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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Humanidades y Ciencias de la Educación

Trabajo Fin de Grado

Consumo espontáneo de ansiolíticos y cafeína en ratas Wistar: un estudio

preliminar.

Alumno/a: Juan Ortega Alonso

Tutor/a: Carmen Torres Bares

Dpto: Psicología

Junio, 2016

1

ÍNDICE

RESUMEN Y PALABRAS CLAVE ..................................................................................... 2

ABSTRACT .............................................................................................................................. 2

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 3

MÉTODO ................................................................................................................................ 10

Sujetos .......................................................................................................................... 10

Aparatos ...................................................................................................................... 10

Procedimiento ............................................................................................................. 11

Fármacos ..................................................................................................................... 12

Variables dependientes .............................................................................................. 12

Análisis estadísticos .................................................................................................... 12

Resultados ................................................................................................................... 13

DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 15

CONCLUSIONES .................................................................................................................. 19

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 20

ANEXOS ................................................................................................................................. 23

2

RESUMEN

En este TFG se trata de investigar los patrones de consumo voluntario de la cafeína, el

clordiazepóxido (CDP) y el alcohol en ratas Wistar, de esta manera el objetivo ha sido

analizar en qué medida estos patrones de consumo dependen de la dosis de sustancia

administrada. Para ello, los animales (ratas Wistar macho privadas de alimento) fueron

expuestos a una prueba de preferencia (2 h) agua/droga en la que recibieron cafeína (de 0,1 a

2 mg/kg), CDP (de 0,1 a 1,4 mg/kg), o alcohol (2%), respectivamente, frente a agua. Los

resultados mostraron que, con independencia de la dosis, los animales mostraron una clara

preferencia por el alcohol y el CDP, pero no por la cafeína, ya que este grupo no mostró un

mayor consumo frente al agua. En concordancia con estudios previos, este experimento

muestra cómo el alcohol y el CDP son sustancias preferidas por los animales, probablemente

debido a sus propiedades ansiolíticas y potencial adictivo. Los resultados de este TFG se

discuten en relación con la utilidad de los modelos animales para comprender la conducta de

consumo humana.

Palabras clave: cafeína, clordiazepóxido, alcohol, consumo voluntario, prueba de

preferencia, adicción, modelos animales.

ABSTRACT

This study investigates the patterns of voluntary consumption of caffeine,

chlordiazepoxide (CDP) and ethanol in Wistar rats, with the main aim of analyzing whether

animals’ preference depends on the drug dose. Food deprived male Wistar rats were exposed

to a preference test (2 h) with access to caffeine (0,1 to 2 mg/kg), CDP (0,1 to 1,4 mg/kg) or

ethanol (2%) vs water, respectively. The results showed that, regardless the dose, animals

preferred CDP and etanol vs water, as oppossed to caffeine. According to previous studies,

present data suggest that ethanol and CDP are highly preferred by animals, probably because

of their anxiolytic effects and addictive potential. The usefulness of animal models to better

understand human addictive behavior is discussed.

Keywords: caffeine, chlordiazepoxide, alcohol, voluntary consumption, preference

test, addiction, animals models.

3

INTRODUCCIÓN

A lo largo de su historia el ser humano ha utilizado sustancias psicoactivas con

diversos fines, incluyendo el alivio de dolencias físicas, el tratamiento de problemas

emocionales y el abordaje terapéutico de enfermedades mentales (Torres y Papini, 2016).

Mascar hojas de coca, fumar cigarrillos de nicotina o de marihuana, beber vino, consumir

opio, etc. constituyen algunos ejemplos populares de sustancias que el hombre ha consumido

a lo largo de años y que tienen potencial adictivo, haciendo éste referencia a la posibilidad de

que algunas personas pierdan el control y consuman de forma compulsiva dichas drogas

(Brugal, Rodríguez-Martos y Villalbí, 2006). En este sentido, la adicción se define como un

trastorno crónico caracterizado por compulsión a buscar y consumir la droga, pérdida de

control de un consumo limitado, y aparición de un estado emocional negativo (ansiedad,

irritabilidad, disforia), cuando la droga no está disponible (Koob, Arends y LeMoal, 2014).

De este modo, el estado de abstinencia derivado del cese del consumo puede llegar a ser el

factor desencadenante de una recaída y de la búsqueda de la droga, funcionando este

mecanismo como un reforzamiento que mantiene y cronifica la adicción (Fernández-Espejo,

2002; Torres y Papini, 2016).

El Manual de Diagnósticos y Estadísticas de los Trastornos Mentales de la Asociación

Psiquiátrica Americana (DSM-V, 2013) establece los criterios para realizar un diagnóstico por

abuso de sustancias. En la denominación de trastornos relacionados con sustancias y

trastornos adictivos se incluyen distintas sustancias psicoactivas, como alcohol, cafeína,

cannabis, alucinógenos, inhalantes, opiáceos, sedantes, hipnóticos y ansiolíticos, estimulantes,

tabaco y otras sustancias. A diferencia de publicaciones anteriores, que establecían una

distinción entre abuso y dependencia, el diagnóstico se realiza cuando la persona tiene dos o

más síntomas de los siguientes once a lo largo de un periodo mínimo de un año (Becoña,

2014):

1.- Uso peligroso

2.- Problemas sociales/interpersonales relacionados con el consumo

3.- Incumplimiento de los principales roles por su consumo

4.- Síndrome de abstinencia

5.- Tolerancia

6.- Usa mayor cantidad/más tiempo

4

7.- Intentos repetidos de dejarlo o de controlar el consumo

8.- Se pasa mucho más tiempo del que se pensaba realizando actividades relacionadas

con el consumo

9.- Problemas físicos/psicológicos relacionados con el consumo

10.- Dejar de hacer otras actividades debido al consumo

11.- Craving

También se establece el grado de severidad del trastorno adictivo, siendo éste leve si el

paciente presenta 2-3 síntomas, moderado si tiene 4-5 síntomas, y severo cuando están

presentes 6 o más síntomas (Becoña, 2014).

