2. material und methoden - albert-ludwigs-universität freiburg

Aus dem Zentrum für Psychische Erkrankungen

Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie des Universitätsklinikums Freiburg i.Br.

Modulation von Adenosinrezeptoren

hippocampaler Neurone von Mäusen und Ratten

bei assoziativer Langzeitpotenzierung

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg i. Br.

Vorgelegt

2017

von Aaron Vogt

geboren in Stuttgart

Dekanin Prof. Dr. Kerstin Krieglstein

Erster Gutachter Prof. Dr. Claus Normann

Zweiter Gutachter Prof. Dr. Josef Bischofberger

Jahr der Promotion 2018

I Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... III

TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................................................ IV

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... V

1 EINLEITUNG......................................................................................................................... 7

1.1 Synaptische Plastizität .............................................................................................................. 7

1.1.1 Synaptische Langzeitpotenzierung (LTP) ..................................................................... 8

1.1.2 Mechanismen der assoziativen LTP ............................................................................ 10

1.1.3 Neuroplastizitätshypothese der Depression ................................................................ 12

1.2 Schaltregion Hippocampus .................................................................................................... 14

1.3 Adenosin .................................................................................................................................. 15

1.3.1 Adenosinrezeptoren .................................................................................................... 16

1.3.2 Neuromodulation ........................................................................................................ 17

1.3.3 Neuro(patho)physiologische Implikationen ................................................................ 19

1.4 Fragestellung dieser Arbeit .................................................................................................... 20

2 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................... 21

2.1 Lösungen und Substanzen ...................................................................................................... 21

2.1.1 Extrazelluläre Lösungen ............................................................................................. 21

2.1.2 Pipetten-Lösung .......................................................................................................... 21

2.1.3 Substanzen .................................................................................................................. 23

2.2 Versuchstiere ........................................................................................................................... 24

2.3 Hippocampusschnitte ............................................................................................................. 25

2.4 Patch-Clamp-Methode ........................................................................................................... 27

2.5 Aufbau des Patch-Clamp-Messplatzes .................................................................................. 29

2.5.1 Übersicht ..................................................................................................................... 29

2.5.2 Messkammer und optisches System ............................................................................. 29

2.5.3 Messtisch und Mikromanipulator ............................................................................... 30

2.5.4 Pulsstimulator, Verstärker und Software .................................................................... 31

2.6 Pipettenherstellung ................................................................................................................. 32

2.7 Stimulationsprotokoll ............................................................................................................. 32

2.8 Versuchsablauf ........................................................................................................................ 33

2.9 Datenanalyse und -auswertung .............................................................................................. 34

II Inhaltsverzeichnis

3 ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 35

3.1 Versuchsreihen mit Mäusen ................................................................................................... 35

3.1.1 Kontrollreihe LTP bei Wildtyp-Mäusen ...................................................................... 35

3.1.2 Messreihe LTP bei transgenen Mäusen ...................................................................... 36

3.2 Versuchsreihen mit Wistar-Ratten ........................................................................................ 37

3.2.1 Kontrollreihe LTP bei Wistar-Ratten .......................................................................... 37

3.2.2 Messreihe mit cCPA .................................................................................................... 38

3.2.3 Messreihe mit DPCPX und cCPA ............................................................................... 39

3.2.4 Messreihe mit NEM und cCPA ................................................................................... 40

3.2.5 Messreihe mit CGS ..................................................................................................... 41

3.2.6 NEM-Zugabe ohne LTP-Induktion .............................................................................. 42

3.3 Übersicht .................................................................................................................................. 42

3.3.1 LTP-Versuchsreihe mit Mäusen .................................................................................. 42

3.3.2 LTP-Versuchsreihe mit Wistar-Ratten ........................................................................ 43

4 DISKUSSION ...................................................................................................................... 45

4.1 Patch-Clamp-Technik an Hirnschnitten ............................................................................... 45

4.2 LTP-Kontrollreihen an Mäusen und Ratten ........................................................................ 46

4.3 LTP-Modulation durch A1R-Überexprimierung ................................................................. 47

4.4 LTP-Modulation durch cCPA ............................................................................................... 48

4.5 LTP-Modulation durch DPCPX + cCPA .............................................................................. 50

4.6 LTP-Modulation durch NEM + cCPA .................................................................................. 51

4.7 LTP-Modulation durch CGS ................................................................................................. 54

4.8 Pathophysiologische Bedeutung ............................................................................................. 56

5 ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................................... 58

LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................................................... 59

EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG ..................................................................................... 77

DANKSAGUNG ............................................................................................................................... 78

III Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

ABBILDUNG 1: SPIKE TIMING-DEPENDENT PLASTICITY (STDP) ............................................................ 9

ABBILDUNG 2: PHASEN UND MOLEKULARE PROZESSE DER LTP AN EINER

CA3/CA1 SYNAPSE ............................................................................................................. 12

ABBILDUNG 3: SCHEMA SYNAPTISCHER VERBINDUNGEN IM ANGESCHNITTENEN

HIPPOCAMPUS .................................................................................................................... 15

ABBILDUNG 4: SCHEMA DES METABOLISMUS UND SIGNALWEGS VON ADENOSIN ..................... 17

ABBILDUNG 5: SCHEMA DER ÜBEREXPRIMIERUNG DES A1R-GENS ................................................... 24

ABBILDUNG 6: IMMUNOFLUORESZENZMUSTER ANTI-MCHERRY

IM HIPPOCAMPUS-SCHNITT ............................................................................................ 25

ABBILDUNG 7: ANFERTIGEN DER HIRNSCHNITTE .................................................................................. 27

ABBILDUNG 8: PATCHKONFIGURATIONEN ............................................................................................... 28

ABBILDUNG 9: ÜBERSICHT DES PATCH-CLAMP-MESSPLATZES .......................................................... 29

ABBILDUNG 10: MESSTISCH MIT MESSKAMMER WÄHREND MESSUNG ........................................... 30

ABBILDUNG 11: VEREINFACHTES SCHALTBILD EINES PATCH-CLAMP-VERSTÄRKERS ............... 31

ABBILDUNG 12: SCHEMA DES THETA-BURST-PAIRING-PROTOKOLLS .............................................. 33

ABBILDUNG 13: LTP-KONTROLLREIHE WILDTYP-MÄUSE..................................................................... 35

ABBILDUNG 14: LTP-MESSREIHE AN CAMKII-ADOA1R-92-MÄUSEN..................................................... 36

ABBILDUNG 15: LTP-KONTROLLREIHE WISTAR-RATTEN ..................................................................... 37

ABBILDUNG 18: LTP-MESSREIHE MIT NEM UND CCPA AN WISTAR-RATTEN ................................... 40

ABBILDUNG 19: LTP-MESSREIHE MIT CGS AN WISTAR-RATTEN ......................................................... 41

ABBILDUNG 20: EPSP-VERLAUF BEI NEM-ZUGABE OHNE STIMULATIONSPROTOKOLL ............... 42

ABBILDUNG 21: VERGLEICH ALLER LTP-MESSREIHEN MIT DER KONTROLLGRUPPE

IN % DER BASELINE .......................................................................................................... 44

ABBILDUNG 22: EPSP-VERLAUF BEI CCPA-ZUGABE OHNE STIMULATIONSPROTOKOLL ............. 49

IV Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

TABELLE 1: ANGABEN DER LÖSUNGSBESTANDTEILE (IN MMOL/L) .................................................. 22

TABELLE 2: VERÄNDERUNGEN DER EPSP-AMPLITUDEN NACH LTP-INDUKTION IN % DER

BASELINE BEI MÄUSEN ............................................................................................................ 42

TABELLE 3: VERÄNDERUNGEN DER EPSP-AMPLITUDEN NACH LTP-INDUKTION IN % DER

BASELINE BEI RATTEN ............................................................................................................. 43

V Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

A Ampere

AD Antidepressiva

AMPA α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-Propionsäure

ANOVA Analysis of variance

AP Aktionspotenzial

AR Adenosinrezeptor(en)

AxR Ax-Adenosinrezeptor(en); x = 1, 2A, 2B, 3

BDNF Brain derived neurotrophic factor

BPAP Rückgeleitetes Aktionspotenzial (engl.: back propagating action potential)

CA Ammonshorn (lat. Cornu ammonis)

CaMKII Calmodulin-abhängige Proteinkinase II

Ca2+ Kalzium-Ion

CGS 4-[2-[[6-Amino-9-(N-ethyl-β-D-ribofuranuronamidosyl)-9H-purin-2-

yl]amino]ethyl]benzenepropanoic acid hydrochloride

CREB cAMP response element-binding protein

cCPA 2-chloro-N(6)-cyclopentyladenosine

DAG Diacylglycerin

DPCPX 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine

EGTA Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraethansäure

ENT Equilibrativer Nukleosidtransporter

EPSP Exzitatorisches postsynaptisches Potenzial

G Giga (109)

GTP Guanosin-5‘-triphosphat

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ehtansulfonsäure

HFS High frequency stimulation

Hz Hertz

IP3 Inositoltriphosphat

K+ Kalium-Ion

LTD Langzeitdepression (engl.: long-term depression)

LTP Langzeitpotenzierung (engl.: long-term potentiation)

µ Mikro (10-9)

VI Abkürzungsverzeichnis

M Mega (106) / mol/l

Mg2+ Magnesium-Ion

ms Millisekunde

mV Millivolt (10-3 Volt)

n nano (10-9) / Anzahl der Experimente

Na+ Natrium-Ion

NEM N-Ethylmaleinimide

NSF N-Ethylmaleinimide-sensitiver Faktor

NMDA N-Methyl-D-Aspartat

Ω Ohm

p Piko (10-12)

PKC Proteinkinase C

PLC Phospholipase C

PSD Postsynaptic density

Rm Membranwiderstand

Rs Serienwiderstand

SNARE Soluble N-Ethylmaleinimide-sensitive-factor attachment receptor

STDP Aktionspotenzial-Intervall-abhängige-Plastizität (engl.: spike-time dependent

plasticity)

TBS Theta-burst stimulation

V Volt

WT Wildtyp

ZNS Zentrales Nervensystem

7 1 Einleitung

1 Einleitung

1.1 Synaptische Plastizität

Das menschliche zentrale Nervensystem (ZNS) verfügt über die erstaunliche Fähigkeit,

neuronale Verschaltungen durch Erfahrungen zu modifizieren. So resultieren aus einer

angepassten neuronalen Aktivität Veränderungen in Verhalten, Gedanken und Gefühlen.

Dieser sogenannten Plastizität liegen Prozesse in struktureller, zellulärer und synaptischer

Veränderbarkeit zugrunde. Während die strukturelle und zelluläre Plastizität funktionelle

Veränderungen sowie Neurogenese und Apoptose bedeuten, moduliert die synaptische

Plastizität die Stärke der Signalübertragung an vorhandenen Synapsen (Davis und Malenka

2002).

Den Begriff der neuronalen Plastizität prägte Ramón y Cajal bereits zu Beginn des 20.

Jahrhunderts, nachdem er die morphologische Neubildung axonaler Kollateralen und Dendriten

beobachtet hatte (Cajal, S. R. Y 1894, 1928; Stahnisch 2003).

Zur selben Zeit vermutete man bereits, dass die Anzahl der Neurone im Erwachsenenalter kaum

schwindet und die Speicherung von Lern- und Gedächtnisinhalten nicht nur auf eine

Neubildung von Neuronen zurückzuführen sei. Schließlich formulierte Donald Hebb 1949 das

Grundprinzip synaptischer Plastizität, welches bis heute gültig ist:

„When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or

persistently takes part in firing it, some growth process or metabolic change

takes place in one or both cells such that A's efficiency, as one of the cells firing

B, is increased.“ (Hebb 1949)

Erst einige Jahrzehnte später wiesen Terje Lømo und Timothy Bliss eine solche verstärkte

synaptische Signalübertragung in elektrophysiologischen Experimenten im Hippocampus von

Kaninchen nach (Bliss und Lømo 1973). Dabei registrierten sie nach tetanischer Stimulation

im Tractus perforans eine lang anhaltende Erhöhung der exzitatorischen postsynaptischen

Potenziale (EPSP) im Gyrus dentatus. In ihrer Arbeit nannten sie dieses Phänomen der

Ausbildung einer verstärkten Signaltransduktion Langzeitpotenzierung (engl. long-term

potentiation, LTP).

In darauffolgenden Jahren wurde die Hebb’sche Lernregel erweitert und eine Abschwächung

von EPSP durch asynchrone oder niederfrequente Stimulation beschrieben, folglich

8 1 Einleitung

Langzeitdepression genannt (engl. long-term depression, LTD) (Stent 1973; Levy und Steward

1983).

Obwohl die synaptische Langzeitplastizität das vielversprechendste experimentelle Modell für

das Verständnis von Lernen und Gedächtnis darstellt, braucht es aufgrund der Komplexität

neuronaler Verschaltung nach wie vor den definitiven Nachweis eindeutiger Korrelation (Bliss

und Collingridge 1993; Kandel 2001; Whitlock et al. 2006; Cooke und Bliss 2006). Zwar

konnte anahnd von einigen transgenen Mausmodellen gezeigt werden, dass es Zusammenhänge

zwischen LTP und räumlichem Lernen besonders in Synapsen des Schaffer-

Kollateraltrakts/CA1-Neurone gibt; es bleibt jedoch offen, inwiefern LTP für andere Bereiche

des Lernens verantwortlich gemacht werden kann (Huang et al. 1995; Lynch 2004). Außerdem

konnte gezeigt werden, dass molekulare Prozesse der LTP variieren. Zum einen je nach

Lokalisation, wie beispielsweise in Moosfasern aus dem entorhinalen Kortex im Unterschied

zu Schaffer-Kollateralen, und zum anderen bezogen auf den Entwicklungsstand der Mäuse

(Huang et al. 1995; Yasuda et al. 2003; Luchkina et al. 2014).

Auch wenn die Neurogenese bei Gedächtnisbildung und -erhalt besonders im Hippocampus

eine gewisse Rolle spielt (Deng et al. 2010; Akers et al. 2014), konnten verschiedene Formen

der LTP und LTD in mehreren Gehirnregionen nachgewiesen werden (Fox 2002; Ji et al. 2003;

Purves et al. 2012). Deshalb stellen die Mechanismen der modifizierten synaptischen

Übertragungsstärke nach wie vor ein geeignetes molekulares Erklärungsmodell für Lernen und

Gedächtnis dar (Malenka und Bear 2004; Massey und Bashir 2007).

Von der Minuten bis Stunden andauernden Langzeitplastizität (LTD und LTP) unterscheidet

man die Kurzzeit-Plastizität, welche nur Millisekunden bis Minuten anhält (Abbott und Regehr

2004). Neuere Studien konnten unterschiedliche Mechanismen der Kurzzeit-Potenzierung

(STP) von denen der LTP abgrenzen und damit der STP eine mögliche eigene funktionelle

Bedeutung für das Kurzzeitgedächtnis zuschreiben (Volianskis et al. 2013).

Im Folgenden soll genauer auf die LTP eingegangen werden, da diese der zu untersuchende

Effektparameter aller zugrundeliegenden Experimente ist.

1.1.1 Synaptische Langzeitpotenzierung (LTP)

Wie bereits beschrieben, stellt die synaptische LTP neben der LTD einen wichtigen Teil der

Neuroplastizität dar. Je nach Stimulationsort, -frequenz und -dauer unterscheidet man homo-

von heterosynaptischer Plastizität, bzw. nicht-assoziativer von assoziativer.

9 1 Einleitung

Bei der homosynaptischen Form induziert ausschließlich ein afferenter Stimulus – also ein

präsynaptischer Reiz an einer Synapse – in einem Neuron eine LTP, vorausgesetzt ausreichend

hochfrequente (100-200 Hz) kurzanhaltende Tetani werden appliziert (engl.: high frequency

stimulation, HFS) (Bliss und Gardner-Medwin 1973; Grover und Teyler 1990). Werden

hingegen niederfrequente (1-10 Hz), langanhaltende Stimuli abgegeben, resultiert eine LTD

(engl.: low frequency stimulation, LFS) (Dudek und Bear 1992).

Wird assoziative (heterosynaptische) Langzeitplastizität generiert, kombiniert man in einem

definierten Zeitabstand präsynaptisch stimulierte EPSPs mit einer postsynaptischen

Depolarisation, die am Axonhügel induziert und retrograd über Dendriten fortgeleitet wird (sog.

BPAP, engl.: back propagating action potential) (Stanton und Sejnowski 1989; Brown et al.

1990; Chen et al. 1999; Song et al. 2000).

Neben den Wiederholungen dieser Stimulationspaarungen ist vor allem ihre zeitliche

Reihenfolge entscheidend. Folgt ein BPAP 20 ms oder kürzer auf ein EPSP, entsteht eine LTP,

und folgt umgekehrt ein EPSP auf ein BPAP, eine LTD (Levy und Steward 1983; Song et al.

2000). Außerdem zeigt sich, je kürzer das zeitliche Intervall gewählt wird, desto höhere

Übertragungsstärken resultieren (Markram 1997); (Bi und Poo 1998). Dieser assoziative

Mechanismus wird Aktionspotenzial-Intervall-abhängige Plastizität (engl.: spike timing-

dependent plasticity, STDP) genannt und repräsentiert am wahrscheinlichsten physiologische

Vorgänge hippocampaler Pyramidenzellen (Levy und Steward 1983; Paulsen und Sejnowski

2000; Dan und Poo 2006). Aus diesen Gründen wurde auch in dieser Arbeit eine STDP

induziert.

Abbildung 1: Spike timing-dependent plasticity (STDP)

Änderung der EPSP-Polarität nach Reihenfolge und zeitlichem Abstand von EPSP und BPAP. Je kürzer

(<20 ms) die Abfolge, desto höher bzw. niedriger resultieren EPSP. Modifiziert nach Schmidt et al. (2010).

10 1 Einleitung

1.1.2 Mechanismen der assoziativen LTP

Synapsen der CA3/CA1-Neurone im Hippocampus unterliegen seit Jahrzehnten einem breitem

Forschungsinteresse, weswegen der Mechanismus der LTP an diesem Zellkontakt gut erfasst

ist. Im Folgenden sollen grundlegende Vorgänge der LTP erläutert werden. Zur visuellen

Darstellung molekularer und zellulärer Vorgänge dient Abbildung 2.

Nach Depolarisation der präsynaptischen Membran erfolgt eine Exozytose des Transmitters

Glutamat in den synaptischen Spalt. Glutamat bindet nun an zwei entscheidende Arten

ionotroper Rezeptoren im Bereich erhöhter postsynaptischer Rezeptorendichte, auch genannt

Postsynaptic density (PSD). Zum einen können α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-

isoxazolpropionat-Rezeptoren (AMPA-Rezeptoren) als ligandengesteuerte Na+/K+-Kanäle die

basale Signalweiterleitung vermitteln, indem sie das negative Ruhemembranpotenzial

anheben und ein EPSP auslösen. Zum anderen kann es zu einer Induktion der LTP kommen,

wenn spannungsabhängige N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDA-R) durch folgende

Koinzidenz aktiviert werden: NMDA-R bewirken erst dann einen massiven Ca2+-Einstrom,

wenn ein Mg2+-Block durch Membrandepolarisation gelöst wird und gleichzeitig eine

Glutamatbindung den Kationenkanal aktiviert. Eine Depolarisation kann entweder durch

ausreichend hochfrequente Stimulierung der Präsynapse oder durch ein BPAP ausgelöst

werden. Entscheidend ist dabei die zeitliche Sequenz der STDP, aufgrund welcher am meisten

Ca2+ nach intrazellulär einströmt, wenn der Mg2+-Block kurz nach der relativ langanhaltenden

Glutamatbindung gelöst wird. Es konnte durch eine Blockade der NMDA-R gezeigt werden,

dass auch spannungsabhängige L-Typ Ca2+-Kanäle an dem ausschlaggebenden Ca2+-Einstrom

beteiligt sind, allerdings nur unter bestimmten Voraussetzungen in vitro (Huang und Malenka

1993; Huber et al. 1995; Morgan und Teyler 2001).

Der schnelle Einstrom von Ca2+ in die postsynaptische Zelle mobilisiert zusätzlich

intrazelluläre Ca2+-Speicher und aktiviert im weiteren Verlauf die Kalzium/Calmodulin-

abhängige Proteinkinase II (CaMKII), Proteinkinase C (PKC) und Tyrosinkinasen (Lisman et

al. 2012). CaMKII phosphoryliert und aktiviert zusätzliche AMPA-Rezeptoren und führt zu

einem vermehrten Einbau derselben in die postsynaptische Membran, welche dadurch

wesentlich in ihrer Exzitabilität beeinflusst wird (Citri und Malenka 2008; Lisman et al. 2012).

Silent synapses, in denen bisher keine AMPA-Rezeptoren vorhanden sind, können durch

Einbau von AMPA-Rezeptoren aufgrund benachbarter dendritischer Stimulation zu

exzitatorisch aktiven Synapsen (unsilenced synapses) transformiert werden (Kandel 2013).

Dieser zweite Abschnitt, der zur Aufrechterhaltung der LTP beiträgt, wird als Expression der

LTP verstanden.

11 1 Einleitung

Verschiedene wissenschaftliche Arbeiten gehen davon aus, dass zusätzlich zur

postsynaptischen Sensibilisierung bestimmte Signalmoleküle retrograd zu einer verstärkten

präsynaptischen Transmitterfreisetzung beitragen können. Dazu werden u.a. Lipide (z.B.

Endocannabinoide), Peptide, Wachstumsfaktoren (z.B. brain-derived neurotrophic factor -

BDNF) und insbesondere das Gas NO gezählt. Deren Beitrag zu LTP ist noch nicht ausreichend

geklärt (Regehr et al. 2009; Padamsey und Emptage 2014).

Über die bisher beschriebenen Vorgänge einer early-LTP hinaus, die ein bis drei Stunden

andauert, konnten molekulare Prozesse dargestellt werden, die für eine länger anhaltende Phase

(late-LTP) verantwortlich sind. Hiefür sorgt eine dauerhaft aktivierte Proteinkinase PKMζ

(Sacktor 2010), sowie eine Signalkaskade über cAMP und PKA, welche schlussendlich über

den Transkriptionsfaktor cAMP response element-binding protein (CREB-1) die Synthese

neuer Signalproteine in Gang setzt. Wahrscheinlich werden diese neuen Proteine nicht nur zur

Stabilisierung bestehender Synapsen und Aufrechterhaltung einer erhöhten AMPA-

Rezeptorendichte genutzt, sondern auch zur Ausbildung neuer Synapsen (siehe Abbildung 2;

Yuste und Bonhoeffer 2001; Kandel 2013). Eine strikte Trennung von early- und late-LTP ist

umstritten, zumal gezeigt werden konnte, dass beispielsweise PKA auch während early-LTP

eine essentielle Rolle spielt (Blitzer et al. 1995).

Verschiedene synaptische Eigenschaften unterstreichen die neuronale Anpassungsfähigkeit

eines Lernmodells, bei dem Reize verstärkt, kanalisiert oder nicht weiterverarbeitet werden

müssen. Physiologisch kann ein eigentlich zu schwacher synaptischer Impuls trotzdem zu LTP

führen, wenn er mit einer Depolarisation einer benachbarten Synapse desselben Neurons

gepaart wird. Dieser Vorgang wird als assoziative Konditionierung verstanden. Außerdem

entsteht Gedächtnisbildung zum einen durch Synapsenspezifität, indem nicht-stimulierte

Synapsen keine LTP ausbilden, und zum anderen durch Synapsenkooperativität, bei welcher

sich benachbarte schwache EPSP-Impulse verstärken und LTP triggern (Kandel 2013).

