avaliação do potencial de biorremediação de solos contaminados: método de hidrólise de...

Revista Interdisciplinar da Universidade Veiga de Almeida

ISSN: 14148846

Julho/Dezembro de 2015 – pág.105

Avaliação do Potencial de Biorremediação de Solos

Contaminados: Método de Hidrólise de Diacetato de Fluoresceína

(FDA) como Indicador de Atividade Microbiana

Thiago da Silva Ribeiro1

Patricia Österreicher-Cunha 2

Luciana Andrade Peixoto Silva3

Resumo

Em vista da eficiência comprovada da biorremediação na degradação de compostos poluentes, diversas

empresas, principalmente as relacionadas com consultorias e remediação ambiental, têm despertado

grande interesse pela sua implantação como opção para a reabilitação de áreas contaminadas. Em países

desenvolvidos, como os Estados Unidos, Canadá e vários países da Europa, as técnicas de biorremediação

vêm sendo amplamente utilizadas em trabalhos que se baseiam, por exemplo, no tratamento de solos

contaminados por hidrocarbonetos de petróleo. Ao contrário, porém, do que se tem notado nesses países,

no Brasil, os projetos de biorremediação ainda estão no campo da teoria, com poucos casos práticos,

embora exista uma probabilidade real de expansão. O presente trabalho tem como objetivo apresentar o

método de hidrólise de diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a atividade microbiológica de um

solo como indicador para acompanhar a biorremediação.

Palavras-chave: biorremediação; microbiologia do solo; fluoresceína.

Abstract

In view of the proven efficiency of bioremediation in the degradation of polluting compounds,

companies, especially those related to remediation and environmental monitoring, have shown enormous

interest in its deployment as an option for the rehabilitation of contaminated areas. In developed countries

such as the United States, Canada and several European countries, these bioremediation techniques have

been widely used in work that is based, for example, on the treatment of soil contaminated by petroleum

hydrocarbons. However, contrary to what has been done in these countries, in Brazil, bioremediation

projects are still mainly theoretical, with few practical cases, but there is a real likelihood of expansion.

This study's main objective is to present themethod of fluorescein diacetate hydrolysis (FDA) to

determine the microbiological activity in soil as an indicator to monitor the bioremediation.

Keywords: bioremediation; soil microbiology; fluorescein.

1 Vencedor do Prêmio Cientistas de Amanhã (IBECC/UNESCO), pós-graduado em Gestão Ambiental

pela Escola Politécnica da UFRJ, monitor da disciplina de Mecânica dos Solos I e graduando do curso de

Engenharia Ambiental da Universidade Veiga de Almeida - [email protected]. 2 Doutora em Biotecnologia e Biofísica Ambiental e Mestre em Biotecnologia Vegetal pela UFRJ,

graduada em Biologia de Organismos e Populações/Fisiologia Vegetal pela Université Pierre et Marie

Curie - Paris 6. Pesquisadora no Laboratório de Geotecnia e Meio Ambiente, no Departamento de

Engenharia Civil da PUC-Rio, responsável pelo Laboratório GeoBioSolo - [email protected] 3 Doutoranda e Mestre em Engenharia Civil /Geotecnia pela PUC-Rio, graduada em Engenharia Civil

pela UFF.Professora da Universidade Veiga de Almeida - [email protected].


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Introdução

A preocupação com as questões ambientais tem-se destacado cada vez mais

dentre os problemas do mundo moderno. Na busca incessante do progresso econômico e

da melhora da qualidade e expectativa de vida, a sociedade vem lançando mão de

atividades predatórias, tais como o uso indiscriminado dos recursos naturais e o

lançamento de produtos tóxicos cada vez mais complexos no meio ambiente.

As alterações ambientais devidas às ações antrópicas, como a escassez dos

recursos naturais e poluição tóxica, têm atingido níveis extremamente significativos,

resultando em uma redução comprometedora da qualidade do solo, do ar e da água.

A problemática da contaminação ambiental, e das águas subterrâneas em

particular, por compostos oriundos da atividade humana, denominados xenobióticos,

tem sido objeto de estudo em muitos centros de pesquisa no mundo, haja vista a

necessidade de soluções rápidas e eficientes para os problemas ligados a esta situação.

