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Aus der Abteilung für Transfusionsmedizin und Hämostaseologie

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. R. Eckstein

Vergleichende Untersuchung der Zellqualität mononuk leärer Zellen aus

Leukozytenreduktionskammern und Leukapheresaten

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

an der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Thomas Michael Weidinger

aus Erlangen

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Univ ersität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler Referent: Priv.-Doz. Dr. med. E. Strasser Koreferent: Prof. Dr. med. R. Eckstein Tag der mündlichen Prüfung: 25.07.2012

Meiner Mutter und meiner Schwester

in tiefer Dankbarkeit gewidmet.

Inhaltsverzeichnis 4

I. Inhaltsverzeichnis

I. Inhaltsverzeichnis………………………………………….………………………….. ...4

II. Zusammenfassung und Abstract…………………….………………………… .........6

III. Einleitung……………………………………………………………………….……..... .10

1. Zelluläre Immuntherapien bei Tumorerkrankungen 10

2. Dendritische Zellen und Gewinnung dendritischer Zellen 11

3. Zellschädigung und Zelltod 12

3.1. Zelltod durch Nekrose 12

3.2. Zelltod durch Apoptose 13

3.2.1. Membranintegrität und Phosphatidylserin-Switch 14

4. Fragestellung 16

IV. Material und Methoden……………………………………………………………….. .17

1. Blutspender und Blutgewinnung 17

1.1 Blutspender 17

1.2 Leukapheresate 17

1.3 Thrombozytapherese und Leukozytenreduktionskammern 18

2. Lagerung, Bestimmung der Zellkonzentrationen und Blutgasanalyse 20

3. Durchflusszytometrische Messungen 20

3.1 Das Prinzip der Durchflusszytometrie 20

3.2 Färbungen 22

3.2.1 Oberflächenantigenfärbungen 22

3.2.2 Nachweis und Messung von Nekrose und Apoptose 23

3.2.2.1 Nekrose und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 23

3.2.2.2 Apoptose, Phosphatidylserin-Switch und Annexin V 23

3.3 Instrument Settings 24

3.4 Auswertung der Messungen 25

3.4.1 Festlegung der Gates der durchflusszytometrischen Messungen 25

3.4.1.1 Antikörperfärbungen gegen Oberflächenantigene 25

3.4.1.2 Färbungen mit Annexin V und 7-AAD 26

3.4.2 Statistische Auswertung 28

4. Verwendetet Formeln 28

Inhaltsverzeichnis 5

5. Versuchsreihen zur Beantwortung der Fragestellung 28

5.1 Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweier Zellseparatoren 28

5.2 Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduktionskammern 29

5.3 Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Leukapheresaten 30

V. Ergebnisse……………………………………….………………………………………31

1. Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweier Zellseparatoren 31

2. Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduktionskammern 33

3. Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Leukapheresaten 38

VI. Diskussion………………………………………………………………………….…… 42

1. Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweier Zellseparatoren 42

2. Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduktionskammern 43

3. Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Leukapheresaten 46

VII. Literaturverzeichnis………………………………………………………………… … 50

VIII. Abkürzungen…………………………………………………………………………….57

IX. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen………………………… ………………….58

X. Anhang……………………………………………………………………………………59

Danksagung

Zusammenfassung 6

II. Zusammenfassung und Abstract

Hintergrund und Ziele

Zur Herstellung dendritischer Zellen für zelluläre Immuntherapien werden mo-

nonukleäre Zellen des peripheren Bluts benötigt. Der Goldstandard zur Gewinnung

mononukleärer Zellen ist die Leukozytapherese. Die Kultivierungseffizienz von dendri-

tischen Zellen aus Monozyten beträgt aktuell ca. 30%. Eine Vorschädigung der Mo-

nozyten im Sinne der Apoptose bzw. Nekrose kann einen Einfluss auf die Kultivie-

rungsrate haben. Kürzlich wurde eine neue Quelle zur Gewinnung von mononukleären

Zellen mit ausgezeichneter Qualität beschrieben: die Leukozytenreduktionskammern

der Trima Accel® Thrombozytapheresemaschine. Ziel dieser Arbeit ist der Vergleich

zwischen Leukozytenreduktionskammern und Leukapheresaten hinsichtlich des Leu-

kozytengehalts und der Apoptose- und Nekroserate mononukleärer Zellen.

Methoden

Nach der Thrombozytapherese und nach der Leukozytapherese wurden Blut-

proben aus den Leukozytenreduktionskammern und Leukozytapheresaten entnommen

und sofort für Messungen verwendet. Blut aus den jeweiligen Apheresen wurde in

PVC-Beutel überführt und gelagert. Weitere Messungen erfolgten nach einer Lagerung

von 6, 24, 48 und 72 Stunden. Bestimmt wurden Zellkonzentration, Blutgase und

durchflusszytometrisch der Anteil an CD14-, CD45-, Annexin V- und 7-AAD-positiven

Zellen.

Ergebnisse und Beobachtungen

Der Gehalt mononukleärer Zellen der Leukozytenreduktionskammern des Trima

Accel® Zellseparators war um ein Vielfaches höher als in denen der COBE® Spectra. In

den Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel® korrelierte der Leukozytengehalt

sehr gut mit der Dauer und dem prozessierten Blutvolumen der Thrombozytapherese;

nach doppelter Thrombozytapherese waren signifikant mehr Leukozyten in den Kam-

mern waren als nach einfacher. In den Leukozytenreduktionskammern des Trima Ac-

cel® Zellseparators war die Leukozytenkonzentration signifikant höher als in Leuko-

zytapheresaten. Auf Grund des höheren Produktvolumens der Leukozytapheresate

Zusammenfassung 7

war hier der Leukozytengehalt aber deutlich höher als in den Leukozytenreduktions-

kammern. Es wurde gefunden, dass der Anteil Annexin V+/7-AAD+ Zellen nach Kurz-

zeitlagerung über 72 Stunden in doppelten verglichen mit einfachen Thrombozyten-

spenden signifikant erhöht war. In den Leukozytapheresaten dagegen kam es während

der Lagerung zu einem früheren und stärkerem Anstieg der Apoptose- und Nekrosera-

te mononukleärer Zellen mit einem früheren und stärkeren Abfall des prozentuellen

Anteils mononukleärer Zellen verglichen mit den Leukozytenreduktionskammern der

Trima Accel®. Des Weiteren fiel der pH-Wert in gelagerten Leukozytapheresaten stär-

ker ab als in gelagerten Leukozytenreduktionskammern, wobei in den Leukozytaphere-

saten der pH-Wert sehr gut mit dem Anteil an nekrotischen Zellen korrelierte.

Praktische Schlussfolgerungen

Die Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel® stellen eine sehr gute

Quelle für mononukleäre Zellen dar, während dies für die COBE Spectra® nicht zutrifft.

Die mononukleären Zellen der Trima Accel® Leukozytenreduktionskammern zeigten

während der Kurzzeitlagerung eine signifikant bessere Qualität verglichen mit Leuko-

zytapheresaten. Leukozytapheresate sind auf Grund des höheren Gehalts mononukle-

ärer Zellen der Goldstandard für die Gewinnung von mononukleären Zellen, die heute

für die klinische Versorgung mit Zelltherapeutika zunehmend benötigt werden. Leuko-

zytenreduktionskammern sind aber eine gute Leukozytenquelle für die experimentelle

Zellforschung, wobei vermutlich das schonende Absammeln der Zellen in den Leuko-

zytenreduktionskammern mit einem geringeren Zellstress und damit geringeren

Zellapoptose verbunden ist.

Zusammenfassung 8

Background and Objectives

Peripheral blood mononuclear cells are frequently used for dendritic cell culture

in adoptive immunotherapies. The gold standard to obtain monocytes for dendritic cell

therapies today is leukapheresis. Current culture efficiency is about 30%. Cell damage

of monocytes in terms of apoptosis or necrosis might influence the efficiency of

dendritic cell culture. A new source for peripheral blood mononuclear cells of good

quality, the leukoreduction system chambers of Trima Accel® plateletpheresis device,

has recently been described. This work compares leukoreduction system chambers

and leukapheresis products with regard to leukocytes cell yield and apoptosis and ne-

crosis of mononuclear cells.

Materials and Methods

Immediately after platelet- and leukapheresis blood samples were transferred

from leukoreduction system chambers and leukapheresis products into PVC bags

where they were stored for a maximum of 72 hours. Within one hour after apheresis

and after six, 24, 48 and 72 hours of storage cell counts were measured, blood gas

analysis was performed and the fractions of CD14-, CD45-, Annexin V- and 7-AAD-

positive events were analysed by flow cytometry.

Results

In leukoreduction system chambers of Trima Accel® mononuclear cell yield was

many times higher to those of COBE® Spectra. Leukocyte count of Trima Accel® leuko-

redution system chambers correlated very well with donation time and processed blood

volume. Thus, after double platelet units, leukoreduction system chambers contained a

significantly higher leukocyte count compared to those of single platelet units. Leuko-

cyte concentration of leukoreduction system chambers were higher compared to those

obtained from leukapheresis products. However, due to significantly higher product

volume leukocyte yields of leukapheresis products many times exceeded those con-

tained in leukoreduction system chambers. After 72 hours of storage, fraction of Annex-

in V+/7-AAD+ events were significantly higher in double compared to single platelet

units. In contrast, fractions of apoptotic and necrotic mononuclear cells obtained from

leukapheresis products increased earlier during storage and to higher levels accompa-

nied with an earlier drop of mononuclear cell counts compared to leukoreduction sys-

tem chambers of Trima Accel®. Furthermore, during short time storage pH decreased

Zusammenfassung 9

in leukapheresis products to lower levels compared to leukoreduction system cham-

bers showing a very good inverse correlation of pH and fraction of necrotic cells in

samples of leukapheresis products.

Conclusion

Leukoreduction system chambers of the Trima Accel® plateletpheresis device

are a very good source for peripheral blood mononuclear cells which does not apply for

those of the COBE® Spectra plateletpheresis device. Mononuclear cells of Trima

Accel® leukoreduction system chambers showed a better viablilty regarding apoptosis

and necrosis compared to stored samples of leukapheresis products. Due to high cell

yields leukapheresis is the gold standard to obtain mononuclear cells which today are

increasingly needed for cellular therapies. For experimental purpose leukoreduction

system chambers are a good source to obtain leukocytes while the gentle way to col-

lect cells in leukoreduction system chambers might be accompanied with lower cell

stress and thus lower cell apoptosis.

Einleitung 10

III. Einleitung

1. Zelluläre Immuntherapien bei Tumorerkrankungen

Ende April 2010 wurde von der US-Gesundheitsbehörde Food and Drug Admi-

nistration (FDA) das Medikament ProvengeTM (Sipuleucel-T) der Firma Dendreon zur

Therapie des metastasierten, asymptomatischen, hormon-resistenten Prostatakarzi-

noms zugelassen [17]. Die Zulassung galt als Meilenstein, da mit ProvengeTM erstmals

ein Medikament zugelassen wurde, das, wie eine Reihe weiterer in verschiedenen

Phasen der Zulassung befindlicher Medikamente, eine zelluläre Immunreaktion gegen

Tumorzellen anstößt [3, 4, 14]. Vergleichbar ist dies mit dem Prinzip der Immunreaktion

bei Virusinfektionen: Zytotoxische T-Lymphozyten werden durch antigenpräsentierende

Zellen aktiviert. Dadurch erkennen die zytotoxischen T-Zellen Antigene von Tumorzel-

len als fremd, greifen sie an und zerstören sie [38]. Im Gegensatz zur Immunreaktion

bei Virusinfektionen ist das Gefahrensignal, das von Tumorzellen ausgeht, aber zu

schwach, so dass es in vivo zu keiner ausreichenden Reaktion kommt [67]. Patienten-

eigene antigenpräsentierende Zellen müssen also ex vivo mit Tumorantigenen unter

Verwendung von Zytokinen ‚geimpft’ werden (Abb. 1, a-c). Die antigenpräsentierenden

Zellen reifen aus und beginnen die Tumorantigene an ihrer Oberfläche zu präsentieren

(Abb. 1, d & e). Nach Re-Injektion der ausgereiften antigenpräsentierenden Zellen

kommt es zu der gewünschten Aktivierung von T-Zellen in vivo (Abb. 1, e) und schließ-

lich zu einer spezifischen Immunreaktion gegen die Tumorzellen (Abb.1, f) [22].

Abb. 1: Prinzip der Immunisierung dendritischer Zellen mit Tumorantigenen und Auslösen

einer Immunreaktion gegen die Tumorzelle (modifiziert nach [22]).

Einleitung 11

In der onkologischen Therapie werden auch reine Antikörper gegen Tumoranti-

gene als Chemotherapeutika eingesetzt. Die Wirkweise ist mit der einer Immunreaktion

vergleichbar. Allerdings geht sie nicht vom Immunsystem aus. Beispiele dafür sind die

Medikamente Rituximab zur Therapie von B-Zell-Lymphomen oder Trastuzumab zur

Therapie des HER2-positiven Mammakarzinoms. Zwar erspart der Einsatz monoklona-

ler Antikörper in der Immuntherapie gegen Tumore den Aufwand allogene antigenprä-

sentierende Zellen zu sammeln und diese in vitro zu immunisieren. Im Gegensatz zu

einer reinen Antikörpertherapie bieten T-Zellen, die nach Aktivierung durch antigenprä-

sentierende Zellen gegen Tumorzellen gerichtet sind, aber einige Vorteile: T-Zellen

können besser zu Tumoren in tief liegendem Gewebe vordringen, sie proliferieren bis

alle Antigen tragenden Tumorzellen eliminiert sind und sie bilden ein immunologisches

Gedächtnis, so dass eine Immunreaktion bei Rezidiven möglich ist [16].

2. Dendritische Zellen und Gewinnung dendritischer Zellen

Die für die Immunisierung von Patienten gegen Tumorantigene verwendeten

antigenpräsentierenden Zellen sind Dendritische Zellen (griechisch dendron: Baum),

da sie als die potentesten antigenpräsentierenden Zellen des menschlichen Immunsys-

tems gelten [22, 38, 55]: Sie beeinflussen viele verschiedene Klassen der Lymphozy-

ten (B, NK, NKT) und viele Arten der T-Zell-Antwort (Th1/Th2, T-Zell-Regulierung).

Außerdem gelten sie als Wächter des Immunsystems, da sie dieses aktivieren und die

frühen Immunreaktionen beeinflussen [6, 56]. Man unterscheidet Vorläuferzellen, unrei-

fe dendritische Zellen und reife dendritische Zellen. Um eine ausreichende Immunisie-

rung gegen Tumorantigene zu erreichen sind ca. 1x107 reifer dendritischer Zellen nötig

[50]. Diese Menge ist durch Anreicherung von dendritischen Zellen aus peripherem

Blut schwer zu erreichen. In vivo können sich CD14+ Monozyten im Rahmen von Im-

munreaktionen bei Infekten in dendritische Zellen umwandeln. In vitro ist dies auch

möglich, indem man die CD14+ Monozyten mit verschiedenen Zytokinen, bevorzugt

mit GM-CSF und IL-4, kultiviert [46, 48, 50]. Der Goldstandard zur Gewinnung von Mo-

nozyten für die Zelltherapie mit dendritischen Zellen ist die Leukapherese, da bei einer

Leukapherese mehr als 1x109 CD14+ Monozyten gewonnen werden können [59, 62].