12 1 Einleitung

Abbildung 2: Phasen und molekulare Prozesse der LTP an einer CA3/CA1 Synapse

Während der early-LTP strömt Ca2+ über geöffnete NMDA-R ein (Induktion) und aktiviert den Einbau von

AMPA-Rezeptoren mittels CaMKII und PKC (Expression). Für präsynaptische Signalverstärkung sorgt ein

retrograder messenger. Late-LTP generiert eine aktivierte Signalkaskade via cAMP, PKA,

Transkriptionsfaktor CREB-1 und Proteinsynthese von bspw. PKMζ. Modifiziert nach Kandel (2013).

1.1.3 Neuroplastizitätshypothese der Depression

Obwohl affektive Erkrankungen ein klinisch weitreichend erforschtes Feld darstellen,

existieren besonders in der Ätiopathogenese der Depression eine Vielzahl an

Erklärungsansätzen. Zuvorderst konnten genetische Dispositionen als Ursache festgestellt

13 1 Einleitung

werden (Sullivan et al. 2000). Aus verschiedenen neurobiologischen und psychosozialen

Theorien wie die der erlernten Hilflosigkeit, dysfunktionalen Kognitionen und einem Mangel

an Selbstwert sowie positiven Verstärkern wuchs die Erkenntnis, dass eine Depression am

wahrscheinlichsten aus einem Zusammenspiel vieler prädisponierender Vulnerabilitäten

entsteht (Brakemeier et al. 2008). DeJong-Meyer fasste im Jahr 2005 die genannten

auslösenden Faktoren zu einem sogenannten erweiterten Final-Common-Pathway-Modell der

Depression zusammen.

Es wird angenommen, dass pathophysiologische Mechanismen der Depression mit dem Tier-

Stress-Modell korrelieren. In Experimenten mit Ratten, die chronischem Stress ausgesetzt

waren, konnten hippocampale Veränderungen sowohl in struktureller Plastizität wie

verminderter Neurogenese, als auch in funktioneller Plastizität wie abgeschwächter LTP und

gesteigerter LTD aufgezeigt werden (Castrén 2005; Normann et al. 2007; Holderbach et al.

2007; Serafini 2012). Dies konnte man mittels visuell evozierten Potenzialen (VEP) nicht-

invasiv auch bei Depressiven im Vergleich zu Gesunden feststellen (Normann et al. 2007).

Umgekehrt ist daher naheliegend, dass einige der transkraniellen und invasiven

Hirnstimulationsverfahren (z.B. Elektrokrampftherapie, EKT; repetitive transkranielle

Magnetstimulation, rTMS) zur Behandlung schwerer Depression in ebenjene Neuroplastizität

modulierend eingreifen und einen signifikanten Behandlungserfolg darstellen, auch wenn sie

von kognitiven Nebenwirkungen begleitet sein können (Plewnia und Padberg 2012; Li et al.

2012).

Die Neuroplastizitätshypothese der Depression wird dadurch bestärkt, dass auf zellulärer Ebene

bestimmte Marker im Vergleich zu gesunden Kontrollgruppen ausgemacht werden konnten.

Eine Stressinduktion und die dadurch erhöhte Ausschüttung von Glukokortikoiden kann LTP

insbesondere in CA1-Neuronen von Ratten abschwächen und LTD verstärken (Pavlides et al.

1993; Yamada et al. 2003; Gerges et al. 2004; Krugers et al. 2005; Krugers et al. 2006; Joëls

und Krugers 2007). Der neuroprotektive und für kognitive Funktionen wichtige

Wachstumsfaktor BDNF nimmt zusammen mit dem ihn transkribierenden CREB wohl eine

Schlüsselrolle ein (Nair und Vaidya 2006). Expression von BDNF durch CREB ist bei

Depression bzw. nach Stressinduktion gemindert und verliert damit seine neuronale

Schutzfunktion (Radecki et al. 2005; Sterlemann et al. 2010). Umgekehrt hat eine hohe

Aktivität von CREB einen positiven Einfluss auf Depression (Chen et al. 2001a; Blendy 2006).

Antidepressiva (AD) der Klassen Monoamin-Wiederaufnahmehemmer/-Abbauhemmer

scheinen die Suppression von CREB und BDNF durch Stress im präfrontalen Kortex und

14 1 Einleitung

Hippocampus wieder umzukehren, sodass neben Neurogenese auch zelluläre Anpassungen wie

Dendritenaussprossungen und Synapsenbildung verstärkt werden (Nibuya et al. 1996; Chen et

al. 2001b; Laifenfeld et al. 2005; Warner-Schmidt und Duman 2006). Diese Wirkungsweise

der AD stellt, entgegen der entkräfteten Monoaminmangelhypothese, eine plausiblere

Erklärung dar (Duman 2004; Ruhé et al. 2007; Brunoni et al. 2008; Banasr et al. 2011).

Depressive weisen vermehrt eine linksseitig lokalisierte Atrophie im Hippocampus auf

(Bremner et al. 2000; Campbell et al. 2004; Videbech und Ravnkilde 2004). Eine

Zelldegeneration im Bereich des Hippocampus korreliert wohl mit exekutiven, nicht jedoch mit

kognitiven Dysfunktionen, die im Zusammenhang mit Depression auftreten (Frodl et al. 2006;

Khan et al. 2015).

Zusammenfassend können die beschriebenen Einschränkungen der strukturellen und

funktionellen Neuroplastizität als relevante Faktoren der multifaktoriellen Genese der

Depression betrachtet werden (Normann et al. 2007; Pittenger und Duman 2008; Nissen et al.

2010).

1.2 Schaltregion Hippocampus

Der Hippocampus liegt im medialen Temporallappen und ist Teil des „limbischen Systems“,

dessen Funktion als isolierte Einheit jedoch umstritten ist. Zu der Hippocampusformation im

eigentlichen Sinne zählt man die drei Strukturen Gyrus dentatus, Cornu ammonis

(Ammonshorn, Hippocampus proprius) und Subiculum. Das Ammonshorn (Cornu Ammonis)

kann in die Zellregionen CA1 bis CA4 unterteilt werden. Es zeigt sich histologisch eine

archicorticale Dreischichtung, in der die Pyramidenzellkörper in dem mittleren Stratum

pyramidale liegen und von dort aus Dendriten in das Stratum oriens sowie Stratum radiatum

und lacunosum-moleculare ausbilden (Trepel 2015).

Afferenzen gelangen in den Hippocampus hauptsächlich über den Tractus perforans vom

entorhinalen Kortex zu den Körnerzellen im Gyrus dentatus. Diese glutamatergen Zellen

projizieren über sogenannte Moosfasern in das Stratum radiatum, wo sie glutamaterge CA3-

Pyramidenzellen innervieren. CA3-Zellen wiederum stimulieren CA1-Pyramidenzellen über

Axone, die man Schaffer-Kollateraltrakt nennt. Diese Verschaltungsstelle eignet sich aufgrund

der Unidirektionalität besonders gut für elektrophysiologische Untersuchungen. Zusätzlich

erhalten CA1-Neurone direkte Afferenzen aus dem entorhinalen Kortex. Efferenzen gelangen

15 1 Einleitung

in das Subiculum und bilden dabei eine wichtige Verbindung des Hippocampus über den Fornix

zum „limbischen System“ (Amaral D 2007; Kandel 2013).

Abbildung 3 zeigt schematisch die Binnenverschaltung im Hippocampus.

Abbildung 3: Schema synaptischer Verbindungen im angeschnittenen Hippocampus

a: Informationen gelangen über den Tractus perforans vom entorhinalen Kortex in den Gyrus dentatus.

Körnerzellen projizieren mit ihren Moosfasern in das Cornu ammonis und bilden dort exzitatorische Synapsen

mit CA3-Pyramidenzellen. Letztere sind über den Schaffer-Kollateraltrakt mit CA1-Pyramidenzellen

verbunden, welche einen wichtigen Ausgangspunkt zum Subiculum und zurück zum entorhinalen Kortex

darstellen. b: Die Hippocampusformation liegt im medialen Temporallappen, im limbischen System mit dem

Fornix verbunden. Modifiziert nach Kandel (2013).

Die Funktion des Hippocampus ist noch nicht eindeutig geklärt, da die komplette Darstellung

komplexer neuronaler Netzwerke noch nicht möglich ist. Mit gewisser Wahrscheinlichkeit ist

der Hippocampus jedoch in die Verarbeitung von Emotionen, in Bildung von episodischem

Gedächtnis und räumlicher Orientierung involviert. Möglicherweise dient der Hippocampus

auch dazu, zeitliche und situative Informationen zu kontextualisieren (Neves et al. 2008;

Schiller et al. 2015). Synaptische Plastizität ist eine gut untersuchte Eigenschaft des

Hippocampus und prädestiniert ihn neben der guten anatomischen Abgrenzbarkeit daher zu

einer bevorzugten Grundlage elektrophysiologischer Experimente.

1.3 Adenosin

Adenosin ist ein körpereigenes Nukleosid, bestehend aus der Nukleinbase Adenin und β-D-

Ribose. Es bildet sich aus dem ubiquitären Katabolismus von ATP über die Zwischenstufen

ADP und AMP und kann auch von Neuronen und Gliazellen freigesetzt werden.

Über einen equilibrativen Nukleosidtransporter (ENT) gelangt Adenosin je nach

https://de.wikipedia.org/wiki/Ribose

https://de.wikipedia.org/wiki/Ribose

16 1 Einleitung

Konzentrationsgefälle bidirektional über die Zellmembran. So kann es extrazellulär als

Signalmolekül und Feinmodulator basaler synaptischer Übertragung fungieren, ohne selbst ein

Neurotransmitter zu sein (Sebastião und Ribeiro 2009; Wilson und Mustafa 2009; Dias et al.

2013). Adenosin scheint einen modulierenden Einfluss auf die Neurotransmitter Glutamat,

Dopamin, GABA, Serotonin, Noradrenalin und Acetylcholin zu haben, wenn auch die

Hemmung exzitatorischer Transmitter (z.B. Glutamat) im Vordergrund steht (Shen und Chen

2009). Im Kapitel 1.3.3 wird schließlich auf die Bedeutung von Adenosin bei

neuropathophysiologischen Vorgängen eingegangen.

1.3.1 Adenosinrezeptoren

Wirkung zeigt Adenosin hauptsächlich an den vier bisher bekannten Adenosinrezeptoren (AR),

die an G-Proteine gekoppelt sind (kurz: GPCR) und intrazelluläre Signalkaskaden auslösen.

Von den vier Rezeptor-Subtypen A1, A2A, A2B und A3 kommen im ZNS hauptsächlich A1- und

A2A-Rezeptoren (A1R und A2AR) in hoher Dichte vor, in CA3- und CA1-Neuronen dominieren

A1R (Rebola et al. 2005). Betrachtet man die Acetylcholin-Modulation im Hippocampus,

scheinen A1R in der CA1-Region und A2AR in der CA3-Region jeweils stärker exprimiert zu

sein (Cunha et al. 1994).

Das Guanylnukleotid-bindende Protein (G-Protein) besteht aus den drei Untereinheiten αs bzw.

αi, β und γ. Bindet Adenosin an den Rezeptor, wird die α-Einheit des G-Proteins durch den

Austausch von Guanosindiphosphat (GDP) zu Guanosintriphosphat (GTP) aktiviert. Entweder

wird die nachgeschaltete Adenylatzyklase dadurch stimuliert (αs/Gs) oder inhibiert (αi/Gi) und

setzt bei Stimulation cAMP frei (Kandel 2013). Damit moduliert Adenosin unter anderem die

in Kapitel 1.1.2 beschriebene Kaskade von cAMP, PKA und CREB.

Sowohl der A1R als auch A3-Rezeptor (A3R) sind hauptsächlich Gi-Protein-gekoppelt,

wohingegen die A2A- (A2AR) und A2B-Rezeptoren (A2BR) Gs-Protein-gekoppelt sind. Adenosin

hat eine hohe Affinität zu den Rezeptoren A1, A2A und A3. Die endogene Adenosin-

Konzentration reicht unter physiologischen Bedingungen nicht dazu aus, den ohnehin wenig

exprimierten A2BR zu stimulieren (Fredholm et al. 2001b). Dieser Umstand unterstreicht die

funktionelle Bedeutung der Adenosinkonzentration und Rezeptorendichte, -affinität

sowie -lokalisation.

Außerdem aktiviert der A1R, ebenso wie A2BR und A3R, Phospholipase C (PLC) über die β/γ-

bzw. αq-Einheit, wodurch schließlich über Inositoltriphosphat (IP3) intrazelluläre Ca2+-Speicher

17 1 Einleitung

freigesetzt werden und mittels Diacylglyzerin (DAG) die Proteinkinase C aktiviert wird (Mori

2014). Abbildung 4 skizziert die beschriebenen Signalwege.

Mit der Aktivierung der AR wird zeitgleich deren Desensibilisierung mittels Internalisierung

über β-Arrestin initiiert, wobei der A1R am längsten aktiviert verbleibt (Klaasse et al. 2008).

Abbildung 4: Schema des Metabolismus und Signalwegs von Adenosin

ATP bindet als Signalmolekül an purinerge Rezeptoren (P2X und P2Y) und wird über Hydrolyse zu ADP,

AMP und schließlich Adenosin abgebaut. Adenosin bindet hochaffin an P1-Rezeptoren, vier G-Protein-

gekoppelte Rezeptoren (A1, A2A, A2B, A3) und löst unterschiedliche Signalmechanismen aus. A1R und A3R

(Gi-gekoppelt) hemmen die Adenylatzyklase, sodass kein cAMP-Anstieg erfolgt. Zudem stimulieren sie

zusammen mit A2B die Phospholipase C mit einem Ca2+-Anstieg sowie einer Aktivierung der PKC zur Folge.

A2A und A2BR (Gs-gekoppelt) stimulieren Adenylatzyklase und die nachgeschaltete Kaskade. Über

equilibrative Nukleosidtransporter (ENT) gelangt Adenosin über die Zellmembran. Modifiziert nach Dias et

al. (2013).

1.3.2 Neuromodulation

Verschiedene Wirkungsweisen versuchen den modulierenden Einfluss von AR auf die

synaptische Übertragungsstärke zu erklären, wenngleich diese Mechanismen noch nicht

abschließend erforscht sind und teilweise uneinheitliche Ergebnisse vorliegen.

18 1 Einleitung

Entscheidend für neuromodulatorische Effekte sind die gegensätzlichen Mechanismen vor

allem von A1R und A2AR, die paradoxerweise häufig in einer einzelnen glutamatergen

Pyramidenzelle co-exprimiert werden (Rebola et al. 2005).

Es konnte bisher gezeigt werden, dass LTP über A1R abgeschwächt, jedoch über A2AR verstärkt

wurde (Mendonça und Ribeiro 1996). A1R scheinen NMDA-R – die maßgeblich an LTP-

Induktion beteiligt sind – in hippocampalen Neuronen zu hemmen. Komplexeren und noch

nicht vollständig erfassten Einfluss scheint der A2AR auf den NMDA-R zu haben. Bei

geringerer Aktivierung verstärkt er dessen Wirkung, bei erhöhter Aktivität scheint er diesen

jedoch speziell im Striatum zu hemmen (Klishin et al. 1995; Mendonca et al. 1995; Wirkner et

al. 2000; Rebola et al. 2008; Wilson und Mustafa 2009).

Zusätzlich wird bei Aktivierung von NMDA-R Adenosin freigesetzt, welches als retrograder

messenger über A1R eine präsynaptische Glutamatfreisetzung hemmen kann (Manzoni et al.

1994). A2AR hingegen führt zu einem gegenteiligen Effekt.

Während postsynaptisch die Modulation von NMDA-R im Vordergrund steht, hemmen A1R

präsynaptisch einen Ca2+-Einstrom, der für die exozytotische Freisetzung von Transmittern

benötigt wird (Wu und Saggau 1994).

Sowohl über NMDA-R als auch über A1R werden GIRKs (engl.: G protein-coupled inwardly-

rectifying K+ channels) aktiviert, wodurch das Membranpotenzial hyperpolarisiert und damit

die synaptische Exzitabilität eingeschränkt wird (Chung et al. 2009; Kim und Johnston 2015).

Auch ATP spielt bei HFS präsynaptisch eine Rolle in der Glutamatfreisetzung mittels

purinergen P2X- und P2Y-Rezeptoren. Eine neuere Studie belegt einen direkten, hemmenden

Einfluss auf postsynaptische AMPA-Expression (Pougnet et al. 2014). Außerdem triggern P2-

Rezeptoren eine Adenosinfreisetzung, welche wiederum LTP reguliert (Wieraszko und Ehrlich

1994; Almeida et al. 2003; Rodrigues et al. 2005).

Entscheidend für die konzentrationsabhängige Wirkung von Adenosin ist die vor allem

präsynaptische Heterodimerisierung von A2AR und A1R, die im Striatum von Ciruela et al.

(2006) beschrieben wurde. So führt eine niedrige Adenosinkonzentration über den A1R zu einer

Inhibierung synaptischer Transmission, eine höhere Konzentration zu einer Aktivierung des

A2AR, der wiederum den A1R hemmt und damit zu einer Potenzierung der

Transmitterfreisetzung führt (O'Kane und Stone 1998; Lopes et al. 2000; Brugarolas et al.

19 1 Einleitung

2014). Die beschriebene Feinmodulierung durch den A2AR kommt wahrscheinlich vermehrt in

pathophysiologischen Situationen zum Tragen (Shen und Chen 2009).

1.3.3 Neuro(patho)physiologische Implikationen

Die Rolle von Adenosin im Körper ist weitreichend. Es schwächt Entzündungsgeschehen, ist

an Wundheilung beteiligt, schützt vermutlich Gewebe vor ischämischem Schaden und

vermittelt Vasodilatation, Angiogenese und Neuroprotektion (Fredholm 2007; Haskó et al.

2008; George et al. 2010)

Über den A1R und A2AR werden vermutlich Schlaf-Wachphasen und Schlafinduktion

beeinflusst (McCarley 2007; Huang et al. 2011). Zudem konnte im Mausmodell gezeigt

werden, dass therapeutischer Schlafentzug und Elektrokrampftherapie astrozytäres Adenosin

vor allem im Frontalhirn freisetzten, die A1-Rezeptorendichte erhöhten und somit A1R-

vermittelt antidepressiv wirkten (Elmenhorst et al. 2007; van Calker und Biber 2005). Dies

konnte durch Zugabe von A1-Rezeptoragonisten verstärkt werden (Hines et al. 2013). Die

Arbeit von Kaster et al. (2012) vermutete den antidepressiven Effekt von A1R in der Hemmung

von NMDA-R.

Bekanntermaßen verstärken AR-Antagonisten wie z.B. Coffein neben Wachheit auch

Aufmerksamkeit. Evidenz dafür liefert eine Studie von Mihara et al. (2007). Bei transgenen

Mäusen konnte nachgewiesen werden, dass die Aktivierung von A2AR negativ

Gedächtnisbildung beeinflusst (Wang et al. 2006; Giménez-Llort et al. 2007).

Vergleichbare Knockout-Mäuse schienen in einer anderen Studie weniger depressives

Verhalten zu zeigen. A2A-überexprimierende Ratten zeigten gegenteiliges Verhalten (El

Yacoubi et al. 2001; Coelho et al. 2014). Daraufhin wurden therapeutische, hochselektive

A2AR-Antagonisten (Istradefylline, Preladenant) identifiziert, die im Mausmodell antidepressiv

wirkten (Hodgson et al. 2009). Dieselben Wirkstoffe reduzieren „Off-Phasen“ bei der

Parkinson-Erkrankung und sind bereits in klinischen Phasen der Zulassung (Hickey und Stacy

2012; Vorovenci und Antonini 2015).

Noch nicht hinreichend geklärt ist die Wirkungsweise der Tiefen Hirnstimulation (appliziert

HFS), die bei Parkinson-Erkrankten effektiv Tremor reduziert und auch bei depressiven

Patienten Erfolge zeigt. Dabei scheint der A1R jedenfalls die Tremorreduzierung durch

Hemmung synaptischer Übertragung im Thalamus mitzuverantworten (Bekar et al. 2008).

Durch HFS aktivierte A2AR stimulieren ENTs (Equilibrative Nukleosidtransporter) und führen

20 1 Einleitung

in der Folge zu einer Internalisierung von Adenosin, wodurch die A1R-Aktivität wiederum

gebremst wird (Pinto-Duarte et al. 2005).

Daneben sind der A1R und der A2AR in einigen anderen neurologischen und psychiatrischen

Pathophysiologien involviert, wie beispielsweise in Alzheimer-Demenz, Huntington-

Erkrankung und Epilepsie, auf die in dieser Arbeit jedoch nicht eingegangen wird.

1.4 Fragestellung dieser Arbeit

In dieser Arbeit wird das durch die Arbeitsgruppe etablierte Theta-Burst-Pairing-

Stimulationsprotokoll weiterhin verwendet, um assoziative LTP als Simulation physiologischer

Reize an Mäuse- und Rattenneuronen in vitro zu untersuchen. Viele ältere Arbeiten nutzten

nicht-assoziative Stimulationsprotokolle (HFS).

Grundlage der Experimente ist die Frage danach, inwiefern AR die assoziative LTP modulieren.

Anhand verschiedener Agonisten und Antagonisten der A1R und A2AR soll überprüft werden,

wie sich diese durch extrazelluläre Beimengung auf die LTP an CA3/CA1-Synapsen im

Hippocampus von Wistar-Ratten auswirken. Die Ergebnisse werden jeweils mit einer

Kontrollgruppe verglichen. Es werden zum Teil Experimente von Christopher Landmann

(Arbeitsgruppe, 2015) wiederholt, um sie zu validieren.

Eine zweite Versuchsreihe geht der Frage nach, wie sich eine selektive Überexprimierung des

A1R in der CA1-Region (postsynaptisch) des Hippocampus von C57BL/6-Mäusen in der

assoziativen LTP-Messung zu einer Kontrollgruppe unterscheidet. David Stolz (Arbeitsgruppe,

2015) untersuchte in seinen Experimenten Mäuse mit einer Überexprimierung desselben

Rezeptors in der CA3-Region (präsynaptisch).

Parallel prüfte Julia Knoll (Arbeitsgruppe, noch nicht veröffentlicht) ähnliche Substanzen und

dieselbe transgene Überexprimierung in Mäusen in ihrer Wirkung auf LTD.

21 2 Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Lösungen und Substanzen

2.1.1 Extrazelluläre Lösungen

Um die Zellen am Leben zu erhalten, wurden die Hirnschnitte ab Präparation mit künstlicher

extrazellulärer Lösung umspült, der sogenannten aCSF (artificial cerebro-spinal fluid),

wodurch man physiologischen Liquor cerebrospinalis simulierte.

Die genauere Zusammensetzung der Elektrolyte in aCSF ist der Tabelle 1 zu entnehmen.

Mit dem Osmomat 030 (genotec, Deutschland) wurde die Osmolalität von aCSF im Bereich

von 320 ± 3 mosmol/kg gemessen.

Vor den Messungen wurde der aCSF-Lösung zusätzlich Picrotoxin hinzugefügt. Als nicht-

kompetitiver Kanalblocker des GABAA-Rezeptors fördert Picrotoxin indirekt eine

exzitatorische Reizweiterleitung, indem es den inhibitorischen Effekt des GABAA-Rezeptors

aufhebt.

Picrotoxin, als Stammlösung in Ethanol aufbewahrt, wurde der aCSF für eine abschließende

Konzentration von 20 µmol/l hinzugefügt.

Außerdem begann man vor den Messungen bereits damit, die Lösung mit Carbogen (95 % O2,

5 % CO2) zu begasen, um die Hirnschnitte ausreichend zu oxygenieren.

Die Stimulationspipetten wurden mit einer modifizierten aCSF befüllt, welche unter anderem

um die Substanz HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ehtansulfonsäure) ergänzt wurde.

Auf diese Weise konnte eine optimale Pufferung des pH-Wertes am Ort der Stimulation

gewährleistet werden. Der pH-Wert der Pipettenlösung wurde mit einem pH-Meter (WTW,

InoLab, pH Level 1, Deutschland) kontrolliert und mit NaOH (Natriumhydroxid) auf den

angestrebten pH 7,4 eingestellt.

