BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH

TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID

TRONG CÂY DỪA CẠN

( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON APOCYNACEAE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC

TP. Hồ Chí Minh – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH

TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID

TRONG CÂY DỪA CẠN

( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON APOCYNACEAE)

Chuyên ngành: Sản xuất và phát triển thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc

TP. Hồ Chí Minh - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong

luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào

khác.

Chữ ký SV

DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH

LỜI CẢM ƠN

Không có thành công nào mà không có những bàn tay dìu dắt và giúp đỡ. Em xin

chân thành cảm ơn Ban giám hiệu của trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo

cơ hội và điều kiện để em có thể thực hiện đề tài này.

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến

Cô PGS. TS Võ Thị Bạch Huệ

Cô Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc

đã dìu dắt và chỉ dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và giúp em hoàn thành

khóa luận này.

Em xin cảm ơn Thầy, Cô trong hội đồng đã đồng ý phản biện cho đề tài của em.

Em cũng xin gởi lời cảm ơn tới các anh chị kỹ thuật viên bộ môn đã giúp đỡ vào tạo

điều kiện về cơ sở vật chất và dụng cụ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này.

Em xin gởi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô ở các bộ môn của khoa Dƣợc – trƣờng Đại

học Nguyễn Tất Thành đã cho em mƣợn thiết bị, dụng cụ và hóa chất nhằm phục vụ

cho mục đích nghiên cứu.

Em xin trân trọng cảm ơn.

i

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .............................................................. iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................ v

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 2

1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT ............................................................................. 2

1.1.1. Catharanthus ............................................................................................. 2

1.1.2. Catharanthus roseus (L.) G. Don ............................................................. 3

1.1.3. Các hợp chất alkaloid trong cây Catharanthus roseus (L.) G. Don ......... 6

1.1.4. Các Vinca alkaloid chính ........................................................................ 10

1.2. Phƣơng pháp chiết xuất, định tính và định lƣợng alkaloid ............................ 14

1.2.1. Chiết xuất ................................................................................................ 14

1.2.2. Định tính .................................................................................................. 18

1.2.3. Định lƣợng .............................................................................................. 20

1.3. Tối ƣu hóa bằng phần mềm ............................................................................ 22

1.3.1. Giới thiệu chung ...................................................................................... 22

1.3.2. Phƣơng pháp tối ƣu hóa .......................................................................... 22

1.3.3. Phần mềm tối ƣu hóa Modde 5.0 ............................................................ 23

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 24

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu..................................................................................... 24

2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 24

2.1.2. Dung môi, hóa chất ................................................................................. 24

2.1.3. Trang thiết bị ........................................................................................... 25

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 26

2.2.1. Chọn alkaloid để định hƣớng chiết ......................................................... 26

2.2.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn ........................ 28

ii

2.2.3. Tối ƣu hóa quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn ...

........................................................................................................... 30

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 32

3.1. Chọn alkaloid để định hƣớng chiết ................................................................ 32

3.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin ..................................... 32

3.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm ............................................................... 34

3.1.3. Xác định khối lƣợng phân tử của chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm bằng

phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (MS ) .................................... 34

3.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin

10mg/ 10ml bằng phƣơng pháp quang phổ ....................................................... 35

3.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat trong nƣớc ................................. 36

3.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn ............................... 38

3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật ........................................................................... 38

3.2.2. Định tính alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn ............................................ 40

3.2.3. Xây dựng quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ cây Dừa

cạn ........................................................................................................... 43

3.3. Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ cây Dừa

cạn ......................................................................................................................... 49

3.3.1. Xây dựng các thí nghiệm tối ƣu hóa ....................................................... 49

3.3.2. Kết quả tối ƣu hóa ................................................................................... 51

3.3.3. Phân tích tƣơng tác ảnh hƣởng giữa các yếu tố ...................................... 54

3.3.4. Kết quả dự đoán ...................................................................................... 56

3.4. Bàn luận ......................................................................................................... 57

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 58

4.1. Kết luận .......................................................................................................... 58

4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT C ữ v ết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh ng tiếng Việt

1 VB Vinblastin

2 VC Vincristine

3 SKLM Sắc ký lớp mỏng

4 UV-Vis Ultra violet–visible Tử ngoại – khả kiến

5 HPLC High-performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

6 ESI-MS Electrospray Ionization -

Mass Spectrometer

Phƣơng pháp khối phổ với

ion hóa phun điện

7 DĐVN Dƣợc điển Việt Nam

iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. 1. Công thức cấu tạo Vinblastin ................................................................... 10

Hình 1. 2. Công thức cấu tạo Vincristin.................................................................... 12

Hình 1. 3. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trƣờng kiềm

................................................................................................................................... 15

Hình 1. 4. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng nƣớc acid ................................................ 16

Hình 2. 1. Sơ đồ tổng quát chiết xuất alkaloid từ dƣợc liệu ..................................... 29

Hình 3. 1. Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) trong thuốc tiêm Cytoblastin

(1) và dịch chiết ra từ thuốc tiêm (2) ......................................................................... 33

Hình 3. 2. Phổ khối ESI-MS của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin .................... 34

Hình 3. 3. Phổ UV-Vis của vinblastine sulfat trong nƣớc ........................................ 35

Hình 3. 4. Phổ UV-Vis của vinblastine base trong methanol ................................... 36

Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của

vinblastine sulfat ....................................................................................................... 37

Hình 3. 6. Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn ........................................................................ 39

Hình 3. 7. Sắc ký đồ xác định vinblastine (C) trong dịch chiết (T) cây Dừa cạn ..... 41

Hình 3. 8. Sơ đồ quy trình chiết xuất alkaloid chi tiết .............................................. 43

Hình 3. 9. Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết ở bƣớc 1 ........................................... 44

Hình 3. 10. Sắc ký đồ dịch dung môi loại chlorophyll (dịch A) ............................... 46

Hình 3. 11. Sắc ký đồ dịch alkaloid toàn phần (dịch B) .......................................... 47

Hình 3. 12. Sắc ký đồ so sánh dung môi chiết tách alkaloid base toàn phần (dịch B)

................................................................................................................................... 48

Hình 3. 13. Sắc ký đồ của các dung dịch trong thí nghiệm ...................................... 51

Hình 3. 14. Kết quả thể hiện mức ảnh hƣởng của các yếu tố tối ƣu hóa .................. 53

Hình 3. 15. Hệ số biến thiên của các yếu tố ảnh hƣởng ............................................ 53

Hình 3. 16. Đƣờng cong thể hiện tƣơng tác giữa các yếu tố khảo sát ...................... 54

Hình 3. 17. Đƣờng thẳng thể hiện mối quan hệ giữa kết quả dự đoán và kết quả thực

tế ................................................................................................................................ 56

file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365695file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365695file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365696file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365702file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365713file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365713file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365714file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365715file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365716file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365717file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365717file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365718file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365719file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365720file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365721file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365722file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365723file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365724file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365724file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365725file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365726file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365728file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365729file:///C:/Users/DELL/Desktop/Bài%20chỉnh%20sửa%2025102018.docx%23_Toc528365729

v

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2. 1. Dung môi và hóa chất cần dùng .............................................................. 24

Bảng 2. 2. Các thiết bị sử dụng ................................................................................. 25

Bảng 2. 3. Nồng độ các dung dịch thu đƣợc ............................................................. 27

Bảng 2. 4. Các yếu tố ảnh hƣởng và mức độ biến đổi .............................................. 31

Bảng 3. 1. Kết quả định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng phƣơng

pháp hóa học ............................................................................................................. 32

Bảng 3. 2. Độ hấp thụ của các dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin .................. 36

Bảng 3. 3. Kết quả định tính alkaloid trong bột dƣợc liệu ........................................ 40

Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát dung môi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1) ..................... 44

Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát dung môi loại chlorophyll ở bƣớc 2............................. 46

Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 ................ 48

Bảng 3. 7. Các thí nghiệm tối ƣu hóa đã xây dựng đƣợc .......................................... 50

Bảng 3. 8. Kết quả các thông số đánh giá mô hình thiết kế tối ƣu hóa ..................... 52

Bảng 3. 9. Điều kiện tối ƣu hóa dự đoán .................................................................. 56

Bảng 3. 10. Kết quả thực hiện 3 lần điều kiện tối ƣu ................................................ 57

Khóa luận tốt nghiệp dƣợc s đại học - Năm ọc 2017 – 2018

Tố ƣu ó quy trìn c ết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn

(Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace)

Dƣơng P ƣơng Quỳnh

Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, ung thƣ đã trở thành căn bệnh nguy hiểm đe dọa đến tính mạng con ngƣời. Tuy

nhiên, các thuốc điều trị ung thƣ vẫn còn hạn chế. Từ những năm 60 của thế kỉ trƣớc, các nhà

khoa học đã tìm ra đƣợc công dụng giúp điều trị ung thƣ của các hợp chất vinca alkaloid trong

Dừa cạn. Thế nhƣng, hàm lƣợng các alkaloid này trong cây không nhiều, vì vậy, nhằm xác

định những điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn, đề tài “Tố ƣu ó quy

trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)” đã đƣợc

thực hiện.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: Dƣợc liệu là toàn cây Dừa cạn khô mua tại hiệu thuốc đông y trên

đƣờng Hải Thƣợng Lãn Ông, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. Chất đối chiếu là vinblastin

sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin của công ty Cipla Pharma.

