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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Química
Kelly Suely Galhardo
Construção de biossensores baseados em biomoléculas e líquidos iônicos
São Paulo
19/05/2010
KELLY SUELY GALHARDO
Construção de biossensores baseados em biomoléculas e líquidos iônicos
Orientadora: Profa. Dra. Susana Inés Córdoba de Torresi
São Paulo 2010
Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Química (Físico-Química)
Kelly Suely Galhardo
Construção de biossensores baseados em biomoléculas e líquidos iônicos
Dissertação apresentada ao Instituto
de Química da Universidade de São Paulo
para obtenção do Título de Mestre em Físico-
Química
Aprovado em: ____________ Banca Examinadora Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Dedico este trabalho aos meus pais, Pedro e Norma, aos meus
irmãos Caroline e Pedro Jr. e ao meu namorado Leonardo, pelo
amor e pelo apoio que me deram.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Pedro e Norma (in memorian) que me ensinaram a lutar
pelos meus objetivos e me deram educação, amor e apoio.
Quero agradecer a Profa. Dra. Susana Inés Córdoba de Torresi pela
oportunidade que me foi dada de realizar o Mestrado, bem como por sua orientação
nas diretrizes deste projeto e pela amizade e conselhos.
Ao Prof. Dr. Roberto Torresi pelas discussões de grupo e sugestões. A
Profa. Dra. Patrícia Inés Ortiz e a Profa. Dra. Carla Eugenia Giacomelli da Facultad
de Ciencias Químicas da Universidad Nacional Córdoba - Argentina pelo auxílio na
técnica de injeção de fluxo e pela acolhida na Cidade de Córdoba - Argentina.
Aos meus irmãos Carol e Junior pelo apoio e compreensão nos
momentos em que não pude estar com eles.
Ao me namorado pelo apoio, ajuda, amor, carinho e dedicação que ele
me proporcionou para que eu pudesse continuar minha pesquisa.
Aos meus amigos do Laboratório de Materiais Eletroativos (LME) do
Instituto de Química da USP, Fernanda, Fernando, Gisela, Leonardo (Leovis),
Marcelo, Mariana (Mari), Simone (Simonete), Suelen (Su), Tânia, Tatiana (Tati),
Vinícius (Vina) e Vitor, pelo auxílio no desenvolvimento do meu trabalho,
compreensão, amizade, bem como pelos momentos de descontração.
Agradeço também aos funcionários da secretaria de pós-graduação, da
biblioteca da química e aos técnicos de laboratório do Instituto de Química da USP
por todo o auxílio dado frente as minhas necessidades.
Ao CNPq pela bolsa de mestrado que me concederam.
E a todas as pessoas que me esqueci de citar e que de alguma forma
fizeram parte desta etapa tão importante da minha vida.
RESUMO
Galhardo, K. S., Construção de biossensores baseados em biomoléculas e
líquidos iônicos, 2010. 80p. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-
Graduação em Química, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São
Paulo.
Este trabalho consiste em estudar o comportamento eletroquímico de
biomoléculas imobilizadas sobre o eletrodo de carbono vítreo, utilizando materiais
biocompatíveis como meios imobilizadores para detecções em meios aquosos.
Foram utilizados inicialmente compósitos de hidrogéis capazes de auxiliar a
permanência da enzima sobre a superfície do eletrodo e beneficiar a transferência
de carga entre a enzima e o eletrodo de trabalho. Para melhorar a resposta
eletroquímica do biossensor, também foram estudados métodos que utilizam
líquidos iônicos no processo de imobilização da enzima.
Deste modo a eletroatividade da enzima foi inicialmente estudada por
voltametria cíclica, a fim de evidenciar tal eletroatividade no meio totalmente iônico,
como também avaliar o melhor método de imobilização, para futuras aplicações em
detecções de analitos. Os líquidos iônicos utilizados são compostos por cátions
alquil-imidazol com ânions de natureza orgânica ou inorgânica. Como se sabe os
íons que compõem o líquido iônico podem distinguir sua funcionalidade, pois é o
tamanho desses íons que influencia na maioria das suas propriedades físico-
químicas, tais como hidrofobicidade e viscosidade.
Palavra Chave: biomoléculas, líquidos iônicos, citocromo c e glicose oxidase.
ABSTRACT
Galhardo, K. S., Construction of biosensors based on biomolecules and ionic
liquids , 2010. 80p. Masters Thesis. Graduate Program in Chemistry. Instituto de
Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
The aim of this work is to study the electrochemical behavior of
biomolecules immobilized on a glassy carbon electrode, using biocompatible
materials as a way for immobilizing detection in aqueous media. Initially, hydrogels
composite were used because they are able to assist the permanence of the enzyme
on the electrode surface and they are benefit to the charge transfer between enzyme
and electrode surface. To improve the electrochemical response of the biosensor,
methods using ionic liquids in the process of immobilization of the enzyme were also
studied.
Thus the electroactivity of the enzyme was initially analyzed by cyclic
voltammetry in order to show that the electroactivity remains in an entirely ionic
media, as well as evaluating the best method of immobilization, for future applications
in biosensors. The ionic liquids used are composed of imidazole-alkyl cations with
anions of organic or inorganic nature. As it is well known, the ions in the ionic liquid
can distinguish its functionality, due to the fact that it is the size of these ions that
influences most on their physicochemical properties such as hydrophobicity and
viscosity.
Keywords: biomolecules, ionic liquids, cytochrome c and glucose oxidase.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Líquidos iônicos [5]. .................................................................................16
Figura 2 - Aplicações dos líquidos iônicos [11].........................................................17
Figura 3 – Elementos e componentes de um biossensor típico [40]. .......................21
Figura 4 - Estrutura da quitina, quitosana e celulose [20].........................................24
Figura 5 - Esquema de funcionamento do biossensor com citocromo c imobilizado
sobre um eletrodo, onde C é o eletrodo Carbono vítreo e M é a modificação feita
na superfície.......................................................................................................27
Figura 6 - Representação da reação de GOx [45]....................................................28
Figura 7 – Biossensor com o Azul da Prússia e enzima oxidase [46]. .....................29
Figura 8 – Preparação dos líquidos iônicos..............................................................34
Figura 9 – Voltametria cíclica em PBS 0.1mol L-1 do eletrodo contendo 5L da
solução (170µL de quitosana 0.5wt% + 100µL de citocromo c 10mg mL-1 +
830µL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 + 8% v/v de BMMIBF4) ciclando várias vezes
em velocidade de varredura de 100mV s-1.........................................................37
Figura 10 – Voltametria cíclica de a) Cit c/GC; b) Qui-LI-MWNTs/GC; c) Qui-cit c-
MWTNs/GC e d) Qui-cit c-LI-MWNTs/GC em PBS 0.1mol L-1 pH7.0. Imagem
retirada da referência [48]. .................................................................................38
Figura 11 – Voltametria cíclica do eletrodo de carbono vítreo na detecção de H2O2
em meio de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 com velocidade de varredura de 100mV s-1.
...........................................................................................................................40
Figura 12 – Representação esquemática de um biossensor amperométrico de
glicose. ...............................................................................................................41
Figura 13 – Cronoamperometria com potencial aplicado de: (A) 0,7V; (B) 0,8V; (C)
0,9V e (D) 1,0V no eletrodo contendo 5µL de solução (300µL de quitosana
0.5wt% + 80µL glicose oxidase 10mg mL-1 + 3% v/v BMMIBF4), com adições
0.1mmol L-1 de glicose.......................................................................................42
Figura 14 – Representação esquemática de um biossensor amperométrico baseado
na detecção de glicose medida pelo híbrido. .....................................................43
Figura 15 – Voltametria cíclica em meio de K3Fe(CN)6 0.02mol L-1, KCl 0.1mol L-1 e
pirrol 0.015mol L-1, 10 ciclos com velocidade de varredura de 50mV s-1. ..........44
Figura 16 – Voltametria cíclica em meio de CuCl2 0.02mol L-1 e KCl 0.1mol l-1, 20
ciclos com velocidade de varredura de 50mV s-1. ..............................................44
Figura 17 – Cronoamperometria a 0V do eletrodo de carbono vítreo com o híbrido
contendo 5µL de solução A (300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase
10mg mL-1); B(300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase 5mg mL-1); C
(300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase 2.5mg mL-1) . Adições de
0.1mmol L-1 de glicose. ......................................................................................46
Figura 18 – Ligação cruzada envolvendo a reação entre glutaraldeído e os grupos
amina residuais livres de enzimas [47]...............................................................48
Figura 19 – O gráfico A representa a cronoamperometria a 0V do eletrodo
modificado com o híbrido e com a mistura de 10µL de solução 10µL de
glutaraldeído 2.5%v/v + 25µL de (40mg de BSA + 10mg GOx + 1mL de PBS
0.1mol L-1 pH7 + 3% v/v BMMIBF4). O gráfico B1 representa a
cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido com o híbrido e
com a mistura de 10µL de solução 10µL de glutaraldeído 2.5%v/v + 25µL de
(10mg GOx + 1mL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 + 3% v/v BMMIBF4). E o gráfico B2
representa sensibilidade. Realizaram-se adições de 0.1mmol L-1 de glicose. ...49
Figura 20 – Cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido e com
uma mistura de 10µL de solução 25µL de GOx 10mg mL-1 + 10µL de
glutaraldeído 2.5%v/v.C1 é a detecção e C2 é a sensibilidade. Adições de
0.1mmol L-1 de glicose. ......................................................................................50
Figura 21 – Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os
eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido
seguido da adição de 5µL de solução 10mg mL-1 de GOx com 4% BMMIBF4,
após seco acrescentou-se 2(A) ou 10(B)µL de glutaraldeído 2.5%v/v em água.
