Fusarium oxiosporum.

3 cm. 3 cm. 3 cm.

Siembra masiva

del

actinomiceto

Placa de enfrentamiento Placa control

Siembra de un disco

de micelio del hongo

patógeno

Fusarium oxiosporum Enfrentamiento

Actinomiceto Vs

Fusarium.

Mediciones periódicas Se calcula el

porcentaje de

inhibición del

crecimiento del

patógeno

%I = x100%

Los análisis de cobre en la solución “lixiviada” de los biorreactores, arrojaron concentraciones de 10,494 g de

Cu/Kg de mineral en el Biorreactor 1 y de 9,916 g de Cu/Kg de mineral en el Biorreactor 2, ambas, mayores a

la concentración de cobre obtenida por el proceso de lixiviación química de minerales de baja ley en la mina

Cerro Verde (aproximadamente 6 g de Cu/Kg de mineral).

En el mercado Nacional: Agricultura

LOGROS SE ALCANZAN

EN EL TRABAJO EN EQUIPO

LA MULTIDICIPLINARIEDAD

I Encuentro Bi-Nacional Biotecnológico Ecuador-Perú

“VALORIZACIÓN microbiológica de desechos pesqueros acuícolas y

agroindustriales”

Un solo norte, un solo objetivo: Biotecnología

Luis Aldo López Luna M.Sc

Yajaira Tatiana Toribio Delgado M.Sc.

MICROORGANISMOS

“VALORIZACIÓN microbiológica de desechos pesqueros acuícolas

Luis Aldo López Luna M.Sc

SITUACIÓN PROBLEMATICA

Hidrolizados.

Mejor alternativa.

Hidrolizado microbiológico

ALTERNATIVAS

METODOLOGIA

Aislamiento

Pruebas enzimáticasPoder AcidificanteSecuenciación

molecular

Multiplex PCR

Metagenomica

Análisis de péptidos

RESULTADOS

C-0 C-3 C-6 E3-3 E3-6 2A1-3 2A1-6

C-0 C-3 C-6 E3-3 E3-6 2A1-3 2A1-6

E3-3 2A1-3E3-6 C-32A1-6 C-6

19 %20 %

PRODUCTOS APLICACIONES

Masificación de

consorcios bacterianos.

Degradadores de Cianuro,

controladores de nematodos y

probioticos para cerdos y pollos

Bioferlizantes y

bioestimulante para plantas

Arroz, uva (vid) y bananos.

Fuente de alimento

Langostinos, peces, cerdos y pollos

VALORIZACIÓN microbiológica de desechos agroindustriales

VALORIZACIÓN DEL BAGAZO DE LA CAÑA DE AZÚCAR

Yajaira Tatiana Toribio Delgado M.Sc.

¿CÓMO NACE ESTA IDEA?

ALIANZA ESTRATÉGICA

PRODUCCIÓN DE ETANOL AGRICULTURA ACUICULTURA

Caña de azúcar Etanol

370 mil litros de etanol por día4300 toneladas diarias de caña

PROCESO DE TRANSFORMACIÓN

INDUSTRIAL

BAGAZO DE LA CAÑA DE AZÚCAR

Bagazo de la caña de azúcar

¡Alto contenido de carbono!

COMPONENTE %

Celulosa 32-44

Hemicelulosa 27-32

Lignina 19-25

RESIDUO

LIGNOCELULOLÍTICO

COMPOST

El compost es uno de los mejores abonos orgánicos que

se puede obtener en forma fácil y que permite

mantener la fertilidad de los suelos con excelentes

resultados en el rendimiento de los cultivos.

•Mejora aireación del suelo

•Mejora porosidad del suelo

•Aumenta la capacidad de carga

•Consolida la estructura del suelo y su

consistencia.

•Aumenta la actividad biológica.

•Aumenta capacidad de intercambio

catiónico.

•Sirve para la supresión de enfermedades

causadas por patógenos de plantas que se

transmiten por el suelo.

Beneficios a los cultivos

El compostaje es un proceso controlado de

descomposición que transforma los materiales de

desecho crudos en sustancias húmicas establesque hacen una excelente enmienda para el suelo.