Dietz und Kollegen haben in einer 2007 veröffentlichten Arbeit berichtet, dass

aus Leukozytenreduktionskammern, die als Nebenprodukt bei Thrombozytapheresen

mit den Trima Accel® Apheresegeräten entstehen, mononukleäre Zellen von sehr gu-

ter Qualität gewonnen werden können [15, 35, 41]. Neron et al. beschrieben, dass der

Anteil mononukleärer Zellen in Leukozytenreduktionskammern um das Fünffache hö-

her ist als in Leukoreduktionsfiltern [41]. Leukozytenreduktionskammern werden auf

Grund des geringen Volumens von maximal 10ml vorrangig zur Forschung verwendet.

Einleitung 12

Abb. 2: Morphologischer Ablauf

der Nekrose (modifiziert

nach [30]).

Auch bei dem Thrombozytenspendegerät COBE® Spectra werden zur Leukozytenre-

duktion Leukozytenreduktionskammern verwendet. Über die Qualität des hierbei ge-

sammelten, an mononukleären Zellen reichen Blutes sind bisher noch keine Daten

veröffentlicht.

3. Zellschädigung und Zelltod

Aktuell beträgt die Ausreifungsrate von dendritischen Zellen aus Monozyten ca.

20% bis 40%. Es ist nahe liegend, dass hierbei eine Schädigung der Monozyten vor

Kultivierung Einfluss auf die Ausreifungsrate haben kann. Eine Schädigung der Zellen

kann zum Beispiel physiologisch im Sinne einer Zellalterung, aber auch unter patholo-

gischen Umständen wie Hypoxie, immunologischen Reaktionen, Gen-Defekten und

chemischen, physikalischen oder infektiösen Noxen stattfinden [38]. Abhängig vom

Ausmaß der Schädigung und der Art der Schädigung erholt sich die Zelle ad integrum

oder geht zugrunde. Im letzteren Fall gibt es zwei mögliche Wege: die Apoptose oder

die Nekrose [51, 65].

3.1. Zelltod durch Nekrose

Der Begriff „Nekrose“ leitet sich von dem

griechischen Wort nekrosis (ηεκροσισ), die Tötung,

ab. Jede abrupte, ausreichend intensive Zellschä-

digung kann zur Zellnekrose führen. Typisches

Beispiel hierfür ist die Zellnekrose beim akuten

Myokardinfarkt, bei der es auf Grund einer Hypoxie

zur irreversiblen Schädigung der Myokardzellen

kommt. Die wichtigsten morphologischen Merkma-

le einer Nekrose sind das Anschwellen der Zellen

und der Verlust der Integrität sowohl der Plasma-

membran als auch der Kernmembran („Karyor-

rhexis“). Der Zellkern schrumpft („Pyknosis“) und

wird aufgelöst („Karyolysis“). Gleichzeitig tritt der

Zellinhalt mitsamt verschiedener Proteasen durch

die löchrige Plasmamembran aus der Zelle aus

und verursacht eine Entzündungsreaktion im um-

liegenden Gewebe (Abb. 2) [63]. Ursprünglich galt

die Nekrose als plötzlich eintretendes Ereignis, mit

zufälligem, ungeregeltem Ablauf ohne Beteiligung

Einleitung 13

von Signalkaskaden. Neuere Studien zeigen, dass unter bestimmten Voraussetzun-

gen, vor allem in Abhängigkeit der auslösenden Stimuli, vorbestimmte Signalkaskaden

während der Nekrose, vergleichbar zur Apoptose, ablaufen [64]. Am morphologischen

Ablauf der Nekrose ändert sich dabei aber nichts, so dass diese Erkenntnis keinen

Einfluss auf die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse haben wird.

3.2. Zelltod durch Apoptose

Die Apoptose beschreibt eine Form des Zelltodes, den man als ‚stiller Selbst-

mord’ bezeichnen könnte. Eingeführt wurde der Begriff „Apoptose“ 1972 von Kerr et al.,

die eine neue Form des Zelltodes beobachtet haben; ohne Anschwellen und Platzen

der Zelle und ohne Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes. Stattdessen lös-

ten sich die sterbenden Zellen aus dem Zellverband, zersetzten sich nach und nach in

von Plasmamembran umhüllte Vesikel und wurden von umgebenden Zellen phagozy-

tiert (Abb. 3) [30, 31]. Den diesen Vorgang beschreibenden Begriff „Apoptose“, bzw. im

englischen „Apoptosis“, prägte Professor J. Cormack (Lehrstuhl für klassische Philolo-

gie (Griechisch), Universität Aberdeen, Aberdeen, GB). Apoptosis (άπωπτωσισ) wird

im griechischen als Beschreibung des Abfallens von Laub oder Blütenblättern beim

Welken verwendet.

Abb. 3: Morphologischer Ablauf der Apoptose und Phagozytose der apoptotischen Vesikel

(modifiziert nach [30]).

Die Auslöser für die Apoptose sind vielfältig. Pathologische Ursachen sind

DNS-Schädigung, intrazelluläre Ansammlung fehlerhaft gefalteter Proteine oder Zell-

schädigung bei diversen Infektionen, beispielsweise mit Adenoviren. Es gibt aber auch

Einleitung 14

physiologische Ursachen für die Apoptose. Bei der positiven und negativen Selektion

während der Reifung der T-Lymphozyten, bei der Rückbildung von Zellen während der

Embryogenese, bei der Gewebshomöostase, aber auch beim Abbau von Zellen, deren

Funktionen nicht mehr gebraucht werden, spielt die Apoptose eine entscheidende Rol-

le [34].

Heute weiß man, dass die Apoptose auf molekularer Ebene ein streng regulier-

ter Prozess mit genau aufeinander abgestimmten Signalübertragungswegen und Er-

eignissen ist [25]. Ausgelöst wird sie entweder durch Liganden an Todesrezeptoren

(„extrinsische Kaskade“) oder durch Proteine mitochondriellen Ursprungs („intrinsische

Kaskade“), vorrangig Cytochrom C [18]. Bei beiden Wegen der Aktivierung wird eine

Kaskade proteolytischer Enzyme angestoßen, die letztlich für fast alle Veränderungen

im Verlauf der Apoptose verantwortlich zu sein scheint. Diese proteolytischen Enzyme

heißen „Caspasen“, hergeleitet vom Cystein im aktiven Zentrum des Enzyms und der

Eigenschaft Peptidbindungen immer nach einer Asparaginsäure im Substrat zu spalten

(engl.: cysteinyl-aspartate specific protease). In vitalen Zellen liegen die Caspasen in

inaktiver Form vor. Ihre Aktivierung erfolgt durch die proteolytische Abspaltung der

N-Terminalen Pro-Domäne. Bisher wurden sieben unterschiedliche Caspasen ent-

deckt, die für die Apoptose menschlicher Zellen bedeutsam sind. Kommt es zu einem

apoptogenen Stimulus, unabhängig ob intrinsisch oder extrinsisch, wird nach Ablauf

der jeweiligen Caspase-Kaskade schließlich die Caspase 3 als zentrale Caspase der

Apoptose aktiviert [42]. Die zentrale Rolle der Caspasen an der Apoptose wird daran

deutlich, dass sie für die Aktivierung von DNSen mit Zersetzung der DNS, für die

Fragmentierung des Zellkerns, für die Zersetzung des Zytoskeletts mit konsekutiver

Bildung membranumhüllter Vesikel und für die Aufhebung der Plasmamembranasym-

metrie verantwortlich sind.

3.2.1. Membranintegrität und Phosphatidylserin-Swit ch

Die Zellmembran einer menschlichen Zelle besteht aus Phospholipiden, die

sich entsprechend dem Fluid-Mosaik-Model von Singer und Nicolson in einer Doppel-

schicht anordnen, so dass die hydrophoben Lipidanteile im Inneren der Membran zu

einander stehen und die hydrophilen Phosphatanteile an den Außenseiten der Memb-

ran aneinander gereiht sind (Abb. 4, a) [54]. In und an diese Phospholipiddoppelschicht

sind weitere Moleküle wie zum Beispiel Proteine, Lipide oder Cholesterine gebunden.

Die Aufgaben dieser Moleküle sind verschieden; beispielsweise können Transmemb-

ranproteine als Ionenkanäle fungieren.

Einleitung 15

Physiologischer Weise ist die Plasmamembran asymmetrisch. Das bedeutet,

dass es bei vitalen Zellen Moleküle gibt, die nur auf der Innenseite der Membran zu

finden sein können, nicht aber auf der Außenseite und umgekehrt [36]. Diese Membra-

nintegrität ist für den physiologischen Ablauf vieler Prozesse, zum Beispiel die Auf-

rechterhaltung der Elektrolytverteilung zwischen dem intra- und extrazellulären Raum,

einer vitalen Zelle notwendig. Eines dieser Moleküle ist das Phospholipid Phos-

phatidylserin. In vitalen Zellen kommt Phosphatidylserin ausschließlich in der intrazellu-

lären Schicht der Plasmamembran vor. Die Aufrechterhaltung dieser Verteilung ist

energieabhängig [49]. Wird aber eine Zelle apoptotisch, wird das Phosphatidylserin

sehr früh im Verlauf der Apoptose von der inneren auf die äußere Seite der Membran

verschoben, unabhängig vom Auslöser der Apoptose (Abb. 4, b) [37]. Diesen Vorgang

nennt man Phosphatidylserin-Switch. Wahrscheinlich dient die Externalisation von

Phosphatidylserin den umliegenden Zellen, die Apoptose zu erkennen und die Pha-

gozytose der im Verlauf der Apoptose entstehenden membranumhüllten Zellreste zu

initiiren [9, 11].

Abb. 4: Phosphatidylserin-Switch im Verlauf der Apoptose mit Phosphatidylserin in vitalen

Zellen ausschließlich auf der Zytoplasma-Seite (a) und Switch im Verlauf der Apopto-

se auf die Außenseite der Membran (b) (modifiziert nach [40]).

Einleitung 16

4. Fragestellung

Leukozytenreduktionskammern scheinen eine vielversprechende Quelle für

mononukleäre Zellen des peripheren Blutes zu sein. Einige Daten zur Qualität der aus

den Leukozytenreduktionskammern gewonnenen Zellen liegen bereits vor [15, 35, 41].

Bisher wurden aber nur Kammern untersucht, die mit der Trima Accel® hergestellt wur-

den. Des Weiteren wurden bei allen bisher veröffentlichten Daten keine Angaben zur

Apoptose gemacht. Daher ergeben sich folgende Fragestellungen:

1. Nicht nur bei der Thrombozytapherese mit der Trima Accel® sondern auch wäh-

rend der Thrombozytapherese mit der COBE® Spectra werden Leukozytenredukti-

onskammern verwendet. Der Zellgehalt und gegebenenfalls die Qualität der Zellen

der Leukozytenreduktionskammern beider Thrombozytapheresemaschinen sollen

miteinander verglichen werden.

2. In den bisher veröffentlichten Daten wurde Blut von sehr homogenen Spender-

gruppen verwendet und Ergebnisse mit geringer Streubreiter erzielt. Zu prüfen ist,

ob es bei Einfach- gegenüber Doppelapharesen zu Unterschieden in der Leukozy-

tenzahl der Leukozytenreduktionskammern kommt. Sind im Verlauf der Kurzzeitla-

gerung über 72 Stunden Zeichen einer Schädigung im Sinne der Apoptose bzw.

Nekrose bei mononukleären Zellen des peripheren Blutes nachweisbar? Wie ver-

halten sich die Zellkonzentrationen im Verlauf der Lagerung?

3. Sind Unterschiede in der Qualität bezüglich der Apoptose- und Nekroserate zwi-

schen mononukleären Zellen aus Leukozytenreduktionskammern und mononukle-

ären Zellen der Leukapherese nachweisbar? Haben die unterschiedlichen Prinzi-

pien der Anreicherung mononukleärer Zellen bei der Leukapherese und in Leuko-

zytenreduktionskammern einen Einfluss auf die Qualität der Produkte? Kommt es

zu Unterschieden in über 48 Stunden gelagerten Produkten?

Material und Methoden 17

IV. Material und Methoden

1. Blutspender und Blutgewinnung

1.1 Blutspender

Das in dieser Forschungsarbeit verwendete Blut wurde entsprechend der Richt-

linien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutpro-

dukten (Hämotherapie) der Bundesärztekammer gewonnen. [2, 26, 27] Alle Spender

dieser Studien wurden nach Feststellung der Spendetauglichkeit über den Spendevor-

gang einschließlich der Risiken aufgeklärt und stimmten der Verwendung ihres Blutes

zu Forschungszwecken zu. Alle Spender waren entsprechend der Richtlinien gesund.

Keiner der Spender erfüllte ein oder mehrere der unter Punkt 2.2 der Richtlinien zur

Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten

(Hämotherapie) der Bundesärztekammer genannten Ausschlusskriterien. Für das Wohl

der Spender wurde jederzeit Sorge getragen. Das Studienprotokoll war von der Ethik-

kommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg geprüft und gebil-

ligt worden. Verwendet wurde Blut aus Leukapherisaten des COM.TEC® Zellseparators

und Blut aus Leukozytenreduktionskammern der COBE® Spectra und der Trima Accel®

Thrombozytapherese-Maschinen.

1.2 Leukapheresate

In dieser Arbeit wurden ausschließlich Produkte verwendet, die mit dem

COM.TEC® Zellseparator (Fresenius HemoCare GmbH, Bad Homburg, Deutschland)

unter dem Separationsprogramm „autoMNC“ hergestellt wurden. Bei der Leukapherese

wird venöses Blut des Spenders über ein geschlossenes System in die Apheresema-

schine geführt. Durch Zentrifugation wird das Vollblut entsprechend der jeweiligen phy-

sikalischen Eigenschaften der Blutbestandteile in Plasma, den sogenannten „Buffy

Coat“ aus Leukozyten und Thrombozyten und in Erythrozyten aufgespaltet (Abb. 5).

Bei der Aufspaltung spielt das Gewicht der einzelnen Zellen die entscheidende Rolle.

Entsprechend der Zentripetalkraft und der Trägheit der Masse werden bei Bewegun-

gen auf einer gekrümmten Bahn und bei kreisförmigen Bewegungen Körper mit einer

höheren Masse weiter nach außen getragen als Körper mit einer geringeren Masse

[47, 52]. Entsprechend des durchschnittlichen Gewichts der einzelnen Zellen werden

daher die schwereren Erythrozyten weiter vom Mittelpunkt der Kreisbahn der Zentrifu-

ge getragen als Leukozyten. Am wenigsten werden Thrombozyten und das Blutplasma


durch die Zentrifugation beeinflusst, so dass es zur in Abb. 5 gezeigten Aufspaltung

des Blutes kommt. Durch die Aufteilung der zellulären Blutbestandteile während der

Zentrifugation in verschiedene Schichten lassen sich bestimmte Blutzellen durch ge-

zieltes Absammeln der jeweiligen Schicht gewinnen.

Ziel der Leukapherese ist das Sammeln leukozytenreicher Blutprodukte, abzu-

saugen ist daher der Buffy Coat. Das „autoMNC“-Separationsprogramm verwendet

eine einstufige Separationskammer, genannt PL1a. Die Blutzellen werden während

den einstellbaren „Überschuss-“ und „Buffy Coat - Phasen“ gesammelt. Die Trenn-

schicht zum Buffy Coat wurde durch acht optische Sensoren kontrolliert, wobei sieben

auf die Zellschichten ausgerichtet waren und einer auf die Plasmaschicht. Während der

Apherese betrug die Zentrifugendrehzahl 1500 Umdrehungen pro Minute. Die durch

die Zentrifugation auf die Zellen wirkende Kraft entsprach der Kraft, die durch das

297-fache der Erdbeschleunigung hervorgerufen werden würde.

