Download - i encuentro bi-nacional - biotecnológico
Aplicación de biotecnología reproductiva
para el mejoramiento genético de la
ganadería en el país
Blgo. Jenin Víctor Cortez Polanco
Investigador - UNTRM
I ENCUENTRO BI-NACIONAL
BIOTECNOLÓGICOECUADOR - PERÚ
Importación de Núcleo Genético de Bovinos :Angus, Brahmán, Brangus, Simmental – Fleckvieh y Jersey
UNTRM – C. Cuarentena Lurín UNTRM - E.E.
a-b/Letras diferentes en sentido vertical, indican diferencias
estadísticamente significativas (P<0.05).
Investigación realizada
Manipulación embrionaria
La UNRTM el 2015 generó losprimer nacimiento de gemeloshomocigóticos (clones) porbipartición embrionaria en elPerú, con el desarrollo demedios especializados.
Wilmut et al. (1997), ovejas, Dolly
Stice et al. (1998), vacas
Yanaguimachi et al. (1998), ratones
Diamond et al. (1999), cabras
Woods et al. (2003), mulos
Polejaeva et al. (2000), cerdos
Damiani et al. (2001), gaur
Chesne et al., (2002), conejosWesthusin et al. (2002), gatos
Galli et al. (2003), caballos
Qi et al. (2003), ratas
Westhusin (2003), venados
Lee et al. (2005), perros
Li and Engelhardt (2006), hurones
Gómez et al. (2005) gatos salvajes
Línea celular
Reconstruidos
os cultivados Clivaje
(%)
Blastocistos
Embriones
(%)
Reconstruidos
(%)
Fibroblastos de
de piel97
79.5 ± 5.1a
29.0 ± 8.4a 65.8 ± 6.8a
Células del
cumulus91
80.7 ± 5.4a
27.9 ± 10.1a 86.9 ± 7.9b
Cuadro 2. Desarrollo de los embriones mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) tras su
reconstrucción con dos líneas celulares en bovinos.
RESULTADOS
a,b Superíndices diferentes dentro de columnas indican diferencia estadística (p<0.05), se aplicó una prueba t de Student
Células usadas para la
reconstrucción
Embriones
transferidos (n)Receptoras
(n)
Permanencia
Día 28
(n)
Día 60
(n)
Día 75
(n)
Fibroblastos de piel3 2 2/2 1/2 1/2
Células del cumulus4 4 2/4 2/4 1/4
Cuadro 3. Gestaciones establecidas tras la transferencia de blastocistos clonados obtenidos mediante
transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) utilizando dos tipos de líneas celulares en bovinos.
RESULTADOS
APLICACIONES
Biotecnología y
Biomedicina
Nutracéuticos y Farmacéuticos
Erradicación de
enfermedades
Xenotransplante
Alotransplante
Producción animal
Programas de mejoramiento
genético
Preservación de especiesAnimales en extinción o extintos
(?)
Investigación básica
Estudio de fenómenos biológicos:
diferenciación celular, envejecimiento y
crecimiento celular.
Aplicaciones
de la clonación
Zita
La vaca Holstein de mayor rango en los Estados
Unidos
En 1997 produjo casi 40000 libras de leche
Once de los 46 Holstein más productivos de los
Estados Unidos son descendientes directos de Zita
En febrero de 2001 nacieron los primeros clones de
Zita
11/09/2017
MOET FIV
Proceso N° Proceso N°
Colectas 6 Aspiraciones 48
Embriones colectados 30 Óvulos colectados 384
Embriones transferidos 30 Embriones transferidos 115
Terneros nacidos 12 Teneros nacidos 35
Vaca altamente productiva
Vacas clonadas
11/09/2017
PERSPECTIVAS A FUTURO
Clonación hetero-específica.
“Cavia tschudii”
Se logro generar embriones clonados de cuyes silvestres hetero-específica (Citoplasma bovino,
núcleo del cuy silvestre), UNTRM 2015
11/09/2017
PERSPECTIVAS A FUTURO
Clonación hetero-específica.
“Odocoileus virginianus”
Se logro generar embriones clonados de venado silvestres hetero-específica (Citoplasma
bovino, núcleo de venado silvestre), UECE, UNTRM, 2016
Agradecimientos Los autores agradecen a la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza deAmazonas y al Instituto de Investigación en Ganadería y Biotecnología por lasfacilidades prestadas para el desarrollo del estudio.
Biotecnología en acuicultura.
GRUPO MARINASOLYO VANI LU Z M I L A R O SA L ES M AC EDA .
T U M B ES – P E R Ú
2 0 1 7
El cultivo de Langostino en el Perú.
El cultivo de camarones peneidos se inició a fines de la década de ’80 cuando el IMARPE y el entonces Ministerio de Pesquería realizaron los primeros ensayos de cultivo en la zona de Tumbes, ulteriormente el cultivo fue desarrollado por empresas privadas.
0
5000
10000
15000
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25000
2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
Tm
Producción Anual de Langostinos.
Total Region Piura Region Tumbes
Grupo Marinasol
Centros de engordeCentro de Producción de larva
Semi Intensivos
Área: 1200 Ha
Cap. Prod.: 3Tn/Ha
Intensivos
Área: 65 Ha
Cap. Prod.: 48 Tn/Ha
PSI
ABC
PLC
CIDPL
Ha: 4 Ha
Plantas de Procesamiento
PC
El enfoque de mejorar la productividad del langostinoPrevención de enfermedades y Mejoramiento continuo del langostino.
Intensificación de sistemas de engorde
Obtener microorganismos que sean amigables con el medio ambiente, que favorezcan la producción y reduzcan los costos de producción.
Medio ambiente
Huésped Patógeno
Enfermedad
Enfermedades del LangostinoQue esta pasando
en mi producción.???
Que enfermedades puede tener el langostino.???
Quienes pueden afectar el cultivo del langostino???
•Virus: WSSV, IHHNV, BPV.•Bacterianas: NHP, Vibriosis, Pseudómomas.•Factores Fisicoquímicos: Temperatura, pH, OD, etc…
PRODUCCIÓN TRANSFERENCIA INVESTIGACIÓN
Problemas. Interrogantes.
Evaluación de problemática.
Información.
Investigación/ Tecnologías.
Validación.Aplicación.
FLUJO DE LA INFORMACION
Investigación/ Tecnologías.
Validación.Aplicación.
Prevención de enfermedades y mejoramiento genético del langostino Litopenaeus vannamei. 042-FINCyT-PITEI-2008
25
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% BPV % NHP %IHHNV %WSSV
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2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017
% D
E IN
CID
ENC
IA
MACHOS
% BPV % NHP %WSSV
Selección de mejores piscinas comerciales
Selección fenotípica individual de pre reproductores
Aclimatación y traslado de pre reproductores
Ablación y despermatización de pre reproductores
Prevención de enfermedades y mejoramiento genético del langostino Litopenaeus vannamei. 042-FINCyT-PITEI-2008
Crecimiento
Fecundidad
Resistencia
Prevención de enfermedades y mejoramiento genético del langostino Litopenaeus vannamei. 042-FINCyT-PITEI-2008
Cruces dirigidos de animales de interés
Banco de reproductores
Desafío en campo Desafío experimental WSSV
Banco de sobrevivientes
Prevención de enfermedades y mejoramiento genético del langostino Litopenaeus vannamei. 042-FINCyT-PITEI-2008
257
AMARILLO
MZUL
245 NARANJA
SOBRE/
JAULA
371
AMARILLO
LP 323
369
AMARILLO
LP 323
491
PLOMO
LP 498
247
CELESTE
LP 498
70
AMARILLO
PARACAS
464
BLANCO
ECUADOR
242
AMARILLO
LP 38
263
VERDE
LP 38
138
ROJO
LP 149
978
CELESTE
LP 149
664
AMARILLO
LP 295
950
MARRON
LP 295
389
VERDE
LP 427
16
VERDE
LP 427
LP
618
?
950
MARRON
LP 295
664
AMARILLO
LP 295
24
NARANJA
LP 427
241
AMARILLO
MZUL
62
AMARILLO
MZUL
915
AMARILLO
LP 421
LP
616
?
81
VERDE
LP 427
489
VERDE
LP 427
LP
605
?
1090
VERDE
LP 421
942
VERDE
LP 421
LP
600
?
769
CELESTE
PARACAS
429
BLANCO
D RODAS
728
NARANJA
LP 398
1498
VERDE
LP 398
1078
AMARILLO
LP 323
141
AMARILLO
LP 323
LP
495
?
LP
703
?
LP
593
?
Domesticación de comunidades microbianas asociadas al cultivo del langostino para la reducción del alimento artificial, mejoramiento de la calidad de agua y prevención de bacteriosis.
0
5
10
15
20
25
25/02/2009 04/03/2009 11/03/2009 18/03/2009 25/03/2009 01/04/2009 08/04/2009 15/04/2009 22/04/2009 29/04/2009 06/05/2009 13/05/2009 20/05/2009
2.64.0
5.4 6.1
9.111,2 11,9
14,816,2
17,6 17,618,7
20.3
Pe
so (
g)
Fechas de Muestreo
Peso Promedio - Estanques: E3, E4 y E5
E3 (CONTROL) E4 (Geotextiles - Perifiton) E5 (Sacos - Perifiton)
Estanque Área Ha
Densidad de siembrapL/m2
Superficie de Periphitonm2
3 0.8 20 ---
5 0.8 20 0.875
4 0.8 400 0.6
CEPAS UTILIZADAS
Bacterias Microalgas Ciliados Nematodos
1A Shewanella sp. Diatomea 1 Uronema marina Nematodo 2
8A Shewanella sp. 98% Diatomea 3Paranophrys magna
15A Shewanella sp. 96% Amphipora sp. Euplotes crassus
17A Shewanella sp. 96% Cymbella sp.1
19A Shewanella sp. 96% Cymbella sp.221D Bacillus denitrificante 98%
Cymbella sp.3
76G Bacillus sp. 98% Cymbella sp. 4
Navicula sp. 4
Caracterización y domesticación de la flora microbiana del tracto digestivo del langostino Litopenaeus vannamei para la prevención de enfermedades bacterianas y el incremento de productividad. FINCYT-024-2009
Células digestivas
Bacterias transitorias o residentesen el tracto digestivo de Langostinosisvestre
Oportunistas
Probióticos
Patógenos
Disponer de un conjuntode microorganismosconstitutivos de la floramicrobiana nativa dellangostino L.vannamei
Equipamiento Científico-Tecnológico “Equipamiento de una unidad de cultivo celular del langostino Litopenaeus vannamei” No. 1663/OC-PE
Figura 4: Primocultivo de hemocitos en DEM después 12h (A), 18h (B) y 48h (C). Barra 20µm.
A B C
Colección de muestras de hemolinfa
Selección de medios de cultivo y estandarización de primo cultivos
Preparación de inóculos virales
Evaluación génica de NOS en primo cultivo de células de langostino. Derch. Células 3 horas post infección con WSSV, Centro: Celulas 48 horas post infección con wssv,Izq. Células 72 horas post
infección con WSSV
Evaluación de la expresión inmunitarias de células de langostino en el tiempo mediante técnicas de PCR en tiempo Real
Obtención, masificación y liofilización de protistas thraustochytridos nativos y/o modificados como fuente de ácidos grasos esenciales (PUFAS) alternativos y/o complementarios al aceite de pescado. 013-FINCYT-FIDECOM-PIPEA-2013
Especies aislados en Tumbes # Especies aislados en Piura #
Aurantiochytrium limacinum SL1101 88 Aurantiochytrium limacinum SL1101 16
Aurantiochytrium sp. BL1 4 Aurantiochytrium sp. LY-2012 5
Parietichytrium sarkarianum 3 Botryochytrium radiatum 4
Schizochytrium limacinum OUC168 4 Schizochytrium limacinum OUC166 1
Schizochytrium limacinum OUC174 1 Schizochytrium sp. ATCC 20888 2
Schizochytrium limacinum OUC192 1 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705763.1 1
Schizochytrium mangrovei 5 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705766.1 2
Schizochytrium sp. KR-5 1 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705771.1 3
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705761.1 1 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705781.1 6
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705763.1 21 Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705784.1 2
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705766.1 48 Thraustochytriidae sp. MBIC11087 5
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705769.1 3 Thraustochytrium sp. ATCC 26185 1
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705771.1 21 Ulkenia sp. 1
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705772.1 2 Ulkenia visurgensis 2
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705774.1 2
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705776.1 2
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705779.1 1
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705781.1 16
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705783.1 4
Thraustochytriidae sp. MBIC11085 2
Thraustochytriidae sp MBIC11087 1
TOTAL 231 TOTAL 51
TOTAL DE ESPECIES AISLADAS 30
Caracterización molecular
Caracterización lipidica
Calidad de PUFAs N° de cepasDHA 28
DHA EPA 103
DHA EPA ARA 72
EPA 23
Ninguno 56
Total 232
CEPACódigo
internoEPA DHA
A. limacinum SL1101 A 123 0.64 39.31
A. limacinum SL1101 B* 214 0.68 38.31
A. limacinum SL1101 C 503 0.57 35.79
A. limacinum SL1101 D* b2pap 0.95 39.53
Aurantiochytrium sp. BL1 216 1.17 40.26
Aurantiochytrium sp. LY-2012* 517 1.09 40.93
Botryochytrium radiatum 541 1.48 35.74
dinoflagelado 320 0 26.2
Parietichytrium sarkarianum 120 4 17.98
S. limacinum OUC166 c4 1 36.8
S. mangrovei* 48 0.93 40.07
Schizochytrium limacinum OUC168* 85 0.7 42.66
Schizochytrium sp. KR-5 301 x x
Thraustochytriidae sp MBIC11087 75 0.67 36.96
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705763.1 304 1.33 40.44
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705766.1 213 0.92 39.31
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705769.1 227 0.85 38.4
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705771.1* 124 0.62 40.94
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705772.1* 222 0.81 42.02
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705774.1 34 0.8 37.96
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705781.1 325 0.99 40.97
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705783.1 332 0.67 37
Thraustochytriidae sp NIOS-1 AY705784.1 527 1.76 29.86
Thraustochytriidae sp. MBIC11085 307 1.19 39.33
Thraustochytrium sp. ATCC 26185 c1 2.88 37.53
Ulkenia sp. 543 0.67 37
Selección de las mejores
* Cepas seleccionadas para transformación genética.
Selección de langostinos multi-resistentes a virus mediante el uso de marcadores genéticos QTLs correspondientes al sistema de defensa antiviral ARN interferencia.
PIPEI-2-P-096-11
Alin
eam
ien
to d
e se
cuen
cias
Drosophila melanogaster
Bombyx mori
Drosophila teissieri
Drosophila santomea
Drosophila yakuba
Drosophila simulans
Tribolium castaneum
Aedes aegypti
Marsupenaeus japonicus
Penaeus monodon
Litopenaeus vannamei
Alineamiento de secuencias.
Dic
er 2
.A
rgo
nau
te 2
.
Análisis de eficiencia
Recolección de muestra
Extracción de ADN
Amplificación Electroforesis
Secuenciamiento
Primer Tm Tamaño
Dic
er 2 LvDcr2F1 60.6°
269pbLvDcr2R1 60.7°
Arg
on
aute
2
LvAgo2F3 60.1°
101pb
LvAgo2R3 60.2°
Primers seleccionados Comparación entre infección experimental y infección natural
Implementación de metodologías de “secado por pulverización sobre soporte fluidizado” (Fluidized bed spray drying) para la formulación en forma seca de microorganismos probióticos para el cultivo de langostinos
175-FINCYT-FIDECOM-PIPEA-2014
La demanda de uso de probioticos en acuicultura haciende a mas de 2 millones de dólares anuales sin contar gastos logísticos de distribución y fermentación.
Bio
ensayo
Larvicultu
raEn
gord
e
Proyecto: 2012-00018: Bacterias recombinantes
Bioensayo: ensayos de plásmidos individuales. Fecha: julio 2013 # individuos: 10 000 # tratamiento: 9 (3) Periodo de alimentación : 15 díasPeriodo de infección: 30 días. Dosis: 1ml/g.Concentración de wssv: 10E+08Inicio de mortalidad: 2DPI
Suministro de bacterias. Fecha: enero 2013 # individuos: 1000 # tratamiento: 6 (3) Periodo de alimentación : 5 días Periodo de infección: 14 días. Dosis: 1ml. Concentración de wssv: 10E+08 Inicio de mortalidad: 2DPI
SOBREVIVENCIA INFECCIÓN VIRAL
Mejora de la productividad de postlarvas de Litopenaeus vannamei mediante la selección de reproductores ligados a marcadores tipo SNP de tres caracteres genéticos de importancia comercial (Crecimiento, Fecundidad y Resistencia).