MICROORGANISMOS

Complejo enzimático

Lynd et al. (2002)

Bagazo

Dashtab et al. (2015)

Nivel biológico Nivel experimental

CO

MP

LE

JID

AD

ES

TR

UC

TU

RA

L D

E L

A

LIG

NO

CE

LU

LO

SA

BIOPROSPECCIÓN

Explorar la diversidad microbiana

Capacidad metabólica de degradar de manera eficiente el bagazo de la caña de azúcar, un

residuo altamente complejo.

Valorizar

N2

pH

Pi

HIBIOCA

MICROORGANISMOS BENÉFICOS

AGUA

AGUA

ESTIERCOL

PROCESO CLÁSICO CON BIOTECNOLOGÍA

COMPOST MEJORADO

¿QUÉ SE HA LOGRADO?

Bioprospección:

1. Aislamiento de

bacterias de

diferentes fuentes

Bagazo de caña de azúcar

Suelos prístinos

Cascarilla de arroz

Larvas de Bothynus maimon

Larvas de Diatraea saccharalis

Termitas

102 bacterias aisladas

CASCARILLA DE ARROZ (21 BACTERIAS)Código Bacteria CMC AVICEL BAGA

ZO1B Staphylococcus sciuri DSM 203452B Staphylococcus sciuri DSM 203453B Pantoea ananatis AJ 133554B Klebsiella oxytoca KCTC 16865B Pseudomonas cremoricolorata

NBRC 166346B Klebsiella oxytoca KCTC 16867B Raoultella planticola NBRC 149398B Plautia stali (simbionte) 9B Klebsiella oxytoca KCTC 1686

10B Acinetobacter baumannii ATCC 17978

+ +

11B Plautia stali (simbionte) +12B Plautia stali (simbionte) 13B Plautia stali (simbionte) 14B Kosakonia cowanii 888-76 +15B Pantoea ananatis AJ 13355 +16B Plautia stali (simbionte) +17B Plautia Stali (simbionte) +18 B Lysinibacillus macroides LMG

1847419 B Enterobacter kobei CIP 10556620 B Plautia Stali (simbionte)21 B Klebsiella oxytoca KCTC 1686

Diatraea saccharalis (27 BACTERIAS)

Código Bacteria CMC AVICEL BAGAZO01 MDS Enterobacter sp. + +

02 MDS Klebsiella variicola +03 MDS Enterobacter sp. +04 MDS Klebsiella variicola + +05 MDS Enterobacter sp. + + +06 MDS Enterobacter sp. + +07 MDS Uncultured Bacillus sp. + +08 MDS Enterobacter sp. + +10 MDS Enterobacter sp. + +11 MDS Enterobacter sp. +12 MDS Enterobacter sp. + +16 MDS Massilia timonae17 MDS Staphylococcus warneri18 MDS Staphylococcus sp. 20 MDS Sporosarcina koreensis21 MDS Lysinibacillus sphaericus26 MDS Lysinibacillus sphaericus +

27 MDS Bacillus subtilis + +

Identificación molecular, a través del gen 16S ADNr, de bacterias aisladas y determinación de la la actividad celulolítica

2. Caracterización

molecular de

bacterias aisladas

3. Determinación de

actividad celulolítica

de las bacterias

aisladasIdentificación molecular y determinación de la la actividad celulolítica cualitativa

BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR (8 BACTERIAS)Código Bacteria CMC AVICEL BAGAZO

BBC 1 Klebsiella pneumoniae strain VITP2 + +BBC 2 Klebsiella pneumonae +BBC 3 Enterobacter asburiae strain CAV1043BBC 4 Klebsiella variicosaBBC 5 Enterobacter asburiae strain CAV1043BBC 6 Klebsiella variicola strain DSM 15968BBC 7 Enterobacter sp. +BBC 8 Enterobacter sp +