Abb. 5: Schematische Darstellung der durch Zentrifugation aufgespaltenen Blutbestandteile

bei der Leukozytapherese (modifiziert nach [53]).

1.3 Thrombozytapherese und Leukozytenreduktionskamm ern

Während der Thrombozytapherese mit den Geräten Trima Accel® (Caridian

BCT, Lakewood, CO, USA) und COBE® Spektra (Caridian BCT) werden im Spender-

blut Thrombozyten von Leukozyten und Erythrozyten getrennt, damit die Thrombozyten

im Konzentrat so rein wie möglich angereichert werden. Die Trennung geschieht beim

Plasma

Buffy Coat:

Thrombozyten

Leukozyten

Erythrozyten


Abb. 6: Leukozytenreduktionskammer der

Trima Accel Thrombozytapherese

Maschine nach Apherese.

Durchlaufen einer konischen Leukozytenreduktionskammer, wobei die Trennung der

Blutbestandteile von der Geometrie und den hydrodynamischen Eigenschaften der

Leukozytenreduktionskammern abhängt (Abb. 6). Durch den konischen, stufenför-

migen Aufbau der Kammer sammeln

sich im Bereich der Kammerwand die

schweren Blutbestandteile, also Erythro-

zyten und Leukozyten, an, während die

Thrombozyten und das Blutplasma

durch die Kammer hindurch fließen. So

enthalten die Leukozytenreduktions-

kammern erythrozyten- und leukozyten-

reiches Blut [27].

Bisher wurden diese Leukozyten-

reduktionskammern nach Abschluss des

Spendevorgangs entsorgt. Das in der

Kammer der Trima Accel® verbleibende

Blut ist auf Grund des Leukozytenreich-

tums aber eine gute Quelle für mononuk-

leäre Zellen des peripheren Blutes, wie

kürzlich gezeigt werden konnte [15]. Es

konnte weiterhin gezeigt werden, dass

die gewonnenen Monozyten und Lym-

phozyten eine hervorragende Qualität

besitzen und gut zu dendritischen Zellen kultiviert werden können [15, 35, 41]. Daten

zur Eignung der Leukozytenreduktionskammer des COBE® Spectra Zellseparators als

Quelle für mononukleäre Zellen liegen bisher nicht vor.

Bei den Thrombozytapheresen, deren Leukozytenreduktionskammern für diese

Arbeit genutzt wurden, wurde an der Trima Accel® die Software Version 5.1, an der

COBE® Spectra die Software Version 7.0 der jeweiligen Hersteller verwendet. Die Ge-

räteeinstellungen waren bei beiden Separatoren gleich: ‚anticoagulant ratio’ 11:1, ‚draw

Management’ 6; ‚return Management’ 4, maximaler ‚draw flow’ mittel. Um zu einer

Thrombozytenspende zugelassen zu werden, musste die Thrombozytenkonzentration

der Spender vor der Spende mindestens 160 x 109 Thrombozyten pro Liter betragen.

Überstieg die Thrombozytenkonzentration 230 x 109 Thrombozyten pro Liter wurde

eine doppelte Thrombozytenspende durchgeführt (Doppel-Thrombozytapherese, D-

TA), sonst eine einfache (Einfach-Thrombozytapherese, E-TA). Sofort nach Abschluss

der Apherese wurden die Thrombozytenkonzentrate und im direkten Anschluss auch


die zu- und abführenden Schläuche der Leukozytenreduktionskammern abgeschweißt.

Das Blut der Leukozytenreduktionskammern wurde unter Wahrung aseptischer Bedin-

gungen über einen „sampling site coupler“ (Baxter, REF EMC1401) in Beutel aus Po-

lyvinylchlorid (PVC) mit einem Fassungsvolumen von je 150ml (Compoflex R Single

Bags, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) überführt und gelagert.

2. Lagerung, Bestimmung der Zellkonzentrationen und Blutgasanalyse

Die Blutprodukte wurden bei 22°C ± 2°C ohne Agitati on und vor Licht geschützt

im Thrombozyteninkubator gelagert. Lagermedien wurden nicht verwendet. Zur Lage-

rung wurden die Leukozytenreduktionskammern über ein Verbindungsstück (sampling

site coupler, Baxter, REF EMC1401) in einen 150ml PVC-Beutel (Compoflex R Single

Bags, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) überführt. Um vergleichbare Be-

dingungen zu schaffen wurden aus den Leukapherisaten Proben mit einem Volumen

von 10ml, dem maximalen Volumen der Leukozytenreduktionskammern, unter asepti-

schen Bedingungen entnommen und ebenfalls in den 150ml PVC-Beuteln gelagert. Die

Gasaustauschraten der PVC-Beutel betrugen: O2: 0.675l / m2 Beuteloberfläche / 24 h /

bar; CO2: 4.75l / m2 Beuteloberfläche / 24h / bar. Gelagert wurden die Beutel bis zu 72

Stunden. Um bei der Probenentnahme aus dem Beutel aseptische Bedingungen zu

wahren wurde der bei der Probenüberführung bereits verwendete sampling site coupler

desinfiziert und die Probe über eine Kanüle in eine 2ml Spritze abgezogen. Das jeweils

abgezogene Probevolumen betrug 0,7ml.

Die Zellkonzentrationen von Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten in

den Blutprodukten wurde mit dem ADVIA120-Zellzähler (Bayer HealthCare Diagnos-

tics) bestimmt. Wurde eine Blutgasanalyse zur Bestimmung von pH-Wert, pCO2, pO2,

HCO3- - Konzentration, sO2 und Base Excess (BE) benötigt, so wurde diese mit dem

ABL-5 (Radiometer, Kopenhagen, Dänemark) durchgeführt.

3. Durchflusszytometrische Messungen

3.1. Das Prinzip der Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie, auch fluoreszenzaktivierte Zellanalyse („fluorescence

activated cell sorting“, FACS) genannt, ist ein opto-elektronisches Messsystem, bei

dem optische Signale in elektronische Impulse umgewandelt werden und so mit Hilfe

eines EDV-Systems verarbeitet werden können. Dabei werden Streulicht- und Fluores-

zenzeigenschaften von Einzelzellen in Suspension detektiert. Der Aufbau dieser Gerä-

te setzt sich aus drei Teilen zusammen (Abb. 7):


a. Als Lichtquelle dient ein Laser der Wellenlänge 488nm und ein Dioden-Laser der

Wellenlänge 635nm. In Geräten älterer Bauart werden Quecksilber- oder Xenon-

dampflampen verwendet.

b. In der Analysekammer werden die einzelnen Zellen durch eine schnelle laminare

Strömung perlschnurartig hintereinander aufgereiht und nacheinander durch den

Laserstrahl geführt.

c. Das Detektionssystem besteht aus einer Reihe optischer Filter und Sensoren. Die

emittierten Photonen jeder einzelnen, die Analysekammer passierenden Zelle wer-

den durch die optischen Filter nach Wellenlängen aufgeteilt und an den optischen

Sensoren (FSC, SSC und FL1-FL4) in elektronische Signale umgewandelt.

Abb. 7: Schematischer Aufbau eines Durchflusszytometers (modifiziert nach [19]).

Jede Zellart streut entsprechend ihrer Größe und ihrer Zellstruktur das Licht des

488nm-Lasers auf eine zellspezifische Weise. Das vorwärts gestreute Licht (foreward

light scatter, FSC) ist nach Ausblenden des Zentralstrahls ein Maß für die Größe einer

Zelle. Das im rechten Winkel zum Zentralstrahl gestreute Licht (sideward light scatter,

SSC) ist ein Maß für die Granularität [60, 61]. Die Grundlage der Fluoreszenzmessung

ist das Anfärben von Zellen bzw. der zu untersuchenden Moleküle mit Fluoreszenz-

farbstoffen, meist nach dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Bei Bestrahlen

der Fluoreszenzfarbstoffe mit dem 635nm Dioden-Laser in der Durchflusszelle absor-

bieren die Farbstoffe eine für jeden Farbstoff spezifische Menge an Energie und wer-

den dadurch kurzzeitig auf ein höheres Energieniveau gehoben. Bei dem anschließen-

den Absinken auf das ursprüngliche Energieniveau wird die Energiedifferenz in Form

von Licht bestimmter Wellenlänge entsprechend der Planck’schen Wellen-Energie-

Relation E = h x f emittiert. Dabei steht E für die absorbierte und dadurch emittierbare

Energie, h für eine Naturkonstante, das Plancksche Wirkungsquantum, und f für die


Frequenz und damit indirekt für die Wellenlänge des emittierten Lichts [45]. Da jeder

Fluoreszenzfarbstoff ausschließlich eine bestimmte Energiemenge absorbiert, wird auf

Grund der Planck’schen Wellen-Energie-Relation nur Licht mit einem Intensitätsmaxi-

mum in einem bestimmtem Wellenlängenbereich, der für den Farbstoff charakteristisch

ist, emittiert. Die Sensoren des Durchflusszytometers registrieren das emittierte Licht

und digitalisieren das Signal. Da die Zellen einer Probe in der Durchflusszelle durch die

laminare Strömung hintereinander aufgereiht werden, lassen sich für jede einzelne

Zelle Aussagen bezüglich des Färbeverhaltens treffen. Auf Grund des vorbekannten

Emissionsmaximums jedes Farbstoffes lässt sich mit Hilfe einer geeigneten Computer-

Software das registrierte Signal mit den Messergebnissen der vorwärts und seitwärts

gestreuten Lichter kombinieren und so einem Ereignis, in diesem Fall einer Zelle, zu-

ordnen. Da bei konstanter Leistung des Lasers die Intensität der Lichtemission von der

Zahl der aktivierten Fluoreszenzfarbstoffe abhängt ist, ist mit dieser Methode nicht nur

ein qualitativer Nachweis, sondern auch eine (semi)-quantitative Messung möglich [29].

Die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind Fluorescein isothiocyanat (FITC), Pyco-

erythrin (PE) und Allophycocyanin (APC). Das Fluoreszenzmaximum von FITC liegt bei

519nm (gelb-grün), das von PE bei 578nm (rot-orange) und das von APC bei 660nm

(gelb). Für die hier dargestellten Analysen wurde das Durchflusszytometer

FACSCalibur mit der Software CellQuest™ Pro (beides BD Biosciences, San Jose,

CA, USA) verwendet.

3.2 Färbungen

Alle für die in dieser Arbeit durchgeführten Färbungen benötigten Geräte, Pro-

dukte, Chemikalien und Biochemikalien sind im Anhang, Tab. A1 und A2, aufgeführt.

3.2.1 Oberflächenantigenfärbungen

Jeder Zelltyp hat sein spezifisches Oberflächenantigenmuster entsprechend

dem er zu identifizieren ist. Diese Oberflächenantigene werden nach der „cluster of

differentiation“-Klassifikation (CD) in Kombination mit einer Zahl eingeteilt. Hierbei gibt

die zugeordnete Zahl die Reihenfolge der Zuordnung zur CD-Nomenklatur wieder. Alle

Leukozyten haben das an der Oberfläche exprimierte „leukocyte common antigen“,

kurz CD45. Monozyten besitzen zusätzlich das für sie typische Oberflächenantigen

CD14. Zur durchflusszytometrischen Bestimmung des Anteils an CD14+ Monozyten in

peripherem Blut wurde die Blutprobe mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen

CD14 und CD45 gefärbt. Die bei der Antikörperherstellung verwendeten Klone und die

an die Antikörper gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe sind in Tab. 1 aufgeführt.


Tab. 1: Fluoreszenzfarbstoffe und Klone der verwendeten Antikörper.

Antikö rper Klon Fluoreszenzfar bstoff

CD45 HI30 PE

CD14 M5E2 APC

Entsprechend des Färbeprotokolls des Herstellers werden vor der Färbung mit

Antikörpern gegen Oberflächenantigene die Erythrozyten mit PharM-LyseTM bei Raum-

temperatur im Dunkeln lysiert. Nach anschließendem zweimaligem Waschen mit PBS

(Phosphat-gepufferte Salzlösung) und Zentrifugieren mit 500x g für fünf Minuten wird

das Sediment mit 200µl PBS und 5µl des gewünschten Antikörpers pro 1x106 Leukozy-

ten bei 4°C im Dunkeln für 25 Minuten inkubiert. Ab schließend wird die Probe zweimal

mit PBS gewaschen und zur durchflusszytometrischen Messung mit PBS versetzt oder

das Sediment zu weiteren Färbungen verwendet.

3.2.2 Nachweis und Messung von Nekrose und Apoptose

3.2.2.1 Nekrose und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)

7-AAD ist ein Farbstoff, der hochspezifisch an DNS bindet. Bei intakter Plas-

mamembran dringen die Farbstoffe nicht in die Zelle ein. Es kommt zu keiner Färbung.

Bei Verlust der Membranintegrität können 7-AAD-Moleküle durch die löchrige Memb-

ran in die Zelle eindringen und eine Kernfärbung bewirken. Typischerweise ist bei der

Nekrose oder bei der späten Apoptose ein Verlust der Membranintegrität zu finden.

Daher dient diese Färbung als hochspezifischer Nachweis für tote Zellen. Die maxima-

le Fluoreszenzemission von 7-AAD liegt bei 610nm. Das Färbeprotokoll sieht eine Fär-

bung ausschließlich in Kombination mit Annexin V vor. Der Ablauf der Färbung wird

unter dem entsprechenden Unterpunkt erläutert.

3.2.2.2 Apoptose, Phosphatidylserin-Switch und Anne xin V

Wie unter I. 3.2.1 beschrieben kommt es schon früh im Verlauf der Apoptose zu

einem sogenannten Phosphatidylserin-Switch, bei dem Phosphatidylserin vom inneren

Blatt der Plasmamembran auf das äußere wechselt. Annexin V, ursprünglich „vascular

anticoagulant alpha“ (VAC alpha) genannt, bindet spezifisch an Phosphatidylserin [2].

Durch die Koppelung an FITC werden Zellen mit externalisiertem Phosphatidylserin,

also apoptotische Zellen, im Durchflusszytometer dedektierbar. Bei der Nekrose kommt

es zum Verlust der Membranintegrität, wobei die Membran porös wird. Annexin V bin-

det somit auch an nekrotische Zellen, im Gegensatz zur Apoptose aber von intrazellu-

lär. Um einen eventuell beginnenden Zerfall der Plasmamembran nachzuweisen und


so zwischen Apoptose und Nekrose unterscheiden zu können, erfolgt die gleichzeitige

Färbung von Annexin V und 7-AAD [13, 20, 24, 66]. Dadurch ergeben sich die vier in

Tab. 2 aufgezeigten Möglichkeiten, wie die Zielzellen gefärbt sein können.

Tab. 2: Mögliche Messergebnisse bei gleichzeitiger Färbung mit Annexin V und 7-AAD.

Mögliche Kombinationen für A nnexin -V und 7 -AAD Interpretation der Fä rbung

Annexin V– / 7-AAD– vitale Zellen

Annexin V+ / 7-AAD– (Früh-) Apoptose

Annexin V– / 7-AAD+ Messfehler

Annexin V+ / 7-AAD+ Nekrose / Spätapoptose

Aus den Bindungseigenschaften von Annexin V und 7-AAD ergibt sich, dass ei-

ne gleichzeitige Bindung an 7-AAD ohne Bindung von Annexin V nicht möglich ist.

Damit spricht das Ausbleiben von Annexin V–/7-AAD+ Ereignissen für eine qualitativ

hochwertige Messung. Die Färbung mit Annexin V erfolgt nach der Färbung mit Anti-

körpern gegen Oberflächenantigene. Nach letztmaligem Waschen der Zellen wird das

Sediment mit 1ml Bindungspuffer (1x) pro 1x106 Leukozyten versetzt. Davon werden

100µl bei Raumtemperatur im Dunkeln mit je 5µl Annexin V und 7-AAD inkubiert, an-

schließend mit 400µl unverdünntem Bindungspuffer versetzt und durchflusszytomet-

risch gemessen.