Actualmente, la adicción a diferentes sustancias de abuso constituye un marco común

que abarca problemas de tipo social, político y médico, según se desprende de los estudios

que periódicamente publica el Observatorio Español de la Droga y las Toxicomanías (OEDT),

dependiente del Plan Nacional sobre Drogas. En las últimas encuestas presentadas por este

organismo se pone de manifiesto un aumento considerable de la prevalencia en el consumo de

drogas, siendo el alcohol la sustancia psicoactiva que más se consume. Durante el año 2013 el

78% de la población había consumido alcohol en los últimos 12 meses y el 19% de los

españoles entre 15 y 64 años habían llevado a cabo consumos intensivos de alcohol a lo largo

del último año. Además se estimó un aumento del consumo de tabaco a edades tempranas,

donde el 41% de la población ha fumado durante el último año y el 73% de la población de 15

a 64 años reconoce haber consumido tabaco alguna vez en su vida. A estas sustancias le

siguen el uso de hipnótico-sedantes (12%), cannabis (9% de la población reconoció haberlo

consumido en los últimos 12 meses), y finalmente la cocaína (2%). De acuerdo con los datos

estadísticos comentados, sin duda, es evidente el papel que las sustancias con potencial

adictivo tienen en nuestra sociedad y las implicaciones sociales que ello conlleva. Todo ello

justifica la realización de investigaciones científicas que exploren las causas neurobiológicas

de este complejo trastorno neuroconductual.

Un efecto común a todas las drogas de abuso es su capacidad para producir

sentimientos de euforia y bienestar, y para disminuir los estados negativos. Estos efectos se

originan en el mesencéfalo y proyectan a la base del prosencéfalo, formando un circuito

conocido como sistema de recompensa cerebral. La activación de este circuito (en especial de

un núcleo conocido como núcleo accumbens) a través de una determinada conducta (en

5

nuestro caso, el consumo de una sustancia adictiva) aumenta la probabilidad de que dicha

conducta vuelva a emitirse, por lo que las drogas de abuso actúan como potentes reforzadores

debido a su capacidad para activar el circuito de la recompensa (Koob y Volkow, 2010). Los

conocimientos relativos a las bases biológicas de la conducta adictiva han sido posibles

gracias, en gran medida, al empleo de modelos animales de comportamiento humano (Camí,

Mcgeary y Swift, 2005). Así, los modelos animales de conducta adictiva permiten estudiar en

condiciones controladas comportamientos o problemas que son complejos o inasequibles de

estudiar directamente en personas, bien por limitaciones éticas o bien por dificultades

metodológicas. En el caso que nos ocupa, las adicciones, son varios los modelos animales de

conducta adictiva utilizados, pudiéndose clasificar en función de si la exposición a la droga

está controlada por el animal (es decir, si depende de su conducta), aludiéndose en este caso a

los modelos de autoadministración, o si por el contrario está controlada por el

experimentador, lo que correspondería a modelos de administración forzada. A su vez, los

modelos de autoadministración se clasifican en procedimientos de jaula-hogar o de

condicionamiento operante. En el primer caso, el animal tiene acceso ilimitado o limitado a la

droga en su jaula-hogar, donde se le presentan botellas con agua o con una sustancia de abuso

(simultánea o sucesivamente) y se le da opción al animal a consumir la droga de forma

espontánea. Por el contrario, en las pruebas operantes se requiere la aparición de una

respuesta instrumental (por ejemplo, la presión de una palanca) para conseguir la droga,

considerándose dicha respuesta como una conducta de búsqueda de la droga bajo estudio

(Kamenetzky y Mustaca, 2004). Dado que el presente Trabajo de Fin de Grado (TFG) utiliza

las pruebas de preferencia en la jaula-hogar, en las páginas siguientes se hará una revisión

más exhaustiva de este procedimiento.

El consumo voluntario de sustancias de abuso es un fenómeno que se observa con

relativa frecuencia en roedores y otros mamíferos en su ambiente natural. Así, por ejemplo,

los animales consumen frutas y otros alimentos fermentados que contienen concentraciones

variables de alcohol, mostrando patrones conductuales indicativos de intoxicación etílica

(Torres y Papini, 2016). En el laboratorio se trabaja con la conducta consumatoria que el

animal despliega cuando tiene acceso a la droga de abuso, lo cual determina la cantidad que se

ingiere en un intervalo de tiempo determinado. Con frecuencia se emplean pruebas de

preferencia o elección en las que los animales tienen disponible en sus jaulas-hogar

soluciones de agua y droga en diferentes concentraciones. El animal tiene la opción de

consumir una u otra solución, bien de forma permanente (24 horas) o bien durante períodos

6

limitados de tiempo (por ejemplo 2 horas). Se registra el volumen consumido de cada botella,

y se calcula el índice de preferencia por la sustancia con potencial de abuso, basado en la

proporción ingerida en relación con el volumen total de líquido consumido. La preferencia

aparece cuando, del volumen total de fluido ingerido, más del 50% corresponde a la solución

que contiene la droga. En ocasiones se opta por presentar ésta como única solución disponible

para beber, una condición de consumo forzado que puede influir en los procesos de elección y

preferencia posteriores (Kamenetzky y Mustaca, 2004).

Estos modelos presentan una serie de características que merecen destacarse (véase

Spanagel, 2003, para revisión). En primer lugar, y como ya se ha comentado, los animales son

capaces de autoadministrarse la droga de forma espontánea, es decir, de consumirla de forma

voluntaria. Además, las tasas de autoadministración están directamente relacionadas con los

efectos farmacológicos de la misma, y no estrictamente con su sabor o con su valor calórico,

de modo que los animales pueden regular, a través de la cantidad de sustancia ingerida, los

efectos psicoactivos que pretenden conseguir. Por otro lado, el acceso prolongado a sustancias

de abuso da lugar a la aparición de comportamientos y fenómenos similares a los observados

en seres humanos, incluyendo tolerancia, deseo compulsivo (craving), pérdida de control,

recaídas, etc. En este sentido, se sabe que, en el caso del alcohol, su consumo voluntario pasa

por tres fases o estadios de desarrollo. En primer lugar se encuentra la fase de adquisición,

que se desarrolla a lo largo de las dos primeras semanas; en este estadio la ingesta de alcohol

es inestable y a su vez pueden aparecer fenómenos de aversión debido a un mecanismo

conocido como neofobia o tendencia a evitar estímulos novedosos. Este fenómeno que puede

atenuarse presentando dosis gradualmente crecientes de la sustancia en cuestión, dando la

opción de beber diferentes concentraciones de la misma de forma simultánea, o bien

mezclando la solución con alguna sustancia altamente palatable como sacarosa o sacarina

(Kamenetzky y Mustaca, 2004). Esta primera fase va seguida de una fase de consumo

controlado, que puede mantenerse algunos meses y en la que el consumo está regulado por

factores externos e internos. Por último, a partir del sexto mes aproximadamente comienza

una fase de pérdida de control en la que los factores externos e internos ya no influyen en el

consumo de la droga, sino que éste parece automatizarse. El comportamiento de los animales

se caracteriza ahora por una alta preferencia por la droga y por una transición del consumo

controlado al no controlado, en un “punto de no retorno” (Spanagel, 2000).