PIAP-2-P-514-14
Grafico N° 01.- Dispersión de Peso y talla de stock de reproductores de L. vannamei.
Corrida LP N°
Hembra Macho FECHA DE SIEMBRA
CANTIDAD SEMBRADA
N° anillo
color LP
Origen Lote de Origen
N° anillo
color LP
Origen Lote de Origen
N° 40
783 62 Naranja 641 32 558 Naranja 635 32 26/01/2016 52500 784 774 Naranja 645 32 1267 Naranja 645 32 26/01/2016 52500 785 172 Naranja 645 32 12 Amarillo 652 33 27/01/2016 50000 786 610 Naranja 635 32 833 Naranja 670 33 28/01/2016 67500 787 1262 Naranja 640 32 377 Verde 658 33 28/01/2016 45000 788 475 Naranja 645 32 619 Amarillo 665 33 29/01/2016 120000 789 1157 Naranja 644 32 486 Verde 647 32 29/01/2016 97500 790 1204 Celeste 643 32 607 Naranja 645 32 29/01/2016 45000 791 392 Celeste 627 31 1039 Naranja 641 32 29/01/2016 52500 792 356 Naranja 627 31 842 Naranja 643 32 30/01/2016 135000 793 1056 Verde 629 31 407 Naranja 641 32 30/01/2016 135000 794 1266 Naranja 633 31 716 Naranja 641 32 30/01/2016 120000 795 879 Naranja 629 31 1413 Naranja 644 32 30/01/2016 60000 796 443 Celeste 626 32 1421 Naranja 637 32 30/01/2016 200000 797 342 Blanco 627 32 1144 Naranja 641 32 30/01/2016 120000 798 32 Blanco 624 31 1282 Naranja 640 32 31/01/2016 150000 799 445 Blanco 647 32 527 Naranja 637 32 31/01/2016 180000 800 52 Blanco 626 31 1290 Naranja 644 32 31/01/2016 170000 801 1270 Celeste 627 31 624 Naranja 640 32 31/02/2016 200000 802 321 Blanco 644 32 558 Naranja 635 32 31/01/2016 200000 803 461 Blanco 627 31 1142 Naranja 641 32 31/01/2016 100000 804 157 Naranja 627 31 340 Marrón 641 32 01/02/2016 120000
Corrida LP N° Hembra Macho
Fecundación Fecha de siembra
Cantidad sembrada
N° anillo color N° anillo color
N° 41
805
807 Blanco
Natural 18/03/2016
75000
170 Blanco
563 Amarillo
806
807 Blanco
Natural 18/03/2016 65000 170 Blanco
563 Amarillo
1100 Amarillo
807
638 Blanco
Natural 19/03/2016 126000 496 Amarillo
768 Blanco
808
638 Blanco
Natural 19/03/2016 126000 496 Amarillo
325 Blanco
809
1351 Naranja
Natural 20/03/2016 120000
26 Verde
877 Amarillo
318 Celeste
293 Verde
810
1351 Naranja
Natural 20/03/2016
140000
26 Verde
877 Amarillo
318 Celeste
334 Blanco
811
1351 Naranja
Natural 20/03/2016 140000
26 Verde
877 Amarillo
318 Celeste
632 Amarillo
812
1100 Amarillo
Natural 21/03/2016 80000 419 Verde
145 Verde
813
275 Verde
Natural 21/03/2016 98000 789 Amarillo
145 Verde
814 1361 Celeste 1424 Amarillo I. Artificial 23/03/2016 130000
815 319 Blanco 7 Celeste I. Artificial 23/03/2016 42500
816 1020 Verde 654 Blanco I. Artificial 23/03/2016 40000
817 536 Rosado 771 Blanco I. Artificial 23/03/2016 60500
818 171 Naranja
Natural 23/03/2016 84000 293 Verde
819
694 Amarillo
Natural 23/03/2016 68500 293 Verde
900 Naranja
820 419 Verde 471 Rosado I. Artificial 24/03/2016 95000
821 394 Amarillo 633 Blanco I. Artificial 24/03/2016 40000
Caracterización molecular
Domesticación, identificación molecular , reproducción y larviculturade corvina-cherela (cynoscion phoxocephalus) como una proyección hacia la maricultura de peces tropicales de alto valor comercial enel norte del Perú .
Selección y transporte de reproductores
Aclimatación yprofilaxis
AcondicionamientoReproducción
Aplicación de técnicas para la reproducción , obtención de semillas y caracterización molecular de Atrina maura “concha pala” en hatchery como una nueva especie para la maricultura en el Perú .
Selección y acondicionamiento de
reproductores
Caracterización molecular
Desove y cultivo larvario
cultivo de post larvasSemilla de 2 mm
2012-00020 Caracterización del gene de la GnRH del Paiche (Arapaima gigas) y evaluación del efecto de inyección de péptidos sintéticos o recombinantes. 2012-00021 Análisis proteómico de los constituyentes del plasma de Paiche(Arapaima gigas) en función del sexo y del edad.
9 406 803 1200 1597 1994
Mass (m/z)
79.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - PLACA DE BAJO PESO III 07-06-12; Run #27; Label B6 Prec = 1888.9814
1251.91(R6015,S40)
1246.13(R11760,S36)93.93(R3241,S33)
121.66(R4060,S30)
72.63(R3600,S26) 1254.24(R11156,S26)823.27(R9731,S26)650.83(R8683,S26)1284.11(R7639,S26)
1797.84(R13700,S21)11.67(R1354,S21) 1597.22(R12980,S20)684.02(R9023,S18) 1286.35(R12267,S17)
205.99(R5373,S14)637.72(R7832,S12) 1268.40(R12040,S14)
850.28(R9993,S12)1240.16(R12299,S11)96.99(R3720,S10) 646.67(R9125,S10) 1766.68(R14216,S10)1522.10(R12736,S10)
324.04(R6558,S8) 958.23(R10438,S7)654.46(R8861,S7) 1704.81(R13480,S7)1295.04(R12555,S7)
Genómica aplicada al
mejoramiento genético en
alpacas
Dr. Jorge Rodriguez Bailon
Unidad de Biotecnología Molecular
Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID)
Alpaca
Alpaca recurso de importancia
socioeconómica
Selección y Mejora Genética
Marcadores genéticos (SSR
[100], SNPs [0], ADNmt [173;
43]), 5 genomas
Conocimiento y conservación
de la biodiversidad
Investigación básica y aplicada
Generación de herramientas para selección y registro
Genómica de alpacas: Identificación de genes
expresados y marcadores genéticos asociados a
productividad de fibra fina en alpacas
Generación de núcleos de alpacas reproductoras de alta
productividad basados en la selección asistida con
marcadores genéticos
Una aproximación genómica de poblaciones aplicada a
la filogenia y mapeo de rasgos productivos en alpacas
Prueba de parentesco e identidad y su aplicación en la
validación de libros de pedigrí en alpacas de alta
productividad
Prueba de parentesco niveles de confiabilidad ~ 100%
Aceptada internacionalmente (publicación)
Laboratorio afiliado a la ISAG (International Society of
Animal Genetics)
Participación en el Panel Internacional para
determinación de pruebas de parentesco en alpacas
Prueba validada en diferentes centros
de producción de alpacas
Desarrollo y validación de libros de registro y pedigri
Software Alpaca IdGen versión 1.0, aplicaciones para
registro productivo, reproductivo y sanitario de alpacas,
plus registro de genotipificación por ADN que permite
calcular identidad, índices de filiación, endogamia,
heterocigosidad, etc.
En desarrollo la versión 1.1 y en plataforma web
Bases de datos para investigación
genética (fenotipos y genotipos)
Identificación y Estructuración de Familias de
referencia
Base de datos de registros productivos
Base de datos de productividad en abuelos, padres y crías de alpaca
Filiación comprobada con análisis de ADN
Certificación
Certificación de identidad, parentesco (paternidad y maternidad) y origen
Certificado de Identidad por ADN infalsificable
Certificado de filiación infalsificable
Certificado de origen
Análisis de consanguinidad
Reporte de los niveles de consanguinidad
Análisis de variabilidad genética
Genes expresados y características productivas
Órganos clave: Piel y Tejido linfoide
Genes expresados
Marcadores moleculares dentro de genes expresados
Asociación con características fenotípicas
Conservación y Diversidad
Caracterización de la diversidad genética en alpacas (Vicugna
pacos) como herramienta para conservación de su germplasma y
búsqueda de marcadores para la identificación de razas Suri y
Huacaya.
Generación de marcadores genéticos tipo SNPs en genes codantes
de proteínas componentes de la fibra y su uso en selección
genética y filogenia de la alpaca.
Identificación del Polimorfismo Genético de Nramp-1, TLR2 y TLR4
y su asociación con resistencia a enfermedades en alpacas
(Vicugna pacos), para incrementar la ventaja competitiva de la
industria alpaquera local
MARCADORES MICROSATÉLITES PULBLICADOS DE AMPLIFICACION EN MULTIPLES ESPECIES (GenBank)
MARCADORES MICROSATÉLITES GENOTECA SUSTRACTIVA DE cDNA DE PIEL DE ALPACA (Lab UBM-UPCH)
MARCADORES MICROSATÉLITES BIBLIOTECA GENOMICA DE ALPACA (Reeds et al 2008)
MARCADORES MICROSATÉLITES A PARTIR DE EST DE ALPACA (GenBank)
MARCADORES SNP A PARTIR DE GENOTECA SUSTRACTIVA DE PIEL DE ALPACA (Lab UBM-UPCH)
Generación de marcadores genéticos en alpacas
Variabilidad genética y estructura poblacional en alpacas peruanas
(Vicugna pacos)
ADN nuclear: 12 microsatélitesADN mitocondrial: Región control
N= 446
12 localidades distribuidas en 6 departamentos
Tabla. Número promedio de alelos, heterocigosidad observada (HO),
heterocigosidad esperada (HE) e índice de Garza-Williamson (G-W) y FIS en 6
poblaciones de alpacas mediante el análisis de 12 microsatélites.
Departamento Nº Nº promedio
de alelosHO HE G-W FIS
Huancavelica59
11.5 0.7915 0.8144 0.7069 0.0280
Junin 34 10.5 0.8000 0.8100 0.6614 0.0120
Apurimac 30 10.5 0.8133 0.8110 0.6945 -0.00301
Arequipa 20 9.8 0.7650 0.8009 0.6767 0.0460
Cusco 66 12.3 0.8030 0.8070 0.7731 0.0050
Puno 237 14.7 0.7962 0.8139 0.8169 0.0220
1 Valores negativos de FIS indican exceso de genotipos heterocigotos.
38 sitios polimórficos + 1 inserción de timina
32 haplotipos identificados
Diversidad haplotípica = 0.905
Diversidad nucleotídica = 0.01746
Variabilidad genética en alpacas (ADN mitocondrial)
Figura. Análisis factorial de 2 dimensiones realizado con la matriz de genotipos microsatelites
utilizando el programa Genetix. Nótese la presencia de dos grupos genéticos claramente definidos.
Variabilidad genética en alpacas (Genes nucleares)
Raza Nº Nº promedio
de alelos HO HE PIC PE FIS
Huacaya 375 16.2 0.7939 0.819 0.7967 0.999992 0.0306
Suri 71 12.4 0.8113 0.810 0.7809 0.999984 -0.0014
Detección de alelos de riesgo – Ojo Sarco
Defecto genético hereditario
Microsatélites KIT (3) permiten detectar alelos
de riesgo en alpacas reproductoras
Selección para eliminación del defecto
Fotografía: Conopa.org
Genoma y asociación genética
Genomas completos (3 alpacas y 1 llama) - 49.6 a 50.9 Gb
Elevada nivel de cobertura y resolución (aprox. 95%, 22X)
Estudios de genómica evolutiva, asociación genética
(GWAS, gen candidato), mapa de LD.
Estudios iniciales de asociación genética en KRTAP1-2,
KRTAP6-1, KRTAP9-2, KRTAP11-1 y KRTAP13-1
(Foppiano, 2016), Tricohialina (Delgado de la Flor, 2016).
Identificación de SNPs en gen KRTAP 13.1 cercano a
genes bajo fuerte presión de selección (Veliz, 2017)
Identificación de polimorfismos tipo SNPs para elaboración
de DNA microarray
Plataforma de microarreglos ADN para alpacasTranscriptoma y Genotipificacion en paralelo
Caracterización del transcriptoma de las células de la piel de la alpaca
2,280 clonas: 1,075 transcritos.
347 secuencias de consenso y 728 singletons.
Caracterización del transcriptoma de los glóbulos blancos de la alpaca
PacoChip, microarreglo para determinación de identidad y filiación en alpacas (llamas, vicuñas)
Unidad de Biotecnología Molecular
Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID)
Ph D. José R. Espinoza
Ph D. Patricia Herrera Velit
Dr. Jorge Rodriguez Bailón
MSc. Teresa Barreto Gaviria
MSc. Juan Agapito Panta
MSc. Irene Delgado de la Flor
MSc. Diego Veliz Otani
MSc. Lissete Delgado Aquije
Dr. Jorge Rodriguez Bailon
Facultad de Ciencias y Filosofía
Universidad Peruana Cayetano Heredia
Nematodos agalladores de la raíz, Meloidogyne javanica
Abad….Annu. Rev. Phytopathol. 2013. 51:203–20 Raíces de uva variedad patrón Freedom con infección severa de M. javanica
HOSPEDERONEMATODOS
METAGENOMICS
Microbiota of nematode pathogens
METAGENOMICS
Microbial community associated with root infection caused
by nematodes
METAGENOMICS
Cultivated and pristine soil
CONTROL BIOLÓGICO
PROTEOMICS
Effector proteins identification from M.
javanica.
PROTEOMICS
Mass imaging from root gall formation
PROTEOMICS
Mass imaging of Meloidogyne
Desarrollar un producto biológico controlador del nematodo fitopatógeno de la vid, Meloidogyne javanica, basado en la
domesticación de microorganismos nativos patógenos del nematodo, dentro de los viñedos de la empresa ECOSAC
OMICAS
HOSPEDERO
NEMATODO CONTROL BIOLÓGICO
BACTERIA
Bacillus, Pseudomonas, Pasteuria
FUNGI
Trichoderma, Paecilomyces
ROOT-KNOT NEMATODE
Meloidogyne
RESISTENTSUSCEPTIBLE
799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0
Mass (m/z)
4.7E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - IB12-5-17 MICROALGAS; Run #14; Label P5
832.2596(R5474,S538)
1776.7977(R11362,S472)
1198.6287(R9799,S418)
854.9813(R8073,S165)
2273.0439(R16478,S259)870.9521(R8679,S130)
2162.9463(R18006,S183)1704.6576(R15113,S120)
860.9901(R9576,S69)1515.6688(R13166,S70)2192.8945(R15172,S97)
3165.4958(R17640,S101)2550.1199(R12847,S53)
Figura 1: Se muestran los precursores M/Z de los aminoácidos que identificaron lasproteínas efectoras mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF extraídas a partirdel cuarto estadio de M. javanica
IDENTIFICACION POR ESPECTROMETRIA DE DOBLE MASA MALDI
TOF/TOF DE TIPO SHOUTGUN PROTEOMICS DE PROTEINAS DE
VARIOS ESTADIOS DEL NEMATODO, Meloidogyne javanica, DE
EFECTORES INVOLUCRADOS EN LA INFECCION DE RAICES.