Phương pháp nghiên cứu: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm; khảo sát các hợp chất alkaloid

trong dƣợc liệu Dừa cạn và tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Đề tài đã hoàn thành các mục tiêu đƣa ra và thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:

- Xác định vinblastin từ thuốc tiêm bằng: phản ứng hóa học, SKLM, khối phổ MS. Sử dụng

vinblastin này làm chất đối chiếu trong định tính alkaloid từ bột dƣợc liệu. Khảo sát đƣợc cực

đại hấp thụ và xây dựng đƣờng chuẩn vinblastin bằng phƣơng pháp quang phổ UV-Vis.

- Định tính sơ bộ dƣợc liệu Dừa cạn bằng phƣơng pháp soi bột và định tính các alkaloid trong

bột Dừa cạn bằng phƣơng pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng.

- Khảo sát các dung môi và xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất alkaloid toàn phần (định

hƣớng vinblastin) với dung môi chiết ban đầu là ethanol 80 %, dung môi loại chlorophyll là

hexan và dung môi chiết tách alkaloid base từ dịch acid là chloroform.

- Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn bằng phần mềm Modde 5.0 và đã

chọn đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn: tỷ lệ dung môi/ dƣợc liệu là 5:1

(tt/kl), thời gian ngâm lạnh là 18 giờ và pH kiềm hóa là 8.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Sau 2 tháng, đề tài đã đã thực hiện đƣợc 3 mục tiêu đề ra: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm,

khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn và tối ƣu hóa quy trình chiết xuất

alkaloid trong cây Dừa cạn.

Từ khóa: Dừa cạn, tối ƣu hóa, Catharanthus roseus, vinblastin, alkaloid.

Final essay for the degree of BS Pharm - Academic year 2017 – 2018

Optimizing conditions for the extraction of alkaloid from periwinkle

(Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace)

Duong Phuong Quynh

Adviser: M.S.Pharm. Nguyen Thi Hong Phuc

INTRODUCTION

These days, cancer has become a life-threatening disease. However, the cancer treatment is

still limited. Since the 1960s, scientists have found a therapeutic use of the vinca alkaloid

which is extracted from Catharanthus roseus. However, the content of these alkaloids in the

plant is not much, so to determine the optimal conditions for alkaloid extraction from

periwinkle, the subject "Optimizing conditions for the extraction of alkaloid from

periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace" was done.

MATERIALS AND METHOD

Material: Dried periwinkle plants was purchased at herbal medicine store on Hai Thuong Lan

Ong Street, District 5, Ho Chi Minh City. The comparator is vinblastine sulfate extracted from

the Cytoblastin injection solution of Cipla Pharma.

Method: Determination of vinblastine from injection; examination of alkaloid compounds in

periwinkle and optimization conditions of the alkaloid extraction process from periwinkle.

RESULTS AND DISCUSSTION

The project has achieved the following objectives and results:

- Determination of vinblastine from injection by: chemical reaction, thin layer

chromatography, mass spectrometry. Use vinblastine (which had been determinated) as a

comparator to do alkaloid qualitative analysis in dried periwinkle plant. Determination

vinblastine's wavelength of maximum absorbance and preparation of calibration curve of

vinblastine by UV-Vis spectroscopy.

- Preliminary qualification of dried periwinkle powder and carry out the qualitative analysis of

alkaloid in dried periwinkle powder by chemical method and thin layer chromatography.

- Investigating the solvents and complete the alkaloid extraction proceduce (orientation of

vinblastine) with an initial extraction solvent is ethanol 80%, chlorophyll removal solvent is

hexane and the solvent using to extract based alkaloid from an acidic solution is chloroform.

- Optimizing the proceduce to extract alkaloid from periwinkle plant using Modde 5.0 and

selecting the optimal conditions for alkaloid extraction from periwinkle: ratio of solvent and

dried periwinkle powder 5: 1 (v/w), extracting duration is 18 hours and pH is 8.

CONCLUSION

After 2 months of researching on the subject, the essay have finished 3 target: determination

of vinblastine from injection; examination of alkaloid compounds in dried periwinkle and

optimization conditions of the alkaloid extraction process from periwinkle.

Keywords: Periwinkle, Catharanthus roseus, optimizing conditions, alkaloid, vinblastine.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, khi thế giới ngày càng phát triển, con ngƣời ta tập quen dần với lối sống

hiện đại hơn. Tuy nhiên, cũng từ những lối sống hiện đại này lại kéo theo những hệ

lụy khác nghiêm trọng ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Con ngƣời của thế

kỉ 21 càng ngày càng bị đe dọa bởi các chứng bệnh nguy hiểm, mà một trong số đó

là ung thƣ. Khác với ngày xƣa, ung thƣ ngày nay đã trở thành một căn bệnh thế kỉ,

đe dọa đến tính mạng của hàng trăm triệu ngƣời trên khắp thế giới. Dù là căn bệnh

nguy hiểm nhƣng đến nay, ung thƣ chỉ đƣợc điều trị triệt để khi phát hiện bệnh ở

những giai đoạn sớm. Tuy nhiên, giới hạn các thuốc điều trị và giá cả các thuốc này

đã khiến cho việc điều trị trở nên càng khó khăn hơn.

Thuốc điều trị ung thƣ, từ trƣớc đến nay đều khá đắt đỏ bởi vì việc nghiên cứu các

loại thuốc này vẫn còn hạn chế và đòi hỏi phải có nguồn kinh phí lớn. Tuy nhiên,

vào những năm 60 của thế kỉ trƣớc, các nhà khoa học đã khám phá ra đƣợc công

dụng thần kì giúp điều trị ung thƣ của các hợp chất vinca alkaloid (đặc biệt là

vinblastin và vincristin) trong Dừa cạn, một loài cây tƣơng đối thân quen, từ đó mở

ra một hƣớng đi mới cho việc nghiên cứu các loại thuốc chống ung thƣ.

Các hợp chất vinca alkaloid trong cây Dừa cạn có tác động tốt trong điều trị ung thƣ,

thế nhƣng hàm lƣợng các alkaloid này trong cây không nhiều. Vì vậy, nhằm nghiên

cứu và xác định những điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn,

chúng tôi đã thực hiện đề tài “Tố ƣu ó quy trìn c ết xuất alkaloid trong cây

Dừa cạn”, với các mục tiêu cụ thể nhƣ sau:

- Xác định vinblastin từ thuốc tiêm.

- Khảo sát các hợp chất alkaloid trong Dừa cạn.

- Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn.

2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT

1.1.1. Catharanthus

Chi Dừa cạn Madagascar (danh pháp khoa học: Catharanthus) là một chi gồm 8

loài cây thân thảo sống lâu năm, trong số này có 7 loài là đặc hữu của Madagascar.

Trong thực tế, các loài trong chi này chia sẻ cùng một tên gọi chung (Dừa cạn) với

các loài trong chi Vinca (Dừa cạn Châu Âu).

Các loài trong chi:

+ Catharanthus coriaceus Markgr, 1970.

+ Catharanthus lanceus (Bojer ex A.DC.) Pichon, 1948.

+ Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon, 1949.

+ Catharanthus ovalis Markgr, 1970.

+Catharanthus pusillus (Murray) G. Don, 1837.

+ Catharanthus roseus (L.) G. Don, 1837: Dừa cạn, trƣờng xuân hoa, hải đằng,

bông dừa.

+ Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon, 1949.

+ Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon, 1949.

Số lƣợng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là 2n = 16. Trong các

loài của chi Catharanthus thì Catharanthus roseus là loài có giá trị ứng dụng và

kinh tế cao nhất. Ngoài việc đƣợc biết đến nhƣ một loại cây cảnh, từ lâu dịch chiết

alkaloid từ Catharanthus roseus đã đƣợc sử dụng trong y học dân gian nhƣ một loại

thuốc chống đái tháo đƣờng, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thƣơng

mau lành, chống viêm mắt, làm se da... và ngày nay ngƣời ta còn tìm đƣợc một

công dụng hết sức quan trọng của loài Catharanthus roseus, đó là khả năng điều trị

bệnh ung thƣ rất hiệu quả.

3

1.1.2. Catharanthus roseus (L.) G. Don

1.1.2.1. Tên gọi

Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G. Don; Vinca roseus L.; Lochnera rosea

Reich.

Tên gọi khác: Trƣờng xuân hoa, dừa tây, bông dừa, hải đằng, phjắc pót đông (Tày),

dƣơng giác, Madagascar periwinkle, pervenche de Madagascar.

Bậc phân loại thực vật:

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Phân lớp: Hoa Môi (Lamiidae)

Bộ: Trúc Đào (Apocynales)

Họ: Trúc đào (Apocynaceae)

Chi: Catharanthus

Loài: Catharanthus roseus (L.) G. Don [30]

1.1.2.2. Bộ phận dùng

Lá Dừa cạn đƣợc phơi nắng nhẹ hoặc sấy ở 30-50 oC đến khô. Lá chiếm 20-25 % so

với toàn cây. Lá phải chứa ít nhất 0,7 % alkaloid toàn cây.

Rễ chiếm 14,5 % so với toàn cây [3].

1.1.2.3. Đặc điểm thực vật

Dừa cạn là cây thân thảo, sống nhiều năm, cao 40-80 cm, phân nhiều cành thẳng

đứng, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên, mọc thành bụi.

Lá mọc đối, thuôn dài, đầu hơi nhọn, phía cuống hẹp, nhọn, dài 3-8 cm, rộng 1-2,5

cm, không có nhựa mủ.