Los modelos animales de consumo voluntario (oral) de drogas de abuso se han

desarrollado básicamente en relación con el alcohol, ya que es una de las sustancias de

7

carácter psicoactivo con mayor abuso por parte del hombre. El alcohol ejerce su efecto

actuando sobre los receptores de sistemas neuroquímicos diversos, como el de dopamina,

opioides, glutamato y especialmente sobre el sistema GABAérgico, donde potencia la acción

inhibitoria de éste, ocasionando efectos hipnóticos, miorrelajantes y ansiolíticos en el

comportamiento. Además actúa en el sistema mesolímbico dopaminérgico, el cual es clave en

el consumo y abuso de drogas, aumentando la liberación de dopamina en el circuito de la

recompensa (Rengifo, Tapiero y Spinel, 2005). En los estudios de consumo voluntario de

alcohol se ha comprobado en repetidas ocasiones que existe una gran variabilidad entre los

individuos en sus tasas de preferencia por el alcohol, y que estas diferencias pueden

determinar la susceptibilidad de los sujetos a desarrollar patrones anormales de consumo. Esta

observación ha permitido desarrollar, mediante procedimientos de selección psicogenética,

pares de cepas de animales caracterizados por diferencias extremas en sus niveles de consumo

voluntario de etanol (Manzo et al., 2012). Asimismo, en ocasiones se comprueba que los

patrones específicos de ingestión de esta droga difieren en función de la dosis de etanol que se

presenta durante la prueba de preferencia. Así, por ejemplo, en algunos estudios se utiliza una

dosis al 10%, observándose que los sujetos suelen preferir el agua; ello sugiere que el etanol

pudiera ser aversivo en concentraciones tan elevadas (Fernández-Teruel et al., 2002). En otros

casos se emplean dosis crecientes de etanol, comenzando con una dosis inicial al 2% la cual

se va incrementando hasta llegar al 10%, obteniendo como resultado una mayor preferencia

por el alcohol cuando la dosis fue del 2% (Manzo et al., 2012). En el laboratorio de Psicología

Animal de la Universidad de Jaén hemos comprobado repetidamente que la dosis de alcohol

idónea para inducir patrones de preferencia estables en los roedores están en torno al 2% de

concentración (Manzo, Donaire, Sabariego, Papini y Torres, 2015; Manzo et al., 2014; Manzo

et al., 2012; Manzo, Gómez et al., 2015).

En contraposición a los numerosos trabajos relacionados con el consumo oral de

alcohol, son muy escasos los trabajos que analizan el consumo espontáneo de otras sustancias

con potencial de abuso en animales de laboratorio. Tal es el caso de la cafeína y de las

benzodiacepinas, dos sustancias con potencial de abuso que se consumen en seres humanos de

forma oral, y que se revisarán en a continuación por su especial importancia para el presente

TFG.

La cafeína es la sustancia estimulante más consumida hoy en día, y también la que

recibe mayor aceptación a nivel mundial. Esta droga pertenece al grupo de las metilxantinas,

las cuales se unen a los receptores A1 y A2a de la adenosina, un neuromodulador que se

8

encarga de inhibir la liberación de neurotransmisores como el GABA, la acetilcolina, la

dopamina o el glutamato; es decir, la adenosina es un inhibidor del sistema nervioso que

produce relajación, sedación y ansiólisis (Moratalla, 2008). La cafeína actúa sobre estos

receptores como un antagonista competitivo, bloqueando por tanto la acción inhibitoria de la

adenosina. Además, esta sustancia potencia la transmisión dopaminérgica en neuronas del

núcleo estriado y en el circuito cerebral de la recompensa (donde se coexpresan los receptores

A2a); de ahí su potencial de abuso. Los efectos farmacológicos de la cafeína son bien

conocidos, incluyendo el aumento de la alerta y de la capacidad para mantener esfuerzo

intelectual, la reducción del nivel de cansancio y fatiga, y el mantenimiento del estado de

vigilia pese a la privación de sueño (Fenu y Acquas, 2013; Lozano, García, Tafalla y

Albadalejo 2007). Consumida en dosis bajas (0.2 mg/kg), la cafeína produce aumentos en la

actividad locomotora en animales (Ball y Poplawsky, 2011), mientras que el consumo de

dosis elevadas reduce el dolor neuropático en los mismos (Wu et al., 2006).

En cuanto a las benzodiacepinas, actualmente constituyen el grupo de fármacos más

consumido para el tratamiento de la ansiedad, y a pesar de su acción ansiolítica también se

han utilizado en otras aplicaciones clínicas, como por ejemplo para inducir sueño o como

anticonvulsivos. Las benzodiacepinas potencian la acción del GABA sobre el receptor

GABA-A y se unen a interneuronas GABAérgicas que interaccionan con la dopamina, lo que

resulta en una mayor liberación de este neurotransmisor en el núcleo accumbens. Tal efecto

puede generar dependencia física, adicción y efectos secundarios tales como amnesia y

sedación (Rosas-Gutiérrez, Simón-Arceo y Mercado, 2013). La mayoría de los estudios

experimentales realizados con estas sustancias se basan en la administración forzada de las

mismas y el estudio posterior de sus efectos ansiolíticos, analizados en pruebas conductuales

de laboratorio con alta validez predictiva, como el laberinto elevado o el campo abierto

(Leite, Castelahno y Cysneiros, 2016). Sin embargo, sólo disponemos de un estudio

experimental en el que los animales tuvieron acceso a una benzodiacepina (el clordiazepóxido

-CDP-) para su consumo de forma oral. En este trabajo, Manzo, Donaire et al. (2015)

analizaron el impacto de una experiencia emocional negativa sobre el consumo voluntario de

este ansiolítico. Para ello llevaron a cabo una tarea de inducción de frustración que fue el

contraste sucesivo negativo consumatorio (cSNC), compuesto de dos fases, pre- y post-. En la

primera fase un grupo de animales recibía una solución azucarada al 32% (grupo 1), y otro al

4% (grupo 2); en cambio, en la fase post- todos los animales recibían la solución al 4%.