...........................................................................................................................53
Figura 22 – Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, o
eletrodo foi preparado a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da
adição de 5µL de solução 10mg mL-1 de GOx, após seco acrescentou-se 2µL
de glutaraldeído 2.5%v/v em água.....................................................................54
Figura 23 - Espectro de UV–vis da GOx em PBS contendo 0 vol% (a), 2 vol% (b), 5
vol% (c)10 vol% (d), 15 vol% (e), e 20 vol% (f) de BMMIBF4. Esta imagem foi
retirada da referência 42. ...................................................................................56
Figura 24 - Espectro de dicroísmo circular (CD) da GOx PBS (0.1M, pH8.2)
contendo 0 (preto), 2 (vermelho), 5 (verde), 10 (azul), 15 (azul claro), e 20 vol%
(lilás) de BMMIBF4 na região UV-distante (A)e UV-perto (B).Estas imagens
foram retiradas da referência 42. .......................................................................57
Figura 25 - Espectro Raman de (a) 10mM glicose em PBS 0.1mol L-1; (b) Mistura
GOx-BMMIBF4–PBS contendo 20 vol% de BMMIBF4 ; e (c) Espectro Raman do
BMMIBF4 registrado na mistura BMMIBF4–PBS (20 vol% BMMIBF4). O espectro
foi registrado usando energia de excitação em 514.5nm. Esta imagem foi
retirada da referência 42. ...................................................................................58
Figura 26 – Estimativa da constante aparente de Michalis-Menten. ........................60
Figura 27- Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os
eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido
seguido da adição de 5µL de solução 10mg mL-1 de GOx com 4% BMMIBF4 (A)
ou 4% BMMITFSI(B), após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído 2.5%v/v
em água. ............................................................................................................62
Figura 28 - Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os
eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido
seguido da adição de 5µL de solução 10mg GOx dissolvida parcialmente em
1mL de BMMITFSI, após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído 2.5%v/v em
água. ..................................................................................................................63
Figura 29 – Detecção de glicose utilizando FIA do eletrodo modificado com o híbrido
seguido da adição de 5µL de solução (GOx 10mg mL-1 com 4% v/v BMMIBF4),
após seco acrescentou-se 2µL de Glut 2.5% v/v em água. Foram realizadas 3
adições de cada concentração: 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.1, 0.4, 0.8 e 1mmol L-1
de glicose. ..........................................................................................................65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Tabela de reagentes utilizados................................................................32
Tabela 2 – Modificações feitas no eletrodo de carbono vítreo .................................39
Tabela 3 – Modificação da quantidade de quitosana. ..............................................47
Tabela 4 – Modificação das quantidades de glutaraldeído, glicose oxidase e líquido
iônico..................................................................................................................51
Tabela 5 – Modificação da forma de adição do glutaraldeído. .................................55
Tabela 6 – Valores de KMap para outros sistemas.....................................................61
Tabela 7 – Eletrodos modificados com glicose oxidase. ..........................................67
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
BMMIBr – brometo de 1-butil-2,3-dimetilimidazólio
BMMIBF4 – tetrafluoroborato de 1-butil-2,3-dimetilimidazólio
BMMITFSI - bis(trifluorometanosufonil)imideto de 1-butil-2,3-dimetilimidazólio
Cit c – Citocromo c
CuHCNFe - hexacianoferrato de cobre
CuHCNFe/ppi - hexacianoferrato de cobre/polipirrol
CNTs – nanotubos de carbono
GOx – glicose oxidase
LI(s) – líquido iônico(s)
PPi – poli(pirrol)
PBS – tampão fosfato
Qui - quitosana
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................... 15
1.1 Biossensores ............................................................................................20
1.2 Líquidos iônicos .......................................................................................21
1.3 Quitosana ..................................................................................................23
1.4 Enzimas .....................................................................................................25
1.4.1 Citocromo c ...........................................................................................26
1.4.2 Glicose oxidase .....................................................................................27
1.5 Híbrido .......................................................................................................28
2 OBJETIVOS........................................................................ 31
3 PARTE EXPERIMENTAL.................................................. 32
3.1 Eletrodos utilizados..................................................................................32
3.2 Reagentes..................................................................................................32
3.3 Instrumentação .........................................................................................33
3.4 Enzimas .....................................................................................................34
3.4.1 Preparação e caracterização de líquidos iônicos ..................................34
3.4.2 Preparação da quitosana.......................................................................35
3.5 Preparação do híbrido..............................................................................36
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................... 37
4.1 Citocromo c...............................................................................................37
4.2 Glicose oxidase.........................................................................................41
4.2.1 Modificações realizadas no biossensor de glicose................................46
4.2.2 Adição de glutaraldeído substituindo a quitosana .................................48
4.2.3 Variação da forma de adição do glutaraldeído ......................................53
4.2.4 Cálculo da constante aparente de Michaelis-Menten (KMap)..................60
4.2.5 BMMIBF4 versus BMMITFSI..................................................................62
4.3 Detecção de glicose por Análise por Injeção em Fluxo (FIA) ...............65
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................. 67
6 CONCLUSÃO..................................................................... 69
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................. 70
8 SÚMULA CURRICULAR................................................... 79
Introdução 15
1 INTRODUÇÃO
A utilização de enzimas em solventes não-aquosos tem se tornado foco de
intensa pesquisa devido a alguns benefícios deste meio em relação aos meios
reacionais aquosos convencionais. Podendo-se destacar a alta solubilidade dos
substratos, a supressão de reações indesejáveis promovidas pela água, na favorável
imobilização das enzimas devido a sua insolubilidade, e em alguns casos
considerável melhora na estabilidade, atividade e seletividade dessas biomoléculas
[1, 2]. Tal fato, por exemplo, permite a aplicação, com sucesso, de hidrolases em
reação não hidrolítica, tais como a acilação de álcoois e aminas, as quais são de
interesse industrial. Neste contexto a substituição de solventes orgânicos voláteis
(VOCs) por outros meios reacionais, ambientalmente mais compatíveis, como fluidos
supercríticos (CO2) e líquidos iônicos vem se destacando. Todavia, a solubilidade
limitada de muitos substratos em CO2 supercrítico restringe a plena aplicação [3],
desvantagem esta que não ocorre em líquidos iônicos, os quais apresentam
excelente capacidade solubilizante, além de propriedades como não inflamabilidade,
boa condutividade iônica e estabilidade térmica e química [4].
Líquidos iônicos, figura 1, são solventes orgânicos compostos
exclusivamente por íons que são líquidos a temperatura ambiente [5, 6, 7]. Suas
aplicações vinculadas principalmente a reações orgânicas, incluindo biocatálise, não
se deve exclusivamente a sua baixa volatilidade e dessa forma também em sua
classificação como solvente verde, mas devido as suas propriedades únicas, tais
como polaridade, viscosidade e hidrofobicidade ajustáveis através da combinação
adequada de cátions e ânions e excelente estabilidade eletroquímica. Dessa forma,
Introdução 16
eles são considerados solventes moduláveis ou “de engenharia”, fornecendo novas
oportunidades para muitos processos biocatalíticos [8-11].
Figura 1 - Líquidos iônicos [5].
Os líquidos iônicos realçam a atividade de heme proteínas, e possibilita a
utilização dos eletrodos que têm a enzima imobilizada em meios não-aquosos [9]. A
possibilidade de utilização de meios não-aquosos, fez com que muitos trabalhos
fossem desenvolvidos empregando os líquidos iônicos em diversas áreas, como
podemos constatar na figura 2.
Introdução 17
Figura 2 - Aplicações dos líquidos iônicos [11].
O foco de nosso trabalho esta nos sensores eletroquímicos e como
podemos observar na figura 2, os métodos utilizados são: cronopotenciometria,
cronoamperometria, voltametria e microbalança de cristal de quartzo. A
cronopotenciometria consiste em aplicar uma corrente constante e monitorar o
potencial em função do tempo e a cronoamperometria consiste em aplicar um
potencial constante e monitorar a variação de corrente em função do tempo. No caso
da voltametria aplicamos uma variação de potencial e monitoramos a variação da
corrente de acordo com uma velocidade determinada. Já a microbalança de cristal
de quartzo consiste em monitorar o aumento de massa em função da variação da
frequência de oscilação do cristal de quartzo [12, 13].
O fato de se ter um crescente interesse e uso de líquidos iônicos como
novo meio para reações que envolvam enzimas, o estudo fundamental do efeito
Aplicações dos líquidos iônicos
Reações orgânicas e catalíticas
Dispositivos eletroquímicos
Análises
Baterias e capacitores Células combustíveis Células fotovoltaicas Atuação eletroquímica no estado sólido
Cronopotenciometria Cronoamperometria Voltametria Microbalança de cristal de quartzo
Sensores eletroquímicos
Extração e separação
Cromatografia gasosa Cromatografia líquida Eletroforese capilar
Sensores ópticos
Introdução 18
desses solventes sobre a atividade, estabilidade e seletividade dessas biomoléculas
está apenas no início. Diversos fatores, tais como polaridade, capacidade de
formação de ligações de hidrogênio, nucleofilicidade e viscosidade são alguns dos
aspectos sugeridos para explicar este diferenciado comportamento em um meio
totalmente iônico. Dentre esses fatores, hidrofobicidade e viscosidade parecem ser
os mais relevantes na atividade da enzima [11, 14, 15].
O uso de enzimas com atividade redox é de grande interesse na área
eletroquímica, visando principalmente seu uso em biossensores através de sua
imobilização em eletrodos, o que confere uma maior estabilidade a essas
biomoléculas [16, 17]. Devido à natureza condutiva intrínseca dos líquidos iônicos o
que exclui a necessidade de eletrólitos e a estabilidade e atividade diferenciada que
enzimas podem apresentar neste meio totalmente iônico, tal emprego torna-se bem
oportuno [18].
O modo como a enzima é imobilizada sobre o eletrodo, é um dos fatores
determinantes para a estabilização e boa reprodutibilidade do biossensor. Para
alcançar o melhor aproveitamento da enzima, existem três fatores que devem ser
superados para permitir a transferência direta de elétrons sobre a superfície sólida
do eletrodo, sendo eles: (i) centros ativos não acessíveis da enzima; (ii) mudanças
de conformação da enzima devido à adsorção sobre o eletrodo e (iii) orientação não
organizada da enzima adsorvida sobre o eletrodo. A imobilização de enzimas sobre
eletrodos pode ser realizada de diversas maneiras, utilizando materiais como
polímeros condutores, surfactantes, filmes sol-gel, nanomateriais, materiais híbridos,
compósitos, hidrogéis e outros [19-32, 48-50].
Dentre as enzimas com atividade redox, o citocromo c e a glicose oxidase,
representam excelentes modelos de biomoléculas para investigar a bioeletroquímica
Introdução 19
em meios aquosos mistos e mesmo em solventes orgânicos devido a sua estrutura,
atividade e caracterização espectroeletroquímica e a manutenção de sua atividade
em sistemas não aquosos [16, 33-35]. Frente tais vantagens, essas enzimas tornam-
se atraentes como material ativo em biossensores, destacando para a detecção de
radicais superóxidos e NO [2, 36-39]. Vale mencionar que a maioria das técnicas
utilizadas para detectar estes radicais tem usado métodos espectroscópicos
indiretos como, por exemplo, meios espectrofotométricos, quimiluminescência e
ressonância de elétron spin. No entanto, estes métodos são de detecção ex situ com
baixo grau de seletividade e sensibilidade. Além disso, a detecção quantitativa
destes radicais em modelos biológicos é muito dificultada, devido a sua baixa
concentração e curta estabilidade nos meios eletrolíticos convencionais.
Neste trabalho iniciamos a imobilização das enzimas, citocromo c e
glicose oxidase, utilizando líquido iônico e quitosana como matriz para a formação
do biossensor.
Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos com o intuito de verificar a
transferência direta de elétrons de biomoléculas na presença de líquidos iônicos,
alguns exemplos são listados a seguir:
a) Eletrodo de carbono vítreo modificado com uma mistura de quitosana,
nanotubos de carbono, líquido iônico (BMMIBF4) e citocromo c [48];
b) Eletrodo de ouro modificado com nanopartículas de ouro, quitosana,
líquido iônico e glicose oxidase [49];
c) Carbono vítreo modificado com nanotubos de carbono, nanopartículas
de ouro, líquido iônico e glicose oxidase [50];
d) Grafite com líquido iônico substituindo o nujol em eletrodos de pasta
de carbono, com adição de glicose oxidase [51, 52].
