Estudio del mecanismo molecular de secreción de proteínas translocadoras a través del inyectisoma de Escherichia coli enteropatógena.Alan Gerardo Hernández Melgar

Laboratorio 325 NorteDra. Bertha González Pedrajo

Claudia Torres VargasP. De M. En C.B.

Escherichia coli enteropatógena (EPEC)

Escherichia coli enteropatógena (EPEC) es uno de los principales agentes etiológicos de diarrea infantil en países en vías de desarrollo.

FisiopatologíaLa infección por EPEC se caracteriza histopatológicamente por una alteración que la bacteria produce a nivel intestinal conocida como la lesión A/E (adherencia y esfacelamiento)

EPEC

Actina

IntiminaTirNck N-WASPArp2/3

SST3

Efectores

EPEC

1. Adherencia inicial2. Transducción de señales3. Adherencia íntima

Kaper et al., 2004; Nataro y Kaper, 1998;Knutton et al., 1995

Para que se induzca la lesión (A/E) la bacteria necesita adherirse al enterocito y traslocar hacia las células del huésped algunas proteínas importantes en la virulencia (efectores).

Para lograr esto utiliza el sistema de secreción de proteínas tipo III (SST3).

Funciona como una jeringa molecular para inyectar dichas proteínas, en la célula eucarionte (enterocito).

Inyectisoma o sistema de secreción tipo III de EPEC

Sustratos tempranos

(Eje/Aguja)

Sustratos intermedios

(Translocadores

EspA, EspB y EspD)

Sustratos tardíos

(Efectores)

Cuerpo Basal

Filamento

Aguja

EM

IM

PG

MHPoro de transloca

ción EspB/D

EspA

EscF

3 conjuntos diferentes de proteínas se secretan de manera ordenada: los sustratos tempranos (subunidades del eje y la aguja), sustratos intermedios (translocadores) y sustratos tardíos (efectores).

2do interruptor (SepL-SepD) garantiza que los sustratos tardíos o efectores se transloquen eficientemente al interior de la célula hospedera en lugar de secretarse al medio extracelular.

SepL/Sep

Switch 2

SepD

SepL

Sustratos intermedios

(Translocadores) (EspB/D)

FavoreceSustratos tardíos

(Efectores)

Bloquea

M. O. Gaytán Enríquez

+ Efectores

− Translocadores

AntecedentesFenotipo de secreción de las mutantes ΔsepD, ΔsepL y Δorf12

Objetivo

¿SepD interacciona también con los translocadores?

SepD en complejo con SepL ¿interacciona de igual manera?

Materiales y métodosCepas bacterianas Escherichia coli BDP [BL21(λDE3) pLysS] (Stratagene). Salmonella SJW1368.

PlásmidospMEespB Plásmido que contiene el gen espB en el vector

pET19b, fusiona una etiqueta de 10 histidinas en el extremo amino terminal de la proteína, es inducible con IPTG).

pATpD Plásmido que contiene el gen sepD en el vector

pTrc99A, confiere resistencia a ampicilina, es inducible con IPTG.

pMTBipDpL Construcción bicistrónica que contiene los genes

sepD y sepL en el vector pTrc99A, confiere resistencia a ampicilina y es inducible con IPTG.

Se prepararon células quimiocompetentes con CaCl2

Los plásmidos se transformaron en la cepa hospedera adecuada (pMEespB en BDP, BipDpL y pATpD en SJW1368)

Se indujó la producción de proteínas

Las células se centrifugaron y se lisaron por sonicación

Se centrifugo para separar las fracciones soluble e insolube

La fracción soluble de la proteína recombinante His-EspB se cargó en una columna de resina acoplada a niquel.

Se incubó con la segunda proteína (SepD ó SepL/D)

La resina se lavó con cconcentraciones crecientes de imidazol

Las proteínas se eluyeron 500 mM de imidazol

Control negativo: lisados de las células SJW1368/BipDpL y SJW1368/pATpD en las que se sobre expresaron las proteínas SepL/SepD y SepD, se incubaron con la resina acoplada a niquel y se les dio el mismo tratamiento.

Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE).

Inmunodetección tipo Western Blot.

