Diagnóstico microbiológico del síndrome diarreico agudoInnovaciones tecnológicas

Dra. Maritza Navarrete C

Microbiólogo clínicoHospital Base Valdivia

OBJETIVOS

• Conocer el desarrollo en el dg de las infecciones GI y discutir la aplicación clínica y las limitaciones de la implementación de estas técnicas.

• Conocer el Desafío de clínicos : Reconocer quienesrequieren test diagnóstico y a quienes tratar.

• Compartir experiencia en el diagnóstico molecular enel SDA en el HBV

Consideraciones del Síndrome diarreico

• 1,7 billones de casos de diarrea reportadas al año

• Segunda causa de muerte en < 5 años en el mundo

• 2,2 millones de muerte/año

• Prevalencia varía con la edad del huésped, estado inmune e historia de viaje

• Asociado a una amplia gama de PatógenosIDSA,AmericanCollegeofGastroenterology

SITUACIÓN EPIDEMIOLÓGICA CHILE2013-2017

• Vigilancia Centinela < 5 AÑOS: Atención primaria (Morbilidad y Etiología) Decreto Supremo N°158/04

• Tasa Diarrea en < 5 años: 2013: 6,8 por cien menores de 5 años, 2017: 6,6 por cien menores de 5 años (Los Ríos 4,0 y 1,9 respectivamente).

• Vigilancia Etiológica: 32% (301/943) se determinó la presencia de algún agente.

Viral :47% (190/408 – Norovirus, Rotavirus, Astrovirus y ADV), Bacteriana: 31% (102/330- ECEP ECEA y ECET ),

Parasito 4% (9/205- Cryptosporidium, Giardia lamblia, Blastocystis hominis).

Consideraciones del Síndrome diarréico

Definición > 3 deposiciones líquidas al día Clasificación según duración

Aguda < 14 dias

Persistente 14-30 diasCrónica 30 días

Clasificación según etiología

Infecciosa Bacterias, Virus, Parasitos

No Infecciosa Intolerancia alimentaria, Enf. Inflamatorias intestinales, Síndr. Intestino Irritable

IDSA 2017 American College og Gastroenterology

Agentes de Diarrea Aguda InfecciosaAGENTE DIARREA ACUOSA DIARREA DISENTÉRICABACTERIAS EETC (DIARREA VIAJERO)

Vibrio cholerae,parahaemolyticusShigella sppSalmonella sppYersinia spp

Aeromonas sppCampylobacter sppE. Coli productora de SLT (Ej. E coli O157:H7)Shigella sppSalmonella sppYersinia spp

VIRUS NorovirusRotavirusAdenovirusAstrovirus

PARÁSITOS Giardia lambliaCryptosporidiumIsospora o Cyclospora spp

Entamoeba histolytica

TOXINA Clostridium difficileStaphylococcus aureusBacillus cereusClostricium perfringens

Diagnóstico Microbiológico ConvencionalBACTERIOLÓGICO: Coprocultivo 2-5% (94% recup. prim. Muestra)Hektoen (Salmonella y Shigella) Cultivo de CampylobacterMc Conkey Sorbitol ( E. coli O157) TCBS ( Vibrio spp)CNI Yersinia AS Plesiomonas shigelloides

VIRUS:Inmunoensayos (EIA, ICT, Aglutinación)/Detección de Antígenos (Rotavirus, ADV)PCR : Norovirus, Adenoviris 40/41PARÁSITOLÓGICO:Observación microscópica (Huevos, Quistes, Parásitos)Inmunoensayos/ Detección de antígenos (Cryptosporidium, Giardia, E. histolytica)PCR

CMR 2015; 28 (1):3-30, Enferm. Infecc Microbiol Clin.2017; 35(6):367-376

NAAT en el diagnóstico de diarreaTÉCNICA TESTPCR: RT-PCRMono TestMultiplex

Xpert C. difficile (Cepheid),BD MAX C. diff (Becton Dickenson) RIDA GENE gastrointestinal KITEntericBio GI- ISeeplex Diarrhea ACE Faecal pathogens A

PCR tiempo final – Hibridación a Microarray/Macroarray

Luminex GI Panel, CLART Enterobac

Plataformas integradas Enteric Pathogen (EP) VerigeneFilmarray GI

Paneles Moleculares Múltiples aprobados por la FDAVerigene EP (Nanosphere)