SUELO (23/47 BACTERIAS)Código de Bacteria CMC AVICEL BAGAZO

M1.1 Bacillus firmusM2.1 Bacillus aryabhattaiM3.1 Bacillus nealsoniiM3.2 Bacillus thuringiensisM3.3 Bacillus sp.M4.1 Bacillus sp.M4.2 Bacillus spM4.3 Bacillus spM4.5 Bacillus cereusM4.6 Bacillus sp.M5.2 Enterobacter sp.M5.3 Enterobacter sp.M6.1A Planococcaceae bacteriumM6.1B Planococcaceae bacteriumM7.2 AcinetobacterM10.1 Uncultured bacteriumM12.1 Uncultured bacterium + +M14.3 Exiguobacterium sp.M15.3 Uncultured bacteriumM16.2 Planococcaceae bacteriumM17.1 Bacillus sp.M17.2 Bacillus nealsoniiM17.3 Acinetobacter baumannii

Identificación molecular y determinación de la la actividad celulolítica cualitativa

TERMITA (4/8 BACTERIAS)Código de la

bacteriaBacteria CMC AVICEL BAGAZO

4 Lysinibacillus sp - - -6 Lysinibacillus sphaericus - - -8 Lysinibacillus sphaericus - - -

23 Cronobacter turicensis + + -

BARRENADOR (8 BACTERIAS)Código de

la bacteria

Bacteria CMC AVICEL BAGAZO

9 Cronobacter turicensis + + -10 Cronobacter turicensis + + -11 Cronobacter turicensis + + -12 Staphylococcus arlettae - - -13 Cronobacter turicensis + + -14 Lysinibacillus sphaericus - - -

15 Lysinibacillus sphaericus - - -25 Bacillus sp + + -

Enterobacter, Klebsiella, Bacillus,

Streptomyces, Acinetobacter, Staphylococcus,

Lynsibacillus, Exigoubacterium, Alcaligenes,

Cronobacte, Massilia, Pantoea, Raoultella,

Kosakonia y Plautia (simbionte).

102 bacterias

aisladas 35 bacterias con

actividad celulolítica

Enterobacter, Klebsiella, Bacillus Massilia

Lynsibacillus Acinetobacter Plautia Kosakonia

Pantoea, Crnonobacter

Identificación molecular y determinación de la la actividad celulolítica cualitativa

(*)

15 bacterias presentaron las mejores actividades celulolíticas

Las concentraciones de glucosa generadas luego de degradar el bagazo de

la caña de azúcar fueron entre 1,9-2 g/l siendo:

BBC2 (Klebsiella; 2,04 g/l)

BBC8 (Enterobacter.; 2,05 g/l)

13 (Cronobacter; 2,08 g/l)

Ésta actividad es superior a la

reportada por Lara and Acosta

(2013) que lograron generar entre

0,8 g/l. Lo que muestra la alta

actividad enzimática de los

aislados

Determinación cuantitativa de la la actividad celulolítica

Consorcio bacterianocompuesto por los géneros de

Klebsiella, Enterobacter, Cronobacter,

Kosakoniacowanii, Pantoea y

Bacillus.

Sin embargo no existen referencias sobre la actividad celulolítica de Cronobacter y

Kosakoniacowanii, siendo nuestra investigación el primer reporte de estos género

bacterianos con actividad celulolítica, además, Cronobacter reportó la mejor actividad

enzimática entre todos los aislados.

Klebsiella (Su et al., 2014; Waghmare et al., 2014).

Enterobacter (Lokapirnasari et al., 2015; Su et al.,

2014; Toczyłowska-Mamińska et al., 2015).

Bacillus (Elkhalil et al., 2015; Kim et al., 2012),

Pantoea (Ma et al., 2016).

¡Actividades enzimáticas comprobadas !

¡Bacterias no-antagónicas!

Pruebas de antagonismo para verificar la compatibilidad bacteriana

699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0

Mass (m/z)

2.9E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - PLANTAS IB- 03-06-16; Run #3; Label I3

1233.5728(R7737,S862)

804.2696(R5165,S399)

1965.9257(R11695,S480)

2117.0815(R17412,S463)

1961.9446(R18119,S181)1216.7866(R6476,S120)

2729.2324(R21013,S176)1192.0782(R10077,S63)1803.8151(R17824,S90)2225.0188(R21699,S93)2807.2144(R28674,S86)3337.6228(R23171,S119)

Caracterización del secretoma por espectrometría de masas MALDI TOF-TOF

La concentración final adecuada para la masificación del

consorcio fue de 0,5% de Hidrolizado de residuos

blandos de concha de abanico y 1,5% de Melaza

El uso de melaza para masificación de bacterias ya

ha sido reportado (Ossa et al., 2010; Bae and Shoda,

2005)

Hidrolizado de residuos blandos de concha de abanico es una

fuente rica en aminoácidos que pueden ser fácilmente

asimilados por las bacterias (Hasan et al., 2003).

