Universidad de OrienteNúcleo de Sucre

Departamento de BioanalisisCitología

Bachilleres:Belmonte MarcelysCornivell JosselynGonzález Favianny

Cumana, Diciembre de 2009

INTRODUCCION

Se puede definir la Citología Diagnóstica como el arte y la ciencia que se ocupa de la interpretación morfológica de las células del cuerpo humano, sean exfoliadas u obtenidas por otros procedimientos. Sus dos principales cambos de aplicación clínica son el citodiagnóstico del cáncer y la citologia hormonal.

Los fundamentos de la citología se remontan al siglo pasado. Están estrechamente vinculados con las investigaciones de las ciencias naturales que siguieron al descubrimiento de la célula como unidad estructural y funcional de los seres vivos por Schleiden y Schwann. Estos investigadores trabajaban en la Universidad de Berlín y eran discípulos de Johannes Müller, Profesor de Anatomía, Fisiología y Patología. En el mismo laboratorio trabajaba Rudolf Virchow, quien se familiarizó con la citología y donde desarrolló la teoría celular de la enfermedad1.

La citología hormonal se inicia con Pouchet, médico y Profesor de Zoología del Museo de Historia Natural de Rouen, quien descubrió los cambios citológicos en material fresco de secreción vaginal de la mujer. Pero es realmente con Moraou que comienza el estudio de la citología vaginal hormonal. Este investigador present6 en 1899, a la sociedad de Citología de Paris, sus observaciones sobre los cambios cíclicos en la vagina de los roedores pequeños.

En 1916, George Papanicolaou y Stockard estudiaron los aspectos citomorfológicos del ciclo vaginal de los cobayos utilizando la técnica del frotis para predecir el memento de la ovulación de los cobayos y obtener óvulos en estado premitótico2. Estos estudios se extendieron posteriormente a primates, que tienen un ciclo ovárico comparable al humano. En 1923 iniciaron un proyecto para el estudio del frotis vaginal de la mujer. Como resultado de estas investigaciones, Papanicolaou y colaboradores establecieron de manera definitiva la existencia de ciclos vaginales comparables al ciclo endometrial y que la exfoliación vaginal es un reflejo de los cambios histológicos del epitelio vaginal3. Los resultados de estas investigaciones fueron publicados en 1933 en la monografía "The Sexual Cycle in the Human Female as Revealed by vaginal Smears"1. Con anterioridad, en 1920 había publicado un libro sobre el aspecto celular de la vagina durante el embarazo.

Posteriormente aparecieron numerosas publicaciones sobre citología hormonal, fruto de su trabajo y del de sus colaboradores.

El use de la técnica del extendido vaginal tuvo derivaciones trascendentales para la endocrinología ginecológica. Gracias a esa técnica, por ejemplo, fue posible el aislamiento de la hormona estrogénica por Allen y Doisy5 y la hormona del cuerpo lúteo.

En el diagnóstico citológico del cáncer, una de las contribuciones básicas más importantes fue el reconocimiento del origen epitelial de los carcino màs de piel por Thiersch en 1865 y los de mama y útero por Waldeyer en 1867. Estos aportes permitieron el desarrollo de la citología diagnóstica clínica y la identificación de las lesiones precancerosas.

Uno de los primeros en utilizar la citología para el diagnóstico de las lesiones cancerosas fue Veale, quien en 1880 reconoció células malignas en un tumor faríngeo6. Siguieron luego numerosas publicaciones sobre diagnóstico citológico, sin que el método fuese aceptado en la clínica.

En 1923, George Papanicolaou, quien desarrollaba un proyecto de investigación sobre el extendido vaginal en el Woman's Hospital de Nueva York, reconoció células anormales malignas de un cáncer cervical. Muy sorprendido por su observación, se dedicó al estudio de la citología en el cáncer ginecológico.

En 1927 presentó sus resultados en una Conferencia en Battle Creek, Michigan. El trabajo titulado Nuevo Diagnóstico del Cáncer (New Cáncer Diagnosis), describía las células malignas en los extendidos vaginales. Fue publicado en los Proceedings del Congreso en 1928, pero no despertó mayor interés en la comunidad científica medica. Paralelamente, en 1927, el pat6logo rumano Aurel Babes presentaba a la Sociedad de Ginecología de Bucarest sus observaciones sobre las características de las células tumorales obtenidas por raspado cervical con un asa bacteriológica. El trabajo fue publicado en 1928 en Presse Medicale con el titulo Diagnostic du Cáncer du Col Uterine par le frotties. Como en el caso de Papanicolaou, la idea no tuvo mayor trascendencia. El único que utilizó el método fue un ginecólogo de Verona, Italia, de nombre Odorico Viana7.