Introdução 20
Estes autores afirmam que a transferência direta de elétrons é dada pela
presença do líquido iônico, porém não há como saber se a resposta é referente à
presença do líquido iônico, aos nanotubos de carbono ou as nanopartículas
presentes na superfície. No caso dos eletrodos de pasta de carbono os autores
substituem o nujol por líquido iônico e afirmam que ocorre uma melhora muito
grande da resposta do eletrodo.
A partir destas constatações, decidimos estudar a interação da
biomolécula com o líquido iônico, sem a presença de nanotubos ou nanopartículas,
e assim verificar se a transferência direta de elétrons é realmente devida à presença
do líquido iônico.
1.1 Biossensores
Um biossensor é geralmente definido como um dispositivo analítico que
converte uma resposta biológica em um sinal mensurável. A figura 3 ilustra
esquematicamente as partes típicas de um biossensor: a) o bioreceptor ligado ao
analito; b) a arquitetura da interface onde um evento biológico específico ocorre e
que ocasiona um aumento de sinal; c) o transdutor que converte o sinal eletrônico e
amplifica para o circuito de detecção usando uma referência apropriada; d) um
computador que converte o sinal para um significado físico descrevendo o processo
investigado; e finalmente, e) o resultado é apresentado em uma interface para o
operador humano.
Introdução 21
Figura 3 – Elementos e componentes de um biossensor típico [40].
Biossensores eletroquímicos são baseados no consumo de espécies
eletroquímicas e/ou geração durante interação biológica e química no processo de
ativação biológica da substância e do substrato. Neste processo, um detector mede
o sinal eletroquímico produzido pela interação [32, 41].
1.2 Líquidos iônicos
Os eletrólitos normalmente são obtidos pela dissolução de um sal em
solventes moleculares. Estes sistemas consistem em íons solvatados, sua
combinação carregada (ou neutra) e moléculas de solvente. Um sal pode ser
liquefeito combinando íons livres em moléculas de solvente, neste caso temos o
líquido iônico (LI) [5].
Líquidos iônicos (LIs) usualmente são sais de amônio quaternário, como
tetraalquilamônio [R4N]+ ou baseados em aminas cíclicas, ambos aromáticos
(piridina, imidazol) e saturados (piperidina, pirrolidinio). Um LI típico é uma
combinação de um cátion orgânico (N-alquilpiridina, N,N-dialquilimidazol) com uma
variedade de ânions orgânicos ou inorgânicos (Cl-, Br-, I-, AlCl4-, NO3-, PF6
-, BF4-,
Introdução 22
CF3SO3-, CF3COO-, [(CF3SO2)2N-=Tf2N-], [(C2F5SO2)2N-=Pf2N-] ). Possuem alta
viscosidade que provoca dificuldades na manipulação dos mesmos [5, 11].
As propriedades dos líquidos iônicos como o ponto de fusão, constante
dielétrica, viscosidade, polaridade, miscibilidade em água, podem ser controladas
pela combinação de cátions com ânions apropriados. A viscosidade de líquidos
iônicos hidrofóbicos é fortemente dependente da quantidade dissolvida em água. A
presença de água e solventes orgânicos decresce a viscosidade dos LIs, enquanto
que a presença de cloro aumenta a viscosidade. Estudos eletroquímicos mostram
que a janela eletroquímica alcança até 4.5V em comparação com 1.2V na maioria
dos eletrólitos aquosos. Propriedades como a não inflamabilidade, boa
condutividade iônica, eletroquímica e estabilidade térmica dos LIs fazem com que
eles sejam aplicados em vários dispositivos eletroquímicos, como baterias,
capacitores, células combustível, células fotovoltaicas e sensores eletroquímicos [11,
15].
Métodos eletroquímicos como a potenciometria, voltametria e
microbalança de cristal de quartzo têm sido utilizados com líquidos iônicos, para
desenvolver uma nova geração de sensores íon seletivos, dispositivos voltamétricos,
sensores a gás e biossensores [11].
No trabalho a seguir, utilizamos os líquidos iônicos BMMIBF4 (hidrofílico) e
BMMITFSI (hidrofóbico), para verificar se a presença deles melhora a resposta
eletroquímica do biossensor.
Introdução 23
1.3 Quitosana
As propriedades de enzimas imobilizadas são governadas pelas
propriedades de ambas, da enzima e do material de suporte. A interação entre a
imobilização da enzima e suas propriedades físico-químicas e cinéticas pode ser
decidida de acordo com a aplicação e a escolha do suporte que pode significar um
desempenho operacional do sistema imobilizado. É conhecido que não há um
suporte universal para todas as enzimas e suas aplicações, um número de
características desejáveis podem ser comum para qualquer material: alta afinidade
com a proteína, disponibilidade de grupos de funções reativos para reações diretas
com enzimas e para modificações químicas, hidrofílico, estabilidade mecânica,
rigidez, regenerabilidade, e fácil preparação em diferentes configurações que
fornecem ao sistema permeabilidade e área superficial apropriada para a
biotransformação escolhida [17, 20].
Muitos portadores têm sido considerados e estudados para imobilização
de enzimas, orgânicos e inorgânicos, naturais e sintéticos, quitina e quitosana são
de interesse da maioria, devido ao fato de oferecerem a maioria das características
citadas acima [20-23].
Quitina e quitosana são poliaminosacarídeos naturais, quitina é um dos
recursos orgânicos renováveis mais abundantes no mundo. A quitina é o principal
constituinte de conchas de crustáceos, de exoesqueletos de insetos e paredes de
célula de fungos que fornece força e estabilidade. Quimicamente, a quitina é
composta por β(1→4) unidades ligadas de 2-acetamida-2-dioxi-β-D-glicose (ou N-
acetil-D-glicosamina), formam uma longa cadeia linear de polímero, sendo insolúvel
na maioria dos solventes. Quitosana, o principal derivado da quitina, é obtido pela N-
desacetilação para uma extensão variada caracterizada pelo grau de desacetilação,
Introdução 24
sendo consequentemente um copolímero de N-acetil-D-glicosamina e D-
glicosamina. Quitina e quitosana são quimicamente consideradas análogas a
celulose, em que o hidroxil do carbono-2 é substituído pelo acetamida e grupos
aminas, respectivamente. Quitosana é insolúvel em água, mas a presença de grupos
amina torna solúvel em soluções ácidas em pH próximo a 6.5 [20-23].
Figura 4 - Estrutura da quitina, quitosana e celulose [20].
Materiais baseados em quitina e quitosana são aplicados em muitas áreas
como: estação de tratamento de água (remover metais pesados,
floculação/coagulação de tinturas e proteínas, processo de purificação de
membrana), indústria de alimentos (anticolesterol e gordura ligada, preservativo,
material de embalagem, aditivo de alimento animal), agricultura (semente e camada
de fertilizante, controlar agroquímico livre), indústria de polpa e papel (tratamento de
superfície, papel fotográfico), cosméticos e artigos para banho (hidratante, cremes
para o corpo e loção de banho) [20].
Para suporte de imobilização de enzimas a quitina e a quitosana são
usadas na forma de pós, flocos e géis com configurações geométricas diferentes. A
preparação de géis é promovida pelo fato de que a quitosana dissolve prontamente
Introdução 25
em soluções diluídas da maioria dos ácidos orgânicos, incluindo fórmico, acético,
tartárico, e ácido cítrico, para formar soluções viscosas que precipitam em um
aumento de pH. Frequentemente, diferentes tratamentos e modificações são
aplicados para promover géis estáveis e duráveis [20-23].
Neste trabalho utilizaremos a quitosana na forma de gel formando um
filme sobre a superfície do eletrodo.
1.4 Enzimas
Enzimas exibem características vantajosas em relação a catalise
convencional. Primeiro têm nível alto de eficiência catalítica, frequentemente
superior a catalisadores químicos, e alto grau de especificidade que permite a
discriminação não apenas entre reações, mas também entre substratos (substrato
específico), partes similares da molécula (regioseletividade) e entre isômeros ópticos
(estereoespecificidade). Geralmente as enzimas operam em condições moderadas
de temperatura, pressão e pH com velocidade de reação da ordem daquelas
alcançadas pelos catalisadores químicos em condições extremas [20].
Existem muitos problemas práticos no uso de enzimas: o alto custo de
isolamento e purificação, a instabilidade de suas estruturas quando são isoladas de
fontes naturais, sensibilidade a condições de processo e condições ópticas, e o fato
de que traços de algumas substâncias podem inibir sua ação [20].
Muitos métodos são propostos para superar essas limitações, um método
bem sucedido é a imobilização de enzimas, que pode ser realizada por vários
métodos, sendo classificados como método físico, onde há interações fracas entre o
Introdução 26
suporte e a enzima ou métodos químicos, onde há ligações covalentes formadas
com a enzima [20].
A imobilização de enzimas envolve efeitos agravantes para o desempenho
das enzimas. Comparando com as enzimas livres, é comum a maioria imobilizada
ter sua atividade diminuída e a constante de Michaelis aumentada. Estas alterações
resultam da mudança da estrutura da enzima devido ao procedimento de
imobilização e da criação de microambiente que a enzima trabalha, diferente da
solução estoque [20].
As enzimas imobilizadas são aplicadas principalmente em biossensores,
que são construídos pela integração de sistema biológico, no caso a enzima, como
transdutor. As enzimas na maioria dos casos são imobilizadas diretamente na ponta
de trabalho do transdutor ou sobre uma membrana polimérica que embrulha
firmemente a enzima.
A seguir vamos caracterizar as enzimas, citocromo c e glicose oxidase,
que foram utilizadas neste trabalho.
1.4.1 Citocromo c
O citocromo c (Cit c) é uma heme proteína que está associada à
membrana interna da mitocôndria. É uma proteína com alta solubilidade em água, ao
contrário de outros citocromos, e é um componente essencial da cadeia
transportadora de elétrons. É capaz de realizar oxidações e reduções, mas não se
liga ao oxigênio. Transfere elétrons entre o complexo citocromo c redutase e a
citocromo c oxidase. Portanto, o estudo eletroquímico do Cit c é muito importante.
Porém, é usualmente difícil para o Cit c transferir elétron a um eletrodo convencional.
Introdução 27
Para remediar este problema, vários promotores, como surfactantes, biopolímeros,
nanopartículas, polieletrólitos, líquidos iônicos, tem sido empregados para promover
a transferência direta de elétron entre o Cit c e o eletrodo, na figura 5 podemos
observar o funcionamento de um biossensor baseado na imobilização do Cit c [43].
Figura 5 - Esquema de funcionamento do biossensor com citocromo c imobilizado sobre um eletrodo, onde C é o eletrodo Carbono vítreo e M é a modificação feita na superfície.
Pela figura acima, constatamos que o Cit c tem em seu centro ativo o ferro
que é reduzido e oxidado na superfície do eletrodo modificado. Este é o esquema de
funcionamento do biossensor.