Determinación de las concentraciones adecuadas de HIBIOCA y melaza para el crecimiento del consorcio

H: 0.5M: 1.5

Proceso de escalamiento de la masificación del consorcio en HIBIOCA

• Pilas regadas 2 veces a la semana, durante 7 a 8

horas, por 6 semanas.

INOCULACIÓN EN LAS PILAS DE BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR

Se elaboraron 2 pilas triangulares de 190

ton cada una (1.60x1x1.20 metros)

• El bagazo de caña de azúcar se

mezcló con 0,1% de hidrolizado

de residuos blandos de concha de

abanico

• El porcentaje de humedad fue de

55%

Proceso de compostaje e inoculación del consorcio

8. Extracción y

secuenciamiento del

ADNm de las pilas de

compostaje

Características de las pilas de compostaje MEZCLA DEL CONSORCIO BACTERIANO

La sucesión de las comunidades microbianas durante el compostaje

es un clásico ejemplo de como el crecimiento y la actividad de

un grupo de organismos crean las condiciones necesarias

para el crecimiento de otros. (Agrawal et al., 2011)

La variación estructural en el tiempo puede deberse a la variación

en la disponibilidad de nutrientes (Mello et al. 2016),

¡Dinámica de degradación activa del

bagazo de caña de azúcar en el

compostaje!

Análisis de la diversidad bacteriana del compostaje de bagazo de la caña de azúcar

SCBC1: 07 días SCBC2: 35 díasSCBC3: 60 días

Recientes estudios han avalado el rol de Pseudomonas como

competidor contra patógenos en el suelo y su capacidad para

reducir los efectos directos causados por patógenos sobre la planta,

además ayudan en la promoción del crecimiento de la planta(Kyselková and Moênne-Loccoz, 2012; Erlacher et al., 2014).

Metilobacterium sp. promueve el crecimiento y desarrollo de las plantas

por producción de fitormonas (Madhaiyan et al., 2004), tiene la

capacidad de degradar compuestos multicarbonados, y además,

puede destruir eficientemente contaminantes orgánicos(Podolich et al., 2009). Ardanov et al. (2012) demostraron que

Metilobacterium sp tiene efecto sobre la resistencia a

enfermedades en la planta.

Upreti and Thomas (2015) reportaron que los géneros de

Pantoea y Enterobacter tienen una alta actividad antagónica

contra patógenos que causan enfermedades de plantas

Análisis de la diversidad bacteriana del compostaje de bagazo de la caña de azúcar

¿QUÉ APRENDIMOS?

COMPOSTAJE

PERMITE MANEJO SOSTENIBLE DE

RESIDUOS

TECNOLOGÍA BARATATECNOLOGÍA SENCILLA

CompostBagazo

¿CUÁLES SON NUESTRAS PERSPECTIVAS?

PRODUCTO DE VALOR AGREGADO

Residuos orgánicos

Residuos lignocelulósicos

Residuos solidos municipales

CONSORCIO

BACTERIANO

CELULOLÍTICO

COMPOST MEJORADO

BIOTECNOLÓGICAMENTE

Decreto Legislativo N° 1278 .- Decreto

Legislativo que aprueba la Ley de Gestión

Integral de Residuos Sólidos

Agradecimientos:

VALORIZACIÓN DE RESIDUOS: UN ENFOQUE DE LA BIOTECNOLOGÍA

HACIA EL DESARROLLO SOSTENIBLE

¡Gracias por su atención!

BIOTECNOLOGÍA PARA LA BIORREMEDIACIÓN EN EL SECTOR MINEROBlg. Melitza Cornejo.

MSc.

MINERÍA

El sector minero en el Perú es uno de los pilares de la economía peruana.