Papanicolaou pudo desarrollar su proyecto de detección temprana del cáncer mediante la citología cuando recibió pleno apoyo de Joseph Hinsey, quien asumió la jefatura del Departamento de Anatomía de la Universidad de Cornell. Papanicolaou se asoció con Herb F. Traut, un patólogo experto en patología ginecológica. En 1943 publicaron la clásica monografía El Diagnóstico del Cáncer Uterino por el Extendido Vaginal, en el American Journal of Obstetrics and Gynecology 5. Lo novedoso del método citológico de Papanicolaou fue la fijación y coloración óptimos que facilitaban la lectura de los extendidos, con la incorporación de los colorantes OG 6 y EA 36. La coloración fue ideada en 1942 y posteriormente modificada por el mismo Papanicolaou, en 1954 y 1960.

Otro hito importante en el desarrollo de la citología diagnóstica fue la publicación por Papanicolaou, en 1954, de su monumental Atlas of Exfoliative Cytology. En 1947, la Universidad de Cornell realizó el primer curso para capacitación en citología exfoliativa y el laboratorio de Papanicolaou llegó a ser la meca para estos estudios.

El método de la citología tuvo inicialmente mucha resistencia para su use clínico. En los mismos EU de A tenia detractores, sobre todo patólogos, pero también defensores, como Rubin, Meiggs, Stewart y Koss. Ewing, considerado como el padre de la patología del cáncer de los Estados Unidos, fue inicialmente escéptico; para 61, el cuello del útero era lo suficientemente accesible a la biopsia, de modo que la citología era un examen superfluo. A Ewing, quien fue Director del Memorial Hospital de Nueva York, se le diagnosticó cáncer de la vejiga, diagnóstico que sus colegas trataron de ocultar, pero el comenzó a examinar a intervalos su propio sedimento urinario y cuando identificó las células malignas, anunció a sus colegas que ya conocía el tipo de cáncer que padecía4.

En Europa, inicialmente se prestó poca atención a la citología. Roberto Meyer, en Alemania, decía "es mas útil enseñar la histología del cáncer a los patólogos". Un profesor francés, De Brux, decía sarcásticamente "dejad la citología a los químicos". En Nápoles se hablaba del "cuento americano". La creación de la Academia Internacional de Citología impulsó la citología en Europa y, en su Segundo Congreso Internacional, el mismo profesor De Brux decía "la citología ha hecho su entrada triunfal en el Royal Palace de Versailles"74.

La citología se fue perfeccionando y, en 1957, James Reagan, discípulo de Papanicolaou, hizo estudios de análisis celular y planimetría, que permitieron establecer criterios de mayor rigurosidad científica para el diagnóstico citológico.

En 1947, Ernest Ayre introdujo la espátula que lleva su nombre, para obtener por raspado células del orificio cervical externo en lugar de la aspiración del fondo de saco posterior8. Este instrumento permitió mejores resultados, al bajar la excesiva tasa de falsos negativos por toma inadecuada de la muestra.

Un asunto conflictivo para los citopatólogos ha sido la terminología de los diagnósticos citológicos cervicales. En 1954, Papanicolaou describió el sistema de cinco clases. Reagan propuso el uso de términos histológicos, como displasia, carcinoma in situ y carcinoma invasivo. En 1966, Ralph Richard propuso la clasificación de la neoplasia intraepitelial cervical en tres grados. En 1988 se realizó en Bethesda, Maryland, una reunión convocada por el National Cáncer lnstitute para revisar la terminología de la citología cervicovaginal. Después de un ardoroso debate, los participantes acordaron ya no usar el sistema de clases de Papanicolaou y recomendaron adoptar la terminología y clasificación del

Institute National de Cáncer, que se conoce come el Sistema de Bethesda9, que ha sido aceptado por la mayoría de laboratorios.

La técnica de la citología de aspiración con aguja fue ensayada por primera vez por Kronig, en 1884, para diagnosticar un cáncer pulmonar9. El temor de diseminar el cáncer mediante la biopsia motivó la introducción de la citología por aspiración de los tumores. En 1920, Hayes Martin y Edward Ellis, tecnólogo de Ewing, del Memorial Sloan Kettering Hospital de Nueva York, comenzaron a usar agujas gruesas calibre 16 a 18, con una jeringa de 20 mL, para obtener aspirado de tumores palpables, come los de mama y ganglios linfáticos. Con el material aspirado, se preparó extendidos gruesos que eran coloreados con hematoxilinaeosina, y los fragmentos tisulares residuales llama-dos "coágulos" eran procesados come biopsias8. En 1947, Oschner y De Bakey objetaron el procedimiento, porque en algunos de sus pacientes se había producido implantes de tumor en el sitio de la punción10. La técnica de la citología por aspiración fue modificada en Europa con el uso de agujas finas de calibre 22 por investigadores daneses y suecos, particularmente Soderstromm, Franzen y Zajicek. Desde entonces, la técnica de la citología por aspiración con aguja fina es ampliamente aceptada.

En el Perú, la citología diagnóstica fue promovida e impulsada a inicios de los anos cincuenta por el profesor Jorge Campos Rey de Castro, quien con perseverancia y tenacidad pudo superar el escepticismo de muchos patólogos y ginecólogos que se resistían, como lo acontecido en otras partes, a aceptar el diagnóstico basado en la morfología celular. Los discípulos patólogos que formó el profesor Campos llevaron la novedosa técnica citológica a diversos ámbitos del país.