1.4.2 Glicose oxidase
A glicose oxidase é uma flavoproteína que catalisa a oxidação da β-D-
glicose a D-Glucomo-δ-lactona e H2O2 usando oxigênio como elétron aceptor. Esta
reação pode ser dividida em etapa redutiva e oxidativa (figura 6). Na reação metade
redutiva, GOx catalisa o oxigênio da β-D-glicose a D-Glucomo-δ-lactona, com
Introdução 28
hidrólise não enzimática do ácido glucônico. Subsequentemente, a adenina flavina
dinucleotídeo (FAD) rodeando a GOx é reduzida a FADH2. Na metade da reação
oxidativa, a redução da GOx é re-oxidada pelo oxigênio a H2O2. O H2O2 é clivado a
catálise para produção de água e oxigênio [44].
Figura 6 - Representação da reação de GOx [45].
Este é o esquema de reações químicas que acontecem com a GOx que
produz H2O2 que é detectado no final da reação, assim, o biossensor só terá
resposta se a reação química acima ocorrer.
Os biossensores compostos por glicose oxidase podem ser construídos
com diversos materiais combinados, como quitosana, nanotubo de carbono, líquidos
iônicos e nanopartículas de ouro [28, 29, 42, 49, 50].
1.5 Híbrido
Mediadores eletroquímicos inorgânicos que catalisam a oxidação e a
redução do peróxido de hidrogênio têm sido utilizados como base para
Introdução 29
biossensores, já que diminuem o potencial aplicado e consequentemente evitam
muitos interferentes eletroquímicos. Nesta perspectiva, hexacianoferratos e em
particular o Azul da Prússia (hexacianoferrato férrico - AZ) é usado em grande
escala, durante a reação redox do hexacianoferrato, a compensação de carga é
dada pela inserção e ejeção de contra-íons de metal alcalino. No caso específico do
Azul da Prússia, a atividade eletroquímica é suportada pela presença de K+, Rb+,
Cs+ e NH4+. Na+, Li+, H+ e todos os cátions do grupo II bloqueiam a atividade do Azul
da Prússia. Uma alternativa para evitar o bloqueio é utilizar hexacianoferrato de
níquel (NiHCNFe), hexacianoferrato de cobalto (CoHCNFe) e hexacianoferrato de
cobre (CuHCNFe) [26, 27, 46, 47]. A seguir temos o esquema do sistema de oxi-
redução do eletrodo com o AZ.
Figura 7 – Biossensor com o Azul da Prússia e enzima oxidase [46].
A sensibilidade alcançada por estes materiais durante a detecção de
H2O2, mesmo contendo K+, é menor que os medidos com o azul da Prússia
modificando eletrodos. Para superar este problema têm sido desenvolvidos materiais
híbridos inorgânicos/orgânicos para tentar obter um reforço ou sinergia entre eles.
Alguns hexacianoferratos de metal NiHCNFe e CuHCNFe, têm sido introduzidos em
Introdução 30
uma matriz com polipirrol criando um material híbrido de hexacianoferrato de
cobre/polipirrol (CuHCNFe/ppi) e hexacianoferrato de níquel/polipirrol (NiHCNFe/ppi)
com características mecânicas e eletroquímicas melhores [26, 27, 47].
Objetivos 31
2 OBJETIVOS
Desenvolver um biossensor utilizando um composto formado por uma
biomolécula (citocromo c ou glicose oxidase) e líquido iônico (BMMIBF4 ou
BMMITFSI), para futuras aplicações em soluções aquosas.
O objetivo específico é:
A imobilização da biomolécula do sistema eletrodo/biomolécula/líquido iônico
por quitosana analisando a atividade redox (via voltametria cíclica e
cronoamperometria) desses eletrodos modificados.
Parte Experimental 32
3 PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Eletrodos utilizados
Eletrodo de carbono vítreo de área 0.0707cm2 previamente polido com
alumina 1, 0.3 e 0.05µm e em seguida foi levado ao banho de ultrassom 10 minutos
com etanol e 10 minutos com água deionizada antes de ser modificado.
3.2 Reagentes
Os reagentes listados na tabela 1 foram utilizados sem purificação prévia.
Tabela 1 - Tabela de reagentes utilizados.
Reagente Fórmula Massa Molar / g mol-1
Teor % Procedência
Acetonitrila CH3CN 41.05 99.5 Synth Ácido tetrafluorbórico HBF4 87.81 48% Aldrich
1-Bromobutano CH3(CH2)3Br 137.03 99.0 Aldrich Bis(trifluorometanosulfonil)imideto
de Lítio (CF3SO2)2NLi 287.08 97.0 Aldrich
Cloreto de potássio KCl 74.55 99-100.5 Synth Cloreto de sódio NaCl 58.44 99 Synth
Cloreto de cobre II CuCl2.2H20 170.48 99 Cromoline Diclorometano CH2Cl2 84.93 99.5 Synth
1,2-dimetilimidazol C5H8N2 96.13 98.0 Aldrich Ferricianeto de potássio K3Fe(CN)6 329.25 99 Synth
Fosfato de sódio monobásico NaH2PO4.H20 98-102 Reagen
Fosfato de sódio bibásico heptahidratado
Na2HPO4.7H20 268.07 98-102 Nuclear
D-glicose C6H12O6 180.16 - Synth Pirrol* C4H5N 67.09 98 Aldrich
Sulfato de Magnésio MgSO4 anidro 120.37 >97.0 Synth
* O pirrol foi destilado e estocado na geladeira.
Foi utilizado Citocromo c proveniente de coração de cavalo com pureza de
99%, com 7.2% de água procedente da Sigma; glicose oxidase 174400 unidades g-1
Parte Experimental 33
da Sigma; glutaraldeído 25%, 1L=1.06Kg da Merck; peróxido de hidrogênio (H2O2)
30% em peso, 34.02%, Sigma-Aldrich; e quitosana (C12H24N2O9) 75-85% de
desacetilação da Aldrich.
3.3 Instrumentação
VOLTAMETRIA CÍCLICA: Utilizamos um potenciostato da Eco Chemie,
Autolab PGSTAT 30. A cela eletroquímica usada nos experimentos de voltametria
cíclica consistia em uma cela de vidro com três eletrodos com capacidade
aproximada de 5mL.
CRONOAMPEROMETRIA: Os experimentos de cronoamperometria foram
realizados nas mesmas condições que a voltametria cíclica.
ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO (FIA): Os aparatos usados para os
experimentos de injeção de fluxo foram uma válvula de injeção manual de fabricação
caseira, uma célula eletroquímica montada em uma configuração de jato de parede
e a solução foi propulsada com o auxílio de uma bomba peristáltica. A detecção
eletroquímica (cronoamperometria) foi realizada em um potenciostato da Eco
Chemie Autolab PGSTAT 30.
Parte Experimental 34
3.4 Enzimas
3.4.1 Preparação e caracterização de líquidos iônicos
Os líquidos iônicos foram preparados em duas etapas consecutivas, sendo
a primeira relacionada à quaternização de aminas seguido por uma reação de troca
iônica, conforme mostrado na figura 8.
Figura 8 – Preparação dos líquidos iônicos.
A amina (1.2-dimetilimidazol), o haleto de alquila (1-bromobutano) e o sal
para troca iônica (HBF4 e o LiTFSI) são disponíveis comercialmente e serão
utilizadas após purificação prévia.
Em um balão de fundo redondo conectado a um condensador de refluxo
adicionamos 10mmol de 1.2-dimetilimidazol e 10mmol de 1-bromobutano. A mistura
foi então aquecida a 100ºC em banho de óleo sob agitação. Ao resfriar obteve-se um
sólido branco que foi recristalizado com acetonitrila e seco a pressão reduzida,
obtendo assim o brometo de 1-butil-2.3-dimetilimidazol (BMMIBr), com rendimento
de 95%.
Em outro frasco dissolvemos 5mmol do BMMIBr obtido em 5mL de água e
foi adicionado a uma solução de 5mmol de ácido tetrafluorbórico (HBF4) ou
bis(trifluorometanosulfoni)imedeto de lítio (LiTFSI) dissolvidos em 5mL de água. Esta
Parte Experimental 35
mistura reacional foi deixada sob agitação por 3 horas onde foi observada a
formação de duas fases heterogêneas. A esta mistura foi adicionado 15mL de
diclorometano para auxiliar na separação dos compostos e em seguida foi colocado
em um funil de separação.
No caso do BMMIBF4 separamos a fase orgânica e fizemos lavagens da
fase aquosa com diclorometano separando a fase orgânica. O LI embora seja
hidrofílico ele tem uma afinidade maior pelo diclorometano. No caso do BMMITFSI a
fase contendo o líquido iônico foi lavada várias vezes com água, desprezando-se a
fase aquosa, pois ela contém as substâncias resultantes da reação (LiBr).
Na fase orgânica resultante das lavagens com diclorometano,
adicionamos sulfato de magnésio anidro, como secante, e em seguida efetuou-se
uma filtração simples. Finalmente o diclorometano foi retirado via sistema de
evaporação à pressão reduzida, e os líquidos iônicos BMMIBF4 e BMMITFSI obtidos
foram colocados para secar em estufa a 100ºC à pressão reduzida por três dias.
Este método de preparo dos líquidos iônicos foi desenvolvido no
laboratório [53, 54, 55].
3.4.2 Preparação da quitosana
A solução de quitosana 0.5wt% foi preparada a partir da dissolução de
5mg de quitosana em 1mL de ácido clorídrico 0.5mol L-1 e o pH foi ajustado para
pH5 com a utilização de NaOH 1mol L-1 em seguida a solução foi filtrada em uma
seringa de 5mL contendo algodão na parte inferior e a solução foi estocada na
geladeira quando não utilizada.
Parte Experimental 36
3.5 Preparação do híbrido
Preparamos soluções de ferrocianeto de potássio (K3Fe(CN6)) 0.02mol L-1
com cloreto de potássio (KCl) 0.1mol L-1 e cloreto de cobre II (CuCl2) 0.02mol L-1
com KCl 0.1mol L-1.
Adicionamos 0.015mol L-1 de pirrol destilado a 10mL da solução
K3Fe(CN)6 e aplicamos 10 ciclos de voltametria cíclica de 0.95 a -0.25V com
velocidade de varredura de 50mV s-1.
Após, colocarmos o eletrodo mergulhado em solução de CuCl2 0.02mol L-1
por 2 horas e na sequência realizamos a 20 ciclos de voltametria cíclica de 0.95 a -
0.25V com velocidade de varredura de 50mV s-1.
Com isso temos o eletrodo modificado com o híbrido CuHFeCN/ppi. Esta
técnica foi desenvolvida em nosso laboratório [26, 27, 47].
Resultados e discussões 37
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Citocromo c
A princípio utilizamos o citocromo c para estudar a interação com o líquido
iônico já que muitos trabalhos foram desenvolvidos usando esta biomolécula em
conjunto com líquido iônico e quitosana [24, 43, 48, 56-58].