4

Hoa trắng hoặc hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ ở kẽ lá phía trên, đài hợp thành ống

ngắn. Tràng hợp hình đinh. Phiến có 5 thùy, 5 nhị đính trên tràng, 2 lá noãn hợp với

nhau ở vòi.

Quả gồm 2 quả đại, dài 2,5-5 cm, rộng 2-3 mm, mọc thẳng đứng hơi ngả sang hai

bên, trong có 12-20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có những mụn

nổi thành hàng dọc. Mùa hoa, quả gần nhƣ quanh năm [6].

1.1.2.4. Phân bố và trồng trọt

Chi Catharanthus G. Don có nguồn gốc ở đảo Madagascar với 8 loài, trừ loài C.

pusillus (Murr.) G. Don có thể tìm thấy rải rác ở Ấn Độ và Srilanca. Từ Madagascar,

mọc hoang và đƣợc trồng ở nhiều nƣớc nhiệt đới cũng nhƣ ôn đới.

Ở nƣớc ta, dừa cạn mọc hoang khá nhiều ở vùng bãi cát ven biển từ Hải Phòng đến

Kiên Giang. Nơi tập trung nhiều nhất là các tỉnh Kiên Giang, đảo Phú Quốc và Côn

Đảo, có nhiều ở Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam – Đà Nẵng,

Bình Định, Phú Yên.

Ở nguyên quán, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan cây bụi trên đất pha cát

hoặc sỏi đá, độ cao tới 1500 m. Dừa cạn là loài cây ƣa sáng, ƣa ẩm và có khả năng

chịu đƣợc hạn. Cây ra hoa, quả nhiều hằng năm.

Nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tƣơng đối dồi dào. Trƣớc năm 1975, miền

Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu. Những năm gần đây, xuất khẩu sang Pháp

thƣờng xuyên hơn nhƣng chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [3].

1.1.2.5. Công dụng chủ yếu

Trong dân gian

Từ xa xƣa, Catharanthus roseus đã đƣợc sử dụng để chữa trị nhiều loại bệnh khác

nhau. Loài cây này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học dân gian.

Ở Madagascar, chiết xuất của Dừa cạn đã đƣợc sử dụng từ lâu nhƣ một loại thuốc

an thần, hạ huyết áp, sát trùng và thuốc điều trị tiểu đƣờng.

Ở Ấn Độ, chiết xuất từ lá của Dừa cạn đã đƣợc sử dụng để xử lý vết ong đốt.

5

Ở Trung Quốc, Dừa cạn đƣợc biết đến nhƣ một loài cây giúp lợi tiểu, trị ho và làm

săn se niêm mạc.

Ở Trung và Nam Mỹ, Dừa cạn đƣợc sử dụng để chữa viêm mắt và đau họng.

Ở Việt Nam, Catharanthus roseus từ lâu đã đƣợc dùng để hạ huyết áp, trị đái tháo

đƣờng, điều kinh, chữa lỵ, thông tiểu tiện. Có ngƣời dùng để trị ung thƣ máu, ung

thƣ phổi có hiệu quả. Cách dùng: Thƣờng dùng thân và lá phơi khô sắc uống, có thể

dùng tới 50 g [4].

Trong y học hiện đại

Nghiên cứu về dƣợc lý đã tiết lộ rằng Dừa cạn có chứa hơn 70 loại alkaloid (indol

alklaloids) khác nhau và mang đến hiệu quả trong điều trị các loại ung thƣ nhƣ ung

thƣ vú, ung thƣ phổi, ung thƣ tử cung, u ác tính, u lympho Hodgkin và không

Hodgkin [25]. Catharanthus alkaloids ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thƣ

bằng cách liên kết với các tubulin trong quá trình phân bào. Catharanthus alkaloids

cũng gây nên apoptosis (trình tự hủy diệt của tế bào theo chƣơng trình có sẵn trong

gen). Chúng cũng ức chế sự lây lan của nhiều loại ung thƣ khác nhau [10, 11].

Chiết xuất từ cây Dừa cạn cho các tác dụng hiệu quả lên các vi khuẩn và vi nấm

khác nhau. Theo một vài nghiên cứu, các hợp chất trong cây Dừa cạn có tác động

kháng khuẩn trên một số các vi khuẩn chọn lọc [12, 18].

Các nhà khoa học hiện đại đã tiến hành nghiên cứu và chứng minh đƣợc khả năng

điều trị tiểu đƣờng của các alkaloid trong loài cây này [17, 28].

Không những vậy, một vài nghiên cứu khác đã chứng minh đƣợc tác dụng hạ huyết

áp và lipid huyết của chiết xuất từ lá Dừa cạn. Các chiết xuất từ lá Dừa cạn có thể

đƣợc dùng làm thuốc hoặc bổ sung vào chế độ ăn đối với những ngƣời có nguy cơ

mắc bệnh cao huyết áp [9].

Bên cạnh đó, chiết xuất từ cây Dừa cạn còn có các tác dụng khác nhƣ làm lành vết

thƣơng nhanh chóng [21], điều trị tiêu chảy [16].

6

1.1.3. Các hợp chất alkaloid trong cây Catharanthus roseus (L.) G. Don

1.1.3.1. Alkaloid

a. Khái niệm

Đã từ lâu các nhà khoa học tìm thấy trong cây các hợp chất tự nhiên, những hợp

chất tự nhiên, những hợp chất này thƣờng là những acid hoặc những chất trung tính.

Nhƣng đến năm 1819, dƣợc sĩ Wilhelm Meissner mới đề nghị xếp các chất có tính

kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng và gọi là alkaloid, do đó ngƣời ta ghi

nhận Meissner là ngƣời đầu tiên đƣa ra khái niệm về alkaloid: “Alkaloid là những

hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra”.

Sau này, Polonopski đã định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa

nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thƣờng gặp trong thực vật và đôi khi

trong động vật, thƣờng có dƣợc lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với

một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid”.

Tuy nhiên, cũng có một số chất đƣợc xếp vào alkaloid nhƣng nitơ không ở dị vòng

mà ở mạch nhánh nhƣ: ephedrin trong Ma hoàng, capsaicin trong ớt, hordenin trong

mầm mạch nha, colchicin trong hạt cây tỏi độc...[5]

b. Phân loại

Alkaloid là những base bậc 1, bậc 2 hay bậc 3, đôi khi các alkaloid có nitơ bậc 4.

Hầu hết các alkaloid có nitơ tham gia vào nhân dị vòng nhƣng cũng có alkaloid mà

nitơ ở ngoài vòng.

Ngày nay, ngƣời ta thƣờng chia các alkaloid ra thành các loại:

Alkaloid thật: Những alkaloid đƣợc tạo nên từ acid amin và nitơ nằm trong dị vòng

là và gọi là những chất tạo ra từ acid amin.

Protoalkaloid: Nitơ nằm ở mạch thẳng.

Pseudoalkaloid: là những chất đƣợc tạo ra do sự ngƣng tụ amoniac với các hợp chất

không có nitơ.

7

Ngoài ra, ngƣời ta cũng phân loại alkaloid dựa theo cấu trúc của nhân:

Alkaloid không có nhân dị vòng: Những alkaloid thuộc nhóm này có nitơ nằm ở

mạch thẳng, còn gọi là “protoalkaloid”.

Alkaloid có nhân dị vòng: Các alkaloid loại này có thể có một vòng hay nhiều vòng.

Alkaloid có nhân sterol: Các alkaloid steroid có một khung

cyclopentanoperhydrophenantren và có 1 hoặc 2 nitơ trong mạch nhánh đã đóng

vòng ở vị trí C17 hoặc vị trí C3. Chúng là dẫn chất của dãy cholestan hoặc là dẫn

chất của dãy pregnan.

Alkaloid có cấu trúc terpen: Ngƣời ta mới thấy rất ít alkaloid có cấu tạo monoterpen

và sesquiterpen, cấu tạo diterpen có nhiều hơn nhóm mono và sesquiterpen.

Cũng có nhiều tác giả phân loại alkaloid theo họ thực vật [5].

1.1.3.2. Tính chất chung của alkaloid

a. Lý tính

Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy, nghĩa là

trong công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thƣờng ở thể rắn ở nhiệt độ

thƣờng. Những alkaloid không có oxy thƣờng ở thể lỏng (coniin, nicotin, spartein...),

tuy nhiên cũng có vài chất trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng nhƣ

arecolin (C8H13NO2), pilocarpin (C10H14N2O2) và có vài chất không có oxy ở thể rắn

nhƣ sempervirin (C19H16N2), concessin (C24H40N2). Các alkaloid ở thể rắn thƣờng

kết tinh đƣợc và có điểm chảy rõ ràng, nhƣng cũng có một số alkaloid không có

điểm chảy vì bị phá hủy ở nhiệt độ trƣớc khi chảy. Những alkaloid ở thể lỏng bay

hơi đƣợc và thƣờng vững bền, không bị phá hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo đƣợc

bằng hơi nƣớc để lấy ra khỏi dƣợc liệu.

Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay nhƣ

capsaicin, piperin, chavicin...

8

Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng

nhƣ berberin, palmatin, chelidonin...

Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung

môi hữu cơ nhƣ methanol, ethanol, ether, chloroform,... Trái lại, muối alkaloid thì

dễ tan trong nƣớc, hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực.

Năng suất quay cực: Phần lớn alkaloid có khả năng quay cực (vì trong cấu trúc có

carbon không đối xứng), thƣờng tả tuyền, một số nhỏ hữu tuyền [5].

b. Hóa tính

Hầu nhƣ alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng nhƣ base

mạnh và có khả năng làm xanh giấy quỳ. Có vài trƣờng hợp ngoại lệ, những

alkaloid không có phản ứng kiềm và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu.

