công trình được hoàn thành tại: học viện khoa học và công...
TRANSCRIPT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Quách Thị Minh Thu
NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA ULVAN CÓ
HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ
ULVA RETICULATA
Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý
Mã sỗ: 62.44.01.19
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Hà Nội – 2017
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công
nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Thành Thị Thu Thủy
2: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân
Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng
… năm 2017.
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho
nhiều ngành công nghiệp như dệt may, mỹ phẩm. Trên thế giới có
khoảng 10 000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành
rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophyte), rong
nâu (Pheophyte) và rong đỏ (Rhodophyte). Nước ta có một vùng biển
nhiệt đới rộng với bờ biển dài hơn 3000 km bao bọc hết phía đông và
nam đất nước, là nguồn cung cấp các loài rong biển phong phú và đa
dạng.
Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết
các chất có hoạt tinh sinh học như lipid, protein, peptide,
polysaccharide, carotenoid, hợp chất phenolic, alkaloid. Tại Việt Nam
nguồn lợi rong lục rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các chi
rong Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi
Ulva gồm 69 loài và phổ biến nhất là Ulva reticulata và Ulva lactuca.
Ulvan là sulfate polysaccharide có trong rong lục thuộc chi Ulva
và Enteromorpha. Cũng giống như các sulfate polysaccharide có
nguồn gốc từ rong biển khác, ulvan có cấu trúc rất phức tạp, nó được
cấu tạo bởi các thành phần chủ yếu là các đường rhamnose, xylose,
các acid glucuronic, iduronic và nhóm sulfate. Thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm
thu hái, vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và điều kiện chiết tách. Các
ulvan từ rong lục có cấu trúc rất đa dạng làm cho việc nghiên cứu cấu
trúc gặp nhiều khó khăn, cản trở sự phát triển của các sản phẩm thuốc
chữa bệnh. Do vậy, việc nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide đòi
hỏi phải có sự kết hợp một cách hợp lý của nhiều phương pháp. Mặt
khác, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa
cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt với hoạt tính
sinh học của polysaccharide, do vậy việc nghiên cứu một cách tổng
thể cấu trúc của polysaccharide là cần thiết. Hiện nay, một hướng
2
nghiên cứu đang được quan tâm là điều chế các dẫn xuất của hợp chất
thiên nhiên với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố cấu
trúc đến hoạt tính sinh học, từ đó có thể tạo ra các chất có hoạt tính
sinh học cao hơn mẫu tự nhiên.
Ở nước ta, polysaccharide chiết tách từ rong đỏ và rong nâu như
carrageenan, alginate và fucoidan đã được nghiên cứu và thu được các
kết quả tốt thì cho đến nay chưa có một công bố nào về
polysaccharide từ các loài thuộc ngành rong lục nói chung và ulvan từ
chi Ulva nói riêng.
Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu " Nghiên
cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva lactuca
và Ulva reticulata”, để nghiên cứu cấu trúc của ulvan-một
polysaccharide có trong rong lục và tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến
tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng nhằm góp
phần hoàn thiện hướng nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển và
mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án:
-Xác định cấu trúc của các ulvan có hoạt tính sinh học chiết tách từ 2
loài rong lục Ulva reticulata và Ulva lactuca phổ biến ở vùng biển
Nha Trang của Việt Nam.
-Tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt
tính sinh học của ulvan.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Thu thập 2 loài rong lục thuộc chi Ulva là Ulva reticulata và Ulva
lactuca
- Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của
ulvan chiết tách từ 2 loài rong lục trên.
- Nghiên cứu cấu trúc của các ulvan có hoạt tính tốt.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học (sulfate hóa và
acetyl hóa) đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan.
3
4. Cấu trúc của luận án: Luận án gồm 130 trang: Đặt vấn đề 2 trang,
Chương 1-Tổng quan 35 trang, Chương 2-Thực nghiệm 14 trang,
Chương 3-Kết quả và thảo luận 56 trang, Kết luận và kiến nghị 3
trang, Danh mục các công trình đã công bố 2 trang, Tài liệu tham
khảo 18 trang, có 17 bảng biểu và 58 hình ảnh và đồ thị.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Trong phần tổng quan, luận án đã giới thiệu chung về rong biển,
phân loài rong biển ở Việt Nam và trên thế giới, thành phần dinh
dưỡng và ứng dụng của rong biển, các sulfate polysaccharide từ rong
biển và tổng hợp về các tính chất hóa lý, phương pháp chiết tách,
thành phần, cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan từ rong lục chi
Ulva, như sau: Rong biển hay tảo bẹ hay cỏ biển có thế sống ở cả hai
môi trường nước mặn và nước lợ, được chia thành 3 ngành chính bao
gồm: rong đỏ (Rhodophyta), rong nâu (Phaeophyta) và rong lục
(Chlorophyta). Rong biển chứa hàm lượng đạm rất cao, rất nhiều
khoáng chất, các yếu tố vi lượng trong đó nổi bật là iodine, các
vitamin (A, E, C, B12 và B1) và chất xơ. Thành phần hóa học của
rong biển bao gồm lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid,
các hợp chất phenolic, alkaloid... Trong đó, polysaccharide là thành
phần chính của rong biển, rất có giá trị về mặt kinh tế và được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích y học. Ulvan
là sulfate polysaccharide tan trong nước được phân lập chủ yếu từ 2
chi rong lục Ulva và Enteromorpha thuộc họ Ulvaceae, được biết đến
là các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học
quý báu như điều chỉnh hệ miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa,
chống đông tụ và kháng vi sinh vật kiểm định. Thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm
thu hái, vị trí địa lý và điều kiện xử lý sau thu hái. Cấu trúc của ulvan
từ rong lục rất đa dạng và không đồng nhất, được tạo nên bởi các
thành phần đường chủ yếu là rhamnose (Rha), xylose (Xyl), các acid
4
là acid glucuronic (GlcA), acid iduronic (IdoA) và nhóm sulfate để
tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide chính là acid 3-
sulfate ulvanobiuronic dạng A ((β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(→1))
và acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng B ((α-L-IdoA-(1→4)-α-L-
Rha3S (→1)).
Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu cấu trúc
polysaccharide bao gồm: Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC,
phương pháp phổ IR, phương pháp phổ NMR, phương pháp phổ MS,
phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS).
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
2.1.1. Thu thập và định danh rong
Các mẫu rong lục dùng để chiết ulvan được thu hái tại vùng biển
Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa, tháng 4/2014 gồm 2 loài rong lục Ulva
reticulata và Ulva lactuca, được định danh bởi TS. Lê Như Hậu (Viện
nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha trang). Tiêu bản của 2 mẫu
rong nghiên cứu đang được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
công nghệ Nha Trang và Viện Hóa học với kí hiệu UR-14 (Ulva
reticulata) và UL-14 (Ulva lactuca).
2.1.2. Phân tích thành phần hóa học của rong
Xác định độ ẩm, hàm lượng tro, protein thô, béo thô và
carbohydrate của rong: Theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ
AOAC.
2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục
Sau khi nghiên cứu tham khảo các quy trình và điều kiện chiết
tách ulvan từ rong lục mà các tác giả đã công bố, chúng tôi đã khảo
sát và đưa ra các quy trình để chiết tách ulvan từ 2 loại rong lục thu
thập được như sau:
2.1.3.1. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi nước:
Ngâm chiết 20g bột rong trong 400ml dung dịch nước ở nhiệt độ
80º-90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở
5
điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, ly tâm lấy dịch trong,
sau đó, cô quay cho đến khi thể tích còn 100ml, thêm tiếp cồn tuyệt
đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa,
rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C thu được ulvan thô. Ký
hiệu UR-N, UL-N với hiệu suất chiết tách tương ứng 8,3 và 6,5 (%
w).
2.1.3.2. Quy trình chiết bằng dung môi acid:
Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400ml dung dịch acid HCl 0,05-
0,1N ở nhiệt độ 90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết
tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung hòa
về pH=7 rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó cô quay cho đến khi thể tích
còn 100ml, thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1).
Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở
60°C thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-H, UL-H với hiệu suất chiết
tách tương ứng là 7,2 và 6,4 (% w).
2.1.3.3. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi kiềm:
Ngâm chiết 20g bột rong trong 400ml dung dịch kiềm NaOH
0,1N ở nhiệt độ 60ºC, thời gian 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được
chiết tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung
hòa về pH=7 rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó cô quay cho đến khi thể
tích còn 100ml. Thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch =
4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy
tủa ở 60°C thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-K, UL-K với hiệu suất
chiết tách tương ứng là 5,1 và 4,1 (% w).
Tinh chế ulvan: mẫu ulvan thô được hòa tan trong nước cất và
được tinh chế bằng màng thẩm tách MWCO 10000 (Da) của hãng
Thermo Scientific – USA dưới vòi nước chảy trong 72h, kết tủa ulvan
bằng cồn tuyệt đối, ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º, sấy
tủa ở 60°C đến trọng lượng không đổi thu được ulvan có độ sạch cao.
2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học
Các phép thử hoạt tính sinh học được tiến hành thử nghiệm đối
với các ulvan tự nhiên và các dẫn xuất. Các phép thử đều tuân theo
6
qui định chung về thử hoạt tính sinh học như: chuẩn bị mẫu thử,
mẫu đối chứng, ghi đọc và tính toán kết quả.
2.1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào
Xác định hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư
thử nghiệm bao gồm: HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và
HeLa (ung thư cổ tử cung). Phép thử này được thực hiện theo
phương pháp của Monks.
2.1.4.2. Hoạt tính chống đông tụ máu
Xác định hoạt tính chống đông tụ máu theo phương pháp của
Anderson và CS.
2.1.4.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương
pháp khuyếch tán đĩa thạch tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công
nghệ Nha trang theo phương pháp của Vanden và CS.
2.1.4.4. Hoạt tính chống oxy hóa
- Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Prieto và
CS.
- Xác định khả năng khử sắt theo phương pháp Zhu và CS.
2.2. Xác định cấu trúc ulvan
2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan
- Xác định hàm lượng sulfate: Hàm lượng sulfate trong phân tử
ulvan được xác định theo phương pháp của Dodgson và CS.
- Xác định hàm lượng acid uronic: Xác định bằng phương pháp
của Bitter và CS.
- Xác định thành phần đường: Xác định theo phương pháp của
Billan và CS.
2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Khối lượng phân tử trung bình của ulvan được xác định bằng GPC, trên máy HPLC Agilent 1100. Pha động 0,1N NaNO3, tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID150.
2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại IR
Phổ hồng ngoại của các mẫu ulvan được đo trên máy FT-IR
Affinity-1S SHIMADZU trong vùng số sóng 4000-400cm-1.
7
2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung môi D2O và được đo
phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nước, trên
máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-
1-sulfonic acid) được dùng làm chất chuẩn nội.
2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng MS
Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LTQ Orbitrap XLTM,
Thermo SCIENTIFIC kiểu ion hóa âm với dung môi MeOH : H2O =
1:1. Khí phun mù là N2 với áp suất khí là 30psi với tốc độ phun khí
650 lít/giờ tại nhiệt độ là 1800C.
2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS
Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được thực hiện tại
BL19B2, SPring-8, Hyogo, Nhật Bản.
2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét SEM
Ảnh SEM được chụp trên hệ thiết bị Nova NaNoSEM 450 – FEI
tại Khoa Vật lý - Trường ĐH KHTN – Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên
- Dẫn xuất sulfate hóa: tổng hợp theo phương pháp của Lihong Fan và
CS. Xác định hàm lượng sulfate bằng phương pháp khối lượng
- Dẫn xuất acetyl hóa: tổng hợp theo phương pháp của Xiao-xiao Liu
và CS. Xác định hàm lượng acetyl của ulvan bằng phương pháp phân
tích thể tích theo Luis.A.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu
3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan
Kết quả thành phần hóa học của các ulvan ở Bảng 3.1 cho thấy,
hàm lượng sulfate trong các mẫu ulvan thu được dao động ở khoảng
13-19%, hàm lượng uronic acid rất lớn nằm trong khoảng 18-23%
tính theo trọng lượng rong khô. Kết quả này cũng phù hợp với các
nghiên cứu đã công bố trên các loài rong lục khác.