Uma área contaminada pode ser definida como um local ou um terreno onde há

comprovadamente poluição ou contaminação causada pela introdução de quaisquer

substâncias ou resíduos que nela tenham sido depositados, acumulados, armazenados,

enterrados ou infiltrados de forma planejada, acidental ou até natural, e que determinam

impactos negativos sobre os bens a proteger (CETESB, 2015). A Resolução CONAMA

n° 420, publicada em dezembro de 2009, é a primeira regulamentação federal sobre

gerenciamento de áreas contaminadas e tem como referência os parâmetros utilizados

pela Companhia Ambiental do Estado de São Paulo (CETESB). O cenário desejado

para o gerenciamento de áreas contaminadas ainda não foi implementado no país.

Embora os primeiros casos de áreas contaminadas tenham surgido na década de

1980, período não muito distante das primeiras descobertas realizadas nos EUA e em

alguns países da Comunidade Europeia, foram estabelecidas naqueles países políticas

públicas e construiu-se um adequado arcabouço legal que proporcionaram expressivos

resultados no que se refere à identificação e à remediação de áreas contaminadas. A

evolução desse mercado atraiu as universidades e centros de pesquisa que, por meio de

pesquisas básicas e aplicadas, proporcionaram o desenvolvimento de novas e mais

adequadas tecnologias de investigação e de remediação. Programas de qualificação dos


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profissionais multiplicaram-se e foram estabelecidos programas destinados à

certificação desses profissionais. Mesmo diante dessas ações positivas, entretanto, erros

também foram cometidos, o que implicouum consumo de recursos financeiros e

materiais que poderia ter sido evitado.

No Brasil, há pouco para se comemorar em relação ao gerenciamento de áreas

contaminadas. Não se tem conhecimento de que algum Estado tenha estabelecido

políticas relativas à gestão das áreas contaminadas e poucos são os que possuem

legislações que abordem o tema. Em relação aos órgãos ambientais, poucos são aqueles

que tratam a questão como uma prioridade ou que tenham se estruturado minimamente

para fazer frente às demandas surgidas e cumprir as obrigações fixadas em nível federal.

No setor produtivo, poucas têm sido as iniciativas das grandes corporações no

sentido de identificar e remediar as áreas contaminadas decorrentes do desenvolvimento

de suas atividades ao longo de décadas. Na mesma situação, encontram-se as áreas

ocupadas pelas empresas estatais e órgãos que desenvolvem atividades com potencial de

contaminação dos solos e das águas subterrâneas. Na maioria das vezes, os programas

de investigação são iniciados só após terem sido demandados pelos órgãos ambientais.

Em relação aos prestadores de serviços, embora o número de empresas que

atuam no setor tenha crescido exponencialmente na última década, especialmente para

atender as demandas decorrentes da identificação das áreas contaminadas surgidas pela

atividade de comércio de combustíveis automotivos, ainda se verifica que poucas

investiram na elevação do seu capital intelectual. Como resultado, as ações de

investigação têm sido mal planejadas e executadas, determinando ineficiência dos

sistemas de remediação que demandarão ajustes a um elevado custo financeiro e com

um dispêndio desnecessário de tempo.

Não surpreende, portanto, o fato de a técnica de bombeamento e tratamento

ainda estar relacionada como a mais utilizada, conforme dados disponibilizados pela

CETESB, ainda que sua ineficiência para promover a remediação de áreas

contaminadas tenha sido relatada pelo NationalResearchCouncil, nos Estados Unidos,

ainda na década de 1990.

Também é lamentável o fato das técnicas de remediação serem selecionadas e

implementadas com pouca fundamentação técnica e científica, fato que reflete a falta de

experiência e conhecimento necessários por parte das empresas de consultoria. Para

completar o cenário desolador, em que pese a expressiva evolução das técnicas de


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investigação ocorrida nas últimas décadas, ainda é pouco significativo o número de

áreas em que essas técnicas tenham sido empregadas.

Existem algumas opções ou combinações de opções disponíveis atualmente para

restaurar a qualidade de umaárea impactada. Devemos observar, entretanto, que embora

haja diversas tecnologias aplicáveis, o processo de remediação inevitavelmente resultará

na mudança ou suspensão das funções naturais do meio, seja permanente ou

temporariamente.

As tecnologias disponíveis para minimizar ou impedir o problema da

contaminação de solos e águas subterrâneas, podem ser classificadas sob diversos

aspectos como, por exemplo, em termos de seu objetivo (contenção x tratamento),

localização (in situ x ex situ), processo (físico, químico, biológico, termal), meio

contaminado (ar, água ou solo), mecanismo operacional (recuperação de líquidos e

vapores, imobilização, degradação), entre outros.