Tác dụng với các acid, alkaloid cho các muối tƣơng ứng.

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt...) tạo ra các muối phức.

Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid,

chia làm 2 loại:

Phản ứng tạo tủa: Có hai nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid:

o Nhóm thuốc thử I cho tủa rất ít tan trong nƣớc. Tủa này sinh ra hầu hết là do

sự kết hợp của một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thƣờng là anion

phức hợp của thuốc thử.

Thuốc thử Valse - Mayer (K2HgI4– Kali tetraiodomercurat): Cho tủa trắng

hay vàng nhạt.

Thuốc thử Bouchardat (Iodo –Iodid): Cho tủa nâu.

Thuốc thử Dragendorff (KBiI4– Kali tetraiodobismutat III): Cho tủa vàng

cam đến đỏ.

Thuốc thử Bertrand (Acid silicotungstic): Cho tủa trắng hay trắng ngà.

Thuốc thử Hager (Acid picric): Cho tủa màu vàng đến đỏ cam.

9

o Nhóm thuốc thử thứ hai cho những kết tủa ở dạng tinh thể.

Dung dịch vàng clorid, acid picrolonic, acid styphnic.

Dung dịch platin clorid.

Dung dịch nƣớc bão hòa acid picric.

Phản ứng tạo màu: Có một số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc

biệt khác nhau, do đó ngƣời ta cùng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid.

Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết

có alkaloid nào trong đó [5].

1.1.3.3. Alkaloid trong Catharanthus roseus (L.)

Dừa cạn là một nguồn dƣợc liệu có giá trị điều chế các indol alkaloid

monoterpenoid. Có khoảng 90 alkaloid khác nhau đƣợc tổng hợp từ loài cây này,

trong số đó các alkaloid thì G.H. Svohada và cộng sự (1991) đã phân loại thành

nhiều nhóm hóa học:

a. Alkaloid dưới dạng monomer

Alkaloid thuộc nhân indol: alstonin (vỏ rễ), amorosin (rễ), catharantin (lá, rễ)...

Alkaloid thuộc nhóm 2-acyl indol: perividin (lá), perivin (lá, rễ), perosin (lá, rễ),

reserpin, ajmalicin (rễ), tetrahydroalstonin, serpentin (rễ), akuammin.

Alkaloid thuộc nhóm oxindol: mitraphylin (lá, rễ).

Alkaloid thuộc nhóm α-methylen indolin: akuammicin (rễ), lochnericin (lá), ...

Các alkaloid khác: amocalin (rễ), pericalin (rễ), perimivin (lá), virosin (rễ) [5].

b. Alkaloid dưới dạng dimer

Alkaloid thuộc nhóm nhỏ dimer idol – indolin: desacetyl – vincaleucoblastin (lá),

isoleurosin (lá), leurocristin (lá, rễ), leurosidin (lá, rễ), leurosin (lá, rễ), leurosivin

(rễ), neuleurocristin (lá), rovidin (lá), neoleurosidin (lá), vinaleucoblastin (lá, rễ).

Alkaloid thuộc nhóm nhỏ dimer khác: carosidin (lá, rễ), vincamicin (lá), vindolidin

(lá), vincarodin (lá), vindolicin (lá), vinosidin (rễ), vinsedicin (hạt) [3].

10

1.1.4. Các Vinca alkaloid chính

Trong Dừa cạn có chứa khá nhiều alkaloid, tuy nhiên các vinca alkaloid lại đóng vai

trò quan trọng giúp hình thành giá trị điều trị bệnh và giá trị thị trƣờng của cây này.

Vinca alkaloid là tập hợp các alkaloid có khả năng kháng mitotic và kháng

microtubule. Chúng có tác động ngăn chặn liên kết beta-tubulin trong quá trình

phân chia tế bào ung thƣ. Từ đó có vai trò quan trọng trong điều trị ung thƣ. Hai

vinca alkaloid chủ yếu hay đƣợc sử dụng đó là vinblastin và vincristin. Ngoài ra còn

một số các vinca alkaloid khác nhƣ vindesine, vinorelbine, vincaminol, vineridine

và vinburnine cũng đang đƣợc nghiên cứu và đƣa vào liệu trình điều trị.

1.1.4.1. Vinblastin (VB)

Công thức phân tử: C46H58N4O9.

Vinblastin là methyl (3aR,4R,5S, 5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9 -

[32]indol-9-yl ]-5-hydroxy-8-methoxy-6-methyl-3a,4,5,5a,6,11,12,13a-octahydro-

1H-indolizino [31] carbazol-5-carboxyl.

Vinblastin còn có tên gọi khác là vincaleucoblastine.

N

N

NH

OCH3 O N

CH3

H

H CH3

O CH3

O

OH

H

OCH3

O

OCH3

OH

CH3

Hình 1. 1. Công thức cấu tạo Vinblastin

11

a. Đặc điểm

Là tinh thể hình kim, kết tinh từ methanol.

Trọng lƣợng phân tử: 810,989 g/mol.

Điểm chảy: 211-216 oC

Bƣớc sóng hấp thụ cực đại của vinblastin trong ethanol là 214 nm và 259 nm.

Không tan trong nƣớc, ether dầu hỏa, tan trong alcol aceton, ethyl acetat,

chloroform [3].

Vinblastin dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, tạo ra khí nitơ oxit [24].

b. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

Vinblastin là vinca alkaloid đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1958 bởi Robert Noble

và Charles Thomas Beer tại đại học Western Ontario từ Dừa cạn [22].

Trong số các tác dụng dƣợc lý đƣợc nghiên cứu của VB thì hoạt tính chống ung thƣ

đƣợc nghiên cứu và đƣa vào ứng dụng nhiều nhất. Mặc dù cơ chế tác dụng của hợp

chất này còn chƣa thật sáng tỏ, nhƣng có lẽ vinblastin thể hiện tác dụng độc tế bào

bằng cách ức chế sự tạo thành các vi ống trên thoi gián phân, dẫn đến ngừng phân

chia tế bào ở pha giữa (pha M). Ở nồng độ cao, vinblastin còn thể hiện nhiều tác

dụng phức tạp trên tổng hợp acid nucleic và protein .VB có tác dụng chống ung thƣ

còn do tác động đối với chuyển hóa của glutamat và aspartat [2].

Vinblastin đƣợc sử dụng trong điều trị nhiều loại ung thƣ nhƣ: Ung thƣ vú [29], ung

thƣ phổi [15], ung thƣ bàng quang [26], ung thƣ tinh hoàn [14], ung thƣ các dòng tế

bào máu (bệnh máu ác tính), ung thƣ cổ và ung thƣ dạng nấm da [3]...

Từ năm 1970, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc điều trị bệnh

Letterer-Siwe (bệnh hệ lƣới lan tỏa nhiều phủ tạng) bằng VB [23].

Vinblastin có mặt trong liệu trình điều trị hội chứng mô bào (là hội chứng rối loạn

hiếm gặp gây ra bởi sự phát triển bất thƣờng của một loại tế bào máu trắng gọi là

mô bào) ở trẻ em. Không chỉ ở trẻ em, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng

vinblastin để điều trị hội chứng này ở ngƣời lớn và nghiên cứu cho kết quả khả quan

[27].

12

Vinblastin cũng có mặt trong danh sách các thuốc đƣợc dùng để trị bệnh Hodgkin

(một loại ung thƣ hạch, bệnh ung thƣ máu bắt đầu trong hệ bạch huyết) ở giai đoạn

III và IV. Thay vì dùng riêng lẻ, ngƣời ta hay phối hợp sử dụng đồng thời 4 thuốc là

mechloretamin, vinblastin, procabazine và prenisone để điều trị căn bệnh này [13].

Vinblastin còn đƣợc dùng để điều trị bệnh leukemia cấp, u lympho không Hodgkin,

lympho mô bào (u lympho mô bào), u sùi dạng nấm, sarcom cơ vân, u nguyên bào

thần kinh và u Wilm.

Vào năm 2016, các nhà khoa học Canada đã nghiên cứu đƣợc rằng, vinblastin mang

đến hiệu quả điều trị cũng nhƣ thể hiện ít độc tính trên các trẻ em bị u thần kinh

đệm cấp thấp [19].

1.1.4.2. Vincristin (VC)

Công thức phân tử: C46H56N4O10

Vincristin là methyl (1R,9R,10S,11R,12R,19R)-11-(acetyloxy)-12-ethyl-4-

[33]nonadeca-4(12),5,7,9-tetraen-13-yl]-8-formyl-10-hydroxy-5-methoxy-8,16-

diazapentacyclo[34]nonadeca-2(7),3,5,13-tetraene-10-carboxylate.

Vincristin còn có tên gọi khác là leurocristine.

NH

N OH

C2H5

N

N

C2H5

OCOCH 3

CHO

H OH COOCH 3

CH3OOC

OH3C

Hình 1. 2. Công thức cấu tạo Vincristin

13

a. Đặc điểm

Là tinh thể hình phiến

Điểm chảy: 218-220 oC

Trọng lƣợng phân tử: 824,972 g/mol

Bƣớc sóng hấp thụ cực đại trong ethanol là 220 nm, 255 nm và 296 nm.