2.1.2 Pipetten-Lösung

Um einen bestmöglichen Ionenaustausch in der Whole-cell-Zellverbindung zu schaffen,

befüllte man die Patchpipetten mit künstlicher intrazellulärer Lösung; für diese wurde eine

geringgradig niedrigere Osmolalität von 292 mosmol/kg (gemessen mit Osmomat 030, gonotec,

Deutschland) gegenüber der Zytoplasma-Osmolalität verwendet.


Hierbei wird ein besserer Abdichtdruck des Seals generiert, sowie ein osmotisch bedingtes

Aufschwellen der Zelle verhindert (Numberger und Draguhn 1996).

Der Calcium-Chelator EGTA (Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-

tetraethansäure) diente dazu, die Konzentration freier Calcium-Ionen zu puffern.

Um einen pH-Wert der Pipetten-Lösung von ursprünglich 5,48 auf 7,23 - 7,25 zu titrieren,

wurde KOH (Kaliumhydroxid) verwendet (ph-Meter: WTW, InoLab pH Level 1, Deutschland).

Kurze Zeit vor der Messung gab man GTP (Guanosin-5’-triphosphat) zu der Pipetten-Lösung

hinzu, um einen starken Zerfall durch Temperaturanstieg zu vermeiden.

Vor der Verwendung wurde die Lösung mit einem 0,2 μm Sterilfilter von kleinen Partikeln

gereinigt, um einer Verstopfung der Pipette vorzubeugen. Während der Messungen erfolgte

eine Kühlung der Pipetten-Lösung.

Substanz Extrazelluläre Lösung

(aCSF)

Pipetten-Lösung

NaCl 125 -

NaHCO3 25 -

NaH2PO4 1,25 -

KCL 2,5 20

K-Gluconat - 135

CaCl2 2 -

MgCl2 1 2

Glucose 27 -

Na2ATP - 2

GTP - 0,3

HEPES - 10

EGTA - 0,1

Picrotoxin (0,02) -

Tabelle 1: Angaben der Lösungsbestandteile (in mmol/l)

aCSF: Artifizielle cerebro-spinale Flüssigkeit, Na: Natrium, Cl: Chlorid, HCO3: Hydrogencarbonat, H2PO4:

Dihydrogen-phosphat, K: Kalium, Ca: Calcium, Mg: Magnesium, ATP: Adenosin-5‘-Triphosphat, GTP:

Guanosin-5‘-Triphosphat, HEPES: 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ehtansulfonsäure, EGTA: Ethylenglykol-

bis(2-aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraethansäure.


2.1.3 Substanzen

Der aCSF mischte man bei den jeweiligen Experimenten Substanzen bei, welchte unten

angeführte Stoffmengenkonzentrationen der endgültigen Spüllösung enthielten. Die

Substanzen mit höchstem Reinheitsgrad, im Folgenden aufgelistet, stammten von Sigma-

Aldrich (Deutschland) und Tocris (Deutschland).

cCPA 2-chloro-N(6)-cyclopentyladenosine

Sigma Aldrich, Deutschland

Stammlösung in Aqua dest.

Lösung in aCSF: 200 nM

DPCPX 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine

Tocris, Deutschland

Stammlösung in DMSO


CGS-21680 4-[2-[[6-Amino-9-(N-ethyl-β-D-ribofuranuronamidosyl)-9H-purin-2-

yl]amino]ethyl]benzenepropanoic acid hydrochloride

Tocris, Deutschland

Stammlösung in DMSO


NEM N-Ethylmaleinimide

Sigma Aldrich, Deutschland

Stammlösung in Ethanol

Lösung in aCSF: 250 µM


2.2 Versuchstiere

Alle Tiere wurden mit größter Sorgfalt, umsichtig und respektvoll behandelt. Sowohl während

des Transports, als auch im Labor wurde bestmöglich versucht, die Tiere vor Stressfaktoren

wie Kälte, Lärm und Erschütterung zu schützen.

Für einen Großteil der Versuche wurden weiße, junge Wistar-Ratten P12 (±2 Tage) verwendet.

Bei den anderen Versuchsreihen wurden transgene, junge C57BL/6-Mäuse P11-19 sowie deren

Wildtyp herangezogen. In der Linie CaMKII-AdoA1R-92 wird das A1R-Gen spezifisch in der

CA1-Region des Hippocampus ca. zweifach überexprimiert. Die zugrundeliegende Methode

wurde von Serchov et al. (2015) veröffentlicht. Ein Immunofluoreszenznachweis des

Verteilungsmusters im Hippocampus ist in Abbildung 6 zu sehen.

Um entsprechende transgene Mäuse zu züchten, werden die beiden folgenden Linien gekreuzt,

wobei nur 25 % der F1-Generation die gewünschte Genkombination tragen (siehe

Abbildung 5):

1. CaMKII‐tTA-Linie: Der Promotor CaMKII (Ca2+-Calmodulin-abhängige

Proteinkinase II) exprimiert das Tetracyclin-kontrollierte Transaktivatorgen (tTA) in

Neuronen des Vorderhirns.

2. TRE-A1R-mCherry‐Linie: Das Tetracyclin Response Element (TRE) exprimiert über

einen bidirektionalen Promotor sowohl das Fluoreszenzprotein mCherry-Gen, als auch das

Maus-spezifische A1R-Gen.

Abbildung 5: Schema der Überexprimierung des A1R-Gens

CaMKII exprimiert den Transaktivator (tTA), der Tetracyclin-abhängig (Dox/Doxycylin ist ein stabiles

Tetracyclin-Derivat) an TRE bindet und eine bidirektionale Exprimierung der Gensequenzen mCherry und

mA1R cDNA (A1R-Gen) zur Folge hat. Abbildung nach Serchov et al. (2015).


Abbildung 6: Immunofluoreszenzmuster anti-mCherry im Hippocampus-Schnitt

Grün: Marker für Neuronenkerne; gelb-orange: mCherry-Expression in der CA1-Region.

Abbildung orientiert sich an Serchov et al. (2015).

2.3 Hippocampusschnitte

Die hier beschriebenen Präparationsvorgänge orientieren sich an dem von Edwards und

Bischofberger etablierten Protokoll (Edwards et al. 1989; Bischofberger et al. 2006).

Die Dekapitation der Tiere erfolgte mit einer speziellen Schere. Ab diesem Zeitpunkt wurden

der Schädel, die Großhirnhemisphären und Hirnschnitte fortwährend in halbgefrorener bis

flüssiger, kalter aCSF präpariert und kontinuierlich mit Carbogen (Gasgemisch aus 95 % O2

und 5 % CO2) begast.

Zuerst wurde die Schädelkalotte freigelegt, sodass diese mit einem von dorsal geführten

sagittalen Scherenschnitt median durchtrennt werden konnte. Durch Schnitte, die medio-lateral

auf Höhe der Sutura lambdoidea und rostral der Bulbi olfaktorii gesetzt wurden, konnten die

Kalottenhälften entfernt werden, nachdem die Hirnhäute vorsichtig abgelöst wurden (siehe

Abbildung 7a). Mit einem Skalpell wurde rostral der Bulbi olfaktorii und caudal des

Cerebellums geschnitten, sodass die Großhirnhemisphären mit einem stumpfen Spatel aus der

Schädelhöhle herausgehoben und in eine mit aCSF gefüllte und begaste Petrischale gelegt

werden konnten. Nach drei Minuten wurden die Hemisphären mit einem Schnitt durch den

Corpus callosum getrennt, wobei ein untergelegtes Filterpapier für besseren Halt sorgte. Fortan

wurde für bessere Vergleichbarkeit nur die rechte Hemisphäre verwendet, die linke verworfen.

Auf die mediane Schnittseite gelegt, wurde der kraniale Anteil der rechten Hemisphäre mit

einem zum Lot um 5 ° geneigten, basofrontalen Schnitt entfernt, der ca. 1-2 mm nach apikal

gesetzt wurde (siehe Abbildung 7b). Dies ist der sogenannte „Magic Cut“, dessen Schnittwinkel


so gewählt ist, dass möglichst wenig Schaffer-Kollateralen angeschnitten werden, welche für

die Potenzial-Weiterleitung in den folgenden Experimenten vonnöten sind.

Die daraus entstandene Schnittfläche wurde mit Cyanacrylatkleber (LOCTITE 454, Henkel,

Deutschland) auf die vorgekühlte Schnittkammer des Mikrotoms (Leica VT1200, Deutschland)

geklebt. Ohne Verzug wurde die Kammer mit fast gefrorener aCSF-Lösung aufgefüllt und

weiterhin mit Carbogen begast.

Eingestellt mit einer Vorschubgeschwindigkeit von ca. 1 mm/s stellte das Mikrotom 300 µm

dünne Hippocampusschnitte her, wobei immer eine unbenutzte Rasierklinge (Gilette,

Deutschland) eingespannt wurde. Mit einer gebogenen Injektonsnadel ließ sich jeder Schnitt

von dem haftenden Gewebeblock am Subiculum abtrennen (siehe Abbildung 7c).

Etwa 6 gewonnene transversale Schnitte wurden mit einer Pipette in ein spezielles

Lagerungsgefäß abgelegt. In diesem lagen die Schnitte auf einem Haltering, der mit einer

Mullkompresse bespannt war, sodass ausreichende Oxygenierung durch die umspülende aCSF-

Lösung sichergestellt werden konnte (siehe Abbildung 7d).

Für 20 Minuten wurde das runde Gefäß bei 34,5 °C in einem Wasserbad (Julabo, EC-AP,

Deutschland) inkubiert. Im Anschluss lagerten die Schnitte bei Zimmertemperatur.

Durch die regenerative Phase während der Inkubation wurde die Zellqualität verbessert.

Dadurch konnte eine Durchführung der Messungen für eine Dauer von bis zu 5-6 Stunden

gewährleistet werden.


Abbildung 7: Anfertigen der Hirnschnitte

a: Schädel beim Entfernen der rechten Kalotte; b: „Magic Cut“ der rechten Hemisphäre in gekühlter und

mit Carbogen begaster aCSF; c: Hippocampaler Schnitt in der Schnittkammer des Vibratoms nach

Ablösen durch eine gebogene Injektionsnadel; d: Mehrere Hirnschnitte liegen mittig auf einem Netz zur

Aufbewahrung in mit Carbogen begaster aCSF.

2.4 Patch-Clamp-Methode

Mit der Entdeckung der Patch-Clamp-Technik revolutionierten Erwin Neher und Bert Sakmann

im Jahr 1976 die Messung von elektrophysiologischen Strömen über die Zellmembran einer

Zelle (Neher und Sakmann 1976). Dabei stießen die beiden auf die Möglichkeit, einzelne

Ionenströme durch Membrankanäle im Pico-Ampère-Bereich zu registrieren, wofür sie 1991

den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin erhielten (Nobelprize.org 2014).

Erste Messungen an Nervenzellen, die eine Membranleitfähigkeit während eines

Aktionspotenzials nachwiesen, gelangen Cole und Curtis in den 1930er-Jahren. Dies erreichten

sie mithilfe einer Spannungsklemme (voltage clamp) und indem sie Elektroden in die Zelle

einführten (Cole und Curtis 1938).

Hodgkin und Huxley konnten rechnerisch das Membranpotenzial auf die zwei spezifischen

Ionenströme von Kalium und Natrium über die Membran zurückführen (Hodgkin und Huxley


1952). Dass für die Membranpermeabilität ein Ionencarrier verantwortlich sei, wie die Autoren

annahmen, konnte allerdings nicht bestätigt werden.

Erst Neher und Sakmann gelang der Nachweis einzelner Ionenkanäle, deren Eigenschaft, sich

zu öffnen oder zu schließen, auf einem spannungsabhängigen Alles-oder-Nichts-Prinzip beruht.

In der verbesserten Patch-Clamp-Technik wird eine Glaspipette verwendet, deren abgerundete

Spitze mit einer minimal großen Öffnung auf der Zellmembran aufsitzt. Durch leichtes

Ansaugen schafft man eine dichte Unterdruckverbindung, wodurch sich Leckströme und

elektrisches Rauschen verringern. Dabei stülpt sich die kreisrunde Zelloberfläche (patch =

„Flicken“) in die Öffnung der Glaspipette und es entstehen bestenfalls Abdichtwiderstände von

einigen Gigaohm (sog. Gigaseal). Ausgehend von dieser Pipetten-Zellverbindung bestehen

mehrere mögliche Patchkonfigurationen (Numberger und Draguhn 1996). Neben der

beschriebenen Cell-attached-Konfiguration (siehe Abbildung 8a) kann durch einen kurzen

Saugimpuls der „patch“ herausgetrennt werden, sodass eine offene Verbindung zum

Zytoplasma hergestellt wird – es ensteht die Whole-cell-Konfiguration (siehe Abbildung 8b).

Möchte man Kanalströme ausschließlich an dem isolierten Membranstück messen, bieten sich

Konfigurationen Inside-out und Outside-out an (siehe Abbildung 8c,d).

Die durchgeführten Experimente wurden ausschließlich mit der Whole-cell-Konfiguration

gemessen. Vorteilhaft dabei ist, dass Ströme über die gesamte Zellmembran registriert und

zusätzlich Stoffe über die Patchpipette in den Intrazellulärraum appliziert werden können.

Abbildung 8: Patchkonfigurationen

a: Cell-attached-Konfiguration; b: Whole-cell-Konfiguation; c: Inside-out-Konfiguration; d: Outside-out-

Konfiguration. Modifiziert nach Numberger und Draguhn (1996).


2.5 Aufbau des Patch-Clamp-Messplatzes

2.5.1 Übersicht

Der Aufbau eines Patch-Clamp-Messplatzes erfordert das Zusammenspiel einzelner Geräte, die

eine Experimentdurchführung ermöglichen, registrieren und dokumentieren. Kernelement stellt

das Mikroskop samt Messkammer, Mikromanipulatoren für die Steuerung der Pipetten und der

Vorverstärker dar. Über eine Kamera und den zugehörigen Videomonitor ist die vergrößerte

Betrachtung des Experiments möglich. Die Einheit aus Pulsstimulator, Verstärker und

Computer ist für eine Durchführung, Analyse und Datenspeicherung des Experiments

unabdingbar.

Abbildung 9: Übersicht des Patch-Clamp-Messplatzes

2.5.2 Messkammer und optisches System

Die präparierten Hirnschnitte wurden nach Inkubation in eine runde Messkammer aus Plexiglas

(Mechanische Werkstätten, Universitätsklinikum Freiburg) überführt, die man auf dem

Mikroskoptisch verankerte. Für ein geringeres Flüssigkeitsvolumen in der Messkammer und

für einen erhöhten Durchfluss sorgte eine angewinkelt vertiefte Plexiglaswanne, deren Boden

ein Deckgläschen bildete. Hierauf wurde der Hirnschnitt gelegt und durch einen mit

Nylonfäden bespannten Platinring an den Rändern fixiert.


Über einen Perfusionszulauf wurde die ständige Versorgung des Hirnschnittes mit frischer

aCSF-Lösung, die beständig mit Carbogen begast wurde, sichergestellt. Eine Vakuumpumpe

(WISA, ASF-Thomas, Deutschland) sorgte für den Ablauf der Flüssigkeit an der

gegenüberliegenden Seite der Messkammer. Der regulierbare Zulauf wurde auf eine

Durchflussrate von ca. 5 ml/min eingestellt.

Abbildung 10: Messtisch mit Messkammer während Messung

a: Messkammer mit Hirnschnitt unter Platinring; b: Patchpipette; c: Stimulationspipette; d: Objektiv; e:

Referenzelektrode; f: Perfusionszulauf; g: Perfusionsablauf

Zur Verbesserung der Optik des verwendeten aufrechten Mikroskops (Axioskop, Zeiss,

Deutschland) wurde die Technik des differentiellen Interferenzkontrasts (DIC) angewendet.

Dies dient der besseren dreidimensionalen Orientierung im Gewebsschnitt während der

Lokalisierung der Zellen. Zusätzlich ermöglichte die Verwendung einer Infrarot-Videotechnik

(IR-Filter und IR-Kamera) eine optimale Lichtausbeute für eine kontrastreiche Darstellung.

Die optische 40-fache Vergrößerung durch ein Wasserimmersionsobjektiv (LUMPLAN FI/IR,

40 x/0.80 W, Olympus, Japan) wurde durch eine zusätzliche elektronische 30-fache

Vergrößerung einer Videokamera (Thomas Völker, Deutschland) erweitert. Sobald ein

geeignetes Neuron in der Mikroskop-Optik aufgefunden wurde, konnte der Pipetten-

Zellkontakt über die Videooptik erschütterungsfrei hergestellt werden.

2.5.3 Messtisch und Mikromanipulator

Um Störeffekte mechanischer Schwingungen und Erschütterungen während der Messungen zu

reduzieren wurde die komplette Messvorrichtung auf einem druckluftgefederten Messtisch

(Newport 3030W-OPT, USA) angebracht.


Für eine präzisere Pipettenplatzierung verwendete man elektrisch betriebene

Mikromanipulatoren (mini 25, Luigs & Neumann, Deutschland). Über ein Bedienpult konnten

so die Stimulations- und Patchpipetten gesteuert werden. An der Patchpipettenhalterung

befestigte man neben dem Vorverstärker einen Schlauch, mit dem Über- oder Unterdruck auf

die Pipette ausgeübt werden konnte.

Leitende Oberflächen von Messtisch, Mikroskop, Mikromanipulatoren und Vorverstärker

wurden elektrisch geerdet und signalleitende Kabel zusätzlich elektrisch abgeschirmt, um

Hintergrundrauschen zu minimieren.

2.5.4 Pulsstimulator, Verstärker und Software

Über eine Stimulationspipette, die einen Ag/AgCl-Elektrodendraht enthielt und mit aCSF-

Lösung befüllt war, wurden Spannungspulse im Schaffer-Kollateraltrakt der CA3-Neurone des

Hippocampus appliziert. Ein Pulsstimulator (A-M SYSTEMS, Model 2100, USA) generierte

diese Spannungspulse, die dann als EPSP-Amplituden über die Patchpipettenelektrode

registriert werden konnten.

Die mit einer Intrazellularlösung befüllte Patchpipette enthielt ebenso einen Ag/AgCl-Draht,

der über einen Vorverstärker am Mikromanipulator mit dem Verstärker (EPC-9, HEKA,

Deutschland) verbunden war.

Der Vorverstärker (Strom-Spannungswandler) maß mittels einer definierten Spannung (sog.

Kommando-/Sollspannung) über der Zellmembran Kompensationsströme, die zur

Aufrechterhaltung dieser Spannung nötig waren. Aufgrund der Verschaltung mit

Rückkopplungswiderstand wurde dieser Strom als Spannung ausgelesen. Dieses Signal, an den

Hauptverstärker weitergeleitet, wurde dort gefiltert und verstärkt.

Abbildung 11: Vereinfachtes Schaltbild eines Patch-Clamp-Verstärkers

OPA: Operationsverstärker; Usoll: Kommando-/Sollspannung; Upip: Pipettenspannung; Uaus:

Ausgangsspannung; Rf: Rückkopplungswiderstand. Modifiziert nach Numberger & Draguhn (1996)


In der Badlösung befand sich ein Silberchlorid-Draht als Referenzelektrode für die Messungen.

Neben dem Modus der Spannungsklemme (voltage clamp) existiert der Modus der

Stromklemme (current clamp). Dabei wird nicht die Spannung, sondern ein definierter Strom

aufrechterhalten und folglich die Änderung der Spannung registriert. Ein solcher

Stromklemmenmodus diente der Messung von EPSPs und Aktionspotenzialen an der Zelle.

Für das Stimulationsprotokoll sowie die Datenmessung und -verarbeitung wurde eine spezielle

Software (Pulse Version 8.77, Heka, Deutschland) verwendet.

2.6 Pipettenherstellung

Für die Herstellung der Stimulations- und Patchpipette dienten Borsilikatkapillaren (Ø außen

2 mm, Ø innen 1,5 mm, Hilgenberg, Deutschland), die in ein Pipetten-Ziehgerät (engl.: puller;

Sutter Instruments Co., P-87, USA) eingespannt und unter vorprogrammierter Zugkraft und

Hitzeeinwirkung auseinandergezogen wurden. So entstanden jeweils zwei identische

Glaspipetten, deren Spitzen die gewünschte Flankenlänge und Öffnungsfläche erhielten. Beide

Faktoren beeinflussten den Pipettenwiderstand. Zielbereich des Öffnungswiderstands der

Patchpipetten war 5-8 MΩ für eine stabile Sealbildung und weniger Lösungsaustausch mit dem

Zytosol. Für Stimulationspipetten genügten lediglich 2-3 MΩ für eine leichtere

Gewebestimulation bei größerer Pipettenöffnung.

Bei der Befüllung der Pipetten half eine Saugvorrichtung (Mechanische Werkstätten,

Uniklinikum Freiburg), mittels der die Pipettenspitze durch Unterdruck mit der gewünschten

Lösung befüllt werden konnte (engl. tip filling).

2.7 Stimulationsprotokoll

Das in dieser Arbeit verwendete assoziative LTP-Stimulationsprotokoll beruht auf einem von

Seifert (2009) etablierten Theta-Burst-Pairing-Modell (siehe Abbildung 12), welches sich

wiederum auf ein Protokoll von Schmidt-Hieber et al. (2004) bezieht.

Hierbei folgt auf ein präsynaptisch stimuliertes EPSP (Stimulationspipette) nach 5 ms ein

postsynaptisch stimuliertes AP (Patchpipette I: 0,7-1,2 nA, Pulsdauer = 3 ms). Durch

fünfmalige Wiederholung dieses Reizpaares mit 100 Hz entsteht eine Salve, welche mit einer

Frequenz von 5 Hz fünfmal wiederholt wird und den sog. Theta-Block formt. Mit einem

Abstand von 10 s wird auch dieser Theta-Block fünfmal wiederholt, sodass insgesamt 125

Reizpaare appliziert werden.


Abbildung 12: Schema des Theta-Burst-Pairing-Protokolls

Bildausschnitt: Sog. Theta-Blöcke mit zeitlich korrelierenden prä- und postsynaptisch, asynchron stimulierten

EPSPs und APs. Insgesamt resultieren 125 Reizpaare. Modifiziert nach Seifert (2009).

2.8 Versuchsablauf

Ein inkubierter Hirnschnitt wurde in der Messkammer mit einem Platinring fixiert, um diese

daraufhin am Messtisch des Mikroskops zu befestigen. Man legte sowohl die Schläuche der

aCSF-Perfusionsanlage, als auch die Erdungselektrode in die Messkammer ein.

In der Mikroskop- und Videomonitorübersicht konnte im CA1-Areal des Hippocampus eine

geeignete Pyramidenzelle ausfindig gemacht werden. Die Stimulationspipette platzierte man in

der Gegend der zuführenden Schaffer-Kollateral-Fasern der CA3-Neurone.

Mit einem Überdruck von ca. 200 mbar in der Patchpipette konnte Verunreinigung der

Pipettenspitze durch Zellmaterial vermieden werden, während man die Patchpipette vorsichtig

auf die Zielzelle absenkte. Sobald der Kontakt durch eine Eindellung (sog. dimpling) sichtbar

wurde, ließ man den Überdruck ab und es bildete sich spontan ein Abdichtwiderstand (sog.

seal) aus. Durch leichten Unterdruck mittels Ansaugen erreichte man ein Giga-Seal im Bereich

einiger GΩ. Zur Überprüfung der Sealqualität diente ein Kommandospannungspuls

(Rechteckpuls +5 mV, 20 ms).

Während dieser Cell-attached-Konfiguration regulierte man die Spannung auf -20 mV,

schließlich auf -70 mV, um daraufhin mit einem kurzen starken Saugimpuls den Membranfleck

(Patch) aus der Membran herauszulösen – daraus resultierte die Whole-cell-Konfiguration.


Um einer Verwechslung zwischen Pyramidenzellen und Interneuronen vorzubeugen, testete

man vor jedem Experiment Aktionspotenzialschwellen und Adaptionseigenschaften von

Pyramidenzellen bei wiederholten Depolarisationen.