2016

Principales productores

mineros del mundo

5°

Departamentos con mayor actividad minera

PROBLEMÁTICA: Contaminación ambiental

Conflictos sociales

2

3

4 3

4

BIOT

ECNO

LOGÍ

A MIN

ERA

DEL

ORO

Cuatro campos de aplicación de biotecnología y microbiología molecular1. Bioindicadores y biosensores para la exploración

2. Procesamiento microbiano del oro

3. Biorremediación de los efluentes y suelos

4. Valorización microbiana de Topsoil

3

21

432

1

BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR PARA LA ACTIVIDAD MINERA SUSTENTABLE

(D) Quantitative xrf-maps showing the distribution ofAu, Ca, Cu, Fe, S, and Zn in an individual cell after 1 minexposure to Au(III) at pH 7.0

(A) C. metallidurans containing a Au nanoparticlein the periplasmic space

PROSPECCIÓN EXPLORACIÓN EXPLOTACIÓN Y PROCESAMIENTO

REHABILITACIÓN Y CIERRE

Aislamiento de los varios tipos de microorganismos benéficos para las plantas, mediante el uso de medios de cultivos específicos:

Bacterias fijadoras de N2

Bacterias solubilizadoras-PBacterias para resistencia stress abióticos.Bacterias para resistencia bióticosMicorrizas

1 432

BIOREMEDIACIÓN DE SUELOS Y AGUAS AFECTADOS POR ACTIVIDADES MINERAS AURÍFERAS Y ARGENTÍFERAS EN LA REGIÓN LA LIBERTAD

MEDIANTE EL USO DE UN CONSORCIO DE BACTERIAS Y/O HONGOS NATIVOS PRODUCTORES DE ENZIMAS DEGRADADORAS DEL CIANURO Y DE SUS

DERIVADOS TÓXICOS

Blg. MELITZA DE LOURDES CORNEJO LA TORRE. MSc

Convenio N° 214-FINCyT-FIDECOM-PIPEI-2014

Colegio de Ingenieros del PerúLima – 04 Abril – 2017

Aislamiento, identificación, caracterización y utilización demicroorganismos nativos degradadores del cianuro para suimplementación en procesos de biorremediación de sitioscontaminados.

Tratamiento de residuos con

cianuro

Microorganismo Fuente

Bacteria

Alcaligenes spp., Arthrobacter spp., Burkhoderia cepacia, Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa, flourescens, Psudeomonas putida, Pseudomonas pseudoalcaligenes

Babu et al., 1996; Chapatwala et al.,

Huertas et al., 2010, Luque-Almagro et al., 2011; Knowles, 1976

Hongos

Polyporus arcularius (T 438), commune (T 701), Clavariadelphustruncatus (T 192), Pleurotus eryngii (M Ganoderma applanatum (M 105), versicolor (D 22), Cerrena unicolor (D 30), Schizophyllum commune (D 35) Ganoderma lucidum (D 33)

Ozel et al., 2010

MicroalgasArthrospira maxima, Scenedesmus obliquusChlorella spp.

Gurbuz et al., 2004& 2009

TAXONOMÍA MOLECULAR Y CARATERIZACIÓN DE LOS GENES

DEGRADADORES

GENÓMICAEXTRACCIÓN DE ADN

SECUENCIACIÓN

PCR: INICIADOR CONSERVADOS

PROT

EÓMIC

A

Cultivo microbiano

Recuperación de proteínas

Electroforesis

Digestión de proteínas

Análisis MALDI

TOFTOF

Análisis de espectros de masas

PARÁMETROS DE CRECIMIENTO

pH Temperatura Concentración de inóculo Concentración CN

Cepas seleccionadas

FORMULACIÓN DE

CONSORCIOS

Consorcio seleccionado

Evaluación de degradación de CNEvaluación de crecimiento

Formulación de consorcios

Microorganismos seleccionados

Ensayo de degradación

Ensayo en laboratorio

HUAMACHUCO

Ensayo en campo

MSCN: Muestra de Suelo Contaminado con Cianuro. MSP: Muestra de Suelo Prístino. MACN: Muestra de Suelo Contaminado con Cianuro. MAP: Muestra de

MINAM (2013)