Tesista: Stalyn Córdova
HOSPEDERO
NEMATODO CONTROL BIOLÓGICO
BACTERIA
Bacillus, Pseudomonas, Pasteuria
FUNGI
Trichoderma, Paecilomyces
ROOT-KNOT NEMATODE
Meloidogyne
RESISTENTSUSCEPTIBLE
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Hembra M. javanica Huevo M. javanica M. javanica en Nodulos Aporcelaimellus sp Tylencholaimus parvus Suelo cultivado con uva Suelo cultivado conpimiento
Suelo Pristino
Especies de Bacterias presentes en Nematodos y Suelos de Uva por Analisis de Metagenomica Otros (<1%)Pseudomonas poaeSphingomonas spp.Ensifer sinorhizobium terangaeExiguobacterium panipatensisPontibacter korlensisBacillus viretiAcinetobacter spp.Comamonadaceae spp.Massilia timonaeAcinetobacter radioresistensAcinetobacter johnsoniiAcinetobacter baumanniiBalneimonas spp.Burkholderia ambifariaHylemonella spp.Burkholderia ubonensisAcinetobacter calcoaceticusBurkholderia thailandensisGeobacillus thermoglucosidasius tr2Acinetobacter rhizosphaeraeAeromonas veroniiHydrogenophaga spp.Chromobacterium violaceumPseudomonas oryzihabitansRheinheimera texanaPseudomonas jinjuensisAzorhizophilus azotobacter tropicalisCupriavidus taiwanensisRheinheimera sp._chandigarhAeromonas enteropelogenesPaludimonas paludibacterium yongneupenseEnsifer melilotiPseudomonas alcaligenesVariovorax spp.Pseudomonas resinovoransPseudomonas mendocinaPseudomonas pseudoalcaligenesPseudomonas veroniiBacillus polygonumiCorynebacterium diphtheriaeComamonas testosteroni sb4Sphingobium yanoikuyaeMethylobacterium fujisawaenseSphingomonas yabuuchiaeAcidimicrobiales spp.Acinetobacter genomosp. 3Streptococcus sanguinisNeisseria siccaAcinetobacter juniiChryseobacterium pallidumHerbaspirillum rubrisubalbicansSteroidobacter spp.Stenotrophomonas maltophiliaMethylobacterium radiotoleransHaloferula spp.Pedobacter steyniiRalstonia pickettiiMethylobacterium tardumPseudomonas putida
Diversidad de especies de nematodos fitopatógenos y de vida libre, así como la
diversidad bacteriana en los suelos cultivado de uva, pimiento y suelo prístino
mediante el uso de herramientas moleculares de nueva generación de secuenciamiento por metagenómica
dirigida al gen 16S DNAr
HOSPEDERO
NEMATODO CONTROL BIOLÓGICO
BACTERIA
Bacillus, Pseudomonas, Pasteuria
FUNGI
Trichoderma, Paecilomyces
ROOT-KNOT NEMATODE
Meloidogyne
RESISTENTSUSCEPTIBLE
Detección de esporas de Pasteuria
penetrans adheridas a la cutícula
de juveniles de Meloidogyne
javanica
HOSPEDERO
NEMATODO CONTROL BIOLÓGICO
BACTERIA
Bacillus, Pseudomonas, Pasteuria
FUNGI
Trichoderma, Paecilomyces
ROOT-KNOT NEMATODE
Meloidogyne
RESISTENTSUSCEPTIBLE
Colecta de hembras adultas de
Meloidogyne infectados con Pasteuria sp.
Endosporas de Pasteruria sp.
adheridas a la cutícula de J2.
Infección de J2 en plantas de
tomate
Endosporas de Pasteuria sp.
Cada hembra
adulta contiene
más de 2
millones de
endoporas
Infección
artificial
Desarrollo de endosporas en vez de
huevos
HOSPEDERO
NEMATODO CONTROL BIOLÓGICO
BACTERIA
Bacillus, Pseudomonas, Pasteuria
FUNGI
Trichoderma, Paecilomyces
ROOT-KNOT NEMATODE
Meloidogyne
RESISTENTSUSCEPTIBLE
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Pasteuria Meloidogyne
Po
rcen
taje
ab
un
dan
cia
< 0.01%
Opitutus
Enterobacter
Burkholderia
Flavobacterium
Dongia
Sphingobium
Acinetobacter
Rhizobium
Brevundimonas
Bacillus
Variibacter
Sphingomonas
Acidibacter
Pseudoxanthomonas
Hydrogenophaga
Cloacibacterium
Pseudolabrys
Variovorax
Streptomyces
Pseudomonas
Pasteuria
Paenibacillus
ANÁLISIS TAXONÓMICO Y FUNCIONAL DE
LA MICROBIOTA DE HEMBRAS DEL
NEMATODO AGALLADOR DE LA RAÍZ,
Meloidogyne javanica, EN RELACIÓN CON
LA INFECCIÓN POR Pasteuria penetrans
Tesista: David Lindo
Identificación por Metaproteómica de la diversidad de bacterias relacionadas a las semillas de pimiento piquillo
980 996 1012 1028 1044 1060
Mass (m/z)
7.7E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - cacao 5-09-16 2642; Run #8; Label E14
1007.4515(R6529,S897)1045.5770(R7461,S904)
1009.4497(R9027,S339)
990.4201(R9930,S327)
1039.4320(R9878,S200)989.4313(R10938,S139) 1030.5414(R11241,S150)
1005.4192(R10689,S76)1019.4435(R10484,S74)1033.4570(R9523,S70)1043.5551(R11413,S52)
Análisis metagenómico comparativo de las comunidades fúngicas y
bacterianas asociadas al proceso de desarrollo de las enfermedades del
tronco de la vid (Vitis vinifera L.) en Piura, e identificación de hongos por
espectrometría de masas MALDI TOF/TOF shotgun proteomics
M. Saucedo-Bazalar, C. Santos, P. Masías, P. Duarte, G. León, P. Dorresteins, I. Fournier, M. Salzet,
V. Cedeño and E. Mialhe
La uva de mesa es uno de los principales productos de exportación en el departamento de Piura.
Perú es el tercer exportador de uvas de mesa a nivel mundial
Introducción
En Perú, Piura tiene una superficie cultivada de aproximadamente 9 000 ha con, tendencia a seguir creciendo en los próximos años
1,032.00 US$ Mill
La vid (Vitis vinifera L.) es uno de los cultivos frutales más ampliamente cultivado y económicamente importante a nivel mundial
Grapevine Trunk Diseases (GTD): complex and still poorly understood
C. Bertsch, M. Ramírez-Suero, M. Magnin-Robert, P. Larignon, J. Chong, E. Abou-Mansour, A. Spagnolo, C. Clément and F. Fontaine (2013)Patologías de la vid
Nematode infestationsMeloydogine javanica
Taken and modified from:
Grapevine Pathogenic Microorganisms:
Understanding Infection Strategies and Host
Response ScenariosGrace Armijo, Rudolf Schlechter, Mario Agurto, Daniela Muñoz, Constanza
Nuñez and Patricio Arce Johnson (2016)
Grapevine Trunk Diseases (GTD):
Botryosphaeria dieback
Esca disease
Eutypa dieback Complejo fúngico
Introducción
Esca disease
Phaeomoniella chlamidospora
Phaeoacremonium aleophilum
P. viticola
P. parasitucum
Fomitiporia punctata
F. mediterranea
Eutypa dieback
Eutypa lata
Eutypa leptoplaca
Cryptovalsa ampelina
Diatrypella sp.
Diatrype stigma
Diatrype whitemanensis
Cryptosphaeria pullmanensis
Eutypella sp.
Botryosphaeria dieback
Especies de la familia Botryosphaeriaceae
En Piura, Lasiodiplodia theobromae
(= Botryodiplodia theobromae) sin embargo…
L. viticola
L. iraniensis
L. pseudotheobromae
Dothiorella viticola (=B. viticola)
Botryosphaeria dothidea
Diplodia seriata (=B. obtusa)
Neofusicoccum parvum (=B. parva)
Neofusicoccum luteum (=B. lutea)
Macrophomina phaseolina
Black foot disease
Ilyonectria spp. (= Cylindrocarpon)
Campylocarpon spp.,
Black foot disease
Plant Pathology Journal
Grapevine Trunk Diseases (GTD): complex and still poorly understood
C. Bertsch, M. Ramírez-Suero, M. Magnin-Robert, P. Larignon, J. Chong, E. Abou-Mansour, A. Spagnolo, C. Clément and F. Fontaine (2013)Patologías de la vid
Nematode infestationsMeloydogine javanica
Taken and modified from:
Grapevine Pathogenic Microorganisms:
Understanding Infection Strategies and Host
Response ScenariosGrace Armijo, Rudolf Schlechter, Mario Agurto, Daniela Muñoz, Constanza
Nuñez and Patricio Arce Johnson (2016)
Grapevine Trunk Diseases (GTD):
Botryosphaeria dieback
Esca disease
Eutypa dieback Complejo fúngico
Introducción
Black foot disease
Plant Pathology Journal
Front Microbiol
Bacteria in a wood fungal disease: characterization of bacterial communities in woodtissues of esca–foliar symptomatic and asymptomatic grapevinesE. Bruez, R. Haidar, M. T. Alou, J. Vallance, C. Bertsch, F. Mazet, M. Fermaud, A. Deschamps, L. Guerin-Dubrana, S. Compant and P. Rey (2015)
The role of bacterial microbiome in the grapevine
Phyllosphere
Carposphere
Anthosphere
Caulosphere
Rhizosphere
¿Es posible la
existencia de
bacterias que
participen o estén
relacionadas a los
hongos que causan
GTD?
Objetivos
1. Análisis metagenómico de las comunidades fúngicas y bacterianas asociadas a platas de vid sanas y con GTD
2. Identificación de hongos asociados a GTD mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF shotgun proteomics
3. Análisis metabolómico de Bacillus sp. contra Lasiodiplodia theobromae mediante espectrometría de masas MALDI-TOF
4. Análisis metabolómico de Bacillus sp. contra Lasiodiplodia theobromae mediante MS IMAGING
Zona de estudio
Materiales y Métodos
La zona de estudio fueron los viñedos de la empresa ECOSAC AGRICOLA
SAC (1200 ha) ubicada en el centro poblado de Chapairá, distrito de Castilla,departamento de Piura (5°07’06.6’’ LS y 80°35’52.3” LO).
Síntomas de GTD fueron detectados en todas las zonas muestreadas
Plantas de vid muertas con necrosis vascular del tronco
Muerte regresiva afectando los racimos
de uva
Síntomas de marchitez severa de ramas enteras
Síntomas de clorosis y
necrosis foliar
Necrosis en la superficie de las ramas
Presencia de picnidios en la superficie de las ramas
Necrosis en zona de poda
Presencia de picnidios en la superficie de las ramas
Las muestras fueron tomadas a partir de plantas de vid (vr. Red Globe) de 5 años de edad. Tres tipos de plantas de vid fueron muestreadas: Vid sana (VS), Vid
sana, a partir de un área con plantas de vid con síntomas de GTD (VR) y vid con síntomas de GTD (VE).
Evaluación en campo y muestreo
VS
VS VR
Las muestras fueron tomadas a partir de plantas de vid (vr. Red Globe) de 5 años de edad. Tres tipos de plantas de vid fueron muestreadas: Vid sana (VS), Vid
sana, a partir de un área con plantas de vid con síntomas de GTD (VR) y vid con síntomas de GTD (VE).
Evaluación en campo y muestreo
VRVS VE
Cada una de ellas fueron podadas, luego las muestras de ramas, tronco y cuello fueron procesadas en el laboratorio para el análisis microbiológico y metagenómico
Las muestras fueron tomadas a partir de plantas de vid (vr. Red Globe) de 5 años de edad. Tres tipos de plantas de vid fueron muestreadas: Vid sana (VS), Vid
sana, a partir de un área con plantas de vid con síntomas de GTD (VR) y vid con síntomas de GTD (VE).
Evaluación en campo y muestreo
Next Generation
Sequencing
(ITS and 16S rRNA)
Maceración en nitrógeno líquidoProcesamiento de muestra
Materiales y Métodos
1. Análisis metagenómico de las comunidades fúngicas y bacterianas asociadas a platas de vid sanas y con GTD
Corte de tejidos
1 2
3
Análisis pipeline
3
4
Extracción de AND metagenómico
5
AND
metagenómico
67
ANALISIS METAGENOMICO DE HONGOS (433 OTUs)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
orc
enta
je d
e ab
un
dan
cia
Otros géneros < 1%
Rhizophagus
Wallemia
Bartalinia
Acremonium
Aspergillus
Aureobasidium
Cladosporium
Fusarium
Deniquelata
Lasiodiplodia
Alternaria
Peniophora
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
oce
nta
je d
e ab
un
dan
cia
Glomeromycota
Ascomycota
Basidiomycota
A B
C
Resultados y Discusión
Análisis metagenómico de hongos basado en la secuenciación del ADNr ITS. A) Composición taxonómica y porcentaje de abundancia a nivel de Phylum con VS(G=1.2%; A=97.6% y B=1.2%); VR (G=0.1%; A=99.2% y B=0.7%) y VE (G=0.0%; A=41.2% y B=58.8%).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
orc
enta
je d
e ab
un
dan
cia
Otros géneros < 1%
Rhizophagus
Wallemia
Bartalinia
Acremonium
Aspergillus
Aureobasidium
Cladosporium
Fusarium
Deniquelata
Lasiodiplodia
Alternaria
Peniophora
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
oce
nta
je d
e ab
un
dan
cia
Glomeromycota
Ascomycota
Basidiomycota
A B
C
Resultados y Discusión
B) Composición taxonómica y porcentaje de abundancia (>1%) a nivel de género para cada tipo de muestra. Aspergillus (A. penicillioides) resaltó como especiemarcadora en un 93.2% y Lasiodiplodia con 4.3% en VS; por otro lado, aparecen Alternaria con 33.0%, Aureobasidium (Aureobasidium sp.) como especie marcadora con23.9%, Cladosporium con 13.4%, Aspergillus con 12.3%, Acremonium con 8.4% y Bartalinia con 6.0% en VR; finalmente aparece Peniophora (P. aurantiaca) como especiemarcadora con 57.9%, Alternaria con 15.9%, Lasiodiplodia con 11.9%, Deniquelata con 6.3% y Fusarium (F. oxysporum) como especie marcadora con 3.3% en VE.
ANALISIS METAGENOMICO DE HONGOS (433 OTUs)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
orc
enta
je d
e ab
un
dan
cia
Otros géneros < 1%
Rhizophagus
Wallemia
Bartalinia
Acremonium
Aspergillus
Aureobasidium
Cladosporium
Fusarium
Deniquelata
Lasiodiplodia
Alternaria
Peniophora
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
oce
nta
je d
e ab
un
dan
cia
Glomeromycota
Ascomycota
Basidiomycota
A B
C
Resultados y Discusión
C) Representación gráfica de Venn mostrando el número de especies únicas y comunes en los tipos de plantas evaluadas. VS y VR compartieron 7 especies; VR y VEcompartieron 12 especies; VS y VE compartieron 3 especies y finalmente, VS, VR y VE compartieron 3 especies de los géneros Aspergillus, Alternaria y Lasiodiplodia.
ANALISIS METAGENOMICO DE HONGOS (433 OTUs)
VS
VR
VE
A
B
Resultados y Discusión
ANALISIS METAGENOMICO DE BACTERIAS (512 OTUs)
Análisis metagenómico de bacterias basado en el secuenciamiento del ADNr 16S. A) La curva de rarefacción muestra la diferencia en la diversidad de OTUs en las tresmuestras donde VE muestra una mayor diversidad de OTUs.
VS
VR
VE
A
B
Resultados y Discusión
ANALISIS METAGENOMICO DE BACTERIAS (512 OTUs)
B) Representación gráfica de Venn mostrando el número de especies únicas y comunes en los tipos de plantas evaluadas. VS y VR compartieron 53 especies; VR y VEcompartieron 58 especies; VS y VE compartieron 82 especies y finalmente, VS, VR y VE compartieron 51 especies.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
orc
enta
je d
e ab
un
dan
cia Otros Phylum < 1%
Firmicutes
Actinobacteria
Deinococcus Thermus
Proteobacteria
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
orc
enta
je d
e ab
un
dan
cia
Otras especies < 1%
Proteus sp.
Pseudomonas mendocina
Bacillus weihenstephanensis
Serratia marcescens
Curtobacterium sp.
Enterococcus sp.
Staphylococcus sp.
Bacillus spp.
Proteus mirabilis
Proteus spp.
Curtobacterium pusillum
Pseudomonas oryzihabitans
Proteus vulgaris
A B
Resultados y Discusión
ANALISIS METAGENOMICO DE BACTERIAS (512 OTUs)
A) Composición taxonómica y porcentaje de abundancia a nivel de Phylum Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes y Deinococcus-Thermus con VS (P=10.7%; A=86.5%;F=0% y D-T=0%); VR (P=3.0%; A=96.4%; F=0% y D-T=0%) y VE (P=74.1%; A=2.2%; F=1% y D-T=9.6%).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
orc
enta
je d
e ab
un
dan
cia Otros Phylum < 1%
Firmicutes
Actinobacteria
Deinococcus Thermus
Proteobacteria
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VS VR VE
%P
orc
enta
je d
e ab
un
dan
cia
Otras especies < 1%
Proteus sp.
Pseudomonas mendocina
Bacillus weihenstephanensis
Serratia marcescens
Curtobacterium sp.
Enterococcus sp.
Staphylococcus sp.
Bacillus spp.
Proteus mirabilis
Proteus spp.