Über die Stimulationspipette regulierte man Spannungspulse von 5-95 V und 200 ms Dauer,

sodass EPSPs mit einer Amplitude von 2-7 mV ausgelöst wurden.

Nach jedem Block von 10 EPSP-Messungen erfolgte jeweils ein Testpuls (+5 mV) zur

Bestimmung des aktuellen Membran- und Serienwiderstands.

Jede Baseline-Messung dauerte 5 min, woraufhin das LTP-Induktionsprotokoll durchgeführt

wurde und schließlich EPSP-Messungen (je 30 min) in kurzen Abständen gemessen wurden.

2.9 Datenanalyse und -auswertung

Mit der PulseFit-Software (v8.53 HEKA, Lambrecht, Deutschland) wurden alle Daten erfasst,

welche später mit der Software GraphPad (Prism 6.0, USA) analysiert und graphisch dargestellt

wurden. EPSP-Amplituden der Einzelexperimente wurden als Punkte in einem EPSP/Zeit-

Diagramm skizziert. Für die Darstellung der Messreihe wurden jeweils 6 aufeinanderfolgende

Messwerte gemittelt und mit Fehlerbalken (SEM: standard error of the mean) kombiniert. Der

Baseline entsprechen die Werte vor LTP-Induktion (t = 0).

In der statistischen Auswertung der Experimente mit Mäusen wurden gemittelte Werte der

fünfminütigen Baseline mit denen zwischen der 20. und 30. Minute nach LTP-Induktion mittels

nichtparametrischem Wilcoxon-Rangsummentest auf signifikanten Unterschied (p = 0,05)

untersucht. Bei Experimenten mit Ratten wurde lediglich ein Zeitfenster zwischen der 20. und

25. Minute zum Vergleich gewählt.

Für den Vergleich zweier unabhängier Testreihen wurde ein ungepaarter, nicht-parametrischer

Mann-Whitney-U-Test nach Normalisierung verwendet, bei drei Reihen im Vergleich ein

spezieller ANOVA-Test, der sogenannte Kruskal-Wallis-Test.

35 3 Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Versuchsreihen mit Mäusen

3.1.1 Kontrollreihe LTP bei Wildtyp-Mäusen

Als Referenz für Experimente mit transgenen CaMKII-AdoA1R-92-Mäusen wurden Wildtyp-

Mäuse desselben Stammes C57BL/6 verwendet. Die mittlere EPSP-Amplitude der Baseline

betrug 4,01 ± 0,31 mV. Im Vergleichszeitfenster (20-30 min nach LTP-Induktion) erhöhten

sich die Werte sehr signifikant auf einen mittleren EPSP-Wert von 6,74 ± 0,75 mV bzw. auf

166,9 ± 10,05 % der Baseline (p = 0,0039, n = 9).

-5 0

3

6

9

1 2

1 5

0 1 0 2 0 3 0

Z e i t [ m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

I n d u k t io na b

c

-5 0

0

2

4

6

8

1 0

0

4 0

8 0

1 2 0

0 1 0 2 0 3 0

R s

In d u k tio n R m

Z e it [m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

Rs [M

] / R

m [-p

A]

B a s e lin e n a c h I n d u k t io n

0

2

4

6

8

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

* *

Abbildung 13: LTP-Kontrollreihe Wildtyp-Mäuse

a: Übersicht der gesamten Messreihe; b: Vergleich der mittleren EPSP-Amplituden vor LTP-Induktion und

20-30 min danach. Der Unterschied ist sehr signifikant (**); c: Beispiel eines Einzelexperiments

(20140116_s3c1), neben EPSP-Werten sind auch Membran- und Serienwiderstand (Rm, Rs) dargestellt.

36 3 Ergebnisse

3.1.2 Messreihe LTP bei transgenen Mäusen

Bei den CaMKII-AdoA1R-92-Mäusen des Stammes C57BL/6, die den A1R in der CA1-Region

überexprimieren, konnte eine mittlere EPSP-Amplitude der Baseline von 3,10 ± 0,16 mV

gemessen werden. Im Vergleichszeitfenster (20-30 min nach LTP-Induktion) erhöhten sich die

Werte hoch signifikant auf einen mittleren EPSP-Wert von 4,23 ± 0,33 mV bzw. auf 136,8 ±

8,46 % der Baseline (p = 0,001; n = 11). Verglichen mit der Kontrollgruppe zeigte sich eine

signifikante Verringerung der LTP (p = 0,0381).

-5 0

2

4

6

8

0 1 0 2 0 3 0

Z e i t [ m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

I n d u k t io na b

c

-5 0

0

2

4

6

8

1 0

0

4 0

8 0

1 2 0

0 1 0 2 0 3 0

R s

R m

Z e it [m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

Rs

[M

] / Rm

[-pA

]

In d u k tiond


0

1

2

3

4

5

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

* * *

K o n tr o lle T r a n s g e n

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

EP

SP

- A

mp

litu

de

in

% d

er

Ba

se

lin

e

*

Abbildung 14: LTP-Messreihe an CaMKII-AdoA1R-92-Mäusen


20-30 min danach. Der Unterschied ist hoch signifikant (***); c: Beispiel eines Einzelexperiments

(20140110_s1c1), neben EPSP-Werten sind auch Membran- und Serienwiderstand (Rm, Rs) dargestellt; d:

Vergleich prozentualer Veränderung der EPSP-Werte 20-30 min nach LTP-Induktion von transgener Gruppe

zu Kontrollgruppe in Bezug auf die Baseline. Der Unterschied ist signifikant (*).

37 3 Ergebnisse

3.2 Versuchsreihen mit Wistar-Ratten

3.2.1 Kontrollreihe LTP bei Wistar-Ratten

Als weitere Kontrollgruppe wurden Wistar-Ratten ohne Zugabe einer Substanz während der

Messungen verwendet. Die mittlere EPSP-Amplitude der Baseline betrug 3,83 ± 0,31 mV. Im

Vergleichszeitfenster (20-25 min nach LTP-Induktion) erhöhten sich die Werte signifikant auf

einen mittleren EPSP-Wert von 5,97 ± 0,39 mV bzw. auf 157,4 ± 5,89 % der Baseline

(p = 0,0313, n = 6).

-5 0

0

3

6

9

1 2

1 5

0 1 0 2 0 3 0

Z e i t [ m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

I n d u k t io n


0

2

4

6

8

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

*a b

c

-5 0

0

2

4

6

8

1 0

0

4 0

8 0

1 2 0

0 1 0 2 0 3 0

R s

R m

Z e it [m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

Rs

[M

] / Rm

[-pA

]

I n d u k tio n

Abbildung 15: LTP-Kontrollreihe Wistar-Ratten


20-25 min danach. Der Unterschied ist signifikant (*); c: Beispiel eines Einzelexperiments (20140211_s3c1),

neben EPSP-Werten sind auch Membran- und Serienwiderstand (Rm, Rs) dargestellt.

38 3 Ergebnisse

3.2.2 Messreihe mit cCPA

In dieser Messreihe wurde der selektive A1R-Agonist cCPA (2-chloro-N(6)-

cyclopentyladenosine) bereits 10 min vor LTP-Induktion in die Badlösung (200 nM)

eingebracht. Die mittlere EPSP-Amplitude der Baseline (5 min bis Induktion) betrug 3,21 ±

0,60 mV. Im Vergleichszeitfenster (20-25 min nach LTP-Induktion) sank der mittlere EPSP-

Wert signifikant auf 2,13 ± 0,51 mV bzw. auf 64,02 ± 4,41 % der Baseline (p = 0,0313, n = 6).

Verglichen mit der Wistar-Kontrollreihe verringerte sich die prozentuale EPSP-Amplitude nach

Induktion sehr signifikant (p = 0,0022).

-1 0 -5 0

0

2

4

6

0 1 0 2 0 3 0

Z e i t [ m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

I n d u k t io n

2 0 0 n m o l c C P Aa b

c d


0

1

2

3

4

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

*

K o n tr o lle c C P A

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

EP

SP

- A

mp

litu

de

in

% d

er

Ba

se

lin

e

* *

-1 0 -5 0

0

2

4

6

8

1 0

1 2

1 4

0

4 0

8 0

1 2 0

0 1 0 2 0 3 0

R s

R m

Z e it [m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

Rs

[M

] / Rm

[-pA

]

I n d u k tio n

2 0 0 n m o l cC P A

Abbildung 16: LTP-Messreihe mit cCPA an Wistar-Ratten

a: Übersicht der gesamten Messreihe. Jeweils cCPA-Einwasch 10 min vor Induktion; b: Vergleich der

mittleren EPSP-Amplituden 5 min vor LTP-Induktion und 20-25 min danach. Der Unterschied ist signifikant

(*); c: Beispiel eines Einzelexperiments (20140310_s3c1), neben EPSP-Werten sind auch Membran- und

Serienwiderstand (Rm, Rs) dargestellt; d: Vergleich prozentualer Veränderung der EPSP-Werte 20-25 min

nach LTP-Induktion von cCPA-Messreihe zu Kontrollgruppe in Bezug auf die Baseline. Der Unterschied ist

sehr signifikant (**).

39 3 Ergebnisse

3.2.3 Messreihe mit DPCPX und cCPA

In dieser Messreihe wurde der A1R-Antagonist DPCPX (200 nM) 15 min und zusätzlich cCPA

(200 nM) 10 min vor LTP-Induktion in die Badlösung zugegeben. Die mittlere EPSP-

Amplitude der Baseline (5 min vor Induktion) betrug 3,20 ± 0,25 mV. Im Vergleichszeitfenster

(20-25 min nach LTP-Induktion) sank der mittlere EPSP-Wert nicht signifikant auf 2,33 ±

0,46 mV bzw. auf 75,02 ± 13,97 % der Baseline (p = 0,0771, n = 12). Verglichen mit der

Wistar-Kontrollreihe verringerte sich die prozentuale EPSP-Amplitude nach Induktion sehr

signifikant (p = 0,0069).

-1 5 -1 0 -5 0

0

2

4

6

8

0 1 0 2 0 3 0

Z eit (m in )

EP

SP

-Am

pli

tud

e [

mV

]

I n d u k t io n

2 0 0 n M c C P A

2 0 0 n M D P C P X

B a s e lin e n a c h L T P -I n d u k t io n

0

1

2

3

4

EP

SP

-Am

pli

tud

e [

mV

]

n .s .

K o n tr o lle D P C P X + c C P A

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

EP

SP

- A

mp

litu

de

in

% d

er

Ba

se

lin

e

**

a b

dc

-1 5 -1 0 -5 0

0

2

4

6

8

1 0

0 1 0 2 0 3 0

0

4 0

8 0

1 2 0

R s

R m

Z e it [m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

Rs [M

] / R

m [-p

A]

I n d u k tio n

2 0 0 n M c C P A

2 0 0 n M D P C P X

Abbildung 17: LTP-Messreihe mit DPCPX und cCPA an Wistar-Ratten

a: Übersicht der gesamten Messreihe. Jeweils DPCPX- und cCPA-Einwasch 15 bzw. 10 min vor Induktion;

b: Vergleich der mittleren EPSP-Amplituden 5 min vor LTP-Induktion und 20-25 min danach. Der

Unterschied ist nicht signifikant (n.s.); c: Beispiel eines Einzelexperiments (20140127_s3c1), neben EPSP-

Werten sind auch Membran- und Serienwiderstand (Rm, Rs) dargestellt; d: Vergleich prozentualer

Veränderung der EPSP-Werte 20-25 min nach LTP-Induktion von transgener Gruppe zu Kontrollgruppe in

Bezug auf die Baseline. Der Unterschied ist sehr signifikant (**).

40 3 Ergebnisse

3.2.4 Messreihe mit NEM und cCPA

In dieser Messreihe wurde NEM (250 µM) 15 min und zusätzlich cCPA (200 nM) 10 min vor

LTP-Induktion in die Badlösung zugegeben. Die mittlere EPSP-Amplitude der Baseline (5 min

vor Induktion) betrug 4,80 ± 0,38 mV. Im Vergleichszeitfenster (20-25 min nach LTP-

Induktion) sank der mittlere EPSP-Wert nicht signifikant auf 1,49 ± 0,62 mV bzw. auf 30,02 ±

10,39 % der Baseline (p = 0,0625, n = 5). Verglichen mit der Wistar-Kontrollreihe verringerte

sich die prozentuale EPSP-Amplitude nach Induktion sehr signifikant (p = 0,0043).

-1 5 -1 0 -5 0

0

2

4

6

8

1 0

0 1 0 2 0 3 0

Z eit [m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

I n d u k t io n

2 0 0 n M c C P A

2 5 0 µ M N E M

K o n tr o lle N E M + c C P A

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

EP

SP

- A

mp

litu

de

in

% d

er

Ba

se

lin

e * *

B a s e lin e n a c h L T P -I n d u k t io n

0

2

4

6

8

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

n .s .

a b

dc

-1 5 -1 0 -5 0

0

2

4

6

8

1 0

0

4 0

8 0

1 2 0

0 1 0 2 0 3 0

R s

R m

Z e it [m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

Rs [M

] / R

m [-p

A]

In d u k tion

2 0 0 n M cC P A

2 50 µ M N E M

Abbildung 18: LTP-Messreihe mit NEM und cCPA an Wistar-Ratten

a: Übersicht der gesamten Messreihe. Jeweils NEM- und cCPA-Zugabe 15 bzw. 10 min vor Induktion; b:

Vergleich der mittleren EPSP-Amplituden 5 min vor LTP-Induktion und 20-25 min danach. Der Unterschied

ist nicht signifikant (n.s.); c: Beispiel eines Einzelexperiments (20140227_s3c1), neben EPSP-Werten sind

auch Membran- und Serienwiderstand (Rm, Rs) dargestellt; d: Vergleich prozentualer Veränderung der EPSP-

Werte 20-25 min nach LTP-Induktion von NEM/cCPA-Messreihe zu Kontrollgruppe in Bezug auf die

Baseline. Der Unterschied ist sehr signifikant (**).

41 3 Ergebnisse

3.2.5 Messreihe mit CGS

In dieser Messreihe wurde der A2A-Rezeptoragonist CGS-21680 (200 nM) 10 min vor LTP-

Induktion in die Badlösung zugegeben. Die mittlere EPSP-Amplitude der Baseline (5 min vor

Induktion) betrug 3,62 ± 0,32 mV. Im Vergleichszeitfenster (20-25 min nach LTP-Induktion)

sank der mittlere EPSP-Wert nicht signifikant auf 2,38 ± 0,71 mV bzw. auf 72,36 ± 23,01 %

der Baseline (p = 0,3215, n = 6). Verglichen mit der Wistar-Kontrollreihe verringerte sich die

prozentuale EPSP-Amplitude nach Induktion sehr signifikant (p = 0,0087).

-1 0 -5 0

0

2

4

6

8

0 1 0 2 0 3 0

Z e i t [ m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

I n d u k t io n

2 0 0 n m o l C G S


0

1

2

3

4

5

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

n .s .

K o n tr o lle C G S

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

EP

SP

- A

mp

litu

de

in

% d

er

Ba

se

lin

e **

a b

c d

-1 0 -5 0

0

2

4

6

8

1 0

0

4 0

8 0

1 2 0

0 1 0 2 0 3 0

R s

R m

Z e it [m in ]

EP

SP

- A

mp

litu

de

[m

V]

Rs [M

] / R

m [-p

A]

2 0 0 n m o l C G S

In d u k tion

Abbildung 19: LTP-Messreihe mit CGS an Wistar-Ratten

a: Übersicht der gesamten Messreihe. Jeweils CGS-Einwasch 10 min vor Induktion; b: Vergleich der mittleren

EPSP-Amplituden 5 min vor LTP-Induktion und 20-25 min danach. Der Unterschied ist nicht signifikant (n.s.);

c: Beispiel eines Einzelexperiments (20140304_s2c1), neben EPSP-Werten sind auch Membran- und

Serienwiderstand (Rm, Rs) dargestellt; d: Vergleich prozentualer Veränderung der EPSP-Werte 20-25 min

nach LTP-Induktion von CGS-Messreihe zu Kontrollgruppe in Bezug auf die Baseline. Der Unterschied ist

sehr signifikant (**).

42 3 Ergebnisse

3.2.6 NEM-Zugabe ohne LTP-Induktion

Eine Messreihe ohne Stimulationsprotokoll lässt erkennen, dass intrazellulär abgeleitete EPSP-

Amplituden innerhalb von wenigen Minuten nach Zugabe von 250 µM NEM so stark ansteigen

(n = 4), dass hierbei die Schwelle zum Auslösen von Aktionspotenzialen überschritten wurde.

0 5 1 0 1 5 2 0

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

Z eit (m in )

EP

SP

-Am

pli

tud

e [

mV

]

2 5 0 µ M N E M

Abbildung 20: EPSP-Verlauf bei NEM-Zugabe ohne Stimulationsprotokoll

a: Gesamter Verlauf der EPSP-Amplituden. Die Punkte entsprechen jeweils drei gemittelten aufeinander

folgenden EPSP-Werten. 250 µM NEM wurden nach 5 min Baseline zugegeben (n = 4).

3.3 Übersicht

3.3.1 LTP-Versuchsreihe mit Mäusen

Sowohl bei der Kontrollgruppe der Wildtyp-Mäuse als auch bei den transgenen CaMKII-

AdoA1R-92-Mäusen erzeugte das LTP-Stimulationsprotokoll nach 20-30 min eine sehr bzw.

hoch signifikante Erhöhung der EPSP-Werte in Bezug auf die Baseline, in Tabelle 2

einzusehen.

EPSP-Amplitude 20-30 min nach LTP-Induktion in % der Baseline

Wildtyp-Kontrolle 166,9 ± 10,05 % (**, p = 0,0039, n = 9)

CaMKII-AdoA1R-92 136,8 ± 8,46 % (***, p = 0,001; n = 11)

Tabelle 2: Veränderungen der EPSP-Amplituden nach LTP-Induktion in % der Baseline bei Mäusen

**: sehr signifikanter Unterschied; ***: hoch signifikanter Unterschied.

43 3 Ergebnisse

Verglichen mit der Kontrollgruppe zeigte sich eine signifikante Verringerung der LTP bei den

transgenen Tieren (p = 0,0381). Abbildung 14d in Kapitel 3.1.2 verdeutlicht dies grafisch.

3.3.2 LTP-Versuchsreihe mit Wistar-Ratten

In der Wistar-Kontrollgruppe konnte eine LTP mit signifikantem Unterschied der EPSP-Werte

20-25 min nach LTP-Induktion in Bezug auf die Baseline erreicht werden.

Trotz LTP-Stimulationsprotokoll verringerte sich die EPSP-Amplitude signifikant bei

Messungen mit cCPA. In den Messreihen mit DPCPX + cCPA, NEM + cCPA sowie CGS

konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden, obwohl sich tendenziell

Verringerungen der EPSP-Amplituden abzeichneten. Tabelle 3 gibt dazu eine Übersicht.

EPSP-Amplitude 20-25 min nach LTP-Induktion in % der Baseline

Wistar-Kontrolle 157,4 ± 5,89 % (*, p = 0,0313, n = 6)

cCPA 64,02 ± 4,41 % (*, p = 0,0313, n = 6)

DPCPX + cCPA 75,02 ± 13,97 % (n.s., p = 0,0771, n = 12)

NEM + cCPA 30,02 ± 10,39 % (n.s., p = 0,0625, n = 5)

CGS 72,36 ± 23,01 % (n.s., p = 0,3215, n = 6)

Tabelle 3: Veränderungen der EPSP-Amplituden nach LTP-Induktion in % der Baseline bei Ratten

Unterschiede: n.s.: nicht signifikant; *: signifikant

Im paarweisen Vergleich der normalisierten EPSP-Amplituden nach Induktion mittels Mann-

Whitney-U-Test unterscheiden sich die Messreihen mit cCPA (p = 0,0022), DPCPX + cCPA

(p = 0,0069), NEM + cCPA (p = 0,0043) und CGS (p = 0,0087) jeweils sehr signifikant von

der Kontrollgruppe.

Im Vergleich der drei Messreihen mit cCPA, DPCPX + cCPA und NEM + cCPA im

Zeitintervall 20-25 min nach Induktion untereinander ergibt sich mit dem Kruskal-Wallis-Test

und Dunns multiplem Vergleichstest kein signifikanter Unterschied (p = 0,0819).

Die folgende Abbildung 22 veranschaulicht diese Ergebnisse.

44 3 Ergebnisse

Wis

tar K

on

troll

e

cCP

A

DP

CP

X +

cC

PA

NE

M +

cC

PA

CG

S

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

% d

er

Ba

se

lin

e

** **** **

n .s .

n .s . n .s .

Abbildung 21: Vergleich aller LTP-Messreihen mit der Kontrollgruppe in % der Baseline

Auf Signifikanz wurde im jeweiligen Vergleich mit der Kontrolle mittels Mann-Whitney-U-Test geprüft. Im

Vergleich der Messreihen cCPA, DPCPX + cCPA und NEM + cCPA untereinander mittels Kruskal-Wallis-

Test mit Dunns multiplem Vergleichstest wurde kein signifikanter Unterschied ermittelt.

Unterschiede: n.s.: nicht signifikant; **: sehr signifikant

45 4 Diskussion

4 Diskussion

4.1 Patch-Clamp-Technik an Hirnschnitten

Entgegen vieler Vorteile der Patch-Clamp-Technik, wie z.B. intrazelluläre physiologische

Messungen an einzelnen Zellen in vitro durchführen zu können, resultieren einige Störfaktoren

aus dem komplexen und sensiblen methodischen Vorgehen.

Trotz vorsichtiger Präparation des Gehirns und der Anfertigung der Hirnschnitte werden

Neurone zwangsläufig einem unnatürlichen, mechanischen und hypoxischen Stress ausgesetzt,

der die weiteren Experimente verfälschen kann (Hershkowitz et al. 1993; Kirov et al. 1999;

Taubenfeld et al. 2002). Dadurch kann sich u.a. der Adenosinspiegel unkalkulierbar im

Schnittgewebe erhöhen, worauf Neurone in Inkubation jedoch mit rascher Regeneration und

beschleunigter Desensibilisierung der A1R antworten (Winn et al. 1981; Fowler; Fowler 1993;

Frenguelli et al. 2003; Zur Nedden et al. 2011). Auch wenn durch die Isolation des

Hippocampusschnitts afferente (und efferente) synaptische Verbindungen zu außerhalb gelegen

Hirnregionen gekappt werden, verbleiben die zu untersuchenden Zellen in ihrem engeren

physiologischem Zellverband.

Obgleich in der Whole-cell-Konfiguration bestmögliche physiologische Lösungs-

zusammensetzungen in Pipetten verwendet wurden, konnten Elektrolytverschiebungen

schlussendlich nicht vermieden werden. Dasselbe gilt für aCSF als osmotisch wirksame

Nährlösung. Zusätzlich zu einer optischen Vorauswahl unter dem Mikroskop unterstützt die

Messung von Serienwiderstand und Ruhemembranpotenzial die Kontrolle der Zellqualität.

Weitere mögliche Störfaktoren sind Erschütterungen des Messplatzes, fehlerhafte Erdung

leitender Oberflächen, elektrische Ströme durch benachbarte Geräte, Verschleißerscheinungen

der Silberdrahtelektrode in Mess- und Stimulationspipette, unterschiedliche Wanddicke und

Öffnungswiderstand der Pipetten, die allesamt konstante Messergebnisse manipulieren können.

Nagetiere wie Mäuse und Ratten sind nur eingeschränkt als Modell der vorliegenden

Experimente auf den Menschen übertragbar, da die genetische Ähnlichkeit der

Adenosinrezeptor-Subtypen zwar stark, dennoch nicht identisch ist (Fredholm et al. 2000).