Podemos distinguir duas classes principais de remediação. A primeira diz

respeito à remediação in situ, que envolve tratamentos como a lavagem, a ventilação, a

extração de vapores e a biodegradação, realizados sem o deslocamento do material

contaminado do local de origem; e a segunda diz respeito à remediação ex situ, que

promove a descontaminação de um compartimento após a escavação e remoção do

material impactado para um ambiente de condições controladas.

Solos contaminados são remediados através de três processos: físico, químico e

biológico. Os mais comuns dos métodos de tratamento físicos são a disposição em

lixões ou lagoas de decantação e a incineração. Além de constituir uma tecnologia

muito cara, porém, a incineração pode representar uma fonte de poluição do ar. O

tratamento químico, por sua vez, inclui a injeção direta de oxidantes químicos no solo

contaminado e/ou nas águas subterrâneas. Já o tratamento biológico envolve o

esgotamento da contaminação a partir da transformação em compostos não tóxicos

através de processos biológicos e microbiológicos (SARKAR et al., 2005).

Embora as técnicas convencionais de remediação tenham seu uso bastante

disseminado e dispõem de tecnologias avançadas de suporte, implicam em altos custos

de execução e meios de tratamento que, na maioria das vezes, alcançam a remediação,

mas também ocasionam impacto ao ambiente.


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Nesse cenário, o tratamento biológico insere-se como uma interessante

alternativa, pois, embora não tenha todas suas deficiências solucionadas, apresenta

vantagens ambientais e econômicas relevantes.

Uma vez que a biorremediação é uma alternativa atraente no tratamento de solos

contaminados, a biodisponibilidade dos contaminantes deve ser bem avaliada, a fim de

que todo o processo possa ser monitorado de forma eficaz. Nesse contexto, a aplicação

de diferentes ensaios biológicos para a avaliação da biodisponibilidade dos

contaminantes tem-se configurado como um importante instrumento no monitoramento

e comprovação da eficiência do processo de biorremediação de solos impactados.

As atividades enzimáticas são comumente utilizadas como indicadores da

qualidade do solo porque representam um importante papel na ciclagem de nutrientes e

podem ser indicadores sensíveis na remediação de solos contaminados.

O método da hidrólise de diacetato de fluoresceína é simples, rápido, de baixo

custo, sem necessidade de adequação da amostra para a realização do teste, sem

necessidade de inóculo bacteriano, além de apresentar uma variabilidade pequena dos

resultados. A hidrólise de diacetato de fluoresceína pode ser usada como método para

avaliação do potencial intrínseco da biorremediação de um solo contaminado.

O presente trabalho inicia-se com uma breve revisão bibliográfica. Foram

abordados os conceitos de maior relevância para o entendimento da biorremediação. As

conclusões são precedidas pela realização dos ensaios de laboratório utilizando o

método de hidrólise de diacetato de fluoresceína (FDA) como indicador de atividade

microbiana.

2. Biorremediação

A biorremediação é um processo em que organismos vivos são responsáveis por

reduzir ou transformar poluentes xenobióticos (agrotóxicos, corantes, fármacos,

polímeros e resíduos plásticos) de áreas contaminadas, por meio de processos

biológicos de degradação.

Nas duas últimas décadas, a aplicação de processos biológicos ao tratamento de

solos contaminados tem despertado grande interesse nas comunidades acadêmica e

industrial. Comparativamente, a técnica possui, em relação às tecnologias convencionais


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de remediação, ampla aplicabilidade e envolvimento de baixos custos operacionais.

Embora o processo, em alguns casos, possa vir a ser longo, o mesmo é eficiente na

transformação de contaminantes em substâncias inócuas, ou seja, produtos com pouca

ou nenhuma toxicidade (ZHANG et al., 2010).

O tratamento biológico nada mais é do que a degradação de compostos

orgânicos pela ação dos microrganismos através da sua capacidade natural de ciclagem

do carbono. O grau de alteração da estrutura molecular destes compostos determina se o

processo em questão constitui uma biotransformação ou uma mineralização. A

biotransformação é a transformação do composto orgânico em compostos mais simples.

A mineralização, por sua vez, refere-se à quebra completa de moléculas orgânicas em

massa celular, dióxido de carbono, água e resíduos inorgânicos inertes. A

biotransformação consiste, portanto, na degradação parcial do contaminante enquanto a

mineralização consiste na sua degradação completa (LA GREGA, 1994).