Không tan trong nƣớc, ether dầu hỏa, tan trong alcol aceton, ethyl acetat,

chloroform [3].

b. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

Vincristin là một alkaloid chống ung thƣ có tác dụng kích ứng mạnh các mô. Cơ chế

tác dụng còn chƣa đƣợc biết thật chi tiết nhƣng vincristin là chất ức chế mạnh tế bào.

Thuốc liên kết đặc hiệu với tubulin là protein ống vi thể, phong bế sự tạo thành các

thoi phân bào cần thiết cho sự phân chia tế bào. Do đó vincristin có tính đặc hiệu

cao trên chu kì tế bào, và ức chế sự phân chia tế bào ở kì giữa. Ở nồng độ cao, thuốc

diệt đƣợc tế bào, còn ở nồng độ thấp, làm ngừng phân chia tế bào. Do thuốc có tính

đặc hiệu với kì giữa của sự phân chia tế bào nên độc lực của tế bào thay đổi theo

thời gian tiếp xúc với thuốc, nhờ có nửa đời thải trừ dài và độ lƣu giữ thuốc cao

trong tế bào nên không cần phải truyền kéo dài.

Cũng nhƣ VB, VC phối hợp với các chất khác trong điều trị bệnh leukemia cấp,

bệnh Hodgkin, u lympho không Hodgkin, sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh

và u Wilm. Vincristin cũng tỏ ra có ích trong điều trị bệnh leukemia mạn, sarcom

Ewing, u sùi dạng nấm, sarcom Kaposi, các sarcom mô mềm, sarcom xƣơng, u

melanin, đa u tủy, ung thƣ lá nuôi, ung thƣ trực tràng, não, vú, cổ tử cung, ung thƣ

tuyến giáp và ung thƣ phổi [2].

Vincristin cũng gây độc thần kinh, tuy nhiên không mạnh nhƣ vinblastin.

14

1.2. P ƣơng p áp c ết xuất, địn tín và địn lƣợng alkaloid

1.2.1. Chiết xuất

Việc chiết xuất alkaloid dựa vào tính chất chung nhƣ sau:

Alkaloid nói chung là những base yếu, thƣờng tồn tại trong cây dƣới dạng muối của

acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi có dạng kết hợp với tanin nên phải tán nhỏ dƣợc

liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những

kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh.

Hầu hết các alkaloid base không tan trong nƣớc nhƣng lại dễ tan trong dung môi

hữu cơ ít phân cực. Trái lại, các muối alkaloid thƣờng tan trong nƣớc, cồn và không

tan trong các dung môi ít phân cực. Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid

nhƣ loại bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phƣơng pháp chiết thích hợp.

Thông thƣờng, ngƣời ta sử dụng một trong 4 phƣơng pháp sau đây để chiết tách

alkaloid từ dƣợc liệu [5].

1.2.1.1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong mô trƣờng kiềm

Dƣợc liệu đƣợc tán nhỏ rồi tẩm bột dƣợc liệu với dung dịch kiềm trong nƣớc.

Chiết bột dƣợc liệu đã kiềm hóa nhƣ trên bằng dung môi hữu cơ không phân cực

thích hợp, dung môi này dùng để hòa tan các alkaloid base vừa đƣợc giải phóng.

Cất thu hồi dung môi hữu cơ dƣới áp lực giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dung

dịch acid loãng. Các alkaloid đƣợc chuyển sang dạng muối tan trong nƣớc, còn mỡ,

sắc tố và sterol... ở lại dung môi hữu cơ.

Gộp các dịch chiết muối alkaloid lại rồi kiềm hóa để chuyển alkaloid sang dạng

base, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid base.

Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid base, ngƣời ta thƣờng loại

nƣớc bằng muối trung tính khan nƣớc (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc

bốc hơi dung môi sẽ thu đƣợc alkaloid thô [5].

15

1.2.1.2. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nƣớc (P ƣơng

pháp STAS-OTTO)

Thấm ẩm bột dƣợc liệu bằng dung môi chiết xuất.

Chiết bột dƣợc liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alkaloid trong dƣợc liệu sẽ

chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên.

Hình 1. 3. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi

trƣờng kiềm

Bột dƣợc liệu (2-5 g)

Dịch chiết dung môi hữu cơ

Dịch chiết nƣớc acid

Dịch chiết dung môi hữu cơ

- Kiềm hóa vừa đủ ẩm

- Chiết bằng 20-30 ml dung môi hữu cơ ở nhiệt độ

phòng hoặc bằng Sohxlet

- Lắc dịch với dung dịch acid loãng

- Kiềm hóa đến pH = 10

- Chiết bằng 20-30 ml dung môi hữu cơ

Cắn alkaloid base

- Bốc hơi đến cắn khô

16

Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dƣới áp suất giảm, dùng ether rửa dịch

chiết đậm đặc còn lại. Trong môi trƣờng acid, ether thƣờng hòa tan 1 số hợp chất

chứ không hòa tan alkaloid.

Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nƣớc rồi lấy alkaloid base đƣợc giải

phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp. Cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc

hơi tới khô sẽ thu đƣợc cắn alkaloid thô [5].

1.2.1.3. Chiết bằng cồn acid

Có một số alkaloid trong dƣợc liệu tồn tại dƣới dạng muối tan tốt trong cồn ở môi

trƣờng trung tính. Do đó, sau khi tán nhỏ dƣợc liệu ở kích thƣớc thích hợp đem

thấm ẩm và chiết bằng cồn etylic tới kiệt alkaloid. Quy trình tiếp theo đƣợc thực

hiện tƣơng tự [5].

Hình 1. 4. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng nƣớc acid

Bột dƣợc liệu (2-5 g)

Dịch chiết nƣớc acid

Dịch chiết dung môi hữu cơ

Dịch chiết nƣớc acid

- 20 ml dung môi chiết

- Đun 15 phút, lọc (2 lần x 20 ml)

- Kiềm hóa đến pH = 10

- Chiết với dung môi hữu cơ

- Acid hóa bằng acid loãng (5 ml x 2 lần)

17

1.2.1.4. Chiết bằng cất kéo ơ nƣớc

Đây là phƣơng pháp dùng để chiết tách những alkaloid bay hơi đƣợc nhƣ coniin,

nicotin, spartein... Sau khi sấy khô dƣợc liệu, tán nhỏ, cho kiềm vào để đẩy alkaloid

dạng muối ra dạng base rồi lấy alkaloid ra khỏi dƣợc liệu theo phƣơng pháp cất kéo

bằng hơi nƣớc [5].

Hình 1. 5. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng cồn acid

Bột dƣợc liệu (2-5 g)

Dịch chiết cồn acid

Dịch chiết nƣớc acid

Dịch chiết dung môi hữu cơ

- 20 ml – 30 ml cồn có 5% acid

- Đun hồi lƣu 10 phút, lọc (2 lần x 20 ml)

- Trung hòa đến pH 5-6

- Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến cắn

- Hòa tan cắn trong nƣớc nóng (10 ml x 2 lần), lọc

- Kiềm hóa đến pH = 10

- Chiết bằng dung môi hữu cơ

Dịch chiết nƣớc acid

- Chiết với dung dịch acid

18

1.2.2. Định tính

1.2.2.1. Định tính trên tiêu bản thực vật

Muốn xác định xem trên tiêu bản thực vật có alkaloid hay không và có ở vị trí nào

thì ngƣời ta hay dùng thuốc thử Bouchardat (iodo-iodid). Vì protid cũng có thể cho

kết tủa với thuốc thử này nên để kết luận chắc chắn thì thƣờng tiến hành song song

hai tiêu bản:

Tiêu bản 1: Ngay sau khi mới cắt, nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, đợi

một lúc rồi soi kính hiển vi sẽ thấy kết tủa màu nâu.

Tiêu bản 2: Đem ngâm tiêu bản vào cồn tartric, sau đó rửa sạch cồn tartric,

đặt lên phiến kính rồi nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, để một lúc rồi đem

soi kính.

Nếu tế bào có chứa alkaloid thì alkaloid đã hòa tan trong cồn và trên vi phẫu 2

không quan sát thấy tủa nâu. Còn nếu vẫn thấy tủa thì phải nghĩ ngay tới tủa của

protid [5].

Hình 1. 6. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng cất kéo hơi nƣớc

Bột dƣợc liệu (10 g)

Dịch cất (50 ml)

Dịch chiết dung môi hữu cơ

Cắn alkaloid

- Kiềm hóa sau đó cất kéo theo hơi nƣớc

- Hứng vào bình có sẵn dung dịch acid loãng

- Kiềm hóa đến pH = 10

- Chiết với dung môi hữu cơ

- Bay hơi dung môi

19

1.2.2.2. Địn tín trong dƣợc liệu và trong các chế phẩm

a. Định tính bằng thuốc thử chung

Để phát hiện alkaloid trong dƣợc liệu bằng các thuốc thử chung, thƣờng ngƣời ta

chiết alkaloid ra khỏi cơ quan thực vật bằng phƣơng pháp chiết thích hợp rồi dùng

các thuốc thử để phát hiện và đánh giá sơ bộ sự có mặt của chúng trong dƣợc liệu.

Tùy theo phản ứng mà sử dụng dịch chiết thích hợp. Các phản ứng với thuốc thử

chung thƣờng đƣợc thực hiện với muối alkaloid trong môi trƣờng nƣớc acid.

Các thuốc thử chung cho với các alkaloid một tủa vô định hình có màu sắc không

đặc trƣng thay đổi tùy theo thuốc thử. Với một số thuốc thử, tủa này có thể tan lại

trong một lƣợng thuốc thử thừa.