Baseado nos resultados obtidos no trabalho de Zhang e Zheng (2008) [48]
preparou-se uma solução contendo 170µL de quitosana 0.5wt%, 100µL de citocromo
c 10mg mL-1, 830µL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 e 8% v/v de BMMIBF4 adicionando-se
5µL dessa mistura sobre o eletrodo de carbono vítreo previamente polido e tratado,
deixando-o secar em temperatura ambiente. Após seco, aplicamos voltametria
cíclica em meio de PBS e o resultado é mostrado na figura 9 a seguir. Antes de
medir, borbulhamos N2 por 30min, para reduzir a quantidade de O2 presente em
solução.
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2
-8
-6
-4
-2
0
2
I /
A
E / V vs. Ag/AgCl
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 9 – Voltametria cíclica em PBS 0.1mol L-1 do eletrodo contendo 5L da solução (170µL de
quitosana 0.5wt% + 100µL de citocromo c 10mg mL-1 + 830µL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 + 8% v/v de
BMMIBF4) ciclando várias vezes em velocidade de varredura de 100mV s-1.
Resultados e discussões 38
Quando colocamos o eletrodo no tampão para realizarmos a medida,
observamos que ocorreu o desprendimento do filme, que é confirmado pela redução
da corrente na figura 9, podemos comparar com o resultado obtido por Zhang e
Zheng (2008) [48] da figura 10 a seguir.
Figura 10 – Voltametria cíclica de a) Cit c/GC; b) Qui-LI-MWNTs/GC; c) Qui-cit c-MWTNs/GC e d) Qui-cit c-LI-MWNTs/GC em PBS 0.1mol L-1 pH7.0. Imagem retirada da referência [48].
Os resultados obtidos na figura 9 mostram que na ausência de nanotubos
de carbono não há a transferência direta de elétrons do citocromo c, enquanto que
na figura 10, obtida pelos autores, vemos que a transferência direta de elétrons esta
presente. Isto sugere que não é a presença do líquido iônico que leva a
transferência direta de elétrons e sim a presença dos nanotubos de carbono. Se
observarmos a figura 9 há um pico de redução próximo ao potencial de -0.4V e na
figura 10 tem-se um pico de redução e de oxidação próximo ao potencial de -0.2V,
que caracteriza a transferência direta de elétrons do citocromo c. Provavelmente o
pico de redução que observamos na figura 9 é devido à redução do O2 presente em
Resultados e discussões 39
solução, pois mesmo borbulhando N2 antes da medida, um pouco de O2 continua
dissolvido já que a medida é feita sem borbulhar N2.
Outros testes foram realizados modificando as quantidades de quitosana,
citocromo c e líquido iônico, para confirmar o resultado obtido, como é mostrado na
tabela 2.
Tabela 2 – Modificações feitas no eletrodo de carbono vítreo
Qui 0.5wt%/ µL Cit c 10mg mL-1 / µL BMMIBF4 / % v/v PBS 0.1mol L-1 pH7.0 / µL
170 100 8 830 170 100 5 300 100 3 300 100 1 300 100 5
Em todas as modificações feitas os voltamogramas obtidos foram
semelhantes aos obtidos na figura 9, exceto que no caso do eletrodo contendo 3%
de líquido iônico não houve desprendimento total do filme. Com isso, constatamos
que não foi observada a transferência direta de elétrons do citocromo c devido à
presença do líquido iônico.
Podemos então partir para o estudo da interação da glicose oxidase com o
líquido iônico, cuja detecção de glicose é feita pelo monitoramento da quantidade de
peróxido de hidrogênio.
Para o estudo com a glicose oxidase a técnica de voltametria cíclica não é
satisfatória porque a resposta é muito pequena, sendo muitas vezes necessário o
uso de outros artifícios como os nanotubos de carbono ou nanopartículas para se
obter uma resposta melhor. Assim, para realizar os testes de detecção partimos para
outra técnica, a cronoamperometria, e a fim de determinar o potencial de resposta do
Resultados e discussões 40
eletrodo de carbono vítreo realizamos uma voltametria cíclica aplicando potencial de
-0.8 a 1.2V com velocidade de varredura de 100mV s-1, com adições de 1mmol L-1
de H2O2.
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5-40
-20
0
20
40
60
80
0mmol L-1
1mmol L-1
5mmol L-1
10mmol L-1
1,0
0
I /
A
E / V vs. Ag/AgCl
I /
A
E / V vs. Ag/AgCl
Figura 11 – Voltametria cíclica do eletrodo de carbono vítreo na detecção de H2O2 em meio de PBS
0.1mol L-1 pH7.0 com velocidade de varredura de 100mV s-1.
O voltamograma obtido mostra que na região de 0.7 a 1.2V ocorre o
aumento de potencial com a adição de H2O2, logo podemos aplicar o potencial nesta
faixa para a cronoamperometria.
Resultados e discussões 41
4.2 Glicose oxidase
Antes de iniciar os estudos com a glicose oxidase é importante lembrar
que a detecção da glicose é feita de forma indireta pela detecção de peróxido de
hidrogênio como é mostrado no esquema a seguir, na figura 12.
Figura 12 – Representação esquemática de um biossensor amperométrico de glicose.
O esquema mostra que a reação da glicose com a enzima promove a
formação de H2O2 que é detectada pelo eletrodo, por isso dizemos que a detecção
da glicose é indireta.
A partir dos resultados obtidos com o citocromo c (quantidade de
quitosana e líquido iônico que não desgruda do eletrodo), preparou-se um eletrodo
contendo 5µL de solução 300µL de quitosana 0.5wt%, 80µL de glicose oxidase
10mg mL-1 e 3% v/v BMMIBF4. Após secar 24 horas na geladeira realizou-se a
cronoamperometria em meio de PBS 0.1mol L-1 pH7.0. O potencial aplicado variou
de 0.7 a 1.0V e os resultados obtidos são mostrados a seguir.
Resultados e discussões 42
A
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
i / n
A
t / s
B
0 1000 2000 3000 4000 50000
5
10
15
20
25
30
i / n
A
t / s
C
0 1000 2000 3000 4000 5000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
i / n
A
t / s
D
0 1000 2000 3000 4000 50000
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
i / n
A
t / s
Figura 13 – Cronoamperometria com potencial aplicado de: (A) 0,7V; (B) 0,8V; (C) 0,9V e (D) 1,0V
no eletrodo contendo 5µL de solução (300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase 10mg mL-1
+ 3% v/v BMMIBF4), com adições 0.1mmol L-1 de glicose.
Para o potencial de 0.7 e 0.8V não observamos resposta significativa do
biossensor, a corrente aumenta pouco com as adições. Enquanto que para o
potencial de 0.9 e 1.0V observa-se que embora a corrente seja significativa, não há
a formação de patamares de corrente. Isto pode ocorrer porque a transferência de
carga pode não ser efetiva.
Resultados e discussões 43
Para melhorar este problema, podemos colocar sobre a superfície do
carbono vítreo um filme híbrido que facilita a transferência de carga do eletrodo,
como é mostrado na figura 14.
Figura 14 – Representação esquemática de um biossensor amperométrico baseado na detecção de glicose medida pelo híbrido.
Quando colocamos o híbrido sobre a superfície do eletrodo de carbono
vítreo a redução do peróxido de hidrogênio é catalisada, já que diminui o potencial
aplicado e consequentemente evita muitos interferentes eletroquímicos.
A formação do híbrido (HCuFeCN/ppi) consiste de 3 etapas:
1) Voltametria cíclica aplicando potencial de -0.25 a 0.95V em meio de
K3Fe(CN)6 0.02mol L-1, KCl 0.1mol L-1 e pirrol 0.015mol L-1, 10 ciclos com velocidade
de varredura de 50mV s-1;
Resultados e discussões 44
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
i / m
A
E / V vs. Ag/AgCl
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 15 – Voltametria cíclica em meio de K3Fe(CN)6 0.02mol L-1, KCl 0.1mol L-1 e pirrol 0.015mol L-
1, 10 ciclos com velocidade de varredura de 50mV s-1.
2) O eletrodo da etapa 1 é mergulhado em meio de CuCl2 0.02mol L-1 e
KCl 0.1mol L-1 por 2 horas;
3) Voltametria cíclica em meio de CuCl2 0.02mol L-1 e KCl 0.1mol L-1
usado na etapa 2, nas mesmas condições da etapa 1, porém 20 ciclos.
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
i / m
A
E / V vs. Ag/AgCl
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
i / m
A
E / V vs. Ag/AgCl
2 4 8 12 16 20
Figura 16 – Voltametria cíclica em meio de CuCl2 0.02mol L-1 e KCl 0.1mol l-1, 20 ciclos com
velocidade de varredura de 50mV s-1.
Resultados e discussões 45
O híbrido que utilizamos neste trabalho foi desenvolvido em nosso grupo
de pesquisa por Fiorito (2005) [47], o autor realizou estudos referente a sensibilidade
do híbrido a detecção de peróxido de hidrogênio e encontrou os valores de 0.14µA
mmol-1 L cm-2 para o eletrodo que contém CuHCNFe e encontrou 899.41µA mmol-1 L
cm-2 para o eletrodo com CuHCNFe/ppi, comprovando o fato de que o híbrido
catalisa a redução do peróxido de hidrogênio.
O eletrodo de carbono vítreo modificado com o híbrido foi então submetido
a modificações com glicose oxidase e quitosana como é mostrado a seguir.
Resultados e discussões 46
4.2.1 Modificações realizadas no biossensor de glicose
Vários testes foram realizados modificando a quantidade de enzima, de
quitosana e também de líquido iônico. O resultado obtido modificando a
concentração de glicose oxidase é mostrado a seguir na figura 17.
A
-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
j - j 0 /
A c
m-2
t / s
B
-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
j - j 0 /
A c
m-2
t / s
C
-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600-8
-6
-4
-2
0
2
j - j 0 /
A
cm
-2
t / s
Figura 17 – Cronoamperometria a 0V do eletrodo de carbono vítreo com o híbrido contendo 5µL de
solução A (300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase 10mg mL-1); B(300µL de quitosana
0.5wt% + 80µL glicose oxidase 5mg mL-1); C (300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase
2.5mg mL-1) . Adições de 0.1mmol L-1 de glicose.
Para a figura 17 observamos que para a concentração de glicose oxidase
de 10mg mL-1 a resposta é melhor do que para a concentração de 5mg mL-1 e 2.5mg
Resultados e discussões 47
mL-1, não foi possível calcular a sensibilidade já que os gráficos obtidos não
fornecem valores apropriados para traçar uma reta.
Nas medidas realizadas anteriormente, observamos que não se forma
patamares de corrente quando adicionamos a glicose. A fim de evitar este problema
fizemos a modificação da quantidade de quitosana, esperando que o problema
diminuísse.
Tabela 3 – Modificação da quantidade de quitosana.