Curtobacterium pusillum
Pseudomonas oryzihabitans
Proteus vulgaris
A B
Resultados y Discusión
ANALISIS METAGENOMICO DE BACTERIAS (512 OTUs)
B) Composición taxonómica y porcentaje de abundancia (>1%) a nivel de especie para cada tipo de muestra. los microorganismos bacterianos reportados en VS y VRfueron Proteus vulgaris con 61.1% y 62.4%; Bacillus spp. con 5.5% y 3.8%; Serratia marcens con 1.7% y 1.9% respectivamente, mientras que en VE se encontraron bacteriasmarcadoras como Pseudomonas oryzihabitans con 10.9%, Curtobacterium pusillun con 7.6% y Curtobacterium sp. con 1.6%
Árbol filogenético basado en el método Neighbor-Joining, quemuestra la diversidad de la comunidad bacteriana.
Resultados y Discusión
Cultivo de hongos
Extracción y migración de proteínas
Análisis MALDI TOF/TOF MS
Extracción de ADN y
Amplificación por
PCRAislamiento de hongos y bacterias
Procesamiento de muestra
Previamente
Materiales y Métodos
2. Identificación de hongos asociados a GTD mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF shotgun proteomics
Maceración de los hongos
12 3
4
5
1
2
3
4
5
Se aislaron 48 cepas fúngicas. Se identificaron a nivel molecular 27 cepas fúngicas.
Resultados y Discusión
Cepa Accesión Especie Ident Caráct. patogénico Procedencia Estado
2AMS KX146504 Chaetomium brasiliense 98% No patógeno Rama Sana
3AMS KR709026 Lasiodiplodia theobromae 100% Patógeno Rama Sana
5AMS FJ882040 Peniophora laxitexa 94% Patógeno Rama Sana
14AMS HQ315840 Botryosphaeria rhodina 100% Patógeno Rama Sana
15AMS KX401428 Lasiodiplodia theobromae 100% Patógeno Rama Sana
18AMS KX499521 Alternaria longipes 100% Patógeno Rama Sana
21AMS KX443224 Aspergillus sp. 98% No patógeno Rama Sana
24AMS AF099008 Trichoderma virens 99% No patógeno Rama Sana
25AMS KX816009 Trichoderma sp. 99% No patógeno Tronco Sana
28AMS EF567981 Aspergillus niger 99% No patógeno Rama Sana
29AMS KX443224 Aspergillus sp. 98% No patógeno Rama Sana
4AMS KJ832022 Peniophora sp. 95% Patógeno Rama Enferma
6AMS JF502430 Peniophora sp. 93% Patógeno Tronco Enferma
7AMS KU507487 Lasiodiplodia laeliocattleyae 99% Patógeno Rama Enferma
10AMS KY473068 Lasiodiplodia theobromae 99% Patógeno Rama Enferma
11AMS MF480345 Lasiodiplodia theobromae 100% Patógeno Rama Enferma
12AMS KY655212 Lasiodiplodia brasiliensis 99% Patógeno Rama Enferma
16AMS KY473061 Lasiodiplodia theobromae 99% Patógeno Tronco Enferma
17AMS KY473068 Lasiodiplodia theobromae 99% Patógeno Rama Enferma
19AMS MF136589 Diplodia sp. 99% Patógeno Rama Enferma
20AMS KM508494 Lasiodiplodia theobromae 99% Patógeno Rama Enferma
22AMS KJ941006 Phaeoacremonium sp. 100% Patógeno Tronco Enferma
23AMS KF179094 Phaeoacremonium minimun 99% Patógeno Cuello Enferma
26AMS KX394413 Neofusicoccum parvum 99% Patógeno Tronco Enferma
27AMS KF179094 Phaeoacremonium minimun 99% Patógeno Cuello Enferma
30AMS KY680345 Macrophomina phaseolina 100% Patógeno Cuello Enferma
31AMS KX394413 Neofusicoccum parvum 99% Patógeno Rama Enferma
Tabla 1. Hongos identificados molecularmente y caracterizados según su carácter patogénico, procedencia y estado de la planta
Identificación molecular (ITS) de algunas cepas fúngicas aisladas en este estudio. 1) Alternaria sp., 2) Peniophora sp. 3) Diplodia seriata, 4) Macrophominaphaseolina, 5) Phaeoacremonium sp. 6) Phaeoacremonium minimun, 7) Neofusicoccum parvum, 8) Lasiodiplodia brasiliensis, 9) L. theobromae, 10) Conidiasmaduras e inmaduras de L. theobromae (40X).
1
109876
5432
Resultados y Discusión
Se aislaron 107 cepas bacterianas (28 endófitas y 79 epifitas). Se identificaron a nivel molecular 62 cepas bacterianas.
Resultados y Discusión
Cepa Accesión Especie Ident Caráct. residente Procedencia Estado
1IIB NR_024640 Enterobacter asburiae 98% Epífita Rama Sana
1IID(1) NR_126208 Enterobacter xiangfangensis 99% Epífita Rama Sana
1IIC NR_104933 Leclercia adecarboxylata 96% Epífita Rama Sana
1IIA NR_116797 Pantoea dispersa 91% Epífita Rama Sana
1ID NR_042349 Enterobacter ludwigii 97% Epífita Rama Sana
1IIIC NR_042349 Enterobacter ludwigii 94% Epífita Rama Sana
1IA NR_126208 Enterobacter xiangfangensis 95% Epífita Rama Sana
1IVC NR_042349 Enterobacter ludwigii 96% Epífita Rama Sana
1IID(2) NR_041715 Pseudomonas stutzeri 95% Epífita Rama Sana
1IB NR_116755 Pantoea dispersa 98% Epífita Rama Sana
1BM NR_104839 Curtobacterium oceanosedimentum 99% Epífita Rama Sana
2BM NR_104839 Curtobacterium oceanosedimentum 98% Epífita Rama Sana
4BM NR_028983 Roseomonas ludipueritiae 99% Epífita Rama Sana
5BM NR_042315 Curtobacterium pusillum 93% Epífita Rama Sana
8BM NR_025922 Staphylococcus warneri 98% Endófita Rama Sana
9BM NR_025922 Staphylococcus warneri 99% Endófita Rama Sana
11BM NR_134084 Microbacterium hydrothermale 93% Epífita Rama Sana
12BM NR_104839 Curtobacterium oceanosedimentum 98% Epífita Rama Sana
15BM NR_025922 Staphylococcus warneri 99% Endófita Rama Sana
17BM NR_114215 Pseudomonas luteola 99% Epífita Rama Sana
19BM NR_025922 Staphylococcus warneri 97% Endófita Rama Sana
3SP6 NR_104749 Bacillus subterraneus 97% Epífita Rama Sana
3SP7 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 93% Epífita Rama Sana
3SN1 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Endófita Rama Sana
4SP1 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Epífita Rama Sana
4SP2 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Epífita Rama Sana
4SP3 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Epífita Tronco Sana
4SP4 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 91% Epífita Rama Sana
4SP5 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Epífita Rama Sana
Tabla 2. Bacterias identificadas molecularmente y caracterizadas según su carácter patogénico, procedencia y estado de la planta
4SP6 NR_104749 Bacillus subterraneus 86% Epífita Tronco Sana
4SP7 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Epífita Rama Sana
4SP8 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Epífita Rama Sana
4SP9 NR_075005 Bacillus amyloliquefaciens 99% Epífita Rama Sana
4SN1 NR_043334 Bacillus niabensis 98% Endófita Rama Sana
2IIIB NR_121761 Bacillus toyonensis 91% Epífita Rama Sana
2IIB KT591342 Bacillus thuringiensis 86% Epífita Tronco Sana
2IB NR_044546 Bacillus nealsonii 94% Epífita Tronco Sana
2IVA GU584975 Bacillus cereus 89% Epífita Rama Sana
2VB NR_104873 Bacillus subtilis 94% Endófita Rama Sana
3IID NR_042349 Enterobacter ludwigii 95% Epífita Rama Enferma
3IIC NR_118011 Enterobacter sp. 99% Epífita Rama Enferma
3IVA NR_111998 Pantoea agglomerans 97% Epífita Rama Enferma
3IB NR_024662 Pseudomona plecoglossicida 95% Epífita Cuello Enferma
3IA NR_042349 Enterobacter ludwigii 97% Epífita Cuello Enferma
3IIA NR_024662 Pseudomona plecoglossicida 99% Epífita Rama Enferma
3IIIA NR_024662 Pseudomona plecoglossicida 98% Epífita Rama Enferma
3IC NR_024662 Pseudomona plecoglossicida 99% Epífita Rama Enferma
3IIIC NR_042349 Enterobacter ludwigii 99% Epífita Rama Enferma
3IIB NR_042349 Enterobacter ludwigii 99% Epífita Cuello Enferma
3BM NR_042315 Curtobacterium pusillum 98% Endófita Rama Enferma
6BM NR_042315 Curtobacterium pusillum 95% Epífita Rama Enferma
7BM NR_026156 Curtobacterium citreum 99% Epífita Rama Enferma
10BM NR_104839 Curtobacterium oceanosedimentum 97% Endófita Rama Enferma
13BM NR_026156 Curtobacterium citreum 98% Epífita Rama Enferma
14BM NR_042315 Curtobacterium pusillum 99% Epífita Rama Enferma
16BM NR_025922 Staphylococcus warneri 99% Endófita Tronco Enferma
18BM NR_104839 Curtobacterium oceanosedimentum 99% Epífita Rama Enferma
20BM NR_114215 Pseudomonas luteola 93% Epífita Rama Enferma
21BM NR_025922 Staphylococcus warneri 91% Epífita Rama Enferma
3EP1 NR_117946 Bacillus amyloliquefaciens 97% Epífita Rama Enferma
4EP1 NR_118950 Bacillus subtilis 88% Epífita Rama Enferma
4EP3 NR_025122 Bacillus endophyticus 99% Epífita Rama Enferma
Prec MW Prec m/z Best Sequence Protein Specie Identified by Ident Accession
1673.6967 1674.704 LVSWYDNEWGYSR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2SSH4
2151.8887 2152.896 GILGYTEDDIVSSDLNGDNR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2SSH4
818.4304 819.4377 VGINGFGR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase OS Macrophomina phaseolina Protein Pilot 13.90% K2SSH4
2368.0466 2369.054 SAVDETLPNYGGVYAGDGSNAGVR Thiamine pyrophosphate enzyme TPP-binding protein Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2QQI7
1053.5096 1054.517 FVELYMPR Thiamine pyrophosphate enzyme TPP-binding protein Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2QQI7
969.4402 970.4475 YSEYPGVR Thiamine pyrophosphate enzyme TPP-binding protein Macrophomina phaseolina Protein Pilot 32.40% K2QQI7
1051.4617 1052.469 DLWWNYR FAD linked oxidase Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2RK68
975.5063 976.5136 VWLQQFR FAD linked oxidase Macrophomina phaseolina Protein Pilot 0.70% K2RK68
1656.7286 1657.736 YPEGDNIHVNWTGR 6-phosphogluconate dehydrogenase decarboxylating Macrophomina phaseolina Protein Pilot 99% K2S8M9
1143.5726 1144.58 SSLGPSDAVLAK hypothetical protein MPH_09945 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG12953.1
1673.6987 1674.706 RSTLPDAVACGIATSR hypothetical protein MPH_06777 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG16082.1
1646.7107 1647.718 ANTNCTVAEGIDRAR hypothetical protein MPH_06175 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG16594.1
2058.9197 2059.927 TTGMAASAYTTNMERNSPR hypothetical protein MPH_01866 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG20832.1
2192.1206 2193.128 AGEEAAADAALGLVLLLDQVPR hypothetical protein MPH_09564 Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG13282.1
1695.6497 1696.657 RPSCAVDMQHAPRR Glycoside hydrolase Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG13172.1
2025.0046 2026.012 QNLEETGMGFDAEVQMVK Putative TIM-barrel signal transduction protein Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG17264.1
2951.2017 2952.209 LPMWEKMQAPDIAIDYWKMPEGNR Alternative oxidase Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG17769.1
2210.0476 2211.055 FVDTSAQEAAAAAWQDVFQR SNF2-related protein Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG15835.1
1862.9547 1863.962 KGAQVIYDVVTSTGAAAGR Short-chain dehydrogenase/reductase SDR Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG13230.1
2883.2146 2884.222 QHIASWWPSWNMEPRAPRWEFR protein of unknown function Macrophomina phaseolina Protein BLAST 100% EKG14295.1
2253.9036 2254.911 MNFSHGSYEYHQSVIDNAR Pyruvate kinase Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GDV7
1834.8607 1835.868 TEWLSQLNTEYRPAK Pyruvate kinase Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GDV7
1053.5117 1054.519 FVELYMPR Putative pyruvate decarboxylase protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1EZ71
1307.5427 1308.55 SDFNTTGFTYR Putative pyruvate decarboxylase protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 98.90% R1EZ71
1518.6687 1519.676 DSFAAGWGVMVSHR Putative enolase protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GXH7
1708.8707 1709.878 VIVVAYHPSNNELVR 40S ribosomal protein S8 Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GA90
1195.5256 1196.533 WSYEDVEIR Putative 40s ribosomal protein S5 Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1GEL1
Resultados y Discusión
Tabla 3. Secuencias peptídicas obtenidas del análisis MALDI-TOF7TOF MS, las cuales correspondieron a proteínas de seis hongos asociados a las GTD.