A metabolização de poluentes, em especialos orgânicos, por microrganismos

vivos compõem a base fundamental da biorremediação. Estes, ao fazerem uso dessa

fonte de energia disponível, promovem a transformação de moléculas persistentes em

compostos menos tóxicos e complexos. O entendimento de como os microrganismos

destroem os contaminantes é fundamental para a compreensão da biorremediação. Os

tipos de processos microbianos que serão empregados na degradação irão indicar os

suplementos nutricionais que o sistema deve fornecer. Além disso, os subprodutos dos

processos microbianos fornecem indicadores sobre o andamentos da biorremediação.

Em comparação a outros organismos vivos capazes de degradar poluentes

orgânicos, os microrganismos são os agentes preferenciais para desempenhar a função

de restauradores da qualidade ambiental, devido a alguns aspectos principais. Dentre

estes, estão a sua natureza ubíqua, isto é, estão presentes em todos os meios; sua ampla

diversidade genética e catalítica; e sua capacidade de atuação sob condições ambientais

extremas (MEGHARAJ et al., 2011). Além disso, podem apresentar estratégias de

adaptação à presença dos contaminantes, como alteração da permeabilidade celular,

produção de biofilme e de biossurfactantes (CHRZANOWSKI et al., 2012).

A variedade de compostos poluentes que umaárea pode degradar implica que

exista naquela área uma comunidade degradadora de ampla diversidade catabólica.

Assim, quando uma situação de contaminação é simulada em laboratório, a utilização de

consórcios microbianos ao invés do uso de culturas puras é mais vantajosa, pois fornece


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essa diversidade metabólica necessária para um tratamento efetivo (TYAGI et al.,

2011).

A biorremediação pode dar-se in situ ou ex situ. As técnicas de biorremediação

ex situ podem ser mais rápidas e fáceis de controlar, porém requerem escavação,

transporte, tratamento e disposição do solo contaminado, ainda que sejam de mais alto

custo, impacto e dificuldades operacionais do que as técnicas in situ. As tecnologias de

biorremediação in situ não requerem escavação do solo contaminado, sendo mais

baratas e causando menos perturbações e liberação do contaminante para o meio

ambiente. Possibilitam também o tratamento de uma maior quantidade de solo. Nem

sempre, contudo, a área é acessível à intervenção.

O estabelecimento de condições ambientais adequadas é fundamental para que o

processo de biorremediação aconteça de forma eficaz. Caso isto não ocorra, o

crescimento e a sobrevivência dos microrganismos envolvidos no processo de

degradação serão severamente afetados e, consequentemente, a biorremediação dos

compostos poluentes ficará comprometida.

3. Monitoramento de biodegradação

O objetivo do monitoramento, em geral, é identificar quais compostos, ou

classes de compostos, estão sendo degradados e como este processo varia com o tempo.

Essas informações são empregadas para avaliar a eficiência de agentes biológicos

(consórcio de microrganismos) no processo de biodegradação.

A necessidade de um rigoroso monitoramento de contaminantes para atender a

especificações rígidas ditadas pela legislação tem promovido investimentos em

desenvolvimento de técnicas analíticas cada vez mais robustas, sofisticadas e de alto

processamento. Esse cuidado deve-sea que alguns contaminantes e seus metabólitos

podem persistir por muito tempo no meio ambiente, especialmente em solos e

sedimentos.

É importante ressaltar que o programa de monitoramento é complexo e não deve

ser negligenciado, acompanhando a geração e eventual acúmulo de intermediários

tóxicos de degradação. No caso de acompanhamento da atenuação natural, esse


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monitoramento é ainda mais crítico, devido ao longo tempo de tratamento e a

possibilidade de migração do contaminante para outras camadas do solo.

Atividades microbiológicas tais como respiração, fixação biológica do

nitrogênio, mineralização de compostos orgânicos, atividade enzimática e biomassa

microbiana do solo podem ser quantificadas através de técnicas. Combinando atividade

microbiológica e estimativas do número de microrganismos, podemos obter indicadores

mais sensíveis da contaminação do solo do que aqueles que seriam obtidos através de

um único parâmetro (BROOKES, 1995).