Luminex xTAG GPP

Film Array GIBiofire

Bacterias 7 8 13Nº patógenos detec Virus 2 3 5

Parásitos - 3 4TOTAL 9 14 22Tiempo Procesamiento 1 muestra en dos

horas24 muestras en 5 hrs

1 muestra en 80 min

Tecnología PCR + hibridación por nanopartículas

PCR + detección por hibridación perlas

PCR anidado mas curva de melting

Equipo Sistema Cerrado/automatizado

Abierto / extracción requerida

Cerrado/automatizado

Paneles Moleculares Múltiples FDA - CE/IVDBD Max (BectonDickinson)

FTD GI Panel (Fast Track)

Allplex™ Gastrointestinal Panel

Bacterias 5 7 13 (Aeromonas)Nº patóg. detect Virus - 5 6

Parásitos - 3 6TOTAL 5 15 25Tiempo Procesamiento 1 muestra en 3hr 3 hr 45 min 96 muestras en 4 horas

Tecnología RT-PCR + detección por Sondas HibridaciónFC

RT-PCR + detecpor Sondas HibridaciónFC

Multiplex Rt-PCR detección con electroforesis capilar

Equipo Sistema Cerrado/automatizado Abierto /extrac. requerida

Cerrado/extracción requerida

Desempeño de Paneles Multiples Moleculares:Estudios sobre aumento de detección

Supina et al, 2015

• Estudio multicentrico 10 países europeos Biofire GI 709 muestras

• Muestra pos por al menos 1 patogeno BF 54%, Métodos convencionales 18%

• Muestra por > 2 Patog. 16% (EAEC,EPEC) v/s Convencional 1%

Khare et al , 2014:

• BF 33%

• Luminex GPP 30%

• Métodos convencionales 8%

Ø Desempeño analítico de paneles GI equivalente : Esp. Analitica > 98%, Sensibilidad 90-100%

VENTAJAS /DESVENTAJAS:¿ CON QUE TEST ESTUDIAR?NAAT TECNICAS CONVENCIONALES

VENTAJA RápidoMayor Sensibilidad Detección de virus y bacterias en los que no hay test disponibles ( sapovirus, astrovirus, E enteroagregativa)

Aislamiento bacterianos disponibles para estudios epidemiológicos., susceptibilidad antimicrobiana (brotes, vigilancia antimicrobianos)

DESVENTAJA

Elevado costoResultados difícil de interpretar:Detección de múltiples patógenosAlgunos MO blanco comensalesCorrelación Clínica es requeridaAislamiento bact no disponible estudiosepidemiologicos

Lento (2-3 días)Múltiples muestras para aumento sensibilidad (Microscopía)

CMR 2018;31 (1): 1-28

Estudios sobre Impacto costo efectividad

ü Implementación FA (L-Vl 7AM a.3 PM) , informe electrónico, coordinación con IAAS y software gestión clínica:

Ø Reporte más rápido (8.94 h vs 54.75 h),

Ø Menor Nº Test(0,58 frente a 3,02 pruebas / paciente; P = 0,0001)

Ø Menor Estudios de imagen (0,18 frente a 0,39 estudios / paciente; P =0.002)

Ø Días de antibióticos similares (1.73 vs 2.12días / paciente P = 0.06)

Ø Días estada similar (5.2 vs 5.6 días;P = 0.14)

Ø Ahorro $ 293.61 por pacienteen comparación con las pruebas convencionales

Microbiol 2017;56:e01457–17

ü Diagnóstico FA : Uso Antibióticos inapropiados disminuyeron de

42.9% con el FA solo al 25.8% con FA más programa de Control de uso de Antimicrobianos(p = 0,023)

J Clin Microbiol 2018;56:CM.00148-18. 75.

Estudios sobre Impacto costo efectividad

vPuede ser fundamental en los esfuerzos de Descalamientoen programas de control de uso de antimicrobianos(unidades de alta prevalencia , Ej. pediatría)

vLa identificación rápida tiene el beneficio de un controlrápido de la infección y ajustes de aislamiento.

J Clin Microbiol 2015;53:915–25. 74. J Clin Microbiol2018;56:CM.00148-18. 75., Clin Infect Dis 2018;67: 1688 –96.

Diarrea infecciosa: ¿Cuándo estudiar y Cuándo tratar?

CONCEPTOS CLAVES Y RECOMENDACIONES

v Mayoría casos AUTOLIMITADOS y NO requieren Diagnóstico Etiológico(Incluido Diarrea viajero, diarrea en inmunocompetentes).

v Algunos patógenos pueden causar infección severa especialmente en pacientesinmunocomprometidos (Pacientes Especiales).

v Realizar estudio para patógenos específicos en pacientes con : Fiebre,deposiciones disentéricas,sepsis. (NAAT o Cultivo)

v Identificación de agente infeccioso necesaria para guiar medidas de control yprevención.