46 4 Diskussion

4.2 LTP-Kontrollreihen an Mäusen und Ratten

Als Referenz für die Versuche mit transgenen Mäusen und Stoffzugaben bei Ratten in den

beiden Kontrollgruppen, konnte jeweils eine – im Vergleich zu anderen Experimentalserien der

Arbeitsgruppe – schwach ausgeprägte, dennoch stabile und langanhaltende LTP gemessen

werden. So unterschied sich die LTP der Wildtyp-Mäuse des Stammes C57BL/6 mit 166,9 ±

10,05 % sehr signifikant von der Baseline. Bei der Kontrollgruppe der Wistar-Ratten erhöhte

sich die Baseline signifikant auf eine LTP mit 157,4 ± 5,89 %.

Bisher wurde mit einem identischen Theta-Burst-Stimulationsprotokoll (siehe Kapitel 2.7) in

derselben Arbeitsgruppe assoziative LTP an Wistar-Ratten in Höhe von 279,5 ± 22,2 % (Wolff

2007), 168.9 ± 3.22 % (Holderbach 2006), 214,7 ± 34,18 % (Seifert 2009) induziert. In einer

anderen, am selben Messstand stattfindenden Arbeit lieferte die Wistar-Kontrollreihe eine

vergleichbar geringer ausfallende Erhöhung der LTP auf 179 % (Ehrenberger, noch nicht

veröffentlicht). Ein reduziertes Stimulationsprotokoll mit nur 25 Reizpaaren lieferte dennoch

eine LTP von 182,10 ± 22,79 % (Dratz 2013).

An Mäusen des Stammes C57BL/6 wurden höhere LTP-Niveaus von 234,1 ± 51,44 %

(Landmann 2015) und 225,6 ± 31,22 % (Stolz 2015) gemessen.

Eine Ursache der relativ niedrig gemessenen LTP in den Kontrollreihen von Mäusen und Ratten

könnte an der gemeinsamen Nutzung des Schlauchsystems liegen, über das die Testsubstanzen

zugeführt wurden. Diesem Problem wurde durch regelmäßige Spülungen mit destilliertem

Wasser nach jedem Arbeitstag entgegengewirkt. Eventuell hätte die ca. 5-minütige Spülung

zwischen den einzelnen Messungen verlängert werden müssen, insbesondere wenn vorher mit

cCPA gemessen wurde.

Die in Kapitel 4.1 beschriebenen, sehr fehleranfälligen Versuchsbedingungen müssen ebenso

als mögliche Erklärung für die schwach ausgeprägten LTP-Messungen in Betracht gezogen

werden.

Des Weiteren sollte beachtet werden, dass in den vorliegenden Experimenten bei Mäusen ein

Zeitintervall von 20-30 min nach Induktion mit der Baseline verglichen wurde; bei Wistar-

Ratten das Intervall von 20-25 min nach Induktion – der besseren Vergleichbarkeit geschuldet,

da ein Teil der Messreihen mit Substanzen nicht über 25 min hinaus gemessen wurde.

47 4 Diskussion

Gegenüber einem Deckeneffekt bei einer sehr hohen LTP erweist sich eine niedrigere LTP

vorteilig, sofern LTP-verstärkende Substanzen verwendet werden.

Zusammenfassend stellen die signifikanten Erhöhungen im Vergleich zur Baseline dennoch

langanhaltende und stabile LTP-Messungen dar, sodass diese als Referenz für die weiteren

Experimente herangezogen werden können.

4.3 LTP-Modulation durch A1R-Überexprimierung

Aus dem signifikanten Unterschied der LTP von 166,9 ± 10,05 % in der WT-Kontrolle zu 136,8

± 8,46 % in der transgenen A1R -Maus kann man schließen, dass endogenes Adenosin über den

postsynaptischen A1R an der CA3/CA1-Synapse des Hippocampus der Maus assoziative LTP

abschwächt.

Dieses Ergebnis bestärkt grundsätzlich die Ergebnisse anderer Arbeiten, welche eine

verminderte LTP mit der Aktivierung des A1R in Zusammenhang bringen, auch wenn andere

Versuchsbedingungen, beispielsweise Rezeptoragonisten oder -antagonisten, nicht-assoziative

Stimulationsprotokolle, extrazelluläre Ableitungen, andere Spezies unterschiedlichen Alters

oder andere Lokalisationen angewandt wurden (Larson et al. 1993; Mendonça und Ribeiro

1994; Forghani und Krnjevic 1995; Abraham und Huggett 1997; Rex et al. 2005).

Die in Kapitel 4.4 diskutierten Messergebnisse mit cCPA bestätigen zusätzlich die Wirkung des

A1R auf die LTP.

Mit einer A1R-Überexprimierung in der CA3-Region, vereinzelt auch in der CA1-Region,

konnte Stolz (2015) mit einem vergleichbaren Versuchsaufbau eine Reduktion der LTP auf

46,61 ± 11,70 % (p = 0,125; n = 5) in Bezug auf die Baseline messen – eine hoch signifikante

Absenkung zu dessen LTP-Kontrollreihe (p = 0,0043).

Betrachtet man die Wirkung der erhöhten Expression von prä- (CA3) und postsynaptischen

(CA1) A1R auf die LTP bei Mäusen, scheint Adenosin stärker an der Präsynapse zu wirken,

wenngleich der quantitative Vergleich von zwei unterschiedlichen Arbeiten als kritisch zu

bewerten ist.

Ob der hemmende Einfluss von Adenosin über A1R auf die präsynaptische

Transmitterfreisetzung mittels Blockierung von Ca2+-Kanälen größer ist als auf die

postsynaptische Hemmung von NMDA- und AMPA-Rezeptoren, bleibt weiterhin offen. Einige

Arbeiten haben die präsynaptische Hemmung via A1R bereits hervorgehoben (Dunwiddie und

48 4 Diskussion

Haas 1985; Wu und Saggau 1994). Der Mechanismus, über den A1R Ca2+-Kanäle hemmen,

bleibt weiterhin unklar, wobei im Nucleus accumbens G-Proteine daran beteiligt zu sein

scheinen (Chieng und Bekkers 2001). Gundlfinger et al. (2007) führten diesen präsynaptischen

molekularen Mechanismus an der Moosfaser/CA3-Synapse auf eine Hemmung

spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle zurück.

Womöglich besteht ein Unterschied prä- oder postsynaptischer Hemmung aber auch aufgrund

einer alternierenden Expression des A1R oder aufgrund divergierender endogener

Adenosinkonzentrationen innnerhalb der Hippocampusregionen (Zur Nedden et al. 2011; Trieu

et al. 2015).

Grundsätzlich muss dennoch davon ausgegangen werden, dass die Aktivierung des A1R sowohl

prä- als auch postsynaptisch (CA3/CA1) zu einer effektiven Hemmung der assoziativen LTP

führt.

4.4 LTP-Modulation durch cCPA

In der Messreihe mit dem selektiven A1R-Agonist cCPA (200 nM) wurde eine signifikante

LTP-Reduktion auf 64,02 ± 4,41 % der Baseline 20-25 min nach LTP-Induktion gemessen. Es

besteht ein sehr signifikanter Unterschied zur LTP der Wistar-Kontrollgruppe.

In der vorliegenden Messreihe wurde cCPA (200 nM) bereits 10 min vor LTP-Induktion in die

Badlösung eingebracht, wobei nach den ersten 5 min die Baseline korrigiert wurde.

Aus einer von Julia Knoll durchgeführten Messreihe (noch nicht veröffentlicht) ohne

Stimulationsprotokoll geht hervor, dass intrazellulär abgeleitete EPSP-Amplituden ca. 5 min

nach Zugabe von 200 nM cCPA stetig abfallen. Abbildung 22 veraunschaulicht dies.

49 4 Diskussion

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

2

4

6

8

1 0

Z eit (m in )

EP

SP

-Am

pli

tud

e [

mV

]2 0 0 n M c C P A

Abbildung 22: EPSP-Verlauf bei cCPA-Zugabe ohne Stimulationsprotokoll

200 nM cCPA wurden nach 5 min Baseline zugegeben. Die Punkte entsprechen jeweils drei gemittelten EPSP-

Werten; Modifiziert nach Daten von Julia Knoll (noch nicht veröffentlicht).

Aus diesem Zeitverlauf wird ersichtlich, dass der stark hemmende cCPA-Effekt auf die basale

synaptische Transmission durch die zeitversetzte Baseline-Korrektur nur bedingt aufgehoben

wurde. Mindestens weitere 5 min cCPA-Zugabe wären vor Baseline-Beginn notwendig

gewesen, um eine fortschreitende Absenkung der basalen Transmission während der LTP-

Messung sicherer auszuschließen.

Grundsätzlich ist anerkannt, dass CPA via A1R einen hemmenden Einfluss auf die basale

synaptische Übertragung besitzt, wie in extrazellulären Ableitungen (fEPSP) an CA3/CA1-

Synapsen (Sebastião et al. 2000; Rebola et al. 2003), aber auch an Moosfaser/CA3-Synapsen

gemessen werden konnte (Gundlfinger et al. 2007). Ähnliche Ergebnisse lieferten Experimente

mit kultivierten Hippocampus-Zellen in der Whole-cell-Ableitung (Scholz und Miller 1996).

Obwohl bekannt ist, dass exogen zugeführtes Adenosin LTP reduziert (Rex et al. 2005), gibt es

jedoch kaum vergleichbare LTP-Messungen mit cCPA.

Sehr ähnliche LTP-Messungen an Mäusen, wie die von Landmann (2015), lieferten allerdings

vergleichbare Werte mit einer Absenkung auf 50,78 ± 9,73 % der Baseline. Hier wurde cCPA

erst 5 min vor Induktion in die Badlösung eingewaschen, weshalb anzunehmen ist, dass die

Absenkung dadurch vergrößert wurde und dass sich die Messwerte deshalb unter das

Ausgangsniveau absenkten.

Die verwendete cCPA-Konzentration von 200 nM ist in Relation zum Gebrauch in anderen

Arbeiten sehr hoch. Rebola et al. (2003) stellten beispielsweise fest, dass höhere CPA-

50 4 Diskussion

Konzentrationen als 100 nM keine größere Suppression der fEPSP hervorrufen. Dies könnte

erklären, weshalb EPSP-Werte nach LTP-Induktion sehr stark unter das Baseline-Level

abfallen. Zusammenfassend kann davon ausgegangen werden, dass die Aktivierung von A1R

eine assoziative LTP verhindert und sogar eine ausgeprägte Umkehrung hervorrufen kann.

4.5 LTP-Modulation durch DPCPX + cCPA

In dieser Messreihe mit Einwasch des A1R-Antagonist DPCPX (200 nM) 15 min und zusätzlich

cCPA (200 nM) 10 min vor LTP-Induktion sank der mittlere EPSP-Wert nicht signifikant auf

75,02 ± 13,97 % der Baseline. Der Unterschied zu der Wistar-Kontrollreihe ist sehr signifikant

(p = 0,0069).

Damit konnte gezeigt werden, dass eine LTP ausbleibt, wenn die Wirkung des A1R-

Antagonisten DPCPX durch den zeitversetzt applizierten A1R-Agonisten cCPA aufgehoben

wird. Im Vergleich zu der Messreihe mit ausschließlich cCPA zeigt sich im Kruskal-Wallis-

Test kein signifikanter Unterschied.

Man kann davon ausgehen, dass DPCPX die tonische A1R-vermittelte Adenosin-Wirkung auf

die LTP demaskiert, bzw. eine LTP dadurch erhalten bleibt (Forghani und Krnjevic 1995;

Rebola et al. 2003; Rex et al. 2005; Stolz 2015). Messungen ohne LTP-Stimulation lieferten

dosisabhängige Resultate für die Veränderung der basalen synaptischen Transmission. In einer

Studie von Caruana et al. (2012) führte die Applikation von 10 nM DPCPX bei CA3- und CA1-

Pyramidenzellen zu keiner, bei CA2-Neuronen hingegen zu einer starken Erhöhung der fEPSP.

Erst höhere Konzentrationen von 50 nM (Forghani und Krnjevic 1995; Rebola et al. 2003) und

500 nM DPCPX (Rex et al. 2005; Trieu et al. 2015) schienen fEPSP-Werte an der CA3/CA1-

Synapse zu erhöhen. Derselbe Effekt konnte an der Moosfaser/CA3-Synapse beobachtet

werden (Gundlfinger et al. 2007).

In der vorliegenden Messreihe erfolgt der Einwasch von DPCPX 15 min vor LTP-Induktion

daher womöglich zu spät, um eine Verstärkung der basalen Übertragung während der Messung

komplett auszuschließen.

Wie im vorigen Kapitel bereits erläutert, wirkt cCPA entgegensetzt zu DPCPX hemmend auf

die basale Übertragungsstärke.

Der Einwasch von cCPA in Kombination mit DPCPX invertierte die LTP beinahe ebenso stark

wie der alleinige cCPA-Einwasch. Aufgrund ähnlich hoher Bindungsaffinitäten beider

51 4 Diskussion

Liganden, aber wesentlich höheren Selektivität von cCPA für den A1R ist denkbar, dass cCPA

mit einem Ki-Wert von 0,4 nM (0,2-0,7 nM) in der Lage ist, DPCPX (Ki-Wert: 0,3 nM;

0,49 ± 0,06 nM) innerhalb von Minuten an den Rezeptorbindungsstellen zumindest teilweise

zu verdrängen (Lohse et al. 1988; Suzuki et al. 1992). Bindungsaffinität und Selektivität

genannter A1R-Liganden bei Ratten sind beim Menschen geringer ausgeprägt und daher nicht

übertragbar (Wilson und Mustafa 2009).

Eine Arbeit konnte zeigen, dass DPCPX mit 1 µM imstande ist, den hemmenden Effekt von

CPA mit 100 nM auf eine EPSP-Messung in der Substantia nigra von Ratten komplett

aufzuheben (Shen und Johnson 1997). In anderen Experimenten zeigte sich, dass DPCPX die

Wirkung von CPA bei Konzentrationen von 50 nM vs. 30 nM bzw. 200 nM vs. 1 µM bei

gealterten Ratten blockieren konnte (Sebastião et al. 2000; Rebola et al. 2003). Berücksichtigt

man die höhere Affinität von cCPA für den A1R im Verlgeich zu CPA, ist die ohnehin schwach

ausgeprägte Fähigkeit von DPCPX, CPA zu verdrängen, in den vorliegenden Experimenten mit

cCPA noch verminderter zu erwarten (Fredholm et al. 2001a).

Es bleibt festzuhalten, dass cCPA in der vorliegenden Konzentration einen stark hemmenden

Einfluss auf die LTP besitzt, der durch vorherige Applikation von DPCPX in wahrscheinlich

zu geringer Konzentration bzw. mit schwächerer Bindungsaffinität/Selektivität nicht

aufzuheben ist. Dies verdeutlicht dennoch die Abhängigkeit der assoziativen LTP von der A1R-

Aktivität.

4.6 LTP-Modulation durch NEM + cCPA

Während des Einwaschs von N-Ethylmaleimide (NEM) und dem Einstellen der Baseline wurde

ein Anstieg der EPSP-Amplituden verzeichnet, der in gesonderten Experimenten ohne LTP-

Stimulation veranschaulicht wurde (vgl. Kapitel 3.2.7). Innerhalb weniger Minuten konnten

massiv verstärkte EPSP-Amplituden an der CA3/CA1-Synapse beobachtet werden. Eine

vergleichbare Erhöhung mit Peak nach ca. 10 min der fEPSP bei extrazellulär beigemengtem

NEM (200 µM) konnte an der Moosfaser/CA3-Synapse nachgewiesen werden (Moore et al.

2003).

In einer LTP-Messreihe mit Zugabe von NEM (15 min vor LTP-Induktion) und cCPA (10 min

vor LTP-Induktion) wurde die Baseline-Messung bei stabilen EPSP-Werten erst 5 min vor

LTP-Induktion begonnen.

52 4 Diskussion

Statt einer LTP-Erniedrigung mit cCPA alleine auf 64,02 ± 4,41 % der Baseline, wurde ein

noch geringerer LTP-Verlauf von 30,02 ± 10,39 % mit NEM und cCPA gemessen. Allerdings

ist der Unterschied beider Messreihen im Kruskal-Wallis-Test mit Dunn’s multiplem

Vergleichstest nicht signifikant.

Hieraus wird ersichtlich, dass NEM nicht in der Lage ist, den hemmenden Effekt des durch

cCPA agonisierten A1R nach LTP-Stimulation aufzuheben. Womöglich hemmt NEM die LTP

ebenso und führt dadurch zu einem tendenziellen Summeneffekt mit cCPA.

NEM ist imstande, den A1R von dem zugehörigen Gi/o-Protein zu entkoppeln, sodass dessen

vorranging präsynaptische tonische Hemmung der Transmitterfreisetzung durch endogenes

Adenosin aufgehoben wird (Nakajima 1990; Shapiro 1994; Jeong 2002). Unsicher bleibt, ob

NEM über den SNARE-Komplex (siehe unten) auch die astrozytäre Exozytose von

ATP/Adenosin hemmen kann, um damit eine zusätzliche Enthemmung durch Abschwächung

des A1R-Effekts herbeizuführen, sofern sich dieser überhaupt entfalten kann (Pascual 2005;

Florian et al. 2011; Fujita et al. 2014).

Damit ließe sich die erwähnte EPSP-Erhöhung der Messreihe mit NEM ohne LTP-Stimulation

bereits erklären – ungeachtet der Eigenschaften von NEM, die im Folgenden noch erläutert

werden.

Eine kleine LTP-Messreihe mit NEM alleine, die hier nicht zur Darstellung kommt, zeigte

allerdings einen Trend hin zu einer starken LTD anstelle einer LTP – ähnlich den Messungen

mit NEM + cCPA.

Die Arbeit von Lledo (1998) zeigte, dass eine postsynaptische Applikation von lediglich 5 nM

NEM in CA1-Neuronen bereits zu einer signifikanten Reduktion der LTP führte. In zeitlich

folgenden Untersuchungen wurde zudem eine Reduktion der basalen Transmission durch NEM

und NEM-ähnlichen Peptiden aufgezeigt, die ebenso postsynaptisch appliziert wurden

(Nishimune et al. 1998; Lüscher et al. 1999).

Neben der G-Protein-Entkopplung bewirkt NEM auch die potente Hemmung des NEM-

sensitiven Faktors (NSF), einer zytosolischen ATPase, die mit einigen

Membranfusionsproteinen (SNARE-Proteine) interagiert (Glick und Rothman 1987; Hanson et

al. 1997). Damit vermittelt NSF vor allem Recycling und Endozytose der GluR2-enthaltenden

AMPA-R in der postsynaptische Membran (Noel et al. 1999; Jurado et al. 2013). Unterstützt

wird die NSF/GluR2-Interaktion durch die Exprimierung von PKMζ, welche für die

53 4 Diskussion

Aufrechterhaltung der late-LTP verantwortlich ist (Yao et al. 2008). Kontrovers diskutierte

Forschungsergebnisse kommen zu dem Schluss, dass GluR1-enthaltende AMPA-R aus

endosomalen Reservepools einem perisynaptischen Austausch unterworfen sind und zu einem

Großteil der LTP-Aufrechterhaltung dienen, wohingegen die GluR2-Domäne direkt

Endozytose aus der PSD vermittelt (Passafaro et al. 2001; Beretta et al. 2005; Yang et al. 2008).

Über passive laterale Membranbewegung wandern AMPA-R bei LTP-Induktion in den Bereich

der PSD und führen zu einer stärkeren Exzitabilität der Postsynapse (Borgdorff und Choquet

2002; Yudowski et al. 2007; Makino und Malinow 2009; Kneussel und Hausrat 2016).

Da early-LTP auf Reservepools von AMPA-R angewiesen ist, könnte NEM über Blockade

endosomaler Pools von GluR2-AMPA-R zu einer zeitversetzten LTP-Abschwächung führen,

solange noch extrasynaptische Pools von GluR1-AMPA-R verfügbar sind (Granger et al. 2012).

Dies könnte darauf hindeuten, dass die starke Erhöhung der basalen Transmission auf eine frühe

Entkopplung des A1R von dem zugehörigen Gi-Protein durch NEM zurückgeführt werden

könnte. Womöglich spielt die Wirkung von NEM auf NSF hierbei eine geringere Rolle, da NSF

vorwiegend in der PSD exprimiert wird und somit die Aufhebung der basalen A1R-bedingten

Hemmung der Transmitterfreisetzung mehr Gewicht erfahren könnte (Walsh und Kuruc 1992).

Es bleibt offen, inwieweit die Agonisierung des A1R durch die hohe sättigende Konzentration

von cCPA an der Verminderung der LTP mittels möglicher Restaktivität beteiligt ist, oder ob

diese Agonisierung infolge einer kompletten G-Protein-Entkopplung des A1R konkomitant ist.

Aufgrund eines offentsichtlich raschen Wirkungseintritts innerhalb weniger Minuten scheint

das lipophile NEM problemlos über Zellmembranen an dessen spezifische zytoplasmatische

Wirkorte zu gelangen. Ob eine sich über den Zeitverlauf verändernde Wirkung von NEM

existiert, müsste in weiteren Experimenten nachgewiesen werden. Um die Funktionsweise der

cCPA-Hemmung noch besser verstehen zu können, müssten Vergleichsmessungen mit NEM

alleine über einen Zeitverlauf über 20 min hinaus, sowie eine aussagekräftige LTP-Messreihe

mit NEM alleine durchgeführt werden. Die breite Wirkung und extrazelluläre Gabe von NEM

erschweren allerdings spezifische Interpretationen.

54 4 Diskussion

4.7 LTP-Modulation durch CGS

Mit dem A2A-Rezeptoragonist CGS-21680 (200 nM), 10 min vor LTP-Induktion in die

Badlösung gegeben, reduzierte sich die mittlere EPSP-Amplitude nicht signifikant auf 72,36 ±

23,01 % der Baseline (p = 0,3215, n = 6). Der Unterschied zur Wistar-Kontrollreihe im

Paarvergleich ist sehr signifikant (p = 0,0087).

In verschiedenen Arbeiten verstärkten sich allerdings LTP-Messungen mit CGS (10-30 nM),

welches durch einmalige oder kontinuierliche Applikaton eingewaschen wurde (Mendonça und

Ribeiro 1994; Cunha und Ribeiro 2000; Almeida et al. 2003; Dias et al. 2012).

Da A2AR in der Lage sind, ENTs zu steuern und so zu einem extrazellulären

Konzentrationsabfall von Adenosin zu führen, wird die hemmende A1R-Wirkung zusätzlich

reduziert (Pinto-Duarte et al. 2005).

Es stellt sich jedoch die Frage, ob der Effekt von CGS auf die LTP konzentrationsabhängig ist.

Verschiedenen Untersuchungen zu zufolge erhöht sich die basale EPSP/AMPA-Amplitude

ohne LTP-Stimulation bei niedrigen Konzentrationen bis 30 nM; 100 nM CGS führten jedoch

zu keiner Erhöhung (Lopes et al. 2002; Dias et al. 2012). Dies geht einher mit Experimenten,

in denen Konzentrationen im Bereich von µM die fEPSP-Amplituden dosisabhängig

verkleinern (Lupica et al. 1990). Aufgrund der Affinitätseigenschaften ist CGS-21680 bei

Ratten hochselektiv für A2AR (Ki-Wert: 22 nM) und bindet erst im Bereich von µM an A1R,

dann auch als A1R-Agonist wirkend (Hutchison et al. 1989). CGS scheint erst bei sehr hohen

Konzentrationen den cAMP-Spiegel zu erhöhen, was zu der These führte, dass die Aktivierung

des A2AR bereits bei niedrigen Konzentrationen cAMP-unabhängig PKA und AMPA-R

(unabhängig von NMDA-R) aktiviert und so eine postsynaptische Verstärkung der

Transmission erreicht (Kessey und Mogul 1997; Dias et al. 2012). Entgegen dieser Annahme

zeigten Cunha und Ribeiro (2000), dass die Wirkung des A2AR wahrscheinlicher mit der PKC

als mit der PKA assoziiert ist. Gleichzeitig deaktiviert PKC den A1R und damit dessen tonische

Hemmung. In diesem Zusammenhang erfährt eine mögliche A1R/A2AR-Heterodimerisierung

eine besondere Bedeutung bei präsynaptischer Transmitterfreisetzung, wie sie im Stiatum

bereits beschrieben wurde (Ciruela et al. 2006). Demnach ist die Wirkung von CGS bei

niedrigen Konzentrationen auf die early-LTP über PKC plausibler, da die PKA vor allem in

late-LTP involviert ist.