DIAGNÓSTICO CITOLÓGICO

Tipos de tomas

SECRECIONES Y SUSTANCIAS ORGÁNICAS:

Consiste en la recogida de material de emisión espontánea como: orina, heces, esputo, secreciones de mama, que, en ocasiones pueden ser provocadas (expresión del pezón, expectoración forzada, sondaje, cateterización vesical. Etc.) para poder realizar el estudio citológico previo un proceso adecuado.

El derrame del pezón se procede al “ordeñamiento” de toda la mama de forma radial y en dirección distal-proximal con expresión final del seno lactífero. Se recoge la secreción sobre un portaobjeto haciendo una fina extensión.

Para las muestras de orina se recogerá la segunda micción de la mañana, previa ingestión de líquidos. Se centrifuga a 1.500 rpm durante 5 min, se extiende sobre el portaobjeto y se fija.

PUNCIÓN-ASPIRACIÓN:

Esta técnica ha ampliado enormemente el campo del estudio citológico. El utillaje es muy simple, consta de jeringas desechables, agujas finas (0,6mm) con diferente longitud y si es factible pistola portajeringas, así como guías de aguja para punciones de determinados órganos como próstata y ovario. Este tipo de toma tiene diferentes vertientes: cavidades, nódulos y masas quísticas.

Cavidades: cavidades con contenido líquido: pleura, pericardio, amnios, articulaciones, espacio raquídeo. Previo a la toma se requiere: historial clínico-radiológico o ecográfico (según el lugar de la toma).

En muchas ocasiones por el arrastre de hematíes requerirá una heparinización del líquido (3 gotas de heparina son suficientes) para lisar los hematíes y facilitar el estudio morfológico del material.

Secreciones y sustancias orgánicas Punción aspiración Punción aspiración dirigida bajo control

ecográfico

Nódulos: cuando se puede delimitar la masa tumoral, se fija con una mano, mientras que con la otra se introduce la aguja (evitar el dolor al atravesar la piel incidiendo de forma tangencial), una vez en la zona del tumor se aspira, y al mismo tiempo se retira un poco la aguja moviéndola en 2 o 3 direcciones, manteniendo la presión. Una vez finalizada la aspiración se deja que el émbolo vuelva a su posición y se retira el bloque aguja-jeringa, se retira la aguja, se aspira aire en la jeringa, se coloca la aguja de nuevo, se impulsa el émbolo sobre el portaobjeto y se recoge en él el contenido.

La extensión puede realizarse suavemente con otro portaobjeto o con la misma aguja horizontalizada.

Masas quísticas: si al puncionar una masa la jeringa se llena de líquido, ello indica que, normalmente, nos encontramos ante una cavidad quística. El líquido recogido debe remitirse directamente al laboratorio. Los ejemplos típicos de este tipo de toma son: tiroides, mama, ovario, etc.

PUNCIÓN-ASPIRACIÓN DIRIGIDA BAJO CONTROL ECOGRÁFICO:

Permite localizar zonas de sospecha a veces mínima, de las cuales nos interesaría dilucidar sus características de benignidad o malignidad. La introducción de equipos de guía de punción nos facilita la posibilidad de obtener material valorable para el estudio citológico en estas localizaciones.

Las técnicas de punción bajo control ecográfico fueron aplicables inicialmente en patología mamaría. Es una técnica sencilla y poco traumática, se emplean agujas finas de calibre 22 (0,7mm) y sólo en casos de evacuación de abscesos o colecciones organizadas utilizaremos un calibre mayor 20 (0,9 mm). Una vez que se inicia la punción, se sigue el trayecto en la pantalla y se conoce con exactitud el momento preciso en que la aguja incide sobre la zona deseada.

La utilidad de la técnica:

1. Punción de zonas cicatriciales en pacientes tumorrectomizadas para detectar recidivas tumorales.

2. Localización prequirúrgica con arpón de lesiones no palpables y no visibles radiológicamente.

3. Obtener material para receptores hormonales en casos inoperables.

Otro órgano que por su accesibilidad tiene la oportunidad de beneficiarse de este tipo de punción dirigida es el tiroides.

En los casos de punción dirigida diagnóstica se realiza una valoración de celularidad con una técnica de tinción rápida, Diff Quick, con lo cual se evita la reiteración de la punción por escases de material celular.

Impronta: es una técnica clásica muy utilizada para el estudio de ganglios linfáticos que pueden ser de gran utilidad en biopsias y piezas peroperatorias.

En general, el mismo cirujano en pleno campo operatorio toma una muestra del tejido a estudiar por medio de una sección con el bisturí presionada suavemente sobre el portaobjeto (impronta). En otras ocasiones, también intraoperatoriamente se hace un raspado de la zona a estudiar con el bisturí, extendiendo el material sobre el portaobjeto. En realidad cualquier técnica se puede emplear para el estudio peroperatorio y procesándose con carácter de urgencia para obtener un resultado inmediato.