(Adams, Komen y Pickett 2001, Akcil y Mudder 2003; Luque-Almagro2005; Dasha, Gaur y Balomajumderb 2009; Deloya 2012, Luque-Almagro, Moreno-Vivia y Roldán 2016)

Análisis físico-químicos de muestras de suelo y agua

0

20

40

60

80

100

Ab

un

dan

cia R

ela

tiv

a (

%)

Metagenomas

unclassified (derived from

Bacteria)Proteobacteria

Firmicutes

Bacteroidetes

Actinobacteria

Verrucomicrobia

Acidobacteria

Planctomycetes

Spirochaetes

Tenericutes

Aquificae

Chlamydiae

Chlorobi

Chloroflexi

Cyanobacteria

Deinococcus-Thermus

Dictyoglomi

Fibrobacteres

Gemmatimonadetes

MCS01=suelos de 1 mes;

MSC02=suelo de 5 meses;

MCS03=suelo de 1 año y 5 meses;

MCS04=suelo de 3 años;

MCS05=suelos de 4 años;

MCS06=suelo de 5 años

MCS01=suelos de 1 mes; MSC02=suelo de 5 meses; MCS03=suelo de 1 año y 5 meses;

MCS04=suelo de 3 años; MCS05=suelos de 4 años; MCS06=suelo de 5 años

Crono-secuencia de la restauración natural de zonas contaminadas con cianuro y derivados tóxicos

(Kuffner, et al. 2012)(Bastida, et al. 2013) (Rastogi et al. 2010) (Huang, y otros 2011) (Li et al. 2014)

Caracterización de la microbiota aislable de agua no contaminada con

cianuro

Microbiota bacteriana (géneros) de suelo con cianuro identificadas molecularmente por amplificación del gen

16SARNr

Microbiota bacteriana (géneros) de agua con cianuro identificadas molecularmente por amplificación del gen

16SARNr

Microbiota fúngica (géneros) de suelo con cianuro identificadas molecularmente por amplificación de

Región Transcripta Interna ITS 1-4

Caracterización de la microbiota de suelos contaminados con cianuro

Microbiota de co-cultivo de suelo con cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNrMicrobiota (géneros) de suelo con cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr

Caracterización de la microbiota de suelos no contaminados con cianuro

EspeciesGéneros

Géneros

Especies

Microbiota (géneros) de suelo sin cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr Microbiota de co-cultivo de suelo sin cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr

Caracterización de la microbiota de agua no contaminada con cianuro

Caracterización de la microbiota de agua contaminada con cianuro

Microbiota de co-cultivo de agua sin cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr

Microbiota (géneros) de agua con cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr Microbiota de co-cultivo de agua con cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr

Microbiota (géneros) de agua sin cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr

EspeciesGéneros

Identificación genómica de enzimas degradadoras de cianuro presentes

en las bacterias aisladas

La identificación de la secuencia

amplificada con los iniciadores Cyn

para el gen de la enzima Cianidasa

mostró 98% de similitud con la

secuencia de una enzima degradadora

de cianuro presente en Pseudomona

stutzeri.

La comparación de la secuencia amplificada con

los iniciadores CynC para el gen de la enzima

Cianasa mostró 98% de similitud con la secuencia

de una proteína transportadora presente en la

membrana de Pseudomonas speudoalcaligenes

CECT5344 involucrada en el transporte de

cianato, una compuesto íntimamente relacionado

con el cianuro.

Análisis proteómico de las enzimas degradadoras de cianuro

Espectro de masas obtenido del análisis del exoproteoma de Pseudomonas stutzeri

Identificación de la enzima Cyanide dihydratase presente en

Pseudomona stutzeri mediante análisis MS/MS

Elaboración de un consorcio microbiano

Porcentajes de degradación de cianuro por los diferentes consorcios formulados

Evaluación del crecimiento de los consorcios formulados durante la

degradación de cianuro

Ensayos de degradación en laboratorio

Se logró reducir 99% de Cianuro Total contenido en los ensayos de laboratorio en aproximadamente 1 semana

Control Tratamiento

Monitoreo mediante metagenómica de la microbiota bacteriana durante la

degradación de cianuro en ensayos de laboratorio

Ensayos de biorremediación in situ

Se logró reducir el 97% del Cianuro Total presente el suelos a niveles inferiores a los estipulados como límites máximos permisibles para

suelos destinados a agricultura.