JAMA Clinical Guidelines Synopsis, 2019, IDSA 2017, ACG

Aproximación al diagnóstico de laboratorio¿Qué factores son importantes en la historia y examen?

vCuidadosa evaluación del paciente, severidad de la enfermedad y factores de riesgo:

ü Signos y síntomas de enfermedad severa: fiebre, diarrea sanguinolenta, dolor abdominal, deshidratación, hospitalización

ü Factores de riesgo para enfermedad severa: edad, estado inmune del paciemte

vTest debiera ser considerado para población selectiva:

ü Manipulador de alimentos, paciente con persistencia o recaída de la enfermedad y estudio epidemiologico de brotes.

Primer Desafío:Quiénes requieren test diagnóstico

ØPaciente con diarrea mas de 1 día de evolución, asociada a

• Diarrea sanguinolenta

• Fiebre

• Síntomas de sepsis, deshidratación

• Uso de antibióticos recientes, pacientes inmunodeprimidos

• Importancia Salud Pública o riesgo epidemiológico para patógenos específicos(manipuladores de alimentos, cuidadores residenciales , investigación de brote)

JAMA Clinical Guidelines Synopsis, 2019, IDSA 2017, ACG

Rol de los NAAT en el diagnóstico de diarrea

• Múltiplex para Patogenos GI: Mayoría pactes recuperan sin tto.

Como impacta su uso en el comportamiento Médico , en el costo de la atención y egreso del paciente , Sobretratamiento

Algoritmo diagnóstico SDA American College of Gastroenterology

Clinical Guideline: Acute Diarrheal Infections

© 2016 by the American College of Gastroenterology The American Journal of GASTROENTEROLOGY

603

very likely to change the estimate; “very low,” if an eff ect is very uncertain ( 8 ).

EPIDEMIOLOGY AND PUBLIC HEALTH CONSIDERATIONS Recommendation 1 . Diagnostic evaluation using stool culture and culture-

independent methods if available should be used in situa-tions where the individual patient is at high risk of spreading disease to others, and during known or suspected outbreaks. (Strong recommendation, low level of evidence)

Summary of evidence . Surprisingly, there are few published studies that describe the overall incidence of acute diarrhea (including infectious and non-infectious causes) in the United States. In 1998, the Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) conducted a random population-based telephone

survey in which 12,755 persons (median age 40 years) were in-terviewed ( 9 ). Overall, 6% reported having experienced an acute diarrheal illness at some point during the 4 weeks preceding the interview (overall annualized rate, 0.72 episodes per person-year; 15–24, 1.1 episodes per person-year; 25–44, 1.7 episodes per person-year; 45–64, 1.2 episodes per person-year). A follow-up survey where 3,568 respondents (median age 51) were asked at random about illness in the previous 7 days or previous month found that recall bias had an important eff ect on estimates of acute gastrointestinal illness ( 10 ). Using a 7-day exposure win-dow, the estimated incidence of acute diarrhea was 1.6 episodes per person-year, compared with 0.9 episodes per person-year if asked about illness within the preceding month. Other popula-tion-based studies from Canada and western European countries using varied methodologies estimate annual incidence between 0.1 to 3.5 episodes per person-year ( 11 ).

Specifi cally focusing on infectious causes of acute diarrheal illness, in 2011 the Centers for Disease Control and Prevention

Passage of !3 unformed stools in 24 h plus an enteric symptom (nausea, vomiting, abdominal pain/cramps, tenesmus, fecalurgency, moderate to severe flatulence)

Oral fluid therapy: for all cases, hydrate through fluid and salt intakeFood: soups, broths, saltine crackers, broiled and baked foods

Watery diarrhea

Mild illness* Moderate-to-severe illness* No or low-grade fever("100°F)

Microbiologic assessment,then anti-microbial agent

directed to cause for all butSTEC infection

Non-travel-associatedTravel-associated

Hydrationonly, may use

loperamide 4 mginitially tocontrolstooling

Antibiotictherapy

(Table 4)

No orlow-grade

fever(≤100°F)

Fever(≥101°F)

<72 hduration

Persistent diarrhea (14 – 30 days) should be worked up by culture and/or culture-independent microbiologicassessment, then treatment with anti-microbial agent directed to cause

!72 hduration

Consider"48 h of

loperamidetherapy

*Illness severity:Severe —totaldisability due todiarrhea; Moderate= able to functionbut with forcedchange in activitiesdue to illness;Mild = no changein activities

Travel-associated

Empirictreatment,

Azithromycin1 g in single

dose OR 500 mgonce dailyfor 3 days

Considermicrobiologicassessment

Non-travel-associated

Severe illness* with fever(!101°F) in a single case

(not outbreak)

Dysenteric diarrhea (passage of grossly bloody stools)

Figure 1 . Approach to empiric therapy and diagnostic-directed management of the adult patient with acute diarrhea (suspect infectious etiology).