55 4 Diskussion

Wie schon von Lopes et al. (2002) vermutet, gibt es vermehrt Hinweise dafür, dass die

Aktivierung des A2AR erst dann Wirkung zeigt, wenn zuvor ein Ligand an den A1R gebunden

hat (Hernández-González et al. 2014). Dies könnte unter anderem ein Grund dafür sein,

weswegen CGS beispielsweise bei geringer extrazellulärer Adenosinkonzentration oder als

alleinige Applikation in dieser Arbeit keine LTP begünstigte.

Vermutlich wird die postsynaptische Exzitabilität dadurch erhöht, dass A2AR über mGluR5 auf

die NMDA-R-Aktivität wirkt (Tebano et al. 2005; Mouro 2012; Kouvaros und

Papatheodoropoulos 2016). Dagegen schienen höhere Konzentrationen von CGS im Striatum

die Leitfähigkeit von NMDA-R herabzusetzen. Dies geschieht vermutlich ohne Beteiligung der

PKC oder PKA, sondern mithilfe des PLC/IP3/CaMKII-Signalwegs (Nörenberg et al. 1997;

Wirkner et al. 2000; Gerevich et al. 2002).

Ein ähnlicher Effekt könnte im Hippocampus auftreten, da eine wahrscheinliche Interaktion des

A2AR mit Gi/Go-Proteinen festgestellt wurde, wodurch eine Signalkaskade via PLC auch hier

erklärbar wäre (Cunha et al. 1999). Dies könnte für die vorliegende LTP-Messreihe mit CGS

ursächlich sein, die eher einer LTD gleichkommt.

Unklare Bindungseigenschaften bestehen außer den soeben genannten auch aufgrund der

Vermutung, dass CGS-21680 eine zweite hochaffine Bindungsstelle (G-Protein-gekoppelt)

neben A2AR im Hippocampus besitzen könnte (Cunha et al. 1999).

Da A1R erst bei wesentlich höheren Konzentrationen affin und A2BR/A3R nicht affin für CGS-

21680 sind, könnten noch unbekannte, zuvor diskutierte Signalkaskaden für die LTP-

hemmende Wirkung von 200 nM CGS vermutlich mitverantwortlich sein.

Eine konzentrationsabhängige Wirkung von CGS-21680 auf AC, PLC und den Effekt auf LTP

im Hippocampus bleibt weiter zu evaluieren.

Physiologisch betrachtet leuchtet ein, dass der A2AR die Wirkung des A1R abhängig von

endogener Adenosinkonzentration herabsetzen oder unterstützen kann, um damit LTP

feinmodulieren zu können.

56 4 Diskussion

4.8 Pathophysiologische Bedeutung

Evaluiert man adenosinerge Effekte auf die LTP, so bleibt festzuhalten, dass im Besonderen

die Exzitabilität unter Wirkung des A1R herabgesetzt wird. Diese Ergebnisse entsprechen

gemäß dem aktuellen Forschungsstand einer antidepressiven Wirkungsweise und stehen

bislang im Gegensatz zu der Neuroplastizitätstheorie der Depression.

Die LTP-hemmende Wirkung von aktivierten AR geht einher mit der slow-wave-activity

während Tiefschlafphasen (non-REM) bzw. langanhaltender Wachheit wie beispielsweise einer

Schlafentzugstherapie. Daraus lassen sich wichtige Funktionen wie Schlafinduktion, global

downscaling für anschließendes Konsolidieren neuer Gedächtnisinhalte, aber auch kognitive

Defizite ableiten (Diekelmann und Born 2010).

Mit Züchtung der auch in dieser Arbeit verwendeten A1R-überexprimierenden Maus (CaMKII-

AdoA1R-92-Linie) konnte Serchov et al. (2015) einen anxiolytischen und antidepressiven

Effekt, jedoch keine Auswirkungen auf Spontanaktivität, exploratives Verhalten, räumliches

Lernen und Gedächtnis nachweisen. Dies deckt sich mit Ergebnissen einer A1R-Knockout-

Maus, die umgekehrt verstärktes ängstliches Verhalten aufwies (Lang et al. 2003; Giménez‐

Llort et al. 2002; Giménez‐Llort et al. 2005). Zudem scheint ein Zusammenhang zwischen A1R-

und A2AR-Genpolymorphismen und der zerebralen Verfügbarkeit von A1R und damit einer

Anfälligkeit für Angststörungen bei menschlichen Individuen in vivo zu bestehen (Hohoff et al.

2014).

Es konnte außerdem gezeigt werden, dass sowohl erhöhte A1R-Aktivität, ausgelöst durch

besispielsweise Schlafentzug, als auch pharmakologische Behandlungen mit Imipramin oder

Ketamin in eine gemeinsame Endstrecke münden: die Hochregulierung des Proteins Homer1A

(Serchov et al. 2015). Vermutlich verhält es sich bei anderen antidepressiven Therapieformen

wie ECT, DBS und eventuell rTMS ähnlich, da diese wahrscheinlich ebenso mit einer erhöhten

A1R-Aktivität bzw. Adenosinkonzentration einhergehen (Gleiter et al. 1989; Bekar et al. 2008).

Ähnlich der Wirkung von CGS-21680 in dieser Arbeit, konnte auch Fontinha et al. (2009) mit

dem hochselektiven A2AR-Agonist SCH-58261 eine effektive Hemmung der LTP an

CA3/CA1-Synapsen aufzeigen. Gleichzeitig wurde anhand verschiedener

Verhaltensexperimente mit Ratten die entscheidende Bedeutung der A2AR-Modulation für

assoziatives Lernen bewiesen.

57 4 Diskussion

Klärungsbedarf besteht insbesondere bei Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen, die dem A2AR

vermutlich dessen feinmodulierende Rolle verleihen und welche interessante Angriffspunkte

für pharmakologische Eingriffe bei verschiedenen Pathologien bieten (Coelho et al. 2014). Ob

dabei die in dieser Arbeit vermutete dosisabhängige Wirkung des A2AR-Agonisten CGS-21680

eine Rolle spielt, bleibt weiter zu erfoschen. Wie aber bereits an dem Parkinson-Medikament

Istradefylline deutlich wurde, werden in Zukunft spezifische A2AR-Antagonisten aufgrund

neuroprotektiver Eigenschaften sicherlich eine gewichtigere Rolle spielen – ungeachtet des

schon gebräuchlichen, alltäglichen Koffeinkonsums.

58 5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Adenosin hält nicht nur die Homöostase der Schlaf-Wachphasen aufrecht, sondern spielt unter anderem

eine gewichtige Rolle bei der Hebb’schen Plastizität, welche für die Speicherung neuer

Gedächtnisinhalte verantwortlich ist. Verschiedene neuropsychiatrische Krankheiten wie Depression,

Angststörungen, M. Alzheimer oder M. Parkinson weisen eine Beeinflussung oder Störung des

adenosinergen Systems bzw. entsprechender Adenosinrezeptoren auf.

Die vorliegende Arbeit untersuchte, wie die Modulation der A1- und A2AR die assoziative LTP – als Teil

der synaptischen Langzeitplastizität – beeinflusst. An der CA3/CA1-Synapse des Hippocampus wurden

etablierte LTP-Stimulationsprotokolle mit TBS appliziert und EPSP-Veränderungen mittels Patch-

Clamp-Technik in der Wholecell-Konfiguration gemessen.

Durch Gabe des A1R-Agonisten cCPA in Hirnschnitten von Wistar-Ratten konnte keine LTP ausgelöst

werden.

Zudem bestätigte und präzisierte sich diese Blockade in anderen Experimenten. Demgemäß zeigte sich

bei Mäusen mit einer Überexprimierung des A1R-Gens im CA1-Bereich des Hippocampus, dass

postsynaptische A1R an der Suppression der LTP signifikant beteiligt sind. Aus Messreihen von Stolz

(2015) mit transgenen Mäusen derselben Ausprägung im CA3-Bereich ging bereits eine präsynaptische

Hemmung der LTP hervor.

Mithilfe weiterer Stoffbeimengungen konnte weder DPCPX (ein A1R-Antagonist), noch NEM (ein

GPCR-Entkoppler) die cCPA-Hemmung der LTP aufheben. Unterschiede der

Konzentrationsverhältnisse und Bindungseigenschaften sind hierfür in Erwägung zu ziehen, ebenso eine

direkte Wirkung von NEM auf AMPA-R.

Abgeschwächte LTP-Messungen mit dem A2AR-Agonisten CGS-21680 geben Hinweise auf noch

unbekannte bzw. potenzielle konzentrationsabhängige Wirkungsweisen. Hierbei könnten die ohnehin

unterschätzte Heterodimerisierung der A2AR/A1R und der dadurch stattfindende feinmodulierende

Crosstalk ausschlaggebend sein.

Auch wenn NEM und CGS-21680 über teils unbekannte Mechanismen verfügen, sollten deren

interessante Auswirkungen auf die LTP Gegenstand weiterer Forschung sein.

Weitergehende Untersuchungen sind außerdem nötig, um zelluläre Prozesse in Prä- und Postsynapse

unter Modulierung des Adenosinlevels und der AR in Bezug auf early-LTP zu präzisieren und um die

konzentrationsabhängige Funktion des Dimers A1R/A2AR besser verstehen zu können.

Fügte sich diese Arbeit auch nicht in die Neuroplastizitätshypothese der Depression ein, liefert sie

dennoch Gründe für eine inverse Interpretation ebendieser. Überdies stellen die Ergebnisse eine

schlüssige Verbindung zu der Hypothese des synaptic downscaling während des non-REM-Schlafs her.

59 Literaturverzeichnis

Literaturverzeichnis

Abbott, L.F.; Regehr, W.G. (2004): Synaptic computation. In: Nature 431 (7010), S. 796–

803. DOI: 10.1038/nature03010.

Abraham, W.C.; Huggett, A. (1997): Induction and reversal of long‐term potentiation by

repeated high‐frequency stimulation in rat hippocampal slices. In: Hippocampus 7 (2),

S. 137–145. DOI: 10.1002/(SICI)1098-1063(1997)7:2<137::AID-HIPO3>3.0.CO;2-K.

Akers, K.G.; Martinez-Canabal, A.; Restivo, L.; Yiu, A.P.; Cristofaro, A. de; Hsiang, H.-L.L.

et al. (2014): Hippocampal neurogenesis regulates forgetting during adulthood and

infancy. In: Science 344 (6184), S. 598–602. DOI: 10.1126/science.1248903.

Almeida, T.; Rodrigues, R.J.; Mendonca, A. de; Ribeiro, J.A.; Cunha, R.A. (2003): Purinergic

P2 receptors trigger adenosine release leading to adenosine A2A receptor activation

and facilitation of long-term potentiation in rat hippocampal slices. In: Neuroscience

122 (1), S. 111–121.

Amaral D, L.P. (2007): Hippocampal neuroanatomy. In: The hippocampus book. Hg. v. Per

Andersen. Oxford: Oxford University Press. 37-114.

Banasr, M.; Dwyer, J.M.; Duman, R.S. (2011): Cell atrophy and loss in depression: reversal

by antidepressant treatment. Cell differentiation, Cell division, growth and death. In:

Current Opinion in Cell Biology 23 (6), S. 730–737. DOI: 10.1016/j.ceb.2011.09.002.

Bekar, L.; Libionka, W.; Tian, G.-F.; Xu, Q.; Torres, A.; Wang, X. et al. (2008): Adenosine is

crucial for deep brain stimulation-mediated attenuation of tremor. In: Nature medicine

14 (1), S. 75–80. DOI: 10.1038/nm1693.

Beretta, F.; Sala, C.; Saglietti, L.; Hirling, H.; Sheng, M.; Passafaro, M. (2005): NSF

interaction is important for direct insertion of GluR2 at synaptic sites. In: Molecular

and Cellular Neuroscience 28 (4), S. 650–660. DOI: 10.1016/j.mcn.2004.11.008.

Bi, G.Q.; Poo, M.M. (1998): Synaptic modifications in cultured hippocampal neurons:

dependence on spike timing, synaptic strength, and postsynaptic cell type. In: J

Neurosci 18 (24), S. 10464–10472.

Bischofberger, J.; Engel, D.; Li, L.; Geiger, Jörg R P; Jonas, P. (2006): Patch-clamp recording

from mossy fiber terminals in hippocampal slices. In: Nature protocols 1 (4), S. 2075–

2081. DOI: 10.1038/nprot.2006.312.

Blendy, J.A. (2006): The role of CREB in depression and antidepressant treatment. In:

Biological psychiatry 59 (12), S. 1144–1150. DOI: 10.1016/j.biopsych.2005.11.003.

Bliss, T.V.; Collingridge, G.L. (1993): A synaptic model of memory: long-term potentiation

in the hippocampus. In: Nature 361 (6407), S. 31–39. DOI: 10.1038/361031a0.


Bliss, T.V.; Gardner-Medwin, A.R. (1973): Long-lasting potentiation of synaptic transmission

in the dentate area of the unanaesthetized rabbit following stimulation of the perforant

path. In: The Journal of Physiology 232 (2), S. 357–374. DOI:

10.1113/jphysiol.1973.sp010274.

Bliss, T.V.; Lømo, T. (1973): Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the

dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. In:

J Physiol 232 (2), S. 331–356.

Blitzer, R.D.; Wong, T.; Nouranifar, R.; Iyengar, R.; Landau, E.M. (1995): Postsynaptic

CAMP pathway gates early LTP in hippocampal CA1 region. In: Neuron 15 (6), S.

1403–1414. DOI: 10.1016/0896-6273(95)90018-7.

Borgdorff, A.J.; Choquet, D. (2002): Regulation of AMPA receptor lateral movements. In:

Nature 417 (6889), S. 649–653. DOI: 10.1038/nature00780.

Brakemeier, E.-L.; Normann, C.; Berger, M. (2008): Ätiopathogenese der unipolaren

Depression. Bundesgesundheitsblatt - Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz. In:

Bundesgesundheitsbl. 51 (4), S. 379–391. DOI: 10.1007/s00103-008-0505-x.

Bremner, J.D.; Narayan, M.; Anderson, E.R.; Staib, L.H.; Miller, H.L.; Charney, D.S. (2000):

Hippocampal volume reduction in major depression. In: The American journal of

psychiatry 157 (1), S. 115–118. DOI: 10.1176/ajp.157.1.115.

Brown, T.H.; Kairiss, E.W.; Keenan, C.L. (1990): Hebbian synapses: biophysical mechanisms

and algorithms. In: Annu Rev Neurosci 13, S. 475–511.

Brugarolas, M.; Navarro, G.; Martínez‐Pinilla, E.; Angelats, E.; Casadó, V.; Lanciego, J.L.;

Franco, R. (2014): G‐Protein‐Coupled Receptor Heteromers as Key Players in the

Molecular Architecture of the Central Nervous System. In: CNS neuroscience &

therapeutics 20 (8), S. 703–709. DOI: 10.1111/cns.12277.

Brunoni, A.R.; Lopes, M.; Fregni, F. (2008): A systematic review and meta-analysis of

clinical studies on major depression and BDNF levels: implications for the role of

neuroplasticity in depression. In: The international journal of

neuropsychopharmacology / official scientific journal of the Collegium Internationale

Neuropsychopharmacologicum (CINP) 11 (8), S. 1169–1180. DOI:

10.1017/S1461145708009309.

Cajal, S. R. Y (1894): The Croonian Lecture: La Fine Structure des Centres Nerveux. In:

Proceedings of the Royal Society of London 55 (331-335), S. 444–468. DOI:

10.1098/rspl.1894.0063.

Cajal, S. R. Y (1928): Degeneration and Regeneration of the Nervous System. English

translation by May R.M. et al., eds. (1991). New York: Oxford University Press.

Campbell, S.; Marriott, M.; Nahmias, C.; MacQueen, G.M. (2004): Lower hippocampal

volume in patients suffering from depression: a meta-analysis. In: The American

journal of psychiatry 161 (4), S. 598–607. DOI: 10.1176/appi.ajp.161.4.598.

Caruana, D.A.; Alexander, G.M.; Dudek, S.M. (2012): New insights into the regulation of

synaptic plasticity from an unexpected place: Hippocampal area CA2. In: Learn. Mem.

19 (9), S. 391–400. DOI: 10.1101/lm.025304.111.


Castrén, E. (2005): Is mood chemistry? In: Nature reviews. Neuroscience 6 (3), S. 241–246.

DOI: 10.1038/nrn1629.

Chen, A.C.-H.; Shirayama, Y.; Shin, K.-H.; Neve, R.L.; Duman, R.S. (2001a): Expression of

the cAMP response element binding protein (CREB) in hippocampus produces an

antidepressant effect. In: Biological psychiatry 49 (9), S. 753–762. DOI:

10.1016/S0006-3223(00)01114-8.

Chen, B.; Dowlatshahi, D.; MacQueen, G.M.; Wang, J.-F.; Young, L. (2001b): Increased

hippocampal bdnf immunoreactivity in subjects treated with antidepressant

medication. In: Biological psychiatry 50 (4), S. 260–265. DOI: 10.1016/S0006-

3223(01)01083-6.

Chen, H.-X.; Otmakhov, N.; Lisman, J. (1999): Requirements for LTP Induction by Pairing in

Hippocampal CA1 Pyramidal Cells. In: Journal of Neurophysiology 82 (2), S. 526–

532.

Chieng, B.; Bekkers, J.M. (2001): Inhibition of calcium channels by opioid‐ and adenosine‐receptor agonists in neurons of the nucleus accumbens. In: British Journal of

Pharmacology 133 (3), S. 337–344. DOI: 10.1038/sj.bjp.0704072.

Chung, H.J.; Qian, X.; Ehlers, M.; Jan, Y.N.; Jan, L.Y. (2009): Neuronal activity regulates

phosphorylation-dependent surface delivery of G protein-activated inwardly rectifying

potassium channels. In: PNAS 106 (2), S. 629–634. DOI: 10.1073/pnas.0811615106.

Ciruela, F.; Casadó, V.; Rodrigues, R.J.; Luján, R.; Burgueño, J.; Canals, M. et al. (2006):

Presynaptic Control of Striatal Glutamatergic Neurotransmission by Adenosine A1–

A2A Receptor Heteromers. In: J. Neurosci. 26 (7), S. 2080–2087. DOI:

10.1523/JNEUROSCI.3574-05.2006.

Citri, A.; Malenka, R.C. (2008): Synaptic plasticity: multiple forms, functions, and

mechanisms. In: Neuropsychopharmacology : official publication of the American

College of Neuropsychopharmacology 33 (1), S. 18–41. DOI:

10.1038/sj.npp.1301559.

Coelho, J.E.; Alves, P.; Canas, P.M.; Valadas, J.S.; Shmidt, T.; Batalha, V.L. et al. (2014):

Overexpression of Adenosine A2A Receptors in Rats: Effects on Depression,

Locomotion, and Anxiety. In: Frontiers in psychiatry 5, S. 67. DOI:

10.3389/fpsyt.2014.00067.

Cole; Curtis (1938): Electrical Impedance of Nerve During Activity. In: Nature <London>

142 (3587), S. 209–210. Online verfügbar unter http://dx.doi.org/10.1038/142209b0.

Cooke, S.F.; Bliss (2006): Plasticity in the human central nervous system. In: Brain : a

journal of neurology 129 (Pt 7), S. 1659–1673. DOI: 10.1093/brain/awl082.

Cunha, R.A.; Constantino, M.D.; Ribeiro, J.A. (1999): G Protein coupling of CGS 21680

binding sites in the rat hippocampus and cortex is different from that of adenosine A1

and striatal A2A receptors. In: Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 359 (4), S.

295–302. DOI: 10.1007/PL00005355.


Cunha, R.A.; Milusheva, E.; Vizi, E.S.; Ribeiro, J.A.; Sebastião, A.M. (1994): Excitatory and

Inhibitory Effects of A1 and A2A Adenosine Receptor Activation on the Electrically

Evoked [3H]Acetylcholine Release from Different Areas of the Rat Hippocampus. In:

Journal of Neurochemistry 63 (1), S. 207–214. DOI: 10.1046/j.1471-

4159.1994.63010207.x.

Cunha, R.A.; Ribeiro, J.A. (2000): Adenosine A2A receptor facilitation of synaptic

transmission in the CA1 area of the rat hippocampus requires protein kinase C but not

protein kinase A activation. In: Neuroscience letters 289 (2), S. 127–130.

Dan, Y.; Poo, M.-M. (2006): Spike timing-dependent plasticity: from synapse to perception.

In: Physiological reviews 86 (3), S. 1033–1048. DOI: 10.1152/physrev.00030.2005.

Davis, Kenneth L.; Malenka, Robert C. (2002): Neuropsychopharmacology. The fifth

generation of progress : an official publication of the American College of

Neuropsychopharmacology. Chapter 11. Philadelphia: Lippincott/Williams & Wilkins.

DeJong-Meyer, R. (2005): Depressive Störungen: Ätiologie. In Baumann U. & Perrez M.

(Hrsg.). Lehrbuch klinische Psychologie - Psychotherapie. 3., vollständig überarb.

Aufl. Bern: Hans Huber. 862-877.

Deng, W.; Aimone, J.B.; Gage, F.H. (2010): New neurons and new memories: how does adult

hippocampal neurogenesis affect learning and memory? In: Nature reviews.

Neuroscience 11 (5), S. 339–350. DOI: 10.1038/nrn2822.

Dias, R.B.; Ribeiro, J.A.; Sebastiao, A.M. (2012): Enhancement of AMPA currents and

GluR1 membrane expression through PKA-coupled adenosine A(2A) receptors. In:

Hippocampus 22 (2), S. 276–291. DOI: 10.1002/hipo.20894.

Dias, R.B.; Rombo, D.M.; Ribeiro, J.A.; Henley, J.M.; Sebastião, A.M. (2013): Adenosine:

setting the stage for plasticity. In: Trends in Neurosciences 36 (4), S. 248–257. DOI:

10.1016/j.tins.2012.12.003.

Diekelmann, S.; Born, J. (2010): The memory function of sleep. In: Nature reviews.


Dratz, E. (2013): Modulation assoziativer LTP im Hippocampus. Med. Dissertation,

Universität Freiburg i. Br.

Dudek, S.M.; Bear, M.F. (1992): Homosynaptic long-term depression in area CA1 of

hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. In: Proceedings

of the National Academy of Sciences 89 (10), S. 4363–4367. DOI:

10.1073/pnas.89.10.4363.

Duman, R.S. (2004): Depression: a case of neuronal life and death? In: Biological psychiatry

56 (3), S. 140–145. DOI: 10.1016/j.biopsych.2004.02.033.

Dunwiddie, T.V.; Haas, H.L. (1985): Adenosine increases synaptic facilitation in the in vitro

rat hippocampus: evidence for a presynaptic site of action. In: The Journal of

Physiology 369, S. 365–377.


Edwards, F.A.; Konnerth, A.; Sakmann, B.; Takahashi, T. (1989): A thin slice preparation for

patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. In:

Pflugers Arch 414 (5), S. 600–612.

El Yacoubi, M.; Ledent, C.; Parmentier, M.; Bertorelli, R.; Ongini, E.; Costentin, J.;

Vaugeois, J.M. (2001): Adenosine A2A receptor antagonists are potential

antidepressants: evidence based on pharmacology and A2A receptor knockout mice.

In: British Journal of Pharmacology 134 (1), S. 68–77. DOI: 10.1038/sj.bjp.0704240.