Qui 0.5wt%/ µL GOx 10mg mL-1 / µL BMMIBF4 / % v/v 300 80 150 80 80 80 80 80 3 40 80 3 20 3
Para as modificações realizadas constatou-se que não ocorre a
estabilização dos patamares de corrente, os cronoamperogramas obtidos foram
semelhantes aos obtidos na figura 17. No caso do eletrodo com 20µL de quitosana o
filme desgrudou do eletrodo e não foi observada nenhuma resposta de corrente
significativa. O problema persiste mesmo modificando a concentração de enzima e a
quantidade de quitosana, portanto decidimos modificar a forma de imobilização da
enzima.
Alguns trabalhos foram desenvolvidos utilizando o híbrido e o glutaraldeído
como forma de imobilizar a glicose oxidase [26, 27], decidimos então constatar se é
possível imobilizar a enzima juntamente com glutaraldeído e líquido iônico e se o
problema da não formação de um patamar de corrente será minimizado.
Resultados e discussões 48
4.2.2 Adição de glutaraldeído substituindo a quitosana
O glutaraldeído forma ligações covalentes com grupos amina residuais
livres de enzimas, como é mostrado na figura 18, muito estável do ponto de vista
mecânico alterando a estrutura secundária da proteína [59].
Figura 18 – Ligação cruzada envolvendo a reação entre glutaraldeído e os grupos amina residuais livres de enzimas [47].
Preparamos uma solução de glutaraldeído 2.5% v/v em água, em seguida
fizemos uma solução contendo BSA e GOx em PBS 0,1mol L-1 pH7,0 e
acrescentamos 3% v/v de BMMIBF4.
Em um eletrodo acrescentamos 10µL de uma mistura de 10µL de
glutaraldeído e 25µL de solução BSA, GOx, BMMIBF4. Em outro eletrodo
acrescentamos 10µL de uma mistura contendo 10µL de glutaraldeído e 25µL de
solução GOx, BMMIBF4. Os resultados obtidos estão a seguir na figura 19.
Resultados e discussões 49
A
0 200 400 600 800 1000-1,50
-1,45
-1,40
-1,35
-1,30
-1,25
-1,20
-1,15
-1,10
i /
A
t / s
B1
0 500 1000 1500 2000-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
j - j 0 /
A c
m-2
t / s
B2
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
1
2
3
4
5
6
Y = A + B * XParameter Value Error---------------------------------------------A -0,38 0,16B 7,90 0,33---------------------------------------------
R SD N P---------------------------------------------0,99 0,25 9 <0.0001---------------------------------------------
j- j 0 /
A
cm-2
[glicose] / mmol L-1
Figura 19 – O gráfico A representa a cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido e com a mistura de 10µL de solução 10µL de glutaraldeído 2.5%v/v + 25µL de (40mg de BSA + 10mg
GOx + 1mL de PBS 0.1mol L-1 pH7 + 3% v/v BMMIBF4). O gráfico B1 representa a cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido com o híbrido e com a mistura de 10µL
de solução 10µL de glutaraldeído 2.5%v/v + 25µL de (10mg GOx + 1mL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 + 3% v/v BMMIBF4). E o gráfico B2 representa sensibilidade. Realizaram-se adições de 0.1mmol L-1 de
glicose.
Observamos que para a medida feita com o eletrodo contendo BSA e
líquido iônico não há o aumento de corrente conforme acrescentamos a glicose, o
que sugere que o BSA interfere na resposta do líquido iônico. Quando retiramos o
BSA vemos que a resposta melhora e temos uma sensibilidade de 7.90µA cm-2
mmol-1 L, que difere muito dos resultados obtidos com quitosana. Podemos fazer
Resultados e discussões 50
uma comparação com o eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de
GOx e glutaraldeído. E o resultado obtido esta na figura a seguir.
C1
0 500 1000 1500 2000 2500 3000-10
-8
-6
-4
-2
0
j - j 0 /
A
cm-2
t / s
C2
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
2
4
6
8
10
Y = A + B * XParameter Value Error--------------------------------------------A -0,223 0,104B 7,48 0,148--------------------------------------------R SDN P--------------------------------------------0,998 0,199 13 <0.0001--------------------------------------------
j - j 0 /
A
cm-2
[glicose] / mmol L-1
Figura 20 – Cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido e com uma mistura de 10µL de solução 25µL de GOx 10mg mL-1 + 10µL de glutaraldeído 2.5%v/v.C1 é a detecção e C2 é a
sensibilidade. Adições de 0.1mmol L-1 de glicose.
Quando comparamos o resultado obtido na presença de líquido iônico e
na ausência dele (figura19B e figura 20) vemos que a sensibilidade obtida na
presença do líquido iônico é maior do que a obtida em sua ausência. Porém a
diferença é muito pequena, para melhorar a sensibilidade, decidimos modificar
alguns parâmetros como é mostrado na tabela 4 a seguir. Foram calculados além da
sensibilidade o limite de detecção e o tempo de resposta. A estabilidade de um
biossensor está diretamente relacionada com o tipo de imobilização da camada do
material biológico, outro fator que altera a estabilidade de alguns biossensores é a
perda do cofator dos sítios ativos das enzimas que dele necessitam para a sua
atividade [59-61].
A sensibilidade é o intervalo de concentração linear das curvas de
calibração no estado estacionário determinada pelo de gráfico de (j-j0) /c ou (j-j0)/log
Resultados e discussões 51
c/c0 versus log c/c0. A sensibilidade descreve quanto a resposta (corrente) varia
com a variação da concentração do analito, pode ser expressa como a inclinação da
curva analítica (coeficiente angular), expresso pela equação S=dx/dc, onde
dx:variação da resposta e dc:variação da concentração. O limite de detecção é o
mínimo de concentração da substância em análise que pode ser detectada. O tempo
de resposta de um biossensor é afetado por vários fatores, tais como: velocidade de
agitação da solução, concentração do substrato, concentração da biomolécula, pH e
temperatura[59, 60].
Tabela 4 – Modificação das quantidades de glutaraldeído, glicose oxidase e líquido iônico.
Biossensor Sensibilidade / µA cm-2 mmol-1 L
LD / µmol L-1 tr / s
10µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1 + 3%BMMIBF4)
7.90 151.2 14.8
10µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1 + 4%BMMIBF4)
10.4 190 15.4
10µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1 + 5%BMMIBF4)
- - -
2.5µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1 + 4%BMMIBF4)
5.61 177.5 38
5µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1 + 4%BMMIBF4)
7.03 78.9 23.2
10µL Glut + 25µL (GOx 5mg mL-1 + 4%BMMIBF4)
9.60 89.4 25.4
10µL Glut + 25µL (GOx 2.5mg mL-1 + 4%BMMIBF4)
11.4 73.7 27.8
10µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1) 7.48 42.5 71.6
Todos os eletrodos da tabela 4 foram modificados com o híbrido antes da
adição da mistura contendo glutaraldeído, glicose oxidase e líquido iônico. Foi
adicionado sobre o eletrodo 10µL dessa mistura esperando-o secar 24h em
temperatura ambiente antes da cronoamperometria.
Resultados e discussões 52
Comparando as sensibilidades o eletrodo que contem 2.5mg mL-1 de GOx
apresentou a maior sensibilidade, 11.4µA cm-2 mmol-1 L, e o eletrodo que contem
2.5µL de Glut apresentou a menor sensibilidade, 5.61µA cm-2 mmol-1 L. No caso do
limite de detecção o eletrodo que não contem líquido iônico apresentou o menor
limite de detecção, porém, neste caso temos que lembrar que este eletrodo contem
maior quantidade de enzima já que não tem líquido iônico e isso pode favorecer o
limite de detecção, já que uma quantidade maior de biomolécula normalmente
acarreta em menor limite de detecção. Agora, comprando os outros eletrodos, o que
contem 2.5mg mL-1 de GOx apresentou o menor LD, 73.7µmol L-1; em relação ao
tempo de resposta, o melhor resultado foi obtido para o eletrodo com 3% de
BMMIBF4.
Se analisarmos com maior detalhe os resultados obtidos, vemos que eles
não diferem muito, e que podem ser melhorados. Com este intuito, resolvemos
modificar a forma de adição do glutaraldeído.
Resultados e discussões 53
4.2.3 Variação da forma de adição do glutaraldeído
Realizamos o teste em que ao invés de misturarmos o glutaraldeído com a
enzima e o líquido iônico optamos por colocá-lo por cima do eletrodo e o resultado
obtido esta a seguir, na figura 21.
A1
0 800 1600
-12
-6
0
j - j 0 /
A c
m-2
t / s
A2
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-2
0
2
4
6
8
10
12
14
Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 0,07279 0,05562B 17,06625 0,11683------------------------------------------------------------
R SD N P------------------------------------------------------------0,99984 0,09049 9 <0.0001------------------------------------------------------------
j - j 0 /
A c
m-2
[glicose] / mmol L-1
B1
0 500 1000 1500 2000-25
-20
-15
-10
-5
0
5
j - j 0 /
A
cm
-2
t / s
B2
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25
Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------------------A -0,2717 0,1329B 22,98668 0,3177------------------------------------------------------------
R SD N P------------------------------------------------------------0,99943 0,20589 8 <0.0001------------------------------------------------------------
j - j 0 /
A c
m-2
[glicose] / mmol L-1
Figura 21 – Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução 10mg mL-1 de GOx com 4% BMMIBF4, após seco acrescentou-se 2(A) ou 10(B)µL de glutaraldeído 2.5%v/v
em água.
Resultados e discussões 54
Não há uma diferença significativa na sensibilidade entre o eletrodo que
contem 2 ou 10µL de glutaraldeído, porém no eletrodo que contem 10µL
observamos que há um problema na estabilização dos patamares no final da
medida, que não é observado para o eletrodo com 2µL. Determinado a quantidade
de glutaraldeído podemos comprar com eletrodo sem o líquido na figura 22.
0 500 1000 1500 2000-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
j - j 0 /
A
cm-2
t / s
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-2
0
2
4
6
8
10
12
14
Y = A + B * XParameter Value Error----------------------------------------------A -0,352 0,224B 14,6 0,421----------------------------------------------R SD N P----------------------------------------------0,997 0,382 10 <0.0001
j - j 0 /
A c
m-2
[glicose] / mmol L-1
Figura 22 – Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, o eletrodo foi preparado a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução 10mg
mL-1 de GOx, após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído 2.5%v/v em água.
Vemos que a sensibilidade para o eletrodo sem o líquido iônico (figura 22)
foi de 14.6µA cm-2 mmol-1 L enquanto que para o eletrodo com o líquido iônico
(figura 21A) foi de 17.1µA cm-2 mmol-1 L.
Os resultados obtidos adicionando glutaraldeído por cima, levam aos
seguintes limites de detecção e tempo de resposta mostrados na tabela 5.
Resultados e discussões 55
Tabela 5 – Modificação da forma de adição do glutaraldeído.