SI ESTUDIO MICROBIOLÓGICO

IDSA,AmericanCollegeofGastroenterology

Algoritmo sindrómico de Public Health England (PHE)

Recomendación Guía Clínica de la Sociedad Gastroenterología: diagnóstico,tratamiento y prevención de las infecciones diarreicas agudas en adultos

• Tabla 1. Resumen y fuerza de las recomendaciones.Epidemiología y salud pública.1. Cultivo de heces y métodos independientes del cultivo (MIC), si están disponibles, se debe usar en situaciones en las que el paciente tenga un alto riesgo de transmisión y durante brotes conocidos o sospechosos. (Recomendación fuerte, bajo nivel de evidencia)Diagnóstico: Realizar Cultivo o MIC 2. Disentería, enfermedad moderada-grave y síntomas que duran más de 7 días para aclarar etiología y terapia específica. (Recomendación fuerte, nivel muy bajo de evidencia)3. Los métodos tradicionales de diagnóstico no revelan la etiología de la mayoría de loscasos de DA infecciosa. Si está disponible, se recomienda el uso MIC aprobados por laFDA, como complemento de los métodos tradicionales. (Recomendación fuerte, bajonivel de evidencia)

Am J Gastroenterol 2016; 111:602–622;doi:10.1038/ajg.2016.126;

Potenciales Ventajas y Limitaciones de Paneles múltiplesPROS CONTRAS

Rapidez de resultados (Guía Tto, IAAS), Aumenta rendimiento de la muestra

Costo

Satisfacción paciente No adaptado a paciente

Identificación de brotes Detección de Ac nucleicos VS MO viables

Estudios Epidemiológicos Detecta portadores asintomáticos, Eliminación prolongada, virus latentes o reactivados

Reducción días estada y uso de antibióticos??? Necesidad de cultivo, PCR complementarios, Pruebas Ag, Microscopía (Huevos, Quistes, Parásitos)

Medical Microbiology. CID 2016:63, 15 nov, 1365

Metagenomic Approach for Identification of the Pathogens Associatedwith Diarrhea in Stool Specimens

Yanjiao Zhou,a* Kristine M. Wylie,a Rana E. El Feghaly,b Kathie A. Mihindukulasuriya,c Alexis Elward,a David B. Haslam,d

Gregory A. Storch,a George M. Weinstockc*Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, USAa; Department of Pediatrics, University of Mississippi Medical Center, Jackson,Mississippi, USAb; McDonnell Genome Institute, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, USAc; Division of Infectious Disease, Cincinnati Children’sHospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USAd

The potential to rapidly capture the entire microbial community structure and/or gene content makes metagenomic sequencingan attractive tool for pathogen identification and the detection of resistance/virulence genes in clinical settings. Here, we as-sessed the consistency between PCR from a diagnostic laboratory, quantitative PCR (qPCR) from a research laboratory, 16SrRNA gene sequencing, and metagenomic shotgun sequencing (MSS) for Clostridium difficile identification in diarrhea stoolsamples. Twenty-two C. difficile-positive diarrhea samples identified by PCR and qPCR and five C. difficile-negative diarrheacontrols were studied. C. difficile was detected in 90.9% of C. difficile-positive samples using 16S rRNA gene sequencing, and C.difficile was detected in 86.3% of C. difficile-positive samples using MSS. CFU inferred from qPCR analysis were positively corre-lated with the relative abundance of C. difficile from 16S rRNA gene sequencing (r2 ! "0.60) and MSS (r2 ! "0.55). C. difficilewas codetected with Clostridium perfringens, norovirus, sapovirus, parechovirus, and anellovirus in 3.7% to 27.3% of the sam-ples. A high load of Candida spp. was found in a symptomatic control sample in which no causative agents for diarrhea wereidentified in routine clinical testing. Beta-lactamase and tetracycline resistance genes were the most prevalent (25.9%) antibioticresistance genes in these samples. In summary, the proof-of-concept study demonstrated that next-generation sequencing (NGS)in pathogen detection is moderately correlated with laboratory testing and is advantageous in detecting pathogens without apriori knowledge.