Elmenhorst, D.; Meyer, P.T.; Winz, O.H.; Matusch, A.; Ermert, J.; Coenen, H.H. et al.

(2007): Sleep deprivation increases A1 adenosine receptor binding in the human brain:

a positron emission tomography study. In: The Journal of neuroscience : the official

journal of the Society for Neuroscience 27 (9), S. 2410–2415. DOI:

10.1523/JNEUROSCI.5066-06.2007.

Florian, C.; Vecsey, C.G.; Halassa, M.M.; Haydon, P.G.; Abel, T. (2011): Astrocyte-derived

adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in

hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. In: The Journal of neuroscience

: the official journal of the Society for Neuroscience 31 (19), S. 6956–6962. DOI:

10.1523/JNEUROSCI.5761-10.2011.

Fontinha, B.M.; Delgado-García, J.M.; Madroñal, N.; Ribeiro, J.A.; Sebastião, A.M.; Gruart,

A. (2009): Adenosine A(2A) receptor modulation of hippocampal CA3-CA1 synapse

plasticity during associative learning in behaving mice. In: Neuropsychopharmacology

: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology 34 (7), S.

1865–1874. DOI: 10.1038/npp.2009.8.

Forghani, R.; Krnjevic, K. (1995): Adenosine antagonists have differential effects on

induction of long-term potentiation in hippocampal slices. In: Hippocampus 5 (1), S.

71–77. DOI: 10.1002/hipo.450050109.

Fowler, J.C.: Changes in extracellular adenosine levels and population spike amplitude during

graded hypoxia in the rat hippocampal slice. In: Naunyn-Schmiedeberg's Arch

Pharmacol 347 (1), S. 73–78. DOI: 10.1007/BF00168775.

Fowler, J.C. (1993): Changes in extracellular adenosine levels and population spike amplitude

during graded hypoxia in the rat hippocampal slice. In: Naunyn-Schmiedeberg's

archives of pharmacology 347 (1), S. 73–78.

Fox, K. (2002): Anatomical pathways and molecular mechanisms for plasticity in the barrel

cortex. In: Neuroscience 111 (4), S. 799–814. DOI: 10.1016/S0306-4522(02)00027-1.

Fredholm, B.B. (2007): Adenosine, an endogenous distress signal, modulates tissue damage

and repair. In: Cell Death & Differentiation 14 (7), S. 1315–1323. DOI:

10.1038/sj.cdd.4402132.

Fredholm, B.B.; Arslan, G.; Halldner, L.; Kull, B.; Schulte, G.; Wasserman, W. (2000):

Structure and function of adenosine receptors and their genes. In: Naunyn-

Schmiedeberg's archives of pharmacology 362 (4-5), S. 364–374.

Fredholm, B.B.; IJzerman, A.P.; Jacobson, K.A.; Klotz, K.N.; Linden, J. (2001a):

International Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of

adenosine receptors. In: Pharmacological reviews 53 (4), S. 527–552.


Fredholm, B.B.; Irenius, E.; Kull, B.; Schulte, G. (2001b): Comparison of the potency of

adenosine as an agonist at human adenosine receptors expressed in Chinese hamster

ovary cells. In: Biochemical pharmacology 61 (4), S. 443–448.

Frenguelli, B.G.; Llaudet, E.; Dale, N. (2003): High‐resolution real‐time recording with

microelectrode biosensors reveals novel aspects of adenosine release during hypoxia

in rat hippocampal slices. In: Journal of Neurochemistry 86 (6), S. 1506–1515. DOI:

10.1046/j.1471-4159.2003.01957.x.

Frodl, T.; Schaub, A.; Banac, S.; Charypar, M.; Jäger, M.; Kümmler, P. et al. (2006): Reduced

hippocampal volume correlates with executive dysfunctioning in major depression. In:

Journal of Psychiatry and Neuroscience 31 (5), S. 316–325.

Fujita, T.; Chen, M.J.; Li, B.; Smith, N.A.; Peng, W.; Sun, W. et al. (2014): Neuronal

transgene expression in dominant-negative SNARE mice. In: The Journal of

neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 34 (50), S. 16594–

16604. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2585-14.2014.

George, E.M.; Cockrell, K.; Adair, T.H.; Granger, J.P. (2010): Regulation of sFlt-1 and

VEGF secretion by adenosine under hypoxic conditions in rat placental villous

explants. In: American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative

physiology 299 (6), S. R1629-33. DOI: 10.1152/ajpregu.00330.2010.

Gerevich, Z.; Wirkner, K.; Illes, P. (2002): Adenosine A2A receptors inhibit the N-methyl-D-

aspartate component of excitatory synaptic currents in rat striatal neurons. In:

European journal of pharmacology 451 (2), S. 161–164.

Gerges, N.Z.; Aleisa, A.M.; Schwarz, L.A.; Alkadhi, K.A. (2004): Reduced basal CaMKII

levels in hippocampal CA1 region: possible cause of stress-induced impairment of

LTP in chronically stressed rats. In: Hippocampus 14 (3), S. 402–410. DOI:

10.1002/hipo.10193.

Giménez-Llort, L.; Schiffmann, S.N.; Shmidt, T.; Canela, L.; Camón, L.; Wassholm, M. et al.

(2007): Working memory deficits in transgenic rats overexpressing human adenosine

A2A receptors in the brain. In: Neurobiology of Learning and Memory 87 (1), S. 42–

56. DOI: 10.1016/j.nlm.2006.05.004.

Giménez‐Llort, L.; Fernández‐Teruel, A.; Escorihuela, R.M.; Fredholm, B.B.; Tobeña, A.;

Pekny, M.; Johansson, B. (2002): Mice lacking the adenosine A1 receptor are anxious

and aggressive, but are normal learners with reduced muscle strength and survival rate.

In: European Journal of Neuroscience 16 (3), S. 547–550. DOI: 10.1046/j.1460-

9568.2002.02122.x.

Giménez‐Llort, L.; Masino, S.A.; Diao, L.; Fernández‐Teruel, A.; Tobeña, A.; Halldner, L.;

Fredholm, B.B. (2005): Mice lacking the adenosine A1 receptor have normal spatial

learning and plasticity in the CA1 region of the hippocampus, but they habituate more

slowly. In: Synapse 57 (1), S. 8–16. DOI: 10.1002/syn.20146.

Gleiter, C.H.; Deckert, J.; Nutt, D.J.; Marangos, P.J. (1989): Electroconvulsive Shock (ECS)

and the Adenosine Neuromodulatory System. Effect of Single and Repeated ECS on

the Adenosine A1 and A2 Receptors, Adenylate Cyclase, and the Adenosine Uptake

Site. In: J Neurochem 52 (2), S. 641–646. DOI: 10.1111/j.1471-4159.1989.tb09168.x.


Glick, B.S.; Rothman, J.E. (1987): Possible role for fatty acyl-coenzyme A in intracellular

protein transport. In: Nature 326 (6110), S. 309–312. DOI: 10.1038/326309a0.

Granger, A.J.; Shi, Y.; Lu, W.; Cerpas, M.; Nicoll, R.A. (2012): LTP requires a reserve pool

of glutamate receptors independent of subunit type. In: Nature 493 (7433), S. 495–

500. DOI: 10.1038/nature11775.

Grover, L.M.; Teyler, T.J. (1990): Two components of long-term potentiation induced by

different patterns of afferent activation. In: Nature 347 (6292), S. 477–479. DOI:

10.1038/347477a0.

Gundlfinger, A.; Bischofberger, J.; Johenning, F.W.; Torvinen, M.; Schmitz, D.; Breustedt, J.

(2007): Adenosine modulates transmission at the hippocampal mossy fibre synapse via

direct inhibition of presynaptic calcium channels. In: The Journal of Physiology 582

(Pt 1), S. 263–277. DOI: 10.1113/jphysiol.2007.132613.

Hanson, P.I.; Roth, R.; Morisaki, H.; Jahn, R.; Heuser, J.E. (1997): Structure and

Conformational Changes in NSF and Its Membrane Receptor Complexes Visualized

by Quick-Freeze/Deep-Etch Electron Microscopy. In: Cell 90 (3), S. 523–535. DOI:

10.1016/S0092-8674(00)80512-7.

Haskó, G.; Linden, J.; Cronstein, B.; Pacher, P. (2008): Adenosine receptors: therapeutic

aspects for inflammatory and immune diseases. In: Nature reviews. Drug discovery 7

(9), S. 759–770. DOI: 10.1038/nrd2638.

Hebb, D. O. (1949): The organization of behavior;. A neuropsychological theory. New York:

Wiley (Wiley's books in clinical psychology).

Hernández-González, O.; Hernández-Flores, T.; Prieto, G.A.; Pérez-Burgos, A.; Arias-García,

M.A.; Galarraga, E.; Bargas, J. (2014): Modulation of Ca2+-currents by sequential and

simultaneous activation of adenosine A1 and A2A receptors in striatal projection

neurons. In: Purinergic Signalling 10 (2), S. 269–281. DOI: 10.1007/s11302-013-

9386-z.

Hershkowitz, N.; Katchman, A.N.; Veregge, S. (1993): Site of synaptic depression during

hypoxia: a patch-clamp analysis. In: Journal of Neurophysiology 69 (2), S. 432–441.

Hickey, P.; Stacy, M. (2012): Adenosine A2A Antagonists in Parkinson’s Disease: What’s

Next? Current Neurology and Neuroscience Reports. In: Curr Neurol Neurosci Rep 12

(4), S. 376–385. DOI: 10.1007/s11910-012-0279-2.

Hines, D.J.; Schmitt, L.I.; Hines, R.M.; Moss, S.J.; Haydon, P.G. (2013): Antidepressant

effects of sleep deprivation require astrocyte-dependent adenosine mediated signaling.

In: Translational Psychiatry 3 (1), S. e212. DOI: 10.1038/tp.2012.136.

Hodgkin, A.; Huxley, A. (1952): A quantitative description of membrane current and its

application to conduction and excitation in nerve. In: Bulletin of Mathematical Biology

52 (1-2), S. 25–71.


Hodgson, R.A.; Bertorelli, R.; Varty, G.B.; Lachowicz, J.E.; Forlani, A.; Fredduzzi, S. et al.

(2009): Characterization of the Potent and Highly Selective A2A Receptor

Antagonists Preladenant and SCH 412348 [7-[2-[4-2,4-Difluorophenyl]-1-

piperazinyl]ethyl]-2-(2-furanyl)-7H-pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidin-5-

amine] in Rodent Models of Movement Disorders and Depression. In: J Pharmacol

Exp Ther 330 (1), S. 294–303. DOI: 10.1124/jpet.108.149617.

Hohoff, C.; Garibotto, V.; Elmenhorst, D.; Baffa, A.; Kroll, T.; Hoffmann, A. et al. (2014):

Association of adenosine receptor gene polymorphisms and in vivo adenosine A1

receptor binding in the human brain. In: Neuropsychopharmacology : official

publication of the American College of Neuropsychopharmacology 39 (13), S. 2989–

2999. DOI: 10.1038/npp.2014.150.

Holderbach, R.; Clark, K.; Moreau, J.-L.; Bischofberger, J.; Normann, C. (2007): Enhanced

long-term synaptic depression in an animal model of depression. In: Biological

psychiatry 62 (1), S. 92–100. DOI: 10.1016/j.biopsych.2006.07.007.

Holderbach, R.S. (2006): Synaptische Plastizität und Neurogenese in einem Depressions-

Tiermodell. Med. Dissertation, Universität Freiburg i.Br.

Huang, Y.Y.; Kandel, E.R.; Varshavsky, L.; Brandon, E.P.; Qi, M.; Idzerda, R.L. et al.

(1995): A genetic test of the effects of mutations in PKA on mossy fiber LTP and its

relation to spatial and contextual learning. In: Cell 83 (7), S. 1211–1222.

Huang, Y.Y.; Malenka, R.C. (1993): Examination of TEA-induced synaptic enhancement in

area CA1 of the hippocampus: the role of voltage-dependent Ca2+ channels in the

induction of LTP. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society

for Neuroscience 13 (2), S. 568–576.

Huang, Z.-L.; Urade, Y.; Hayaishi, O. (2011): The Role of Adenosine in the Regulation of

Sleep. In: CTMC 11 (8), S. 1047–1057. DOI: 10.2174/156802611795347654.

Huber, K.M.; Mauk, M.D.; Kelly, P.T. (1995): Distinct LTP induction mechanisms:

contribution of NMDA receptors and voltage-dependent calcium channels. In: Journal

of Neurophysiology 73 (1), S. 270–279.

Hutchison, A.J.; Webb, R.L.; Oei, H.H.; Ghai, G.R.; Zimmerman, M.B.; Williams, M. (1989):

CGS 21680C, an A2 selective adenosine receptor agonist with preferential

hypotensive activity. In: The Journal of pharmacology and experimental therapeutics

251 (1), S. 47–55.

Jeong, H.-J. (2002): Adenosine A1 Receptor-Mediated Presynaptic Inhibition of GABAergic

Transmission in Immature Rat Hippocampal CA1 Neurons. In: Journal of

Neurophysiology 89 (3), S. 1214–1222. DOI: 10.1152/jn.00516.2002.

Ji, R.-R.; Kohno, T.; Moore, K.A.; Woolf, C.J. (2003): Central sensitization and LTP: do pain

and memory share similar mechanisms? In: Trends in Neurosciences 26 (12), S. 696–

705. DOI: 10.1016/j.tins.2003.09.017.

Joëls, M.; Krugers, H.J. (2007): LTP after stress: up or down? In: Neural plasticity 2007, S.

93202. DOI: 10.1155/2007/93202.


Jurado, S.; Goswami, D.; Zhang, Y.; Molina, A.J.M.; Südhof, T.C.; Malenka, R.C. (2013):

LTP Requires a Unique Postsynaptic SNARE Fusion Machinery. In: Neuron 77 (3), S.

542–558. DOI: 10.1016/j.neuron.2012.11.029.

Kandel, E.R. (2001): The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes

and synapses. In: Science 294 (5544), S. 1030–1038.

Kandel, Eric R. (2013): Principles of neural science. 5th ed. New York: McGraw-Hill.

Kaster, M.P.; Machado, D.G.; Santos, A.R.S.; Rodrigues, A.L.S. (2012): Involvement of

NMDA receptors in the antidepressant-like action of adenosine. In: Pharmacological

reports : PR 64 (3), S. 706–713.

Kessey, K.; Mogul, D.J. (1997): NMDA-Independent LTP by adenosine A2 receptor-

mediated postsynaptic AMPA potentiation in hippocampus. In: Journal of

Neurophysiology 78 (4), S. 1965–1972.

Khan, S.A.; Ryali, V.; Bhat, P.S.; Prakash, J.; Srivastava, K.; Khanam, S. (2015): The

hippocampus and executive functions in depression. In: Industrial psychiatry journal

24 (1), S. 18–22. DOI: 10.4103/0972-6748.160920.

Kim, C.S.; Johnston, D. (2015): A1 adenosine receptor-mediated GIRK channels contribute to

the resting conductance of CA1 neurons in the dorsal hippocampus. In: Journal of

Neurophysiology 113 (7), S. 2511–2523. DOI: 10.1152/jn.00951.2014.

Kirov, S.A.; Sorra, K.E.; Harris, K.M. (1999): Slices Have More Synapses than Perfusion-

Fixed Hippocampus from both Young and Mature Rats. In: J. Neurosci. 19 (8), S.

2876–2886. Online verfügbar unter http://www.jneurosci.org/content/19/8/2876.full.

Klaasse, E.C.; IJzerman, A.P.; Grip, W.J. de; Beukers, M.W. (2008): Internalization and

desensitization of adenosine receptors. In: Purinergic Signalling 4 (1), S. 21–37. DOI:

10.1007/s11302-007-9086-7.

Klishin, A.; Lozovaya, N.; Krishtal, O. (1995): A1 adenosine receptors differentially regulate

the N-methyl-d-aspartate and non-N-methyl-d-aspartate receptor-mediated

components of hippocampal excitatory postsynaptic current in a Ca2+/Mg2+-

dependent manner. In: Neuroscience 65 (4), S. 947–953.

Kneussel, M.; Hausrat, T.J. (2016): Postsynaptic Neurotransmitter Receptor Reserve Pools for

Synaptic Potentiation. In: Trends in Neurosciences 39 (3), S. 170–182.

Kouvaros, S.; Papatheodoropoulos, C. (2016): Major dorsoventral differences in the

modulation of the local CA1 hippocampal network by NMDA, mGlu5, adenosine

A2A and cannabinoid CB1 receptors. In: Neuroscience 317, S. 47–64. DOI:

10.1016/j.neuroscience.2015.12.059.

Krugers, H.J.; Alfarez, D.N.; Karst, H.; Parashkouhi, K.; van Gemert, N.; Joëls, M. (2005):

Corticosterone shifts different forms of synaptic potentiation in opposite directions. In:

Hippocampus 15 (6), S. 697–703. DOI: 10.1002/hipo.20092.


Krugers, H.J.; Goltstein, P.M.; van der Linden, S.; Joëls, M. (2006): Blockade of

glucocorticoid receptors rapidly restores hippocampal CA1 synaptic plasticity after

exposure to chronic stress. In: The European journal of neuroscience 23 (11), S.

3051–3055. DOI: 10.1111/j.1460-9568.2006.04842.x.

Laifenfeld, D.; Karry, R.; Grauer, E.; Klein, E.; Ben-Shachar, D. (2005): Antidepressants and

prolonged stress in rats modulate CAM-L1, laminin, and pCREB, implicated in

neuronal plasticity. In: Neurobiology of disease 20 (2), S. 432–441. DOI:

10.1016/j.nbd.2005.03.023.

Landmann, Björn Christopher (2015): Pharmakologische Modulation der assoziativen

synaptischen Langzeitplastizität durch Adenosinrezeptoren. Med. Dissertation.

Universität Freiburg i. Br.

Lang, U.E.; Lang, F.; Richter, K.; Vallon, V.; Lipp, H.-P.; Schnermann, J.; Wolfer, D.P.

(2003): Emotional instability but intact spatial cognition in adenosine receptor 1 knock

out mice. In: Behavioural Brain Research 145 (1–2), S. 179–188. DOI:

10.1016/S0166-4328(03)00108-6.

Larson, J.; Xiao, P.; Lynch, G. (1993): Reversal of LTP by theta frequency stimulation. In:

Brain research 600 (1), S. 97–102.

Levy, W.B.; Steward, O. (1983): Temporal contiguity requirements for long-term associative

potentiation/depression in the hippocampus. In: Neuroscience 8 (4), S. 791–797.

Li, W.; Liu, L.; Liu, Y.-y.; Luo, J.; Lin, J.-y.; Li, X. et al. (2012): Effects of electroconvulsive

stimulation on long-term potentiation and synaptophysin in the hippocampus of rats

with depressive behavior. In: The journal of ECT 28 (2), S. 111–117. DOI:

10.1097/YCT.0b013e31824a47ca.

Lisman, J.; Yasuda, R.; Raghavachari, S. (2012): Mechanisms of CaMKII action in long-term

potentiation. In: Nature reviews. Neuroscience 13 (3), S. 169–182. DOI:

10.1038/nrn3192.

Lledo, P. (1998): Postsynaptic Membrane Fusion and Long-Term Potentiation. In: Science

279 (5349), S. 399–403. DOI: 10.1126/science.279.5349.399.

Lohse, M.J.; Klotz, K.N.; Schwabe, U.; Cristalli, G.; Vittori, S.; Grifantini, M. (1988): 2-

Chloro-N6-cyclopentyladenosine: a highly selective agonist at A1 adenosine

receptors. In: Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology 337 (6), S. 687–689.

Lopes, L.V.; Cunha, R.A.; Kull, B.; Fredholm, B.B.; Ribeiro, J.A. (2002): Adenosine A2A

receptor facilitation of hippocampal synaptic transmission is dependent on tonic A1

receptor inhibition. In: Neuroscience 112 (2), S. 319–329. DOI: 10.1016/S0306-

4522(02)00080-5.

Lopes, L.V.; Cunha, R.A.; Ribeiro, J.A. (2000): Cross talk between A1 and A2A adenosine

receptors in the hippocampus and cortex of young adult and old rats. J Neurophysiol.

In: Journal of Neurophysiology 82 (6), S. 3196–3203. Online verfügbar unter

https://www.researchgate.net/profile/Luisa_Lopes3/publication/12700869_Cross_talk

_between_A1_and_A2A_adenosine_receptors_in_the_hippocampus_and_cortex_of_y

oung_adult_and_old_rats_J_Neurophysiol/links/0f3175367fee699f99000000.pdf.


Luchkina, N.V.; Huupponen, J.; Clarke, V.R.J.; Coleman, S.K.; Keinänen, K.; Taira, T.;

Lauri, S.E. (2014): Developmental switch in the kinase dependency of long-term

potentiation depends on expression of GluA4 subunit-containing AMPA receptors. In:

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111

(11), S. 4321–4326. DOI: 10.1073/pnas.1315769111.

Lupica, C.R.; Cass, W.A.; Zahniser, N.R.; Dunwiddie, T.V. (1990): Effects of the selective

adenosine A2 receptor agonist CGS 21680 on in vitro electrophysiology, cAMP

formation and dopamine release in rat hippocampus and striatum. In: The Journal of

pharmacology and experimental therapeutics 252 (3), S. 1134–1141.

Lüscher, C.; Xia, H.; Beattie, E.C.; Carroll, R.C.; Zastrow, M. von; Malenka, R.C.; Nicoll,

R.A. (1999): Role of AMPA Receptor Cycling in Synaptic Transmission and

Plasticity. In: Neuron 24 (3), S. 649–658. DOI: 10.1016/S0896-6273(00)81119-8.

Lynch, M.A. (2004): Long-term potentiation and memory. In: Physiol Rev 84 (1), S. 87–136.

DOI: 10.1152/physrev.00014.2003.

Makino, H.; Malinow, R. (2009): AMPA Receptor Incorporation into Synapses during LTP.

The Role of Lateral Movement and Exocytosis. In: Neuron 64 (3), S. 381–390. DOI:

10.1016/j.neuron.2009.08.035.

Malenka, R.C.; Bear, M.F. (2004): LTP and LTD: an embarrassment of riches. In: Neuron 44

(1), S. 5–21. DOI: 10.1016/j.neuron.2004.09.012.

Manzoni, O.; Manabe, T.; Nicoll, R. (1994): Release of adenosine by activation of NMDA

receptors in the hippocampus. In: Science 265 (5181), S. 2098–2101. DOI:

10.1126/science.7916485.

Markram, H. (1997): Regulation of Synaptic Efficacy by Coincidence of Postsynaptic APs

and EPSPs. In: Science 275 (5297), S. 213–215. DOI: 10.1126/science.275.5297.213.

Massey, P.V.; Bashir, Z.I. (2007): Long-term depression: multiple forms and implications for

brain function. In: Trends Neurosci 30 (4), S. 176–184.

McCarley, R.W. (2007): Neurobiology of REM and NREM sleep. In: Sleep medicine 8 (4), S.

302–330. DOI: 10.1016/j.sleep.2007.03.005.

Mendonca, A. de; Sebastiao A.M.; Ribeiro J.A. (1995): Inhibition of NMDA receptor-

mediated currents in isolated rat hippocampal neurones by adenosine A1 receptor

activation. In: Neuroreport 6 (8), S. 1097–1100.

Mendonça, A.d.; Ribeiro, J.A. (1996): Adenosine and neuronal plasticity. In: Life Sciences 60

(4–5), S. 245–251. DOI: 10.1016/S0024-3205(96)00544-9.

Mendonça, A. de; Ribeiro, J.A. (1994): Endogenous adenosine modulates long-term

potentiation in the hippocampus. In: Neuroscience 62 (2), S. 385–390. DOI:

10.1016/0306-4522(94)90373-5.