Các thuốc thử thƣờng dùng là Bouchardat, Valse-Mayer, Dragendorff, Hager và

acid tannic [5].

b. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM)

SKLM đƣợc sử dụng nhƣ một phƣơng pháp phát hiện sự có mặt, đồng thời đánh giá

sơ bộ thành phần alkaloid của dƣợc liệu khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp.

Tiến hành sắc ký song song với 1 alkaloid chuẩn còn cho phép nhận định sự có mặt

của một alkaloid nào đó trong dƣợc liệu. SKLM còn hữu dụng trong việc xác định 1

dƣợc liệu khi sắc ký so sánh với dƣợc liệu chuẩn.

Pha tĩnh: Trong định tính alkaloid bằng SKLM, ta thƣờng dùng silica gel G, F254,

GF254 .Các pha tĩnh khác nhƣ nhôm oxyd, silica gel pha đảo đôi khi cũng đƣợc dùng.

Dung môi khai triển: Dung môi khai triển sắc ký alkaloid thƣờng là hỗn hợp 2 hay 3

dung môi hữu cơ, từ phân cực yếu tới phân cực trung bình. Đôi khi, các dung môi

phân cực mạnh hơn nhƣ butanol, ethanol, methanol, nƣớc, các acid nhƣ acid acetic,

acid formic cũng đƣợc dùng đối với alkaloid phân cực mạnh. Mẫu thử thƣờng là

alkaloid base hay hỗn hợp alkaloid base toàn phần đƣợc hòa tan trong các dung môi

ít phân cực và dễ bay hơi. Các hệ dung môi khai triển sắc ký thƣờng dùng cho

alkaloid là:

20

CHCl3– MeOH – NH4OH (50:9:1)

n-butanol – CH3COOH – NH4OH (4:1:5)

Cyclohexane – CHCl3– dietylamine (5:4:1)

CHCl3– MeOH (4:1)

Phát hiện vết: Để phát hiện vết alkaloid trên bản sắc ký, ngƣời ta thƣờng phun hoặc

nhúng với thuốc thử Dragendorff. Các alkaloid sẽ cho các vết màu đỏ cam trên nền

vàng cam. Cách phát hiện thông thƣờng nhƣ soi đèn UV (254 nm và 365 nm) hoặc

hơ trong hơi iod cũng đƣợc dùng nhƣ là phƣơng pháp bổ sung nhƣng không đặc

hiệu.

Ghi nhận kết quả: Ghi nhận số lƣợng các vết quan sát đƣợc trên sắc ký đồ về màu

sắc với các phƣơng pháp phát hiện, Rf và tỉ lệ tƣơng đối của các vết alkaloid trong

hỗn hợp [5].

1.2.3. Địn lƣợng

1.2.3.1. P ƣơng p áp cân

Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng khi đã chiết đƣợc alkaloid tinh khiết, nghĩa là đã

loại đƣợc hoàn toàn những tạp chất kèm theo.

Phạm vi sử dụng: Áp dụng với những alkaloid có tính base rất yếu, vì những

alkaloid này không chuẩn độ đƣợc bằng phƣơng pháp acid-base, do hằng số điện ly

quá bé sẽ không có bƣớc nhảy trên đƣờng cong chuẩn độ nên không quan sát đƣợc

sự chuyển màu rõ rệt của chỉ thị.

Thực hiện: Khi định lƣợng, ngƣời ta phải chiết đƣợc alkaloid tinh khiết bằng một

dung môi thích hợp, đem bốc hơi dung môi, sấy cắn đến khối lƣợng không đổi rồi

đem cân [5].

21

1.2.3.2. P ƣơng p áp trung ò (t ừa trừ)

Phạm vi sử dụng: Thƣờng dùng nhiều với những alkaloid họ Cà, áp dụng với các

alkaloid chiết ra ở dạng base.

Thực hiện: Sau khi đã có dịch chiết alkaloid base, có thể tiến hành định lƣợng bằng

cách lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ với lƣợng chính xác acid chuẩn độ dƣ, sau

đó định lƣợng acid thừa bằng kiềm tƣơng ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ,

cắn alkaloid còn lại đƣợc định lƣợng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ. Chỉ

thị thƣờng dùng trong phƣơng pháp chuẩn độ thừa trừ này là metyl da cam hoặc

metyl đỏ [5].

1.2.3.3. P ƣơng p áp chuẩn độ trong mô trƣờng khan

Phạm vi sử dụng: Áp dụng với các alkaloid có tính base rất yếu.

Thực hiện: Hòa tan alkaloid vào dung môi không phải nƣớc, thƣờng dùng acid

acetic khan (gọi là môi trƣờng khan). Sau đó dùng acid percloric để định lƣợng và

chỉ thị là tím tinh thể [5].

1.2.3.4. P ƣơng p áp đo qu ng

Phạm vi sử dụng: Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng với các alkaloid có màu tự nhiên

hoặc các alkaloid có thể tác dụng với thuốc thử hoặc biến đổi để tạo thành các chất

có màu.

Thực hiện:

- Đối với các alkaloid có màu tự nhiên, có thể đo trực tiếp màu dung dịch

- Với những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lƣợng trực

tiếp, ngƣời ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách

riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp để thu đƣợc dung dịch có màu để

định lƣợng.

- Một số alkaloid có thể biến đổi để tạo thành một dẫn chất có màu hoặc dùng

phản ứng giáng phân alkaloid thành những phần nhỏ, lấy riêng phần cần thiết

rồi cho tác dụng với thuốc thử tạo ra dung dịch có màu để định lƣợng [5].

22

1.2.3.5. P ƣơng p áp sắc ký lỏng hiệu năng c o (HPLC)

Phạm vi sử dụng: Áp dụng cho nhiều alkaloid khác nhau.

Thực hiện: Để tến hành định lƣợng alkaloid bằng phƣơng pháp HPLC cần:

- Có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn.

- Xây dựng phƣơng pháp chiết kiệt alkaloid trong dƣợc liệu đáp ứng đủ nhu cầu

định lƣợng.

- Xây dựng đƣợc chƣơng trình sắc ký trên máy HPLC (pha tĩnh, pha động,

detector, tốc độ dòng, thể tích tiêm, nhiệt độ phân tích) [5].

1.3. Tố ƣu ó bằng phần mềm

1.3.1. Giới thiệu chung

Trong điều kiện chiết, ngoài bản chất của mẫu chiết thì kết quả của quá trình chiết

còn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố bên ngoài. Vì vậy, cần tối ƣu hóa các điều

kiện này để đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Tối ƣu hóa có thể đƣợc định nghĩa là quá

trình tìm kiếm các yếu tố ảnh hƣởng để hạm mục tiêu đạt lớn nhất hoặc nhỏ nhất

theo mong muốn, trong khi vẫn đáp ứng đủ các điều kiện ban đầu.

1.3.2. P ƣơng p áp tố ƣu ó

Thông thƣờng, có 2 phƣơng pháp để tối ƣu hóa một mô hình :

- Phƣơng pháp cổ điển (phƣơng pháp thực nghiệm một biến số): ta thay đổi lần

lƣợt từng yếu tố (biến độc lập) để thu đƣợc kết quả (biến phụ thuộc), thực hiện

lần lƣợt với từng yếu tố. Phƣơng pháp này tƣơng đối đơn giản nên chỉ áp dụng

cho mô hình có từ một đến hai biến độc lập. Phƣơng pháp không có hiệu quả

trong các mô hình nhiều yếu tố.

- Phƣơng pháp tối ƣu hóa bằng phần mềm chuyên dụng: phƣơng pháp này cho

phép xây dựng đƣợc các mô hình có nhiều yếu tố ảnh hƣởng. Đánh giá đƣợc sự

ảnh hƣởng nhiều hay ít giữa các yếu tố, từ đó xác định đƣợc kết quả dự đoán

bằng các phép tính toán trong phần mềm. Có nhiều phần mềm chuyên dụng cho

việc tối ƣu hóa nhƣ MODDE, JMP, Design – Expert [8].

23

1.3.3. Phần mềm tố ƣu ó Modde 5.0

Modde 5.0 là phần mềm tối ƣu hóa đƣợc phát triển bởi Umetrics AB. Đây là phần

mềm đƣợc xây dựng để thiết kế và đánh giá các thử nghiệm với nhiều biến số khác

nhau. Phần mềm này giúp ngƣời sử dụng định hƣớng cải thiện và tối ƣu hóa đƣợc

các sản phẩm cũng nhƣ quy trình với lƣợng thử nghiệm tối thiểu, do đó giảm đƣợc

công sức và tiết kiệm đƣợc thời gian hơn so với dùng các phƣơng pháp đắt tiền khác.

Phần mềm Modde có những công dụng nhƣ sau:

- Thiết kế thử nghiệm.

- Phân tích dữ liệu và đánh giá kết quả.

- Dự đoán và tối ƣu hóa quy trình [20].

24

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1. Đố tƣợng nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu

Dược liệu (Toàn cây Dừa cạn)

Dƣợc liệu đƣợc thu mua tại hiệu thuốc đông y trên đƣờng Hải Thƣợng Lãn Ông,

Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu dƣợc liệu sau khi sơ chế đƣợc sấy khô.

Dƣợc liệu khô đƣợc xay nhỏ đến dạng bột thô. Bảo quản trong bao nylon kín.

Alkaloid định hướng chiết từ thuốc tiêm:

Vinblastin sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1

mg vinblastin sulfat) của công ty Cipla Pharma.