Monitoreo mediante metagenómica dirigida al ADNr de la microbiota bacteriana durante la

degradación de cianuro en ensayos de campo

Evaluación de la degradación del cianuro en suelos mineros

recientemente contaminados con cianuro en ensayos en campo

Monitoreo metagenómico (géneros ) de la microbiota bacteriana presente

en la poza control durante el ensayo de degradación de cianuro in situ

Variación de la estructura de lamicrobiota natural presente enpozas de lixiviación.

Presencia de uno losgéneros empleado enel consorcio formulado

Monitoreo metagenómico (géneros ) de la microbiota presente en la poza

tratada (7 días) durante el ensayo de degradación de cianuro in situ

Abundancia relativa de las especies del género Alcaligenes presentes en el consorcio eincorporadas a la poza tratada y abundancia relativa de las especies presentes demanera natural en la poza control

Abundancia relativa de las especies del género Bacilluspresentes en el consorcio e incorporadas a la poza tratada yabundancia relativa de las especies presentes de maneranatural en la poza control

Abundancia relativa de las especies del géneroPseudomonas presentes en el consorcio e incorporadas ala poza tratada y abundancia relativa de las especiespresentes de manera natural en la poza control

Diferencia de la abundancia relativa de la especiePseudomonas pseudoalcaligenes en la poza tratada ycontrol. Esta especie ha sido ampliamente reportada porestar presente de manera natural en ambientescontaminados con cianuro.

700.0 1362.6 2025.2 2687.8 3350.4 4013.0

Mass (m/z)

9.2E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 750 - SPOT SET IB I 46978 21-09-15; Run #4; Label J17

2171.0669(R11489,S560)1060.4644(R5726,S461)

2157.9968(R13768,S524)

1292.6628(R8595,S392)2174.0574(R15845,S180)

1923.8517(R16433,S133)

1414.7032(R10366,S258)1912.9540(R16392,S250)

804.2620(R6729,S202)1890.8759(R15443,S180)

2332.1450(R22636,S254)703.1559(R8158,S150)1244.6860(R9823,S151)1933.9989(R18231,S136)2969.3850(R25768,S508)1586.8043(R11871,S120)877.0223(R8201,S104)1233.5974(R9878,S94)2211.0872(R20215,S94)2616.2263(R25333,S224)1782.8215(R15373,S85)

1205.5936(R6322,S53) 2310.2856(R26731,S80)892.9864(R7529,S52) 2807.3228(R25956,S184)

2909.3718(R24930,S53)3312.3093(R32149,S68)

Resultados obtenidos:

B P

A

CONSORCIOBACILLUSPSEUDOMONASALCALIGENES

Análisis Proteómico

MALDI TOF TOF

Spectrum Best Sequence Ident Result Blast Genus

1.G10.7.1.17 IISTKVAQGIQWADVAR 100% cyanate hydrataseB

1.N22.7.1.9 PIMSKSEAAAHVDSARIRQGR 100% cyanaseB

1.H14.7.1.2 LGYRMPEGR 100% nitrilaseAB

1.L18.7.1.5 WAWLVLGTAAHLLAVGGR 100% nitrilaseBP

Análisis genómico

Cyanase

9 347 685 1023 1361 1699

Mass (m/z)

1.3E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Final - Shots 1000 - 0430 bioremediation cyanide 16-05-16; Run #7; Label H16 Prec = 1607.3361

175.1139(R1786,S1046)

1108.4966(R3743,S236)

557.1694(R2629,S227)

839.3637(R3599,S220)

822.3539(R3224,S181)

439.1706(R2542,S172)

552.2232(R3035,S134)

1237.5242(R3187,S109)670.2390(R2750,S117)

1473.2688(R4500,S78)

368.1350(R2566,S118)

642.2291(R3881,S79)

938.4326(R4469,S69)628.2839(R3431,S53)472.2379(R2779,S56)

242.1199(R2753,S174)401.2112(R2300,S50)

288.1733(R2591,S55)112.0907(R1255,S119)

72.1026(R1402,S89)

11.0268(R726,S59)

OPTIMIZACIÓN DE LA BIORREMEDIACIÓN DE CIANURO POR UN CONSORCIO BACTERIANO NATIVO CARACTERIZADO MOLECULARMENTE: ANÁLISIS TRANSCRIPTÓMICOS Y PROTEÓMICOS.