Mihara, T.; Mihara, K.; Yarimizu, J.; Mitani, Y.; Matsuda, R.; Yamamoto, H. et al. (2007):

Pharmacological Characterization of a Novel, Potent Adenosine A1 and A2A

Receptor Dual Antagonist, 5-[5-Amino-3-(4-fluorophenyl)pyrazin-2-yl]-1-

isopropylpyridine-2(1H)-one (ASP5854), in Models of Parkinson's Disease and

Cognition. In: J Pharmacol Exp Ther 323 (2), S. 708–719. DOI:

10.1124/jpet.107.121962.

Moore, K.A.; Nicoll, R.A.; Schmitz, D. (2003): Adenosine gates synaptic plasticity at

hippocampal mossy fiber synapses. In: PNAS 100 (24), S. 14397–14402. DOI:

10.1073/pnas.1835831100.

Morgan, S.L.; Teyler, T.J. (2001): Electrical Stimuli Patterned After the Theta-Rhythm

Induce Multiple Forms of LTP. In: Journal of Neurophysiology 86 (3), S. 1289–1296.

Online verfügbar unter http://jn.physiology.org/content/jn/86/3/1289.full.pdf.

Mori, A. (2014): Adenosine Receptors in Neurology and Psychiatry: Elsevier Science. Online

verfügbar unter https://books.google.de/books?id=pgZ0AwAAQBAJ.

Mouro, F. (2012): Modulation of NMDA receptor activity through adenosine A2A receptors

in the hippocampus. Med. Diss. Universität Lissabon.

Nair, A.; Vaidya, V.A. (2006): Cyclic AMP response element binding protein and brain-

derived neurotrophic factor: Molecules that modulate our mood? Journal of

Biosciences. In: J Biosci 31 (3), S. 423–434. DOI: 10.1007/BF02704114.

Nakajima, T. (1990): N-ethylmaleimide uncouples muscarinic receptors from acetylcholine-

sensitive potassium channels in bullfrog atrium. In: The Journal of General

Physiology 96 (4), S. 887–903. DOI: 10.1085/jgp.96.4.887.

Neher, E.; Sakmann, B. (1976): Single-channel currents recorded from membrane of

denervated frog muscle fibres. In: Nature 260 (5554), S. 799–802.

Neves, G.; Cooke, S.F.; Bliss, T.V.P. (2008): Synaptic plasticity, memory and the

hippocampus: a neural network approach to causality. In: Nature Reviews


Nibuya, M.; Nestler, E.J.; Duman, R.S. (1996): Chronic antidepressant administration

increases the expression of cAMP response element binding protein (CREB) in rat

hippocampus. In: J. Neurosci. 16 (7), S. 2365–2372. Online verfügbar unter

http://www.jneurosci.org/content/16/7/2365.full.pdf.

Nishimune, A.; Isaac, J.T.; Molnar, E.; Noel, J.; Nash, S.; Tagaya, M. et al. (1998): NSF

Binding to GluR2 Regulates Synaptic Transmission. In: Neuron 21 (1), S. 87–97.

DOI: 10.1016/S0896-6273(00)80517-6.

Nissen, C.; Holz, J.; Blechert, J.; Feige, B.; Riemann, D.; Voderholzer, U.; Normann, C.

(2010): Learning as a model for neural plasticity in major depression. In: Biological


Nobelprize.org (2014): The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1991. Nobel Media AB.

Online verfügbar unter

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1991/, zuletzt geprüft am

05.05.2016.


Noel, J.; Ralph, G.; Pickard, L.; Williams, J.; Molnar, E.; Uney, J.B. et al. (1999): Surface

Expression of AMPA Receptors in Hippocampal Neurons Is Regulated by an NSF-

Dependent Mechanism. In: Neuron 23 (2), S. 365–376. DOI: 10.1016/S0896-

6273(00)80786-2.

Nörenberg, W.; Wirkner, K.; Illes, P. (1997): Effect of adenosine and some of its structural

analogues on the conductance of NMDA receptor channels in a subset of rat

neostriatal neurones. In: British Journal of Pharmacology 122 (1), S. 71–80. DOI:

10.1038/sj.bjp.0701347.

Normann, C.; Schmitz, D.; Fürmaier, A.; Döing, C.; Bach, M. (2007): Long-term plasticity of

visually evoked potentials in humans is altered in major depression. In: Biological


Numberger, Markus; Draguhn, Andreas (1996): Patch-Clamp-Technik. Heidelberg [u.a.]:

Spektrum, Akad. Verl. (Labor im Fokus).

O'Kane, E.; Stone, T.W. (1998): Interaction between adenosine A1 and A2 receptor-mediated

responses in the rat hippocampus in vitro. In: European journal of pharmacology 362

(1), S. 17–25. DOI: 10.1016/S0014-2999(98)00730-4.

Padamsey, Z.; Emptage, N. (2014): Two sides to long-term potentiation: a view towards

reconciliation. In: Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B,

Biological sciences 369 (1633), S. 20130154. DOI: 10.1098/rstb.2013.0154.

Pascual, O. (2005): Astrocytic Purinergic Signaling Coordinates Synaptic Networks. In:

Science 310 (5745), S. 113–116. DOI: 10.1126/science.1116916.

Passafaro, M.; Piëch, V.; Sheng, M. (2001): Subunit-specific temporal and spatial patterns of

AMPA receptor exocytosis in hippocampal neurons. In: Nat Neurosci 4 (9), S. 917–

926. DOI: 10.1038/nn0901-917.

Paulsen, O.; Sejnowski, T.J. (2000): Natural patterns of activity and long-term synaptic

plasticity. In: Current opinion in neurobiology 10 (2), S. 172–179.

Pavlides, C.; Watanabe, Y.; McEwen, B.S. (1993): Effects of glucocorticoids on hippocampal

long‐term potentiation. In: Hippocampus 3 (2), S. 183–192. DOI:

10.1002/hipo.450030210.

Pinto-Duarte, A.; Coelho, J.E.; Cunha, R.A.; Ribeiro, J.A.; Sebastiao, A.M. (2005):

Adenosine A2A receptors control the extracellular levels of adenosine through

modulation of nucleoside transporters activity in the rat hippocampus. In: J

Neurochem 93 (3), S. 595–604. DOI: 10.1111/j.1471-4159.2005.03071.x.

Pittenger, C.; Duman, R.S. (2008): Stress, depression, and neuroplasticity: a convergence of

mechanisms. In: Neuropsychopharmacology : official publication of the American

College of Neuropsychopharmacology 33 (1), S. 88–109. DOI:

10.1038/sj.npp.1301574.

Plewnia, C.; Padberg, F. (2012): Transkranielle und invasive Hirnstimulationsverfahren bei

Depression. Der Nervenarzt. In: Nervenarzt 83 (8), S. 1006–1012. DOI:

10.1007/s00115-012-3573-y.


Pougnet, J.-T.; Toulme, E.; Martinez, A.; Choquet, D.; Hosy, E.; Boué-Grabot, E. (2014):

ATP P2X receptors downregulate AMPA receptor trafficking and postsynaptic

efficacy in hippocampal neurons. In: Neuron 83 (2), S. 417–430. DOI:

10.1016/j.neuron.2014.06.005.

Purves, Dale; Mooney, Richard D.; Platt, Michael L. (2012): Neuroscience. 5th ed.

Sunderland (MA): Sinauer Associates.

Radecki, D.T.; Brown, L.M.; Martinez, J.; Teyler, T.J. (2005): BDNF protects against stress-

induced impairments in spatial learning and memory and LTP. In: Hippocampus 15

(2), S. 246–253. DOI: 10.1002/hipo.20048.

Rebola, N.; Coelho, J.E.; Costenla, A.R.; Lopes, L.V.; Parada, A.; Oliveira, C.R. et al. (2003):

Decrease of adenosine A1 receptor density and of adenosine neuromodulation in the

hippocampus of kindled rats. In: European Journal of Neuroscience 18 (4), S. 820–

828. DOI: 10.1046/j.1460-9568.2003.02815.x.

Rebola, N.; Lujan, R.; Cunha, R.A.; Mulle, C. (2008): Adenosine A2A receptors are essential

for long-term potentiation of NMDA-EPSCs at hippocampal mossy fiber synapses. In:

Neuron 57 (1), S. 121–134. DOI: 10.1016/j.neuron.2007.11.023.

Rebola, N.; Rodrigues, R.J.; Lopes, L.V.; Richardson, P.J.; Oliveira, C.R.; Cunha, R.A.

(2005): Adenosine A1 and A2A receptors are co-expressed in pyramidal neurons and

co-localized in glutamatergic nerve terminals of the rat hippocampus. In:

Neuroscience 133 (1), S. 79–83. DOI: 10.1016/j.neuroscience.2005.01.054.

Regehr, W.G.; Carey, M.R.; Best, A.R. (2009): Activity-dependent regulation of synapses by

retrograde messengers. In: Neuron 63 (2), S. 154–170. DOI:

10.1016/j.neuron.2009.06.021.

Rex, C.; Kramár, E.; Ll, C.; B, L.; Cm, G.; G, L. (2005): Long-term potentiation is impaired

in middle-aged rats: regional specificity and reversal by adenosine receptor

antagonists. In: J Neurosci 25 (25), S. 5956–5966. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.0880-

05.2005.

Rodrigues, R.J.; Almeida, T.; Richardson, P.J.; Oliveira, C.R.; Cunha, R.A. (2005): Dual

presynaptic control by ATP of glutamate release via facilitatory P2X1, P2X2/3, and

P2X3 and inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 receptors in the rat hippocampus. In:

The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 25

(27), S. 6286–6295. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.0628-05.2005.

Ruhé, H.G.; Mason, N.S.; Schene, A.H. (2007): Mood is indirectly related to serotonin,

norepinephrine and dopamine levels in humans: a meta-analysis of monoamine

depletion studies. In: Molecular psychiatry 12 (4), S. 331–359. DOI:

10.1038/sj.mp.4001949.

Sacktor, T.C. (2010): How does PKMζ maintain long-term memory? In: Nat Rev Neurosci 12

(1), S. 9–15. DOI: 10.1038/nrn2949.

Schiller, D.; Eichenbaum, H.; Buffalo, E.A.; Davachi, L.; Foster, D.J.; Leutgeb, S.;

Ranganath, C. (2015): Memory and Space: Towards an Understanding of the

Cognitive Map. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience 35 (41), S. 13904–13911. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2618-15.2015.


Schmidt, Robert F.; Lang, Florian; Heckmann, Manfred (Hg.) (2010): Physiologie des

Menschen. S. 95. 31., überarb. und aktualisierte Aufl. Heidelberg: Springer-Medizin-

Verl. (Springer-Lehrbuch).

Schmidt-Hieber, C.; Jonas, P.; Bischofberger, J. (2004): Enhanced synaptic plasticity in newly

generated granule cells of the adult hippocampus. In: Nature 429 (6988), S. 184–187.

DOI: 10.1038/nature02553.

Scholz, K.P.; Miller, R.J. (1996): Presynaptic inhibition at excitatory hippocampal synapses:

development and role of presynaptic Ca2+ channels. In: Journal of Neurophysiology

76 (1), S. 39–46. Online verfügbar unter

http://jn.physiology.org/content/jn/76/1/39.full.pdf.

Sebastião, A.; Ribeiro, J. (2009): Tuning and Fine-Tuning of Synapses with Adenosine. In:

Current Neuropharmacology 7 (3), S. 180–194. DOI: 10.2174/157015909789152128.

Sebastião, A.M.; Cunha, R.A.; Mendonça, A. de; Ribeiro, J.A. (2000): Modification of

adenosine modulation of synaptic transmission in the hippocampus of aged rats. In:

British Journal of Pharmacology 131 (8), S. 1629–1634.

Seifert, Gabriel (2009): Langzeitpotenzierung in der CA1-Region. Verschiedene

Modulatoren. Med. Dissertation. Universität Freiburg i.Br.

Serafini, G. (2012): Neuroplasticity and major depression, the role of modern antidepressant

drugs. In: World journal of psychiatry 2 (3), S. 49–57. DOI: 10.5498/wjp.v2.i3.49.

Serchov, T.; Clement, H.-W.; Schwarz, M.K.; Iasevoli, F.; Tosh, D.K.; Idzko, M. et al.

(2015): Increased Signaling via Adenosine A1 Receptors, Sleep Deprivation,

Imipramine, and Ketamine Inhibit Depressive-like Behavior via Induction of

Homer1a. In: Neuron 87 (3), S. 549–562. DOI: 10.1016/j.neuron.2015.07.010.

Shapiro, M. (1994): Angiotensin II inhibits calcium and M current channels in rat sympathetic

neurons via G proteins. In: Neuron 12 (6), S. 1319–1329. DOI: 10.1016/0896-

6273(94)90447-2.

Shen, H.-Y.; Chen, J.-F. (2009): Adenosine A2A Receptors in Psychopharmacology:

Modulators of Behavior, Mood and Cognition. In: Current Neuropharmacology 7 (3),

S. 195–206. DOI: 10.2174/157015909789152191.

Shen, K.; Johnson, S.W. (1997): Presynaptic GABAB and adenosine A1 receptors regulate

synaptic transmission to rat substantia nigra reticulata neurones. In: The Journal of

Physiology 505 (1), S. 153–163. DOI: 10.1111/j.1469-7793.1997.153bc.x.

Song, S.; Miller, K.D.; Abbott, L.F. (2000): Competitive Hebbian learning through spike-

timing-dependent synaptic plasticity. In: Nature neuroscience 3 (9), S. 919–926. DOI:

10.1038/78829.

Stahnisch, F.W. (2003): Making the brain plastic: early neuroanatomical staining techniques

and the pursuit of structural plasticity, 1910-1970. In: Journal of the history of the

neurosciences 12 (4), S. 413–435. DOI: 10.1076/jhin.12.4.413.27917.


Stanton, P.K.; Sejnowski, T.J. (1989): Associative long-term depression in the hippocampus

induced by hebbian covariance. In: Nature 339 (6221), S. 215–218. DOI:

10.1038/339215a0.

Stent, G.S. (1973): A physiological mechanism for Hebb's postulate of learning. In: Proc Natl

Acad Sci U S A 70 (4), S. 997–1001.

Sterlemann, V.; Rammes, G.; Wolf, M.; Liebl, C.; Ganea, K.; Müller, M.B.; Schmidt, M.V.

(2010): Chronic social stress during adolescence induces cognitive impairment in aged

mice. In: Hippocampus 20 (4), S. 540–549. DOI: 10.1002/hipo.20655.

Stolz, S. D. (2015): Synaptische Langzeitplastizität bei A1-Rezeptor‐Knockout und -

überexprimierenden Mäusen. Med. Dissertation. Universität Freiburg i. Br.

Sullivan, P.F.; Neale, M.C.; Kendler, K.S. (2000): Genetic epidemiology of major depression:

review and meta-analysis. In: The American journal of psychiatry 157 (10), S. 1552–

1562. DOI: 10.1176/appi.ajp.157.10.1552.

Suzuki, F.; Shimada, J.; Mizumoto, H.; Karasawa, A.; Kubo, K.; Nonaka, H. et al. (1992):

Adenosine A1 antagonists. 2. Structure-activity relationships on diuretic activities and

protective effects against acute renal failure. In: J. Med. Chem. 35 (16), S. 3066–3075.

DOI: 10.1021/jm00094a022.

Taubenfeld, S.M.; Stevens, K.A.; Pollonini, G.; Ruggiero, J.; Alberini, C.M. (2002): Profound

molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor

subunits and uncoupled mRNA/protein expression. In: Journal of Neurochemistry 81

(6), S. 1348–1360. DOI: 10.1046/j.1471-4159.2002.00936.x.

Tebano, M.T.; Martire, A.; Rebola, N.; Pepponi, R.; Domenici, M.R.; Grò, M.C. et al. (2005):

Adenosine A2A receptors and metabotropic glutamate 5 receptors are co‐localized and

functionally interact in the hippocampus: a possible key mechanism in the modulation

of N‐methyl‐d‐aspartate effects. In: Journal of Neurochemistry 95 (4), S. 1188–1200.

DOI: 10.1111/j.1471-4159.2005.03455.x.

Trepel, Martin (2015): Neuroanatomie. Struktur und Funktion - mit StudentConsult-Zugang.

6. Aufl. München: Urban & Fischer in Elsevier.

Trieu, B.H.; Kramár, E.A.; Cox, C.D.; Jia, Y.; Wang, W.; Gall, C.M.; Lynch, G. (2015):

Pronounced differences in signal processing and synaptic plasticity between piriform‐hippocampal network stages: a prominent role for adenosine. In: The Journal of

Physiology 593 (13), S. 2889–2907.

van Calker, D.; Biber, K. (2005): The Role of Glial Adenosine Receptors in Neural Resilience

and the Neurobiology of Mood Disorders. Neurochemical Research. In: Neurochem

Res 30 (10), S. 1205–1217. DOI: 10.1007/s11064-005-8792-1.

Videbech, P.; Ravnkilde, B. (2004): Hippocampal volume and depression: a meta-analysis of

MRI studies. In: The American journal of psychiatry 161 (11), S. 1957–1966. DOI:

10.1176/appi.ajp.161.11.1957.


Volianskis, A.; Bannister, N.; Collett, V.J.; Irvine, M.W.; Monaghan, D.T.; Fitzjohn, S.M. et

al. (2013): Different NMDA receptor subtypes mediate induction of long-term

potentiation and two forms of short-term potentiation at CA1 synapses in rat

hippocampus in vitro. In: The Journal of Physiology 591 (Pt 4), S. 955–972. DOI:

10.1113/jphysiol.2012.247296.

Vorovenci, R.J.; Antonini, A. (2015): The efficacy of oral adenosine A2A antagonist

istradefylline for the treatment of moderate to severe Parkinson's disease. In: Expert

review of neurotherapeutics 15 (12), S. 1383–1390. DOI:

10.1586/14737175.2015.1113131.

Walsh, M.J.; Kuruc, N. (1992): The Postsynaptic Density. Constituent and Associated

Proteins Characterized by Electrophoresis, Immunoblotting, and Peptide Sequencing.

In: J Neurochem 59 (2), S. 667–678. DOI: 10.1111/j.1471-4159.1992.tb09421.x.

Wang, J.H.; Ma, Y.Y.; van den Buuse, M. (2006): Improved spatial recognition memory in

mice lacking adenosine A2A receptors. In: Experimental Neurology 199 (2), S. 438–

445. DOI: 10.1016/j.expneurol.2006.01.005.

Warner-Schmidt, J.L.; Duman, R.S. (2006): Hippocampal neurogenesis: opposing effects of

stress and antidepressant treatment. In: Hippocampus 16 (3), S. 239–249. DOI:

10.1002/hipo.20156.

Whitlock, J.R.; Heynen, A.J.; Shuler, M.G.; Bear, M.F. (2006): Learning induces long-term

potentiation in the hippocampus. In: Science 313 (5790), S. 1093–1097.

Wieraszko, A.; Ehrlich, Y.H. (1994): On the role of extracellular ATP in the induction of

long-term potentiation in the hippocampus. In: Journal of Neurochemistry 63 (5), S.

1731–1738.

Wilson, Constance N.; Mustafa, S. Jamal (2009): Adenosine receptors in health and disease.

Dordrecht, New York: Springer (Handbook of experimental pharmacology, 0171-

2004, v. 193).

Winn, H.R.; Rubio, R.; Berne, R.M. (1981): Brain adenosine concentration during hypoxia in

rats. In: The American journal of physiology 241 (2), S. H235-42.

Wirkner, K.; Assmann, H.; Köles, L.; Gerevich, Z.; Franke, H.; Nörenberg, W. et al. (2000):

Inhibition by adenosine A2A receptors of NMDA but not AMPA currents in rat

neostriatal neurons. In: British Journal of Pharmacology 130 (2), S. 259–269. DOI:

10.1038/sj.bjp.0703234.

Wolff, C. von (2007): Die Wirkung selektiver Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmer auf die

assoziative synaptische Langzeitplastizität im Hippocampus der Ratte. Med.

Dissertation, Universität Freiburg i. Br.

Wu, L.G.; Saggau, P. (1994): Adenosine inhibits evoked synaptic transmission primarily by

reducing presynaptic calcium influx in area CA1 of hippocampus. In: Neuron 12 (5),

S. 1139–1148.

Yamada, K.; McEwen, B.; Pavlides, C. (2003): Site and time dependent effects of acute stress

on hippocampal long-term potentiation in freely behaving rats. Experimental Brain

Research. In: Exp Brain Res 152 (1), S. 52–59. DOI: 10.1007/s00221-003-1519-0.


Yang, Y.; Wang, X.-b.; Frerking, M.; Zhou, Q. (2008): Delivery of AMPA receptors to

perisynaptic sites precedes the full expression of long-term potentiation. In:

Proceedings of the National Academy of Sciences 105 (32), S. 11388–11393. DOI:

10.1073/pnas.0802978105.

Yao, Y.; Kelly, M.T.; Sajikumar, S.; Serrano, P.; Tian, D.; Bergold, P.J. et al. (2008): PKM

Maintains Late Long-Term Potentiation by N-Ethylmaleimide-Sensitive

Factor/GluR2-Dependent Trafficking of Postsynaptic AMPA Receptors. In: Journal of

Neuroscience 28 (31), S. 7820–7827. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.0223-08.2008.

Yasuda, H.; Barth, A.L.; Stellwagen, D.; Malenka, R.C. (2003): A developmental switch in

the signaling cascades for LTP induction. In: Nature neuroscience 6 (1), S. 15–16.

DOI: 10.1038/nn985.

Yudowski, G.A.; Puthenveedu, M.A.; Leonoudakis, D.; Panicker, S.; Thorn, K.S.; Beattie,

E.C.; Zastrow, M. von (2007): Real-Time Imaging of Discrete Exocytic Events

Mediating Surface Delivery of AMPA Receptors. In: Journal of Neuroscience 27 (41),

S. 11112–11121. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2465-07.2007.

Yuste, R.; Bonhoeffer, T. (2001): Morphological changes in dendritic spines associated with

long-term synaptic plasticity. In: Annual review of neuroscience 24, S. 1071–1089.

DOI: 10.1146/annurev.neuro.24.1.1071.

Zur Nedden, S.; Hawley, S.; Pentland, N.; Hardie, D.G.; Doney, A.S.; Frenguelli, B.G.

(2011): Intracellular ATP Influences Synaptic Plasticity in Area CA1 of Rat

Hippocampus via Metabolism to Adenosine and Activity-Dependent Activation of

Adenosine A1 Receptors. In: J. Neurosci. 31 (16), S. 6221–6234. DOI:

10.1523/JNEUROSCI.4039-10.2011.

77 Eidesstattliche Versicherung

Eidesstattliche Versicherung

78 Danksagung

Danksagung

An erster Steller gilt mein herzlicher Dank für das Ermöglichen dieser Arbeit Herrn Prof. Dr.

Claus Normann. Während der Arbeit im Labor und während des Verfassens der

Dissertationsschrift konnte ich auf seine kompetente und geduldige Begleitung bauen und hatte

jederzeit einen guten Ansprechpartner.

Ebenso möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Josef Bischofberger für die Übernahme des

Zweitgutachtens sehr bedanken.

Den Laborkollegen Konstantin Ehrenberger, Julia Knoll und Max Horn sei Dank, dass das

Lösen von technischen Problemen ein Leichtes wurde und dass mir die gemeinsame Zeit sehr

viel Freude bereitet hat.

Die Züchtung und Bereitstellung der transgenen Tiere übernahm dankenswerterweise Tsvetan

Serchov. Auch dem Team des Tierstalls im BioMed-Zentrum, im Besonderen Tanja Richter,

möchte ich für die Bereitstellung der gezüchteten Ratten danken.

Schließlich möchte ich besonders meinen Eltern für die weitreichende Unterstützung danken,

wodurch mir eine solche Arbeit überhaupt erst ermöglicht wurde.

Alisa danke ich neben Korrektur dieser Arbeit vor allem für ihre geduldige Unterstützung und

Begleitung.

2. material und methoden - albert-ludwigs-universität freiburg

Documents