1256.6947 1257.702 LGSVLVQCILR Putative phosphate transporter protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1G8S4
1244.4907 1245.498 YGEDWEKYR Putative delta-sterol reductase protein Botryosphaeria parva Protein Pilot 99% R1EL76
1272.6387 1273.646 AVSLTWPNETR putative trna processing endoribonuclease protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007587580.1
1607.7966 1608.804 DGSIAMAVLGVRFTR putative polyketide synthase protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007588609.1
2951.3357 2952.343 FHGSATWNIEICGANFKPLPMYLNR putative rna-dependent rna polymerase protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007589444.1
1481.7167 1482.724 DRRDKPEGNMHK putative inositol monophosphatase protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007583401.1
2247.0427 2248.05 TSSHSESNSLYEAKPVLGQGR putative integral membrane protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007584725.1
1350.6107 1351.618 EYAAEAIQGSRR putative cercosporin toxin biosynthesis protein Neofusicoccum parvum Protein BLAST 100% XP_007585443.1
1053.5096 1054.517 FVELYMPR Putative pyruvate decarboxylase Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A0G2GHC2
1350.6107 1351.618 QPIDVAEYLFR Putative pyruvate decarboxylase Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A0G2GHC2
2265.0518 2266.059 ENDIVITETGTANFGIWETR Putative pyruvate decarboxylase Diplodia seriata Protein Pilot 89.40% A0A0G2GHC2
1779.9507 1780.958 ALENPQRPFVAILGGAK Phosphoglycetare kinase Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A0G2EPE0
1440.7556 1441.763 ATDGQIVLLENLR Phosphoglycerate kinase Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A1S8BL31
1790.8947 1791.902 LEKGASYDEIKETIR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP86720.1
1524.6127 1525.62 HYGMTPDDYTAVR Putative thiamine biosynthesis protein Diplodia seriata Protein Pilot 99% A0A0G2F1L8
1868.8436 1869.851 IEEELGSQAVYAGKNFR putative phosphopyruvate hydratase Diplodia seriata Protein BLAST 100% XP_020127401.1
2090.9397 2091.947 AQAEQALWKWVGEWHPR Aldehyde reductase 2 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP84324.1
1394.5747 1395.582 YYPAEDEQQPR putative 60s ribosomal protein l6 Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY22334.1
1006.3928 1007.4 AGATAQMGAGR hypothetical protein BK809_0004048 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP85378.1
2367.0156 2368.023 ANQANHWNIDYRAVLQIWR putative 6-phosphogluconate dehydrogenase Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY14827.1
1389.6766 1390.684 EGTNGSTQPAYGAR GTP-binding protein rhoC Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP86342.1
1705.7537 1706.761 AGIPKESIFDEELMK Chromatin-remodeling complexes subunit NGG1 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP82564.1
1481.7167 1482.724 GAPGSMGPPQRPADK putative transcription initiation factor tfiid component taf4 Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY13456.1
2020.8997 2021.907 LSAQFQNGFHDSNADQSR putative ccch zinc finger and rrm domain-containing protein Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY23048.1
2673.2666 2674.274 NTAAFLVEPIQGEAGIVVPDDSYLR putative l-ornithine aminotransferase Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY17893.1
1834.8937 1835.901 GTVIAEYVWIDGSNGVR putative glutamine synthetase Diplodia seriata Protein BLAST 100% KKY14390.1
2934.2397 2935.247 AGCYAPTLHEHNTPGRCYSYHCQR Rho1 guanine nucleotide exchange factor 3 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP83955.1
2951.2507 2952.258 HYELHKNTVLPFIPLDDDGEEDINK Serine/threonine-protein kinase ATG1 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP85750.1
2151.8887 2152.896 DGEETGYPIGMTPKQSRNR ATP-dependent DNA helicase mph1 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP87502.1
1193.5616 1194.569 AVNMPGNYVGR Pumilio-like protein 1 Diplodia seriata Protein BLAST 100% OMP86744.1
1673.7136 1674.721 LVSWYDNEWGYSR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Diplodia corticola Protein Pilot 99% A0A1J9R8I0
1053.5096 1054.517 FVELYMPR Pyruvate decarboxylase Diplodia corticola Protein Pilot 99% A0A1J9R1X2
2306.1357 2307.143 KPYVLPVPFQNVLNGGSHAGGR enolase Diplodia corticola Protein Pilot 99% A0A1J9RUF2
1382.7677 1383.775 ATGGQIVLLENLR Phosphoglycerate kinase Diplodia corticola Protein Pilot 99% A0A1J9RAW6
1601.8247 1602.832 ARARAATTELDSNAR epidermal growth factor receptor substrate 15-like Diplodia corticola Protein BLAST 100% XP_020129707.1
2367.0437 2368.051 DGVKVYDFLPMQTVVNATVVR conidiation-specific protein (con-13) protein Diplodia corticola Protein BLAST 100% XP_020128865.1
1655.6816 1656.689 RSSDPSSPPQSPEER hypothetical protein BKCO1_300072 Diplodia corticola Protein BLAST 100% XP_020134487.1
1440.7556 1441.763 SDRVSVDPAKVIR 10-deacetylbaccatin III-10-O acetyltransferase Lasiodiplodia theobromae Protein Pilot 99% A0A0D4BT92
1440.7556 1441.763 LSESDIRPDRIR LasS1 (Lasiodiplodin) Lasiodiplodia theobromae Protein Pilot 99% X4YI58
1382.7677 1383.775 LTIGNPGLLDTLR LasS1 (Lasiodiplodin) Lasiodiplodia theobromae Protein Pilot 0.20% X4YI58
1382.7677 1383.775 LDDALRDGDSIR LasS1 (Lasiodiplodin) Lasiodiplodia theobromae Protein BLAST 100% AHV78245.1
1351.6857 1352.693 EFKPVNQKPRR LasS2 (Lasiodiplodin) Lasiodiplodia theobromae Protein BLAST 100% AHV78247.1
1382.7677 1383.775 QDNGGVVLLENLR Phosphoglycerate kinase Togninia minima Protein Pilot 99% R8BAM1
1647.7806 1648.788 LGDVYINDAFGTAHR Phosphoglycerate kinase Togninia minima Protein Pilot 94.50% R8BAM1
1673.7136 1674.721 LVSWYDNEWGYSR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Togninia minima Protein Pilot 97.30% R8BM12
1456.7496 1457.757 VPTSNVSVVDLTAR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Togninia minima Protein Pilot 80.90% R8BM12
1101.5797 1102.587 GQKLADNSNR Putative Zn 2cys6 transcription factor protein Togninia minima Protein Pilot 99% R8BE84
1354.6866 1355.694 RYQAQELGENM Putative cortical actin cytoskeleton protein asp1 protein Togninia minima Protein Pilot 99% R8BHX7
1868.8436 1869.851 QLEEQQAAYYVRQSR putative phosphorus acquisition-controlling protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007914704.1
1440.7556 1441.763 LAISKETIAINLR putative cleavage and polyadenylylation specificity protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007916345.1
1501.7777 1502.785 RYTLDVVQQPKR putative developmental regulator protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007914683.1
1790.8947 1791.902 LSTSQEEEEPITLSTK putative surfeit locus protein 6 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007913292.1
2151.8887 2152.896 GDVMIRDLRLWHAGMPNR putative phytanoyl- dioxygenase protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007919464.1
2400.0896 2401.097 AEMEAFLTKYSQSYFGNDKR putative vps52 sac2 family protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007918651.1
2673.2666 2674.274 EIPEFTNNIAMESIKMATDPEHR putative short chain dehydrogenase protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007916810.1
2414.0818 2415.089 EAPPEQMVFYEAANDSAMEER putative serine threonine protein kinase protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007918280.1
2367.0437 2368.051 RKDVWNLLTAMSEYLICVR putative upf0171 domain protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007918350.1
1779.9797 1780.987 KGPGSTTNSDKNMSAER putative fibronectin type III domain-containing protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007916911.1
2400.1157 2401.123 TESAIRLTHIPSGTVVSMQDSR putative peptide chain release factor 1 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007912665.1
1518.6277 1519.635 MMEGFARDVMER putative dna-binding protein smubp-2 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007916178.1
2934.1746 2935.182 IMTDAVTGQSRGYGFVRFAEEGDQQR putative trna selenocysteine-associated protein 1 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007911032.1
1481.7537 1482.761 SQKWGQPHCQAR putative dipeptidyl-peptidase 3 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007913215.1
1318.6997 1319.707 IQDSQDELQSR putative rho-gtpase-activating protein 8 protein Phaeoacremonium minimum Protein BLAST 100% XP_007917645.1
1300 1440 1580 1720 1860 2000
Mass (m/z)
3.9E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - I.B 30-05-17 USO COMUN; Run #3; Label A21
1869.8512(R12128,S373)
1836.9015(R11737,S338)
1648.7639(R11858,S292)
1441.7632(R10351,S265) 1773.8778(R12713,S245)
1767.9629(R13238,S208)1542.7542(R9729,S169)
1674.7146(R13569,S138)1544.7465(R11848,S64) 1756.8530(R16619,S112)
1855.8507(R14012,S106)
1541.7761(R11781,S97)1631.7657(R12218,S60)
1909.9163(R15491,S52)1821.8560(R15644,S56)1390.6731(R11577,S58) 1690.8185(R10993,S55)
LSESDIRPDRIR
A
1600 1700 1800 1900 2000 2100
Mass (m/z)
3.3E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - I.B 30-05-17 USO COMUN; Run #3; Label B7
1780.9872(R11900,S518)1648.7882(R11107,S468)
1707.8331(R14004,S290)1836.9091(R14089,S183)
1722.8956(R14358,S155)1835.9014(R13722,S146)
1674.7335(R13503,S93)2027.9769(R18624,S72)1773.8929(R13138,S79)
Los espectros de masas muestran los picos de intensidad detectados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF A) El pico 1441.7632 (m/z) representa la secuencia que
corresponde a LasS1, una enzima relacionada a la biosíntesis de la fitotoxina lasiodiplodin de Lasiodiplodia theobromae. B) El pico 1780.9872 (m/z) representa la secuencia quecorresponde a una putative fibronectin type III de Phaeoacremonium minimum.
KGPGSTTNSDKNMSAER
m/z
m/z
B
Lasiodiplodia theobromae
Phaeoacremonium minimum
Resultados y Discusión
699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0
Mass (m/z)
6.4E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - 0262; Run #3; Label A10
1674.7042(R11992,S1559)
1791.8805(R18077,S602)
742.3502(R7975,S379)1525.6201(R15961,S411)
819.4377(R8034,S285)1812.8606(R19722,S301)
1457.7451(R15589,S244)2193.0203(R20415,S301)795.4138(R8445,S162) 2952.2087(R19630,S543)
1478.6599(R16730,S128)892.9924(R9070,S92) 2211.0059(R22640,S114)1808.8740(R20638,S54)
799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0
Mass (m/z)
2.8E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - I.B 30-05-17 USO COMUN; Run #3; Label A20
1054.5167(R8043,S302)
2110.9746(R13364,S168)
2369.0544(R14882,S368)
1351.6179(R8684,S207)
1368.6460(R7818,S152) 2266.0593(R15469,S229)
970.4475(R8124,S114)2211.0598(R16318,S135)877.0206(R9624,S92)
2071.0396(R16568,S117)1070.5060(R8606,S71)2415.1741(R22230,S125)1738.8594(R13056,S84)
1674.7378(R11208,S64) 2814.3533(R16658,S121)
EYAAEAIQGSRR
B
A
LVSWYDNEWGYSR
LEKGASYDEIKQTI
m/z
m/z
Botryosphaeria parva
Macrophomina phaseolina
Resultados y Discusión
Los espectros de masas muestran los picos de intensidad detectados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF A) El pico 1351.6179 (m/z) representa la secuencia que
corresponde a la enzima relacionada a la síntesis Cercosporin de Botryosphaeria parva B) El pico 1674.7042 (m/z) representa la secuencia que corresponde a una enzimaGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase de Macrophomina phaseolina.
Resultados y Discusión
Actividad Glicolítica
21%
Actividad Catalítica
10%
Actividad Oxido-
Reductasa
10%
Trasducción de Señal
5%
Traducción
5%
Transcripción
5%
Proceso Co-enzimatico
3%
Unión a ATP
3%
Unión a ADN
2%
Unión a ARN
2%
Transportador
Transmembrana
2%
Otras funciones (< 1%)
17%
No determinada
15%
Gráfico que representa la clasificación de las proteínas fúngicas de acuerdo a su proceso biológico y/o función molecular, mostrando diferencias en porcentajes.
Análisis mediante MALDI-TOF MS
Análisis de lipopéptidos antifúngicos
Cultivo dual
L. theobromae – Bacillus
sp. M1 strain
3 y 4. Análisis metabolómico de Bacillus sp. contra Lasiodiplodia theobromae por espectrometría de masas MALDI-TOF y MS IMAGING
Resultados y Discusión
1
23
4
1
2
B
A
1040 1054 1068 1082 1096 1110
Mass (m/z)
2810.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - lasiodiplodia-IB-24-01-17; Run #8; Label C11
1081.4435(R10803,S578)
1095.4564(R10670,S323)
1043.4814(R9836,S228)
1065.4725(R11335,S181)
1057.4961(R9625,S110) 1093.4923(R11127,S94)1071.5104(R9940,S89)1079.4830(R10837,S83)
1400 1432 1464 1496 1528 1560
Mass (m/z)
6745.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - lasiodiplodia-IB-24-01-17; Run #12; Label D17
1501.7832(R10688,S1091)
1463.8053(R10500,S727)
1487.7798(R10337,S493)
1515.8024(R10902,S487)
1449.7898(R10916,S304) 1529.8131(R11119,S378)1477.8159(R11442,S305)
1491.8278(R10701,S237)1473.7651(R9612,S191)
1435.7766(R12026,S136)1499.8138(R11928,S140)1471.7955(R10862,S123)
1457.7777(R10691,S55)
m/z
Cultivo dual mostrando la
inhibición de L. theobromae
por Bacillus sp. M1
Confirmación del gen
Fengyncin por PCR
M1 M1* M2 M2* A1 A1*
M1 M1* M2 M2* A1 A1*
Confirmación del gen Iturin por
PCR
A) Los picos 1463.8053 (m/z) y 1529.831 (m/z) representan la m/z de los lipopéptidos antifúngicos que corresponden a Fengycin (fleche roja) y Mycobacillin (fleche azul),
respectivamente. B) Las flechas rojas representan las masas de isoformas de Iturin de la cepa de Bacillus sp. M1.
Resultados y Discusión
m/z
A) Distribución especial de Mycobacillin (m/z = 1529.64) presente en un medio solo
con la cepa de Bacillus sp. M1 como control (izquierda); distribución especial de
Mycobacillin (m/z = 1529.64) presente en la interacción de Lasiodiplodia theobromae -
Bacillus sp. M1 mostrando una mayor intensidad. B) Distribución especial de Fengycin
(m/z = 1463.91), los resultados son similares a los de Mycobacillin.
Visualización de los metabolitos de la zona de inhibición mediante
MS IMAGING
B
A
Zona de inhibición
Análisis Metabolómico mediante MS IMAGING
Resultados y Discusión
Cultivo dual mostrando la inhibición de L.
theobromae por Bacillussp. M1
Conclusiones
1. Este estudio, ha podido revelar la presencia de las GTD en las condiciones de Piura. Botryosphaeria dieback y Petri
disease (young Esca) han sido confirmadas en este estudio como establecidas en los viñedos piuranos afectando de
manera seria y con amenaza de propagarse rápidamente si no se toman medidas urgentes.
2. Por primera vez fue revelada la comunidad microbiana asociada a los tejidos de la madera de vid mediante
metagenómica. Las comunidades bacterianas están interactuando con los hongos asociados a las GTD, algunas de ellas
son marcadoras de plantas sanas y enfermas, lo cual permitiría responder a las cuestiones de cuál es el rol de las bacterias
en una enfermedad que ha sido considerada por mucho tiempo netamente fúngica. Sin embargo queda mucho por
investigar.
3. Este trabajo, reporta por primera vez, 4 nuevas especies de hongos patógenos asociados a GTD en Piura, Peniophora
sp., por secuenciamiento ITS y Macrophomina phaseolina, Diplodia corticola y Diplodia seriata por espectrometría de
masas MALDI-TOF/TOF, con esto la espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF es una tecnica potente, rápida y confiable
para la identificación de hongos patógenos de la vid.
4. Se analizaron aislamientos bacterianos candidatos para su uso en control biológico de las GTD como una cepa de
Bacillus sp. M1. MALDI-TOF/TOF y MS IMAGING han permitido analizar e identificar moléculas de interés e importancia
antifúngica, los cuales podrían tener utilidad a gran escala en la prevención de enfermedades fúngicas de la vid y otros
cultivos de importancia económica en el Perú.
Agradecimientos
A través del financiamiento de CIENCIACTIVA del CONCYTEC, se pudo presentar estos resultados en el
10th International Workshop on Grapevine Trunk Diseases en Reims, Francia.
Agradecimientos
the Dorrestein Lab.The Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences
The Departments of Pharmacology, Chemistry and Biochemistry
I EBP-E
Biotecnología del Limón Citrus aurantifolia
Ing° James Leigh / M.Sc. Aimi Nouchi
SOMATITO EIRL INCABIOTEC SAC
Producción de limón en Sudamérica(2014)
Otros14% Loreto
4%
Tumbes7%
Lambayeque19%
Piura56%
Producción de limón a nivel nacional
(2013)
5°Chile
134 161 Ton.
4°Colombia
142 859 Ton.
1°Argentina
1 402 011 Ton.
2°Brasil
1 101 799 Ton.
3°Perú
275 520 Ton.
FAOSTAT (2014)
¿Qué aplicaciones biotecnológicas se desarrollan actualmente en el cultivo de limón?
Sci. Rep. 2014
Characterization of limes (Citrus aurantifolia) grown in Butan andIndonesia using high-troughput secuencing.Penior T, Mimura T, Matsumoto R, Nagano Y.
Methods Mol. Biol. 2015
Citrus transformation using juvenile tissue explants.Orbovic V, Grosser JW.
BMC Microbiol. 2011
Identification of genes differentially expressed during interaction ofMexican lime tree infected with "Candidatus Phytoplasma aurantifolia".Zamharir MG1, Mardi M, Alavi SM, Hasanzadeh N, Nekouei MK, Zamanizadeh HR,Alizadeh A, Salekdeh GH.
Phytopathology. 2017
In Silico probe-based detection of citrus viruses in NGS data.Jooste TL, Visser M, Cook G, Burger JT, Maree HJ.
Biotecnología enfocada al diagnóstico y detección de enfermedades
ELISA (Enzyme-Linkend ImnunoSorbent Assay)
PCR (Polymerase Chain Reaction)
RT-PCR
qPCR
Multiplex PCR
IC-PCR
Técnicas Blot
Northen Blot
Western Blot
Mass Spectrometry
MALDI-TOF/TOF MS
Extracción de ARN total
Extracción de proteínasDigestión enzimáticaAnálisis espectrométricaMALDI TOF TOF
Muestras
Electroforesis de agarosa
RT-PCR
499.0 1101.4 1703.8 2306.2 2908.6 3511.0
Mass (m/z)
8.1E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - 0262; Run #3; Label A5
1465.6611(R9446,S5224)
2169.8206(R15270,S3145)
898.3604(R9091,S2025)
1964.7795(R16241,S1597)
1275.5463(R12884,S1004)665.9846(R7437,S854)
1451.5264(R13256,S442) 3050.2285(R12866,S1224)914.3456(R9398,S352) 2279.0032(R15794,S415)506.1404(R5679,S237) 1497.5999(R12846,S130) 3066.2346(R12018,S107)
Metodología:
Detección de principales strains del virus de la tristeza de los cítricos en principales regiones productoras. (A) La Peña, Lineas: 1, strain B165; 2,strain VT; 3, strain T30, 4, strain T3; 5, strain B36 (B) Cabuyal, Lineas: 1, strain T36; 2, strain T3; 3, strain T30, 4, strain VT; 5, strain B165 (C)Matapalo, Lineas: 1, strain T36; 2, strain T3; 3, strain T30, 4, strain VT; 5, strain B165; (D) Canoas de Punta Sal Lineas: 1, strain T36; 2, strain T30; 3,strain T3, 4, strain VT; 5, strain B165.