Lavado: se realizan éstos en actos exploratorios fundamentalmente endoscópicos, añadiendo sustancias líquidas (suero fisiológico o soluciones salinas) y haciendo un lavado de grandes superficies para recoger posteriormente el material: lavados peritoneales, broncoaspirados, lavado gástrico, etc. Esta técnica permite obtener material para estudio de amplias zonas.

Raspado: esta técnica se puede realizar con cualquier instrumental: espátula, bisturí, cánula, etc. Los ejemplos característicos de este tipo de toma los hallamos en la triple toma cervicovaginal de Wied en el cuello uterino, en la toma de mucosa oral con espátula, en las toma de mucosa endometrial con cánulas (Medhosa, espiral de Mi-Mark) y las tomas de vulva con bisturí.

Cepillado: los avances en los instrumentos de exploración endoscópicas, como son los fibroscopios flexibles con múltiples complementos (cepillos), nos permiten realizar cepillados de zonas muy concretas que nos interesa estudiar. Una vez realizado el cepillado se pueden lavar en suero fisiológico o bien se extiende el material directamente sobre el portaobjeto.

EXTENSIÓN DEL MATERIAL EN EL PORTAOBJETO

En todo momento se hará cuidadosamente para no alterar las células, procurando que quede una fina película de material sobre el portaobjeto, con el fin de facilitar una buena tinción de todo el material, que nos permitirá un buen estudio morfológico de éste.

A veces puede resultar útil el desplazamiento del material con otro portaobjeto para que no quede amontonado, pues el extendido debe ser fino y uniforme, a la manera de la extensión hematológica.

CENTRIFUGACIÓN

Cuando los líquidos llegan al laboratorio deben procesarse inmediatamente. En caso de que esto no sea posible se guardarán en la nevera, procurando que no exceda de 24 horas su retención; añadiendo igual cantidad de alcohol de 50º en evitación de contaminaciones. Con el material ontenido haremos como mínimo dos extensiones.

La citocentrifugación se hace de 1.500 a 2.000 rpm y el tiempo puede variar entre 5 y 10 min. Todo esto dependiendo de la densidad del líquido. Cuanto más denso sea un líquido, menos tiempo hay que centrifugarlo. En casos de líquidos muy poco celulares se puede aumentar el tiempo y las revoluciones del procesado.

Actualmente existe citocentrifugas (tipo Cytospin), con las que se consiguen mejores resultados que con los convencionales. Este tipo de centrifuga consta de un rotor central que se dispone de 12 espacios con recipientes, a los que se pueden adaptar otros tantos líquidos. Dependiendo de la densidad de los líquidos se puede decantar la parte sobrenadante y realizar una nueva centrifugación o forzar las revoluciones, ya que se puede llegar hasta 2.000 rpm. Quizás un inconveniente sea el que deben utilizarse filtros troquelados, no siempre fáciles de obtener, y que la técnica responsable debe ser muy cuidadosa.

FIJACIÓN

Es la técnica que se utiliza en la práctica citológica para procurar a la preparación una buena conservación de las células. Es un paso realmente indispensable si no queremos vernos ante una extensión citológica deteriorada, oxidada, que no tomara bien los colorantes y que, en definitiva, no permitirá una correcta lectura cuando pretendamos estudiarla en el microscopio.

La fijación debe realizarse de inmediato a la toma y extensión del material citológico, cuando una preparación está todavía húmeda.

MEDIOS DE FIJACIÓN

Alcohol éter Alcohol de 95º Nebulizadores (sprays) comerciales Secado al aire

ALCOHOL- ÉTER: se utiliza una mezcla de alcohol etílico de 90º y éter a partes iguales con un pH de 6.8 a 7; la mezcla debe guardarse en frascos de boca ancha y, si puede ser, con pestañas verticales que facilitan la colocación de varias preparaciones en un solo frasco.

Las preparaciones deben mantenerse en esta mezcla fijadora un mínimo de 15 min. Y un máximo de 6 días para teñirlas posteriormente.

ALCOHOL DE 95º: se puede utilizar alcohol etílico de 95º o alcohol metílico y el procedimiento es igual que el caso anterior.

A los fijadores nombrados se les puede añadir ácido acético al 2.5% con lo que lisan los hematíes; por ello, en las preparaciones en que se sospecha su existencia, resulta una buena solución para evitar la dificultad que representa una presencia masiva de hematíes, recubriendo a los elementos celulares motivo de estudio. Esta mezcla no debe realizarse en los casos en que se desee realizar una valoración citológica hormonal (toma vaginal o urinaria), ya que se produce una falsa eosinofilia que puede llevar a confusión al realizar el recuento para el índice de eosinofilia.