Inmediatamente después de realizar esta tarea de inducción, los animales era transportados de

9

vuelta a su jaula-hogar, donde se les administraba un test de preferencia con dos botellas, una

con agua y otra con CDP (la dosis se fue incrementando desde 0.1 hasta 1 mg/kg durante las

sesiones pre-) o con alcohol (2%). Los resultados obtenidos en este estudio indicaron que la

reducción en la concentración de la solución del 32% al 4% en el grupo 1 produjo un aumento

en el consumo de CDP y de alcohol en el test de preferencia posterior, un aumento que no

apareció en el grupo 2. Estos datos sugieren que la reducción en el valor de una recompensa

esperada constituye un acontecimiento emocional negativo que puede aumentar el consumo

voluntario de ansiolíticos a través de un mecanismo de automedicación (Manzo, Donaire et

al., 2015).

En definitiva, la revisión realizada en estas páginas pone de manifiesto que el estudio

del consumo voluntario oral de sustancias de abuso constituye uno de los modelos animales

de adicción más utilizados en la investigación neurocientífica. Sin embargo, a pesar de su

utilidad, son numerosas las cuestiones que aún deben investigarse con más detalle para

avanzar en el conocimiento de los determinantes de la conducta adictiva. El presente TFG se

enmarca en este contexto experimental, y trata de investigar los patrones de consumo

voluntario de dos sustancias de abuso poco empleadas en este ámbito: la cafeína y el CDP,

tratando de comparar los patrones de consumo de estas drogas con los característicos del

alcohol en ratas Wistar. En concreto, su objetivo fue analizar los patrones de consumo de

alcohol, cafeína y CDP en ratas Wistar macho, tratando de establecer en qué medida dichos

patrones de consumo dependen de la dosis de sustancia administrada. Para ello los animales

fueron sometidos a una prueba de preferencia agua/droga de dos horas de duración. Sobre la

base de los estudios anteriores y tras su revisión se establecieron las siguientes hipótesis y sus

correspondientes predicciones: (1) El alcohol y el CDP son sustancias ansiolíticas con

potencial adictivo (Rengifo et al., 2005; Rosas-Gutiérrez et al., 2012); (2) La cafeína es una

sustancia estimulante que los animales consumen en dosis moderadas (Ball y Poplawsky,

2011), mientras que dosis altas de la misma producen efectos ansiogénicos (Hughes y

Hancock, 2016); (3) los animales sometidos a una prueba de consumo voluntario oral

consumirán de forma espontánea alcohol, CDP y cafeína, mostrando preferencia por dichas

sustancias en relación con el agua; (4) Los patrones de consumo y preferencia por el CDP y

la cafeína dependerán de la dosis de droga utilizada, en especial en relación con la cafeína,

que en dosis elevadas podrá tener efectos aversivos.

10

MÉTODO

Sujetos

Se utilizaron 36 ratas Romanas macho Wistar (Harlan Laboratories S.A.). Los

animales tenían una media de peso aproximado de 368.2 ± 20.84 gramos al comienzo del

experimento, y fueron colocados individualmente en su jaula hogar, donde tuvieron acceso

libre a agua. Los animales fueron sometidos a un procedimiento de privación de comida para

conseguir mantener su peso al 82-85% de su peso inicial. La temperatura de la sala fue de 20

grados centígrados de manera constante, y los sujetos fueron sometidos a un periodo de luz de

8.00 a 20.00 y de oscuridad de 20.00 a 8.00. La exposición a los fármacos se realizó en

sesiones de 2 horas, y el registro de las variables dependientes se llevó a cabo entre las 8.00 y

las 13.00 horas. El experimento se realizó en el Centro de Producción y Experimentación

Animal (CPEA) de la Universidad de Jaén, contando con el visto bueno del Comité de

Bioética de la Universidad de Jaén. Además este estudio sigue las directrices de la Unión

Europea para el uso de animales en Investigación (2010/63/EU) y la Ley española (6/2013;

RD. 53/2013) (véase Anexo I).

Aparatos

Para este experimento se contó con jaulas hogar de plexiglás, con unas dimensiones de

30 cm de largo y ancho y 15 cm de alto. Cada jaula contenía el suelo cubierto de serrín y el

techo fue una rejilla metálica, sobre la cual se colocaron botellas que contenían los líquidos y

los pellets. Las botellas utilizadas para suministrarles agua tenían una capacidad de 500 ml,

mientras que las botellas usadas para la prueba de preferencia fueron de 150 ml cada una. Las

sustancias farmacológicas que se usaron en el estudio fueron clordiacepóxido (CDP), etanol

(E) y cafeína (CAF). Las botellas que contenían los compuestos farmacológicos se forraron

con cinta adhesiva negra, ya que el CDP podía perder efecto al entrar en contacto con la luz.

Para evitar la influencia de esta variable, también se forró una de las botellas en el resto de los

grupos y en el grupo control que tenía acceso a dos botellas con agua. En cuanto a la

medición del consumo de líquidos se utilizó una báscula digital de precisión (Cobos, JT-

300C, Barcelona, España) y para el control del peso de los animales se utilizó una báscula

digital de precisión diferente (Baxtran, Model BS3, Girona, España). Las concentraciones de

11

CDP y CAF se prepararon utilizando un agitador magnético (Nahita Magnetic Stirrer 680-9,

Beriain, España) y una báscula digital (Cobos, Precisa 125A, Barcelona, España). En cuanto

al registro de los datos diarios de consumo se utilizaron hojas de registro donde se anotaba el

peso de cada botella antes y después del test de preferencia. Todos los datos fueron

introducidos diariamente en un disco duro y ordenados en un fichero Excel para calcular las

variables dependientes (véase Anexo II).

Procedimiento

Los animales fueron asignados a cuatro grupos aleatoriamente, en función de su peso

inicial: CDP, E, CAF y agua (A). El estudio constó de dos fases, una primera de habituación

(con una duración de 4 sesiones) en la que se exponía a los animales a las dos botellas

pequeñas rellenas de agua, y una fase experimental (con una duración de 14 sesiones) en la

que una de las botellas contendría el fármaco correspondiente a cada grupo experimental, y la

otra agua. La prueba de preferencia duraba dos horas, y cada día se cambiaba el orden de

colocación de las botellas en la jaula hogar para evitar que hubiera un efecto de preferencia

por el lugar. Las disoluciones se prepararon diariamente mezclando el fármaco con agua del

grifo. Las dosis de CAF y CDP se introdujeron gradualmente para evitar aversión, mientras

que la concentración de E fue siempre al 2%, dado que es una dosis que no produce aversión

(Manzo et al., 2012). Los animales del grupo CDP fueron expuestos, durante dos días

consecutivos, a concentraciones de 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 1.2, y 1.4 mg/kg, respectivamente.