3.3 Instrument Settings

In dieser Arbeit wurden die Zellen mit vier Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt. Wie

unter 3.1 angeführt hat jeder Farbstoff ein photometrisches Intensitätsmaximum mit der

Wellenlänge des nach Aktivierung emittierten Lichts. Die Farbstoffe wurden so gewählt,

dass sich die Wellenlängen der Intensitätsmaxima der einzelnen Farbstoffe unter-

scheiden. Da aber die Farbstoffe nicht monochromes Licht mit ausschließlich einer

Wellenlänge, sondern zusätzlich Licht verschiedener Wellenlängen mit reduzierter In-

tensität emittieren, kommt es zu Überschneidungen der zusätzlich zum Intensitätsma-

ximum emittierten Wellenlängen zwischen den verschiedenen Farbstoffen. Beispiels-

weise emittiert der Farbstoff A auch Licht der Wellenlänge des Intensitätsmaximums

des Farbstoffes B. Dadurch werden falsch positive Ereignisse am die Wellenlänge des

Farbstoffes B registrierenden Sensors aufgezeichnet. Um diese falsch positiven Mess-

werte auszuschließen müssen in der verwendeten Computer-Software die Messungen

der Sensoren gegeneinander abgeglichen werden. Diese gegenseitige Kompensation

der Sensoren wird in den Geräteeinstellungen des Durchflusszytometers festgelegt.

Hier kann auch festgelegt werden, ob Messereignisse bis zu einer bestimmten Größe


Abb.8: Gates von Lymphozyten und Mo-

nozyten (a) nach morphologischen

Eigenschaften und (b) in Abhängig-

keit ihrer Oberflächenantigene

ausgeschlossen werden sollen („Treshold“) oder ob die Signale verstärkt werden sol-

len. Die verwendeten Geräteeinstellungen des Durchflusszytometers und die Kompen-

sationseinstellungen der Parameter FL1 bis FL4 sind in Tabelle 3 aufgeführt. Als

Treshold war bei allen Messungen der Parameter FSC auf den Wert 175 eingestellt.

Tab. 3: Verwendete Geräteeinstellungen am Durchflusszytometer

Detector Voltage AmpGain Mode Compensation

FSC E00 1,11 Linear -

SSC 361 1,16 Linear -

FL1 520 1.00 Logarithmisch - 0,9% FL2




3.4 Auswertung der Messungen

3.4.1 Festlegen der Gates der durchflusszytometrisc hen Messungen

3.4.1.1 Antikörperfärbungen gegen Oberflächenantige ne

Lymphozyten und Monozyten wur-

den entsprechend ihrer morphologischen

Eigenschaften im FSC-SSC-Blot gegatet.

Monozyten sind größer, haben eine höhe-

re Granularität als Lymphozyten und lie-

gen daher bei höheren FSC- und SSC-

Werten (Abb. 8a). Zur genauen Differen-

zierung wurden zusätzlich Populationen

entsprechend ihrer Oberflächenantigenei-

genschaften gegated: CD45+CD14– für

Lymphozyten, CD45+CD14+ für Monozy-

ten (Abb. 8b). Als Lymphozyten bzw. Mo-

nozyten wurden Events bezeichnet, die

sowohl die typischen morphologischen

Eigenschaften (Abb. 8a, R1: Lymphozy-

ten, R2: Monozyten) als auch die entspre-

chenden Färbeeigenschaften der Oberflä-

chenantigene (Abb. 8b, R3: Lymphozyten,

R4: Monozyten) aufwiesen.


3.4.1.2 Färbungen mit Annexin V und 7-AAD

Wie in Tab. 2 (Seite 24) aufgezeigt, gibt es vier mögliche Kombinationen bei der

Färbung mit Annexin V und 7-AAD. Die Einteilung der gemessenen Ereignisse erfolgt

daher am besten mit Hilfe von Quadranten (Abb. 9). Wie bereits dargestellt, gelten An-

nexin V+/7-AAD+ Zellen als spät-apoptotisch bzw. nekrotisch, da die Färbung mit 7-

AAD ein Kernfärbung ist. Diese nur stattfinden kann, wenn die Zellmembran einer Zelle

undicht wird, so wie es während der Nekrose oder in späten Stadien der Apoptose ge-

schieht. Zellen die Annexin V+, aber 7-AAD- sind, gelten somit als früh-apoptotisch

bzw. apoptotisch.

Da aber bei der Zuordnung der durchflusszytometrisch registrierten Ereignisse

zu Lymphozyten und Monozyten nicht nur die Färbeeigenschaften gegen Oberflä-

chenantigene der jeweiligen Zellen, sondern auch deren Größe und Granularität be-

achtet wurden, konnten keine Annexin V+/7-AAD+ Lymphozyten oder Monozyten dar-

gestellt werden. Wie unter Punkt 3 der Einleitung beschrieben, ändert sich im Verlauf

der Apoptose und der Nekrose die Zellmorphologie. Die Zellen fallen also aus den für

sie typischen Regionen (Abb. 8a, R1: Lymphozyten, R2: Monozyten) heraus und wer-

den so nicht in die Auswertung einbezogen. Dies hat zwei Folgen: zum einen können

die bei dieser Gating-Strategie die als Lymphozyten beziehungsweise Monozyten be-

zeichneten Events allein bezüglich ihrer Annexin V - Färbeeigenschaften bewertet wer-

den, da, wie eben beschrieben, weder Lymphozyten noch Monozyten 7-AAD-positiv

sein können. Bei der Differenzierung zwischen Annexin V-negativ und Annexin V-

positiv kann somit auch auf ein Histogramm, welches eine eindeutigere graphische

Abb. 9: Einteilung in Quadranten nach Annexin V-

und 7-AAD- Doppelfärbung.


Abb. 11: Gaten von Lymphozyten und Monozy-

ten unabhängig ihrer Morphologie.

Verteilung der registrierten Ereignisse ermöglicht, zurückgegriffen werden (Abb. 10).

Der erste Peak des Histogramms gilt als Annexin V-negativ, die Trennmarke ist rechts

der Basis dieses Peaks zu setzen. Alle Events, die rechts dieser Trennmarke sind gel-

ten als Annexin V-positiv und somit als apoptotisch.

Zum anderen muss eine weitere Gating-Strategie hinzugezogen werden um die

Darstellung von 7-AAD-positiven Ereignissen zu ermöglichen. Die durchflusszytomet-

risch gemessenen Ereignisse werden wieder in Lymphozyten und Monozyten unter-

schieden, allerdings nur bezüglich

ihrer Oberflächenantigenfärbeeigen-

schaften, nicht bezüglich ihrer Mor-

phologie (Abb. 11). Dadurch verliert

die Auswertung Präzision, da zum

Teil auch Konglomerate von Zell-

Detritus als Zellen gewertet werden.

Allerdings werden Zellen mit apopto-

tisch oder nekrotisch bedingter Ver-

änderung der Morphologie nicht aus-

geschlossen. Die so gegateten Er-

eignisse werden nun in einem An-

nexin V/7-AAD-Boxplot angezeigt.

Abb. 10: Histogramm zur Unterscheidung zwischen Annexin V-negativen und posi-

tiven Events


Da die Aufteilung in Annexin V-/7-AAD- und Annexin V+/7-AAD- bereits erfolgte, wer-

den hierbei lediglich die Annexin V+/7-AAD+ Ereignisse bewertet und der prozentuelle

Anteil an Lymphozyten beziehungsweise Monozyten angegeben.

3.4.2 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm PASW, Version 18. Mit

Hilfe der explorativen Datenanalyse wurden Mittelwert, Standardabweichung, Spann-

weite und Median berechnet. Der Test auf Normalverteilung der Daten erfolgte nach

Kolmogorov [33]. Zum Vergleich der Daten der Apheresemethoden und der Daten zu

den verschiedenen Zeitpunkten nach Spende wurde das generalisierte lineare Model

verwendet, gefolgt von post-hoc-Tests entsprechend der Methode von Sidak zur An-

passung der p-Werte [23]. Um den Zusammenhang zwischen verschiedenen Variablen

zu erfassen wurde der Korrelationskoeffizient nach Pearson verwendet [43]. Alle Hypo-

thesentests waren zweiseitig und wurden als signifikant angesehen, wenn die p-Werte

kleiner als 0,05 waren und als hochsignifikant, wenn die p-Werte kleiner als 0,01 wa-

ren.

4. Verwendete Formeln

a. Totales Blutvolumen (TBV), Berechnung nach Nadler [39]:

♂: TBV = (0,3669 x (Größe in m)3 + 0,03219 x (Gewicht in kg) + 0,6041) x 1000 [l]

♀: TBV = (0,3561 x (Größe in m)3 + 0,03308 x (Gewicht in kg) + 0,1833) x 1000 [l]

b. Body Mass Index (BMI):

BMI = (Gewicht in kg) / (Größe in m)2 [kg/m2]

c. Zellgehalt eines Blutproduktes:

Zellgehalt = (Zell-Konzentration in Zellen / ml) x (Produktvolumen in ml)

5. Versuchsreihen zur Beantwortung der Fragestellun gen

5.1 Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweie r Zellseparatoren

Es wurde in einer 2007 veröffentlichten Studie über Leukozytenreduktionskam-

mern des Trima Accel® Zellseparators von einer hervorragenden Menge und Qualität

mononukleärer Zellen des peripheren Blutes in den Kammern berichtet. [6] Wie unter

Material und Methoden, Punkt 1.3 beschrieben wird beim COBE® Spectra Zellsepara-

tor ebenfalls eine geometrisch gleich geformte Leukozytenreduktionskammer zur Leu-

kozytenreduktion verwendet. Eventuelle Unterschiede zwischen dem Blut aus den


Leukozytenreduktionskammern beider Zellseparatoren wurden untersucht, indem der

Gehalt von Leukozyten, mononukleären Zellen und Restzellen von zehn Leukozyten-

reduktionskammern der COBE® Spectra und von 27 Leukozytenreduktionskammern

der Trima Accel® analysiert wurden. Die Auswahl der Spender der Thrombozytaphe-

resen, deren Leukozytenreduktionskammern verwendet wurden, war zufällig. Innerhalb

eines Zeitraums von zwei Stunden nach der Thrombozytapherese wurde der Inhalt der

gefüllten Leukozytenreduktionskammern in Röhrchen mit dem Volumen 20 ml über-

führt. Die Zellkonzentrationen wurden mit dem ADVIA120 bestimmt, der prozentuelle

Anteil mononukleärer Zellen durchflusszytometrisch entsprechend der oben beschrie-

benen Färbemethoden gegen Oberflächenantigene (Material und Methoden, Punkt

3.2.1).

5.2 Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenredu ktionskammern

Um eventuelle Einflüsse auf den Gehalt mononukleärer Zellen in den Leukozy-

tenreduktionskammern sowie auf die Qualität der Zellen im Sinne einer Zellschädigung

durch unterschiedliche Spendeparameter wie z.B. die Spendedauer, zu erkennen soll-

ten die Leukozytenreduktionskammern des Trima Accel® Zellseparators nach einfa-

chen Thrombozytapheresen (E-TA) mit denen nach doppelten Thrombozytapheresen

(D-TA) des selben Geräts verglichen werden. Des Weiteren sollte das Blut der Leuko-

zytenreduktionskammern kurzzeitgelagert werden, um aus einer eventuell zu beobach-

tenden Dynamik innerhalb des Blutes, wie Änderungen des Zellgehalts oder des An-

teils geschädigter Zellen, Aussagen zur Qualität der aus Leukozytenreduktionskam-

mern gewonnenen Zellen zu treffen. Dazu wurden je neun Leukozytenreduktionskam-

mern nach E-TA und nach D-TA innerhalb eines Zeitraums von maximal einer Stunde

nach Spende in PVC-Beutel unter aseptischen Bedingungen umgefüllt. Die Auswahl

der Thrombozytapheresen, deren Leukozytenreduktionskammern verwendet wurden,

erfolgte zufällig. Die mit dem Blut der Leukozytenreduktionskammern gefüllten Beutel

wurden für 72 Stunden entsprechend der unter Material und Methoden, Punkt 2 ange-

führten Bedingungen gelagert. Zu den Messzeitpunkten 1 Stunde, 6 Stunden, 24 Stun-

den, 48 Stunden und 72 Stunden nach Ende der Apherese wurden über eine Kanüle

Proben mit je ca. 0,7 ml Blut aus dem gelagerten Material entnommen. Bestimmt wur-

den das Blutbild (Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten) mit dem ADVIA120

Zellzähler und durchflusszytometrisch der Anteil der CD45+, CD14+, Annexin V+ und

7-AAD+ Events.


5.3 Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Le ukapheresaten

Um Unterschiede zwischen der Qualität mononukleärer Zellen des peripheren

Bluts aus Leukozytenreduktionskammern und aus Leukapheresaten zu erforschen,

wurde Blut aus je sechs zufällig ausgewählten Leukozytenreduktionskammern nach

E-TA und nach D-TA sowie Proben aus sechs zufällig ausgewählten Leukapherese-

produkten entnommen. Innerhalb einer Stunde nach Ende der Apherese wurde dieses

Blut in PVC-Beutel umgefüllt und über 48 Stunden unter den unter Material und Me-

thoden, Punkt 2 beschriebenen Bedingungen gelagert. Zu den Messzeitpunkten 1

Stunde, 6 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach Ende der Apherese wurden über

eine Kanüle Proben mit je ca. 0,7 ml Blut aus dem gelagerten Material entnommen.

Bestimmt wurden das Blutbild mit dem ADVIA120 Zellzähler und der pH-Wert sowie

die Blutgase mit dem Abl-5. Außerdem wurden die Proben mit CD14-APC- und CD45-

PE- Antikörpern, mit Annexin-V-FITC und mit 7-AAD gefärbt und durchflusszytomet-

risch analysiert.

Ergebnisse 31

V. Ergebnisse

1. Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweie r Zellseparatoren

Die Ergebnisse des Vergleichs zwischen den Leukozytenreduktionskammern

der Trima Accel® und COBE® Spectra Zellseparatoren sind in den Tabellen 4 bis 6

dargestellt. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Apheresedaueren

der beiden Maschinen. Der erzielte Thrombozytengehalt in den Thrombozytenkonzent-

raten unterschied sich ebenfalls nicht signifikant. Allerdings musste, um eine vergleich-

bare Zahl von Thrombozyten zu gewinnen, bei der COBE® Spectra hochsignifikant

mehr Blut prozessiert werden als bei der Trima Accel® (Tab. 4). Die Leukozytenkon-

zentration im peripheren Venenblut der Spender war bei beiden Apheresemaschinen

nach der Spende im Mittel höher als vor der Spende, wobei keine Korrelation zwischen

dem Anstieg der Leukozytenkonzentration und apheresebezogenen Daten wie Aphe-

resedauer oder prozessierten Blutvolumen festgestellt werden konnte (Tab. 4).