O monitoramento de biodegradação torna-se uma ferramenta indispensável, pois

ao tratar-se de um composto metabolizável (degradável), ainda é preocupante a

possibilidade de que as reações de transformação desse contaminante-alvo possam levar

à geração de metabólitos (subprodutos) ainda mais tóxicos e/ou persistentes.

Além disso, nos processos de biorremediaçãoin situ, enquanto insumos são

adicionados para aumentar a funcionalidade de um microrganismo particular (bactéria

ou fungo), esses mesmos insumos podem ser prejudiciais a outros organismos presentes

naquele mesmo local (SHARMA, 2012).

O monitoramento da respiração endógena (respiração celular da qual deriva a

energia necessária para garantir as funções das células) pode ser um bom indicador de

alterações no desenvolvimento microbiano aeróbio, em resposta a mudanças nas

condições ambientais. Visto que apenas uma fração dos microrganismos do solo estaria

envolvida com a degradação de contaminantes, nem sempre há uma relação direta entre

a taxa de respiração e a degradação. Espera-se, porém, que condições ambientais

favoráveis para o desenvolvimento da microbiota em geral possam promover tambéma

atividade de microrganismos degradadores (RUBINOS et al., 2007).

Uma das formas de mensurar a respiração é capturar os produtos (gases

resultantes) no local onde o processo de biodegradação está ocorrendo. Esse método

consiste em cravar a câmara no solo ou sedimento com a abertura voltada para baixo,

visando o aprisionamento do gás emanado. Conecta-seuma saída na câmara a uma

mangueira por onde são retiradas amostras do gás acumulado, as quais devem ser

rapidamente submetidas à análise cromatográfica para quantificação.

Nos experimentos em escala laboratorial, o monitoramento da respiração em

microcosmos é frequentemente realizado, utilizando sistemas respirométricos

automatizados ou baseados na captura do dióxido de carbono em uma solução básica,


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seguido por titulação para determinar os valores emitidos desse gás. Um dos sistemas

mais utilizados é o respirômetro de Bartha.

Entre as formas de acompanhamento do processo de biodegradação está a

quantificação de microrganismos no local de tratamento, ao longo do tempo. Essa

informação pode ser obtida por meio de técnicas clássicas de microbiologia que

envolvem o cultivo em meios de cultura seletivos ou não. Frente à exposição ao

contaminante e/ou ao tratamento em si, esse monitoramento indica se o

desenvolvimento da microbiota é afetado positivamente ou negativamente.

A técnica do Número Mais Provável (NMP) vem sendo usada para estimar a

densidade de uma enorme gama de microrganismos provenientes das mais diversas

origens e em diferentes sistemas (bactérias, fungos e actinomicetos). A referida técnica

permite estimar a densidade de um grupo microbiano, sem necessidade de contagem

direta.

Embora sejam conhecidas as limitações dessa abordagem, que pode favorecer o

crescimento de determinados grupos e é capaz de recuperar menos de 1% da

diversidade microbiana, esse monitoramento é realizado tanto em ensaios em escala

laboratorial como em tratamento de grandes quantidades de material. Em tais condições,

contudo, não se pode correlacionar diretamente o crescimento da microbiota com a

degradação do contaminante.

Visando monitorar ainda o potencial catabólico da microbiota em relação à

degradação do contaminante alvo, técnicas de biologia molecular estão sendo aplicadas

como alternativa às formas de estudo dependentes de cultivo. Essas técnicas permitem

identificar os genes funcionais envolvidos na biodegradação, assim como entender a

composição e estrutura da comunidade microbiana envolvida no processo.

As atividades enzimáticas são comumente utilizadas como indicadores da

qualidade do solo porque representam um importante papel na ciclagem de nutrientes e

podem ser indicadores sensíveis na remediação de solos contaminados.

De maneira geral, as enzimas são mediadoras do catabolismo dos componentes

orgânicos e inorgânicos do solo e encontram-se relacionadas com a atividade e a

biomassa microbiana, além de estarem diretamente envolvidas nos processos de

degradação de compostos recalcitrantes.

O método da hidrólise de diacetato de fluoresceína (FDA) também tem sido

avaliado como indicador de atividade microbiana em solos contaminados.


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4. Metodologia Experimental: Estudo em Microcosmos

O estudo em microcosmos permite estabelecer condições controladas

necessárias para correlacionar a dinâmica da comunidade microbiana com as variações

ambientais; e, apesar de as informações descobertas serem de difícil extrapolação em

ambiente natural, são extremamente importantes para aumentar o entendimento sobre

esse ambiente.