Tabla 2. Detección de cepas por zonas productoras de limón en el
departamento de Tumbes. Provincia Distrito Sector Cepas
T36 T3 T30 VT B165
Cont. Villar Canoas de Punta Sal
+ + + + +
Tumbes Pampas de Hospital
San Jacinto
Cabuyal
La Peña
+
+
+ +
+
+ Zarumilla Matapalo
+ + + + Predominancia de genotipos VT y T3, relacionadas al
síntoma de acanaladura de la madera.
Genotipaje de cepas de CTV en árboles de limón sutil (Citrus aurantifolia) por RT-PCR.
Detección general de CTV en diferentes árboles
colectadas aleatoriamente en los sectores
productores de limón. Línea: 1, árbol 1; 2, árbol 2;
3, árbol 3; 4, árbol 4; 5, árbol 5.
Resultados:
Especificidad de infección
Replicación y encapsidación
viral
Resultados:
Se detectaron un total de 83 secuencias peptídicas, 41 correspondientes a 10 proteínas virales.Espectros de masas. Masas obtenidas a partir de análisis Maldi ToF, mostrando masas de péptidos detectados.
Implementación de la técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para detección viral en C. aurantifolia y T. citricida.
Especificidad de infección
Espectros de masas. Masas obtenidas a partir de análisis Maldi ToF, mostrando masas de péptidos detectados.
Especificidad de infección
ResistenteSusceptible
Resultados:
Espectros de masas. Masas obtenidas a partir de análisis Maldi ToF, mostrando masas de péptidos detectados.
Silenciamiento de mecanismo de
defensa de la planta
699.0 1261.4 1823.8 2386.2 2948.6 3511.0
Mass (m/z)
4.2E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - 0262; Run #15; Label P9
1465.7288(R11392,S5040)
804.2806(R6595,S3188)
2169.9402(R16160,S1673)
1187.6431(R11030,S1398)1516.8369(R13730,S1268)
2279.1404(R14701,S840)1964.8845(R16802,S715)898.3961(R8969,S828)1275.6064(R12351,S830)3050.4275(R12189,S1226)776.2522(R7684,S544)
1546.7429(R14047,S419)1121.5824(R10758,S399) 2007.8822(R15605,S250)826.2641(R8214,S242) 2409.1440(R15228,S152)1291.6958(R10456,S140) 2892.3279(R15838,S108)
Resultados:
Espectros de masas. Masas obtenidas a partir de análisis Maldi ToF, mostrando masas de péptidos detectados.
Fijación de partícula viral en el conducto
alimenticio del vector:
699.0 1261.4 1823.8 2386.2 2948.6 3511.0
Mass (m/z)
5419.6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - 0262; Run #15; Label O23
892.4473(R10014,S730)1687.8527(R15194,S577)
1323.6538(R12435,S572)1878.8807(R15407,S567)
1295.5205(R11938,S404)
2415.1541(R15777,S485)804.2709(R8761,S399)
1718.8400(R13539,S295)
2329.9666(R16202,S327)
1791.8627(R14752,S85)948.4609(R10136,S214) 2409.1521(R17876,S250)1181.5975(R11578,S140) 1955.8577(R16724,S147)1612.7444(R14099,S112)
2334.0420(R11920,S72)855.0306(R9308,S103) 1907.8889(R16263,S77)1579.7468(R14379,S61)1229.5784(R11564,S55)719.9170(R7455,S62)
2742.2144(R16302,S77)
Resultados:
Gráfico representativo basado en la funcionalidad de las proteínas detectadas mediante secuencias
peptídicas por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF en plantas de limón sutil.
Análisis de secuencias peptídicas correspondientes a proteínas vegetales.
22 secuencias peptídicas propias de C. aurantifolia fueron detectadas
correspondiendo a 12 posibles proteínas.
Implementación de la técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para detección viral en C. aurantifolia.
Resultados:
Secuencias peptídicas identificadas por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF en
C. aurantifolia y sus respectivos procesos biológicos.
Implementación de la técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para detección viral en T. citricida.
Resultados:
Se detectaron 22 secuencias, correspondientes a 19 proteínas, encontrándose 3 proteínas putativas (AAV31409.1, AAU84947.1, AAU84936.1) reconocidas en T. citricida.
Aplicación para determinación de genotipos virales.
Base de Datos: UniProt
Base de Datos: NCBI Nucleotide
Resultados:
Aplicación para determinación de especies de insecto vector.
Resultados:
Se detectaron 22 secuencias, correspondientes a 19 proteínas, encontrándose 3 proteínas putativas (AAV31409.1, AAU84947.1, AAU84936.1) reconocidas en el mismo insecto
analizado (T. citricida)
OBTENCIÓN DE PLANTONES DE LIMÓN EXENTOS DE PATÓGENOS Y
COLONIZADOS POR MICROORGANISMOS NATIVOS
BÉNEFICOS DE LA RIZÓSFERA.
PIMEN-12-P-237-039-16/ GANADOR
COMPONENTE 1 COMPONENTE 2
Estandarización de técnicas moleculares de detección. Estudio y Aislamiento de microrganismos nativos de la rizósfera de limón.
COMPONENTE 3 COMPONENTE 4
Evaluación de propiedades benéficas de microorganismos aislados. Obtención de plantones sanos y colonizados por microorganismos benéficos.
Laboratorio de Micología y BiotecnologíaUniversidad Nacional Agraria La Molina, Perú
Primer Encuentro Binacional
Biotecnológico
La Biotecnología en el Perú
“Lo nuevo y lo desconocido son el motivo de la investigación y de la ciencia;
el científico no teme a lo nuevo y a lo desconocido, lo enfrenta, lo clarifica, lo
explica, abre camino”
Los primeros pasos…
Marcel Gutiérrez Correa (1952-2017)
1984 Primer Curso Nacional de
Biotecnología y publicación del libro
“Principios de Biotecnología”.
1986 Presidente de la Primera Comisión
Nacional de Biotecnología, creada por
CONCYTEC-
1987 Primer Plan Nacional de
Biotecnología.
M. Gutiérrez-Correa, Perú Económico, Enero 2007.
Economía basada en la biotecnología que
usa materias primas renovables,
particularmente biomasa y recursos
genéticos para producir alimentos,
productos y energía al menor costo
ambiental y con la mayor rentabilidad.
La inserción de la biotecnología en la economía mundial ha
dado lugar a La Bioeconomía, en la que los genes y los
procesos de base biológica son los elementos
fundamentales.
Materia prima agrícola convencional Biomasa
Procesos
químicos y
termoquímicos
Combustibles Plásticos (Bio)químicos BiomaterialesAlimentos
Los hongos filamentosos
como sistemas productivos
Biotecnología Industrial
ácidos orgánicos, proteínas,enzimas, metabolitossecundarios
Biotecnología
Médicacompuestos bioactivos,
biofármacos
Ventajas:
•Versatilidad metabólica
•Sistemas robustos
•Alta capacidad de secreción
•Fuentes de nuevos genes
Biotecnología
Agrícola compuestos bioactivos,
biofármacos
Biotecnología
AmbientalEnzimas, degradación de
xenobióticos
Prioridades de investigación
Crecimiento, diferenciación y expresión génica, asociadas a
productividad.
Uso de tecnologías de alto impacto para prospección, tamizado y
clonamiento.
Uso de herramientas de biología sintética y edición génica para
manipulación y re diseño de genomas de hongos.
Desarrollo de cepas mejoradas en producción y secreción de
proteínas.
Obtención de cepas inocuas mediante optimización de genomas.
Entendimiento de patogénesis en diferentes hospederos y
grupos filogéneticos incluyendo el establecimiento de modelos de
infección.
Desarrollo de estrategias para obtención de nuevos compuestos
antifúngicos.
Formulación
Formulación
Bioprospección
Genómica
Funcional
Biología
Sintética
Ingeniería
Genómica
Aislamiento de genes para enzimas y vías
metabólicas a partir de metagenomas y de
especies
Análisis transcriptómico y proteómico global –
Expresión diferencial de genes – Análisis de
vías metabólicas
Diseño y construcción de factorías celulares
para etanol celulósico, enzimas y proteínas
recombinantes
Sistemas de Adhesión a Superficies
Optimización de
bioprocesos
Desarrollo de
Bioprocesos
Ingeniería
Biológica
Producción y uso de enzimas – Modelamiento
matemático – Diseño de biorreactores
Uso de herramientas genómicas en
optimización – Estrategias de respuestas de
superficie
Producción de etanol y otros metabolitos –
Sistemas de muy alta gravedad (VHG)
Líneas Áreas Temas
Líneas de Investigación del Laboratorio de Micología y Biotecnología
al 2021
Bioprospección celular de hongos con capacidades
metabólicas específicas
Ambiente Aislamiento Tamizado
cualitativo
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
pH4.8 pH7.4 pH8.4 pH9.4
Endoglucanasa
Cultivo y
cuantificación de
actividad (enzimas
o metabolitos)
Secuenciamiento de genomas de cepas con
distintas capacidades enzimáticas
• Aspergillus fumigatus LMB-35Aa, Accession PRJNA298653, native
• Talaromyces wortmannii LMB-HP14, Accession PRJNA300345, native
• Aspergillus niger ATCC 10864, Accession PRJNA300350, culture collection.
C
BL
CB
M
CB
X
A heat map of some selected genes expressed in
different media grown Biofilms
Identification of different CAZymes family in
different media
AA= Auxiliary
Activities
GH= glycoside
hydrolases
CE= carbohydrate
esterases
PL= polysaccharide
lyases
GT=
glycosyltransferases
CBM= carbohydrate-
binding modules
Optimización de procesos asistida por herramientas de
genómica funcional: Transcriptómica de biopelículas
IEFSDS
PAGE
Mr
2D-PAGE and MS-Tof
analysis of Aspergillus
niger biofilms – Villena
et al. (2009) RPB 16(1):
101-108.
Búsqueda de celulasas alcalinas para procesos de acabado textil:
Electroforesis en gel de agarosa 1% de productos de PCR
purificados para 18S e ITS. Carril 1, marcador Lambda
HindIII; 2, cepa LMHP32 para 18S; 3, cepa LM-HP33 para
18S; 5, LM-HP37 para 18S; 7, cepa LMHP32 para ITS, 8,
cepa LMHP33 para ITS; 9, cepa LMHP37 para ITS.
Identificación molecular (18S e
ITS)
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
Act.
En
do
glu
can
asa
(U/m
l)
Cepas
pH4.8
pH7.4
pH8.4
pH9.4
Genome characteristics of alkaline cellulase producing Ascomycota strains
LMB-35A isolated from soils of the Peruvian Amazonian Forest
Characteristic Aspergillus fumigatus LMB-35Aa
Place of isolation Tingo Maria Forest (Peru)
Contigs Generated 234 (19)
Maximum Contig Length (MB) 2.52
Assembled Genome Size (MB) 27.56 (29.4)
N50 value 0.726
Total Predicted Proteins 8,660 (9,926)Total Annotated Proteins 8,617 (6,638)Total Unannotated Proteins 43 (3,288)
Secondary metabolism gene clusters
33 (26)
Secondary metabolism genes 57 (36)
CAZymes genes 173
Accession (Bioproject, NCBI) PRJNA 298653
Data in yellow is from the clinical strain Aspergillus fumigatus
Af293 (Nature 438, 1151-1156, 2005).
0.00
1.00
2.00
3.00
40 50 60 70
En
zym
e a
cti
vit
y (
U/m
l)
Temperature (ºC)
Endoglucanase at pH 9.4
Important for the textile industry
Sample Total
number of
raw reads
Total
processed
reads
LMB-35A 2*13799222
(27.59
Million)
2*13299739
(26.59 Million)
Búsqueda de hongos decoloradores de tintes azoicos reactivos:
Ascomicetos
Tamizado en microplacas
:LA: levafix amarillo
ST: Sinosol turquesaSA: Sinosol amarillo
LR: levafix rojoRN: remazol negroAB: azul brillanteRR: remasol rojo
RP: rojo profundo
Análisis molecular (PCR)
de la diversidad
metabólica (lacasas) para
decoloración de tintes
azoicos
Bioreactor paratratamiento de efluentes textiles con
Trametes polyZona LM-TM5
Biofilm 0 h
96 hPreapring
Bioprospección molecular para búsqueda de genes
de enzimas
Diversidad microbiana
Transformación
Aislamiento del metagenoma
Vector de ligamiento
ADN Metagenomico
Transformantes
Bam HI Sau 3 A
Tamizado de recombinantes
Secuenciamiento
0
1
2
3
4
5
BG EG CBH EX
B¿usqueda de genes de celulasas y xilanasas
BG: beta 1-4 endoglucanasa
EG : endoglucanasa
CBH: celobiohidrolasa
EX: endo beta 1-4 xilanasa
0
1
2
3
4
5
6
7
8
EX endo beta xilanasa
xys A beta 1, 4 xilanasa
CBH II celobiohidrolasa
xyn A xilanasa
xyn B xilanasa
xyn D xilanasa
CBH I celobiohidrolasa
endo 1 endoglucanasa
eg1 endoglucanasa
Endoxyl xilanasa termoestable
Fuentes
termales
Suelos de
bosque
b
.
a
.
c
.
d
.
Clones
recombinantes
(E.coli) con genes de
celulasas y xilanasas
Construcción de factorías celulares de levadura para
etanol usando biología sintética
eglA
eglB
eglC
cbhB
cbhA
bgl1
Factoría celular LMB-Cel (7 genes)
Promoter-based gene assembly and simultaneous overexpression (PGASO)
xynA xynB zeoxynD
XIII ku7
0
Saccharomyces cerevisiae
Factoría celular LMB-Xyl (8 genes)
Cel
Xyl
LMB
Cel/Xyl
Barajado
genómico
Celulosa Hemicelulosa
ETANOL
Xilanasas
(15 genes)
Plataforma Proceso Método Producto(s)
Aspergillus fumigatus
LMB-35Aa
Edición genómica –
knockout de genes
toxinas
Transcriptómica
CRISPR/Cas9 Celulasas
Alcalinas
Poceso
optimizado
Trametes polyzona
LMB-TM5
Edición genómica –
inserción de genes
CRISPR/Cas9 Lacasas
Talaromyces
wortmannii LMB-
HP14
Edición genómica –
knockout de genes
toxinas
CRISPR/Cas9 Celulasas
Alcalinas
Saccaromyces
cerevisiae
Edición genómica –
knockout e inserción de
genes
CRISPR/Cas9 Lacasas y
Celulasas
Alcalinas
Saccaromyces
cerevisiae
Ingeniería metabólica Biología sintética -
PGASO
Etanol
T. polyzona-T.reesei-
A.niger
Biopulpeo y
Fermentación en
estado sólido
Trancriptomica
Proteómica –
Optimización
genómica
Celulasas
Algunas investigaciones sobre ingeniería genómica en el
Laboratorio de Micología y Biotecnología (UNALM)
Equipos e infraestructura
Proteómica y metabolómica:
1 HPLC Infinity 1260 (Agilent) – IR
1 UHPLC Bioinert (Agielnt) – DAD con colector de fracciones
y acoplable a detector MS-TOF
1CE (electroforesis capilar) – DAD – TOF (Agilent)
1 Sistema de enfoque isoeléctrico y 2D PAGE
1 Sistema de ultrafiltración tangencial
1 Ultracentrífuga 250,000g
1 Liofilizador de 6L
1 Cuarto frío a 4ºC
Genómica Estructural, Transcriptómica y Metagenómica:
1 Secuenciador Illumina MiSeq
1 Bioanalizador (Bioanalyzer, Agilent)
1 Termocicladores de tiempo real (BioRad)
3 Termocicladores (BioRad)
2 Sistemas de electroforesis PAGE
3 Sistemas de electroforesis horizontal
1 Sistema DGGE
1 Analizador de imágenes ChemiDoc (BioRad)
3 Microcentrífugas refrigeradas
Bioinformática:
1 Servidor Supermicro de 384 GB de RAM (ampliable a 1
TB), Tarjeta GPU Tesla K40, Tarjeta Nvidia K4200 y 28 TB de
almacenaje.