Thành phần của dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/10ml:

Vinblastin sulfat ................................................ 1mg

Natri clorid ....................................................... 9 mg

Benzyl alcohol ............................................ 0,9% v/v

Nước cất pha tiêm ........................... vừa đủ thể tích

2.1.2. Dung môi, hóa chất

Bảng 2. 1. Dung môi và hóa chất cần dùng

Stt Tên dung môi, hóa chất Xuất xứ

1 Chloroform Trung Quốc

2 Dicloromethan Trung Quốc

3 Ethyl acetat Trung Quốc

4 Hexan Trung Quốc

5 Toluen Trung Quốc

6 Methanol Trung Quốc

7 Ethanol 50%, 80%, 96% Việt Nam

8 Amoniac đậm đặc Trung Quốc

9 Acid hydrochloric Trung Quốc

25

2.1.3. Trang thiết bị

Bảng 2. 2. Các thiết bị sử dụng

Stt Tên thiết bị Model Hãng sản xuất

1 Bếp cách thủy WNB 14 Memmert (Đức)

2 Cân phân tích 0,1mg Entris 224I-1S Sartorius (Đức)

3 Đèn UV 254 nm & 365 nm UVP10 Spectroline (Mỹ)

4 Máy đo quang UV UV 1800 Shimadzu (Nhật)

5 Tủ hood BS-122 Tran Vu (Việt Nam)

6 Máy xay An Phú Tân (Việt Nam)

7 Tủ sấy UN 110 Memmert (Đức)

8 Máy cô quay RV 10 Control IKA (Đức)

9 Kính hiển vi CX 22 Olympus (Nhật)

26

2.2. P ƣơng p áp ng ên cứu

2.2.1. Chọn lk lo d để địn ƣớng chiết

Sử dụng dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1 mg vinblastin

sulfat) của công ty Cipla Pharma.

2.2.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin

a. Phương pháp hóa học

Chuẩn bị mẫu: Hút 1 ml thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1 mg

vinblastin sulfat), pha loãng với nước cất vừa đủ 10 ml.

Sau khi chuẩn bị mẫu nhƣ trên, tiến hành định tính alkaloid bằng phƣơng pháp hóa

học với các thuốc thử chung alkaloid.

b. Sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị mẫu:

+ Mẫu 1: Thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1 mg vinblastin sulfat).

+ Mẫu 2: Hút chính xác 1 ml dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin cho vào bình

định mức 20 ml, thêm nước cất đến vạch. Acid hóa dịch nƣớc với HCl 1M (TT)

đến pH 1-2, sau đó kiềm hóa dung dịch bằng amoniac đậm đặc (TT) đến pH 9-

10. Chiết vinblastin base trong dung dịch bằng chloroform. Cô thu hồi bớt dung

môi.

Tiến hành khai triển sắc ký lớp mỏng và quan sát ở những điều kiện khác nhau.

2.2.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm

Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) của phần 2.2.1.1.

2.2.1.3. Xác định khố lƣợng phân tử của alkaloid chiết đƣợc

Thực hiện đo khối phổ của mẫu dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm bằng hệ ESI-

MS/MS (Phƣơng pháp ion hóa phun điện).

Ghi nhận lại phổ đồ và xác định số khối của hoạt chất trong mẫu thử.

27

2.2.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 10

mg/ 10 ml bằng p ƣơng p áp qu ng p ổ

Chuẩn bị mẫu:

+ Mẫu 3: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1

mg vinblastin sulfat) vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch để thu

đƣợc dung dịch có nồng độ 0,001 g/l (1 ppm)

+ Mẫu 4: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) phần 2.2.1.1. Cô dịch chloroform đến

cắn. Hòa tan cắn với methanol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol

đến vạch.

Tiến hành quét phổ của 2 mẫu trên bằng máy quang phổ Shimadzu UV 1800 để

khảo sát cực đại hấp thụ của các mẫu này.

2.2.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn của alkaloid sulfat trong nƣớc

Chuẩn bị mẫu: Tiến hành chuẩn bị 6 dung dịch mẫu nhƣ sau để thu đƣợc các dung

dịch có nồng độ (g/l) khác nhau.

Trộn 5 ống thuốc tiêm lại, lắc đều cho đồng nhất. Hút lƣợng thuốc tiêm nhƣ sau:

Dung dịch 1: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm pha vào bình định mức 50 ml.

Dung dịch 2: Hút chính xác 18 ml dung dịch 1 pha vào bình định mức 20 ml.

Dung dịch 3: Hút chính xác 14 ml dung dịch 1 pha vào bình định mức 20 ml.

Dung dịch 4: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm pha vào bình định mức 100 ml.

Dung dịch 5: Hút chính xác 16 ml dung dịch 4 pha vào bình định mức 20 ml.

Dung dịch 5: Hút chính xác 12 ml dung dịch 4 pha vào bình định mức 20 ml.

Thêm nước cất vừa đủ thể tích.

Bảng 2. 3. Nồng độ các dung dịch thu đƣợc

Dung dịch 1 2 3 4 5 6

Nồng độ thu đƣợc (g/l) 0,002 0,0018 0,0014 0,001 0,0008 0,0006

28

Tiến hành đo độ hấp thụ của các mẫu bằng máy quang phổ Shimadzu UV 1800 và

vẽ đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của vinblastin

sulfat.

2.2.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn

2.2.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật

Soi bột: Quan sát bột bằng cảm quan (màu sắc, mùi vị) trƣớc khi soi trên kính hiển

vi.

2.2.2.2. Địn tín lk lo d trong dƣợc liệu dừa cạn

a. Phương pháp hóa học

Chuẩn bị mẫu: Lấy 3 g bột dƣợc liệu cho vào một bình nón nút mài, làm ẩm bột

dƣợc liệu bằng amoniac đậm đặc (TT) trong 30 phút. Thêm 30 ml chloroform (TT),

lắc kỹ trong 30 phút, lọc vào bình lắng gạn. Chiết 3 lần bằng dung dịch acid

hydrocloric 2 % (TT), mỗi lần với 5 ml, thu đƣợc dịch chiết acid.

Tiến hành thử với các thuốc thử chung alkaloid để xác định sự có mặt của alkaloid.

b. Sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị mẫu:

+ Mẫu chuẩn: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) phần 2.2.1.1.

+ Mẫu thử: Chuyển dung dịch acid đã chiết ở phần phản ứng hóa học còn lại

vào bình gạn, kiềm hóa bằng amoniac đậm đặc (TT) tới pH 9-10, lắc với

chloroform 2 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch chiết chloroform, cô trên cách thủy

đến còn khoảng 5 ml.

Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định sự có mặt của alkaloid.

29

2.2.2.3. Xây dựng quy trình chiết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ Dừa cạn

Quy trình chiết alkaloid cơ bản:

Tiến hành khảo sát các dung môi thích hợp cần dùng để thu đƣợc quy trình ổn định

và phù hợp nhằm chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn. Các bƣớc tiến hành khảo

sát đƣợc tiến hành nhƣ sau:

a. Khảo sát dung môi chiết ở bước 1 (theo hình 2.1)

Tiến hành khảo sát dung môi chiết bƣớc 1 theo quy trình chiết với các dung môi:

+ Ethanol 50 %

+ Ethanol 80 %

+ Ethanol 96 %

Các dung môi dùng ở bƣớc 2 và 3 tùy chọn. Ghi nhận lại khối lƣợng cao alkaloid

toàn phần (m2) và tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn

phần thu đƣợc.

Bột dƣợc liệu

Dịch lọc

Dịch nƣớc còn lại

Dịch chiết dung môi

- Ngâm lạnh với dung môi chiết 1

- Cô thu hồi bớt dung môi, lọc

- Lắc phân bố với dung môi 2 để loại

chlorophyll.

- Loại bỏ dịch dung môi

- Chiết với dung môi 3

Bƣớc 1

Bƣớc 2

Bƣớc 3

Hình 2. 1. Sơ đồ tổng quát chiết xuất alkaloid từ dƣợc liệu

30

b. Khảo sát dung môi loại chlorophyll ở bước 2 (theo hình 2.1)

Sau khi đã khảo sát xong dung môi chiết bƣớc 1, chiết alkaloid trong Dừa cạn bằng

dung môi đã chọn, sau đó tiến hành khảo sát dung môi 2 loại chlorophyll theo quy

trình chiết cơ bản (hình 2.1) với các dung môi sau:

+ Hexan

+ Toluen

+ Ethyl acetat

+ Dicloromethan

Dùng dung môi tùy ý để chiết ở bƣớc 3. Ghi nhận lại khối lƣợng tủa (m1) sau khi

loại chlorophyll và khối lƣợng cao alkaloid toàn phần (m2).

Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn phần thu đƣợc.

c. Khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base ở bước 3 (theo hình 2.1)

Dùng các dung môi đã khảo sát đƣợc ở mục (a), (b) và tiến hành khảo sát tiếp dung

môi để chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 theo quy trình chiết cơ bản (hình 2.1) nhƣ

trên. Khảo sát dung môi chiết alkaloid base với các dung môi sau:

+ Chloroform

+ Ethyl acetat

+ Dicloromethan

Ghi nhận lại khối lƣợng cao alkaloid toàn phần (m2) thu đƣợc.

Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn phần thu đƣợc.