Finalmente, el grupo de CAF recibió concentraciones, durante dos días cada una, de 0.1, 0.2,

0.4, 0.8, 1, 1.5 y 2 mg/kg. Estas concentraciones se prepararon en 12 ml de agua, teniendo en

cuenta el volumen de consumo de líquidos que un animal puede ingerir en un periodo de dos

horas (Manzo et al., 2012). Para todos los días el procedimiento era el mismo: se pesaba

primeramente a los animales, y se retiraba la botella grande de la jaula hogar. Mientras, se

preparaban las disoluciones para las botellas pequeñas, se pesaban, y se colocaban en la jaula

hogar de todos los animales durante dos horas. Transcurrido este tiempo, se retiraban de cada

jaula ambas botellas, se pesaban en la balanza de precisión, se anotaba el peso de la botella y

se restaba del peso inicial de las mismas para calcular el consumo. Por último se colocaban

los pellets correspondientes para mantener al animal en torno al 82-85% de su peso ad

libitum.

12

Cada día, en horario de 8.00 a 13.00, se registró el peso del animal, y el de las botellas

de agua y las demás concentraciones comentadas, calculándose las correspondientes variables

dependientes. Cada dos días se procedía a la limpieza de cada jaula hogar y al cambio de

serrín (véase Anexo III).

Fármacos

Las sustancias farmacológicas que se usaron en el estudio fueron CDP

(chlordiazepoxide hydrochloride, Sigma Aldrich, Madrid, Spain), E (96%, Panreac, Castellar

del Vallés, Spain) y CAF (Sigma Aldrich, Madrid, Spain).

Variables dependientes

Las variables dependientes registradas en este experimento fueron las siguientes:

consumo de agua, consumo del fármaco (E, CDP o CAF, dependiendo de la condición

experimental), y consumo total (consumo del fármaco + consumo de agua). Se calculó, a

partir de estos valores, un índice de preferencia por el consumo de la droga en cuestión:

consumo de la droga/consumo total de líquidos (véase Anexo IV).

Análisis estadísticos

Los datos fueron sometidos a un análisis de variancia con dos factores: grupo (CAF, E,

CDP y A) y dosis (0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 1.2 y 1.4 mg/kg para CDP; y 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 1.5

y 2 mg/kg para CAF) o sesión (para E). Los datos correspondientes al consumo de las

diferentes dosis se obtuvieron a partir del cálculo del promedio del consumo de las dos

sesiones en las que los animales recibieron dicha dosis. Los análisis a posteriori se realizaron

utilizando la diferencia mínima significativa (DMS). Para todos los análisis estadísticos, el

nivel de significación estadística se estableció en p < 0.05. Estos análisis se realizaron

utilizando el paquete estadístico SPSS (IBM SPSS Statistics v.20).

13

Resultados

Consumo del fármaco. La Figura 1 muestra el volumen de fármaco consumido por los

diferentes grupos a los que se ha expuesto la droga, que se corresponden a las dosis utilizadas

durante el experimento. El ANOVA dosis/sesión (7) x grupo (4) arrojó un efecto significativo

de dosis, F(6,192) = 3,619, p < .002, y grupo, F(3,32) = 2,981, p < .046. Los análisis a

posteriori indicaron que el grupo E consumió más de la solución que los grupos A (p < .016)

y CAF (p < .019), mientras que no mostró diferencias estadísticamente significativas con

respecto al grupo CDP.

Figura 1. Cantidad de fármaco ingerida (ml) por las ratas de los diferentes grupos. La figura

muestra el consumo de los animales conforme se aumentaba gradualmente la dosis de

cafeína o CDP, así como el consumo de E a lo largo de las sesiones.

Consumo de agua. No se encontraron diferencias en el consumo de agua entre los

grupos, ni tampoco a lo largo de las sesiones. El ANOVA dosis/sesión (7) x grupo (4) no

arrojó ningún efecto estadísticamente significativo.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0,1 0,2 0,4 0,8 1 1,2/1,5 1,4/2

con

sum

o (

ml)

dosis (mg/kg)

Consumo del fármaco

CAF

ETANOL

CDP

AGUA

14

Consumo total. La Figura 2 muestra el volumen total de líquido consumido por los

distintos grupos. Como puede observarse, el consumo total del grupo de E es mayor que en

los demás grupos, siendo el consumo de los grupos CAF y A similar, mientras que los valores

de consumo del grupo CDP parecen ser intermedios. El ANOVA dosis/sesión (7) x grupo (4)

arrojó un efecto significativo de la variable dosis, F(6,192) = 3,702, p < .002, y

marginalmente significativo de la variable grupo, F(3,32) = 2,793, p < .056.

Figura 2. Cantidad total de líquido ingerido (ml) en los grupos A, CAF, E o CDP.

Preferencia. La figura 3 muestra los datos que corresponden a la preferencia por el E,

CAF, CDP o agua, mostrando que los valores más altos de preferencia correspondieron a los

grupos E y CDP, mientras que el grupo CAF se mantuvo en niveles intermedios entre estos

grupos y el de A. El ANOVA dosis/sesión (7) x grupo (4) arrojó un efecto significativo de la

variable grupo, F(3,32) = 4,436, p < .010. El análisis a posteriori indicó que los grupos E y

CDP mostraron valores de preferencia superiores al grupo A (p < .004 y .005,

respectivamente).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0,1 0,2 0,4 0,8 1 1,2/1,5 1,4/2

con

sum

o (

ml)

dosis (mg/kg)

Consumo total

CAF

ETANOL

CDP

AGUA

15

Figura 3. Preferencia por CAF, E, CDP o A en función de la dosis o la sesión.