Tab. 4: Vergleich von Parameter der Thrombozytapherese mit den Zellseparatoren Trima

Accel® und COBE® Spectra

Variable *

Median Spannweite Mittelwert ± Standardabwe i-

chung

Spendedauer (min) 1 54 38-91 57±15

2 68 43-90 67±18

Separationsvolumen (l) 1 3,20 1,95-4,19 3,21±0,68 ‡

2 4,56 3,10-6,44 4,61±1,25 ‡

Thrombozytengehalt in

Thrombapheresat (x1012/l)

1 5,65 2,29-6,67 4,82±1,47

2 5,51 2,37-7,58 5,18±2,06

Leukozytenkonzentration

vor Spende (x109/l)

1 5,6 3,4-7,5 5,52±1,01

2 5,9 4,5-7,3 6,01±0,89


nach Spende (x109/l)

1 6,4 3,7-10,4 6,40±1,44

2 6,6 4,6-8,3 6,60±1,17

* Leukozytenreduktionskammern von (1) Trima Accel® bzw. (2) COBE® Spectra

‡ p<0.05; Vergleich zwischen 1 und 2

Ergebnisse 32

Nach der Thrombozytapherese mit der COBE® Spectra waren die Leukozyten-

reduktionskammern mit einem hochsignifikant größeren Volumen gefüllt als nach der

Apherese mit der Trima Accel®. Allerdings waren die Konzentrationen und der Gehalt

an Leukozyten, an Thrombozyten und an Erythrozyten in den Leukozytenreduktions-

kammern der Trima Accel® um ein Vielfaches höher als in denen der COBE® Spectra

(Tab. 5). Der Leukozytengehalt in den Leukozytenreduktionskammern der Trima Ac-

cel® war um den Faktor 30 höher als der Leukozytengehalt in den Leukozytenredukti-

onskammern der COBE® Spectra.

Tab. 5: Daten der Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel® und der COBE® Spectra

Zellseparatoren

Variable * Median Spannweite Mittelwert ± Standardabwe i-

chung

Volumen (ml) 1 8,50 5,8-9,5 8,0±1,1 ‡

2 9,35 8,8-10,0 9,3±0,4 ‡


(x109/l)

1 112,1 65,2-205,2 122,6±38,8 ‡

2 3,09 0,85-8,86 3,37±2,31 ‡

Leukozyten, Zellgehalt

(x109)

1 0,93 ,054-1,76 0,98±0,33 ‡

2 0,03 0,008-0,084 0,032±0,022 ‡

Thrombozytenkonzen-

tration (x1012/l)

1 2,33 1,40-4,90 2,51±0,97 ‡

2 0,53 0,32-0,63 0,50±0,10 ‡

Thrombozyten, Zellgehalt

(1010)

1 1,74 0,86-4,21 2,04±0,92 ‡

2 0,48 0,28-0,58 0,47±0,09 ‡

Hämatokrit (%) 1 58,0 2,7-64,8 52,1±17,7 ‡

2 6,60 4,5-26,5 8,7±6,4 ‡

Erythrozytenkonzentration

(x1012/l)

1 5,99 0,30-7,31 5,53±1,90 ‡

2 0,68 0,392,87 0,90±0,71 ‡



Unterschiede bezüglich der Messwerte der Konzentration und des Gehalts der

mononukläeren Zellen in den Leukozytenreduktionskammern stellten sich weniger ein-

deutig dar: es wurden weder signifikante Unterschiede zwischen dem Anteil der mono-

nukleären Zellen noch zwischen dem Anteil der Lymphozyten der jeweiligen Leukozy-

tenreduktionskammern festgestellt. Dagegen war der prozentuelle Anteil der Monozy-

ten an den Leukozyten im Blut der Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel®

Ergebnisse 33

signifikant höher als in denen der COBE® Spectra (Tab. 6). Der absolute Zellgehalt der

mononukleären Zellen, der Lymphozyten und der Monozyten war in den Leukozyten-

reduktionskammern der Trima Accel® hochsignifikant höher als in denen der COBE®

Spectra. Auffällig an den Messwerten der Leukozytenreduktionskammern ist deren

große Streubreite unabhängig vom Zellseparator. Der kleinste und der größte gemes-

sene Wert zum Beispiel des Monozytengehalts unterschieden sich in Leukozytenre-

duktionskammern der Trima Accel® um ca. das zwanzigfache, in Leukozytenredukti-

onskammern der COBE® Spectra um ca. das zehnfache.

Tab. 6: Anteil und Zellgehalt mononukleärer Zellen in Leukozytenreduktionskammern der

Zellseparatoren Trima Accel® und der COBE® Spectra

Variable * Median Spannweite Mittelwert ± Standardabwe i-

chung

CD14+ Monozyten (%) 1 17,6 1,25-25,3 16,7±5,6 †

2 10,3 2,15-25,1 11,5±6,2 †

CD14+ Monozyten, Zell-

gehalt (x108)

1 1,60 0,22-3,16 1,60±0,74 ‡

2 0,03 0,008-0,12 0,037±0,036 ‡

Lymphozyten (%) 1 56,3 40,7-64,2 54,8±6,79

2 53,3 30,3-73,6 54,1±14,2

Lymphozyten, Zellgehalt

(x108)

1 5,33 2,50-8,38 5,33±1,72 ‡

2 0,14 0,023-0,62 0,186±0,168 ‡

Mononukleäre Zellenge-

samt (%)

1 72,9 42,0-83,6 71,5±8,5

2 68,9 35,5-82,9 65,5±15,7

Mononukleäre Zellen ge-

samt, Zellgehalt (x108)

1 7,14 3,47-11,0 6,93±2,16 ‡

2 0,16 0,03-0,70 0,22±0,19 ‡


† p<0.05; Vergleich zwischen 1 und 2


2. Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduk tionskammern

Die Ergebnisse des Vergleichs von Leukozytenreduktionskammern nach einfa-

chen (E-TA) und doppelten (D-TA) Thrombozytapheresen sind in den Tabellen 7, 8

und A3 (Anhang, S. 59) aufgeführt. Die Spender der beiden Spendearten E-TA und D-

TA wiesen keine signifikanten Unterschiede bezüglich ihres Alters, ihres Body-Mass-

Index (BMI) und ihres totalen Blutvolumens auf. Die Blutspender waren zwischen 21

Ergebnisse 34

und 49 Jahre alt. Der BMI schwankte zwischen 20,9 kg/m2 und 29,1 kg/m2. Das Ge-

wicht der Spender variierte zwischen 57 kg und 108kg, die Körpergröße zwischen

164 cm und 200cm. Das totale Blutvolumen (TBV) schwankte zwischen 3669 ml und

7016 ml. Entsprechend der Spendevoraussetzungen für die doppelte Thrombozytaphe-

rese war die peripher-venöse Thrombozytenkonzentration der Spender in der Gruppe

der D-TA-Spender signifikant höher als in der Gruppe der E-TA-Spender. Gleichzeitig

zeigte aber auch die Leukozytenkonzentration im peripher-venösen Blut der Spender

von D-TA eine signifikante Erhöhung im Vergleich zu den Spendern der E-TA (Tab. 7).

Tab. 7: Spenderbezogene Daten der Thrombozytapherese mit dem Zellseparator Trima

Accel®

Variable

(Mittelwert ± Standardabweichung)

E-TA

(N=9)

D-TA

(N=9) p-Wert

Alter der Spender (Jahre) 34,4±8,7 30,8±10,7 0,437

BMI (kg/m2) 24,8±2,7 24,8±2,1 0,690

Totales Blutvolumen (L) 5,02±1,07 5,09±0,68 0,858

Leukozytenkonzentration vor Spende (x 106/mL) 5,31±0,79 6,13±0,85 0,047*

Thrombozytenkonzentration vor Spende (x 106/mL) 226±23 286±49 0,006†

* signifikant (p<0.05)

† hochsignifikant (p<0.01)

Wie zu erwarten dauerte die Spende von D-TA signifikant länger als die der

E-TA. Allerdings wurde für das Sammeln von zwei Thrombozytenkonzentraten bei D-

TA nicht das Doppelte, sondern nur das 1,5-fache der Zeit einer E-TA benötigt. In den

Thrombozytapheresaten der D-TA wurde ein hochsignifikant höherer Thrombozyten-

gehalt erzielt verglichen mit den Thrombozytapheresaten der E-TA. Auch das prozes-

sierte Blutvolumen (PBV) war bei D-TA hochsignifikant höher als bei E-TA. Bei der

Herstellung von E-TA schwankte das PBV zwischen 2040 ml und 2643 ml, bei D-TA

zwischen 2913 ml und 4263 ml (Tab. 8, S. 35). In den Leukozytenreduktionskammern

der beiden Spendearten E-TA und D-TA unterschieden sich die Leukozytenkonzentra-

tionen hochsignifikant, wobei die Leukozytenreduktionskammern der D-TA höhere

Werte zeigten. Entsprechend verhielt es sich mit dem Leukozytengehalt der Leukozy-

tenreduktionskammern nach E-TA (0,93 ± 0,32 x109 Leukozyten) und nach D-TA

(1,71 ± 0,55 x109 Leukozyten). Der Leukozytengehalt in Thrombozytenkonzentraten

war in denen der D-TA (0,102 ± 0,288 x106 Leukozyten) ebenfalls signifikant höher als

in denen der E-TA (0,006 ± 0,011 x 106 Leukozyten).

Ergebnisse 35

Tab. 8: Apheresebezogenen Daten der Thrombozytapherese mit dem Zellseparator Trima

Accel®

Variable

(Mittelwert ± Standardabweichung)

E-TA

(N=9)

D-TA

(N=9) p-Wert

Spendedauer (min) 40±2 57±6 <0,001†

Prozessiertes Blutvolumen (L) 2,15±0,18 3,27±0,43 <0,001†

ACD-A (mL) 266±22 391±49 <0,001†

Volumen Thrompozytenkonzentrat (mL) 2,15±0,18 3,27±0,43 <0,001†

Thrombozytengehalt im Konzentrat (x 1011) 3,03±0,25 6,01±0,96 <0,001†

Leukozytenkonzentration in LRSC (x 106/mL) 93,03±32,23 170,7±54,6 0,002†

Thrombozytenkonzentration in LRSC (x 106/mL) 1429±561 1854±386 0,080

Erythrozytenkonzentration in LRSC (x109/mL) 6,48±0,70 6,40±0,39 0,749

* signifikant (p<0.05)

† hochsignifikant (p<0.01)

Es fiel auf, dass das bei der Thrombozytapherese prozessierte Blutvolumen

signifikant und sehr gut direkt mit der Leukozytenkonzentration in den Leukozytenre-

duktionskammern korrelierte (R2 = 0,75; p < 0,001) (Abb. 12). Dagegen konnte keine

Korrelation zwischen spenderbezogenen Daten (TBV, BMI, Leukozytenkonzentration

vor der Spende) und der Leukozytenkonzentration in den Leukozytenreduktionskam-

mern fest-gestellt werden.

Abb. 12: Korrelation zwischen prozessiertem Blutvolumen (mL) und Leuko-

zytenkonzentration (x 106/mL).

Ergebnisse 36

Bezüglich der Thrombozytenkonzentration wurden weder in den Thrombozy-

tenkonzentraten (E-TA, 1208 ± 78 x106/ml; D-TA, 1128 ± 78 x106/ml; p=0,058) noch in

den Leukozytenreduktionskammern signifikante Unterschiede zwischen den beiden

Spendearten E-TA und D-TA gefunden. Allerdings ist sowohl im Blut der Thrombozy-

tenkonzentrate als auch im Blut der Leukozytenreduktionskammern eine Tendenz zu

höheren Werten der Thrombozytenkonzentrtaion nach doppelter Thrombozytapherese

zu erkennen. Bei der Herstellung von E-TA wurde in mehr Fällen und damit mit einem

größeren Gesamtvolumen Plasma parallel zum Thrombozytenkonzentrat gesammelt

(n=9, 400 ± 108 ml) als bei der Herstellung von D-TA (n=6, 194 ± 8 ml). In den Leuko-

zytenreduktionskammern nach E-TA mit unterschiedlichen Volumina von nebenher

gesammeltem Plasma (298 ± 52 ml im Gegensatz zu 482 ± 49 ml, p=0,01) unterschie-

den sich der Gehalt an Leukozyten und der Gehalt mononukleärer Zellen nur gering

und nicht signifikant.

Tabelle A3 (Anhang, S. 59) zeigt die Ergebnisse der durchflusszytometrischen

Messungen im Verlauf der Lagerung über 72 Stunden. Die Leukozytenkonzentration

blieb ebenso wie die Lymphozytenkonzentration über die gesamte Lagerdauer auf ei-

nem stabilen Niveau. Die Monozytenkonzentration fiel dagegen nach einer Lagerdauer

von 48 Stunden signifikant auf etwa die Hälfte des Ausgangswertes ab. Der Anteil an

Annexin V+/7-AAD– Lymphozyten aus Leukozytenreduktionskammern sowohl von E-

TA als auch von D-TA schwankte während der Lagerung ohne signifikante Unterschie-

de zwischen 21% und 28%. Zwischen E-TA und D-TA waren hier ebenfalls keine signi-

fikanten Unterschiede festzustellen. Dagegen stieg der Anteil an Annexin V+/7-AAD+

Lymphozyten signifikant während der Lagerung der Zellen aus Leukozytenreduktions-

kammern nach E-TA von 1,97% ± 0,96% (1 Stunde) auf 17,41% ± 10,02% (72 Stun-

den) beziehungsweise aus denen nach D-TA von 4,34% ± 2,28% (1 Stunde) auf

25,23% ± 18,35% (72 Stunden) an. Der prozentuelle Anteil von CD14+ Monozyten an

Leukozyten war in den Leukozytenreduktionskammern der D-TA hochsignifikant höher

als in denen der E-TA. Zwischen den Messzeitpunkten nach 48 Stunden und nach 72

Stunden fiel die Konzentration der gelagerten CD14+ Monozyten signifikant verglichen

zum Ausgangswert ab: in E-TA um 38% (p<0,01), in D-TA um 47% (p<0,01). Bezüglich

der Bindung von Annexin V an Monozyten zeigte sich direkt nach der Thrombozyta-

pherese eine hohe Bindungsrate (E-TA, 48,48% ± 8,83%; D-TA, 39,12% ± 10,97%),

die binnen 24-stündiger Lagerung in E-TA um 19% auf 29,88% ± 5,93% (p<0,01), in D-

TA um 8% auf 31,44% ± 7,50% abfiel. Im weiteren Verlauf der Lagerung stieg der An-

teil Annexin V+/7-AAD– Monozyten kontinuierlich bis auf ca. 70% in den Produkten

beider Spendearten an (Abb. 13).

Ergebnisse 37

Im Gegensatz zum hohen Anteil an Annexin V+/7-AAD– Monozyten sofort nach

Spende war der Anteil der spät-apoptotischen bzw. nekrotischen (Annexin V+/7-AAD+)

Monozyten innerhalb der ersten 24 Stunden der Lagerung stabil auf niedrigem Niveau

und stieg erst im Verlauf an (Abb. 14).

Abb. 14: Veränderung des Anteils Annexin V+/7-AAD+ mononukleärer Zellen (links Lympho-

zyten, rechts Monozyten) in Relation zum Ausgangswert.

Die Tendenz eines ersten Anstieges des Anteils der spät-apoptotischen bezie-

hungsweise nekrotischen Monozyten war zum Messzeitpunkt 48 Stunden zu verzeich-

nen. Signifikant wurde der Anstieg erst zwischen den Messungen 48 Stunden und 72

Stunden nach Beginn der Lagerung, wobei hier der Anteil spät-apoptotischer bezie-

Abb. 13: Änderung der Annexin V+/7-AAD– Monozyten (%)

im Verlauf der Lagerung über 72 Stunden.