Biossensor Sensibilidade / µA cm-2 mmol-1 L
LD / µmol L-1 tr / s
5µL (GOx 10mg mL-1 + 4%BMMIBF4) depois de seco 2µL de Glut
17.1 38.8 12.4
5µL (GOx 10mg mL-1 + 4%BMMIBF4) depois de seco 10µL de Glut
23.0 61.6 10.8
5µL (GOx 10mg mL-1) depois de seco 2µL de Glut
14.6 13.7 36.2
10µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1) 7.48 42.5 71.6
A sensibilidade do eletrodo com 2µL de glutaraldeído foi 17.1µA cm-2
mmol-1 L e o com 10µL foi 23.0µA cm-2 mmol-1 L, mas o limite de detecção é menor
para o de 2µL, 38.8µmol L-1 e o tempo de resposta entre eles é praticamente igual.
Comparando com o eletrodo que não contem o LI e com o eletrodo em que
misturamos todas as substâncias, o eletrodo em que acrescentamos o glut
posteriormente apresenta melhor desempenho, já que todos os parâmetros são
melhorados. Podemos retirar uma informação muito importante deste fato,
adicionando o glutaraldeído posteriormente observamos que a interação da
biomolécula com líquido iônico é mais eficiente do que quando temos o glutaraldeído
misturado com a glicose oxidase e o líquido iônico, o fato da sensibilidade aumentar
mostra que a interação da biomolécula com o líquido iônico é benéfica.
DiCarlo et. al (2006) [62] fez um estudo em que analisa a interação do
citocromo c com diferentes líquidos iônicos, e ele constatou que ocorre uma
mudança na estrutura secundária da proteína dependendo do líquido iônico usado, e
afirmou que para evitar a perda de sinal redox em líquidos iônicos, a adição de
grupos de proteção para a proteína pode ser explorado para determinar se a
estrutura secundária de proteínas pode ser protegida da interação com os
componentes dos líquidos iônicos.
Resultados e discussões 56
Wu et. al (2008) [42] fez um estudo da relação entre o líquido iônico
(BMMIBF4) e a glicose oxidase, e constatou que não há mudança de conformação
da estrutura secundária da proteína, os resultados obtidos pelos autores esta nas
figuras 23, 24 e 25.
Figura 23 - Espectro de UV–vis da GOx em PBS contendo 0 vol% (a), 2 vol% (b), 5 vol% (c)10 vol%
(d), 15 vol% (e), e 20 vol% (f) de BMMIBF4. Esta imagem foi retirada da referência 42.
Pela figura 23 vemos que conforme o autor aumentou a quantidade de
líquido iônico na solução o espectro de UV-vis não apresentou mudanças. Ele
sugere que grupos cromóforos da flavina adenina dinucleotídeo (FAD), que
responderam ao espectro de absorção da GOx, foram incorporados na matriz
polipeptídio. Esses grupos não são liberados quando em contato com o líquido
iônico. Alem disso, as bandas de adsorção em ~278nm para as misturas BMMIBF4-
PBS (figura 23b-f) foram as mesmas registradas em PBS puro (na ausência de
BMMIBF4, figura 23a). Esta banda é característica dos picos de cadeias
polipeptídicas da enzima. Estes resultados apóiam o fato de que a GOx manteve a
sua estrutura conformacional nativa na mistura BMMIBF4-PBS [42].
Resultados e discussões 57
Figura 24 - Espectro de dicroísmo circular (CD) da GOx PBS (0.1M, pH8.2) contendo 0 (preto), 2 (vermelho), 5 (verde), 10 (azul), 15 (azul claro), e 20 vol% (lilás) de BMMIBF4 na região UV-distante
(A)e UV-perto (B).Estas imagens foram retiradas da referência 42.
A figura 24 registrada por Wu et. al (2008) [42] mostra que o espectro de
dicroísmo circular na região UV-distante (200-250nm) corresponde ao peptídeo na
transição eletrônica n π*. O espectro nesta região é sensível a mudanças
conformacionais da enzima e vemos que os picos são invariáveis com o aumento da
quantidade de líquido iônico (figura 24A), indicando que a estrutura secundária e a
conformação da GOx em misturas de BMMIBF4-PBS são essencialmente a mesmas
da enzima nativa. O espectro de CD na região de (250-300nm) também não sofre
mudanças (figura 24B). Estes resultados sugerem que o microambiente do sítio ativo
da GOx nas misturas também permanece já que não se observa sinais de
desnaturação da GOx, devido a dissociação da FAD da enzima.
Resultados e discussões 58
Figura 25 - Espectro Raman de (a) 10mM glicose em PBS 0.1mol L-1; (b) Mistura GOx-BMMIBF4–PBS contendo 20 vol% de BMMIBF4 ; e (c) Espectro Raman do BMMIBF4 registrado na mistura BMMIBF4–PBS (20 vol% BMMIBF4). O espectro foi registrado usando energia de excitação em
514.5nm. Esta imagem foi retirada da referência 42.
O espectro Raman registrado por Wu et. al (2008) [42] como é mostrado
na figura 25, serve para estudar a interação da glicose com o BMMIBF4. O espectro
Raman de 10mM glicose em 0.1mol L-1 de PBS (figura 25a), e da mistura BMMIBF4-
PBS (20% vol de BMMIBF4, figura 25b) foram registrados. Para comparação, o
espectro Raman do BMMIBF4 em PBS 0.1mol L-1 (20% vol BMMIBF4, figura 25c)
também foi registrado. Nenhuma banda foi observada no espectro Raman do
BMMIBF4 em abaixo do comprimento de onda de 1.000cm-1 (Fig. 25c). No entanto,
várias bandas (~ 1020, 1390, 1420, e 1567 cm-1) apareceram quando o comprimento
de onda foi superior 1.000 cm-1. Estas bandas foram atribuídas ao espalhamento
Raman do imidazólio. Fig. 25a mostra o espectro Raman da glicose no PBS.
Existem várias bandas Raman (~ 416, 515, 557, 764, 858, e 915 cm-1) medidas
abaixo do comprimento de onda de 1000 cm-1. Estas bandas são as impressões
digitais da glicose. Fig. 25b representa o espectro de Raman da glicose em mistura
BMMIBF4-PBS. É mostrado pelo espectro que a posição e forma das bandas Raman
Resultados e discussões 59
para BMMIBF4 foram quase as mesmas na fig. 25c, e as bandas Raman
características da impressão digital de glicose também foram as mesmas na fig. 25a.
Os resultados indicaram que as características Raman da glicose não são afetadas
por BMMIBF4 e as características do BMMIBF4 também não foram afetados pela
glicose. Estes resultados sugerem não há interação entre glicose e o BMMIBF4.
Pelos experimentos realizados por Wu et. al (2008) [42] temos que o
BMMIBF4 não apresenta mudança na estrutura secundária da glicose oxidase. Isto
justifica o fato de que quando temos a mistura glicose oxidase, líquido iônico e
glutaraldeído a sensibilidade é menor do que quando temos uma mistura de glicose
oxidase e líquido iônico. Acontece que o glutaraldeído forma ligações cruzadas com
a enzima, como foi mostrado na figura 18, que são preferenciais em relação à
interação da biomolécula com o líquido iônico, quando fazemos a mistura apenas do
líquido iônico e da biomolécula, a enzima não sofre as alterações causadas pelo
glutaraldeído em sua estrutura secundária e por isso a sensibilidade aumenta.
Zhao et. al (2010) [63] realizou experimentos de dicroísmo circular e
espectroscopia de infra-vermelho para a glicose oxidase e para o compósito GOx-
CNTs e verificou que há uma mudança conformacional da biomolécula na presença
de nanotubos de carbono, a estrutura secundária da enzima é modificada. Podemos
então afirmar que não é a presença do líquido iônico em compósitos com nanotubos
e biomoléculas que faz com que a resposta do biossensor seja melhorada, mas
provavelmente as mudanças estruturais da biomolécula ocasionada pela presença
dos nanotubos. Em nosso sistema, o biossensor possui uma resposta melhor porque
como o líquido iônico não modifica a proteína, ela se mantém em um microambiente
favorável, tem sua atividade mantida e o glutaraldeído adicionado sobre a GOx e o
BMMIBF4 não ocasiona a formação das ligações cruzadas.
Resultados e discussões 60
4.2.4 Cálculo da constante aparente de Michaelis-Menten (KMap)
Podemos determinar a constante aparente de Michaelis-Menten (KMap)
para o biossensor desenvolvido utilizando os dados da figura 21A.
KMap pode ser estimada através da curva analítica de calibração, uma vez
que é igual à concentração de substrato para a qual a velocidade da reação é a
metade da velocidade máxima. Portanto, se uma enzima tiver um valor pequeno de
KMap, ela atingirá a máxima eficiência catalítica em baixas concentrações de
substrato [64-[66]. Pelo método acima, o valor encontrado para KMap foi 4.2mmol L-1.
Uma maneira mais precisa de se determinar o valor de KMap é alcançada
através de um gráfico de 1/(j-j0) vs. 1/[glicose]. Nesse caso, é valida a equação 1.
0 0 0max max
1 1cos
MapKj j j j j j gli e
Equação 1 [65]
Seguindo a equação apresentada acima, foi possível construir o gráfico
apresentado na figura 26.
0 2 4 6 8 100,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------A 0,0112 0,00368B 0,0555 0,00102------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------0,998 0,00889 12 <0.0001------------------------------------------------
1 / (
j - j 0)
(A
cm-2)
1 / [glicose] (mmol L-1)
Figura 26 – Estimativa da constante aparente de Michalis-Menten.
Resultados e discussões 61
Através do coeficiente angular da parte linear do gráfico, é possível
estimar o valor de KMap como sendo 4.9mmol L-1. Esse valor é próximo do obtido
pelo método descrito anteriormente, mas é mais preciso por considerar um número
maior de pontos.
Podemos comparar o resultado de KMap com outros sistemas
desenvolvidos para a detecção de glicose como é mostrado na tabela 6 a seguir.
Tabela 6 – Valores de KMap para outros sistemas.
Eletrodo modificado KMap / mmol L-1 Referência
GC/CuHFeCN/ppi/GOx/BMMIBF4/Glut 4.9 Este trabalho
GC/CNTs/Qui/GOx 8.2 [28]
GC/CNTs/GOx/FcA 4.5 [42]
nano-Au/Qui/BMMIBF4/GOx 7.8 [49]
Vemos que o valor de KMap obtido pelo biossensor estudado é
relativamente menor do que o de outros sistemas desenvolvidos na presença de
nanotubos ou nanopartículas. Como foi dito anteriormente, valores pequenos de
KMap significam que a enzima atingirá a máxima eficiência catalítica em baixas
concentrações de substrato.
A constante aparente de Michaelis-Menten é característica do filme sobre
o eletrodo, não da enzima, e usualmente difere substancialmente da constante da
enzima, medida em solução homogênea. O valor de KM da glicose oxidase ativa em
solução é 30mM [67].
Resultados e discussões 62
4.2.5 BMMIBF4 versus BMMITFSI
Realizamos um teste comparando diferentes líquidos iônicos, o BMMIBF4
e o BMMITFSI, a figura 27 exibe os resultados obtidos.
