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DNA
Laborbiologie WS 2012
Theresia Stradal Institut für Molekulare Zellbiologie
Nukleotide-Funktionen
Energielieferanten bei metabolischen Prozessen
Regulatorische Funktion, sekundärer Botenstoff
Bausteine der Nukleinsäuren
Nukleotide Nukleotid
Nukleosid
Aromatische Moleküle - Delokalisierte Elektronen zwischen den Atomen der Ringe
Nukleotide - Basen
Nukleinsäuren – Struktur
• Nucleinsäuren werden wegen ihrer Polymerstruktur als Polynucleotide bezeichnet
• Ein Polynucleotid besteht aus Monomeren, den Nucleotiden
• zwei Monomere werden unter Abspaltung eines Wassermoleküls kovalent miteinander verbunden = Kondensation
Nukleinsäuren - Struktur Primärstruktur: Phosphodiester-Bindungen verbinden Nukleotide
Es entsteht ein Zucker Phosphat Rückgrat
Nukleinsäuren - Struktur
Nukleinsäuren - Sekundärstruktur Basenpaarung Doppelhelix, 2 antiparalelle Moleküle, komplementäre Sequenz
Nukleinsäuren - Struktur
Sekundärstruktur: Doppelhelix In Polynukleotiden kommt es zur Basenpaarung G paart sich mit C A paart sich mit T Die gepaarten stränge verlaufen immer antiparallel 2 Kräfte halten Doppelhelix: 1. Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen 2. "Stacking interactions" Je mehr H-Brücken umso stabiler je höher der GC-Gehalt umso stabiler
Nukleinsäuren - Struktur
RNA bleibt ein Einzelstrang Dieser bildet sog. Sekundärstrukturen durch Paarung ähnlicher aber entfernter, kurzer Sequenzabschnitte
Nukleinsäuren - Struktur
Nukleinsäuren - Struktur Sekundärstruktur: Doppelhelix
Nukleinsäuren – Organisation in der Zelle - Chromatin
Nukleinsäuren - Struktur Denaturierung von DNA
- Hitze
- pH
- Ethanol
=> Prinzipien?
Nukleinsäuren - Struktur Denaturierung von DNA
=> Sie isolieren DNA von 2 verschiedenen Organismen O1: 30% AT O2: 40% AT Einer von beiden lebt in heißen Quellen. Was vermuten Sie welcher es ist?
Versuchsschema
Mechanisches Aufbrechen des Gewebes
Chemische Lyse der Zellen
Proteinfällung
DNA-Fällung
Überprüfung der Reinheit von DNA Demonstration des thermochromen Effekts
DN
A Isolation C
harakterisierung
Fragen zur DNA-Isolation
=> Worauf beruht die Fällbarkeit von Nukleinsäuren?
=> Worauf beruht die Fällbarkeit von Proteinen?
=> Was bewirkt die Zugabe von SDS im Lysepuffer?
=> Warum geben Sie im Lysepuffer RNase zu?
=> Warum enthält der DNA Puffer EDTA?
Absorption von Licht durch Moleküle
Spektrophotometer
Lambert-Beer'sches Gesetz: ]exp[0 clII ε−=
ε: molarer Extinktionskoeffizient [l/(mol cm)] c: Konzentration der absorbierenden Moleküle [mol/l] l: Länge des Licht durch die Probe [cm]
Messgröße: Absorption A = log(I0/I) (auch OD, optische Dichte)
Absorption von Licht durch Nukleotide
Absorption von Licht durch DNA
Hyperchromie
Absorption von Licht durch Nukleotide
OD260 = 1 entspricht 50 µg/ml doppelsträngiger (ds) DNA, 40 µg/ml RNA, 33 µg/ml einzelträngiger DNA 20 µg/ml bei Oligonucleotiden. Dieses gilt für Nukleinsäuren bei pH 7,0. Es gilt OD260 ~ c für gerine DNA Konzentrationen
Konzentrationsbestimmung von DNA
=> Bestimmen Sie die Konzentration der von Ihnen isolierten DNA!
Absorption von Licht durch Aminosäuren
Maximum bei 190-210nm: π -> π* Übergange in der Amid Gruppe Maximum bei 280nm: π -> π* Übergänge in aromatischen Aminosäuren
=> Warum lässt sich die Konzentration von Proteinen nicht durch Messung der optischen Dichte bei 280nm bestimmen?