Ergebnisse 38

hungsweise nekrotischer Monozyten aus Leukozytenreduktionskammern von E-TA auf

das 5,3-fache des Ausgangswertes anstieg, aus denen von D-TA auf das 4,2-fache

(Abb. 14, Seite 37). Insgesamt war nach einer Lagerdauer von 72 Stunden der Anteil

spät-apoptotischer beziehungsweise nekrotischer mononukleärer Zellen im Blut der

Leukozytenreduktionskammern nach D-TA signifikant höher als in dem der Leukozy-

tenreduktionskammern nach E-TA.

3. Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Le ukapheresaten

Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in den Tabellen 9 und A4 (Anhang,

S. 60) aufgeführt. Zwischen den spenderbezogenen Daten, z.B. Alter und totales Blut-

volumen, der Leukozytenreduktionskammern der E-TA, der D-TA und denen der

Leukapherisate wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden. Dagegen waren

die Spendedauer, das prozessierte Blutvolumen sowie das verwendete ACD-A-

Volumen der Thrombozytapheresen sowohl bei E-TA als auch bei D-TA signifikant

geringer als die der Leukozytapherese. (Tab. 9)

Tab. 9: Spende- und Produktdaten von Leukozytenreduktionskammern und Leukapherisa-

ten

Variable (Mittelwert ±

Standardabweichung)

LRSC, E-TA

(N=6)

LRSC, D-TA

(N=6)

Leukapher isat

(N=6)

Spenderalter (Jahre) 31,7±9,3 33,3±8,2 33,2±12,5

Totales Blut Volumen (L) 5,65±0,69 4,69±0,92 4,92±0,73

Spendedauer (min) 41,7±3,7* 58,0±12,2† 115,0±13,6*†

Prozessiertes Blut Volumen (mL) 2662±250* 3433±657† 4877±678*†

ACD – A (mL) 295,2±28,0* 367,5±67,6† 487,3±67,3*†

Gelagertes Volumen (ml) 7,90±0,34 8,08±0,47 9,03±2,20

WBC in der Probe (x 109 / L) 118,6±40,2* 143,8±57,2† 62,6±19,8*†

PLT in der Probe (x 109 / L) 2079±512* 1772±833† 3927±812*†

RBC in Probe (x 1012 / L) 6,46±0,35* 6,68±0,61† 1,26±0,25*†

* p<0.05; gepaarter Vergleich zwischen E-TA und Leukapherese

† p<0.05; gepaarter Vergleich zwischen D-TA und Leukapherese

Tabelle A4 (Anhang, S. 60) zeigt den Verlauf des Zellgehalts sowie des Anteils

apoptotischer und nekrotischer mononukleärer Zellen während der Kurzzeitlagerung

über 48 Stunden. Die beim Vergleich von Zellen aus Leukozytenreduktionskammern

Ergebnisse 39

von E-TA mit denen von D-TA unter Ergebnisse, Punkt 2. beschriebenen Unterschiede

konnten tendenziell reproduziert werden, in dieser Stichprobe allerdings ohne den

Nachweis der vorbeschriebenen Signifikanzniveaus. Weiterhin wurden keine signifikan-

ten Unterschiede zwischen den Zellen der Leukozytenreduktionskammern der E-TA

und denen der D-TA gefunden.

Dagegen war in den Proben der Leukapheresate der sofort nach der Spende

gemessene Anteil von Annexin V+/7-AAD- Lymphozyten im Vergleich zu dem der Leu-

kozytenreduktionskammern doppelt so hoch (E-TA: p=0,005; D-TA: p=0,001). Der An-

teil an Annexin V+/7-AAD- Monozyten zeigte in Leukapherisaten verglichen mit den

Leukozytenreduktionskammern ebenfalls höhere Werte, ohne jedoch signifikante Un-

terschiede aufzuweisen. Der Anteil der Annexin V+/7-AAD-, früh-apoptotischen mono-

nukleären Zellen korrelierte in den Proben der Laukapherisate gut und hochsignifikant

mit dem Anteil der Annexin V+/7-AAD+, spät-apoptotischen bzw. nekrotischen mono-

nukleären Zellen (Lymphozyten: R2=0,770, p<0,001; Monozyten: R2=0,703, p<0,001)

(Abb. 15).

Abb. 15: Korrelation zwischen Annexin V+/7-AAD- und Annexin V+/7-AAD+ mononukleären

Zellen aus Leukapherisaten. Links Lymphozyten, rechts Monozyten.

Während der Lagerung zeigte sich in den Proben der Leukapherisate zwischen

den Messzeitpunkten sechs Stunden und 24 Stunden ein erster, nicht signifikanter An-

stieg des Anteils der Annexin V+/7-AAD+ mononukleären Zellen verglichen mit dem

Ausgangswert (Lymphozyten: t = 1 Stunde, 0,5% ± 0,2% gegenüber t = 24 Stunden,

4,7% ± 2,4%, p>0,05; Monozyten: t = 1 Stunde, 1,9% ± 1,3% gegenüber t = 24 Stun-

den, 7,0% ± 5,3%, p>0,05). Nach einer Lagerung von 48 Stunden war der Anteil der

Annexin V+/7-AAD+ mononukleären Zellen des peripheren Bluts signifikant höher als

Ergebnisse 40

der anfängliche Wert nach der Apherese (Lymphozyten: p<0,001; Monozyten:

p<0,001). Dagegen blieb der Anteil der Annexin V+/7-AAD+ mononukleären Zellen aus

dem Blut der Leukozytenreduktionskammern über die gesamte Lagerdauer auf einem

stabilen Niveau ohne signifikante Unterschiede (Tab. A4, Anhang S. 60). Nach einer

Lagerdauer von 48 Stunden waren sowohl der Anteil der Annexin V+/7-AAD– als auch

der Anteil der Annexin V+/7-AAD+ mononukleären Zellen aus Proben der Leukaphere-

sate signifikant höher als im gelagerten Blut der Leukozytenreduktionskammern (E-TA

und D-TA). Gleichzeitig fiel der Anteil und die Konzentration der CD 45+ Lymphozyten

und der CD14+ Monozyten im Blut der Leukapheresate signifikant ab Dagegen verän-

derten sich die Anteile der mononukleären Zellen in den Leukozytenreduktionskam-

mern während der gesamten Lagerdauer nicht.

Des Weiteren war zu beobachten, dass der pH-Wert sowohl im Blut der Leuko-

zytenreduktionskammern als auch im Blut der Leukapherisate innerhalb einer Lager-

dauer von 24 Stunden signifikant abfiel. Allerdings war bereits zu diesem Zeitpunkt der

pH-Wert in Proben der Leukapherisate signifikant tiefer als in denen der Leukozytenre-

duktionskammern (E-TA und D-TA). Im gelagerten Blut der Leukozytenreduktions-

kammern stieg das pCO2 binnen der Lagerung von 24 Stunden stetig an und fiel da-

nach bis zum Messzeitpunkt 48 Stunden signifikant ab. Der pO2-Wert verhielt sich ge-

gengleich. Im gelagerten Blut der Leukapherisate fiel dagegen der pCO2-Wert von Be-

ginn an stetig ab, bei einem gleichzeitigen Anstieg des pO2-Wertes auf mehr als das

Doppelte des Ausgangswertes (Tab. A4, Anhang S. 60). In Blutprodukten der Leuka-

pherese konnte eine inverse Korrelation zwischen pH-Wert und dem Anteil der Annexin

V+/7-AAD+ mononukleären Zellen nachgewiesen werden (Lymphozyten: R2 = 0,761,

p<0,001; Monozyten: R2 = 0,673, p<0,001; Abb. 16).

Abb. 16: Korrelation zwischen Annexin V+/7-AAD+ mononukleären Zellen und dem pH-Wert.

Ergebnisse 41

Zusätzlich wurde eine inverse Korrelation zwischen der initialen Erythrozyten-

konzentration der Proben und dem Anstieg des Anteils der Annexin V+/7-AAD+ Mo-

nozyten nach einer Lagerung für 48 Stunden beobachtet (R2 = 0,766, p < 0,05) (Abb.

17).

Abb. 17: Korrelation zwischen der initialen Erythro-

zytenkonzentration und dem Anstieg des

Anteils der Annexin V+/7-AAD+ Monozyten

Diskussion 42

VI. Diskussion

1. Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweie r Zellseparatoren

In einer Studie wurden die Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel® und

der COBE® Spectra Zellseparatoren bezüglich ihres Zellgehalts verglichen. [59] Die am

häufigsten verwendete Quelle für Leukozyten des Menschen ist der Buffy Coat, der

Bestandteil des Blutes, den man nach Zentrifugation durch Abtrennen der Erythrozyten

erhält. Entsprechend Dietz et al. sind Leukozytenreduktionskammern eine weitere

Quelle, um Produkte mit einem hohen Leukozytengehalt und sehr guter Zellqualität zu

erhalten [15]. Allerdings konnten die Daten von Dietz et al. in dieser Arbeit nicht repro-

duziert werden. Die hier dargestellten Daten zeigen dagegen einen deutlich geringeren

Zellgehalt und eine deutlich stärkere Streuung innerhalb der Ergebnisse. Der Gehalt

mononukleärer Zellen in Leukozytenreduktionskammern des Trima Accel® Zellsepara-

tors war im Mittel 0,69 x109 Zellen, also um 66% geringer als die von Dietz et al. ge-

messenen Werte. Diese Unterschiede zur Studie von Dietz et al. könnten zum Beispiel

durch unterschiedliche Geräteeinstellungen der verwendeten Zellseparatoren hervor-

gerufen worden sein. Bei Dietz et al. waren das Antikoagulationsverhältnis 13:1 (hier

11:1), das „draw management“ war 3 (hier 6), das „return management“ 1 (hier 4) und

der maximale Fluss zum Gerät war auf „fast“ (schnell) eingestellt, in dieser Arbeit da-

gegen auf „medium“ (mittel). Auch unterschieden sich die Volumina des prozessierten

Blutes und die Spendedauer. Während Dietz et al. in 80 Minuten 4,25 l Blut prozessier-

ten, waren es hier nur 3,21 l in 54 Minuten. Dieser Unterschied ist wichtig, da die Leu-

kozytenreduktionskammern der TRIMA Accel® laut Herstellerangaben als voll gelten,

wenn ein Volumen von 4,7 l bei Spendern mit einem BMI < 30 kg/m2 beziehungsweise

von 4,1 l bei Spendern mit einem BMI > 30 kg/m2 prozessiert wurde. Durch die be-

schriebenen Unterschiede ist somit ein direkter Vergleich zwischen den hier dargestell-

ten Daten und denen von Dietz et al. nur bedingt möglich.

Durch die in dieser Arbeit gezeigten starken Schwankungen innerhalb der er-

zielten Zellkonzentrationen und dem erzielten Zellgehalt in den Leukozytenreduktions-

kammern muss die Eignung der Leukozytenreduktionskammern als Quelle für mono-

nukleäre Zellen zur Gewinnung dendritischer Zellen in Frage gestellt werden. Die Un-

beständigkeit des Zellgehalts kann zu einer Unbeständigkeit der Kultivierungsraten

führen. Mögliche Einflüsse auf die Beständigkeit des Zellgehalts in Leukozytenredukti-

onskammern könnten zum Beispiel im prozessierten Blutvolumen oder in unterschied-

lichen Patienteneigenschaften wie Alter oder BMI vermutet werden.

Diskussion 43

Zur Kultivierung von dendritischen Zellen aus mononukleären Zellen werden

nach dem derzeitigen Stand der Dinge mindestens 109 Monozyten benötigt [8]. In den

hier gezeigten Daten erzielten die Leukozytenreduktionskammern einen Monozytenge-

halt von maximal 31,6% des Mindestbedarfs, im Mittel sogar nur 16%. Damit reicht der

Zellgehalt der Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel® aktuell nicht aus, um

aus ihnen eine komplette Impfserie mit dendritischen Zellen herstellen zu können. Al-

lerdings könnte mit verbesserten Kultivierungsraten dendritischer Zellender Mindest-

zellgehalt für die Herstellung von Impfstoffen aus dendritischen Zellen zukünftig sinken.

Bemerkenswert ist, dass der Gehalt an Leukozyten in Leukozytenreduktions-

kammern der TRIMA Accel® 30-fach höher war als in denen der COBE® Spetra. Ver-

mutlich kommt es während oder gegen Ende der Thrombozytapherese mit der COBE®

Spectra zu einem Auswaschen der Zellen aus den Leukozytenreduktionskammern.

Weitere mögliche Ursachen für den geringen Zellgehalt können allgemeine Unter-

schiede in den Spendeprinzipien wie zum Beispiel die Dauer der Apherese, die Fluss-

geschwindigkeit oder das prozessierte Blutvolumen sein. Unabhängig von der Ursache

für den geringen Zellgehalt ist zusammen zu fassen, dass die Leukozytenreduktions-

kammern der COBE® Spectra im Gegensatz zu denen der Trima Accel® keine suffizi-

ente Quelle für Leukozyten und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes sind.

2. Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduk tionskammern

In einer Folgestudie wurde verglichen, ob sich der Zellgehalt sowie die Apopto-

se- und Nekroserate während der Kurzzeitlagerung über 72 Stunden in Leukozytenre-

duktionskammern der Trima Accel® nach einfacher und nach doppelter Thrombozyta-

pherese unterscheiden. [58] Es konnte ein hochsignifikanter Unterschied zwischen den

Leukozytenkonzentrationen der Leukozytenreduktionskammern nach einfachen und

doppelten Thrombozytapheresen mit der Trima Accel® gefunden werden (Tab. 8, S.

35). Der Leukozytengehalt in den Leukozytenreduktionskammern war bei einem Füll-

volumen von 10 ml nach E-TA durchschnittlich 0,93 x109 ± 0,32 x109 Zellen und nach

D-TA durchschnittlich 1,71 x109 ± 0,55 x109 Zellen (p < 0,01). Die letzteren Werte ent-

sprechen denen, die Neron et al. in ihrer 2007 veröffentlichen Arbeit über den in Leu-

kozytenreduktionskammern vorliegenden Zellgehalt beschrieben haben [41]. Die signi-

fikanten Unterschiede zwischen den Leukozytenkonzentrationen und dem Leukozyten-

gehalt von E-TA und D-TA können durch das signifikant unterscheidliche PBV beider

Spendearten erklärt werden, da die Leukozytenkonzentration hochsignifikant mit dem

PBV korreliert (r2 = 0,75, p < 0,001) (Abb. 12, S. 35). Die unter Diskussion, Punkt 1.

Diskussion 44

beschriebenen Unterschiede zwischen den Ergebnissen dieser Arbeit und denen von

Dietz können durch Unterschiede im prozessierten Blutvolumen erklärt werden [59].

Auch in dieser Versuchsserie konnten die veröffentlichten Daten nicht reprodu-

ziert werden. Allerdings hatten im Gegensatz zu der Studie von Dietz et al. [15] die

Spender dieser Serie einen BMI von maximal 30 kg/m2. Damit konnte das Volumen, ab

welchem die Leukozytenreduktionskammern als voll angesehen werden, nicht prozes-

siert werden [10]. Das heißt, dass der Vergleich mit den Ergebnissen von Dietz et al.

auch bei diesen Daten nur eingeschränkt möglich ist. Es konnte keine Korrelation zwi-

schen der Leukozytenkonzentration und dem Anteil CD14+ Monozyten im Blut der

Leukozytenreduktionskammern nachgewiesen werden. Die Konzentration der Monozy-

ten war in Leukozytenreduktionskammern der D-TA signifikant höher als in denen der

E-TA. Dagegen wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Konzentration

der Lymphozyten gefunden.