Sequencing technology has revolutionized infectious diseasesresearch over the past decade. Whole-genome sequencing

(WGS) of pure cultures has been widely used for pathogen char-acterization, evolutionary studies, transmission investigations,and outbreak detection (1, 2, 3). WGS of cultured isolates is nowmoving from the proof-of-concept phase to implementation. Thetwo major applications of WGS of cultured strains in clinical di-agnostic microbiology are molecular epidemiology and antibioticresistance gene prediction (4). In contrast to the WGS sequencingof cultured isolates, metagenomics assesses a community of or-ganisms but eliminates the isolation step. This can be done byfocusing on a specific conserved gene, such as the 16S rRNA gene,or by the metagenomic shotgun sequencing (MSS) of total micro-bial nucleic acids within samples. For the purpose of this study,metagenomics sequencing refers to either 16S rRNA gene se-quencing or MSS; 16S rRNA gene sequencing and MSS usingnext-generation sequencing (NGS) platforms produce largequantities of data in a relatively short time. Although 16S rRNAgene sequencing is less expensive than MSS, it suffers from poten-tial PCR-related bias. Taxonomical classification based on partial16S rRNA gene sequencing is generally limited to phylum to genuslevel specificity. Nevertheless, highly heterogeneous species withincertain genera can be distinguished (5). In addition to the rela-tively high cost, the large amount of sequence data generated byMSS requires significant computing resources for data processingand storage. However, MSS, without the bias inherent to PCR, iscapable of classifying bacteria to the species or strain level. It canalso detect viruses, fungi, and other microbial components, someof which cannot yet be cultured (6). MSS has been used to identifypathogens, including known and novel viruses that cause diarrheaor fever (7, 8). Recently, MSS of cerebrospinal fluid from a coma-

tose patient with a congenital immunodeficiency revealed the un-common pathogen Leptospira santarosai after extensive standardtesting had not yielded an etiologic agent (9).

Using metagenomic sequencing, the Human MicrobiomeProject (HMP) demonstrated that millions of microbes coexistwith their healthy hosts (10). In such individuals, many of thesemicrobes maintain symbiotic relationships with their hosts, in-cluding assisting in food digestion and immune modulation (11).Some microbes may be residing latently or subclinically in ahealthy host but may cause disease at a later time. For example,opportunistic organisms, such as Clostridium difficile, Staphylo-coccus aureus, Acinetobacter baumannii, and Candida albicans, canaffect people with compromised immune systems but often colo-nize without causing disease. Similarly, many viruses were de-tected in the healthy subjects from the HMP cohort, includingherpesviruses and papillomaviruses (12). While not causing overt

Received 22 July 2015 Returned for modification 19 August 2015Accepted 23 November 2015

Accepted manuscript posted online 4 December 2015

Citation Zhou Y, Wylie KM, El Feghaly RE, Mihindukulasuriya KA, Elward A, HaslamDB, Storch GA, Weinstock GM. 2016. Metagenomic approach for identification ofthe pathogens associated with diarrhea in stool specimens. J Clin Microbiol54:368 –375. doi:10.1128/JCM.01965-15.

Editor: P. H. Gilligan

Address correspondence to George M. Weinstock, george.weinstock@jax.org.

* Present address: Yanjiao Zhou, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine,Farmington, Connecticut, USA; George M. Weinstock, The Jackson Laboratory forGenomic Medicine, Farmington, Connecticut, USA.

Copyright © 2016, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

crossmark

368 jcm.asm.org February 2016 Volume 54 Number 2Journal of Clinical Microbiology

Secuenciación metagenómica es una herramienta atractiva para la identificación de patógenos y la detección de genes de resistencia / virulencia en entornos clínicos.

Estudio Etiológico Síndrome Diarreico Agudo

2017 – HBV. Mediante PCR Tiempo Real (FTD Diagnostic)

Positivas Negativas RechazadasTOTAL 48 MUESTRAS

41% POSITIVAS

AGENTES IDENTIFICADOS

UNICO

38 %Bacterias 5 (Yersinia, Shigella,C. difficile, EIEC. Campylobacter)

Parásitos: CryptosporidiumVirus: Sapovirus, Norovirus G1, G2,Rotavirus, Astrovirus, ADV, CMV

Conclusión• No hay duda que la introducción de Test Moleculares permite

una detección más rápida y sensible de patógenosgastrointestinales.

• La decisión de adoptar un ensayo de este tipo y cuál seleccionardependerá de una serie de factores, incluyendo el rendimientodel ensayo, microrganismos objetivo, el costo, el flujo detrabajo, el rendimiento y el paciente.

• Requiere el desarrollo de estrategias de petición einterpretación de resultados.

• Éducación a Clínicos no familiarizados con todos los MOidentificados y/o genes de resistencia detectados ( TTOinnecesario, Test innecesarios de seguimiento)