DISCUSIÓN

El principal objetivo de este experimento fue analizar los patrones de consumo

voluntario de alcohol, cafeína y CDP en ratas Wistar. Para ello los animales fueron expuestos

a una prueba de preferencia en la que las dosis de cafeína y CDP fueron aumentándose

gradualmente, mientras que la dosis de alcohol se mantuvo constante. Los resultados

mostraron una clara preferencia por el alcohol y por el CDP, no dependiendo en este último

caso de la dosis suministrada. Por el contrario, el grupo CAF no mostró un mayor consumo de

la droga frente al agua con ninguna de las dosis utilizadas en este estudio. Estos datos

confirman nuestras hipótesis de partida en relación con el alcohol y del CDP, pero no con la

cafeína. Así, se estableció como hipótesis, derivada de la revisión de la literatura

especializada, de que el alcohol y el CDP son sustancias ansiolíticas con potencial adictivo

que el animal debería preferir frente al agua, una hipótesis que confirmaron nuestros

resultados. Estos resultados, además, están en concordancia con estudios previos realizados en

nuestro laboratorio. En primer lugar, en una investigación reciente se midió la

autoadministración oral alcohol en cepas de ratas Romanas de Alta (RHA-I) y Baja Evitación

(RLA-I), utilizando para ello un procedimiento de aumento progresivo de la dosis, la cual fue

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0,1 0,2 0,4 0,8 1 1,2/1,5 1,4/2

razó

n d

e p

refe

ren

cia

dosis (mg/kg)

Preferencia

CAF

ETANOL

CDP

AGUA

16

del 2% en el momento inicial del experimento hasta llegar a un 10%. Los animales fueron

divididos en dos grupos durante la prueba de preferencia: un grupo recibía las dosis en orden

creciente (grupo de exposición gradual), y otro recibió solo una única dosis al 10% (grupo de

exposición brusca). Los resultados indicaron que los animales de ambas cepas mostraron

preferencia por el alcohol cuando éste se presentó en dosis del 2%, mientras que cuando la

dosis fue del 10% las dos cepas prefirieron consumir agua, un hallazgo indicativo de que a

estas dosis el alcohol tiene efectos aversivos. Estos efectos aversivos, además, no dependieron

de que la exposición al alcohol se hiciera de forma gradual o brusca (Manzo et al., 2012).

Resultados similares fueron obtenidos por Manzo et al. (2014), quienes observaron que los

animales con acceso a una solución al 2% de etanol mostraron un aumento en su preferencia

por esta droga tras ser expuestos a la omisión de una recompensa (sesiones de extinción), un

acontecimiento emocional negativo que afectó especialmente a la cepa más reactiva a este

tipo de experiencias (RLA-I). Este aumento en el consumo de alcohol inducido por la pérdida

del reforzador se bloquea si los animales reciben sesiones de reforzamiento parcial durante la

fase de adquisición, un entrenamiento que les permite desarrollar tolerancia a esta experiencia

de pérdida, reduciendo así el consumo voluntario de etanol al 2% (Manzo, Gómez et al.,

2015). Finalmente, una última investigación realizada en nuestro laboratorio que demuestra la

viabilidad del uso de una dosis del 2% de etanol para su consumo oral es el trabajo realizado

por Manzo, Donaire et al. (2015). En este estudio se comprueba de nuevo, ahora en ratas

Wistar, que ante la devaluación de un incentivo, los animales aumentan su consumo de una

solución de alcohol al 2%. El presente TFG confirma estos resultados, indicando que la

preferencia por soluciones de alcohol al 2% frente a agua es un hecho consistente y replicable,

pudiéndose observar en diferentes animales de laboratorio (RHA-I, RLA-I y Wistar).

Asimismo, nuestros hallazgos están en línea con lo publicado en otros estudios de consumo

espontáneo de etanol, en los que se demuestra que los animales muestran una preferencia por

esta droga que depende de la dosis, siendo más habitual con dosis reducidas que con elevadas

(véase Manzo et al., 2012; Spanagel, 2000, para revisión).

Los resultados referentes al CDP pueden ponerse en relación con el estudio de Manzo,

Donaire et al. (2015), el único publicado hasta la fecha en el que los animales tenían la opción

de consumir este ansiolítico (1 mg/kg) de forma voluntaria tras ser expuestos a una prueba

aversiva inductora de frustración. Comparando este estudio con el presente TFG, puede

concluirse que la preferencia por CDP en animales es consistente y replicable, y que no varía

cuando se aumenta la dosis utilizada hasta 1,4 mg/kg. Por otro lado, a diferencia de otros

17

trabajos en los que la administración del fármaco ansiolítico se realiza de manera forzada (sea

ésta oral, subcutánea o intraperitoneal; por ejemplo, Leite et al., 2016), en nuestro caso el

animal tiene la opción de ingerirlo o no, una situación experimental que se asemeja más a las

condiciones de consumo de ansiolíticos en seres humanos. Por lo tanto, el procedimiento

experimental utilizado en nuestro estudio podría tener una mayor validez ecológica, pudiendo

ser útil en el futuro para investigar los mecanismos implicados en la adicción a sustancias de

prescripción médica, como los ansiolíticos, y el modo en que determinados acontecimientos

ambientales puede modular su consumo.

En relación con la cafeína, se han descrito tanto propiedades reforzantes como

ansiogénicas en estudios con animales, si bien son escasos los trabajos basados en su

autoadministración oral debido, entre otros factores, a las propiedades aversivas de su sabor

amargo. Cuando se revisa la literatura al respecto se constata que los resultados son poco

consistentes y que a menudo dependen de factores tales como la dosis de droga suministrada

al animal, si el consumo es agudo o crónico, la prueba conductual utilizada para estudiar sus

efectos, el tipo de animales empleado, su estado de privación, sexo, uso o no de una fase

previa de consumo forzado, etc. (por ejemplo Fenu y Acquas, 2013; Heppner, Kemble y Cox,

1986; Vitiello y Woods, 1975). Ball y Poplawsky (2011), por ejemplo, utilizaron un

procedimiento de autoadministración oral de cafeína mediante una prueba de preferencia que

consistía en la presentación de soluciones de cafeína a dosis bajas (0.2 mg/kg) mezclada con

agua en días alternos. Se comprobó que los animales que consumían cafeína realizaban más

movimientos horizontales en las pruebas de locomoción que los animales que sólo habían

consumido agua; esto refleja la presencia de sensibilización locomotora con dosis bajas de

cafeína. Además, las ratas que tuvieron acceso a la cafeína deambulaban más y tuvieron un

mayor número de movimientos que en las sesiones sin acceso a la sustancia. Por su parte,

Vautrin, Pelloux y Costentin (2005), analizaron el consumo oral de cafeína en dos cepas de

ratones que diferían en sus niveles basales de ansiedad. En este estudio se comprobó que

dosis de 0.3g/l de cafeína producían tasas estables de preferencia en ambos grupos de

animales, si bien en los más ansiosos esta preferencia se desarrolló más tarde. Estos resultados

contrastan con los hallados en nuestro estudio, en el que no encontramos evidencia de que los

animales prefirieran la solución de cafeína frente al agua con ninguna de las dosis

suministradas. Por tanto, deberán realizarse estudios futuros en nuestro laboratorio para

indagar en las razones por las que no encontramos resultados significativos en relación con la

preferencia de cafeína. A modo de ejemplo, se podría aumentar el rango de dosis de cafeína

18

para de este modo analizar de forma más exhaustiva qué dosis inducen preferencia y cuáles

aversión bajo nuestras condiciones experimentales.