8
Bảng 3.1. Kết quả thành phần hóa học của 6 ulvan
Ulvan
SO3Na
(% khối
lượng)
Acid uronic
(% khối
lượng)
Thành phần monosaccharide ( % mol)
Rha Gal Xyl Man Glu
UR-N 17,6 22,5 1 0,03 0,06 0,01 0,06
UR-H 14,3 19,3 1 0,1 0,11 0,01 0,21
UR-K 13,2 19,8 1 0,1 0,14 0,03 0,14
UL-N 18,9 21,5 1 0,03 0,07 0,01 0,06
UL-H 15,1 18,7 1 0,01 0,10 0,01 0,06
UL-K 14,2 18,2 1 0,04 0,09 0,01 0,07
3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan 3.1.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
của 6 mẫu ulvan
Vi Khuẩn UR-H UR-N UR-K UL-H UL-N UL-K Đối chứng
Gram
(-)
E. coli ++ ++ - ++ +++ - +++
Pseudomonas aeruginosa - + - - + - +++
Vibrio haveyi - - - - - - +++
Gram
(+)
Bacillus cereus - - - - ++ - +++
Streptococcus faecalis - - - - - +++
Enterobacter cloace - ++ - + ++ - +++
Staphylococcus aureus - - - - - - +++
3.1.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào
Các mẫu ulvan chiết kiềm UL-K và UR-K không thể hiện hoạt
tính này. Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan
% tế bào sống sót Nồng
độ
(µg/ml)
UR-H Nồng
độ
(µg/ml)
UR-N
Nồng
độ
(µg/m
l)
Ellipticine
HepG
2
HeLa
MCF-
7
HepG
2
HeLa
MCF-
7
100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00 HepG
2 HeLa
M
CF
-7 20 42,26 50,30 44,72 20 50,34 36,29 48,74
4 70,18 69,05 76,84 4 84,22 83,05 89,66 10 1,33 3,31
5,9
3 0,8 83,24 90,44 85,45 0,8 94,90 96,44 95,91
IC50
(µg/ml)
49,10±
1,56
47,75±
2,37
50,69±
1,86
IC50
(µg/ml)
31,31±
1,56
34,75
±1,38
36,37±
1,73 2 29,14 21,87
28,
86
9
Nồng
độ
(µg/ml)
UL-H Nồng
độ
(µg/ml)
UL-N
HepG
2
HeLa
MCF-
7
HepG
2
HeLa
MCF-
7 0,4 49,42 48,89 48,
58
100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00
20 50,21 55,34 48,67 20 60,67 66,24 58,71 0,08 81,59 77,13
76,
92 4 71,46 73,58 79,45 4 78,13 77,0 67,89
0,8 92,42 94,26 95,53 0,8 89,30 88,0 87,41 IC50
(µg/m
l)
0,50 0,34 0,4
5 IC50
(µg/ml)
40,74±
2,21
44,25±
2,32
50,93±
1,67
IC50
(µg/ml)
29,67±
2,87
36,33
±3,84
25,09±
1,36
3.1.2.3. Hoạt tính chống oxy hóa
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan
TT Mẫu Hoạt tính khử sắt (mg
Fe2+/g ulvan)
Hoạt tính chống oxy hóa tổng
số (mg AcidAscobic/g ulvan)
1 UL-N 2,51 3,75
2 UL-H 1,93 2,60
3 UL-K 0,01 1,12
4 UR-N 4,86 3,96
5 UR-H 1,34 2,56
6 UR-K 0,22 0,86
Kết luận: Các mẫu được chọn cho mục đích nghiên cứu cấu trúc là:
- Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (kí hiệu: UR-N)
- Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (kí hiệu: UR-H)
- Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (kí hiệu: UL-N)
- Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (kí hiệu: UL-H)
3.2. Xác định cấu trúc của ulvan
Kết quả xác định khối lượng phân tử trung bình Mw và phân bố
khối lượng phân tử Mw/Mn chỉ ra rằng, cũng giống như các sulfate
polysaccharide tự nhiên khác, ulvan là polymer có độ phân tán cao với
Mw/Mn có giá trị từ 2,19 đến 5,16 và khối lượng phân tử Mw từ
8,1x104 g/mol đến 3,47x105 g/mol tùy theo điều kiện chiết tách.
10
3.2.1. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H)
Phổ IR của UR-H có dải hấp thụ ở 848 cm 1 và 761 cm-1: liên kết
C-O-S của nhóm sulfate ở vị trí axial và equatorial, tương ứng; băng
sóng hấp thụ tại 1624 cm 1: dao động của nhóm COO của acid
uronic, 1078 cm-1: C-O-C của liên kết glycoside, 2927 cm-1: dao động
hóa trị của liên kết C-H, dải phổ rộng tại 3315 cm-1: dao động của
nhóm OH có liên kết hydro.
Phân tích phổ 1H-NMR, vùng anomeric xuất hiện 3 tín hiệu ở
δ5,30; δ4,65 và δ5,20 ppm được gán là A, B và C. Tín hiệu ở δ1,17
ppm: proton của C-6 ứng với nhóm CH3 của rhamnose, tín hiệu ở
δ3,4-4,3 ppm là các proton của vòng pyranose. Trên phổ 13C-NMR,
tín hiệu ở δ94–102 ppm là các carbon anomer, các carbon còn lại
trong vòng sẽ ở vùng δ72–80 ppm. Tín hiệu với δ17,0 ppm đặc trưng
cho nhóm C-CH3 và tín hiệu điển hình cho nhóm carboxyl của uronic
acid với δ167 ppm. Bốn tín hiệu ở δ63,39; 63,32; 63,12; 63,06 ppm là
của nhóm CH2 (C-6) của galactose và/hoặc glucose và/hoặc CH2 (C-
5) của xylose.