NEBULIZADORES COMERCIALES: contienen una mezcla de alcohol isopropílico (fijador) y una materia plástica –polietilglicol- (protectora de la desecación) con la que se pulveriza toda la superficie del portaobjeto de forma muy rápida y sencilla y con la ventaja ya esta preparada. La pulverización con el nebulizador debe realizarse con cuidado de que toda la extensión quede cubierta, procurando alterar la disposición celular que es importante para que el citopatólogo interprete el caso; para ello debe propulsarse la emulsión a una distancia de 25 o 30cm de distancia, como mínimo, pues si se reduce en lugar de caer una fina lluvia uniforme y delicadamente sobre la preparación recibiría un chorro con demasiada presión que movería el contenido celular de la extensión en cuanto a su disposición y provocaría falsos apelotonamientos. Realizada la pulverización, a los 10 min. Ya pueden procederse a la tinción.

SECADO AL AIRE: suelen usarse cuando se van a emplear tinciones como las de May-Grünwald-Giemsa. Con esta tinción no se puede observar bien el detalle de la cromatina nuclear, cosa que suele interesar mucho al citopatológo y que se consigue muy bien con tinciones como las de Papanicolaou, pero en estos casos no es útil el secado al aire por producirse oxidación y dificultad para interpretar la visión citológica. En las extensiones de sangre es una técnica muy utilizada, por contrastar las granulaciones citoplasmáticas de gran interés en el diagnóstico de la patología hematológica.

IDENTIFICACIÓN

Toda solicitud de análisis que llegue al laboratorio de citología debe cumplir una serie de requisitos para una buena interpretación diagnóstica.

Se rellenará con letras mayúsculas y con los siguientes datos, como mínimo: nombre, tipo de toma, edad, clínica y características técnicas citológicas (tabla 3-1). En los laboratorios

citológicos se utilizan un petitorio más detallado codificado para un programa de ordenador, lo cual permite disponer de mayor número de datos del paciente y facilita enormemente los trabajos científicos y el control estadístico.

Tabla 3-1. Datos mínimos de un impreso de solicitud para realizar un estudio citológico

Dictamen nº

Habit. Nº

Remite Dr.

Nombre…………………………………………………………………………………………………………………………………………

Toma de………………………………………………………………………………………………………………………………………..

FUR……………………………………..Edad…………………………….Gestación………………………………………………….

Motivo estudio

Otros datos de interés

a) Fijador utilizadob) Breve resumen de la historia clínicac) Impresión del diagnóstico clínico

TINCION

¿POR QUÉ SE TIÑEN LAS CELULAS?

La célula, que es una porción de materia orgánica, tiene una composición determinada, que varia discretamente según el tipo de tejido, y unas características físicas propias, que determinan la posibilidad de ser teñidas. Se debe tener en cuenta que en estado normal las células presentan muy poco contraste.

Hay un segundo elemento que es el colorante que vamos a añadir para que aumente el contraste de las diferentes estructuras celulares.

TEORIA DE LA COLORACION CELULAR.

Actualmente se acepta que existen una serie de mecanismos interrelacionados fisicoquímicos que actúan en el complejo mecanismo de la tinción celular.

Se distinguen dos mecanismos:

La Electroadsorcion: se da por reacción de cargas eléctricas de polaridad opuesta (+ y -), y si se tiene en cuenta el carácter anfótero de las proteínas se entiende la importancia que tiene el pH en este proceso de coloración en relación con el punto isoeléctrico de las estructuras a teñir.

La Adsorción por Tensión Superficial: se da por adherencia de las sustancias a la superficie. Los diversos mecanismos de este fenómeno pueden darse sin intervenir fuerzas electrostáticas (apolar). Esta capacidad de adsorción varía de una sustancia a otra, puesto que la tensión superficial de las diferentes estructuras también varían.

En los colorantes por medios físicos se trata de una pura difusión del colorante (coloración por impregnación), y en las coloraciones por adsorción se originan precipitaciones (coloración por precipitación).

La coloración química exclusiva se da por la reacción entre el colorante y el sustrato según un proceso químico bien definido. Constituye la base de la citoquimica y un ejemplo claro es la demostración del hierro (tinción de Peris) en los macrófagos hepáticos.

E las coloraciones físicas, el primer proceso que se da es la disolución del colorante en las estructuras celulares y un ejemplo son las tinciones para grasas (Sudan III).

TIPOS DE COLORANTES.

Los colorantes por su origen se clasifican en naturales y artificiales.

Naturales: son de productos extraídos de animales (carmín) o vegetales (hematoxilina, orceina, azafran).

Artificiales: también llamados sintéticos son derivados de la destilación de la hulla y se conocen con el nombre de colores de anilina.

Los diversos colorantes se clasifican por sus apetencias en cinco grupos.

1. Colorantes Básicos: son sales que tiñen muy bien las estructuras acidas; pertenecen a este grupo: azul de metileno, azul de toluidina, violeta de metilo y verde de metilo.

2. Colorante Ácidos: son sales que tiñen las estructuras básicas. En este grupo se hallan: eosina, eritrosina, verde brillante, fuscina acida, etc.

3. Colorantes Neutros: son unas sales con componente acido y básico capaces de colorear. El eosinato de azul de metileno (componente de la tinción de Giemsa) es el ejemplo más característico.

4. Colorantes Indiferentes: no forman sales, pero tienen la capacidad de disolución en los alcoholes y grasas. El Sudan III y rojo escarlata pertenecen a este grupo.