A1
0 800 1600
-12
-6
0
j - j 0 /
A
cm-2
t / s
A2
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-2
0
2
4
6
8
10
12
14
Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 0,07279 0,05562B 17,06625 0,11683------------------------------------------------------------
R SD N P------------------------------------------------------------0,99984 0,09049 9 <0.0001------------------------------------------------------------
j - j 0 /
A c
m-2
[glicose] / mmol L-1
B1
0 500 1000 1500 2000 2500-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
j- j 0 /
A
cm-2
t / s
Figura 27- Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução 10mg
mL-1 de GOx com 4% BMMIBF4 (A) ou 4% BMMITFSI(B), após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído 2.5%v/v em água.
Comparando os resultados obtidos com os líquidos iônicos constatamos
que o BMMIBF4 apresenta uma linearidade maior do que o BMMITFSI. Visualmente,
quando preparamos o eletrodo com o líquido iônico BMMITFSI observamos um
Resultados e discussões 63
aglomerado de bolhas de líquido iônico que não se misturaram à solução de enzima,
no caso do BMMIBF4, formou-se uma solução homogênea entre o líquido iônico e a
enzima glicose oxidase. Isto ocorre devido ao fato do BMMITFSI ser um líquido
iônico hidrofóbico, portanto não é dissolvido em solução que contem água enquanto
que o BMMIBF4 é hidrofílico, e se dissolve facilmente em água. Para minimizar este
efeito decidimos modificar o eletrodo com o BMMITFSI de uma forma diferente,
Dissolvemos a enzima diretamente no líquido iônico, e observamos que apenas uma
parte da enzima foi dissolvida, retiramos uma alíquota de 5µL de solução e
adicionamos sobre o eletrodo para verificar se a enzima continuava ativa.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
j - j 0 /
A
cm
-2
t / s -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Y = A + B * XParameter Value Error-------------------------------------------------A -0.056 0.0304B 1.37 0.0469-------------------------------------------------R SD N P-------------------------------------------------0.994 0.0561 12 <0.0001-------------------------------------------------
j - j 0 /
A
cm
-2
[glicose] / mmol L-1
Figura 28 - Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução 10mg GOx dissolvida parcialmente em 1mL de BMMITFSI, após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído
2.5%v/v em água.
A sensibilidade alcançada para o eletrodo modificado com uma mistura de
enzima dissolvida diretamente no BMMITFSI foi baixa 1.37µA cm-2 mmol-1 L, mais
isso pode ter ocorrido porque não houve a dissolução completa da enzima no líquido
iônico, apenas parte da enzima foi dissolvida. Sabemos que as enzimas possuem
partes hidrofóbicas e partes hidrofílicas, porém quando adicionamos um líquido
iônico hidrofóbico, apenas parte da enzima foi dissolvida o que explica a baixa
Resultados e discussões 64
sensibilidade obtida, mais se compararmos com o resultado obtido para o eletrodo
da figura 27B onde temos uma solução contendo apenas 4% de BMMITFSI com o
resultado da figura 28 onde dissolvemos a enzima diretamente no BMMITFSI o
resultado foi melhor, mas não supera os resultados obtidos com o BMMIBF4.
Resultados e discussões 65
4.3 Detecção de glicose por Análise por Injeção em Fluxo (FIA)
Ao eletrodo modificado com o híbrido, GOx, LI e Glut aplicamos FIA para
detecção de glicose, com o intuito de melhorar a sensibilidade.
A otimização dos parâmetros utilizando FIA nos levaram aos seguintes
resultados:
Potencial aplicado de 0V;
Velocidade de fluxo de 0.6mL min-1;
Alça de injeção de 40µL.
Com estes resultados partimos para a determinação da detecção de
glicose e a determinação da sensibilidade. Os resultados obtidos são exibidos na
figura a seguir.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
j-j0 /
A
cm
-2
t / s
Figura 29 – Detecção de glicose utilizando FIA do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução (GOx 10mg mL-1 com 4% v/v BMMIBF4), após seco acrescentou-se 2µL de Glut 2.5% v/v em água. Foram realizadas 3 adições de cada concentração: 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.1,
0.4, 0.8 e 1mmol L-1 de glicose.
Resultados e discussões 66
Pelo método de FIA os valores de corrente encontrados para as
concentrações de glicose de 0.08mmol L-1 e 0.8mmol L-1 foi inferior ao que se
esperava, já que conforme aumentamos a concentração a resposta de corrente
deveria crescer até que a saturação fosse atingida. Este problema pode ser devido
ao fato de que a análise em fluxo pode carregar parte do filme conforme o fluxo corre
assim a quantidade de enzima no biossensor diminui com o tempo. Outro problema
que foi observado foi o fato de que muitas bolhas foram formadas no sistema, o que
pode prejudicar a medida, pois as bolhas podem destruir o filme e levar a valores
incorretos de corrente. Este problema não é evidenciado na técnica de
cronoamperometria como podemos ver no gráfico da figura 21B onde os patamares
de corrente crescem em função da adição de glicose até que ocorra a saturação.
Para melhorar a detecção por FIA teremos que desenvolver um sistema que tenha o
mínimo de bolhas possível e também que tenha um fluxo muito baixo para que não
ocorra o desprendimento do filme.
Portanto pelos resultados obtidos chegamos a conclusão de que o
método de cronoamperometria é mais satisfatório para as medidas com o biossensor
que desenvolvemos em nosso trabalho.
Considerações finais 67
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Podemos comparar o biossensor desenvolvido com outros sistemas como
é mostrado na tabela 7 abaixo.
Tabela 7 – Eletrodos modificados com glicose oxidase.
Biossensores Quantidade de GOx no eletrodo /
mg
Sensibilidade / µA mmol-1 L
cm-2
Referência
GC/CuHCNFe/Ppi/GOx/BMMIBF4/Glut 0.05 17.1 Este trabalho
GOx imobilizada em hidrogel redox de ósmio com base tri-dimensional
0.008 5.2 [68]
GOx imobilizada em eletrodo de filme de carbono
0.1 0.25 [69]
GOx com filme de polipirrol eletrogerado em mesoporos deTiO2
0.2 4.0 [70]
GOx co-imobilizada com ferroceno para misturas de etanol/água
- 1.5 [71]
GOx presa em um filme eletropolimerizado
- [72]
Au/Qui/BMMIBF4/GOx - 5.2 [49] nano-Au/Qui/BMMIBF4/GOx - 14 [49]
nanoCuHCNFe/Ppy/GOx/BSA/Glut 0.07 12 [27]
Vemos que o biossensor desenvolvido apresenta uma sensibilidade maior
do que os outros sistemas, 17.1µA mmol-1 L cm-2, e no geral a quantidade de enzima
utilizada é menor do que a dos outros sistemas 0.05mg. No sistema desenvolvido
por Gonçales [27] a sensibilidade encontrada foi de 12µA mmol-1 L cm-2 usando
0.07mg de enzima. Para os outros sistemas mostrados temos valores inferiores aos
obtidos, Ohara et. al [68] obteve 5.2µA mmol-1 L cm-2, Ghica and Brett [69] obtiveram
0.25 µA mmol-1 L cm-2 e Cosnier et. al [70] obteve 4.0µA mmol-1 L cm-2. Portanto,
nosso sistema apresenta uma boa sensibilidade quando comparada com outros
Considerações finais 68
sistemas e mostra que a interação direta entre a biomolécula e o líquido iônico
auxilia no desempenho do biossensor, mantendo a atividade da biomolécula.
Conclusão 69
6 CONCLUSÃO
O biossensor desenvolvido CuHFeCN/Ppi/GOx/BMMIBF4/Glut apresentou
uma resposta satisfatória frente aos resultados obtidos por outros trabalhos, como foi
mostrado nas tabelas 6 e 7.
A sensibilidade na detecção da glicose aumenta na presença do líquido
iônico (BMMIBF4) e principalmente pelo contado direto com a enzima. O líquido
iônico pode por não modificar a estrutura secundária da biomolécula, leva ao
aumento da sensibilidade, diminuição do limite de detecção e do tempo de resposta
do biossensor, quando comparado ao sistema em que o glutaraldeído é misturado
junto com a enzima e o líquido iônico, pois a ligação cruzada entre o glutaraldeído e
a biomolécula é preferida em relação a interação com o líquido iônico e isso faz com
que a atividade da enzima diminua e por isso os resultados de sensibilidade são
menores.
Não observamos a transferência direta de elétrons do citocromo c na
presença do líquido iônico (sem os nanotubos de carbono) e o voltamograma que
obtemos refere-se provavelmente a redução do O2 presente na solução.
Vimos também que para o biossensor que desenvolvemos a técnica de
FIA não é a mais indicada, pois parte do filme é perdido no sistema e com isso
temos a diminuição da corrente detectada, portanto a técnica de cronoamperometria
é mais indicada para este sistema.
Por fim, o trabalho desenvolvido nos mostra que o BMMIBF4 tem uma
interação benéfica com a glicose oxidase, pois a mantêm em um ambiente mais
favorável sem ocasionar mudanças conformacionais e por isso melhora a detecção.
Referências bibliográficas 70
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79
8 SÚMULA CURRICULAR
DADOS PESSOAIS
Kelly Suely Galhardo
Data do Nascimento: 11 de janeiro de 1985
Local: Uberaba, Minas Gerais – Brasil
EDUCAÇÃO
Ensino
fundamental
Professor Arlindo Bittencourt (1996-1999)
Ensino médio Colégio Álvaro Guião (2000)
Colégio São Carlos (2001-2002)
Graduação Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos
(2004-2008)
Pós-Graduação Universidade de São Paulo – Instituto de Química
Mestrado em Química – Área: Físico-química (2008-2010)
OCUPAÇÃO
Bolsista de Mestrado pela Agência Financiadora CNPq (agosto/2008-
março/2010), projeto 554553/2008-2.
EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL
30 novembro - 4 dezembro 2009 Monitoria da 4º Escola de Eletroquímica Agosto 2009 – dezembro 2009 Estágio no Programa de Apoio ao Ensino
(PAE), junto à disciplina: QFL 2426 – Físico-Química XVII – IQ/USP
Janeiro 2008 – maio 2008 Estágio junto a FIPAI
Fevereiro/2005 – Dezembro/2007 Iniciação Científica – Bolsista Fapesp
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PARTICIPAÇÃO EM CONGRESSO
Participação na 30ª Reunião da Sociedade Brasileira de Química com o
trabalho “Caracterização voltamétrica de eletrodos de Au modificados com SAM para
utilização como sensores” painel EQ-55 em Junho de 2007.
Participação no 6º Encontro de Bioengenharia realizado de 7 a 9 de maio
de 2008, na Escola de Engenharia de São Carlos (USP).
CURSOS
Curso de Química Verde na Universidade de São Paulo (IQ-USP) em Janeiro
de 2007.
Curso de Cosmetologia na Universidade de São Paulo (IQSC-USP) em Abril
de 2007.
Curso de Biomateriais durante o 6º Encontro de Bioengenharia na Escola de
Engenharia de São Carlos (EESC-USP) em maio de 2008.
Curso avançado de técnicas eletroquímicas localizadas e XPS realizado em
novembro de 2008 no IQ-USP.