Các proton từ H-1 đến H-6 của A được xác định từ phổ COSY,
các carbon từ C-1 đến C-6 cũng lần lượt được gán dựa vào phổ HSQC
(Hình 3.6). Tín hiệu ở vùng trường thấp của C-2 (δ79-80 ppm), C-3
(δ75-77 ppm) và C-4 (δ74-76 ppm) chỉ ra rằng liên kết glycoside ở
rhamnose của ulvan UR-H có thể là (12,3,4) và/hoặc nhóm sulfate
ở vị trí C-2, C-3 và C-4. Kết quả này được khẳng định một lần nữa
thông qua mối tương quan giữa H-1(A) và C-2(A), C-3(A), C-4(A)
trên phổ HMBC (Hình 3.7).
Đối với gốc B, proton anomer H-1 trên phổ 1H-NMR với δ4,65
ppm, đây là giá trị cộng hưởng đặc trưng cho proton anomer H. Phân
tích phổ HSQC cho thấy: C-1(B) ở δ98,39 ppm và δ98,52 ppm có liên
hệ với H-1(B) tại δ4,65 ppm. Dựa vào tín hiệu của H-1(B), phổ COSY
và HSQC các tín hiệu tại δ3,2 ppm và δ3,8 ppm lần lượt được gán cho
H-2(B) và C-3 (B) tương ứng. Tín hiệu C-2 của acid uronic bị đẩy về
11
vùng trường thấp, chứng tỏ C-2 là carbon tham gia liên kết glycoside
(Bảng 3.8).
Hình 3.6. Phổ HSQC của UR-H Hình 3.7. Phổ HMBC của UR-H
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-H
Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6
A
→2)--L-Rha
→4)--L-Rha
102-103
/5,30
79-80
/3,63
75-77
/ 3,95
74-76
/3,85
75-76
/3,65
17-18
/1,17
B
→2)--D-GlcA
98,52;
98,39
/4,65
77,0
/3,20
74,0
/3,75
74,0
/ 3,85
- 167
C
→2)--L-IdoA
94,70;
94,51
/5,20
77,5
/3,60
76,0
/3,95
74,0
/3,85
-
167
Đối với gốc C, proton anomer H-1 trên phổ 1H-NMR ở δ5,2 ppm
là điển hình cho H. Kết hợp các phổ 1D và 2D, gán được H-1(C) tại
δ5,2 ppm ứng với C-1(C) tại δ94,51 ppm và δ94,70 ppm. Tương tự
như vậy, lần lượt gán được H-2(C) ở δ3,6 ppm, và C-2(C) ở δ77 ppm.
Tín hiệu của C-2 của acid uronic bị đẩy về vùng trường thấp chứng tỏ
C-2 là carbon tham gia liên kết glycoside, vậy liên kết glycoside của
C trong phân tử ulvan là kiểu liên kết (12) (Bảng 3.8).
Như vậy, bằng kết quả phân tích phổ NMR, có thể kết luận rằng
phân tử ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata được cấu thành
bởi 2 loại disaccharide tạo thành chuỗi như sau: [→2)--D-GlcA-
(1→2)--L-Rha-(1→] và [→2)--L-IdoA-(1→4)--L-Rha-(1→],
phân nhánh ở vị trí C-2 của acid uronic và Rha bị sulfate hóa ở 3 vị trí
C-2, C-3 và C-4 (Bảng 3.8).
12
Phổ ESI-MS của UR-H, xuất hiện disaccharide dạng
[RhaUroASO3]- biểu hiện qua peak ion mảnh [M-H]- tại m/z 419. Các
monosaccharide là monosulfate rhamnose [RhaSO3]- và acid uronic
[UroA] cho các peak m/z 243 và m/z 195 tương ứng, peak có số khối
m/z 503 là của ion mảnh [Rha3SO3]-. Peak có m/z 339 được gán cho
ion mảnh [RhaUroA]- , ion mảnh tại m/z 401 là của [RhaUroASO3-
H2O]-.
Hình 3.9. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243
Hình 3.9 là phổ ESI-MS/MS của ion mảnh ứng với m/z 243. Peak
tại m/z 183 là của nhóm sulfate ở vị trí C-4 và mảnh với m/z 139 là
do nhóm sulfate tại vị trí C-2 của α-L-Rha. Một peak có cường độ
yếu tại tại m/z 169 là do ulvan bị sulfate hóa một phần tại vị trí số 3
của rhamnose. Vậy, ulvan chiết acid (UR-H) có rhamnose bị
sulfate ở cả 3 vị trí: chủ yếu ở C-2 và C-4, một phần nhỏ ở C-3. Điều
này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR
và NMR ở trên.
Kết hợp với việc phân tích phổ NMR ở trên, chúng tôi đưa ra cấu
trúc mạch chính của ulvan chiết tách bằng dung môi acid từ rong lục
Ulva reticulata Việt Nam là [→2)--D-GlcA-(1→2)--L-Rha-(1→]
và [→2)--L-IdoA-(1→4)--L-Rha-(1→], phân nhánh ở vị trí C-2 của
acid uronic và Rha bị sulfate hóa ở 3 vị trí C-2, C-3 và C-4. Đây là
một ulvan có cấu trúc mới vì các ulvan đã được công bố thì chưa
thấy xuất hiện liên kết (1→2) ở mạch chính.