4.1. Ensaio experimental

4.1.1. Montagem dos microcosmos

A fim de promover uma comparação sobre a atividade microbiológica e

processos químicos e físicos entre solos contaminados e não contaminados, foram

montados dois microcosmos com solo deformado e compactado. Dois recipientes de

tamanho adequado e material inerte: um denominado “microcosmo C”, representando o

solo controle (não contaminado) e outro denominado “microcosmo E”, representando o

solo contaminado, foram preenchidos com 1kg do solo ainda refrigerado.

3.1.2. Análises biológicas e químicas para caracterização de amostras

3.1.2.1. Determinação da atividade microbiana por hidrólise de FDA

A estrutura e atividade das comunidades microbianas refletem a interação

dinâmica entre a microbiota e o ambiente que ela habita. Avaliar seu estado metabólico

permite monitorar processos de biodegradação (ZWOLINSKI, 2000).

A atividade degradadora microbiana total foi quantificada a partir da medição da

hidrólise de diacetato de fluoresceína (FDA) realizada pelos microrganismos do solo. O

método utilizado foi baseado em adaptaçõesdo método original (SCHNÜRER &

ROSWALL, 1982),feitas por ADAM & DUNCAN (2001) e GREEN et al. (2006).


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A hidrólise de FDA é amplamente aceita como um método enzimático para

medir todas as atividades microbianas, seja de populações cultiváveis ou nãocultiváveis,

em uma grande variedade de amostras ambientais, visto que enzimas extracelulares

como esterases, lipases e proteases, que são abundantes em solos e estão envolvidas na

decomposição de muitos tipos de tecidos, possuem a capacidade de catalisar a hidrólise

de FDA. Além disso, o método costuma correlacionar-se bem com algumas das mais

precisas medições de biomassa e incorporação de carbono, além de ser mais rápido,

preciso, simples de se processar e reprodutível. A habilidade de hidrolisar FDA mostra-

se muito difundida, especialmente entre os maiores decompositores, bactérias e fungos

(ADAM & DUNCAN, 2001; BROHON et al., 2001; GREEN et al., 2006).

A incubação é feita em estufa, sem qualquer agitação. Os testes mostraram que a

agitação diminui a hidrólise de FDA, o que vai ao encontro dos testes de GREEN et al.

(2006). Assim sendo, não é necessária a utilização de erlenmeyers.A incubação pode ser

feita diretamente nos tubos falcon que servirão para a centrifugação.

A temperatura de incubação pode ser feita na temperatura na qual se

encontravam as amostras. A temperatura de 30ºC corresponde ao máximo de hidrólise

observado por ADAM&DUNCAN (2001), ou seja, traduz o potencial degradador da

amostra.

O filtrado é recolhido diretamente em provetas graduadas, permitindo a medida

direta do volume de filtrado.

Reagentes:

Diacetato de fluoresceína (FDA) (Sigma Aldrich).

Fluoresceína (Vetec).

Metanol (Isofar).

Clorofórmio (Vetec).

Fosfato de potássio monobásico (Vetec).

Fosfato de potássio dibásico (Proquimio).

Água destilada.

Soluções:

Tampão fosfato 60mM.

Solução de clorofórmio-metanol 2:1.


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Solução estoque de FDA 1000µg.mL-1.

Solução estoque de fluoresceína 2000µg.mL-1.

Solução padrão de fluoresceína 20µg.mL-1.

Procedimento:

Para cada amostra, foram pesadas quatro replicatas de 2g de solo (contaminado e

não contaminado) em tubos falcon previamente preenchidos com 15mL da solução

tampão e identificados (1 controle e 3 replicatas da amostra). Separado o controle,

foram acrescentados às três alíquotas 200µL de solução de FDA 1000µg.mL-1. Agitou-

se manualmente. Após a incubação a 30ºC por 20 minutos em ambiente escuro,

interrompeu-se a reação com 15mL de solução de clorofórmio-metanol 2:1 e agitação

manual. Em seguida, as amostras sofreram centrifugação a 2000 RPM por 3 minutos e

foram filtradas em filtro quantitativo. Mediu-se o volume do filtrado. A fluoresceína

formada nos filtrados durante a incubação foi medida em espectrofotômetro de UV-vis

(Kasuaki IL 227) a 490nm e sua concentração em cada amostra foi obtida a partir de

uma curva-padrão de fluoresceína feita anteriormente à amostragem. Cálculos foram

feitos a fim de encontrar a quantidade de FDA hidrolisado por grama de amostra por

minuto: (concentração medida x volume de filtrado) / massa de amostra / tempo de

incubação).

