UNIDAD CUATRO:

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA CELULAR Y

MOLECULAR

HISTORIA DE LA MICROSCOPÍA

Inicia en el siglo XVI con el uso de lentes y microscopios compuestos

Lewenhock aporta con investigaciones de la microfauna de los estanques y charcas.

Las investigaciones de Robert Hooke, entre otros establecieron la microscopia como poderosa herramienta científica.

Zacharias y Janssen construyeron en 1590 el primer microscopio registrado.

Desarrollo de la biología celular y molecular Se produce en forma paralela a la invención

de instrumentos y técnicas biofísicas y bioquímicas.

El perfeccionamiento de tecnología y métodos citológicos.

Extienden los sentidos a nuevos límites y ampliando el conocimiento de la estructura y funcionamiento de la célula.

Avance en el conocimiento de ultraestructura y función de la célula.

MicroscopíaMicroscopio, permite observar objetos

pequeños que no pueden observarse a simple vista.

Dos valores importantes en microscopia son el aumento y el poder de resolución . Aumento, son las dimensiones aparentes

de los objetos comparados con su tamaño real.

Poder de resolución, medida de la nitidez de la imagen.

Límite de resolución

Limites de resolución Ejemplos de niveles de organización a

nivel microscópico.

Diversos tipos de microscopía

Las técnicas y equipos, desarrollo de nueva tecnología, permiten avances microbiologicos

Los alcances y mejoras llegan a nivel molecular.

Actualmente contamos con equipamientos para diversos alcances visuales. 

Tipos de microscopios

Ópticos

Electrónicos

Campo claroCampo OscuroContraste de faseConfocalFluorescencia

TransmisiónBarrido

Microscopía

Microscopía óptica Estudio de la célula viva, requiere técnicas ópticas

especiales. Ej: la microscopia de contraste de fase, campo oscuro o la de interferencia.

Nivel macromolecular, la difracción de rayos X es la técnica más adecuada para estudiar la configuración molecular de proteínas, de ácidos nucleícos y virus.

Los compuestos químicos que constituyen la célula pueden ser detectados, descriptos y localizados dentro y fuera de la célula mediante métodos adaptados de la Química Analítica.

Microscopio óptico El microscopio óptico común permite estudiar la

morfología celular de las células, vivas y fijadas. Forma y estructura de los organelos más

grandes. Los organismos que podemos observar con este

instrumento son parásitos, bacterias y otras estructuras cuyo límite de resolución sea mayor a 0,2 um.

Sus ventajas son la facilidad de manejo y alta disponibilidad.

Microscopio de contraste de fases Observación de células vivas, componentes

transparentes por su alto contenido de agua. Al disecarla no presenta un significativo

contraste. Los microscopio de contraste de fase y de

interferencia son sistemas ópticos especiales que logran intensificar la escasa interferencia.

Proporcionan mayor contraste que el obtenido con un M.O común.

Microscopio de polarización Provee datos sobre la estructura a nivel

molecular de las células y los tejidos. Aplica luz polarizada a la muestra

observada Usados en células vivas y en

preparados post-mortem.

Microscopio de campo oscuro Facilita la observación de células vivas. El haz luminoso se proyecta oblicuamente y

los sistemas de lentes detectan la luz reflejada por la muestra que se ve como un objeto brillante contra un fondo oscuro.

Lográ un gran relieve de rasgos de la célula que son invisibles en el MO.

Métodos Citoquímicos Aplicados para el estudio de la composición química de las

células y sus procesos biológicos moleculares. Mediante análisis químicos y físicoquímicos que permitan

su observación.  Objetivo es cualitativo y cuantitativo Estudia los cambios dinámicos producidos en el contenido

químico celular en las distintas etapas del metabolismo. La muestra debe ser:

a) inmovilizada (fijación)b) Usar un procedimiento específico (tinción).

Fig. Celulas ovocitarias

HistoquímicaCiencia que se dedica al estudio de los procesos químicos de los tejidos y sus elementos constituyentes.

Técnica histológica, conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada (tejido biológico) para que sea posible su estudio por medio del microscopio.

Preparación de tejidos para estudio microscópicoInicia con la toma de muestra. La obtención de la muestra puede ser de: Tejido vivo (biopsia) Tejido muerto (necropsia).

Técnicas de obtención de muestras Raspado, obtención de muestras de mucosa

(bucal, vaginal). Aguja de biopsia, se obtiene porción de tejido

(hígado). Disección directa, en tejidos superficiales

(piel). Endoscopia, para obtencion de muestras de

órganos huecos o cavidades corporales. Cateter, se puede usar para toma de muestra

de sangre.