3.2.2. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N)
Cấu trúc hóa học của mẫu ulvan chiết nước từ rong lục Ulva
reticulata cũng được nghiên cứu bằng các phương pháp phổ IR,
13
NMR, MS như mẫu UR-H ở trên. Phổ IR của UR-N cũng cho các dải
hấp thụ điển hình của ulvan như: 1595cm 1, 1028cm 1, 844cm 1 và
783cm-1. Phân tích các thông tin thu được từ phổ NMR cho kết quả ở
Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-N
Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6
A →4)α-L-Rha3S 1→
100,51/ 4,82
69,71/ 4,20
78,91/ 4,59
78,86/ 3,79
68,89/ 4,13
17,60/ 1,30
B →2,4)β-D-GlcA 1→
103,83/ 4,63
74,58/ 3,35
74,83/ 3,64
79,48/ 3,65
76,70/ 3,82
177,60
Phổ ESI-MS của UR-N xuất hiện peak mảnh [M-H]- tại m/z 419
là của disaccharide dạng [RhaUroASO3]-. Monosulfate rhamnose
[RhaSO3]- và acid uronic [UroA]- cho các peak tại m/z 243 và m/z 195
tương ứng. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh với m/z 243 có peak ion
mảnh với cường độ mạnh tại m/z 169 chỉ ra sự có mặt của nhóm
sulfate ở vị trí C-3. Như vậy, UR-N có rhamnose bị sulfate ở C-3.
Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích
phổ IR và NMR ở trên.
Từ việc phân tích các phổ IR, NMR và MS, chúng tôi có thể kết
luận cấu trúc mạch chính của ulvan chiết nước từ rong lục Ulva
reticulata Việt Nam có dạng A3s [→4-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-
(1→] và bị phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của acid glucuronic với
nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha.
Cấu trúc không gian của phân tử UR-N ở kích thước cỡ nano
được nghiên cứu bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS).
Các biểu đồ Kratky [Hình 3.22 bên trái] và Guinier [Hình 3.22 bên
phải] của dung dịch 1% ulvan UR-N trong nước và trong NaCl 0,5M
có dạng đặc trưng cho các phân tử có cấu trúc không gian dạng hình
que (rod-like). Qua biểu đồ Kratky, cho thông tin về sự có mặt của các
nhóm sulfate trong phân tử ulvan.
Từ biểu đồ Guinier bán kính từ hồi chuyển của UR-N được xác
định là Rgc = 1,35-1,37 nm, đối với các polysaccharide mạch thẳng
không phân nhánh như carrageenan hay heparin thì giá trị Rgc khoảng
14
0,4-0,5 nm, điều này cho thấy UR-N có mạch nhánh tương đối dài,
giống như fucoidan chiết tách từ các loài rong nâu. Kết quả nghiên
cứu về cấu trúc không gian cũng phù hợp với cấu trúc hóa học xác
định được theo các phương pháp phổ IR, NMR và ESI-MS ở trên là
ulvan có cấu trúc mạch nhánh. 7x10
-3
6
5
4
3
2
1
0
q2 I(q)
543210
q, nm-1
Ulva reticulata Forsskål 1% in water in 0.5 M NaCl aq
-8
-7
-6
-5
-4
-3
ln(q
I(q)
)
6543210
q2
Ulva reticulata Forsskål 1% in water, Rgc=1.35nm in 0.5 M NaCl aq, Rgc=1.37nm
Hình 3.22. Kết quả đo SAXS từ dung dịch UR 1% nước và trong
NaCl 0,5 M: biểu đồ Kratky và biểu đồ Guinier của mẫu UR-N
Phương pháp SAXS không những cung cấp thông tin về cấu trúc
không gian của phân tử mà còn giúp đưa ra các thông tin chi tiết hơn
về cấu trúc hóa học như độ dài mạch nhánh và sự phân bố của mạch
nhánh trên mạch chính. Để làm được điều này, một mô hình phân tử
của UR-N được xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học đã xác định bằng
các phương pháp phổ, sau đó, đường tán xạ tính toàn từ mô hình phân
tử được so sánh (fitting) với đường tán xạ thực nghiệm nhận được từ
phép đo SAXS. Kết quả cho thấy mô hình cấu trúc phân tử xây dựng
với n = 5 và m =4 (Hình 3.24) thì biểu đồ tán xạ Kratky thu được từ
thực nghiệm SAXS và tính toán dựa trên mô hình cấu trúc phân tử có
độ trùng nhau (fitting) khá tốt (Hình 3.25).
Hình 3.24. Mô hình cấu trúc phân tử của UR-N xây dựng dựa trên
cấu trúc hóa học
15
Hình 3.25. Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm và từ
mô hình cấu trúc phân tử.
3.2.3. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N)
Phân tích phổ IR của UL-N, cung cấp những thông tin về sự có
mặt của nhóm sulfate ở 845 cm 1 và 789 cm-1, dao động ở 1599 cm 1
là của nhóm COO- của acid uronic trong phân tử ulvan, dải hấp thụ ở
1026 cm 1 là đặc trưng cho liên kết glycoside C-O-C.
Hình 3.30. Phổ HSQC của UL-N
Hình 3.31. Phổ HMBC của UL-N
16
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-N
Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6
A
→2)-α-D-Xyl-(1→
100,27/
5,36
77,92
3,65
73,82/
3,95
71,87/
3,82
61,20/
3,80; 3,88
-
B
→2,4)-α-L-Rha-(1→
89,65;
101,50/
4,90
79,21/
4,06
71,74/
3,71
76,88/
3,82
68,40/
4,0
17,12/
1,31
C
→4)-α-L-Rha3S-(1→
100,40/
4,82
69,46/
4,23
78,68/
4,61
78,68/
3,80
68,65/
4,13
17,35/
1,31
D
→4)-β-D-GlcA-(1→
103,65/
4,64
74,40/
3,35
74,58/
3,65
79,40/
3,68
76,88/
3,81
177,76
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm: 1H và 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC của ulvan UL-N được tóm tắt ở
Bảng 4.10.
Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh với m/z 243 thấy có hai peak ứng
với m/z 183 và m/z 169 là đặc trưng cho sự có mặt của nhóm sulfate ở
vị trí carbon C-4 và C-3 của α-L-Rha tương ứng.