Resultados

His-EspB

InteracciónHis-EspB/SepD SepD

Control Negativo

His-EspB

SepD

InteracciónHis-EspB-SepD/SepL

His-EspB

SepD

Control Negativo

DiscusiónEl objetivo del presente trabajo consistió en determinar si SepD, que forma parte del segundo interruptor molecular.

SepD no copurifica con la proteína recombinante His-EspB. (10. Resultados)

Cuando SepL se encuentra en complejo con SepD ya no interacciona con la versión recombinante del translocador His-EspB.(12. Diapositiva 12)

No se detectó la presencia de SepD y SepL/SepD respectivamente, lo que nos confirma que las proteínas no se unen inespecíficamente a la resina y de esta manera no obtenemos un resultado falso positivo.

ConclusionesLa interacción SepL/His-EspB se anula cuando SepL se encuentra en complejo con SepD.

Se necesita utilizar otras metodologías para confirmar los resultados obtenidos en este trabajo. Ensayo de doble híbrido en levadura Geles nativos Blue Native(BN-PAGE)

TécnicasPreparación de células competentes con CaCl2

Transformación de células competentesMiniprep (Purificación de ADN plasmídico)

Electroforesis de Ac. Nucleicos en geles de agarosa

Preparación de celulas electrocompetentes

ElectroporaciónSDS-PAGE

Arrastre la imagen al marcador de posición o haga clic en el icono para agregar

Pull down His-EspB/SepD

175836247.5

32.5

25

16.5

6.5

PM SepD EspB FNU L1 L3 E1 E2 E3 E4

His-EspB

SepD

Modificación Pull down His-EspB/SepD

1758362

47.5

32.525

16.5

6.5

PM SepD EspB FNU L1 L2 L3 E1 E2 E3

His-EspB

SepD

Control Negativo Pull down His-EspB/SepD

175836247.

5

32.5

25

16.5

6.5

PM SepD EspB FNU L1 L3 E1 E2 E3 E4

His-EspB

SepD

Purificación de His-CesD2

175836247.5

32.5

25

16.5

6.5

PM FS FNU L1 L2 L3i L3f E1 E2-3 E4

His-CesD2

Minipreps PACTrc

Pruebas de expresión SepL carboxilo y amino terminalpCTpLNt 276 aa comprende el dominio YopNpCTpLCt 75 aa comprende el dominio TyeASJW13682 tempreraturas 20ºC y 30ºC / 1.5 mL c/ 2 h hasta 5 h

pCTpLNt

20ºC 30ºC

Tiempo D.O. Vol. X 400 μL D.O. Vol. X 400

μL

T0 0.772 309 -

T2 1.346 538 1.753 701

T4 1.408 563 1.929 772

T5 1.543 617 1.972 789

pCTpCt

20ºC 30ºC

Tiempo D.O. Vol. X 400 μL D.O. Vol. X 400

μL

T0 0.677 271 -

T2 1.152 461 1.753 701

T4 1.575 630 1.930 772

T5 1.689 676 1.972 789

Gel pCTpLNt

SepL

0h 2h 4h 5h PM 0h 2h 4h 5h

20ºC 30ºC

Gel pCTpLCt

SepLCt

0h 2h 4h 5h PM 0h 2h 4h 5h

20ºC 30ºC

Inmunodetección SepL

EspBΔ7 y EspΔ15

Esp B/D forman el poro2 oligos reverse EspB d7 y EspD d15

Reacción PCR (50 μL)Carriles:

1 MW 1Kb 2 EspBΔ7 3 EspΔ15

1 2 3

Purificó los productos de PCRReacción de digestión NdeI y BamHISe corrieron una muestra en un gel de agarosa

Carriles:1. MW2. EspDΔ15 E13. EspDΔ15 E24. EspBΔ7 E15. EspBΔ7 E26. pTrCC99A Dig. NdeI y Bam HI

1 2 3 4 5 6

Arrastre la imagen al marcador de posición o haga clic en el icono para agregar

Arrastre la imagen al marcador de posición o haga clic en el icono para agregar

Arrastre la imagen al marcador de posición o haga clic en el icono para agregar