Por último, los resultados presentados en este trabajo pueden discutirse en el contexto

de la utilidad de los modelos animales para el estudio de la adicción humana. La adicción a

sustancias psicoactivas se ha convertido en las últimas décadas en un problema público que

conlleva diversas implicaciones en el ámbito social, médico, legal y político (Torres y Papini,

2016). En efecto, el consumo continuado de las mismas produce cambios adaptativos en el

sistema nervioso central que son responsables de la aparición de fenómenos

comportamentales tales como tolerancia, dependencia, sensibilización y “craving” (Camí et

al., 2005). Para investigar las bases biológicas de estos fenómenos se recurre con frecuencia a

modelos animales, que aportan grandes ventajas en comparación con las investigaciones en

seres humanos, superando gran parte de las limitaciones propias de la investigación clínica.

Por ejemplo, ofrecen un alto control experimental, de modo que pueden manipularse tanto

variables conductuales, fisiológicas como genéticas, una manipulación inviable en el caso de

los seres humanos por evidentes razones éticas. Los modelos de autoadministración voluntaria

suponen, además, una ventaja frente a los de administración forzada, ya que en ellos se puede

llevar a cabo la situación experimental en condiciones mucho más sencillas, no hay que

intervenir ni manipular al animal directamente, tampoco requiere ningún entrenamiento de

aprendizaje y reproduce las condiciones de consumo oral humano (Mustaka y Kamenetzky,

2006), sobre todo en el caso de sustancias como el alcohol, la cafeína y las benzodiacepinas.

No obstante, no puede olvidarse que la reproducción en el laboratorio de fenómenos tan

complejos como la conducta adictiva humana tiene también sus limitaciones, de las cuales no

escapa el presente trabajo. Entre ellas se pueden destacar la excesiva simplicidad de los

procedimientos, la imposibilidad de estudiar de forma directa los estados subjetivos inducidos

por la droga, la dificultad para analizar la influencia de factores tales como la “presión del

grupo”, etc. (Lovinger y Crabbe, 2005). Tales limitaciones constituyen debilidades, aunque

también desafíos, para la investigación animal actual en el campo de las drogodependencias,

un trastorno neuroconductual cuya comprensión y tratamiento constituye uno de los

principales retos de nuestra sociedad.

19

CONCLUSIONES

El desarrollo de este TFG me ha servido para conocer de manera directa cómo se lleva

a cabo el trabajo dentro de un laboratorio y de esta forma aprender a coordinar adecuadamente

las actividades, junto con el equipo que las dirige. Estas actividades me han resultado de gran

interés ya que a lo largo del desarrollo del estudio en laboratorio se me ha dado la oportunidad

de participar en muchas tareas, como han sido: el registro del peso de los animales y del peso

de la droga utilizada, donde se requiere gran concentración y destreza para pesar

continuamente a los animales y las botellas asegurando no cometer ningún error; la

asignación de pellets específicos en cada animal según el peso diario, con lo que se llevaba a

cabo la privación; la mezcla de las soluciones para crear la dosis que se requería en cada día

del experimento, personalmente me encargué de mezclar las soluciones necesarias para crear

la dosis de etanol y ayudar en la mezcla de las demás dosis; y finalmente introducir,

diariamente, todos los datos obtenidos en el ordenador para realizar más tarde los análisis

estadísticos. Sin duda, todas estas actividades, me han servido para comprender mucho mejor

la asignatura de Psicofarmacología y la dinámica que se lleva a cabo en un laboratorio como

el que cuenta la Universidad de Jaén.

Este TFG se enmarca en el contexto de la utilidad de los modelos animales en la

adicción humana, y constituye uno de los primeros pasos para avanzar de manera exhaustiva

en el estudio de los procesos neuroconductuales de la adicción en humanos. Nuestras

hipótesis de partida se han cumplido en el caso del alcohol y el CDP, ya que se ha demostrado

el potencial adictivo de estas sustancias ansiolíticas, independientemente de la dosis utilizada,

aunque no con la cafeína, sugiriendo que afectan otros factores a su consumo como pueden

ser la dosis, el consumo, la privación, etc. Finalmente, hay que destacar la importancia de este

estudio respecto a la posibilidad de continuar el desarrollo de otros trabajos que pueden surgir

a partir de este, como es el caso de experimentos donde se añadan pruebas de frustración o un

estudio en el que se analice detalladamente el potencial de abuso de la cafeína.

20

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23

ANEXOS

Anexo I

24

Anexo II

26

Anexo III

JULIO

LUNES MARTES MIÉRCOLES JUEVES VIERNES SÁBADO DOMINGO

1 2 3 4 5

6 PRIVACIÓN 1

7 PRIVACIÓN 2

8 PRIVACIÓN 3

9 PRIVACIÓN 4

10 PRIVACIÓN 5

11 PRIVACIÓN 6

12 PRIVACIÓN 7

13 HABITUACIÓN 1

14 HABITUACIÓN 2

15 HABITUACIÓN 3

16 HABITUACIÓN 4

17 DÍA 1 CDP: 0.1 CAF:0.1 E: 2%

18 DÍA 2 CDP: 0.1 CAF:0.1 E: 2%

19 DÍA 3 CDP: 0.2 CAF:0.2 E: 2%

20 DÍA 4 CDP: 0.2 CAF:0.2 E: 2%

21 DÍA 5 CDP: 0.4 CAF:0.4 E: 2%

22 DÍA 6 CDP: 0.4 CAF:0.4 E: 2%

23 DÍA 7 CDP: 0.8 CAF:0.8 E: 2%

24 DÍA 8 CDP: 0.8 CAF:0.8 E: 2%

25 DÍA 9 CDP: 1 CAF: 1 E: 2%

26 DÍA 10 CDP: 1 CAF: 1 E: 2%

27 DÍA 11 CDP: 1.2 CAF: 1.5 E: 2%

28 DÍA 12 CDP: 1.2 CAF: 1.5 E: 2%

29 DÍA 13 CDP: 1.4 CAF: 2 E: 2%

30 DÍA 14 CDP: 1.4 CAF: 2 E: 2%

31

1 2

Sesión

Notas/procedimiento

Las ratas serán alojadas en jaulas individuales con libre acceso a agua y privadas de

alimento al 82-85% de su peso ad libitum.