Curva-padrão de calibração:

Uma curva-padrão de calibração foi preparada a partir de soluções de

concentrações crescentes de sal de fluoresceína (0; 0,5; 1; 2; 3; 4 e 5µg.mL-1) em

tampão fosfato.

Considerações finais e sugestões

No presente trabalho, foi apresentado um panorama geral sobre biorremediação

e sua aplicabilidade, além de recomendações gerais para estudos e aplicação dessa

tecnologia. Apesar da possibilidade de aplicação para tratar uma grande variedade de


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contaminantes, não se pode afirmar que a biorremediação é um processo único e

universal, que possa ser usado em qualquer caso.

A alta diversidade de microrganismos, o potencial de adaptabilidade genética e a

possibilidade de interação dos mesmos atuando complementarmente em um consórcio,

coloca essa tecnologia em destaque para a solução de problemas ambientais,

principalmente para a remediação de misturas complexas de contaminantes.

Microrganismos bem adaptados a um ambiente específico podem fazer parte de

uma estratégia mais efetiva de biorremediação. Por essa razão, é importante destacar

que a avaliação da existência de microrganismos competentes para a biorremediação e

seus requerimentos nutricionais, combinados com condições favoráveis para o

crescimento, devem ser estudadas previamente em laboratório. Esse conhecimento

permite a posterior manipulação dos fatores ambientais que podem interferir no

processo de biodegradação em campo.

De modo geral, a profunda compreensão das diferentes habilidades de

degradação dos microrganismos, junto com suas vias metabólicas e mecanismos de

resistência ou adaptação, poderão contribuir no futuro para o desenvolvimento de

processos ou combinações de técnicas direcionadas para locais específicos de

contaminação.

O melhor entendimento desses mecanismos poderá contribuir para o controle da

biodegradação de contaminantes, por meio da aplicação de recursos e conhecimento da

genética e fisiologia dos microrganismos. Com o avanço de técnicas de biologia

molecular, a biorremediação pode ter seu potencial de aplicação melhorado, através do

conhecimento de vias de biodegradaçãomais completas e sofisticadas. Isso ainda deve

ser o foco de discussões futuras frente às legislações vigentes.

A biorremediação configura-se como uma das técnicas menos impactantes de

remediação do solo contaminado por hidrocarbonetos, uma vez que o solo não é

destruído e pode retornar novamente ao ambiente. A técnica requer, entretanto, o

acompanhamento de uma série de fatores capazes de influenciar na atividade

microbiológica responsável pela degradação dos compostos no solo.

Um dos fatores que merece destaque nesse monitoramento é a

biodisponibilidade dos contaminantes, visto que sua redução é talvez o objetivo mais

apropriado a ser atingido no final de um processo de tratamento. Essa redução na


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biodisponibilidade é bem demonstrada por meio de vários ensaios com indicadores

biológicos, atualmente usados ainda de forma pouco rotineira.

Espera-se que, além do incremento da biorremediação como técnica de

tratamento de solos contaminados, a aplicação de ensaios com indicadores biológicos

passe a ser mais utilizada como uma das ferramentas mais adequadas para avaliar a

biodisponibilidade dos contaminantes e seus riscos associados.

É razoável concluir que, independentemente da perspectiva de uso

(monitoramento de um sistema de biorremediação), a hidrólise do diacetato de

fluoresceína (FDA) conjuga a avaliação da bioacessibilidade e da biodisponibilidade, as

quais estão sujeitas a uma série de influências por fatores físico-químicos do meio onde

ocorre a oxidação.

De forma resumida, o ensaio com a FDA é ambientalmente realístico, além de

ser rápido, de baixo custo, de fácil execução técnica e com necessidade mínima de

equipamento.

Além do fato de ser conveniente em termos de aplicação industrial/ambiental, o

desenvolvimento da coloração pela hidrólise permite medidas mais precisas e mais reais

(em termos de condições ambientais) para se conhecer a cinética da biodegradação de

uma amostra específica. A eficiência da biodegradação pelo uso de diferentes

microrganismos ou misturas de microrganismos poderá ser feita de forma rápida e

precisa, ajustando-se assim rapidamente as condições ótimas para promover a

biodegradação.

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