Fermentaciones
5 biorreactores de tanque agitado
1 biorreactor air-lift
1 biorreactor de película de discos giratorios
5 Baños agitados
1 Incubador walk-in
Microscopía:
1 Microscopio Laser Confocal de Barrido (Olympus)
1 Microscopio de fluorescencia
1 Microscopio Confocal RAMAN acoplado a Fuerza Atómica
Gretty K. Viilena, Ph.D.
Ilanit Salmolski Klein, Ph.D.
Desarrollo de la
biotecnología
microbianaDra. María Valderrama Valencia
Universidad Nacional de San Agustín
INICIO
Universidades;
Curso: Microbiología, en diferentes carreras
Sociedad Micobiológica 2007 SPC-PENI. Salud
Enfermedades Infecciosas,
microbiología de alimentos y medio ambiente (salud).
Qué permite el desarrollo
Necesidades
Conocimientos
Teóricos
Tecnológicos
Asociación entre diferentes especialistas: Multidiciplinariedad
Políticas Nacionales, Regionales
Hacia donde se apunta
Academia
DIAGNÓSTICO
VACUNAS PROTEOMICA PROBIOTICOS
METABOLICA
BIORREMEDIACIÓN
BIOCOMBUSTIBLES
BIOMATERIALES
Empresa
San Fernando 2008
FARVEST tramite
Cayetano
Hersil
Pesquera diamante
ECOSAC AGRICOLA
Somatito SAC
INCABIOTEC
CITBM
Futuras empresas
Laive
Gloria
Alcoholicas: Vinos, cerveza, productos energizantes
Detergentes
Producción de Vitaminas y complementos
Nuevos antibioticos
Solubilización del Fosforo
Cualitativa
Cuantitativa
Siembra en agar SRSM Cepas solubilizadoras
de fosforo
Siembra en medio
Pikouskaya
Medición del halo de
solubilización
𝑯𝑯𝑯 = 𝑯- 𝑯
Halo de Solubilización
del Fósforo.
Producción del Acido Indol Acético (AIA).
Cualitativa
Cuantitativa
y = 0.0166x + 0.0162R² = 0.992
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 20 40 60
Abso
rvancia
530 n
m
Concentración de AIA (ug/ml)
Curva de calibración para cuantificar la producción de AIA.
El reactivo de
Salkowsky vira a un
rojo grosella
Cepas que evidencian la
producción de AIA
Cepas creciendo en el
caldo BCuantificación de la
producción de AIA.
Capacidad antagónica frente a Fusarium oxiosporum.
3 cm. 3 cm. 3 cm.
Siembra masiva
del
actinomiceto
Placa de enfrentamiento Placa control
Siembra de un disco
de micelio del hongo
patógeno
Fusarium oxiosporum Enfrentamiento
Actinomiceto Vs
Fusarium.
Mediciones periódicas Se calcula el
porcentaje de
inhibición del
crecimiento del
patógeno
%I = x100%
Los análisis de cobre en la solución “lixiviada” de los biorreactores, arrojaron concentraciones de 10,494 g de
Cu/Kg de mineral en el Biorreactor 1 y de 9,916 g de Cu/Kg de mineral en el Biorreactor 2, ambas, mayores a
la concentración de cobre obtenida por el proceso de lixiviación química de minerales de baja ley en la mina
Cerro Verde (aproximadamente 6 g de Cu/Kg de mineral).
I Encuentro Bi-Nacional Biotecnológico Ecuador-Perú
“VALORIZACIÓN microbiológica de desechos pesqueros acuícolas y
agroindustriales”
Un solo norte, un solo objetivo: Biotecnología
Luis Aldo López Luna M.Sc
Yajaira Tatiana Toribio Delgado M.Sc.
MICROORGANISMOS
METODOLOGIA
Aislamiento
Pruebas enzimáticasPoder AcidificanteSecuenciación
molecular
Multiplex PCR
Metagenomica
Análisis de péptidos
RESULTADOS
C-0 C-3 C-6 E3-3 E3-6 2A1-3 2A1-6
C-0 C-3 C-6 E3-3 E3-6 2A1-3 2A1-6
E3-3 2A1-3E3-6 C-32A1-6 C-6
19 %20 %
PRODUCTOS APLICACIONES
Masificación de
consorcios bacterianos.
Degradadores de Cianuro,
controladores de nematodos y
probioticos para cerdos y pollos
Bioferlizantes y
bioestimulante para plantas
Arroz, uva (vid) y bananos.
Fuente de alimento
Langostinos, peces, cerdos y pollos
Caña de azúcar Etanol
370 mil litros de etanol por día4300 toneladas diarias de caña
PROCESO DE TRANSFORMACIÓN
INDUSTRIAL
BAGAZO DE LA CAÑA DE AZÚCAR
Bagazo de la caña de azúcar
¡Alto contenido de carbono!
COMPONENTE %
Celulosa 32-44
Hemicelulosa 27-32
Lignina 19-25
RESIDUO
LIGNOCELULOLÍTICO
COMPOST
El compost es uno de los mejores abonos orgánicos que
se puede obtener en forma fácil y que permite
mantener la fertilidad de los suelos con excelentes
resultados en el rendimiento de los cultivos.
•Mejora aireación del suelo
•Mejora porosidad del suelo
•Aumenta la capacidad de carga
•Consolida la estructura del suelo y su
consistencia.
•Aumenta la actividad biológica.
•Aumenta capacidad de intercambio
catiónico.
•Sirve para la supresión de enfermedades
causadas por patógenos de plantas que se
transmiten por el suelo.
Beneficios a los cultivos
El compostaje es un proceso controlado de
descomposición que transforma los materiales de
desecho crudos en sustancias húmicas establesque hacen una excelente enmienda para el suelo.
MICROORGANISMOS
Complejo enzimático
Lynd et al. (2002)
Bagazo
Dashtab et al. (2015)
Nivel biológico Nivel experimental
BIOPROSPECCIÓN
Explorar la diversidad microbiana
Capacidad metabólica de degradar de manera eficiente el bagazo de la caña de azúcar, un
residuo altamente complejo.
Valorizar
N2
pH
Pi
HIBIOCA
MICROORGANISMOS BENÉFICOS
AGUA
AGUA
ESTIERCOL
PROCESO CLÁSICO CON BIOTECNOLOGÍA
COMPOST MEJORADO
Bioprospección:
1. Aislamiento de
bacterias de
diferentes fuentes
Bagazo de caña de azúcar
Suelos prístinos
Cascarilla de arroz
Larvas de Bothynus maimon
Larvas de Diatraea saccharalis
Termitas
102 bacterias aisladas
CASCARILLA DE ARROZ (21 BACTERIAS)Código Bacteria CMC AVICEL BAGA
ZO1B Staphylococcus sciuri DSM 203452B Staphylococcus sciuri DSM 203453B Pantoea ananatis AJ 133554B Klebsiella oxytoca KCTC 16865B Pseudomonas cremoricolorata
NBRC 166346B Klebsiella oxytoca KCTC 16867B Raoultella planticola NBRC 149398B Plautia stali (simbionte) 9B Klebsiella oxytoca KCTC 1686
10B Acinetobacter baumannii ATCC 17978
+ +
11B Plautia stali (simbionte) +12B Plautia stali (simbionte) 13B Plautia stali (simbionte) 14B Kosakonia cowanii 888-76 +15B Pantoea ananatis AJ 13355 +16B Plautia stali (simbionte) +17B Plautia Stali (simbionte) +18 B Lysinibacillus macroides LMG
1847419 B Enterobacter kobei CIP 10556620 B Plautia Stali (simbionte)21 B Klebsiella oxytoca KCTC 1686
Diatraea saccharalis (27 BACTERIAS)
Código Bacteria CMC AVICEL BAGAZO01 MDS Enterobacter sp. + +
02 MDS Klebsiella variicola +03 MDS Enterobacter sp. +04 MDS Klebsiella variicola + +05 MDS Enterobacter sp. + + +06 MDS Enterobacter sp. + +07 MDS Uncultured Bacillus sp. + +08 MDS Enterobacter sp. + +10 MDS Enterobacter sp. + +11 MDS Enterobacter sp. +12 MDS Enterobacter sp. + +16 MDS Massilia timonae17 MDS Staphylococcus warneri18 MDS Staphylococcus sp. 20 MDS Sporosarcina koreensis21 MDS Lysinibacillus sphaericus26 MDS Lysinibacillus sphaericus +
27 MDS Bacillus subtilis + +
Identificación molecular, a través del gen 16S ADNr, de bacterias aisladas y determinación de la la actividad celulolítica
2. Caracterización
molecular de
bacterias aisladas
3. Determinación de
actividad celulolítica
de las bacterias
aisladasIdentificación molecular y determinación de la la actividad celulolítica cualitativa
BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR (8 BACTERIAS)Código Bacteria CMC AVICEL BAGAZO
BBC 1 Klebsiella pneumoniae strain VITP2 + +BBC 2 Klebsiella pneumonae +BBC 3 Enterobacter asburiae strain CAV1043BBC 4 Klebsiella variicosaBBC 5 Enterobacter asburiae strain CAV1043BBC 6 Klebsiella variicola strain DSM 15968BBC 7 Enterobacter sp. +BBC 8 Enterobacter sp +
SUELO (23/47 BACTERIAS)Código de Bacteria CMC AVICEL BAGAZO
M1.1 Bacillus firmusM2.1 Bacillus aryabhattaiM3.1 Bacillus nealsoniiM3.2 Bacillus thuringiensisM3.3 Bacillus sp.M4.1 Bacillus sp.M4.2 Bacillus spM4.3 Bacillus spM4.5 Bacillus cereusM4.6 Bacillus sp.M5.2 Enterobacter sp.M5.3 Enterobacter sp.M6.1A Planococcaceae bacteriumM6.1B Planococcaceae bacteriumM7.2 AcinetobacterM10.1 Uncultured bacteriumM12.1 Uncultured bacterium + +M14.3 Exiguobacterium sp.M15.3 Uncultured bacteriumM16.2 Planococcaceae bacteriumM17.1 Bacillus sp.M17.2 Bacillus nealsoniiM17.3 Acinetobacter baumannii
Identificación molecular y determinación de la la actividad celulolítica cualitativa
TERMITA (4/8 BACTERIAS)Código de la
bacteriaBacteria CMC AVICEL BAGAZO
4 Lysinibacillus sp - - -6 Lysinibacillus sphaericus - - -8 Lysinibacillus sphaericus - - -
23 Cronobacter turicensis + + -
BARRENADOR (8 BACTERIAS)Código de
la bacteria
Bacteria CMC AVICEL BAGAZO
9 Cronobacter turicensis + + -10 Cronobacter turicensis + + -11 Cronobacter turicensis + + -12 Staphylococcus arlettae - - -13 Cronobacter turicensis + + -14 Lysinibacillus sphaericus - - -
15 Lysinibacillus sphaericus - - -25 Bacillus sp + + -
Enterobacter, Klebsiella, Bacillus,
Streptomyces, Acinetobacter, Staphylococcus,
Lynsibacillus, Exigoubacterium, Alcaligenes,
Cronobacte, Massilia, Pantoea, Raoultella,
Kosakonia y Plautia (simbionte).
102 bacterias
aisladas 35 bacterias con
actividad celulolítica
Enterobacter, Klebsiella, Bacillus Massilia
Lynsibacillus Acinetobacter Plautia Kosakonia
Pantoea, Crnonobacter
Identificación molecular y determinación de la la actividad celulolítica cualitativa
(*)
15 bacterias presentaron las mejores actividades celulolíticas
Las concentraciones de glucosa generadas luego de degradar el bagazo de
la caña de azúcar fueron entre 1,9-2 g/l siendo:
BBC2 (Klebsiella; 2,04 g/l)
BBC8 (Enterobacter.; 2,05 g/l)
13 (Cronobacter; 2,08 g/l)
Ésta actividad es superior a la
reportada por Lara and Acosta
(2013) que lograron generar entre
0,8 g/l. Lo que muestra la alta
actividad enzimática de los
aislados
Determinación cuantitativa de la la actividad celulolítica
Consorcio bacterianocompuesto por los géneros de
Klebsiella, Enterobacter, Cronobacter,
Kosakoniacowanii, Pantoea y
Bacillus.
Sin embargo no existen referencias sobre la actividad celulolítica de Cronobacter y
Kosakoniacowanii, siendo nuestra investigación el primer reporte de estos género
bacterianos con actividad celulolítica, además, Cronobacter reportó la mejor actividad
enzimática entre todos los aislados.
Klebsiella (Su et al., 2014; Waghmare et al., 2014).
Enterobacter (Lokapirnasari et al., 2015; Su et al.,
2014; Toczyłowska-Mamińska et al., 2015).
Bacillus (Elkhalil et al., 2015; Kim et al., 2012),
Pantoea (Ma et al., 2016).
¡Actividades enzimáticas comprobadas !
¡Bacterias no-antagónicas!
Pruebas de antagonismo para verificar la compatibilidad bacteriana
699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0
Mass (m/z)
2.9E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - PLANTAS IB- 03-06-16; Run #3; Label I3
1233.5728(R7737,S862)
804.2696(R5165,S399)
1965.9257(R11695,S480)
2117.0815(R17412,S463)
1961.9446(R18119,S181)1216.7866(R6476,S120)
2729.2324(R21013,S176)1192.0782(R10077,S63)1803.8151(R17824,S90)2225.0188(R21699,S93)2807.2144(R28674,S86)3337.6228(R23171,S119)
Caracterización del secretoma por espectrometría de masas MALDI TOF-TOF
La concentración final adecuada para la masificación del
consorcio fue de 0,5% de Hidrolizado de residuos
blandos de concha de abanico y 1,5% de Melaza
El uso de melaza para masificación de bacterias ya
ha sido reportado (Ossa et al., 2010; Bae and Shoda,
2005)
Hidrolizado de residuos blandos de concha de abanico es una
fuente rica en aminoácidos que pueden ser fácilmente
asimilados por las bacterias (Hasan et al., 2003).
Determinación de las concentraciones adecuadas de HIBIOCA y melaza para el crecimiento del consorcio
H: 0.5M: 1.5
• Pilas regadas 2 veces a la semana, durante 7 a 8
horas, por 6 semanas.
INOCULACIÓN EN LAS PILAS DE BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR
Se elaboraron 2 pilas triangulares de 190
ton cada una (1.60x1x1.20 metros)
• El bagazo de caña de azúcar se
mezcló con 0,1% de hidrolizado
de residuos blandos de concha de
abanico
• El porcentaje de humedad fue de
55%
Proceso de compostaje e inoculación del consorcio
8. Extracción y
secuenciamiento del
ADNm de las pilas de
compostaje
Características de las pilas de compostaje MEZCLA DEL CONSORCIO BACTERIANO
La sucesión de las comunidades microbianas durante el compostaje
es un clásico ejemplo de como el crecimiento y la actividad de
un grupo de organismos crean las condiciones necesarias
para el crecimiento de otros. (Agrawal et al., 2011)
La variación estructural en el tiempo puede deberse a la variación
en la disponibilidad de nutrientes (Mello et al. 2016),
¡Dinámica de degradación activa del
bagazo de caña de azúcar en el
compostaje!
Análisis de la diversidad bacteriana del compostaje de bagazo de la caña de azúcar
SCBC1: 07 días SCBC2: 35 díasSCBC3: 60 días
Recientes estudios han avalado el rol de Pseudomonas como
competidor contra patógenos en el suelo y su capacidad para
reducir los efectos directos causados por patógenos sobre la planta,
además ayudan en la promoción del crecimiento de la planta(Kyselková and Moênne-Loccoz, 2012; Erlacher et al., 2014).
Metilobacterium sp. promueve el crecimiento y desarrollo de las plantas
por producción de fitormonas (Madhaiyan et al., 2004), tiene la
capacidad de degradar compuestos multicarbonados, y además,
puede destruir eficientemente contaminantes orgánicos(Podolich et al., 2009). Ardanov et al. (2012) demostraron que
Metilobacterium sp tiene efecto sobre la resistencia a
enfermedades en la planta.