[UroA]-
[XylUroA]-
[RhaUroA]-
[RhaSO3]-
[XylRhaSO3]-
[UroARhaSO3]-
[Rha3SO3]-
Hình 3.32. Phổ ESI-MS của ulvan UL-N Hình 3.33. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]
- với m/z 243
Kết quả từ việc phân tích phổ IR, NMR và MS có thể khẳng định
rằng, ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca có cấu trúc mạch
chính chủ yếu là disaccharide dạng [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-
Rha3S-(1→] và phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của rhamnose. Ngoài
ra, trong phân tử ulvan còn có lượng nhỏ disaccharide ở dạng liên kết
GlcA-(12)-Xyl, GlcA-(12)-Rha. Như vậy, ulvan chiết nước từ
rong lục Ulva lactuca Việt Nam mà chúng tôi nghiên cứu có cấu trúc
hóa học giống với các kết quả nghiên cứu trước ở mạch chính nhưng
khác nhau ở mạch nhánh và đa dạng ở mạch phụ.
17
3.2.4. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H)
Phổ IR của UL-H có những dao động đặc trưng của ulvan với tín
hiệu ở 850 cm 1 và 786 cm-1 là dao động của liên kết C-O-S của nhóm
sulfate ở vị trí axial và equatorial, tương ứng. Dải hấp thụ ở 1014 cm 1
đặc trưng cho liên kết C-O chứa O-H. Tín hiệu dao động ở 1599 cm 1
là do dao động của nhóm COO của acid uronic.
Từ những kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ NMR bao gồm: 1H và 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC của ulvan UL-N (Bảng 3.11),
chúng tôi có thể kết luận rằng ulvan chiết acid từ rong lục Ulva
lactuca có cấu trúc tạo thành từ disaccharide, tạo thành chuỗi [→4)-β-
D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí C-3 của
rhamnose. So sánh với các nghiên cứu trước đây về ulvan từ rong lục
Ulva lactuca cho thấy bằng các phương pháp chiết tách khác nhau,
các ulvan thu được đều có thành phần mạch chính giống nhau, chúng
chỉ khác nhau ở mạch nhánh.
Hình 3.37. Phổ HSQC của UL-H Hình 3.38. Phổ HMBC của UL-H
Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-H
Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6
D
4)-L-Rha3S 1
102,45/
4,82
71,62/
4,22
80,80/
4,58
80,70/
3,78
70,79/
4,11
~19,56/
~1,3
E
1)-D-GlcA 4
105,69/
4,65
76,44/
3,35
76,72/
3,60
81,52/
3,65
78,49/
3,86
D’
1)-L-Rha 3(4)
~103,6/
4,89
71,62/
4,22
81,34/
4,05
~74,10/
3,86
~73,2/
3,71
~19,48/
~1,29
18
Hình 3.39. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243
Trên phổ ESI-MS của ulvan xuất hiện mảnh khối của disaccharide
[RhaUroASO3]- tại m/z 419. Các monosaccharide là monosulfate
rhamnose [RhaSO3]- và acid uronic [UroA] cho các peak m/z 243 và
m/z 195 tương ứng. Phổ ESI-MS/MS của disaccharide với m/z 243
được đưa ra ở Hình 3.35, trên phổ, có peak ion mảnh với cường độ
mạnh tại m/z 169 là của nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha. Một paek
có cường độ yếu tại tại m/z 139 là do ulvan bị sulfate hóa một phần tại
vị trí số 2 của rhamnose. Như vậy, UL-H có rhamnose bị sulfate ở cả
2 vị trí: chủ yếu ở vị trí carbon C-3 một phần nhỏ ở vị trí carbon C-2.
Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ
IR và NMR ở trên.
Vậy UL-H có cấu trúc chuỗi disaccharide chủ yếu dạng [→4)β-D-
GlcA-(1→4)α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí C-3 của
rhamnose.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến
hoạt tính sinh học của ulvan
Các nghiên cứu trước cho thấy nhóm sulfate là yếu tố cấu trúc có
ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học của sulfate polysaccharide nhất
là hoạt tính chống đông tụ máu. Mặt khác, sự acetyl hóa có thể làm
tăng hoạt tính chống oxi hóa hoặc kháng vi sinh vật kiểm định của
chúng. Nhằm mục đích tìm hiểu sự thay đổi cấu trúc cũng như hoạt
tính sinh học của ulvan khi chúng bị sulfate hóa hoặc acetyl hóa
19
chúng tôi đã điều chế các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa của mẫu
ulvan tự nhiên, ở đây cụ thể là mẫu UR-N.
3.3.1. Ảnh hưởng của sự sulfate hóa
Phổ IR và 13C- và HSQC - NMR được sử dụng để kiểm tra sự
thay đổi trong cấu trúc của mẫu sulfate hóa UR-S.
Kết quả phân tích phổ của mẫu UR-S cho thấy, ở phổ IR có sự
tăng cường độ hấp thụ của tín hiệu tại ~850 cm-1 đặc trưng cho nhóm
sulfate ở vị trí axial, đồng thời có sự giảm cường độ hấp thụ của tín
hiệu tại ~3261-3370 cm-1 là đặc trưng cho dao động của nhóm OH; Ở
phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu mới ở δ77,2 ppm là carbon C-2 của
rhamnose, chứng tỏ mẫu UR-S bị sulfate hóa tại vị trí C-2 của
rhamnose; Phổ HSQC của UR-S xuất hiện một số tín hiệu mới và dịch
chuyển về phía trường thấp hơn so với phổ HSQC của UR-N (Hình
3.42), tín hiệu tương tác C-1/H-1 của rhamnose bị tách ra; đồng thời
có hai tín hiệu mới xuất hiện, thể hiện sự tương tác giữa C-2/H2 với
δ80,0/3,38 ppm và C-3/H3 ở δ76,5/3,67 ppm của glucuronic acid, C-2
của rhamnose có cường độ tín hiệu tăng lên. Vậy cả 3 vị trí gồm
carbon C-2 của rhamnose và carbon C-2, C-3 của glucuronic acid đã
bị sulfate hóa một phần. Như vậy, kết quả phân tích phổ NMR cũng
phù hợp với kết quả phổ IR ở trên và các nghiên cứu trước. Kết quả
phân tích phổ khẳng định sự tăng mức độ sulfate hóa của mẫu UR-S.
Dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM), có sự khác nhau rất rõ ràng
ở cấu trúc bề mặt giữa mẫu UR-N và UR-S. Các phân tử UR-N tạo
thành khối có cấu trúc bề mặt phẳng trong khi UR-S dường như tạo
thành các khối tinh thể nhỏ có hình dạng xác định.
Hình 3.42. Phổ HSQC của UR-N (a) và UR-S (b)
20
Đánh giá mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính chống đông tụ máu
Chúng tôi thử 4 hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng vi
sinh vật kiểm định và chống đông tụ máu của mẫu UR-S giống như đã
thử với mẫu UR-N. Kết quả cho thấy không có sự thay đổi đáng kể
của 3 hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm
định còn hoạt tính chống đông tụ máu thì tăng lên đáng kể.
Với mục đích tìm hiểu ảnh hưởng của mức độ sulfate hóa đến
hoạt tính chống đông tụ máu, các dẫn xuất UR-S với mức độ sulfate
hóa khác nhau đã được điều chế và được tiến hành đánh giá hoạt tính
chống đông tụ máu như được chỉ ra trong phần Thực nghiệm. Kết quả
thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và UR-S với các mức độ
sulfate hóa khác nhau được đưa ra trên Bảng 3.12, thuốc được dùng
làm chất đối chứng là Aspirin.
Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và UR-S
Tên mẫu UR-N UR-S1 UR-S2 UR-S3 UR-S4 UR-S5 Aspirin
DS (%) 17,60 21,25 25,68 30,42 33,21 35,96
Thời gian đông
tụ máu (phút) 10 25 40 45 30 37 48
Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và các dẫn
xuất sulfate hóa của nó cho thấy, khả năng chống đông tụ máu của
mẫu ulvan sulfate tăng lên đáng kể so với ulvan tự nhiên, tuy nhiên
chúng tôi không thấy có sự phụ thuộc có quy luật của khả năng chống
đông tụ máu vào hàm lượng sulfate. Kết quả này có thể giải thích
rằng, còn có những yếu tố khác liên quan đến khả năng chống đông tụ
máu của ulvan như khối lượng phân tử, vị trí nhóm sulfate…Các
nghiên cứu trước đã chỉ ra rằng hoạt tính chống đông tụ máu của
polysaccharide tăng lên khi sulfate hóa là do có sự tăng nhóm mang
điện tích âm và nhóm này có thể liên kết với nhóm mang điện tích
dương của chất ức chế đông tụ máu và do đó làm tăng hoạt tính chống
đông tụ máu.
21
3.3.2. Ảnh hưởng của sự acetyl hóa
Sự thay đổi cấu trúc của UR-N sau khi acetyl hóa được kiểm tra
bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR.
Hình 3.44. Phổ 1H-NMR a) và 13C-NMR b) của UR-Ac
Phổ 1H- NMR và 13C-NMR của UR-Ac được đưa ra ở Hình 3.44,
ta thấy trên phổ 1H-NMR của UR-Ac xuất hiện peak mới ở độ chuyển
dịch hóa học δ2,007 ppm và phổ 13C-NMR có peak tại δ22,5 ppm, thể
hiện sự có mặt của nhóm acetyl O-CH3. Như vậy, bằng phổ NMR,
chúng tôi khẳng định mẫu UR-N đã bị acetyl hóa.
Ảnh SEM cũng thể hiện sự khác nhau rất rõ ràng ở cấu trúc bề
mặt giữa mẫu UR-N và UR-Ac. Cấu trúc bề mặt như các tấm phẳng
của UR-N trở nên xốp hơn với nhiều các lỗ và hốc rỗng lớn.
Đánh giá mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính chống oxy hóa:
Chúng tôi thử 4 hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng
vi sinh vật kiểm định và chống đông tụ máu của mẫu UR-Ac giống
như đã thử với mầu UR-N. Kết quả cho thấy không có sự thay ðổi
ðáng kể của cả 4 hoạt tính này. Điều này có thể được lý giải rằng khi
bị acetyl hóa, ulvan được gắn thêm nhóm acetyl là nhóm không ưa
nước, làm phân tử ulvan khó tan trong nước hơn và do vậy không
thuận lợi cho các phản ứng sinh hóa xảy ra.
22
KẾT LUẬN
Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả như sau:
1. Đã chiết tách 6 mẫu ulvan từ 2 loài rong lục Ulva lactuca và Ulva
reticulata thu thập ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa bằng 3
quy trình chiết tách sử dụng dung môi acid, kiềm và nước; Đã xác
định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của
chúng. Kết quả cho thấy thành phần hóa học cũng như hoạt tính
sinh học của ulvan rất khác nhau phụ thuộc quy trình chiết tách,
ulvan chiết bằng nước có hàm lượng sulfate, acid uronic và
rhamnose cao nhất cũng cho hoạt tính sinh học tốt nhất.
2. Bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý GPC, IR, NMR và MS
đã nghiên cứu thành công cấu trúc hóa học của 4 mẫu ulvan
chiết tách được, cụ thể như sau:
- Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata
Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-2, C-3 và C-4 của Rha.
Đây là một ulvan có cấu trúc mới, vì đa số các ulvan chỉ có liên
kết 1→4 ở mạch chính, trong khi ulvan này tồn tại liên kết 1→2
ở mạch chính.
- Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata
Nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha.
- Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca
23
Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 của Rha.
- Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca
Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 và C-4 của Rha.
Các kết quả nghiên cứu một lần nữa cho phép khẳng định sự phụ
thuộc cấu trúc của ulvan vào vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và
phương pháp chiết tách chúng từ rong.
3. Bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS đã xác định
ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata UR-N có cấu trúc
không gian dạng hình que với mạch nhánh dài.
4. Đã xây dựng được mô hình phân tử của UR-N dựa trên cấu
trúc hóa học. Bằng cách so sánh đường tán xạ tính toán từ mô
hình cấu trúc phân tử với thực nghiệm của phép đo SAXS, cấu
trúc hóa học của UR-N đã được khẳng định. Đây là một
phương pháp góp phần giải quyết khó khăn trong việc nghiên cứu
các polymer tự nhiên có cấu trúc phức tạp.