Modelamiento

Extracción de ADN de

Bacterias cultivables y

No Cultivables

“Secuenciación de próxima

generación" (NGS "Next

Generation Sequencing")

Electroforesis

ANÁLISIS METAGENÓMICO

MUESTREO

PCR

Bacterias Cultivables

Medios específicos

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BACTERIAS

REDUCTORAS DE SULFATO

Cepa referencia: : Desulfotomaculumnigrificans ATCC 19858

Purificación

Extracción ADN SRB

Estandarización de protocolos

Cebadores gen

16S ARNr y dsr

Análisis de

espectros de

masas

Identificación de proteínas por

MALDI TOF TOF

PROTEÓMICA

Evaluación en microcosmo y

mesocosmo

Biorreactor sulfidogénico

Cepas seleccionadas

Biorremediación de zonas impactadas por Mercurio orgánico e inorgánico, producto de la actividad minera aurífera

mediante un consorcio microbiano nativo

ANALISIS GENÓMICO Y METAGENÓMICO

AISLAMIENTO DE CEPAS BACTERIANAS

ANÁLISIS PROTEÓMICO ANÁLISIS TRANSCRIPTÓMICO

Amplificación del gen 16S ARNr

The Next Generation Sequencing

Extracción de proteínas, análisis en MALDI TOF 5800 y selección de

cepas.

Extracción de ARN

qRT-PCR

PRUEBAS DEL CONSORCIO IN SITU y EX SITU

Pruebas en biorreactor BIOFLO 110 tipo batch

Formulación y Selección de consorcio Aplicación del consorcio en campo, y evaluación de resultados

TOMA DE MUESTRA DE ZONAS CONTAMINADAS CON MERCURIO

HIDROCARBUROS

Resultados Preliminares:Se cuenta con : Un cepario de 45 bacterias

con potencial degradador de HC.

Análisis bioinformático de una metagenómica. Formulación un consorcio bacteriano degradador

de HC.

Los principales géneros identificados: Acinetobacter,Bacillus, Bacterium, Stenotrophomonas, Pseudomonas,Halomonas.

Caracterización de enzimas degradadoras deHC por MALDI-TOF.

Análisis de la Comunidad microbiana de zonas contaminadas con petróleo en Nieva-Amazonas mediante técnicas

dependientes e independientes de cultivo.

Objetivo: Caracterizar molecularmente la diversidad microbiana de una zona contaminada con Hidrocarburos de Petróleo en la Distrito de Nieva –

Amazonas.

EXTRACCIÓN DE ADN METAGENÓMICO de agua y suelo contaminados y no

contaminado

OBTENCIÓN DE LA MUESTRADerrame del 10 de agosto del

2016 en Nieva-Amazonas

AISLAMIENTO DE COLONIAS por diluciones sucesivas de cultivos

microbiológicos

ANÁLISIS, SECUENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN mediante el gen 16S ARNr

Se cuenta con 43 CEPAS BACTERIANAS que forman parte del cepario de

Biorremediación de Hidrocarburos de Petróleo

ANÁLISIS DE SECUENCIAS haciendo uso de diversos softwares bioinformáticos disponibles en línea.

THE NEXT GENERATION SEQUENCING

BIOTECNOLOGÌA MOLECULAR PARA LA ACTIVIDAD PETROLERA SUSTENTABLE

Consorcio de Microorganismos que tienen la capacidadde degradar el cianuro empleado en la industriaminera para la recuperación de oro y plata.

MUCHAS GRACIASBlg. Melitza Cornejo La Torre. MSc

Biotecnología Ambiental

Jr. Filipinas 241 - Tumbes

[email protected]

Telf:992204344

Skype: melitza.cornejo

“El interés científico une voluntades para encontrar respuesta a nuestros principales

desafíos”


i encuentro bi-nacional - biotecnológico

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