5. Colorantes metacromaticos: se caracterizan por teñir de diferente color que el colorante utilizado. El azul de toulidina tiñe de rojo el musculo y la sustancia fundamental del cartílago, y de azul los epitelios y el tejido conjuntivo.

Estos colorantes actuaran dependiendo del método de coloración utilizado y existen múltiples técnicas, de las cuales se nombran las mas importantes.

Coloración Directa. Coloración Indirecta. Coloración Progresiva. Coloración Regresiva. Coloración Simple. Coloración Panóptica. Coloración Pancrómica.

¿QUÉ SE CONSIGUE CON LA TINCION DE LAS CELULAS?

La tinción pretende destacar lo más posible la estructura nuclear y suavemente el citoplasma, simplemente para indicarnos si es Eosinofilos o Basofilos. Para ello se emplea distintos colorantes, si bien los fundamentales son la hematoxilina, que tiñe muy bien los núcleos, destacando sus mas pequeños detalles estructurales, y la eosina, que se emplea para la tinción de citoplasma, que es un colorante policromo. Pero hay muchos más colorantes, como el Sudan III, El Orange G, El Verde Luz, Fuscina, etc.

TINCIOES MÁS FRECUENTES EN CITOLOGIA.

Las tinciones de uso habitual en los laboratorios de citología son los siguientes:

1. Tinción de azul de metileno.2. Tinción de hematoxilina – eosina.

3. Tinción de Giemsa.4. Tinción de Papanicolaou.5. Tinción de Rakoff (utiliza verde brillante y eosina amarilla).6. Tinción de Sagiroglu (utiliza azul negro Scheaffer y rojo Scheaffer).7. Tinción de Shorr (utiliza colorante de Shorr)8. Tinción con Violeta de genciana.

TECNICAS MICROSCOPICAS.

Técnicas de Inmunocitologia: estas técnicas están basadas en la capacidad de demostrar componentes de naturaleza antigénica (Ag) utilizando anticuerpos (Ac) específicos de tipo mono o policlonal obtenidos de clonas celulares determinadas.

La aplicación de estas técnicas a células o tejidos constituye a inmunocitopatologia, los dos antígenos utilizados frecuentemente son antígenos completos (proteínas de elevado peso molecular y algunos polisacáridos) y haptenos o antígenos incompletos que son sustancias químicas activas debajo peso molecular y l técnica puede realizarse de forma directa o indirecta.

TECNICAS DE TINCION POR FLUORESCENCIA.

Las técnicas de estudio por fluorescencia se basan en que existen sustancias que se excitan al incidir en ellas los rayos ultravioletas la cual es el fenómeno de la fluorescencia primaria.

Se puede obtener fluorescencia secundaria de sustancia que no son fluorescentes, pero que al añadir fluorocromos a baja concentración son capaces de brindar fluorescencia visible bajo la luz ultravioleta de algunos de sus componentes.

Existe un número de fluorocromos que se clasifican en ácidos (rojo de tiacina, fluoresceína, primulinas), fluorocromos neutros (clorofila) y fluorocromos básicos (auramina, sulfato de berberina, rodamina, acridina amarilla).

Con esta técnica de tinción se diferencian claramente las áreas con contenido de RNA y DNA que nos muestran fluorescencias diferentes (rojizo, anaranjado o verdoso).

NORMAS GENERALES PARA LA LECTURA DE LAS EXTENSIONES CITOLOGICAS

Para poder leer una preparación citológica bajo el microscopio es indispensable que toda su elaboración previa haya sido totalmente correcta. Ello implica:

1. Que la toma del material celular se realiza guardando las normas antes mencionada, con el material y técnica adecuada para cada caso.

2. Que la fijación sea la adecuada y se realice de inmediato a la práctica de la extensión del material en el portaobjeto.

3. Que la tinción sea la más adecuada, de acuerdo a la pretención clínica que se desee, si es un estudio puramente morfológico o si se solicita una valoración hormonal.

4. Que el montaje de la preparación sea correcto para evitar con el retardo la oxidación y la hidratación.

SISTEMA DE ESTUDIO

Nunca se cansa de recomendar que se comienze la observación microscópica con el objetivo de pequeño aumento (lupa), para conseguir con técnicas de barrido rápido de toda la preparción una idea de conjunto, es la visión panorámica; de lo contrario, si se comienza la primera observación con objetivos de más aumento, ocurriría como en la conocida frase de que “los arboles impiden ver el bosque”. Con el pequeño aumento se puede notar una buena idea de la cantidad celular, de la disposición, si hay un predominio de eosinofilia o de cianofilia, si el fondo de la extensión es de tipo hemorrágico, inflamatorio, sucio o limpio, datos todos ellos de mayor interés para la elaboración de un estudio citológico.