Entsprechend der aktuellen Literatur konnten die aus Leukozytenreduktions-

kammern gewonnenen mononukleären Zellen erfolgreich zur Kultivierung dendritischer

Zellen verwendet werden [15, 35, 41]. Weitgehend unbekannt war bisher, ob die aus

Leukozytenreduktionskammern gewonnenen Zellen Zeichen von Apoptose oder Nek-

rose aufzeigen und wenn nicht, wie lange sie gelagert werden können, ohne dass eine

Schädigung auftritt. Dies ist von besonderem Interesse, da eine Zellschädigung zu

Zellverlust führen und so die Kultivierungsraten dendritischer Zellen beeinflussen kann.

Neron und Kollegen berichteten, dass 95% der aus Leukozytenreduktionskammern

gewonnenen Leukozyten vital sind [41]. Dies deckt sich mit den in Tabelle A3 (Anhang,

S. 59) aufgeführten Daten, die einen initialen Anteil von 7-AAD+ mononukleären Zellen

in Höhe von 2% bis 5% zeigen. Zusätzlich werden in dieser Arbeit Daten bezüglich der

Vitalität mononukleärer Zellen aufgeführt, zum einen im Verlauf der Kurzzeitlagerung,

zum anderen im Vergleich von Zellen aus Leukozytenreduktionskammern mit einer

niedrigen Leukozytenkonzentration (E-TA) und denen mit einer hohen Leukozytenkon-

zentration (D-TA). Der Anteil der Annexin V+/7-AAD+ Lymphozyten war in den Leuko-

zytenreduktionskammern der D-TA signifikant höher als in denen der E-TA. Man könn-

te daraus schließen, dass eine hohe Leukozytenkonzentration zu einem höheren Anteil

spät-apoptotischen bzw. nekrotischen Zellen führt. Dem widerspricht allerdings, dass

keine signifikanten Unterschiede zwischen den Anteilen Annexin V+/7-AAD+ Monozy-

ten in den Leukozytenreduktionskammern zu finden waren (Tab. A3, Anhang, S. 59).

Zwischen Lymphozyten und Monozyten gab es signifikante Unterschiede be-

züglich der Anteile der Annexin V+/7-AAD– Zellen. Der Anteil von Annexin V+/7-AAD–

Lymphozyten schwankte zwischen 20% und 27% und war während der gesamten La-

gerdauer stabil. Unterschiede zwischen dem Anteil der Annexin V+/7-AAD– Lymphozy-

Diskussion 45

ten aus Leukozytenreduktionskammern der E-TA mit denen der D-TA wurden nicht

beobachtet. Dagegen war der Anteil der Annexin V+/7-AAD– Monozyten intial mit Wer-

ten zwischen 39% und 48% erhöht und fiel nach einer Lagerung von 24 Stunden so-

wohl in den Leukozytenreduktionskammern der E-TA als auch in denen der D-TA auf

durchschnittlich 30%. Danach kam es zu einem signifikanten Anstieg des Anteils der

Annexin V+/7-AAD– Monozyten, der von einem Anstieg des Anteils der Annexin V+/7-

AAD+ Monozyten begleitet wurde. Sowohl bei Lymphozyten wie auch bei Monozyten

nahm der Anteil der Annexin V+/7-AAD+ Zellen zu, was auf eine irreversible Zellschä-

digung hinweist. Der erste signifikante Anstieg des Anteils der Annexin V+/7-AAD+

Zellen wurde bei Lymphozyten wie bei Monozyten nach einer Lagerdauer von 24 Stun-

den beobachtet. Diese Daten decken sich mit den Beobachtungen von Strasser et al.,

die in einer Studie über die Kurzzeitlagerung von Leukapherisaten in PVC-Beuteln be-

schrieben, dass es zu einem ersten signifikanten Abfall der Konzentration mononukleä-

rer Zellen nach einer Lagerdauer von mehr als 24 Stunden kommt [57].

Obwohl Monozyten einen hohen Anteil an Annexin V+ Zellen binnen der ersten

24 Stunden der Lagerung zeigten war der Anteil der 7-AAD+ Monozyten als Zeichen

der irreversiblen Zellschädigung in diesem Zeitraum gering. Möglicherweise wurden die

hohen Messwerte bezüglich des Anteils der Annexin V+/7-AAD– Monozyten durch un-

spezifische Bindungen von Annexin V an Monozyten hervor gerufen. Es ist bekannt,

dass Annexin V unspezifisch an Zellen binden kann [7, 12]. Allerdings ist dies als allei-

nige Ursache vor allem im Hinblick auf den Abfall des Anteils der Annexin V+ Monozy-

ten binnen der ersten 24 Stunden nach der Apherese unwahrscheinlich. Amer et al.

fanden in einer 2010 veröffentlichten Studie heraus, dass Lymphozyten wie Monozyten

während einer Apherese oxidativem Stress ausgesetzt sind. Dies führt zu einer Zell-

schädigung mit Externalisation von Phosphatidylserin und damit zur Annexin V-

Positivität nach Färbung [1]. Geske et al. zeigten, dass eine durch p53-induzierte

Apoptose in frühen Stadien reversibel ist, wenn die apoptotischen Stimuli entfernt wer-

den. Dabei kam es zum Rückgang der Phosphatidylserin-Externalisation und somit

auch zum Abfall des Anteils der Annexin V+ Zellen [21]. Vor dem Hintergrund der Be-

obachtungen von Amer und Geske könnte die Ursache für den initial nach der Aphere-

se erhöhten Anteil der Annexin V-positiven Monozyten durch die Apherese hervorgeru-

fener Zellstress sein. Nach Ende der Apherese und des Zellstresses wird der apoptoti-

sche Stimulus entfernt, die Zellen regenerieren sich und es kommt nicht obligatorisch

zum Zelltod der Monozyten. Die Regeneration der Monozyten scheint entsprechend

der hier dargestellten Daten binnen der ersten 24 Stunden nach Apherese statt zu fin-

den. Der im Vergleich zu Monozyten niedrige Anteil von Annexin-V+/7-AAD– Lympho-

zyten initial nach der Apherese scheint auf eine höhere Resistenz der Lymphozyten

Diskussion 46

gegenüber äußeren Einflüssen wie zum Beispiel Zellstress während der Apherese hin

zu weisen.

3. Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Le ukapheresaten

In einer weiteren Folgestudie wurden Leukozytenreduktionskammern mit

Leukapheresaten bezüglich Zellgehalt und Zellapoptose/-nekrose während der Kurz-

zeitlagerung über 48 Stunden verglichen. [68] Die hier dargestellten Daten zeigen hin-

sichtlich der Zellviabilität eine deutliche Diskrepanz zwischen der Qualität der Leuka-

pheresate, dem Goldstandard für die Gewinnung mononukleärer Zellen, und der Quali-

tät der Leukozytenreduktionskammern. Bereits bei den Messungen sofort nach der

Apherese zeigte sich verglichen mit den Leukozytenreduktionskammern ein erhöhter

Anteil Annexin V+/7-AAD- mononukleärer Zellen in den Leukapherisaten. Die Färbung

mit Annexin V ist bekanntlich nicht unkritisch zu bewerten, da dieses nicht nur an

apoptotische Zellen bindet, sondern auch unspezifisch binden kann. Dagegen ist eine

mit 7-AAD gefärbte Zelle sicher irreversibel geschädigt. In den hier dargestellten Daten

korrelierte der Anteil der Annexin V+/7-AAD– mononukleären Zellen mit dem Anteil der

Annexin V+/7-AAD+ mononukleären Zellen hochsignifikant (Lymphozyten: R2=0,770,

p<0,001; Monozyten: R2=0,703, p<0,001) (Abb. 15). Es ist daher davon auszugehen,

dass die Bindung von Annexin V an mononukleäre Zellen durch eine Zellschädigung

hervorgerufen wurde.

Üblicherweise werden zur Kultivierung dendritischer Zellen aus Monozyten die

mononukleären Zellen der Leukapherisate binnen sechs bis 24 Stunden nach der A-

pherese in Zellkulturen angelegt. In dieser Zeitspanne war aber bereits ein erster ten-

denzieller Anstieg der Annexin V+/7-AAD+ Events in den Proben der Leukapherisate

zu erkennen, auch wenn noch keine signifikanten Unterschiede bestanden. Gleichzei-

tig fiel in den gelagerten Proben der Leukapherisate der pH-Wert verglichen mit den

Leukozytenreduktionskammern deutlich stärker ab. Im gelagerten Blut der Leukozyten-

reduktionskammern stieg der pCO2-Wert innerhalb der ersten 24 Stunden an, gleich-

zeitig kam es zum Abfall des pO2-Werts. Da die zur Lagerung verwendeten PVC-

Beutel eine feste Gasaustauschrate für O2 und für CO2 haben, kann diese Beobach-

tung als metabolischer Sauerstoffverbrauch unter CO2-Produktion gewertet werten. In

den Blutproben der Leukapherisate fiel dagegen der pCO2-Wert von Beginn der Lage-

rung stetig ab während der pO2-Wert stetig anstieg. Verglichen mit den Proben der

Leukozytenreduktionskammern sind in den Proben der Leukapherisate ein reduzierter

Sauerstoffverbrauch und eine gleichzeitig reduzierte CO2-Produktion, also eine anae-

robe Stoffwechselsituation, zu vermuten. Picker et al. beschrieben in einer Studie zur

Diskussion 47

Thrombozytenlagerung, dass der Sauerstoffverbrauch von Zellen invers mit der Zell-

schädigung korreliert [44]. Gleichzeitig ist aus der Literatur bekannt, dass während der

Lagerung mononukleärer Zellen der pH-Wert umso stärker abfällt, je mehr Laktat pro-

duziert wird [57]. Die Laktatkonzentration konnte in dieser Arbeit auf Grund des gerin-

gen Lagervolumens und des vergleichsweise großen Probenbedarfs zur Laktatbe-

stimmung nicht gemessen werden. Wie unter Ergebnisse, Punkt 3. beschrieben, korre-

liert im Blut der Leukapheresate der pH-Wert-Abfall hochsignifikant mit dem Anstieg

des Anteils der Annexin V+/7-AAD+ mononukleären Zellen (Abb. 16, Seite 40). Aus der

Zusammenschau all dieser Beobachtungen kann die Hypothese formuliert werden,

dass im Blut der Leukapherisate die mononukleären Zellen dermaßen geschädigt sein

könnten, dass der aerobe Stoffwechsel und dadurch der Sauerstoffverbrauch gestört

sind.

Die Diskrepanz zwischen der Viabilität mononukleärer Zellen aus Leukapherisa-

ten und derer aus Leukozytenreduktionskammern kann unterschiedliche Ursachen

haben. Zum einen unterscheidet sich die Art der Zellanreicherung während der Leuko-

zytapherese und in den Leukozytenreduktionskammern. Während der Leukozytaphe-

rese werden Leukozyten durch die Zentrifugation dicht zusammengepresst. Die auf sie

dabei wirkende Kraft entspricht bei den verwendeten Geräteeinstellungen und einer

Drehzahl von 1500 Umdrehungen/Minute 297 x g, also fast dem 300-fachen der Erd-

anziehungskraft. Dagegen kommt es in den Leukozytenreduktionskammern zu einer

Anreicherung von Leukozyten, indem die schweren Zellen, Leukozyten und Erythrozy-

ten, auf Grund der Bauweise der Kammern zur Kammerwand fließen. Dagegen können

die leichten Zellen, Thrombozyten, die Kammer passieren. Ursächlich dafür sind kön-

nen Strömungsturbulenzen an den Stufen des sich in Flussrichtung terrassenförmig

erweiternden Kegels sein. Die dabei auf die Zellen wirkende Kraft ist nicht bekannt.

Bekannt ist aber, dass sich dabei eine lockere Ansammlung von Zellen bildet, so dass

wahrscheinlich geringere Kräfte auf die Zellen in den Kegeln wirken als während der

Leukozytapherese [27, 41]. Des Weiteren haben Amer et al. wie bereits beschrieben

beobachtet, dass Apheresen oxidativen Stress verursachen und so zu einer erhöhten

Annexin V-Bindungsrate an Zellen führen [1]. Vor der Aussage der Studie von Amer ist

zu vermuten, dass neben der sanften Anreicherung der Leukozyten in den Leukozyten-

reduktionskammern weitere Faktoren der Apherese, wie zum Beispiel Unterschiede im

prozessierten Blutvolumen oder in der Spendedauer, Einfluss auf die Qualität der ge-

wonnen mononukleären Zellen haben können. Die Hypothese, dass diese Unterschie-

de in der Methode mononukleäre Zellen anzureichern unterschiedlich stark ausgepräg-

te Zellschädigungen hervorrufen, ist daher naheliegend.

Diskussion 48

Zum anderen unterscheiden sich die Proben der Leukozytenreduktionskam-

mern und der Leukapherisate nicht nur bezüglich ihrer Herstellung sondern auch be-

züglich ihres Restzellgehalts, wobei dieser die Qualität des Blutes weniger direkt nach

der Apherese beeinflusst haben könnte als mehr im Verlauf der Kurzzeitlagerung. In

Proben der Leukapherisate war die Thrombozytenkonzentration verglichen mit denen

der Leukozytenreduktionskammern doppelt so hoch (E-TA, p=0,002; D-TA, p<0,001).

Gleichzeitig war in den Proben der Leukapherisate die Erythrozytenkonzentration um

ein Vielfaches signifikant geringer als in den Proben der Leukozytenreduktionskam-

mern (Tab. 9, S. 38). Thrombozyten werden bekanntermaßen während einer Apherese

aktiviert und steigern dabei ihre Stoffwechselaktivität [5, 28]. Daher wäre es möglich,

dass in den Leukapherisaten durch die erhöhte Zahl der Thrombozyten die für den

Stoffwechsel der Leukozyten nötigen Substrate durch die Thrombozyten verbraucht

wurden, die gelagerten Zellen ihren Stoffwechsel nicht mehr aufrecht erhalten konnten

und es dadurch zu einer Zellschädigung im gelagerten Produkt kam. Es ist bekannt,

dass in gelagerten Thrombozytenkonzentraten der pH-Wert hypoxiebedingt signifikant

abfallen kann [32]. Allerdings kam es im Verlauf der Lagerung zu einem Anstieg des

Sauerstoffpartialdrucks in den Proben der Leukapherisate, so dass eine Hypoxie und

dadurch ein Einfluss der Thrombozyten auf den pH-Wert unwahrscheinlich sind. Dass

keine signifikanten Korrelationen zwischen der Thrombozytenkonzentration und den

Parametern der Zellschädigung beobachtet werden konnte, ist möglicherweise auf die

geringe Fallzahl dieser Studie zurück zu führen.

Amer et al. beschrieben, dass Apheresen zu Zellschädigung durch oxidativem

Stress und so zur Bindung von Annexin V führt [1]. Gleichzeitig wurde von der Arbeits-

gruppe beschrieben, dass durch Glutathion als Antioxidans die bei der Apherese ent-

stehenden Oxidantien reduziert werden. Der oxydative Stress war also umso geringer

je mehr Glutathion zur verfügung stand. Gluthation kommt im Blut vorrangig in Erythro-

zyten vor. In den gelagerten Proben der Leukozytenreduktionskammern war die Eryth-

rozytenkonzentration um ein Vielfaches höher als in denen der Leukapherisate. Außer-

dem konnte beobachtet werden, dass je geringer die initiale Erythrozytenkonzentration

war, umso stärker stieg der Anteil der Annexin V+/7-AAD+ Monozyten im Blut der

Leukapherisate an (Abb. 17, S. 41) Möglich wäre daher, dass die erhöhte Erythrozy-

tenkonzentration in den Leukozytenreduktionskammern einen protektiven Effekt ge-

genüber dem oxidativen Stress während der Apherese haben könnte. Auch könnte auf

Grund der physiologischen Pufferkapazität des Hämoglobins die erhöhte Erythrozyten-

konzentration der Leukozytenreduktionskammern Einfluss auf den, verglichen mit den

Leukapherisaten, geringeren Abfall des pH-Werts haben. Ob Erythrozyten auf die Qua-

Diskussion 49

lität gelagerter mononukleärer Zellen einen Einfluss haben, lässt sich mit dieser Arbeit

aber nicht klären.