2.2.3. Tố ƣu ó quy trìn c ết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ Dừa cạn

Từ kết quả nghiên cứu sơ bộ ở trên, ta có thể chọn đƣợc các dung môi thích hợp để

thu đƣợc quy trình chiết alkaloid ổn định và phù hợp. Để chiết xuất đƣợc alakloid từ

cây Dừa cạn, ta dùng phƣơng pháp ngâm lạnh, tuy nhiên, hiệu suất của phƣơng

pháp này lại phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau nhƣ thời gian chiết xuất,

31

dung môi chiết xuất, tỉ lệ dung môi và dƣợc liệu, nhiệt độ chiết... Vì vậy, tiến hành

tìm những điều kiện chiết tối ƣu để thu đƣợc lƣợng alkaloid toàn phần nhiều nhất.

Áp dụng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm với 3 yếu tố độc lập: Tỷ lệ dung môi

và dƣợc liệu, thời gian ngâm lạnh (giờ), pH dùng để kiềm hóa. Yếu tố phụ thuộc

hay thông số tối ƣu hóa là khối lƣợng alkaloid toàn phần cân đƣợc (g). Giá trị các

yếu tố độc lập và khoảng biến thiên đƣợc trình bày ở bảng 2.4 [7].

Sử dụng phần mềm Modde 5.0 theo mô hình D-Optional để thiết kế 13 thí nghiệm

chọn ngẫu nhiên trong tổng 27 thí nghiệm, sau đó thực hiện lặp lại 3 lần thí nghiệm

tại mức độ cơ bản của các yếu tố. Thực hiện 16 thí nghiệm đã thiết kế, nhập số liệu

thu đƣợc và phân tích kết quả dựa trên các phân tích toán học của phần mềm Modde

5.0.

Bảng 2. 4. Các yếu tố ảnh hƣởng và mức độ biến đổi

Stt Yếu tố

Ký

hiệu

Mức

cơ bản

Mức

trên (+)

Mức

dƣới (-)

Khoảng biến

thiên ()

1

Tỷ lệ dung môi

và dƣợc liệu

(ml/g)

X1 10:1 15:1 5:1 5

2 Thời gian ngâm

lạnh (giờ) X2 24 30 18 6

3 pH dùng để

kiềm hóa X3 9,0 10,0 8,0 1,0

32

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Chọn lk lo d để địn ƣớng chiết

3.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin

3.1.1.1. P ƣơng p áp ó ọc

Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (a) phần 2.2.1.1, sau đó lấy 6 ml dung dịch mẫu cho vào

6 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml.

- Ống 1 (Ống chứng): Không thêm thuốc thử.

- Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT).

- Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT).

- Ống 4: Thêm 2 giọt thuốc thử Bertrand (TT).

- Ống 5: Thêm 2 giọt thuốc thử Valse-Mayer (TT).

- Ống 6: Thêm 2 giọt thuốc thử Hager (TT).

Sau khi cho các thuốc thử chung alkaloid vào các ống nghiệm, so sánh với ống 1

(ống chứng), quan sát thấy các hiện tƣợng nhƣ bảng 3.1:

Bảng 3. 1. Kết quả định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng phƣơng

pháp hóa học

Ống Thuốc thử Kết quả Đán g á

1 Không thêm thuốc thử

2 Dragendorff Xuất hiện tủa cam +++

3 Bouchardat Xuất hiện tủa nâu ++

4 Bertrand Xuất hiện tủa trắng +

5 Valse-Mayer Xuất hiện tủa trắng +

6 Hager Xuất hiện tủa vàng +++

Chú thích: (+) dung dịch đục mờ nhƣng không lắng

(++) Dung dịch đục, có tủa lắng sau vài phút

(+++) Có tủa lắng ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt TT thứ 2.

Nhận xét: Khi cho thêm các thuốc thử vào, thấy xuất hiện kết tủa và dung dịch bị

đục, chứng tỏ trong mẫu thuốc tiêm Cytoblastin có alkaloid.

33

3.1.1.2. Sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (b) phần 2.2.1.1 và tiến hành sắc ký với điều kiện:

- Bản mỏng: Silica gel F254.

- Dung môi khai triển: Chloroform – Methanol (9:1).

- Phát hiện vết bằng UV 254 nm, UV 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff.

(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm

(c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff

Hình 3. 1. Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) trong thuốc tiêm

Cytoblastin (1) và dịch chiết ra từ thuốc tiêm (2)

(a) (b) (c) (d)

34

Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, nhận thấy khi soi bản mỏng ở ánh sáng

bƣớc sóng 254 nm, vết vinblastin sulfat trong thuốc tiêm Cytoblastin (1) và vết của

dịch chiết từ thuốc tiêm (2) có Rf bằng nhau và hiện màu tím lơ. Đồng thời, sắc ký

đồ của 2 dung dịch sau khi phun thuốc thử Dragendorff cho 2 vết màu cam.

3.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm

Thực hiện chiết nhƣ mẫu 2, thu đƣợc dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm.

3.1.3. Xác định khố lƣợng phân tử của chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm bằng

p ƣơng p áp sắc ký lỏng g ép đầu dò khối phổ (MS )

Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu nhƣ phần 2.2.1.3. Tiến hành đo khối phổ của mẫu thử

bằng hệ ESI-MS/MS (Phƣơng pháp ion hóa tia điện).

- Thời gian chạy: 1 phút

- Năng lƣợng ion hóa: 70 eV

- Tốc độ dòng: 2 ml/ phút

Nhận xét: Sau khi quan sát phổ khối của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin, ta

thấy số khối của hoạt chất trong dịch thử là [M] = 811,36 m/z và [M+1] = 812,50

m/z. Phổ khối ESI-MS của chất thử cho pic ion phân tử, ở dạng [M+1] với cƣờng

độ khá mạnh, các pic ion phân tử với số khối phù hợp với trọng lƣợng phân tử lý

thuyết của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V là M = 811,0 g/mol [1].

Hình 3. 2. Phổ khối ESI-MS của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin

35

Kết luận: Từ kết quả của các mục 3.1.1, 3.1.2 và 3.1.3 có thể khẳng định rằng trong

thuốc tiêm Cytoblastin có chứa vinblastin.

3.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin

10mg/ 10ml bằng p ƣơng p áp qu ng p ổ

Chuẩn bị mẫu nhƣ mục 2.2.1.4. Tiến hành quét phổ để tìm cực đại hấp thụ của

vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin, thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

- Mẫu 1: Có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng λ= 258,0 nm, A = 0,327.

- Mẫu 2: Có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng λ= 258,0 nm, A = 0,127.

Hình 3. 3. Phổ UV-Vis của vinblastine sulfat trong nƣớc

36

Nhận xét: Mẫu 3 và mẫu 4 đều có cực đại hấp thụ tại max = 258 nm. Vậy chọn

bƣớc sóng 258 nm để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử.

3.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat trong nƣớc

Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.1.5 ở bƣớc sóng

258 nm, kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.2:

Bảng 3. 2. Độ hấp thụ của các dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin

Mẫu Nồng độ (g/l) Độ hấp thụ

1 0,0020 0,641

2 0,0018 0,576

3 0,0014 0,441

4 0,0010 0,319

5 0,0008 0,259

6 0,0006 0,197

Hình 3. 4. Phổ UV-Vis của vinblastine base trong methanol

37

Trắc nghiệm t: Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số a và b theo phƣơng trình hồi quy:

y = 317x + 0,003.

Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj không có ý nghĩa thống kê”.

HA: Bj ≠ 0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê”.

- t0,05 (n-2) = 2,77.

- t0 = 0,86 < t0,05 (n-2) = 2,77 chấp nhận H0 hệ số b không có ý nghĩa

thống kê.

- t0 = 94,39 > t0,05 (n-2) = 2,77 chấp nhận HA hệ số a có ý nghĩa thống kê.

Trắc nghiệm f: Kiểm tra tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy.

Giả thuyết H0: Bj = 0 “Phƣơng trình hồi quy không tƣơng thích”.

HA: Bj ≠ 0 “Phƣơng trình hồi quy tƣơng thích”.

- f0,05 = 7,71.

- f = 8910,16 > f0,05 chấp nhận HA phƣơng trình hồi quy tƣơng thích.

y = 317.0x + 0.003

R² = 0.999

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025

Độ h

ấp thu A

Nồng độ vinblastine sulfate (g/l)

Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ

của vinblastine sulfat

38

Nhận xét: Kết quả trên cho thấy có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và độ

hấp thụ của vinblastin sulfat theo phƣơng trình y = 317x, R2= 0,999 trong khoảng

nồng độ vinblastin sulfat từ 0,0006 - 0,002 g/l.

Nhận xét chung:

Ta chiết vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng cách chuyển vinblastin ở dạng

muối thành vinblastin base và dùng dung môi hữu cơ để chiết vinblastin base ra

khỏi dung dịch. Sau khi tiến hành định tính dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin và

dịch chiết đƣợc từ thuốc tiêm thì kết quả cho thấy có alkaloid trong cả 2 dung dịch.

Đồng thời, khi xác định khối lƣợng phân tử của chất đã chiết đƣợc bằng phƣơng

pháp MS, ta thấy khối lƣợng phân tử của chất đã chiết tƣơng đƣơng với khối lƣợng

phân tử của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V (M = 811,0 g/mol). Chứng tỏ có

alkaloid (định tính vinblastin) trong dịch chiết này.

Khảo sát cực đại hấp thụ của chất đã chiết và vinblastin sulfat trong thuốc tiêm, ta

thấy cả 2 mẫu đều có cực đại hấp thụ tại 258 nm. Chọn bƣớc sóng 258 nm là bƣớc

sóng để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử.

Sau khi tiến hành thực nghiệm, ta thấy có sự tƣ