5. Đã khảo sát ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc
bề mặt và hoạt tính sinh học của ulvan chiết nước từ rong lục
Ulva reticulata. Kết quả cho thấy:
Sự sulfate hóa làm thay đổi cấu trúc bề mặt của ulvan và
không làm tăng hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống oxy
hóa và kháng vi sinh vật kiểm định nhưng làm tăng đáng kể
hoạt tính chống đông tụ máu và sự tăng này không tỷ lệ với
mức độ sulfate hóa.
Sự acetyl hóa làm ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc bề mặt
nhưng không làm tăng các hoạt tính sinh học đã thử nghiệm
của ulvan.
24
KIẾN NGHỊ
1. Cấu trúc hóa học của ulvan nói riêng và polysaccharide nói chung
là rất phức tạp, hơn nữa rõ ràng là có mối liên hệ giữa cấu trúc
của ulvan và hoạt tính sinh học của chúng, nhưng cho đến nay
mối quan hệ này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Đây là những vấn
đề nghiên cứu rất cơ bản, hấp dẫn không chỉ đối với Việt Nam
mà còn ở cả trên thế giới nên cần được tiếp tục nghiên cứu trong
thời gian tới.
2. Ngoài chi Ulva, ở Việt Nam còn có các chi rong lục khác có các
đặc điểm cấu trúc riêng biệt với các hoạt tính sinh học phong phú
khác cần tiếp tục được nghiên cứu để có thể sử dụng nguồn
rong biển một cách hiệu quả nhất.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Đã sử dụng kết hợp các phương pháp vật lý hiện đại trong nghiên
cứu cấu trúc của polymer bao gồm GPC, phổ IR, NMR, ESI-MS,
tán xạ tia X góc nhỏ SAXS để nghiên cứu cấu trúc bao gồm cấu
trúc hóa học và cấu trúc không gian của sulfate polysaccharide từ
rong lục thu thập ở vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa của Việt
Nam.
2. Đã phát hiện được một dạng cấu trúc mới của ulvan so với các
nghiên cứu đã công bố trên thế giới.
3. Đã xây dựng được mô hình cấu trúc phân tử của ulvan dựa trên
cấu trúc hóa học và so sánh đường tán xạ tính toán từ mô hình cấu
trúc phân tử với thực nghiệm của phép đo SAXS để khẳng định
lại cấu trúc hóa học. Đây là một phương pháp góp phần giải quyết
khó khăn trong việc nghiên cứu các polymer tự nhiên có cấu trúc
phức tạp.
4. Bước đầu nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc- hoạt tính của ulvan.
Đây là hướng nghiên cứu mới so với các nghiên cứu cùng lĩnh
vực ở trong nước.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Q.T.M Thu, Đ.V Lương, T.T.T Vân, B.M Lý và T.T.T Thủy (2014).
Ulvan từ rong lục ulva reticulata: chiết tách, thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học. Tạp chí Hóa học, 52 (6A), 158-162.
2. Q.T.M Thu, N.T Nu, Đ.V Luong, B.M Ly, T.T.T Van and T.T.T Thuy
(2015). Structural characterization of ulvan from green seaweed Ulva
reticulata. Vietnam Journal of Chemistry, 53 (6e1,2), 386-390.
3. Q.T.M Thu, T.H Bang, N.T Nu, Đ.V Luong, B.M Ly, T.T.T Van and
T.T.T Thuy (2015). Structural Determination of Ulvan from Green
Seaweed Ulva reticulata Collected at Central Coast of Vietnam.
Chemistry Letters, 44 (6), 788-790.
4. T.T.T Thuy, Q.T.M Thu, T.T.T Van, D.V Luong and N.T Tai (2015).
Ulvan from green seaweed Ulva reticulata: Extraction and structure.
The 13th Japan – Vietnam Joint Seminar, 29-30 October 2015 Kyoto,
Japan, 23.
5. T.T.T Thuy, T.M.T Quach, T.N Nguyen, D.Vu Luong, B.M Ly and
T.T.V Tran (2016). Structure and cytotoxic activity of ulvan extracted
from green seaweed Ulva lactuca. International Journal of Biological
Macromolecules 93, 695-703.
6. T.T.T Thuy, Q.T.M Thu, N.T Nu, D.V Luong, N.T Tai, T.T.T Van
(2016). Structure and biological activity of sulfated polysaccharide
extracted from green seaweed Ulva lactuca. The 14th Japan-Vietnam
Joint Seminar, Hanoi 22th September 2016, 21.
7. Q.T.M Thu, N.T Nụ, Đ.V Lương, N.T Tài, T.H Bằng, T.T.T Vân, H.Đ
Cường, T.T.T Thủy (2016). Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính chống
oxy hóa của ulvan chiết tách từ rong lục Ulva lactuca. Tạp chí Hóa
học, 54 (6e2), 75-78.
8. Q.T.M Thu, Đ.V Luong, N.T Nu, T.T.T Van, B.M Ly and T.T.T Thuy
(2016). Effect of sulfation on the structure and anticoagulant activity of
ulvan extracted from green seaweed Ulva reticulata. Vietnam Journal
of Science and Technology, 54 (2C), 373-379.
9. Thanh T T T, Quach T M T, Nguyen T N, Dang V L, Tran T T V, Bui
M L (2017). Structure and cytotoxicity of the green seaweed originated
ulvan. The 17th Asian Chemical Congress, 23-28 July 2017 Melbourne
Australia, 332.
10. T.T.V Tran, H.B Truong, N.H.V Tran, T.M.T Quach, T.N Nguyen,
M.L Bui, Yoshiaki Yuguchi & T.T.T Thanh (2017). Structure,
conformation in aqueous solution and antimicrobial activity of ulvan
extracted from green seaweed Ulva reticulata. Natural Product
Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1408098.