Wahrscheinlich ist die Diskrepanz zwischen der Viabilität mononukleärer Zellen

aus Leukapherisaten und derer aus Leukozytenreduktionskammern mit einer Kombina-

tion der hier diskutierten Einflussgrößen zu erklären. Auf Grund des hohen Monozyten-

bedarfs zur Herstellung dendritischer Zellen für die Immuntherapie reichen Leukozyten-

reduktionskammern aktuell noch nicht als Quelle für mononukleäre Zellen aus. Aller-

dings scheint allein das Prinzip der Zellanreicherung in Leukozytenreduktionskammern

als neue und sanfte Methode vielversprechend für die Gewinnung mononukleärer Zel-

len zu sein.

Zusammenfassend sollten die hier bearbeiteten Themen Gegenstand weiterer

Forschung sein um die Qualität der Leukozytenprodukte als auch der darauf folgenden

Kultivierung von dendritischen Zellen zu verbessern. Interessant ist, ob der hier beo-

bachtete Abfall der Annexin V-Bindung an Monozyten aus Leukozytenreduktionskam-

mern innerhalb der ersten 24 Stunden nach Spende Einfluss auf die Kultivierungsrate

dendritischer Zellen hat. Dies hätte die Empfehlung zur Konsequenz, Blutprodukte zwi-

schenzulagern bevor sie für Zellkulturen verwendet werde. Auch sollte der Hypothese

nachgegangen werden, dass die Unterschiede der Zellanreicherung ursächlich für die

Qualitätsunterschiede zwischen Blut aus Leukapheresaten und Leukozytenreduktions-

kammern sind. Offen ist, ob die hier beobachteten Qualitätsunterschiede auch Einfluss

auf die Kultivierungsrate von dendritischen Zellen haben. Es gibt mittlerweile Zellsepa-

ratoren, wie z.B. die Spectra Optia® von CaridianBCT, die eine schonendere Zellanrei-

cherung verglichen mit den klassischen Zellseparatoren bei gleichem Zellgehalt im

Produkt versprechen. Diese neuen Zellseparatoren könnten nützlich für die Gewinnung

dendritischer Zellen sein. Schließlich ist fraglich, inwieweit oxydativer Stress während

der Apherese auf die Kultivierung dendritischer Zellen Einfluss hat. Sollte die hier ge-

machte Beobachtung eines scheinbar protektiven Effekts für Leukozyten durch einen

hohen Erythrozytengehalt in Blutprodukten verifizierbar sein, so müsste zukünftig bei

Leukapheresen ein höherer Zielzellgehalt von Erythrozyten angestrebt werden.

Literaturverzeichnis 50

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Eckstein, R., Storage induced apoptosis of peripheral blood mononuclear cells


obtained from leucoreduction system chambers. Vox Sang, 2011. 101(2): p.

106-11.

59. Strasser, E.F., Weidinger, T., Zimmermann, R., Ringwald, J., und Eckstein, R.,

Recovery of white blood cells and platelets from leukoreduction system

chambers of Trima Accel and COBE Spectra plateletpheresis devices.

Transfusion, 2007. 47(10): p. 1943-4; author reply 1944-5.

60. Traganos, F., Flow cytometry: principles and applications. I. Cancer Invest,

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62. Tuyaerts, S., Aerts, J.L., Corthals, J., Neyns, B., Heirman, C., Breckpot, K.,

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disease. Adv Clin Chem, 1994. 31: p. 177-246.

66. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., und Reutelingsperger, C., A novel

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on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of

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67. Villablanca, E.J., Raccosta, L., Zhou, D., Fontana, R., Maggioni, D., Negro, A.,

Sanvito, F., Ponzoni, M., Valentinis, B., Bregni, M., Prinetti, A., Steffensen,

K.R., Sonnino, S., Gustafsson, J.A., Doglioni, C., Bordignon, C., Traversari, C.,

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responses. Nat Med, 2010. 16(1): p. 98-105.


68. Weidinger, T.M., Keller, A.K., Weiss, D., Zimmermann, R., Eckstein, R., und

Strasser, E.F., Peripheral blood mononuclear cells obtained from

leukoreduction system chambers show better viability than those from

leukapheresis. Transfusion, 2011. 51(9): p. 2047-9.

Abkürzungen 57

VIII. Abkürzungsverzeichnis

7-AAD: 7-Amino-Actinomycin D

APC: Allophycocyanin

BMI: Body Mass Index

CD: engl. Cluster of Differentiation, Oberflächenantigene

D-TA: Doppelt-Thrombozytapherese

DNS: Desoxyribonucleinsäure

E-TA: Einfach-Thrombozytapherese

FACS: engl. Fluorescence activated cell sorting, Durchflusszytometrie

FDA: Food and Drug Administration, US-amerikanische Gesundheitsbe-

hörde

FITC: Fluorescein isothiocyanat

FL1 – 4: Fluorescence 1 – 4

FSC: Foreward light scatter

LRSC: engl. leukoreductionsystem chamber, Leukozytenreduktionskammer

PBMC: engl. Peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen des

peripheren Bluts

PBS: engl. Phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte Salzlösung

PBV: prozessiertes Blutvolumen

PE: Pycoerythrin

PLT: engl. platelets, Thrombozyten

PVC: Polyvinylchlorid

RBC: engl. red blood cells, Erythrozyten

SSC: Sideward light scatter

TBV engl. total blood volume, gesamtes Blutvolumen

VAC alpha: vascular anticoagulant alpha

WBC: engl. white blood cells, Leukozyten

Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 58

IX. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

1. Strasser EF, Weidinger T, Zimmermann R, Ringwald J, Eckstein R. Recovery of

white blood cells and platelets from leukoreduction system chambers of Trima Ac-

cel and COBE Spectra plateletpheresis devices. Transfusion 2007;47:1943-4.

(Letter)

2. Strasser EF, Weidinger T, Weiss DR, Strobel J, Zimmermann R, Eckstein R. Stor-

age induced apoptosis of peripheral blood mononuclear cells obtained from leu-

coreduction system chambers. Vox Sang 2011;101(2):106-11.

3. Weidinger TM, Keller AK, Weiss D, Zimmermann R, Eckstein R, Strasser EF. Pe-

ripheral blood mononuclear cells obtained from leukoreduction system chambers

show better viability than those from leukapheresis. Transfusion 2011;51:2047-9.

(Letter)

Anhang 59

X. Anhang

Tab. A1: Chemikalien und Biochemikalien Hersteller

- 7-AAD BD Pharmingen

- Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit BD Pharmingen

- Annexin-V-FITC BD Pharmingen

- Aqua ad iniectabilia 100ml Braun

- CD14 – APC BD Pharmingen

- CD45 – PE BD Pharmingen

- FACSRinse / FACSFlow BD Biosciences

- PBS Wash Buffer (1X) Girco

- PharM-Lyse™ Lysis Buffer (10X concentrate) BD Pharmingen

Tab. A2: Geräte Hersteller

- Blutgasanalysator ABL5 Radiometer SA

- COBE® Spectra Zellseparator Caridian BCT

- Com.Tec® Zellseparator Fresenius HemoCare GmbH

- Durchflusszytometer: FACSCalibur BD Biosciences

- FACS Messröhrchen BD Biosciences

- FALCON 5 ml Round-Bottom Tubes BD Biosciences

- Kanüle Luer 21G/1,5“, 0,8x40mm BD Microlance 3

- Monovette 2,7ml K3E mit 1,6mg EDTA/ml Blut Sarstedt AG

- Monovettenkappe Sarstedt AG

- PVC-Beutel, 150ml Compoflex R Single Bags

- Sampling Site Baxter

- Spritze 2ml, 5ml, 10ml BD Discardit II

- Thrombozyteninkubator Forma Scientific

- Trima Accel® Zellseparator Gambro BCT

- Vortex Genie 2 Scientific Industries

- Zellzähler: ADVIA 120 Bayer HealthCare Diagnostics

- Zentrifugen: Rotina 48 S Hettich Zentrifugen

Anhang 60

Tab. A3: Apoptose und Nekrose mononukleärer Zellen aus Leukozytenreduktionskammern

der Trima Accel®


Standardabweichung) *

1 Stunde

(N=9)

6 Stunden

(N=9)

24 Stunden

(N=9)

48 Stunden

(N=9)

72 Stunden

(N=9)

Leukozyten (x

106/mL)

1 93,03±32,23 95,11±31,06 96,83±29,55 99,13±31,62 92,98±23,96

2 170,7±54,6 170,0±60,1 166,3±58,4 167,6±59,4 159,0±5 5,8

Lymphozyten (% von

WBC)

1 69,55±7,79 69,48±6,03 71,93±10,56 75,14±6,77 78,78±7,94

2 66,11±12,65 64,50±13,11 65,89±10,28 68,17±10,59 71,50±14,64

Annexin V+/7-AAD-

Lymphozyten (%)

1 24,66±12,67 22,02±9,49 23,08±10,06 23,22±4,49 22,26±4,72

2 27,50±9,60 21,71±10,17 24,22±9,95 21,21±5,28 23,17±8,16

Annexin V+/7-AAD+

Lymphozyten (%)

1 1,97±0,96 1,25±0,73 2,70±2,81 7,17±4,58 17,41±10,02

2 4,34±2,28 3,27±1,24 8,89±7,20 15,99±12,31 25,23±18,36

Monozyten (% von

WBC)

1 13,38±4,81 12,61±2,98 12,76±4,88 13,37±3,28 8,24±4, 12

2 21,09±5,38 22,09±6,70 22,55±6,65 19,68±3,80 10,47±6 ,11

Annexin V+/7AAD-

Monozyten (%)

1 48,48±8,83 34,04±10,53 29,88±5,93 50,00±8,04 69,48±5,79

2 39,12±10,97 35,89±6,76 31,44±7,50 49,38±14,56 68,76±10,88

Annexin V+/7-

AAD+Monozyten (%)

1 3,38±1,62 2,65±1,23 4,15±1,24 7,30±2,58 17,89±8,02

2 4,56±2,09 3,06±1,22 6,86±4,02 8,98±4,29 19,09±16,79

* Leukozytenreduktionskammer aus (1) E-TA und (2) D-TA

Anhang 61

Tab. A4: Kurzzeitlagerung von Blut aus Leukozytenreduktionskammern und Leukapherisaten


Standardabweichung)

1 Stunde

(N=6)

6 Stunden

(N=6)

24 Stunden

(N=6)

48 Stunden

(N=6) *

WBC (x 106 / ml)

1 118,6±40,2 121,4±44,0 118,8±40,8 116,1±39,6

2 143,8±57,2‡ 146,3±59,4‡ 144,1±56,6‡ 138,9±54,6‡

3 62,6±19,8‡ 63,6±17,5‡ 61,3±15,9‡ 60,7±15,4‡

Lymphozyten (% von WBC)

1 67,1±8,3 70,9±8,2 70,6±6,4 64,8±6,9†

2 71,2±5,6 71,3±4,8 73,9±7,9 66,8±10,2‡

3 69,9±10,4 72,2±9,3 61,6±5,3 47,0±10,4†‡ §║

Annexin-V+/7-AAD- Lymphozyten (%)

1 9,4±2,4† 10,8±3,1† 12,6±2,5† 14,4±4,4†

2 8,4±3,7‡ 8,2±2,0‡ 11,5±3,7‡ 18,3±4,0‡ §║

3 19,2±5,8†‡ 19,6±6,4†‡ 27,4±7,5†‡ 41,6±6,7†‡ §║¶

Annexin-V+/7-AAD+ Lymphozyten (%)

1 0,5±0,3 0,4±0,2 1,0±0,5 4,1±3,3†

2 0,3±0,2 0,3±0,2 0,8±0,5 3,5±2,5‡

3 0,5±0,2 0,4±0,3 4,7±2,4 28,3±6,7†‡ §║¶

Monozyten (% von WBC)

1 10,9±2,7 10,8±4,2 9,2±2,0 11,8±4,7

2 9,5±2,6 11,5±2,4 7,9±2,5‡ 10,2±2,7

3 13,7±7,1 12,5±3,8 15,5±3,9‡ 5,0±4,5§║¶

Annexin-V+/7-AAD- Monozyten (%)

1 33,2±11,7 24,9±7,9 37,1±8,8 52,8±8,2║

2 27,1±16,6 20,7±9,7 25,5±6,3 48,4±13,9§║¶

3 38,1±11,5 29,0±8,0 36,1±10,1 65,3±8,5§║¶

Annexin-V+/7-AAD+ Monozyten (%)

1 1,8±0,9 1,5±1,0 3,9±2,3 10,5±14,7†

2 1,8±1,5 1,07±0,6 3,6±0,5 5,9±0,8‡

3 1,9±1,3 1,4±1,1 7,0±5,3 46,8±26,0†‡ §║¶

pH

1 7,01±0,07 6,96±0,03 6,59±0,16† §║ 6,37±0,24† §║

2 6,97±0,03 6,95±0,03 6,56±0,12‡ §║ 6,52±0,08‡ §║

3 7,11±0,08 6,94±0,08 6,11±0,19†‡ §║ 5,93±0,31†‡ §║

pCO2 (mmHg)

1 65,3±8,7 69,2±4,7 74,2±26,2† 40,5±11,5§║¶

2 73,3±5,4 69,7±5,4 76,7±12,6‡ 38,7±14,3§║¶

3 54,0±12,8 53,8±9,4 42,5±16,7†‡ 17,8±10,8§║¶

pO2 (mmHg)

1 55,3±12,2 39,7±10,3† 36,8±9,1† 47,2±31,2†

2 46,0±9,5 37,5±10,0‡ 33,5±6,2‡ 31,5±14,4‡

3 70,3±16,9 89,8±24,4†‡ 113,5±29,4†‡ 152,0±58,2†‡ §║ * Blut aus 1: LRSC, E-TA, aus 2: LRSC, D-TA, und aus 3: Leukapheresat † p < 0.05; Vergleich zwischen E-TA und Leukapheresaten ‡ p < 0.05; Vergleich zwischen D-TA und Leukapheresaten § p < 0.05; gepaarter Vergleich mit Werten 1 Stunde nach Spende ║ p < 0.05; gepaarter Vergleich mit Werten 6 Stunde nach Spende ¶ p < 0.05; gepaarter Vergleich mit Werten 24 Stunde nach Spende

62

Danksagung

Ich möchte mich ganz herzlich bei Herrn Prof. Dr. med. R. Eckstein für Überlassung

des Themas und die großzügige Bereitstellung des Arbeitsplatzes in seiner Abteilung

bedanken.

Für die hervorragende Betreuung, stetige Anleitung und Förderung während der Erstel-

lung der Arbeit und auch danach möchte ich Herrn PD Dr. med. E. Strasser danken.

Für die entgegenkommende Unterstützung bei der Lösung statistischer Probleme dan-

ke ich Frau Dipl.-Stat. FH A.K. Keller.

Auch bedanke ich mich bei den Schwestern und MTAs in der Blutspende und in den

Laboratorien der Transfusionsmedizinischen Abteilung der Universitätsklinik Erlangen

für deren Hilfe im Rahmen ihrer Möglichkeiten.

00_gesamter text_2 - opus4.kobv.de

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