Después de obtener los datos generales de la extensión citológica en estudio gracias al pequeño aumento, se puede ir progresando con objetivo de más aumento, observando los detalles celulares que mas interesen, hasta el punto de llegar al objetivo de inmersión para detallar la cromatina nuclear, estudio del nucleólo, etc. Pero además de esta primera recomendación, es bueno fijar un orden general de estudio para no pasar nunca por alto algún detalle. Por ello, se expone la siguiente sistemática en este orden: sustancia de fondo, cantidad celular, tamaño celular, formas de las células, detalle de la estructura y señalización de campo.

Por ultimo, se debe realizar el examen citológico, que en definitiva es lo que se pretende con esta sistemática de estudio.

SUSTANCIA DE FONDO

El fondo del extendido citológico puede proporcionar datos interesantes, la existencia o no de flora bacteriana, la presencia de moco, de pigmentos, de hematíes, etc; son aspectos que debe valorarse el estudio citológico.

Se considera hablar de fondo limpio y sucio en términos genéricos:

FONDO LIMPIO: es aquel que permite visualizar perfectamente los elementos celuares y su identificación.

FONDO SUCIO: es aquel que dificultad la lectura y no permite delimitar bien los elementos celulares. Aquí se puede englobar el término de diátesis tumoral, que se asocia a las neoplasias malignas avanzadas y estan constituidos por productos de desintegración tumoral (detritus celular).

En el fondo del extendido puede observarse sustancia no celulares: lípidos, calcificaciones, cristales, moco, etc; que deben ser tenida en cuenta en la valoración global. Es decir del estudio de la sustancia de fondo de la sustancia citológica se puede tener una idea de la primera impresión diagnóstica.

CANTIDAD CELULAR

La cantidad de células presente en el frotis dependerá de varios factores: tipo de tejido (los epitelios de escamas más que los tejidos mesenquimatosos), la localización (externa o interna), la técnica de toma (raspado, punción, recogida de liquido, etc.) e indiscutiblemente la enfermedad de base que curse o no con un aumento de la población celular.

Hay una serie de principios generales a tener en cuenta:

1. En las neoplasias se pierde cohesión celular y las células atípicas se despernde en mayor proporción.

2. La cantidad de células tendrán relación con el estudio clínico de la enfermedad: cuanto más avanzado, mayor será el numero de células atípicas.

3. El grado de diferenciación tumoral tiene relación con la cantidad de células anómalas presente en la extensión.

DISPOSICIÓN CELULAR

Las células se pueden hallar de formas totalmente aislada o formando grupos con características definidas. El motivo de que la célula se presente de una u otra forma está relacionando con varios aspectos: del tipo de toma, tejido de base y enfermedad causal.

Existen múltiples denominaciones para designar a los grupos celulares que se hallan en los extendidos citológicos. En el cual se menciona lo siguiente:

1. Complejo regular “Sheet”, placa simple: se caracteriza por su disposición normalmente en un solo plano, con polaridad conservada, contorno celulares bien definidos, disposición regular en general.

2. Complejo celular irregulas “sincitio”: hay perdida de polaridad y desordenamiento, los contornos celulares son desdibujados y no reconocible en ocasiones.

3. Conglomerado celular “cluster”, grupo denso: suelen ser grupos tridimensionales con superposición y contornos de difícil reconocimiento.

TAMAÑO CELULAR

El tamaño celular es muy variable, oscilando desde las pequeñas células de la microglia de 5µm de diámetro a las 200µm del ovulo femenino. Hay una aspecto a la relación del tamaño que debe valorarse cuidadosamente y es que existe una relación entre el nucleo y citoplasma que se mantiene constante en cada estirpe celular.

Cuando se observa una celula, debe tenerse muy en cuenta este aspecto, pues lo que puede resultar normal en los tejidos puede ser patológico si lo aplica a otro. El tamaño celular guarda relación con la función que desarrolla la célula.

FORMA DE LAS CELULAS

La forma de la celula varia según el tejido estudiado y en relación con la función que desarrolla. La forma celular viene dada por el conjunto del aspecto morfológico del citoplasma y núcleo, y en ello puede influir la técnica de toma y la existencia o no de agentes que pueden alterarla. Las formas pueden se multiples pero hay dos grandes grupos fundamentales que se describen a continuación:

Isodiamtericas:

Poligonales (células escamosas) Redondas (linfocitos)

Anisodiamtericas:

Alargadas (células musculares) Columnares (endocervix)

Fusiformes (tejido conjuntivo) Renacuajo (células atípicas)

DETALLES DE LA ESTRUCTURA CELULAR

Es ahora el momento de observar los mas pequeños detalles que pueden ayudar a precisar si las células en estudio son normales o están alteradas, y en este caso hasta que grado; para esto es indispensable los grandes aumento de observación microscópica. El objetivo de inmersión facilitara la visión de la trama cromática y sus mas pequeños detalles.

Toda la sistemática hasta aquí señalada es notorio que necesita de unos cuantos factores imprescindibles para su seguimiento; por ejemplo, es fundamental el tiempo, pues debe emplearse todo el necesario; no se puede realizar el estudio citológico con prisas. Es decir, la calma es muy importante; en caso de dudas recomendamos dejar la observación para volver a ella en un segundo tiempo al cabo de unos minutos, de unas horas o de un dia; quizás entonces con mente mas fresca se pueda interpretar aquello que en un primero intento no se puede comprender.