Upreti and Thomas (2015) reportaron que los géneros de
Pantoea y Enterobacter tienen una alta actividad antagónica
contra patógenos que causan enfermedades de plantas
Análisis de la diversidad bacteriana del compostaje de bagazo de la caña de azúcar
PRODUCTO DE VALOR AGREGADO
Residuos orgánicos
Residuos lignocelulósicos
Residuos solidos municipales
CONSORCIO
BACTERIANO
CELULOLÍTICO
COMPOST MEJORADO
BIOTECNOLÓGICAMENTE
Decreto Legislativo N° 1278 .- Decreto
Legislativo que aprueba la Ley de Gestión
Integral de Residuos Sólidos
VALORIZACIÓN DE RESIDUOS: UN ENFOQUE DE LA BIOTECNOLOGÍA
HACIA EL DESARROLLO SOSTENIBLE
¡Gracias por su atención!
El sector minero en el Perú es uno de los pilares de la economía peruana.
2016
Principales productores
mineros del mundo
5°
Departamentos con mayor actividad minera
PROBLEMÁTICA: Contaminación ambiental
Conflictos sociales
2
3
4 3
4
BIOT
ECNO
LOGÍ
A MIN
ERA
DEL
ORO
Cuatro campos de aplicación de biotecnología y microbiología molecular1. Bioindicadores y biosensores para la exploración
2. Procesamiento microbiano del oro
3. Biorremediación de los efluentes y suelos
4. Valorización microbiana de Topsoil
3
21
432
1
BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR PARA LA ACTIVIDAD MINERA SUSTENTABLE
(D) Quantitative xrf-maps showing the distribution ofAu, Ca, Cu, Fe, S, and Zn in an individual cell after 1 minexposure to Au(III) at pH 7.0
(A) C. metallidurans containing a Au nanoparticlein the periplasmic space
PROSPECCIÓN EXPLORACIÓN EXPLOTACIÓN Y PROCESAMIENTO
REHABILITACIÓN Y CIERRE
Aislamiento de los varios tipos de microorganismos benéficos para las plantas, mediante el uso de medios de cultivos específicos:
Bacterias fijadoras de N2
Bacterias solubilizadoras-PBacterias para resistencia stress abióticos.Bacterias para resistencia bióticosMicorrizas
1 432
BIOREMEDIACIÓN DE SUELOS Y AGUAS AFECTADOS POR ACTIVIDADES MINERAS AURÍFERAS Y ARGENTÍFERAS EN LA REGIÓN LA LIBERTAD
MEDIANTE EL USO DE UN CONSORCIO DE BACTERIAS Y/O HONGOS NATIVOS PRODUCTORES DE ENZIMAS DEGRADADORAS DEL CIANURO Y DE SUS
DERIVADOS TÓXICOS
Blg. MELITZA DE LOURDES CORNEJO LA TORRE. MSc
Convenio N° 214-FINCyT-FIDECOM-PIPEI-2014
Colegio de Ingenieros del PerúLima – 04 Abril – 2017
Aislamiento, identificación, caracterización y utilización demicroorganismos nativos degradadores del cianuro para suimplementación en procesos de biorremediación de sitioscontaminados.
Tratamiento de residuos con
cianuro
Microorganismo Fuente
Bacteria
Alcaligenes spp., Arthrobacter spp., Burkhoderia cepacia, Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa, flourescens, Psudeomonas putida, Pseudomonas pseudoalcaligenes
Babu et al., 1996; Chapatwala et al.,
Huertas et al., 2010, Luque-Almagro et al., 2011; Knowles, 1976
Hongos
Polyporus arcularius (T 438), commune (T 701), Clavariadelphustruncatus (T 192), Pleurotus eryngii (M Ganoderma applanatum (M 105), versicolor (D 22), Cerrena unicolor (D 30), Schizophyllum commune (D 35) Ganoderma lucidum (D 33)
Ozel et al., 2010
MicroalgasArthrospira maxima, Scenedesmus obliquusChlorella spp.
Gurbuz et al., 2004& 2009
TAXONOMÍA MOLECULAR Y CARATERIZACIÓN DE LOS GENES
DEGRADADORES
GENÓMICAEXTRACCIÓN DE ADN
SECUENCIACIÓN
PCR: INICIADOR CONSERVADOS
PROT
EÓMIC
A
Cultivo microbiano
Recuperación de proteínas
Electroforesis
Digestión de proteínas
Análisis MALDI
TOFTOF
Análisis de espectros de masas
PARÁMETROS DE CRECIMIENTO
pH Temperatura Concentración de inóculo Concentración CN
Cepas seleccionadas
FORMULACIÓN DE
CONSORCIOS
Consorcio seleccionado
Evaluación de degradación de CNEvaluación de crecimiento
Formulación de consorcios
Microorganismos seleccionados
Ensayo de degradación
MSCN: Muestra de Suelo Contaminado con Cianuro. MSP: Muestra de Suelo Prístino. MACN: Muestra de Suelo Contaminado con Cianuro. MAP: Muestra de
MINAM (2013)
(Adams, Komen y Pickett 2001, Akcil y Mudder 2003; Luque-Almagro2005; Dasha, Gaur y Balomajumderb 2009; Deloya 2012, Luque-Almagro, Moreno-Vivia y Roldán 2016)
Análisis físico-químicos de muestras de suelo y agua
0
20
40
60
80
100
Ab
un
dan
cia R
ela
tiv
a (
%)
Metagenomas
unclassified (derived from
Bacteria)Proteobacteria
Firmicutes
Bacteroidetes
Actinobacteria
Verrucomicrobia
Acidobacteria
Planctomycetes
Spirochaetes
Tenericutes
Aquificae
Chlamydiae
Chlorobi
Chloroflexi
Cyanobacteria
Deinococcus-Thermus
Dictyoglomi
Fibrobacteres
Gemmatimonadetes
MCS01=suelos de 1 mes;
MSC02=suelo de 5 meses;
MCS03=suelo de 1 año y 5 meses;
MCS04=suelo de 3 años;
MCS05=suelos de 4 años;
MCS06=suelo de 5 años
MCS01=suelos de 1 mes; MSC02=suelo de 5 meses; MCS03=suelo de 1 año y 5 meses;
MCS04=suelo de 3 años; MCS05=suelos de 4 años; MCS06=suelo de 5 años
Crono-secuencia de la restauración natural de zonas contaminadas con cianuro y derivados tóxicos
(Kuffner, et al. 2012)(Bastida, et al. 2013) (Rastogi et al. 2010) (Huang, y otros 2011) (Li et al. 2014)
Caracterización de la microbiota aislable de agua no contaminada con
cianuro
Microbiota bacteriana (géneros) de suelo con cianuro identificadas molecularmente por amplificación del gen
16SARNr
Microbiota bacteriana (géneros) de agua con cianuro identificadas molecularmente por amplificación del gen
16SARNr
Microbiota fúngica (géneros) de suelo con cianuro identificadas molecularmente por amplificación de
Región Transcripta Interna ITS 1-4
Caracterización de la microbiota de suelos contaminados con cianuro
Microbiota de co-cultivo de suelo con cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNrMicrobiota (géneros) de suelo con cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr
Caracterización de la microbiota de suelos no contaminados con cianuro
EspeciesGéneros
Géneros
Especies
Microbiota (géneros) de suelo sin cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr Microbiota de co-cultivo de suelo sin cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr
Caracterización de la microbiota de agua no contaminada con cianuro
Caracterización de la microbiota de agua contaminada con cianuro
Microbiota de co-cultivo de agua sin cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr
Microbiota (géneros) de agua con cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr Microbiota de co-cultivo de agua con cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr
Microbiota (géneros) de agua sin cianuro caracterizada por metagenómica dirigida al ADNr
EspeciesGéneros
Identificación genómica de enzimas degradadoras de cianuro presentes
en las bacterias aisladas
La identificación de la secuencia
amplificada con los iniciadores Cyn
para el gen de la enzima Cianidasa
mostró 98% de similitud con la
secuencia de una enzima degradadora
de cianuro presente en Pseudomona
stutzeri.
La comparación de la secuencia amplificada con
los iniciadores CynC para el gen de la enzima
Cianasa mostró 98% de similitud con la secuencia
de una proteína transportadora presente en la
membrana de Pseudomonas speudoalcaligenes
CECT5344 involucrada en el transporte de
cianato, una compuesto íntimamente relacionado
con el cianuro.
Análisis proteómico de las enzimas degradadoras de cianuro
Espectro de masas obtenido del análisis del exoproteoma de Pseudomonas stutzeri
Identificación de la enzima Cyanide dihydratase presente en
Pseudomona stutzeri mediante análisis MS/MS
Elaboración de un consorcio microbiano
Porcentajes de degradación de cianuro por los diferentes consorcios formulados
Evaluación del crecimiento de los consorcios formulados durante la
degradación de cianuro
Ensayos de degradación en laboratorio
Se logró reducir 99% de Cianuro Total contenido en los ensayos de laboratorio en aproximadamente 1 semana
Control Tratamiento
Monitoreo mediante metagenómica de la microbiota bacteriana durante la
degradación de cianuro en ensayos de laboratorio
Ensayos de biorremediación in situ
Se logró reducir el 97% del Cianuro Total presente el suelos a niveles inferiores a los estipulados como límites máximos permisibles para
suelos destinados a agricultura.
Monitoreo mediante metagenómica dirigida al ADNr de la microbiota bacteriana durante la
degradación de cianuro en ensayos de campo
Evaluación de la degradación del cianuro en suelos mineros
recientemente contaminados con cianuro en ensayos en campo
Monitoreo metagenómico (géneros ) de la microbiota bacteriana presente
en la poza control durante el ensayo de degradación de cianuro in situ
Variación de la estructura de lamicrobiota natural presente enpozas de lixiviación.
Presencia de uno losgéneros empleado enel consorcio formulado
Monitoreo metagenómico (géneros ) de la microbiota presente en la poza
tratada (7 días) durante el ensayo de degradación de cianuro in situ
Abundancia relativa de las especies del género Alcaligenes presentes en el consorcio eincorporadas a la poza tratada y abundancia relativa de las especies presentes demanera natural en la poza control
Abundancia relativa de las especies del género Bacilluspresentes en el consorcio e incorporadas a la poza tratada yabundancia relativa de las especies presentes de maneranatural en la poza control
Abundancia relativa de las especies del géneroPseudomonas presentes en el consorcio e incorporadas ala poza tratada y abundancia relativa de las especiespresentes de manera natural en la poza control
Diferencia de la abundancia relativa de la especiePseudomonas pseudoalcaligenes en la poza tratada ycontrol. Esta especie ha sido ampliamente reportada porestar presente de manera natural en ambientescontaminados con cianuro.
700.0 1362.6 2025.2 2687.8 3350.4 4013.0
Mass (m/z)
9.2E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 750 - SPOT SET IB I 46978 21-09-15; Run #4; Label J17
2171.0669(R11489,S560)1060.4644(R5726,S461)
2157.9968(R13768,S524)
1292.6628(R8595,S392)2174.0574(R15845,S180)
1923.8517(R16433,S133)
1414.7032(R10366,S258)1912.9540(R16392,S250)
804.2620(R6729,S202)1890.8759(R15443,S180)
2332.1450(R22636,S254)703.1559(R8158,S150)1244.6860(R9823,S151)1933.9989(R18231,S136)2969.3850(R25768,S508)1586.8043(R11871,S120)877.0223(R8201,S104)1233.5974(R9878,S94)2211.0872(R20215,S94)2616.2263(R25333,S224)1782.8215(R15373,S85)
1205.5936(R6322,S53) 2310.2856(R26731,S80)892.9864(R7529,S52) 2807.3228(R25956,S184)
2909.3718(R24930,S53)3312.3093(R32149,S68)
Resultados obtenidos:
B P
A
CONSORCIOBACILLUSPSEUDOMONASALCALIGENES
Análisis Proteómico
MALDI TOF TOF
Spectrum Best Sequence Ident Result Blast Genus
1.G10.7.1.17 IISTKVAQGIQWADVAR 100% cyanate hydrataseB
1.N22.7.1.9 PIMSKSEAAAHVDSARIRQGR 100% cyanaseB
1.H14.7.1.2 LGYRMPEGR 100% nitrilaseAB
1.L18.7.1.5 WAWLVLGTAAHLLAVGGR 100% nitrilaseBP
Análisis genómico
Cyanase
9 347 685 1023 1361 1699
Mass (m/z)
1.3E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 1000 - 0430 bioremediation cyanide 16-05-16; Run #7; Label H16 Prec = 1607.3361
175.1139(R1786,S1046)
1108.4966(R3743,S236)
557.1694(R2629,S227)
839.3637(R3599,S220)
822.3539(R3224,S181)
439.1706(R2542,S172)
552.2232(R3035,S134)
1237.5242(R3187,S109)670.2390(R2750,S117)
1473.2688(R4500,S78)
368.1350(R2566,S118)
642.2291(R3881,S79)
938.4326(R4469,S69)628.2839(R3431,S53)472.2379(R2779,S56)
242.1199(R2753,S174)401.2112(R2300,S50)
288.1733(R2591,S55)112.0907(R1255,S119)
72.1026(R1402,S89)
11.0268(R726,S59)
OPTIMIZACIÓN DE LA BIORREMEDIACIÓN DE CIANURO POR UN CONSORCIO BACTERIANO NATIVO CARACTERIZADO MOLECULARMENTE: ANÁLISIS TRANSCRIPTÓMICOS Y PROTEÓMICOS.
Modelamiento
Extracción de ADN de
Bacterias cultivables y
No Cultivables
“Secuenciación de próxima
generación" (NGS "Next
Generation Sequencing")
Electroforesis
ANÁLISIS METAGENÓMICO
MUESTREO
PCR
Bacterias Cultivables
Medios específicos
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BACTERIAS
REDUCTORAS DE SULFATO
Cepa referencia: : Desulfotomaculumnigrificans ATCC 19858
Purificación
Extracción ADN SRB
Estandarización de protocolos
Cebadores gen
16S ARNr y dsr
Análisis de
espectros de
masas
Identificación de proteínas por
MALDI TOF TOF
PROTEÓMICA
Evaluación en microcosmo y
mesocosmo
Biorreactor sulfidogénico
Cepas seleccionadas
Biorremediación de zonas impactadas por Mercurio orgánico e inorgánico, producto de la actividad minera aurífera
mediante un consorcio microbiano nativo
ANALISIS GENÓMICO Y METAGENÓMICO
AISLAMIENTO DE CEPAS BACTERIANAS
ANÁLISIS PROTEÓMICO ANÁLISIS TRANSCRIPTÓMICO
Amplificación del gen 16S ARNr
The Next Generation Sequencing
Extracción de proteínas, análisis en MALDI TOF 5800 y selección de
cepas.
Extracción de ARN
qRT-PCR
PRUEBAS DEL CONSORCIO IN SITU y EX SITU
Pruebas en biorreactor BIOFLO 110 tipo batch
Formulación y Selección de consorcio Aplicación del consorcio en campo, y evaluación de resultados
TOMA DE MUESTRA DE ZONAS CONTAMINADAS CON MERCURIO
Resultados Preliminares:Se cuenta con : Un cepario de 45 bacterias
con potencial degradador de HC.
Análisis bioinformático de una metagenómica. Formulación un consorcio bacteriano degradador
de HC.
Los principales géneros identificados: Acinetobacter,Bacillus, Bacterium, Stenotrophomonas, Pseudomonas,Halomonas.
Caracterización de enzimas degradadoras deHC por MALDI-TOF.
Análisis de la Comunidad microbiana de zonas contaminadas con petróleo en Nieva-Amazonas mediante técnicas
dependientes e independientes de cultivo.
Objetivo: Caracterizar molecularmente la diversidad microbiana de una zona contaminada con Hidrocarburos de Petróleo en la Distrito de Nieva –
Amazonas.
EXTRACCIÓN DE ADN METAGENÓMICO de agua y suelo contaminados y no
contaminado
OBTENCIÓN DE LA MUESTRADerrame del 10 de agosto del
2016 en Nieva-Amazonas
AISLAMIENTO DE COLONIAS por diluciones sucesivas de cultivos
microbiológicos
ANÁLISIS, SECUENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN mediante el gen 16S ARNr
Se cuenta con 43 CEPAS BACTERIANAS que forman parte del cepario de
Biorremediación de Hidrocarburos de Petróleo
ANÁLISIS DE SECUENCIAS haciendo uso de diversos softwares bioinformáticos disponibles en línea.
THE NEXT GENERATION SEQUENCING
Consorcio de Microorganismos que tienen la capacidadde degradar el cianuro empleado en la industriaminera para la recuperación de oro y plata.
MUCHAS GRACIASBlg. Melitza Cornejo La Torre. MSc
Biotecnología Ambiental
Jr. Filipinas 241 - Tumbes
Telf:992204344
Skype: melitza.cornejo
“El interés científico une voluntades para encontrar respuesta a nuestros principales
desafíos”