FijaciónEvita la destrucción enzimática de las células por autólisis, impide la proliferación bacteriana.Mantienen la estructura y evita descomposición del tejido.Endurece las estructuras celulares y se aumenta la afinidad hacia los colorantes. Se puede realizar por medios físicos como el calor o desecación o por medios químicos.

Fijadores químicosPor medios químicos: alcohol, acetil alcohol,formol, Acido acético, tetraoxido de osmio, entre otros en diferentes combinaciones.

Formaldehído: fijador más empleado en microscopía comun.

Glutaraldehído: fijador de uso frecuente en microscopía electrónica.

Cortes finos, resinas y ultramicrótomo

La mayor parte de las células se encuentran formando parte de los tejidos, por lo que es necesario hacer cortes en secciones finas, para un examen al microscopio.

Los cortes se realizan por un micrótomo, para lo cual se debe fijar el tejido e incluirlo en parafina,

Proceso que facilita el corte en el micrótomo. Los cortes obtenidos, con espesores de 3 a 6 micras se pueden observar en microscopios compuestos y en electrónicos.

Proceso de fijación y corte

Coloraciones Sirven también para diferenciar en los tejidos

las diferentes estructuras o sustancias. Mediante tinciones o coloraciones es posible

identificar compuestos orgánicos celulares, como lípidos, enzimas, ácidos nucleicos, etc.

Tipos de coloración Colorantes vitales, no alteran la fisiología

celular y facilitan la identificación de organelos. Se usan para teñir células vivas, se ponen entre el porta y cubre objetos e ingresa en la muestra por difusión.

Colorantes supravitales, son aquellas que se usan in vitro, tiñendo células vivas que han sido separadas del organismo.

Tincion "de rutina”, de uso frecuente, hematoxilina y eosina (H&E), .

Tinción de Gram Tipo de tinción diferencial. Para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto para distinguir la morfología

celular bacteriana y para poder realizar la diferenciación bacteriana

Bacteria Gram positiva, a las bacterias que se visualizan de color moradas. de Bacillus anthracis.

Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella

Ej E.coli

RadioautografíaTécnica citoquímica, para detectar Isotopos radioactivos, que previamente fueron introducidos como marcadores de diversas sustancias en las células. Se emplean para estudiar la duración del ciclo celular, secreción de sustancias y síntesis de compuestos como el ADN y el ARN. Procedimiento que introduce un isótopo específico, que se asocia a la sustancia que se pretende localizar, de la que se obtiene una placa microfotográfica.

Fraccionamiento celularTécnicas que permiten la obtención de fracciones relativamente puras de organelos e inclusiones.En la centrifugación de un homogeneizado de células, las membranas plasmáticas se rompen y sus constituyentes quedan dispersos en un medio líquido, que gralmente es la sacarosa, a diferentes concentraciones. Velocidades de 80000 (RPM). Fuerzas sobre las partículas de 500000 veces mayores que la fuerza de la gravedad (500000g).

Centrifugación Los organelos mayores y más densos se extraen

primero. Se vuelve a centrifugar el sobrenadante a mayor

velocidad, obteniéndose diferentes fracciones celulares, por centrifugaciones sucesivas. Primera fracción: núcleos Segunda mitocondrias y lisosomas Tercera endomembranas membranas Finalmente los ribosomas.

Esquema de proceso de centrifugación

Análisis molecular del ADN e ingeniería genética Técnicas de laboratorio que se usan para

aislar ADN o extraerlo en alta pureza Visualizarlo para ver su estado, cortarlo y

pegarlo Permite amplificar una región en una

enorme cantidad de moléculas. Aplicaciones: diagnóstico de enfermedades

hereditarias, búsqueda de alelos más o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar.

Aplicaciones médicas Diagnóstico de contaminación bacteriana en

alimentos (detección de E. coli, cepas diferentes de Salmonellas, Mycobacterium sp.)

Diagnóstico viral o de infección viral (HIV, Hepatitis C, PIF, otros).

Selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie.

Test de paternidad, diagnóstico de identidad forense, etc.

TAREA Investigar Usos, resolución, aplicaciones en medicina.

Microscopio de interferencia Microscopio confocal Microscopía electrónica - Microscopía electrónica de transmisión

- Microscopía electrónica de barrido