Los animales serán asignados a los grupos (n=9) en función de su peso corporal, para que el

promedio y la variabilidad intragrupos sea similar.

PRUEBA DE PREFERENCIA. Las soluciones de CDP, CAF y de alcohol se prepararán

diariamente mezclando la cantidad de agua del grifo y de alcohol, CAF o CDP

correspondientes. Los animales del grupo de alcohol E/W recibirán una dosis del 2% (= 10.41

ml de alcohol al 96% y completar con agua hasta 500ml de).

27

Notas

generales

o Los animales del grupo de CDP/W recibirán las siguientes concentraciones (media

del peso de los animales 367gr):

0.1 mg/kg en 12 ml (17.07.15) 0.03303 mg de CDP en 108 ml de agua




1 mg/kg en 12 ml (25.07.15) 3.3303 mg de CDP en 108 ml de agua



o Los animales del grupo de CAF/W recibirán las siguientes concentraciones (media

del peso de los animales 367gr)

0.1 mg/kg en 12 ml (17.07.15) 0.03303 mg de CAF en 108 ml de agua




1 mg/kg en 12 ml (25.07.15) 3.3303 mg de CAF en 108 ml de agua


2 mg/kg en 12 ml (29.07.15) 6.606 mg de CAF en 108 ml de agua

1. La habituación a la prueba de preferencia durará 4 días y en la misma se colocarán 2

botellas de agua en la jaula hogar del animal durante dos horas.

2. Las ratas del grupo de CDP/W serán marcadas en rojo. Las ratas del grupo W/W

serán marcadas en blanco. Las ratas del grupo E/W se marcarán en verde. Las

ratas del grupo CAF/W se marcarán en amarillo.

3. Las botellas son numeradas con el número de cada animal, marcando en rojo la

botella que contiene el CDP, en verde la que contiene alcohol, en amarillo la que

contiene CAF, y en blanco la botella que contiene agua. Las botellas que contienen

la droga deberán ser forradas de negro para proteger la solución de la luz. Para

todos los grupos, habrá una botella forrada (E, CDP, CAF, W) y otra no (W).

4. La colocación de las botellas en la jaula hogar se cambiará diariamente para evitar

preferencia por el lugar (también durante la habituación).

Se tomarán diariamente medidas del peso del animal e ingesta de las dos botellas. La prueba de

preferencia durará dos horas

28

Día 1:

Habituación

13-7-15

Se prepararán las dos botellas con agua, se pesan, se retira la botella grande y se colocan en la

jaula hogar de todos los animales durante dos horas. Tras dos horas, se retiran de cada animal

las dos botellas de agua, se pesan ambas en la balanza de precisión, mientras se pesa el animal

en la otra balanza. Se anota el peso de la botella y se resta del peso inicial de las botellas para

calcular el consumo. Se colocan en la jaula los pellets correspondientes para mantener al animal

en torno al 85-82% de su peso ad libitum. BOTELLA NEGRA A LA DERECHA

Día 2

Habituación

14-7-15

Igual que el día anterior. Se cambia el orden de las botellas con respecto al día anterior.

BOTELLA NEGRA A LA IZQUIERDA

Día 3

Habituación

15-7-15


BOTELLA NEGRA A LA DERECHA

Día 4

Habituación

16-7-15


BOTELLA NEGRA A LA IZQUIERDA

Día 5

17-7-15

Se preparan las soluciones de CDP, CAF y Alcohol (2%). La botella roja contendrá la solución de

CDP (0.1 mg/kg), la botella amarilla contendrá la solución de CAF (0.1 mg/kg), y la verde la de

alcohol (2%). La blanca continuará con agua. Se cambia el orden de las botellas con respecto al

día anterior. Tras dos horas, se retiran de cada animal las dos botellas de agua, se pesan ambas

en la balanza de precisión, mientras se pesa el animal en la otra balanza. Se anota el peso y se

resta del peso inicial de las botellas para calcular el consumo. Se coloca la botella de agua grande

y se limpian las botellas pequeñas para el día siguiente. Se colocan en la jaula los pellets

correspondientes para mantener al animal en torno al 85-82% de su peso ad libitum. BOTELLA

NEGRA A LA DERECHA

Día 6

18-7-15

Igual que el día anterior. BOTELLA NEGRA A LA IZQUIERDA

29

Día 7

19-7-15


CDP (0.2 mg/kg), La botella amarilla contendrá la solución de CAF (0.2 mg/kg) y la verde la de

alcohol. La blanca continuará con agua. Se cambia el orden de las botellas con respecto al día

anterior. Tras dos horas, se retiran de cada animal las dos botellas de agua, se pesan ambas en

la balanza de precisión, mientras se pesa el animal en la otra balanza. Se anota el peso y se resta

del peso inicial de las botellas para calcular el consumo. Se coloca la botella de agua grande y se

limpian las botellas pequeñas para el día siguiente. Se colocan en la jaula los pellets


NEGRA A LA DERECHA

Día 8

20-7-15

Igual que día anterior. BOTELLA NEGRA A LA IZQUIERDA

Día 9

21-7-15









NEGRA A LA DERECHA

Día 10

22-7-15


Día 11

23-7-15









NEGRA A LA DERECHA

30

Día 12

24-7-15


Día 13

25-7-15


CDP (1 mg/kg), La botella amarilla contendrá la solución de CAF (1 mg/kg) y la verde la de







NEGRA A LA DERECHA

Día 14

26-7-15


Día 15

27-7-15









NEGRA A LA DERECHA

Día 16

28-7-15


Día 17

29-7-15


CDP (1.4 mg/kg), La botella amarilla contendrá la solución de CAF (2 mg/kg) y la verde la de







31

NEGRA A LA DERECHA

Día 18

30-7-15


32

Anexo IV

FECHA: _____________DÍA DE EXPERIMENTO: ______________

GRUPO

PESO AGUA

PESO FÁRMACO

HORA 2 HORAS

AGUA FÁRMACO

CAFEÍNA (CAF)

AMARILLO

4

8

15

19

23

25

26

34

36

ETANOL (E)

VERDE

2

3

6

10

12

14

18

21

32

GRUPO

PESO AGUA

PESO FÁRMACO

HORA 2 HORAS

AGUA FÁRMACO

CDP ROJO

5

9

16

22

28

30

31

33

37

WATER (W)

BLANCO

1

7

13

17

20

24

27

29

35

consumo espontáneo de ansiolíticos y cafeína en ratas...

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