SEÑALIZACIÓN DE CAMPOS

Es muy recomendable que una vez estudiada toda la preparación se señale los campos citológicos de mayor interés con un punto o un circulo para poder ser observado posteriormente con rapidez en su búsqueda tanta veces como se necesite, sea por un motivo de docencia, por una revisión del caso, como control de calidad o por revalorización del informe, dado el resultado del estudio anatomopatologico.

INFORME CITOLOGICO

El fin ultimo del estudio citológico es orientar la patología del enfermo para que con un tratamiento adecuado pueda recuperar la salud.

El informe diagnostico es el resultado de combinar el aspecto citológico con las datos clínicos y como conclusión emitir un juicio citopatologico.

El informe debe constar de una descripción minima del fondo de la preparación, de los elementos celulares observados, asi como de sus características para concluir en un resumen diagnostico y unas sugerencias de cara al clínico solicitante.

ARTEFACTOS Y CONTAMINANTES

Los artefactos de técnicas son alteraciones de las extensiones ocurridas durante su procesado que originan imágenes no habituales reproducibles.

Entre los artefactos más habituales destancan:

Filamentos aislados de cromatina, vacuolización nuclear y restos de citoplasma originados tras el aplastamiento o dislaceración de las células durante el preparado citológico.

Manchas parduzcas reticuladas encimas de las células por defectos en la fijación. Alternación de zonas bien conservadas y otras no, debido un aplastamiento de la

muestra. Presencia de pseudos-nucleos en extensiones atróficas e inflamatorias. Partículas de color dorados, debida a inclusiones de aire por una incorrecta

desecación de la extensión ante de su montaje.

Los contaminantes son partículas y organismos que aparecen en las extensiones y que son ajenos a la población celular y la flora especifica de la región tisular en objeto de estudio.

Se dividen en:

Intratintoriales:

Precipitados o colorantes: aparecen como cristaloides del color reactivo precipitado (hematoxilina, orange G, etc.)

Cuerpos celulares flotantes: son acumulaciones de células procedentes de extendidos diferentes, apareciendo en distintos planos.

Extratintoriales: son principalmente de origen ambiental, apareciendo por no tomar precauciones durante el procesamiento celular. Entre ellos destancan: hongos, bacterias, parasitos, granulos de polen, elementos fibrilares, etc; y en especial los aparecidos en extendidos cervico-vaginal: espermatozoides, crema anticonceptivas, células de vesículas seminales, polvo de talco de los guantes de latex, etc.

CONCLUSIÓN

El citodiagnóstico, también llamado examen citológico o simplemente citología, es el diagnóstico morfológico basado en los caracteres microscópicos de células y componentes extracelulares, desprendidos de los órganos espontáneamente u obtenidos por procedimientos que, en general, son menos invasivos que la biopsia.

Los objetivos mas importante de un examen citológico es la colaboración en el diagnóstico y tipificación de neoplasias malignas, mediante la evaluación de las alteraciones de la morfología del núcleo, del citoplasma y de las relaciones entre las células, el diagnóstico específico de algunas lesiones benignas, por ejemplo: tumores benignos, hiperplasias, ciertas infecciones virales o micóticas, la elección de pacientes que deben ser estudiados más profundamente en grupos de alto riesgo para un tipo específico de cáncer y en hematología, examen cualitativo y cuantitativo de los elementos figurados de la sangre periférica (hemograma) y de la médula ósea (mielograma).

En comparación con la biopsia, el citodiagnóstico tiene una gran ventaja en la toma de muestra citológica debido a que esta es más fácil, más económica y menos cruenta. El procesamiento es también más sencillo y el resultado se puede obtener con más rapidez. La muestra citológica en general, abarca un área mucho más amplia que la de una biopsia. En muchos casos permite detectar lesiones no visibles a ojo desnudo (Ejemplos: lavado peritoneal, examen de Papanicolaou).

Sin embargo el diagnostico citológico tiene sus limitaciones para el diagnóstico de tumores malignos, estese basa fundamentalmente en los caracteres celulares de malignidad (heterotipía); el extendido no permite ver directamente la distorsión de la microarquitectura ni la invasión. En algunos casos es difícil distinguir entre caracteres citológicos de cáncer y anaplasia de regeneración. La aplicación de técnicas de inmunohistoquímica es más dificultosa que en los cortes histológicos. Finalmente, es necesario destacar que un diagnóstico negativo para cáncer no descarta la existencia de un tumor maligno, especialmente cuando ese diagnóstico no demuestra una lesión benigna específica (tumor benigno, agente etiológico de un proceso infeccioso). Esta aseveración es válida para todos los métodos de diagnóstico.

BIBLIOGRAFIA

CITOPATOLOGIA GINECOLOGICA Y MAMARIA. 2º Edicion. Editorial MASSON – SALVAT Medicina. Edicion Cientifica y Tecnica, S.A.Autores: A. Fernandez – CID L. Lopez Marin